CN113281440B - 基于UHPLC-Q-Orbitrap MS筛查和定量30种合成染料的方法及应用 - Google Patents

基于UHPLC-Q-Orbitrap MS筛查和定量30种合成染料的方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于UHPLC‑Q‑Orbitrap MS筛查和定量30种合成染料的方法及应用。利用超高效液相色谱－四极杆－静电场轨道阱高分辨质谱UHPLC‑Q‑Orbitrap MS检测合成染料标准品，优化色谱、质谱条件建立30种合成染料的筛查数据库，并在TraceFinder中建立合成染料的标准曲线。在样品测试中直接将检测得到的数据导入数据库进行筛查，能够在无需标准品条件下实现30种多类别合成染料的非靶高通量筛查，还能实现检测样品中的合成染料的定量，线性范围均大于0.99，其检出限和定量限分别0.23～6.28μg/kg和0.77～20.52μg/kg，实用性强，应用前景良好。

Description

基于UHPLC-Q-Orbitrap MS筛查和定量30种合成染料的方法 及应用
技术领域
本发明涉及合成染料检测技术领域，具体地，涉及一种基于 UHPLC-Q-OrbitrapMS筛查和定量30种合成染料的方法及应用。
背景技术
颜色是食品的关键特征，它能够直接影响消费者的接受程度和食物选择。因 此，在食品行业中，为了弥补加工或储存过程中损失的色泽往往会向食品中添加 染料。染料可分为天然染料和合成染料。合成染料是从煤焦油分馏出来(或石油 加工)经化学加工而成的。与天然染料相比，合成染料因其价格低廉、着色能力 强和性质稳定等优点往往会代替天然染料用于食品生产中。近年来的研究表明， 合成染料具有遗传毒性、神经毒性和致癌性等；此外，合成染料的使用没有任何 营养价值和防腐功能。目前，许多国家已经制定了相应的法规来监管合成染料允 许使用种类和使用量。因此，开发一种快速而可靠的分析方法用于控制食品中的 合成染料滥用行为具有至关重要的意义。
目前，食品中合成染料常用的检测方法是液相色谱法，检测器多为紫外检测 器和二极管阵列检测器。例如：公开号为CN102221582A的中国专利公开了一种 火锅底料中罗丹明B的快速检测方法，采用液相色谱仪对净化后的火锅底料进 行离子交换色谱-荧光检测，得到火锅底料的液相色谱图，以达到快速检测火锅 底料中罗丹明B的目的。但该方法无法识别没有可见光吸收特异性的染料，且 灵敏度不高。同时，色谱分析过程中存在共流出物，导致其检测结果不准确。而 UHPLC-Q-Orbitrap MS只有一个母离子和子离子便可定性，其高灵敏度、高选择 性有效降低了假阳性。然而，目前基于LC-MS/MS的合成染料测定方法大多关 注于一类性质相同的合成染料，例如：公开号为CN 109632988 A的中国专利公 开了一种分散染料含量的检测方法，具体公开了利用LC-MS/MS检测30种分散 染料的方法。现有技术中仍缺乏能够同时测定不同酸碱性、水溶性、极性的多类 别染料的检测方法。因此，急需建立一种基于UHPLC-Q-Orbitrap MS快速筛查 和定量食品中不同酸碱性和极性合成染料的方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种基于UHPLC-Q-Orbitrap MS筛查和定量30种合成染料的方法。
本发明的第二个目的在于提供上述方法在食品质量安全检测或出入境检验 检疫中的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
一种基于UHPLC-Q-Orbitrap MS筛查和定量30种合成染料的方法，包括以 下步骤：
S1.通过超高效液相色谱－四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱 UHPLC-Q-OrbitrapMS获取30种合成染料标准物质的精确质荷比、保留时间、 二级碎片的信息，将合成染料的名称、分子式、CAS、精确质荷比、化合物的加 合方式、保留时间和二级碎片信息输入TraceFinder以建立合成染料的筛查数据 库；将一系列浓度梯度的合成染料标准品数据文件导入TraceFinder，建立30种 合成染料的标准曲线用于后期样本中的合成染料的定量；
S2.将待测样品加入提取剂中，经涡旋振荡后超声提取，离心取上清液，过 膜，检测过膜后的上清液，通过超高效液相色谱－四极杆/静电场轨道阱高分辨 质谱UHPLC-Q-Orbitrap MS进行检测；
S3.将步骤S2检测得到的样本数据导入步骤S1数据库进行筛查，并基于TraceFinder对合成染料进行定性定量分析；
所述30种染料为柠檬黄、诱惑红、苋菜红、胭脂红、日落黄、亮蓝、赤藓 红B、靛蓝、苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ、苏丹红7B、苏丹红G、 苏丹黄、对位红、喹啉黄、罗丹明B、罗丹明6G、酸性蓝3、监牢绿、碱性橙 21、碱性橙Ⅱ、碱性橙22、酸性橙1、酸性橙2、偶氮玉红、酸性黄36、颜料橙 5、颜料红53:1。
在上述方法中，首先通过超高效液相色谱－四极杆/静电场轨道阱高分辨质 谱UHPLC-Q-Orbitrap MS检测30种合成染料标准物质，优化色谱条件和质谱条 件，获取合成染料标准物质的精确质荷比、保留时间、二级碎片的信息，从而建 立30合成染料的筛查数据库，再将一系列浓度梯度的合成染料标准品数据文件 导入TraceFinder，建立30种合成染料的标准曲线用于后期样品的合成染料的定 量。当对待测样品进行检测时，直接将检测得到的数据导入数据库进行筛查，基 于TraceFinder中的合成染料标准曲线对样品中的合成染料进行定量。该方法能 够在无需标准品的条件下实现这30种多类别合成染料的非靶高通量筛查，检测 效率高，精确度高，实用性强。
优选地，步骤S1、S2所述超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质 谱UHPLC-Q-Orbitrap MS的色谱和质谱条件为：
所述色谱条件为：色谱柱：苯基柱ACQUITY UPLC BEH Phenyl，内径×长 为2.1×100mm，粒径为1.7μm；流速0.2mL/min；进样体积：5μL；流动相：乙 腈和5mmol/L乙酸铵溶液；梯度洗脱测序如下：0～1min，90％乙酸铵溶液；1～ 2min，90～80％乙酸铵溶液；2～3min，80～40％乙酸铵溶液；3～5min，40～20％ 乙酸铵溶液；5～7min，20～5％乙酸铵溶液；7～10min，5％乙酸铵溶液；10～ 11min，5～90％乙酸铵溶液；11～14min，90％乙酸铵溶液；所述百分数为乙酸 铵溶液占乙腈、乙酸铵溶液混合液的体积百分数；
所述质谱条件为：喷雾电压：正离子模式+3.5kv，负离子模式-3.2kv；离子 传输管温度：350℃；鞘气流速：45arb；辅助气流速：15arb；s-lens电压：50v； 加热温度：250℃；扫描范围：150-1000m/z；一级质谱全扫描(Full scan)分辨 率：R＝70000；自动增益控制做Full MS时C-Trap中的目标离子数目(AGC target)： 3e6；最大注入时间(Maximum IT)：100ms；数据依赖二级离子全扫描分辨率： R＝17500；AGC target：2e5；最大注入时间：50ms；归一化碰撞能：20ev，40ev， 60ev；动态排除：10s。
优选地，步骤S2所述提取剂为甲醇和/或乙腈。
更优选地，甲醇和乙腈的体积比为(1～16)：4。
优选地，步骤S2所述的样品包括高蛋白基质样品、高糖基质样品以及高脂 基质样品中的任意一种或多种。
优选地，步骤S2所述的样品包括牛奶、运动饮料、牛肉制品中的任意一种 或多种。
优选地，步骤S2所述超声功率为40kHz，超声温度30℃，超声时间为15min。
优选地，步骤S2所述离心转速为12000rpm，温度4℃，离心时间为15min。
优选地，步骤S2所述过膜所用的膜的孔径为0.22μm。
本发明还提供了上述任一所述方法在食品质量安全检测或出入境检验检疫 中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过利用超高效液相色谱－四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱 UHPLC-Q-Orbitrap MS对合成染料标准品进行检测，优化色谱条件和质谱条件建 立30种合成染料的筛查数据库，并在TraceFinder中建立合成染料的标准曲线。 在后续的样品测试中，直接将检测得到的数据导入数据库进行筛查，能够在无需 标准品的条件下实现30种多类别合成染料的非靶高通量筛查，还能实现高蛋白 基质、高糖基质和高脂基质样品的合成染料的定量，线性范围均大于0.99，其检 出限和定量限分别0.23～6.28μg/kg和0.77～20.52μg/kg，实用性强，具有良好的 应用前景。
附图说明
图1为不同浓度的乙酸铵对30种合成染料的质谱响应信号相对值的影响。
图2为使用C18柱在正、负离子模式下的30种合成染料基峰图。
图3为使用Amide柱在正、负离子模式下30种合成染料基峰图。
图4为使用Phenyl柱在正、负离子模式下30种合成染料基峰图。
图5为负离子模式下不同喷雾电压对30种合成染料的质谱响应信号相对值 的影响。
图6为基于TraceFinder的筛查流程图。
图7为30种合成染料的提取离子流图；a：柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂 红、诱惑红、酸性橙1、酸性橙2、喹啉黄、靛蓝、偶氮玉红的提取离子流图；b： 酸性黄36、颜料橙5、颜料红53:1、亮蓝、酸性蓝3、监牢绿、赤藓红B的提取 离子流图；c：罗丹明B、罗丹明6G、碱性橙21、碱性橙II、碱性橙22、苏丹 黄、对位红的提取离子流图；d：苏丹红I、苏丹红II、苏丹红III、苏丹红IV、 苏丹红7B、苏丹红G的提取离子流图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本 发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技 术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
本发明所用的试剂与标准物质的信息如下：
甲醇(质谱纯)，乙腈(质谱纯)购自美国sigma公司；乙酸铵(质谱纯) 购自中国aladdin公司；超纯水由德国Merck公司Milli-Q Integral超纯水系统纯 化制备(18.2MΩ)；Q-Exactive高分辨质谱专用质量轴校正液(正、负离子) 购自美国Thermo Scientific公司。30种合成染料标准物质见表1。
表1 30种合成染料标准物质信息
Figure BDA0003036236130000051
Figure BDA0003036236130000061
实施例1仪器条件的优化
本发明通过优化色谱条件(流动相的组成、色谱柱的种类、梯度洗脱程序) 和质谱条件(正、负离子模式的喷雾电压)来建立筛查数据库。
1.色谱条件的优化
1.1流动相组成的优化
不同流动相组成如表2所示：
表2不同流动相组成
序号 A相 B相
1 乙腈 0.1％甲酸
2 乙腈 0.1％氨水
3 乙腈 0mmol/L乙酸铵(水)
4 乙腈 5mmol/L乙酸铵
5 乙腈 10mmol/L乙酸铵
6 乙腈 15mmol/L乙酸铵
7 乙腈 20mmol/L乙酸铵
结果分析：不同浓度乙酸铵浓度对30种合成染料的质谱响应信号相对值如 图1所示。结果显示，当采用0mm乙酸铵作为流动相时，罗丹明5G、监牢绿、 罗丹明B、苏丹红7B的质谱响应信号较弱；当乙酸铵的浓度大于15mmol/L时， 苏丹红III、酸性蓝3、监牢绿、喹啉黄以及赤藓红B的质谱响应信号相对值较 低。另外，研究表明，以乙腈为A相、以0.1％甲酸或0.1％氨水为B相时，甲酸 会导致酸性染料的峰拖尾，而氨水则会导致碱性染料峰形变差。由此可知，以乙 腈为A相、5mmol/L乙酸铵为B相更适合用作30种合成染料的流动相。
1.2色谱柱的优化
考察ACQUITY UPLC BEH Phenyl(phenyl柱)1.7μm、ACQUITY UPLC BEH C18(C18柱)1.7μm、ACQUITY UPLC BEH amide(amide柱)1.7μm对 30种合成染料的色谱峰的影响。
结果分析：利用phenyl柱、C18柱、amide柱在正、负离子模式下的30种 合成染料基峰分别如图2～4所示。结果显示，可以看出，使用Amide柱分离时， 30种合成色素在1min左右出峰完毕，色谱峰分不开，原因在于大部分合成色素 都不是强极性物质；而Phenyl柱和C18柱相较，峰形尖锐对称，14min可完成 30种合成色素分离。
1.3梯度洗脱程序的优化
以乙腈作为A相，5mmol/L乙酸铵溶液为B相，考察以下不同的梯度洗脱 程序对30种染料的洗脱效果的影响，不同的洗脱程序如表3所示。
表3不同的梯度洗脱程序
Figure BDA0003036236130000071
通过组1所述的梯度洗脱程序洗脱后，30种合成染料均能够被洗脱出来， 通过组2所述的梯度洗脱程序洗脱后，无法洗脱出柠檬黄、日落黄和苋菜红等强 极性合成染料；通过组3所述的梯度洗脱程序洗脱后，酸性橙1，酸性橙2的峰 无法分开。因此，组1所述的梯度洗脱程序更适用于30种合成染料的洗脱。
2.质谱条件的优化
2.1正离子模式的喷雾电压的优化
本发明考察了质谱的正离子模式的喷雾电压分别为+2.5kv，+2.8kv，+3.2kv， +3.5kv时对30种染料的质谱响应信号的影响。
结果分析：当正离子模式的喷雾电压为+2.5kv，+2.8kv和+3.2kv时，苏丹红 I-IV、苏丹红7B、苏丹红G、苏丹黄、对位红、罗丹明B、罗丹明6G、碱性橙 21、碱性橙II、碱性橙22这13种染料的质谱响应信号较差。因而，最终确定+3.5kv 作正离子模式下的喷雾电压。
2.2负离子模式的喷雾电压的优化
本发明考察了质谱的负离子模式的喷雾电压分别-2.5kv，-2.8kv，-3.2kv， -3.5kv时对30种染料的质谱响应信号的影响。
结果分析：不同的负离子模式的喷雾电压对17种合成染料的质谱响应信号 相对值结果如图5所示。当负离子模式的喷雾电压为-3.2kv时，17种合成染料的 质谱响应信号较高。而在-2.5kv，-2.8kv和-3.2kv时，质谱响应信号较差。
经过上述步骤，30种合成染料的提取离子流图如图7所示。
实施例2合成染料筛查方法的建立
经过实施例1所述的色谱条件与质谱条件的优化，筛选数据库的建立步骤如 下：
(1)30种合成染料标样工作液的配制
分别移取适量14种单标(表1中的3～16)和2种混标(表1中的1、2) 标准储备液，乙腈定容，得到标样工作液，待测。
(2)30种合成染料标样工作液的化学成分分析
用超高效液相色谱－四极杆－静电场轨道阱高分辨质谱 UHPLC-Q-Orbitrap-MS对标样工作液进行化学成分分析。
所述色谱条件为：色谱柱：ACQUITY UPLC BEH Phenyl(phenyl柱)，内 径×长为2.1×100mm，粒径为1.7μm，流速0.2ml/min；进样体积：5μL；流动 相：乙腈和5mmol/L乙酸铵溶液；梯度洗脱测序如下：0～1min，90％乙酸铵溶 液；1～2min，90～80％乙酸铵溶液；2～3min，80～40％乙酸铵溶液；3～5min， 40～20％乙酸铵溶液；5～7min，20～5％乙酸铵溶液；7～10min，5％乙酸铵溶液； 10～11min，5～90％乙酸铵溶液；11～14min，90％乙酸铵溶液；所述百分数为 乙酸铵溶液占乙腈、乙酸铵溶液混合液的体积百分数；
所述质谱条件为：喷雾电压：正离子模式+3.5kv，负离子模式-3.2kv；离子 传输管温度：350℃；鞘气流速：45arb；辅助气流速：15arb；s-lens电压：50v； 加热温度：250℃；扫描范围：150-1000m/z；一级质谱全扫描(Full scan)分辨 率：R＝70000；自动增益控制做Full MS时C-Trap中的目标离子数目(AGC target)： 3e6；最大注入时间(Maximum IT)：100ms；数据依赖二级离子全扫描分辨率： R＝17500；AGC target：2e5；最大注入时间：50ms；归一化碰撞能：20ev，40ev， 60ev；动态排除：10s。
(3)建立30合成染料的筛查数据库
配制500μg/L的混标溶液，用于标准数据库的建立。采用Full MS/dd-MS2模式，以获取合成染料的精确质荷比、保留时间、二级碎片的信息。将合成染料 的名称、分子式、CAS、精确质荷比、化合物的加合方式、保留时间和二级碎片 信息输入TraceFinder以建立合成染料的筛查数据库，其在样品筛查时用于样品 中的合成染料的定性分析，并将一系列浓度梯度的合成染料标准品数据文件导入 tracefinder，建立30种合成染料的标准曲线用于后期样本中的合成染料的定量分 析。
经过上述步骤，其筛查数据库信息如表5所示。
表5 30种合成染料筛查数据库信息表
Figure BDA0003036236130000091
Figure BDA0003036236130000101
基于tracefinder的筛查流程及方法参数设置分别如图6、表4所示。
表4基于tracefinder的筛查参数设置信息
Figure BDA0003036236130000102
实施例3合成染料定量方法的建立
(1)前处理方法
牛奶、运动饮料：移取0.2mL样品，加入1mL甲醇-乙腈(2:3，v/v)提取 剂，涡旋振荡1min，在30℃下，超声提取30min；在12000rpm，4℃下，离心 15min；取上清液，过0.22μmPTFE膜后，上机。
牛肉制品：称取0.2g样品，加入1ml甲醇-乙腈(2:3，v/v)提取剂和10颗 研磨用的钢珠，于研磨仪中均质(研磨频率为50Hz，研磨时间为60s，研磨3 次，相邻间隔30s)后，在30℃下，超声提取30min；在12000rpm，4℃下，离 心15min；取上清液，重复上述提取步骤2次，合并上清液，加入正己烷除脂； 最后，过0.22μm PTFE膜后，上机。
(2)合成染料的筛查和定量
采用外标法及实施例2步骤(2)所述条件对30种合成色素进行定量。将超 高效液相色谱－四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱UHPLC-Q-Orbitrap MS检测得 到的样本数据导入实施例2建立的数据库进行筛查进行定性分析，并基于 TraceFinder中的合成染料标准曲线对样品中的合成染料进行定量分析。
结果分析：UHPLC-Q-Orbitrap MS测定30种合成染料的线性方程、相关系 数表6所示；牛奶、运动饮料以及牛肉制品中30种合成染料的检出限和定量限 如表7所示；牛奶、运动饮料以及牛肉制品中30种合成染料的的回收率和相关 系数(n＝6)如表8所示。
表6 30种合成染料的线性方程、相关系数
Figure BDA0003036236130000111
Figure BDA0003036236130000121
从表6可以看出，30种合成染料的线性方程的相关系数均大于0.99。
表7 30种合成染料的检出限和定量限
Figure BDA0003036236130000122
从表7可以看出，牛奶基质的检出限和定量限分别为0.23～4.54μg/kg和 0.77～15.13μg/kg；运动饮料基质的检出限和定量限分别为0.29～5.48μg/kg和 0.96～18.25μg/kg；牛肉制品基质的检出限和定量限分别为0.57～6.28μg/kg和 1.92～20.52μg/kg。
表8牛奶、运动饮料以及牛肉制品中30种合成染料的的回收率和相关系数(n＝6)
Figure BDA0003036236130000123
Figure BDA0003036236130000131
Figure BDA0003036236130000141
Figure BDA0003036236130000151
综上所述，本发明通过对样品的前处理条件以及优化UHPLC-Q-Orbitrap MS 测的色谱、质谱条件，提供了一种能够同时测定多组分食品中多类别合成染料的 方法，通过该方法能够在短时间分离多类别合成染料，并通过精确质量数、二级 碎片和保留时间等参数对染料进行定性，高效测定食品中30种合成染料的含量。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明技术方案所作的举例， 而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则 之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范 围之内。

Claims (5)

1.一种基于UHPLC-Q-Orbitrap MS筛查和定量30种合成染料的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.通过超高效液相色谱－四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱UHPLC-Q-Orbitrap MS获取30种合成染料标准物质的精确质荷比、保留时间、二级碎片的信息，将合成染料的名称、分子式、CAS、精确质荷比、化合物的加合方式、保留时间和二级碎片信息输入TraceFinder以建立合成染料的筛查数据库；将一系列浓度梯度的合成染料标准品数据文件导入TraceFinder，建立30种合成染料的标准曲线用于后期样本中的合成染料的定量；
S2.将待测样品加入提取剂中，经涡旋振荡后超声提取，离心取上清液，过膜，检测过膜后的上清液，通过超高效液相色谱－四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱UHPLC-Q-OrbitrapMS进行检测；
S3.将步骤S2检测得到的样本数据导入步骤S1数据库进行筛查，并基于TraceFinder对合成染料进行定性定量分析；
所述30种合成染料为柠檬黄、诱惑红、苋菜红、胭脂红、日落黄、亮蓝、赤藓红B、靛蓝、苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ、苏丹红7B、苏丹红G、苏丹黄、对位红、喹啉黄、罗丹明B、罗丹明6G、酸性蓝3、监牢绿、碱性橙21、碱性橙Ⅱ、碱性橙22、酸性橙1、酸性橙2、偶氮玉红、酸性黄36、颜料橙5、颜料红53:1；
步骤S1、S2所述超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱UHPLC-Q-OrbitrapMS的色谱和质谱条件为：
所述色谱条件为：色谱柱：苯基柱ACQUITY UPLC BEH Phenyl，内径×长为2.1×100mm，粒径为1.7μm；流速0.2mL/min；进样体积：5μL；流动相：乙腈和5mmol/L乙酸铵溶液；梯度洗脱测序如下：0～1min，90％乙酸铵溶液；1～2min，90～80％乙酸铵溶液；2～3min，80～40％乙酸铵溶液；3～5min，40～20％乙酸铵溶液；5～7min，20～5％乙酸铵溶液；7～10min，5％乙酸铵溶液；10～11min，5～90％乙酸铵溶液；11～14min，90％乙酸铵溶液；所述百分数为乙酸铵溶液占乙腈、乙酸铵溶液混合液的体积百分数；
所述质谱条件为：喷雾电压：正离子模式+3.5kv，负离子模式-3.2kv；离子传输管温度：350℃；鞘气流速：45arb；辅助气流速：15arb；s-lens电压：50v；加热温度：250℃；扫描范围：150-1000m/z；一级质谱全扫描分辨率：R＝70000；自动增益控制做Full MS时C-Trap中的目标离子数目：3e6；最大注入时间：100ms；数据依赖二级离子全扫描分辨率：R＝17500；AGCtarget：2e5；最大注入时间：50ms；归一化碰撞能：20ev，40ev，60ev；动态排除：10s；
步骤S2所述的样品包括牛奶、运动饮料、牛肉制品中的任意一种或多种；所述提取剂为甲醇和/或乙腈；甲醇和乙腈的体积比为(1～16)：4。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S2所述超声功率为40kHz，超声温度30℃，超声时间为15min。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S2所述离心转速为12000rpm，温度4℃，离心时间为15min。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S2所述过膜所用的膜的孔径为0.22μm。
5.权利要求1～4任一所述方法在食品质量安全检测或出入境检验检疫中的应用。
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