CN109444320B - 一种高效薄层色谱-质谱联用快速筛检米面制品中荧光增白剂的方法 - Google Patents

Abstract

一种高效薄层色谱‑质谱联用快速筛检米面制品中荧光增白剂的方法，属于食品检测技术领域。本发明将待测样品先在薄层色谱上展开，再进行薄层色谱扫描，之后高效薄层色谱结果在可视化条件下进行目标条带洗脱，最后原位质谱检测。本发明建立了一种高效薄层色谱‑质谱联用快速筛检米面制品中荧光增白剂的方法，可实现单次实验同时检测多种样品，实现高通量筛检。单次筛检过程从样品准备到获得最终结果可以控制在1‑2h以内，检测限可达到18~21μg/kg，检测方法可实现重复性RSD<3.4%，加标回收率在78.4%‑97.7%，此方法具有快速、准确、经济的优点；同时基于原位质谱检测方法的建立为平面高效薄层色谱与质谱联用分析提供了新的思路。

Description

一种高效薄层色谱-质谱联用快速筛检米面制品中荧光增白 剂的方法

技术领域

本发明涉及一种高效薄层色谱-质谱联用快速筛检米面制品中荧光增白剂的方法，属于食品检测技术领域。

背景技术

荧光增白剂（FWAs）是一种荧光染料，或称为白色染料，也是一种复杂的有机化合物。它的特性是能够吸收紫外光并同时发射人肉眼可见的蓝色光，与基质上的黄光互补而具有增白的效果，使肉眼看到的物质呈现强烈的白色效果。常用于某些合成纤维、造纸、制皂等工业。这种优势促使作为染色剂的FWAs在纺织和造纸工业中应用。传统观念认为面粉越白，越精细，制作传统面制品感官效果更佳。虽然这在营养价值上有所损害，但是感官效果是显著增强，前提是不使用添加剂时。因此，荧光增白剂的加入让消费者误以为这是精白面，而且增白剂的加入可以在同样白度的情况下变相增加出粉率，提高盈利。增白剂的使用在营养上对消费者几乎没有好处，弊大于利，仅仅是商家获利的手段。然而，越来越多的研究提供了大量证据表明FWAs暴露的不良影响，如致癌性和致畸性。因此，关于食品中FWAs残留的问题日益严格，并且FWAs在中国的食品包装中被禁止使用。除了在食品接触材料中非法添加外，基于掺假的FWAs正在成为食品安全的新的和更严重的威胁。因此，研究一种快速而可靠的分析方法用于控制米面食品中的荧光增白剂滥用行为具有至关重要的意义。

目前，食品中FWAs常用检测方法为高效液相色谱法，此方法样品的前处理复杂，需要将样品中大多数杂质去除，且检测时间较长，实验前需要进行长时间的系统平衡，测定过程只能逐一进行样品检测，无法实现大量样品的快速筛检。相反，仪器化的平面色谱（高效薄层色谱，HPTLC）能够解决上述问题，是一种理想的代替方法。因为每个板子都是独立的，因此检测不会受之前的干扰，即HPTLC方法的高通量是不受限制的。HPTLC分析方法可以实现多个样品的平行测定，大幅度的提升了筛选效率。由于HPTLC的此种优点应该受到控制实验室尤其是资源有限的实验室的高度重视。HPTLC的另外一个优点是可以与先进的检测设备联用，例如IR、SERS等，能够进行酶、杀菌剂以及抗氧化剂分析，这在柱色谱设备中是无法实现的。

由于荧光增白剂分子结构本身具备荧光特性，因此，多采用紫外或者质谱对其色谱分离结构进行检测。但是前者灵敏度和特异性低，而后者对分析设备要求高，制样步骤复杂，分析成本昂贵。荧光增白剂分子本身可以发射强烈的荧光，这一特性可以在色谱展开后的薄层板上原位实施，极其有利于薄层光密度扫描定量，原位电喷雾电离源质谱定性。因此，急需建立一种适用于高效薄层色谱与原位质谱的方法以实现荧光增白剂在薄层色谱上的高效快速检测。

发明内容

本发明的目的是克服上述不足之处，提供一种高效薄层色谱-质谱联用快速筛检米面制品中荧光增白剂的方法。

本发明的技术方案，所述方法是将待测样品先在薄层色谱上展开，再进行薄层色谱扫描，之后高效薄层色谱结果在可视化条件下进行目标条带洗脱，最后进行原位质谱检测。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将待测样品在薄层色谱上展开，后经薄层扫描仪荧光密度扫描定量，之后展开的高效薄层色谱在366nm可视化条件下经乙腈和甲酸铵缓冲液洗脱，最后洗脱液进入ESI源中，进行原位四级杆质谱仪分析。

在本发明的一种实施方式中，所述展开使用流动相是甲苯：乙酸乙酯=10：0.3（v/v）。

在本发明的一种实施方式中，所述原位质谱检测的检测区域是荧光拍照被分离的条带；所述拍照条件是366nm紫外灯下照射，营造可视化条件。

在本发明的一种实施方式中，所述原位质谱检测是在可视化条件下，经洗脱展开条带进行原位电喷雾电离源质谱检测。

其在本发明的一种实施方式中，将待测样品在薄层色谱上展开后经薄层扫描仪荧光密度扫描定量；将分离结果在366nm可视化条件下经乙腈和甲酸铵缓冲液洗脱，洗脱液进入电喷雾电离源中，进行原位四级杆质谱仪分析。

在本发明的一种实施方式中，所述待测样品包括小麦/大米面粉和小麦/大米面条。

在本发明的一种实施方式中，将所述样品5g小麦、大米面粉和切碎的小麦、大米面条，加入20mL乙酸乙酯，超声均质20min，静置5min，用5mL注射器吸取1mL上清液，经0.45μm有机膜过滤，即可得到排除主要基质干扰的待测样品。

在本发明的一种实施方式中，所述薄层色谱的分离为：将2-8 μL样品点样，点样后用甲苯：乙酸乙酯=10：0.3（v/v）作为流动相展开，上行展开距离50mm，展开完成后将硅胶板置于60℃平板加热器上充分干燥3 min。

在本发明的一种实施方式中，经展开后的样品进行薄层色谱扫描，之后置于366nm紫外灯下照射，在可视化条件下进行目标条带洗脱。

在本发明的一种实施方式中，经洗脱所使用洗脱液是乙腈和甲酸铵缓冲液，洗脱液进入ESI源中，进行原位电喷雾电离源质谱定性，通过不同FWAs的分子量，进行确定目标物。

在本发明的一种实施方式中，将所得硅胶板置于薄层扫描仪中进行扫描定量，薄层色谱扫描条件为汞灯，其测定波长为300-400nm。

在本发明的一种实施方式中，将经过高效薄层色谱板分离后所得的硅胶板置于薄层扫描仪中进行扫描定量，通过制标准曲线，计算样品FWAs含量。根据扫描定量所得检测结果得到标准曲线：FWA185为y=3.314x+111.531、FWA393为y=2.567x+3.322，计算样品荧光增白剂的含量；其中，y为色谱峰面积，单位Abs；x为荧光增白剂含量，单位ng。

本发明的有益效果：本发明建立了一种高效薄层色谱-质谱联用快速筛检米面制品中荧光增白剂的方法，可实现单次实验同时检测多种样品，实现高通量筛检。单次筛检过程从样品准备到获得最终结果仅需1-2 h，检测限可达到18~21 μg/kg，检测方法可实现重复性RSD<3.4%，加标回收率在78.4%-97.7%，此方法具有快速、准确、经济的优点；同时基于原位质谱检测方法的建立为平面高效薄层色谱与质谱联用分析开辟了新的视野。

附图说明

图1为实施例1待测样品与荧光增白剂混合标准溶液展开图；

图2-a为基质效应展开图；

图2-b为基质效应扫描图；

其中，A~G分别为面粉1，面粉2，面粉3，荧光增白剂混合标准溶液，面条1，面条2，面条3。

图3-a为实施例3面粉1、面条1加标回收率展开图；

图3-b为实施例3面粉1、面条1薄层扫描定量图；

其中，A~D分别为面粉1（FWA185 600pg/zone），荧光增白剂混合标准溶液（300pg/zone），荧光增白剂混合标准溶液（1000pg/zone），面条1（FWA185和FWA393 800pg/zone）。

图4-a为实施例4面粉1质谱检测定性图；

图4-b为实施例4面条1质谱检测定性图。

具体实施方式

实施例1

（1）FWAs标准液的制备：用甲醇：乙酸乙酯=1：9为溶剂，分别制备浓度为0.01mg/mL的FWA185和FWA393的标准溶液，之后建立标准曲线需将标准液进行稀释至0.001和0.0001mg/mL；

（2）高效薄层色谱分离：将4-8μL FWA185和FWA393的混合标准品、小麦/大米面粉及小麦/大米面条样品用Linomat 5进行精确点样，点样完成后用展开液（甲苯：乙酸乙酯=10：0.3（v/v））展开，上行展开距离50 mm，展开完成后取出硅胶板置于60℃平板加热器上充分干燥3 min；

（3）薄层扫描仪扫描定量：将步骤（2）高效薄层色谱板置于薄层扫描仪中进行扫描定量，光源为汞灯，扫描波长为220-400nm。扫描结束后，以扫描面积为y轴，FWAs质量为x轴，制作标准曲线。结果如图2-b和图3-b所示。通过标准曲线计算样品FWAs含量。

（4）原位ESI-MS检测定性：将硅胶板置于连有TLC-MS接口的366nm可视条件下，通过70%乙腈和30%甲酸铵的缓冲液20mL，以0.2mL/min的速度进行洗脱，之后洗脱液被注入ESI源中，进行四级杆质谱仪定性分析。

其中，实施例1待测样品与荧光增白剂混合标准溶液展开图如图1所示。

实施例2

具体实施方式同实施例1，区别在于，展开流动相的选取，经试验甲苯：乙酸乙酯=10：0.3（v/v）展开效果最佳，之后进行基质效应实验，使用同样比例流动相进行展开，展开效果无明显区别，说明样品基质对展开无明显干扰，之后加标回收率展开均用此流动相。

实施例3

（1）分别对小麦、大米面粉及小麦、大米面条以不同的加标量进行检测。

小麦、大米面粉及小麦、大米面条的预处理：将所述样品5g小麦、大米面粉及切碎的小麦、大米面条，分别加入20mL乙酸乙酯，超声均质20min，静置5min，用5mL注射器吸取1mL上清液，经0.45μm有机膜过滤，将其在4℃中冷藏。

加标回收率样液的预处理：将所述样品5g小麦面粉及切碎的小麦面条，分别加入20mL乙酸乙酯，超声均质20min，静置5min，用5mL注射器吸取1mL上清液，经0.45μm有机膜过滤，小麦面粉萃取液中加入15μL 0.01mg/mL的FWA185，小麦面条萃取液中加入10μL0.01mg/mL的FWA185及10μL 0.01mg/mL的FWA393，将其在4℃中冷藏。

（2）采用0.5MPa氮气为载体，用100μL注射器(CAMAG)将样品和叶酸标准品用Linomat 5进行精确点样于20×10 cm的薄层板上，点样的条带长6 mm，条带距离底部8 mm，距离左端12 mm，条带间距1.7 mm。点样完成后用ADC-2 (CAMAG)展开仪展开，展开前，通过在另一槽注入10 mL的流动相使缸内达到饱和状态。取10 mL优化后的展开液（甲苯：乙酸乙酯=10：0.3（v/v）），上行展开50 mm取出，置于60℃平板加热器上充分干燥3 min。随后将薄层板进行薄层扫描仪荧光密度扫描定量，扫描条件与实施例1中步骤（3）相同。

之后将其置于DD70成像系统(Biostep)上，在366nm的照明下获取硅胶板的图像，并将其在366nm可视化条件下经乙腈和甲酸铵缓冲液洗脱目标条带，最后洗脱液进入ESI源中，进行原位四级杆质谱仪分析。人工添加不同含量的不同FWAs均能够获得清晰的成像，图3-a和3-b结果显示，根据A-J的检测结果可计算不同样品FWAs回收率的标准曲线，将小麦面粉及面条的色谱峰值代入标准曲线，经计算，小麦面粉中FWA185含量为534.22ng，小麦面条中FWA185和FWA393含量分别为728.67ng，738.11ng，小麦面粉中FWA185加标回收率为89%，小麦面条中FWA185和FWA393的加标回收率分别为91%和92.3%，与HPLC检测结果基本一致。

实施例4

将展开的硅胶板置于连有TLC-MS接口的366nm可视条件下，通过70%的乙腈和30%甲酸铵缓冲液20mL，以0.2mL/min的速度进行洗脱，之后洗脱液被注入ESI源中，进行四级杆质谱仪定性分析。具体如图4-a和4-b所示，其中图4-a为面粉1质谱检测定性图，图4-b为面条1质谱检测定性图。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (3)

1.一种高效薄层色谱-质谱联用快速筛检米面制品中荧光增白剂的方法，其特征在于：首先将待测样品先在薄层色谱上展开，再进行薄层色谱扫描，最后进行原位质谱检测；具体步骤为：

（1）FWAs标准液的制备：用甲醇：乙酸乙酯=1：9为溶剂，分别制备浓度为0.01mg/mL的FWA185和FWA393的标准溶液，之后建立标准曲线需将标准液进行稀释至0.001和0.0001mg/mL；

（2）高效薄层色谱分离：将4-8μL FWA185和FWA393的混合标准品、小麦/大米面粉及小麦/大米面条样品用Linomat 5进行精确点样，点样完成后用甲苯：乙酸乙酯=10：0.3，v/v展开液展开，上行展开距离50 mm，展开完成后取出硅胶板置于60℃平板加热器上充分干燥3min；

（3）薄层扫描仪扫描定量：将步骤（2）中的硅胶板置于薄层扫描仪中进行扫描定量，光源为汞灯，扫描波长为220-400nm；扫描结束后，以扫描面积为y轴，FWAs质量为x轴，制作标准曲线，通过标准曲线计算样品FWAs含量；

（4）原位ESI-MS检测定性：将硅胶板置于连有TLC-MS接口的366nm可视条件下，通过70%乙腈和30%甲酸铵的缓冲液20mL，以0.2mL/min的速度进行洗脱，之后洗脱液被注入ESI源中，进行四级杆质谱仪定性分析。

2.根据权利要求1所述高效薄层色谱-质谱联用快速筛检米面制品中荧光增白剂的方法，其特征在于：所述标准曲线FWA185为y=3.314x+111.531、FWA393为y=2.567x+3.322；其中，y为色谱峰面积，单位Abs；x为荧光增白剂含量，单位ng。

3.权利要求1或2所述方法在筛检米面制品中荧光增白剂检测领域的应用。

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