CN116879460A - 液相色谱串联质谱法同时检测多种氨基酸和激素的方法及前处理方法 - Google Patents

液相色谱串联质谱法同时检测多种氨基酸和激素的方法及前处理方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及检测技术领域，尤其涉及一种液相色谱串联质谱法同时检测血液或脑脊液中多种氨基酸和激素的方法。本发明方法包括：制备得到标准曲线方程，对待测样本进行前处理，获得用于检测氨基酸和激素的进样样本；使用高效液相色谱质谱联用仪对进样样本进行检测，将样本检测结果代入标准曲线方程，得到待测样本中多种氨基酸和激素的含量。本发明可同时对血液或脑脊液中含量差异很大的7种氨基酸和11种激素同时进行检测。本发明的前处理通过蛋白沉淀和固相萃取结合的方式，简单易行，且能大程度地排除其他物质对待测物质的干扰，灵敏度高，精确定量。本发明的检测方法大大节省了测定多种氨基酸和激素的分析时间，降低了分析成本。

Description

液相色谱串联质谱法同时检测多种氨基酸和激素的方法及前 处理方法
技术领域
本发明涉及检测技术领域，尤其涉及一种液相色谱串联质谱法同时检测血液或脑脊液中多种氨基酸和激素的方法及前处理方法。
背景技术
在临床疾病诊断中，很多内源性化合物具有重要的生物学意义，其中体液内氨基酸和激素的变化尤为重要，多种疾病的诊断都需要对其进行体液含量测定。人体内氨基酸是构成包括催化新陈代谢的酵素和酶的基本单位，参与保持各类激素的活性。而类固醇激素水平的异常与一系列疾病的发生密切相关，如有文献报道进行脑梗死患者血液与脑脊液中多种性腺轴激素的联合检测及与临床病理参数的对比研究。同时还有报道研究下丘脑－垂体－性腺轴的激素改变会导致的血脂、血液黏稠度。另外还包括多囊卵巢综合征、情绪障碍等这些疾病的发病机制不尽相同，监控激素及氨基酸水平的变化有助于疾病发病机制的精确诊断。所以更需要建立一种灵敏且稳定的检测方法用于测定临床患者体液包括血液、脑脊液中氨基酸及类固醇激素类物质。
人体内激素种类繁多、结构近似，采用免疫学方法容易产生交叉干扰，而LC-MS/MS是一种基于待测物离子质荷比实现准确定量的技术，具有独特的灵敏度和特异性，也逐渐成为医学检验实验室进行激素检测的重要选择，尤其是针对含量极低的激素检测。但在特定的应用场景下，液质联用技术面临很多实际的问题。受限于物质的极性、酸碱性等理化性质，同一来源的生物样本不同物质含量差异等原因，会开展不同的样本前处理方法和分析方法来进行检测。在这种需要多种检测方法的前提下，若想满足出具报告的速度和质量，就需要增加设备和人员的投入。并且更换一次前处理方法和色谱体系至少需要消耗2小时进行，不断更换色谱体系的过程会严重影响实验室的工作效率，还会耗费耗材、人力及场地。另一方面临床上很多生物样品，如脑脊液受到自身特点和采集条件的限制，能够采集到的样品量有限，无法满足多次检测。更多样本采集量，会给患者带来更大的伤害。
由于激素类在生物样本中含量极低，难以与其他类物质同时检测，在现有技术中大部分只能将部分氨基酸、激素分别进行检测，因此需要两次检测。已报道的现有检测技术方法大多十分复杂，如需要进行衍生化的前处理方式，而由于种类不同进行衍生的条件也不同，衍生时间长操作麻烦，且大部分衍生试剂对环境和人体有害性大。
因此临床上需要一种简单、安全、快速同时检测多种氨基酸和激素的方法。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种液相色谱串联质谱法同时检测血液或脑脊液中多种氨基酸和激素的方法。
本发明提出一种液相色谱串联质谱法同时检测多种氨基酸和激素的方法，氨基酸包括异亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、犬尿氨酸；激素包括孕酮、孕烯醇酮、二氢孕酮、四氢孕酮、别孕烯醇酮、睾酮、脱氢表雄酮、雄烷二醇(3α,17β)、二氢睾酮、雌三醇和雌二醇；方法至少包括以下步骤：
S1、制备得到标准曲线方程：配制标准溶液，使用高效液相色谱质谱联用仪对标准溶液进行检测，获得用于计算血液或脑脊液样本中激素和氨基酸含量的标准曲线方程；
S2、待测样本的前处理，包括：
将同一待测样本分为2份：待测样本a、待测样本b；
取混合氨基酸内标工作液和待测样本a，加入蛋白沉淀剂混匀后离心，取上清液I，加入水稀释得到含氨基酸的溶液I；
取混合激素内标工作液和待测样本b混匀，进行固相萃取，收集含激素成分的洗脱液，干燥后与溶液I混合，离心后的上清作为进样样本，用于进样分析；蛋白沉淀剂选自甲醇；所述固相萃取的洗脱液采用乙腈，并在收集洗脱液前依次用水、体积百分比20％～40％甲醇水、体积百分比5％～15％乙腈水进行淋洗；
S3、检测进样样本，包括：
使用高效液相色谱质谱联用仪对进样样本进行检测，将进样样本的检测结果代入标准曲线方程，得到待测样本中多种氨基酸和激素的含量。
可选的，S1包括：内标工作液的配制、标曲工作液的配制和标准溶液的配制，内标工作液的配制包括：分别配制混合激素内标工作液、混合氨基酸内标工作液；标曲工作液的配制包括：分别配制混合激素标曲工作液，混合氨基酸标曲工作液。
可选的，标准溶液的配制包括：取混合氨基酸内标工作液和不同浓度的混合氨基酸标曲工作液，加入蛋白沉淀剂混匀得混合液，混合液中加入水，混匀得到含氨基酸的溶液I’；取混合激素内标工作液和不同浓度的混合激素标曲工作液，干燥后用溶液I’溶解；制成梯度浓度的标准溶液；将标准溶液采用高效液相色谱质谱联用仪进行检测，获得标准曲线方程。
可选的，S1中，混匀的条件为1000～2500rpm下涡旋混匀30s～1min；混合氨基酸内标工作液与混合氨基酸标曲工作液的体积比为1：1；混合氨基酸内标工作液、蛋白沉淀剂的体积比为1：15～20；混合液与水的体积比为1：8～10；混合激素内标工作液、混合激素标曲工作液的体积比为1：1。
可选的，在S2中，在进样样本的制备过程中，混匀的条件为2000rpm～2500rpm混匀3～5min，离心的条件为12000～14000rpm离心5～10min。
可选的，待测样本为血清样本时：
取混合激素内标工作液和待测样本b混匀后，还有加入蛋白沉淀剂、混匀、离心，取上清液II加入水混合的步骤；待测样本a、待测样本b的体积比为1：20；在进样样本的制备过程中，待测样本a与混合氨基酸内标工作液的体积比为1：1，待测样本a与蛋白沉淀剂的体积比为1：15～20；上清液I与水的体积比为1：8～10；待测样本b与混合激素内标工作液的体积比为20：1，待测样本b与蛋白沉淀剂的体积比为1：2～2.5；上清液II与水的体积比为1：1～1.2。进一步可选的，待测样本a、待测样本b的体积分别为10μL～20μL、200μL～400μL。
可选的，待测样本为脑脊液样本时：
待测样本a、待测样本b的体积比为1：25；在进样样本的制备过程中，待测样本a与混合氨基酸内标工作液的体积比为2：1，待测样本a与蛋白沉淀剂的体积比为2：15～20；上清液I与水的体积比为1：8～10；待测样本b与混合激素内标工作液的体积比为50：1。进一步可选的，待测样本a、待测样本b的体积为20μL～30μL、500μL～750μL。
可选的，使用高效液相色谱质谱联用仪分析时色谱柱采用五氟苯基色谱柱，优选Kinetex F5色谱柱，填料粒径为2.6μm；
色谱分析条件为：流动相：A相：含0.4mmol/L～0.5mmol/L氟化铵的水；B相：甲醇；流速为：0.4mL/min～0.5mL/min；
梯度洗脱条件：
0.00～1.00min，A相采用浓度A1，B相采用浓度B1；
1.01～3.00min，A相采用浓度A2，B相采用浓度B2；
3.00～3.50min，A相由浓度A2匀速变化至浓度A3，B相：由浓度B2匀速变化至浓度B3；
3.50～12.00min，由浓度A3匀速变化至浓度A4，B相：由浓度B3匀速变化至浓度B4；
12.01～12.50min，由浓度A4匀速变化至浓度0，B相：由浓度B4匀速变化至100％；
12.50～13.00min，A相为0％；B相为100％；
13.01～15.00min，A相采用浓度A1，B相采用浓度B1；
浓度A1选自95％～90％，浓度B1选自5％～10％，浓度A1+浓度B1＝100％；
浓度A2选自85％～75％，浓度B2选自15％～25％，浓度A2+浓度B2＝100％；
浓度A3选自60％～65％，浓度B3选自35％～40％，浓度A3+浓度B3＝100％；
浓度A4选自10％～20％，浓度B4选自80％～90％，浓度A4+浓度B4＝100％；
质谱分析条件为：采用电喷雾离子源，正负离子模式同时采集，多反应监测模式；雾化温度：500℃～600℃；电喷雾电压：5500/-4000V；气帘气：20～30L/min；碰撞气：6～10L/min；雾化气：55～65L/min；辅助气：55～65L/min。
具体的，本发明提出一种液相色谱串联质谱法同时检测血液中多种氨基酸和激素时的前处理方法，至少包括以下步骤：
将同一血液样本分为2份：血液待测样本a、血液待测样本b；
取混合氨基酸内标工作液和血液待测样本a，加入蛋白沉淀剂混匀后离心，取上清液I，加入水稀释得到含氨基酸的溶液I；
取混合激素内标工作液和血液待测样本b混匀，加入蛋白沉淀剂、混匀、离心，取上清液II加入水混合的步骤；然后进行固相萃取，收集含激素成分的洗脱液，干燥后与溶液I混合，离心后的上清作为进样样本，用于进样分析；蛋白沉淀剂选自甲醇。
可选的，血液待测样本a、血液待测样本b的体积比为1：20；在进样样本的制备过程中，血液待测样本a与混合氨基酸内标工作液的体积比为1：1，血液待测样本a与蛋白沉淀剂的体积比为1：15～20；上清液I与水的体积比为1：8～10；血液待测样本b与混合激素内标工作液的体积比为20：1，血液待测样本b与蛋白沉淀剂的体积比为1：2～2.5；上清液II与水的体积比为1：1～1.2。待测样本为血清样本时。
可选的，血液待测样本a、血液待测样本b的体积分别为10μL～20μL、200μL～400μL。
具体的，本发明提出一种液相色谱串联质谱法同时检测脑脊液中多种氨基酸和激素时的前处理方法，至少包括以下步骤：
将同一脑脊液待测样本分为2份：脑脊液待测样本a、脑脊液待测样本b；
取混合氨基酸内标工作液和脑脊液待测样本a，加入蛋白沉淀剂混匀后离心，取上清液I，加入水稀释得到含氨基酸的溶液I；
取混合激素内标工作液和脑脊液待测样本b混匀，进行固相萃取，收集含激素成分的洗脱液，干燥后与溶液I混合，离心后的上清作为进样样本，用于进样分析；蛋白沉淀剂选自甲醇。
可选的，脑脊液待测样本a、脑脊液待测样本b的体积比为1：25；在进样样本的制备过程中，脑脊液待测样本a与混合氨基酸内标工作液的体积比为2：1，脑脊液待测样本a与蛋白沉淀剂的体积比为2：15～20；上清液I与水的体积比为1：8～10；脑脊液待测样本b与混合激素内标工作液的体积比为50：1。
可选的，脑脊液待测样本a、脑脊液待测样本b的体积为20μL～30μL、500μL～750μL。
本发明实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：
本发明可同时对血液或脑脊液中含量差异很大的7种氨基酸和11种激素同时进行检测。较常规单一的液质联用分析方法相比，本发明的同时检测方法至少缩短了一倍的分析时间，15分钟即可完成18种化合物的分析。只需一名实验人员能够通过一次前处理和一次上样即可完成18种性质不同的内源性化合物含量的测定，节省了人力和耗材，降低了分析成本。
本发明同时检测血液或脑脊液18种不同内源性化合物，所需要的样本量较常规单一的液质联用分析方法少，增加了患者依从性。
本发明标准工作液无需前处理，且标准工作液稳定性好，无需每次检测都制备标准工作液，只需对标准工作液进行简单稀释即可，缩短了前处理时长。
在优选的技术方案中，本发明使用同位素内标，提高了方法稳定性及重现性。并且使用标准曲线进行定量，能对待测的化合物精确定量，提高准确度，有助于临床对于疾病的正确判断。
本发明提供的检测方法检测准确性高，使用已知样本浓测试最大偏差不超过±12％，精密度不超过12％，灵敏度高。
本发明针对样本的特点，简化了前处理步骤，无需使用衍生等复杂的技术手段进行前处理，缩短了整体的前处理时长。并且不使用毒性较强的前处理试剂，对环境及实验人员更安全，降低了对实验人员的技术要求。
附图说明
图1为本发明实施例1、3中标准溶液中激素及氨基酸色谱图；
图2为本发明实施例1中血清样本中激素及氨基酸色谱图；
图3为本发明实施例3中脑脊液样本中激素及氨基酸色谱图；
图4、图5为本发明实施例5中血清样本中激素及氨基酸色谱图；
图6、图7为本发明对比例4中血清样本中激素P、E2色谱图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
本发明实施例提出一种液相色谱串联质谱法同时检测血液或脑脊液中多种氨基酸和激素的方法，氨基酸包括异亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、犬尿氨酸；激素包括孕酮、孕烯醇酮、二氢孕酮、四氢孕酮、别孕烯醇酮、睾酮、脱氢表雄酮、雄烷二醇(3α,17β)、二氢睾酮、雌三醇和雌二醇。本发明实施例检测方法的待测样本可以为多种，包括血液和脑脊液，血液包括血清、血浆及抗凝全血。本发明实施例所检测多种氨基酸和激素的简写具体如表1所示：
表1
由于人体液内氨基酸和激素的含量水平差异巨大，因此，如何采用同一个检测体系一次性的检出就成为一个巨大的难题。为了解决技术问题，本发明实施例创新地提出了一种全新的前处理方法，将待测样本分为2份，分别用于氨基酸和激素的提取，通过巧妙的前处理方法设计将氨基酸和激素合并为一个进样样本，采用固液萃取的方式，从而实现了氨基酸和激素经同一个检测体系一次性的检出，显著的提高了检测效率。
具体的，本发明实施例的检测方法包括三个步骤：S1：标准曲线的制备、S2：样本前处理、S3：使用高效液相色谱质谱联用仪对处理后的样本进行上机检测。
优选的，本发明的内标采用同位素内标，18种待测物所使用内标也如表1所示。
本发明实施例的S1具体包括：制备标准曲线方程，用于计算激素和氨基酸含量。具体包括以下步骤：
S11、溶液的配制，具体包括：内标工作液的配制、标曲工作液的配制和标准溶液的配制；
S111、内标工作液的配制：分别配制混合激素内标工作液、混合氨基酸内标工作液；
其中，混合激素内标工作液中含有10种激素的同位素内标，混合氨基酸内标工作液中含有7种氨基酸的同位素内标。
作为本发明一种具体实施方式，内标工作液的配制方法：精密称量各个化合物的内标标准品，使用内标标准品的溶解液至一定浓度，作为内标标准品储备液保存至-20℃。分别取各个化合物内标标准品储备液混合并使用稀释液稀释至如表2所示的浓度，得到内标工作液。溶解氨基酸内标标准品的溶解液可采用含有体积百分比为65％～75％甲醇水溶液(优选为70％)，溶解激素内标标准品的溶解液可采用纯甲醇溶解。
表2
S112、标曲工作液的配制：分别配制混合激素标曲工作液，混合氨基酸标曲工作液。
作为本发明一种具体实施方式，标曲工作液的配制采用：精密称量各个化合物标准品，使用标准品的溶解液至一定浓度，作为标准品储备液保存至-20℃。分别取各个化合物标准品储备液混合并稀释至表3～表4的浓度，得到两种标曲工作液。溶解氨基酸标准品的溶解液可采用含有体积百分比为65％～75％(优选为70％)甲醇水溶液，溶解激素标准品的溶解液可采用纯甲醇溶解。
表3
表4
级别 Glu/Asp/Phe/Ile/Try/Met(μg/mL) Kyn(μg/mL)
L7 80 5
L6 40 2.5
L5 20 1.25
L4 8 0.5
L3 4 0.25
L2 2 0.125
L1 0.8 0.05
S113、标准溶液的配制包括：取混合氨基酸内标工作液和不同浓度的混合氨基酸标曲工作液，加入蛋白沉淀剂混匀得混合液，混合液中加入水，混匀得到含氨基酸的溶液I’；取混合激素内标工作液与不同浓度的混合激素标曲工作液混合，干燥后与溶液I’混合；制成梯度浓度的标准溶液；
S12、利用高效液相色谱质谱联用仪对标准溶液进行检测，得到不同浓度的标准溶液和内标物的标准溶液色谱图，从上述标准溶液色谱图中分别得到标准溶液和内标物的峰面积，分别以上述不同浓度的标准溶液的峰面积与内标物峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y1，以上述标准工作液中的浓度与内标工作液浓度的比值为作为标准曲线方程的横坐标x1，将以上检测所得的不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y1＝a×x1+b，并且得出线性方程系数a、b。
作为本发明实施例优选的技术方案，在S113中，混匀的条件为1000～2500rpm下涡旋混匀30s～1min。根据该步骤可知，本发明标曲制备中无需添加基质血进行前处理，仅需要旋涡混匀即可，简化了标曲制备步骤，缩短了标曲制备时长。
作为本发明实施例优选的技术方案，在S113中，标准溶液的配制中：混合氨基酸内标工作液与混合氨基酸标曲工作液的体积比为1：1，混合氨基酸内标工作液、蛋白沉淀剂的体积比为1：15～20，混合液与水的体积比为1：8～10；混合激素内标工作液、混合激素标曲工作液的体积比为1：1。优选的，混合氨基酸内标工作液、蛋白沉淀剂的体积比可以为1：15、1：16、1：18、1：20，并优选1：18；混合液与水的体积比为1：8、1：9、1：10，并优选为1：9。
本发明实施中，蛋白沉淀剂选自甲醇。甲醇作为蛋白沉淀剂，兼顾了激素和氨基酸的检测效果，所有色谱峰出峰位置均没有干扰，且有较高的提取回收率，保证了检测的灵敏度和准确度。
作为本发明实施例一个具体实施方式，标准溶液的标定可采用以下方法：
取混合激素内标工作液10μL、混合激素标曲工作液10μL置于1.5mL离心管1中，氮气吹干。
取混合氨基酸内标工作液10μL、混合氨基酸标曲工作液10μL及甲醇180μL置于1.5mL离心管2中，1000～2500rpm下涡旋混匀30s～1min后，取20μL混匀液加入180μL水1000～2500rpm下涡旋混匀30s～1min后，取混匀液50μL置于吹干的1.5mL离心管1中。混合制成7种不同浓度的标准溶液。
作为本发明实施例待测样本前处理的优选技术方案，具体包括：
S21、将待测样本分为2份：待测样本a和待测样本b，待测样本a用于氨基酸的提取，待测样本b用于激素的提取；
S22、取混合氨基酸内标工作液和待测样本a，加入蛋白沉淀剂混匀后离心，取上清液I，加入水稀释得到含氨基酸的溶液I；取混合激素内标工作液和待测样本b混匀，进行固相萃取，收集含激素成分的洗脱液，干燥后与溶液I混合后离心，取上清为进样样本，用于进样分析。与标曲制备过程相同，蛋白沉淀剂选自甲醇。
在S21中，本发明实施例将待测样本分为两份，分别为待测样本a和待测样本b，其中，待测样本a用于检测血清或脑脊液中的氨基酸，待测样本b用于检测血清或脑脊液中的激素。由于两类待测物质在待测样本中的含量差异巨大，性质差异也非常大，因此采用了分别提取后再合并的方式，保证了提取的效果。
作为前处理步骤中进一步优选的实施方式，在进样样本的制备过程中，混匀的条件为2000rpm～2500rpm混匀3～5min，离心的条件为12000～14000rpm离心5～10min。固相萃取采用负载有Oasis PRiME前处理小柱的SPE板。本发明实施例通过研究后发现，由于激素含量低，采用其他提取方法如蛋白沉淀或液液萃取等无法满足灵敏度和准确度的要求，因此，采用了固相萃取的方法。经研究发现，洗脱液采用乙腈可将激素完全洗脱，并在收集洗脱液前依次用水、体积百分比为20％～40％甲醇水溶液、体积百分比为5％～15％乙腈水溶液进行淋洗，以去除杂质。进一步优选的，收集洗脱液前依次用水、体积百分比为30％甲醇水溶液、体积百分比为10％乙腈水溶液进行淋洗。经过筛选的淋洗和洗脱两步骤结合从而达到最大提取回收率。作为前处理步骤中进一步优选的实施方式，在进样样本的制备过程中，混匀的条件为2500rpm混匀5min，离心的条件为14000rpm离心5min。
本发明实施例中的待测样本可以为血清样本或脑脊液样本，并针对样本的特点对前处理的具体条件进行了研究，血清样本的蛋白杂质的含量多，脑脊液样本的蛋白质杂质含量少，同时待测物质的含量低，因此，根据样本的不同，前处理条件具体如下：
当待测样本为血清样本时；待测样本a和待测样本b的体积比为1：20；由于激素在血清中的含量较低，因此，本发明提高了用于激素检测的样本量，可以收集更多的待测物质，提高检测的灵敏度。在一个具体的实施方式中，待测样本a、待测样本b的体积可以分别为10μL～20μL、200μL～400μL，优选为10μL、200μL。
由于血清中的蛋白杂质多，因此不仅需要在用于检测氨基酸的待测样本a中加入蛋白沉淀剂，同时在用于检测激素的待测样本b中也要加入蛋白沉淀剂进行一步蛋白沉淀；具体步骤为，取混合激素内标工作液和待测样本b混匀，加入蛋白沉淀剂后混匀、离心，取上清液II加入水混匀。
具体的，进样样本的制备过程中，待测样本a与混合氨基酸内标工作液的体积比为1：1，待测样本a与蛋白沉淀剂的体积比为1：15～20，优选为1：18；上清液I与水的体积比为1：8～10，优选为1：9。在一个进样样本制备的具体实施方式过程中，待测样本a、混合氨基酸内标工作液、蛋白沉淀剂的体积分别为10μL、10μL、180μL；上清液I与水的体积为20μL、180μL。
具体的，待测样本b与混合激素内标工作液的体积比为20：1，待测样本b与蛋白沉淀剂的体积比为1：2～2.5，优选为1：2.25；上清液II与水的体积比为1：1～1.2，优选为1：1。在一个进样样本制备的具体实施方式过程中，待测样本b、混合激素内标工作液、蛋白沉淀剂的体积为200μL、10μL、450μL；上清液II与水的体积分别为450μL、450μL。
当待测样本为脑脊液样本时，本申请实施根据各类物质在脑脊液中的含量特点，待测样本a、待测样本b的体积比为1：25。由于激素在血清中的含量低。因此，本发明提高了用于激素检测的样本量，从而可以收集更多的待测物质，提高检测的灵敏度。在一个具体的实施方式中，待测样本a、待测样本b的体积比分别为20μL～30μL、500μL～750μL，优选为20μL、500μL。
其中，待测样本a与混合氨基酸内标工作液的体积比为2：1，待测样本a与蛋白沉淀剂的体积比为2：15～20，优选为2：17；上清液I与水的体积比为1：8～10，优选为1：9。和血清样本的前处理条件相比，由于脑脊液中待测物质的含量低，因此本发明通过反复试验，摸索到在该特定比例下，所添加的蛋白沉淀剂的体积均较低，在保证蛋白沉淀效果的同时避免了对待测样本进一步的稀释，在一个具体的实施方式中，待测样本a、混合氨基酸内标工作液、蛋白沉淀剂的体积为20μL、10μL、170μL；上清液I与水的体积为20μL、180μL。
其中，待测样本b与混合激素内标工作液的体积比为50：1，在脑脊液前处理过程中，由于脑脊液中蛋白含量低，同时激素水平更低，因此本发明实施例在研究中发现，在上述溶液体系下，对用于检测激素的待测样本b，不需要添加蛋白沉淀剂，仅需要将混合激素内标工作液与待测样本b混匀后进行固相萃取即可。在一个具体的实施方式中，待测样本b、混合激素内标工作液的体积为500μL、10μL。
作为本发明实施例对进样样本检测的优选技术方案，具体包括：
S3、使用高效液相色谱质谱联用仪对进样样本进行检测，将进样样本的检测结果代入标准曲线方程，得到待测样本中氨基酸和激素的含量。
作为上机检测进一步优选的实施方式，使用高效液相色谱质谱联用仪分析时色谱柱采用五氟苯基色谱柱，优选Kinetex F5色谱柱，填料粒径为2.6μm，3.0×50mm。与其他色谱体系相比，五氟苯基色谱柱可以同时满足对氨基酸、激素的分析，保证检测效果。
作为上机检测进一步优选的实施方式，在S1和S3中，使用高效液相色谱质谱联用仪对标准溶液和进样样本进行检测时：
色谱分析条件为：
流动相：A相：含0.4mmol/L～0.5mmol/L氟化铵的水；B相：甲醇；
流速为：0.4mL/min～0.5mL/min；
梯度洗脱条件：
0.00～1.00min，A相采用浓度A1，B相采用浓度B1；
1.01～3.00min，A相采用浓度A2，B相采用浓度B2；
3.00～3.50min，A相由浓度A2匀速变化至浓度A3，B相：由浓度B2匀速变化至浓度B3；
3.50～12.00min，由浓度A3匀速变化至浓度A4，B相：由浓度B3匀速变化至浓度B4；
12.01～12.50min，由浓度A4匀速变化至浓度0，B相：由浓度B4匀速变化至100％；
12.50～13.00min，A相为0％；B相为100％；
13.01～15.00min，A相采用浓度A1，B相采用浓度B1；
浓度A1选自95％～90％，浓度B1选自5％～10％，浓度A1+浓度B1＝100％；
浓度A2选自85％～75％，浓度B2选自15％～25％，浓度A2+浓度B2＝100％；
浓度A3选自60％～65％，浓度B3选自35％～40％，浓度A3+浓度B3＝100％；
浓度A4选自10％～20％，浓度B4选自80％～90％，浓度A4+浓度B4＝100％。
质谱分析条件为：采用电喷雾离子源(ESI)，正负离子模式同时采集，多反应监测(MRM)。离子源参数如表5所示，离子对参数如表6所示。
表5
表6
/>
作为一个具体的实施方式，本发明实施例还提出了一种液相色谱串联质谱法同时检测血液中多种氨基酸和激素时的前处理方法，至少包括以下步骤：
将同一血液样本分为2份：血液待测样本a、血液待测样本b；
取混合氨基酸内标工作液和血液待测样本a，加入蛋白沉淀剂混匀后离心，取上清液I，加入水稀释得到含氨基酸的溶液I；
取混合激素内标工作液和血液待测样本b混匀，加入蛋白沉淀剂、混匀、离心，取上清液II加入水混合的步骤；然后进行固相萃取，收集含激素成分的洗脱液，干燥后与溶液I混合，离心后的上清作为进样样本，用于进样分析；蛋白沉淀剂选自甲醇。
可选的，血液待测样本a、血液待测样本b的体积比为1：20；在进样样本的制备过程中，血液待测样本a与混合氨基酸内标工作液的体积比为1：1，血液待测样本a与蛋白沉淀剂的体积比为1：15～20；上清液I与水的体积比为1：8～10；血液待测样本b与混合激素内标工作液的体积比为20：1，血液待测样本b与蛋白沉淀剂的体积比为1：2～2.5；上清液II与水的体积比为1：1～1.2。可选的，血液待测样本a、血液待测样本b的体积分别为10μL～20μL、200μL～400μL，优选为10μL、200μL。
作为一个具体的实施方式，本发明实施例还提出一种液相色谱串联质谱法同时检测脑脊液中多种氨基酸和激素时的前处理方法，至少包括以下步骤：
将同一脑脊液待测样本分为2份：脑脊液待测样本a、脑脊液待测样本b；
取混合氨基酸内标工作液和脑脊液待测样本a，加入蛋白沉淀剂混匀后离心，取上清液I，加入水稀释得到含氨基酸的溶液I；
取混合激素内标工作液和脑脊液待测样本b混匀，进行固相萃取，收集含激素成分的洗脱液，干燥后与溶液I混合，离心后的上清作为进样样本，用于进样分析；蛋白沉淀剂选自甲醇。
可选的，脑脊液待测样本a、脑脊液待测样本b的体积比为1：25；在进样样本的制备过程中，脑脊液待测样本a与混合氨基酸内标工作液的体积比为2：1，脑脊液待测样本a与蛋白沉淀剂的体积比为2：15～20；上清液I与水的体积比为1：8～10；脑脊液待测样本b与混合激素内标工作液的体积比为50：1。
可选的，脑脊液待测样本a、脑脊液待测样本b的体积为20μL～30μL、500μL～750μL。
本发明实施例分别针对血液和脑脊液样本的特点，简化了前处理步骤，分别获得了可确保检测效果的前处理方法。并且该前处理方法无需使用衍生等复杂的技术手段进行前处理，缩短了整体的前处理时长，降低了检测成本和对实验人员的技术要求。
实施例1
本实施例用于说明检测血液中7种氨基酸及11种激素含量的液相色谱质谱联用分析方法，包括以下步骤：
(一)标准溶液的标定
取混合激素内标工作液10μL、混合激素标曲工作液10μL置于1.5mL离心管1中，氮气吹干。
取混合氨基酸内标工作液10μL、混合氨基酸标曲工作液10μL及甲醇180μL置于1.5mL离心管2中，2500rpm下涡旋混匀30s后，取20μL混匀液加入180μL水2500rpm下涡旋混匀30s后，取混匀液50μL置于吹干的1.5mL离心管1中。混合制成7种不同浓度的标准溶液。
利用高效液相色谱质谱联用仪对上述溶液进行检测，得到不同浓度的标准溶液和内标物的标准溶液色谱图，从上述标准溶液色谱图中分别得到标准溶液和内标物的峰面积，分别以上述不同浓度的标准溶液的峰面积与内标物峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y1，以上述标准工作液中的浓度与内标工作液浓度的比值为作为标准曲线方程的横坐标x1，将以上检测所得的不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y1＝a*x1+b，并且得出线性方程系数a、b。
内标工作液的配制：精密称量各个化合物内标标准品，使用内标标准品溶解液至一定浓度，作为内标标准品储备液保存至-20℃。分别取各个化合物内标标准品储备液混合并稀释至表2浓度，得到内标工作液。溶解氨基酸内标标准品的溶解液采用含有体积百分比为70％甲醇水溶液，溶解激素内标标准品的溶解液采用纯甲醇溶解。配制得到的内标工作液如表2所示。标准工作液的配制：精密称量各个化合物标准品，使用标准品溶解液至一定浓度，作为标准品储备液保存至-20℃。分别取各个化合物标准品储备液混合并稀释至表3～表4的浓度，得到18种内源性化合物的标准工作液，溶解氨基酸标准品的溶解液采用含有体积百分比为70％甲醇水溶液，溶解激素标准品的溶解液采用纯甲醇溶解。制备得到的标准工作液如表3～表4所示。
(二)血清样本的前处理方法：
取10μL混合氨基酸内标工作液，及10μL血清待测样本a，加入180μL甲醇，2500rpm混匀5min，14000rpm离心10min，取20μL上清液I，加入180μL水混匀。得到含氨基酸的溶液I。
取10μL混合激素内标工作液，及200μL血清待测样本b，加入450μL甲醇，2500rpm混匀5min，14000rpm离心10min，取450μL上清液II与450μL水混合后加入到经活化平衡的SPE板(Oasis PRiME)上，依次使用水、体积百分比30％甲醇水溶液、体积百分比10％乙腈水溶液进行淋洗。最后使用50μL乙腈收集清液，氮气吹干。使用含氨基酸的溶液I复溶。4000rpm离心5min后进样分析。
(三)待测样本的检测
使用高效液相色谱质谱联用仪对上述步骤(二)待测的样本进行检测，分别得出上述待测样本的目标物与相应内标的色谱图，从上述色谱图中可以得到目标物与相应内标峰面积，将目标物与相应内标峰面积的比值y1代入上述步骤(一)的标准曲线方程y1＝a*x1+b中，通过计算得到待检测样本中目标物与相应内标物的相对浓度x1，内标物工作液浓度是已知的，由此计算得到该待检测体液样本中18个待测化合物的浓度。
色谱分析所使用的色谱柱为：Kinetex F5，2.6μm，3.0×50mm；
流动相为：A相：含0.4mmol/L氟化铵的水；B相：甲醇；流速为：0.5mL/min；梯度洗脱条件如表7所示：
表7
时间 A％ B％
0.00 95.00 5.00
1.00 95.00 5.00
1.01 85.00 15.00
3.00 85.00 15.00
3.50 65.00 35.00
12.00 20.00 80.00
12.50 0.00 100.00
13.00 0.00 100.00
13.01 95.00 1.00
15.00 95.00 1.00
质谱条件采用电喷雾离子源(ESI)，正负离子模式同时采集，多反应监测(MRM)，离子源参数如表5所示，离子对参数如表6所示。
得到色谱图如图1、图2所示。
实施例2
实施例1中技术方法论证如下：
一、该方法的线性
按本实施例1测定条件，按浓度由低到高进行测定，分别以18种待测物色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值-18种待测物的浓度与内标物的浓度的比值作图，得到标准曲线。18种待测物浓度在线性范围如表8所示：
表8
根据表8所示数据，本发明的检测方法的线性范围宽，在上述线性范围内，线性良好，相关系数R2﹥0.99。
二、该方法的回收率和精密度
分别取标准工作液配制成低、中、高3种浓度进行加标回收率实验和精密度实验，按实施例1方法进行测定，回收率和精密度分别如表9～表10所示。
表9
表10
三、该方法的定量限及检出限
分别取低浓度血清样本，进行定量限及检出限实验，以三倍信噪比为检出限，10倍信噪比且连续检测6次定量结果变异系数不小于20％为定量限按本实施例1方法进行测定，定量限及检出限分别如表11、表12所示。
表11
单位：ng/mL Ile Asp Glu Met Phe Try Kyn
LOQ 7.26 7.01 9.32 7.95 6.95 7.47 0.50
LOD 2.18 2.10 2.80 2.38 2.09 2.24 0.15
表12
综合上述验证试验，实施例1检测方法的回收率、精密度和灵敏度等各项技术指标均符合要求，方法检测血液中18种待测物含量，精密度良好，加标回收率高，提高了检测结果的准确度和灵敏度。
实施例3
本实施例用于说明脑脊液中7种氨基酸及11种激素的检测方法：
(一)标准溶液的标定同实施例1；
(二)脑脊液样本的前处理方法：
取10μL混合氨基酸内标工作液，及20μL脑脊液待测样本a，加入170μL甲醇，2500rpm混匀5min，14000rpm离心10min，取20μL上清液I，加入180μL水混匀。得到含氨基酸的混合溶液2。
取10μL混合激素内标工作液，及500μL脑脊液待测样本b，2500rpm混匀1min后加入到经活化平衡的SPE板(Oasis PRiME)上，依次用水、30％甲醇水、10％乙腈水进行淋洗。最后使用50μL乙腈收集清液，氮气吹干。使用含氨基酸的混合溶液1复溶。4000rpm离心5min后进样分析。
(三)待测样本的检测条件同实施例1。
得到色谱图如图1、图3所示。
实施例4
本实施例3中技术方法论证如下：
一、该方法的线性
按本实施例3测定条件，按浓度由低到高进行测定，分别以18种待测物色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值-18种待测物的浓度与内标物的浓度的比值作图，得到标准曲线；结果表明18种待测物浓度在线性范围内，线性良好，相关系数R2﹥0.99。18种待测物浓度在线性范围如表13所示：
表13
根据表13所示数据，本发明的检测方法的线性范围宽，在上述线性范围内，线性良好，相关系数R2﹥0.99。
二、该方法的回收率和精密度
分别取标准工作液配制成低、中、高3种浓度进行加标回收率实验和精密度实验，按实施例3方法进行测定，回收率和精密度分别如表14、表15所示。
表14
/>
表15
三、该方法的定量限及检出限
分别取低浓度脑脊液样本，进行定量限及检出限实验，以三倍信噪比为检出限，10倍信噪比且连续检测6次，定量结果变异系数不小于20％为定量限，按实施例3方法进行测定，定量限及检出限分别如表16、表17所示。
表16
单位：ng/mL Ile Asp Glu Met Phe Try Kyn
LOQ 3.63 3.50 4.66 3.97 3.48 3.74 0.25
LOD 1.09 1.05 1.40 1.19 1.04 1.12 0.08
表17
单位：ng/mL DHEA DHP AP IP 3α-diol
LOQ 0.479 0.453 0.468 0.469 1.250
LOD 0.144 0.136 0.140 0.141 0.394
PE T DHT E3 E2 P
0.475 0.01 0.099 0.097 0.100 0.009
0.143 0.003 0.030 0.029 0.03 0.003
综合上述验证试验，实施例3方法的回收率、精密度和灵敏度等各项技术指标均符合要求，实施例3方法检测脑脊液中18种待测物含量，精密度良好，加标回收率高，提高了检测结果的准确度和灵敏度。
实施例5
一、比较不同梯度条件对检测效果的影响：
按照实施例1条件对血清样本前处理，并进行检测，区别在于，流速为：0.4mL/min；梯度洗脱条件如表18所示：
表18
实验结果如图4所示。
由实验结果可知：该洗脱条件下能得到预期效果。
二、比较不同流动相对检测效果的影响：
按照实施例1条件对血清样本前处理，并进行检测，区别在于，流动相为：A相：0.5mmol/L的氟化铵的水；B相：甲醇。实验结果如图5所示。
由实验结果可知：该流动相条件下能得到预期效果。
对比例1
以下对比例用于说明样本前处理步骤的技术效果。
采用实施例1的方法，区别仅在于改变以下条件：
前处理步骤：取10μL混合氨基酸激素内标工作液，及10μL血清待测样本，加入180μL甲醇，2500rpm混匀5min，14000rpm离心10min，取20μL上清液，加入180μL水混匀。得到进样溶液A。取10μL混合氨基酸激素内标工作液，及200μL待测样本，加入600μL甲醇，2500rpm混匀5min，14000rpm离心10min，取20μL上清液，加入180μL水混匀。得到进样溶液B。
上机检测，获得实验结果如表19所示。
表19
样品 待测样本量 激素响应值 氨基酸响应值
进样溶液A 10μL 无响应 响应均在仪器检测范围内
进样溶液B 200μL 无响应 响应均大于6e6超出仪器检测范围
结果显示：同一样本进行一次蛋白沉淀前处理无法同时检测激素及氨基酸，且蛋白沉淀检测激素信号远远低于目标响应，无法满足检测要求。
对比例2
以下对比例用于说明样本前处理步骤的技术效果。
采用实施例3的方法，区别仅在于改变以下条件：
前处理步骤：取20μL混合氨基酸激素内标工作液，及10μL脑脊液待测样本，加入180μL甲醇，2500rpm混匀5min，14000rpm离心10min，取20μL上清液，加入180μL水混匀。得到进样溶液A。取10μL混合氨基酸激素内标工作液，及500μL待测样本，加入600μL甲醇，2500rpm混匀5min，14000rpm离心10min，取20μL上清液，加入180μL水混匀。得到进样溶液B。
上机检测，获得实验结果如表20所示。
表20
样品 待测样本量 激素响应值 氨基酸响应值
进样溶液A 20μL 无响应 响应均在仪器检测范围内
进样溶液B 500μL 无响应 响应均大于6e6超出仪器检测范围
结果显示：同一样本进行一次蛋白沉淀前处理无法同时检测激素及氨基酸，且蛋白沉淀检测激素信号远远低于目标响应，无法满足检测要求。
对比例3
采用实施例1、3的方法，区别仅在于改变以下条件：
对血清样本进行处理时，前处理步骤中固相萃取中依次用水、10％乙腈水进行淋洗。最后使用50μL乙腈收集洗脱液。收集洗脱液后氮气吹干，使用初始流动相复溶进行检测。实验结果如表21所示。
表21
结果显示：只进行水及10％乙腈水两个步骤的淋洗，检测结果显示仍有待测氨基酸被检出，说明固相萃取淋洗不完全，会导致氨基酸检测结果较真实值高，检测结果不准确。
对比例4
采用实施例1、3的方法，区别仅在于改变以下条件：
流动相为：A相：水；B相：甲醇。
对血清样本进行检测时，实验结果如图6、7所示。
结果显示：该流动相条件下激素P、E2信噪比无法达到检测要求。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其他实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (14)

1.一种液相色谱串联质谱法同时检测多种氨基酸和激素的方法，其特征在于，
所述氨基酸包括异亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、犬尿氨酸；所述激素包括孕酮、孕烯醇酮、二氢孕酮、四氢孕酮、别孕烯醇酮、睾酮、脱氢表雄酮、雄烷二醇(3α,17β)、二氢睾酮、雌三醇和雌二醇；
所述方法至少包括以下步骤：
S1、制备得到标准曲线方程：配制标准溶液，使用高效液相色谱质谱联用仪对所述标准溶液进行检测，获得用于计算血液或脑脊液样本中激素和氨基酸含量的标准曲线方程；
S2、待测样本的前处理，包括：
将所述同一待测样本分为2份：待测样本a、待测样本b；
取混合氨基酸内标工作液和待测样本a，加入蛋白沉淀剂混匀后离心，取上清液I，加入水稀释得到含氨基酸的溶液I；
取混合激素内标工作液和待测样本b混匀，进行固相萃取，收集含激素成分的洗脱液，干燥后与所述溶液I混合，离心后的上清作为进样样本，用于进样分析；
所述固相萃取的洗脱液采用乙腈，并在收集洗脱液前依次用水、体积百分比为20％～40％甲醇水溶液、体积百分比为5％～15％乙腈水溶液进行淋洗；
其中，所述蛋白沉淀剂选自甲醇；
S3、检测所述进样样本，包括：
使用高效液相色谱质谱联用仪对所述进样样本进行检测，将所述进样样本的检测结果代入所述标准曲线方程，得到所述待测样本中多种氨基酸和激素的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S1包括：内标工作液的配制、标曲工作液的配制和标准溶液的配制，
所述内标工作液的配制包括：分别配制混合激素内标工作液、混合氨基酸内标工作液；
所述标曲工作液的配制包括：分别配制混合激素标曲工作液，混合氨基酸标曲工作液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，S1中，
所述标准溶液的配制包括：取所述混合氨基酸内标工作液和不同浓度的所述混合氨基酸标曲工作液，加入所述蛋白沉淀剂混匀得混合液，所述混合液中加入水，混匀得到含氨基酸的溶液I’；取混合激素内标工作液和不同浓度的混合激素标曲工作液，干燥后用所述溶液I’溶解；制成梯度浓度的标准溶液；
将所述标准溶液采用高效液相色谱质谱联用仪进行检测，获得标准曲线方程。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，S1中，
所述混匀的条件为1000rpm～2500rpm下涡旋混匀30s～1min；
所述混合氨基酸内标工作液与所述混合氨基酸标曲工作液的体积比为1：1；所述混合氨基酸内标工作液、所述蛋白沉淀剂的体积比为1：15～20；所述混合液与水的体积比为1：8～10；
所述混合激素内标工作液、混合激素标曲工作液的体积比为1：1。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在S2中，
在进样样本的制备过程中，所述混匀的条件为2000rpm～2500rpm混匀3～5min，所述离心的条件为12000～14000rpm离心5～10min。
6.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，所述待测样本为血清样本时：
取混合激素内标工作液和所述待测样本b混匀后，还有加入所述蛋白沉淀剂、混匀、离心，取上清液II加入水混合的步骤；所述蛋白沉淀剂选自甲醇；
所述待测样本a、所述待测样本b的体积比为1：20；和/或，
所述待测样本a与混合氨基酸内标工作液的体积比为1：1；和/或，
所述待测样本a与所述蛋白沉淀剂的体积比为1：15～20；和/或，
所述上清液I与水的体积比为1：8～10；和/或，
所述待测样本b与混合激素内标工作液的体积比为20：1；和/或，
所述待测样本b与蛋白沉淀剂的体积比为1：2～2.5；和/或，
所述上清液II与水的体积比为1：1～1.2。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述待测样本a、所述待测样本b的体积分别为10μL～20μL、200μL～400μL。
8.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，所述待测样本为脑脊液样本时：
所述待测样本a、所述待测样本b的体积比为1：25；和/或，
所述待测样本a与混合氨基酸内标工作液的体积比为2：1；和/或，
所述待测样本a与蛋白沉淀剂的体积比为2：15～20；和/或，
所述上清液I与水的体积比为1：8～10；和/或，
所述待测样本b与混合激素内标工作液的体积比为50：1。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述待测样本a、所述待测样本b的体积为20μL～30μL、500μL～750μL。
10.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，使用高效液相色谱质谱联用仪分析时色谱柱采用五氟苯基色谱柱，优选Kinetex F5色谱柱，填料粒径为2.6μm；
色谱分析条件为：
流动相：A相：含0.4mmol/L～0.5mmol/L氟化铵的水；B相：甲醇；
流速为：0.4mL/min～0.5mL/min；
梯度洗脱条件：
0.00～1.00min，A相采用浓度A1，B相采用浓度B1；
1.01～3.00min，A相采用浓度A2，B相采用浓度B2；
3.00～3.50min，A相由浓度A2匀速变化至浓度A3，B相：由浓度B2匀速变化至浓度B3；
3.50～12.00min，由浓度A3匀速变化至浓度A4，B相：由浓度B3匀速变化至浓度B4；
12.01～12.50min，由浓度A4匀速变化至浓度0，B相：由浓度B4匀速变化至100％；
12.50～13.00min，A相为0％；B相为100％；
13.01～15.00min，A相采用浓度A1，B相采用浓度B1；
浓度A1选自95％～90％，浓度B1选自5％～10％，浓度A1+浓度B1＝100％；
浓度A2选自85％～75％，浓度B2选自15％～25％，浓度A2+浓度B2＝100％；
浓度A3选自60％～65％，浓度B3选自35％～40％，浓度A3+浓度B3＝100％；
浓度A4选自10％～20％，浓度B4选自80％～90％，浓度A4+浓度B4＝100％；
质谱分析条件为：采用电喷雾离子源，正负离子模式同时采集，多反应监测模式；雾化温度：500℃～600℃；电喷雾电压：5500/-4000V；气帘气：20～30L/min；碰撞气：6～10L/min；雾化气：55～65L/min；辅助气：55～65L/min。
11.一种液相色谱串联质谱法同时检测血液中多种氨基酸和激素的前处理方法，其特征在于，至少包括以下步骤：
将同一血液样本分为2份：血液待测样本a、血液待测样本b；
取混合氨基酸内标工作液和所述血液待测样本a，加入蛋白沉淀剂混匀后离心，取上清液I，加入水稀释得到含氨基酸的溶液I；
取混合激素内标工作液和血液待测样本b混匀，加入蛋白沉淀剂、混匀、离心，取上清液II加入水混合的步骤；然后进行固相萃取，收集含激素成分的洗脱液，干燥后与溶液I混合，离心后的上清作为进样样本，用于进样分析；
所述蛋白沉淀剂选自甲醇。
12.根据权利要求11所述的前处理方法，其特征在于，
所述血液待测样本a、所述血液待测样本b的体积比为1：20；和/或，
所述血液待测样本a与混合氨基酸内标工作液的体积比为1：1；和/或，
所述血液待测样本a与蛋白沉淀剂的体积比为1：15～20；和/或，
所述上清液I与水的体积比为1：8～10；和/或，
所述血液待测样本b与混合激素内标工作液的体积比为20：1，和/或，
所述血液待测样本b与蛋白沉淀剂的体积比为1：2～2.5；和/或，
所述上清液II与水的体积比为1：1～1.2；和/或，
所述血液待测样本a、所述血液待测样本b的体积分别为10μL～20μL、200μL～400μL。
13.一种液相色谱串联质谱法同时检测脑脊液中多种氨基酸和激素的前处理方法，其特征在于，至少包括以下步骤：
将同一脑脊液待测样本分为2份：脑脊液待测样本a、脑脊液待测样本b；
取混合氨基酸内标工作液和所述脑脊液待测样本a，加入蛋白沉淀剂混匀后离心，取上清液I，加入水稀释得到含氨基酸的溶液I；所述蛋白沉淀剂选自甲醇；
取混合激素内标工作液和所述脑脊液待测样本b混匀，进行固相萃取，收集含激素成分的洗脱液，干燥后与溶液I混合，离心后的上清作为进样样本，用于进样分析。
14.根据权利要求13所述的前处理方法，其特征在于，
所述脑脊液待测样本a、脑脊液待测样本b的体积比为1：25；和/或，
所述脑脊液待测样本a与混合氨基酸内标工作液的体积比为2：1；和/或，
所述脑脊液待测样本a与蛋白沉淀剂的体积比为2：15～20；和/或，
所述上清液I与水的体积比为1：8～10；和/或，
所述脑脊液待测样本b与混合激素内标工作液的体积比为50：1；和/或，
所述脑脊液待测样本a、所述脑脊液待测样本b的体积为20μL～30μL、500μL～750μL。
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