具体实施方式
为了便于理解本发明,下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述,以下给出了本发明的较佳实施例。但是,本发明可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解,下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂,均为市售产品。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
一种血清中四种孕激素的检测方法,包括以下步骤:
所述四种孕激素为:17α-羟基孕烯醇酮、17α-羟基孕酮、孕酮和孕烯醇酮;
前处理:向血清样品中加入含内标物的甲醇溶液,进行蛋白沉淀,离心、取上清,加入衍生化试剂进行衍生化反应,冷却至室温后加入叔丁基甲醚,离心、取上清,得待测样品;
所述内标物为17α-羟基孕烯醇酮内标物、17α-羟基孕酮内标物、孕酮内标物和孕烯醇酮内标物;
富集、分离和检测:对所述待测样品采用二维液相色谱串联四级杆质谱联用仪进行富集、分离和检测。
优选地,所述富集分离和检测的步骤包括:采用第一流动相洗脱第一维色谱柱,对待测样品进行富集,得富集后的样品;采用第二流动相将所述富集后的样品从第一维色谱柱洗脱至第二维色谱柱,分离、检测。
优选地,所述第一流动相包括A相和B相,所述A相为去离子水,所述B相为甲醇;所述第二流动相包括C相和D相,所述C相为含体积百分比为(0.1±0.01)%甲酸的去离子水溶液,所述D相为含体积百分比为(0.1±0.01)%甲酸的甲醇溶液。
更优选地,所述第一流动相的流速为0.5~1.5ml/min;所述第二流动相的流速为0.2~1.0ml/min。
优选地,所述第一维色谱柱为富集柱,所述第二维色谱柱为分析柱。
优选地,所述第一维色谱柱为C6-Phenyl柱,所述第二维色谱柱为C18柱。
更优选地,所述C6-Phenyl柱的规格为4×2.0mm,所述C18柱的规格为100×2.0mm、3μm。
进一步优选地,所述C6-Phenyl柱和/或C18柱的柱温为30~50℃。
优选地,二维液相色谱采用梯度洗脱的模式:
0min~0.2min时,采用第一流动相洗脱第一维色谱柱,对待测样品进行富集,第一流动相中A相与B相的体积比为(60±3):(40±3);
0.2min时,将第一维色谱柱与第二维色谱柱连通;
0.2min~0.5min时,采用第二流动相将富集后的样品从第一维色谱柱洗脱至第二维色谱柱;第二流动相中C相与D相的体积比为(60±3):(40±3);
0.5min~2min时,第二流动相中C相与D相的体积比为(60±3):(40±3);
2min~3.6min时,第二流动相中C相与D相的体积比为(50±3):(50±3);
3.6min~4.4min时,第二流动相中C相与D相的体积比为(30±3):70±3);
4.4min~7.1min时,第二流动相中C相与D相的体积比为(5±3):(95±3);
7.1min后,第二流动相中C相与D相的体积比为(60±3):(40±3);
洗脱至第8.0~9.0min。
更优选地,0min~0.2min时,采用第一流动相洗脱第一维色谱柱,对待测样品进行富集,第一流动相中A相与B相的体积比为(60±1):(40±1);
0.2min时,将第一维色谱柱与第二维色谱柱连通;
0.2min~0.5min时,采用第二流动相将富集后的样品从第一维色谱柱洗脱至第二维色谱柱;第二流动相中C相与D相的体积比为(60±1):(40±1);
0.5min~2min时,第二流动相中C相与D相的体积比为(60±1):(40±1);
2min~3.6min时,第二流动相中C相与D相的体积比为(50±1):(50±1);
3.6min~4.4min时,第二流动相中C相与D相的体积比为(30±1):70±1);
4.4min~7.1min时,第二流动相中C相与D相的体积比为(5±1):(95±1);
7.1min后,第二流动相中C相与D相的体积比为(60±1):(40±1);
洗脱至第8.0~9.0min。
可选地,所述二维液相色谱串联四级杆质谱联用仪的两套泵通过六通阀(或者其它可实现切换的方式)实现切换。
优选地,所述六通阀在起始模式下使第一维色谱柱富集柱与分析柱处于未连通状态,待测样品经进样器进入富集柱进行富集、纯化,此过程中富集柱用第一流动相进行洗脱;0.20min切换六通阀使富集柱与分析柱连通,将待测样品洗脱至分析柱,此过程中富集柱与分析柱中的洗脱流动相均为第二流动相;5.0min六通阀切回起始模式,断开富集柱与分析柱,待测物在分析柱中经梯度洗脱(流动相为第二流动相)至分离后进入质谱进行检测。可选地,富集柱中的残留杂质经梯度洗脱至废液瓶中;所述富集柱中的残留杂质经梯度洗脱的流动相为第一流动相。
优选地,所述17α-羟基孕烯醇酮内标物为17α-羟基孕烯醇酮的C13标记物或氘代标记物;
所述17α-羟基孕酮内标物为17α-羟基孕酮的C13标记物或氘代标记物;
所述孕酮内标物为孕酮的C13标记物或氘代标记物;
所述孕烯醇酮为孕烯醇酮的C13标记物或氘代标记物。
更优选地,所述17α-羟基孕烯醇酮内标物为17α-羟基孕烯醇酮的氘代标记物;
所述17α-羟基孕酮内标物为17α-羟基孕酮的氘代标记物;
所述孕酮内标物为孕酮的氘代标记物;
所述孕烯醇酮为孕烯醇酮的氘代标记物。
进一步优选的,所述17α-羟基孕酮内标物为17α-羟基孕酮-D8;
所述孕酮内标物为孕酮-D9;
所述孕烯醇酮内标物为孕烯醇酮-D4;
所述17α-羟基孕烯醇酮内标物为17α-羟基孕烯醇酮-D4。
其中,17α-羟基孕酮-D8为由8个H(氢)被D(氘)取代的17α-羟基孕酮。孕酮-D9为由9个H(氢)被D(氘)取代的孕酮。孕烯醇酮-D4为由4个H(氢)被D(氘)取代的孕烯醇酮。17α-羟基孕烯醇酮-D4为由4个H(氢)被D(氘)取代的孕烯醇酮。
优选地,所述前处理中:
所述血清样品与所述甲醇溶液的体积比为1:1~4;及/或
所述血清样品与所述叔丁基甲醚的体积比为1:2~4;及/或
所述叔丁基甲醚与所述血清样品经蛋白沉淀后的上清液的体积比为1:1~2。
优选地,所述衍生化试剂为盐酸羟胺。更优选地,所述盐酸羟胺溶液的浓度为1.0~2.0mol/L。
优选地,所述衍生化反应的条件为:温度60-90℃,时间30-60min。
优选地,所述离心的条件为:温度0~5℃,转速11000~13000r/min,时间4~8min。
优选地,其特征在于,四级杆质谱条件为:正离子模式,扫描方式为多反应监测离子扫描MRM;所述正离子模式中,目标定量离子对包括17α-羟基孕烯醇酮定量离子对、17α-羟基孕酮定量离子对、孕酮定量离子对和孕烯醇酮定量离子对;和/或17α-羟基孕烯醇酮内标物的定量离子对、17α-羟基孕酮内标物的定量离子对、孕酮内标物的定量离子对和孕烯醇酮内标物的定量离子对;
目标定量离子的多反应监测离子扫描MRM的质/荷比条件包括:
孕烯醇酮的母离子的质/荷比为332.0~332.5,对应的子离子的质/荷比为330.0-330.5,95.8~96.4;
17α-羟基孕酮的母离子的质/荷比为360.5~361.5,对应的子离子的质/荷比为123.8-124.4,111.7~112.3;
孕酮母离子的质/荷比为344.9~345.5,对应的子离子的质/荷比为123.6~124.2,111.9-112.4;
17α-羟基孕烯醇酮母离子的质/荷比为348.0-348.6,对应的子离子的质/荷比为329.7-330.3,311.9~312.5;
17α-羟基孕酮内标物的母离子的质/荷比为369.0-369.6,对应的子离子的质/荷比为127.8-128.4;所述17α-羟基孕酮内标物为17α-羟基孕酮-D8;
孕酮内标物母离子的质/荷比为354.1~354.7,对应的子离子的质/荷比为127.7-128.3;所述孕酮内标物为孕酮-D9;
孕烯醇酮内标物母离子的质/荷比为336.1-336.7,对应的子离子的质/荷比为89.8-90.4;所述孕烯醇酮内标物为孕烯醇酮-D4;
17α-羟基孕烯醇酮内标物母离子的质/荷比为351.0-351.7,对应的子离子的质/荷比为329.9-333.5;所述17α-羟基孕烯醇酮内标物为17α-羟基孕烯醇酮-D4。
优选地,四级杆质谱条件还包括以下离子源参数:电离源为电喷雾电离ESI源,气帘气压力为30~40psi,加热气压力为35~45psi,辅助加热气压力为50~60psi,加热气温度为450~600℃,碰撞气为氮气,碰撞气压力为7.5~12psi,电喷雾针电压为4000~5500V。
优选地,所述四级杆质谱条件还包括:孕烯醇酮定量离子对的去簇电压为140~160V,入口电压为6~9V,碰撞电压为40~50V,出口电压为10~14V;17α-羟基孕酮的定量离子对的去簇电压为160~180V,入口电压5~7V,碰撞电压为40~50V,出口电压为8~12V;孕酮定量离子对的去簇电压为170~180V,入口电压8~12V,碰撞电压为38~45V,出口电压为8~12V;17α-羟基孕烯醇酮定量离子对的去簇电压为80~110V,入口电压6~10V,碰撞电压为13~22V,出口电压为8~12V;17α-羟基孕酮-D8定量离子对的去簇电压为185~200V,入口电压7~12V,碰撞电压为40~50V,出口电压为8~12V;孕酮-D9定量离子对的去簇电压为140~180V,入口电压8~14V,碰撞电压为30~45V,出口电压为9~13V;孕烯醇酮-D4定量离子对的去簇电压为130~150V,入口电压10~14V,碰撞电压为35~50V,出口电压为6~10V;17α-羟基孕烯醇酮-D4定量离子对的去簇电压为90~110V,入口电压6~10V,碰撞电压为15~25V,出口电压为12~18V。
在本发明的具体实施例中所使用的试剂如下:
17α-羟基孕酮-D8,CAS号为:850023-80-2,购买自:Toronto Research ChemicalsInc;
孕酮-D9,CAS号为15775-74-3,购买自:Toronto Research Chemicals Inc;
孕烯醇酮-D4,购买自:Toronto Research Chemicals Inc;
17α-羟基孕烯醇酮-D3,CAS号为:105078-92-0,购买自:Toronto ResearchChemicals Inc。
实施例1
本实施例的四种孕激素的检测方法,包括以下步骤:
一、样品前处理
取200μL样本(标准曲线点与质控同步处理)于2.0离心管中,加入800μL内标工作液(17α-羟基孕烯醇酮-D3 100μg/L、17α-羟基孕酮-D8 10μg/L、孕酮-D9200μg/L和孕烯醇酮-D4 1μg/L的甲醇溶液),高速震荡混匀5min,于4℃,13000r离心5min;取1000μL上清液,于2.0mL离心管中,氮气吹(40℃)40分钟后,加入500μL1.5mol/L盐酸羟胺溶液,高速震荡混匀5min;于90℃培养箱中衍生30min;衍生后溶液冷却至室温后加入800μL叔丁基甲醚溶液,高速震荡混匀5min;于4℃,14000r离心10min;取上清液1mL于1.5mL离心管中,40℃氮气吹干;取100μL复溶液复溶,高速震荡3min;于4℃,10000r离心5min;转移80μL离心后的样本于进样瓶中,上机检测。
二、富集、分离和检测
自动进样器自动将15μl待测样品加载到二维液相色谱系统中,对所述待测样品采用二维液相色谱串联四级杆质谱仪(LC-MS/MS)进行富集、分离与检测。
其中,富集柱为C6-Phenyl(4×2.0mm);分析柱为C18(100×2.0mm,3μm);柱温为40℃。
该系统配置了两套泵,两套泵通过一个六通阀实现切换(也可以通过两个六通阀或者其它的方式进行切换),六通阀3号位连接FLOW1(流动相1),1号和4号位连接富集柱,5号位连接FLOW2(流动相2),6号位连接分析柱,2号位连接废液瓶。
FLOW1流动相:A相为去离子水、B相为甲醇,流速为1.0mL/min;FLOW2流动相:C相为含0.1%甲酸的去离子水溶液、D相为含0.1%甲酸的甲醇溶液,流速0.50mL/min。
六通阀的起始模式为0,即富集柱与分析柱处于未连通状态,待测样品经进样器进入富集柱进行富集、纯化,此过程中富集柱用FLOW1流动相进行洗脱;0.20min切换六通阀为1,即富集柱与分析柱连通,将待测样品洗脱至分析柱,此过程中富集柱与分析柱中的洗脱流动相均为FLOW2流动相;此时FlOW1不经富集柱而是流入废液瓶中此阶段FLOW1的梯度变化是为了洗脱管路中的杂质;5.0min六通阀切回起始模式0,断开富集柱与分析柱,待测物在分析柱中经梯度洗脱(流动相为FLOW2流动相)至分离后进入质谱进行检测,富集柱中的残留杂质经梯度洗脱(流动相为FLOW1流动相)至废液瓶中。流动相的梯度洗脱如表1所示。
表1流动相的洗脱梯度
上述梯度下,17α-羟基孕烯醇酮的保留时间为:5.43min;17α-羟基孕酮的保留时间为:5.55min;孕酮的保留时间:5.68min;孕烯醇酮的保留时间:5.70min。
本实施例LC-MS/MS采用具有电喷雾电离源(ESI)的Applied BiochemistryAPI4500plus串联质谱分析仪作为检测器进行分析。其中,气帘气压力为30~40psi,加热气压力为35~45psi,辅助加热气压力为50~60psi,加热气温度为450~600℃,碰撞气为氮气,碰撞气压力为7.5~12psi,电喷雾针电压为4000~5500V。
其它质谱条件:采用正离子模式,扫描方式采用多反应监测离子扫描MRM,其条件参见表2。
表2多反应监测离子扫描MRM条件
待测物随流动相流出分析柱后,在压力的作用下进入质谱仪离子源,由六通阀控制进入离子源的样品通道,和进入切换时间。在离子源内液体样品被汽化并且电离为带电分子,带电分子在电压和真空作用下,进入Q1、Q2和Q3,其中,Q1和Q3为质量过滤器,只允许根据25羟基维生素D及其内标物的质荷比选择的母离子和子离子通过,Q2为碰撞单元,母离子在此处与惰性气体原子碰撞,产生特定的碎片离子。质谱仪的第一个四极(Q1)选择具有待测物及其内标物的特定质荷比m/z的母离子,具有这些m/z比的母离子被允许进入Q2,Q2产生的碎片离子进入到Q3,其中待测物及其内标物的碎片离子(子离子)被选择通过,而其它离子被除去。参见表3,示出了被用于鉴别和定量的待测物的离子对的质荷比m/z。
表3待测物的质量转变表
随着离子与检测器碰撞,它们将捕获到的离子数转化成数字信号的电子脉冲。所获得的数据被传递到计算机,其将所收集的离子数对时间作图,即得总离子流图(TIC图)(如图1所示)。
三、定性判断和定量计算
(1)依据待测物、内标物的相对保留时间和检测的定量离子对的丰度比判断待测物的存在。
在相同试验条件下,检测样品中被测目标物质的质量色谱峰保留时间与标准溶液中对应物质的质量色谱峰保留时间一致;检测样品的色谱图中所选择的检测离子对的相对丰度比与相当浓度标准溶液的离子对相对丰度比的偏差(即表4中的最大允许误差)不超过表4规定的范围,则可以判断样品中存在对应的目标物质。
表4定性判断相对丰度的最大允许误差
相对丰度(K) |
K≥50% |
20%≤K≤50% |
10%≤K≤20% |
K≤10% |
最大允许误差 |
±20% |
±25% |
±30% |
±50% |
(2)采用内标标准曲线法定量,以待测物与内标物的峰面积比值计算样品中的待测物的含量。
配置系列浓度的含有待测物的血清标准样品,用本实施例的上述方法进行样品前处理以及分离检测,以血清标准样品中待测物和内标物的峰面积的比值构建内标标准曲线,17α-羟基孕酮的标准曲线见图2,曲线的方程Y=0.11X+0.00694,R=0.9987;17α-羟基孕烯醇酮的标准曲线见图3,曲线的方程为Y=0.0498X+0.0293,R=0.9992;孕酮的标准曲线见图4,曲线的方程为Y=0.00742X+8.54e-005,R=0.9950;孕烯醇酮的标准曲线见图5,曲线的方程为Y=0.00419X+2.74e-005,R=0.9993然后利用该标准曲线计算待测样品或质量控制物中的待测物的浓度。
本实施例测得17α-羟基孕酮的峰面积为6.32e+005,其内标物的峰面积为2.35e+006,计算得到本实施例的人血清样品中17α-羟基孕酮的浓度为4.95μg/L;17α-羟基孕烯醇酮的峰面积为7.27e+005,其内标物的峰面积为2.50e+006,计算得到17α-羟基孕烯醇酮的浓度为3.85μg/L;孕酮的峰面积为1.95e+005,其内标物的峰面积为2.41e+006,计算得到孕酮的浓度为4.85μg/L;孕烯醇酮的峰面积为2.56e+004,其内标物的峰面积为2.32e+007,计算得到孕酮的浓度为1.84μg/L。
实施例2方法学验证实验
本实施例对实施例1中的四种类孕激素的检测方法进行方法学验证实验。
1、精密度(Precision)实验
1.1批内精密度(Intra-assay):取实际血清样本分别加标至低、中、高三水平,得到的样本进行批内精密度实验;每个浓度水平的样本平行处理20个,每个进样1次;计算检测结果的平均值及相对标准偏差(RSD)。
1.2批间精密度(Inter-assay):取预先配制好的低、中、高三水平的质控品,进行批间精密度实验;每个水平的样本分别做4个平行,即检测得4组数据,连续测定5天;计算检测结果的平均值及相对标准偏差(RSD)。
17α-羟基孕烯醇酮、17α-羟基孕酮、孕酮和孕烯醇酮的批内精密度及批间精密度实验数据分别如表5~8所示,经验证,批内精密度范围为3.55%~11.84%,批间精密度范围为4.80%~11.52%。
表5孕酮批内精密度及批间精密度实验数据(单位:μg/L)
表6孕烯醇酮批内精密度及批间精密度实验数据(单位:μg/L)
表7 17α-羟基孕酮批内精密度及批间精密度实验数据(单位:μg/L)
表8 17α-羟基孕烯醇酮批内精密度及批间精密度实验数据(单位:μg/L)
2、分析灵敏度和线性范围(Analytical Sensitivity and Analytical M--easurement Range and Linearity Study)
2.1方法定量限与线性范围(Limit of Quantitation and Linearity)
a.配制空白基质;
b.配置标准曲线;
c.每个浓度的样本平行处理6个,分别检测一次;
d.计算各浓度样本的平均值、RSD和回收率;
e.方法定量限的确定标准:RSD小于20%且回收率在85%-115%范围内的最低浓度点视为定量限浓度,即LOQ;
f.线性范围的确定标准:RSD小于20%,回收率在85%-115%范围内,且以理论浓度比率与实际信号响应峰面积比率绘制成的回归曲线R2>0.98,即满足线性范围的要求;
g.验证实验数据如表9~12与图2-4所示,17α-羟基孕酮的LOQ为0.00975μg/L,线性范围为0.00975-20μg/L;17α-羟基孕烯醇酮的LOQ为0.0975μg/L,线性范围为0.0975-200μg/L;孕酮LOQ为0.195μg/L,线性范围为0.195-400μg/L;孕烯醇酮的LOQ为0.0785μg/L,线性范围为0.078-20μg/L。
表9 17α-羟基孕酮定量限实验数据
表10 17α-羟基孕烯醇酮定量限实验数据
理论浓度(μg/L) |
检测平均值(μg/L) |
RSD |
回收率 |
0 |
0 |
|
|
0.04875 |
0.06458 |
19.88% |
132.47% |
0.0975 |
0.11 |
10.31% |
109.64% |
0.195 |
0.20 |
12.09% |
104.87% |
0.39 |
0.42 |
6.50% |
108.72% |
0.78 |
0.83 |
3.65% |
106.52% |
1.56 |
1.70 |
3.90% |
108.87% |
3.13 |
3.46 |
2.49% |
110.54% |
6.25 |
6.64 |
4.50% |
106.16% |
12.5 |
13.30 |
6.22% |
106.40% |
25 |
26.48 |
4.89% |
105.93% |
50 |
55.73 |
4.34% |
111.47% |
100 |
104.67 |
3.12% |
104.67% |
200 |
186.17 |
4.90% |
93.08% |
表11孕酮定量限实验数据
表12孕烯醇酮定量限实验数据
理论浓度(μg/L) |
检测平均值(μg/L) |
RSD |
回收率 |
0 |
0 |
|
|
0.039 |
0.472 |
28.92% |
121.03% |
0.078 |
0.07414 |
4.22% |
95.05% |
0.156 |
0.164 |
7.63% |
105.13% |
0.313 |
0.3392 |
8.49% |
108.37% |
0.625 |
0.5912 |
9.53% |
94.59% |
1.25 |
1.264 |
11.63% |
101.12% |
2.5 |
2.364 |
11.98% |
94.56% |
5 |
5.264 |
6.18% |
105.28% |
10 |
10.23 |
4.84% |
102.30% |
20 |
19.28 |
5.71% |
96.40% |
2.2方法检出限(Limit of Detection)
a.收集浓度均在定量限LOQ附近的病人血清样本;
b.平行处理此病人样本20个,分别检测1次;
c.计算各浓度样本的平均值、SD和方法检出限(LOD);
d.实验结果如表13所示,17α-羟基孕酮的LOD为0.004μg/L,17α-羟基孕烯醇酮的LOD为0.035μg/L,孕酮的LOD为0.031μg/L,孕烯醇酮的LOD为0.033μg/L。
表13方法检出限试验数据
2.3结论(Summary of the AMR study)
3.方法准确度-回收率(Recovery)
a.收集一批混合血清样本,测得基础浓度,分别加标至高、中、低三水平的样本,进行加标回收率实验;
b.未加标及加标样品,每个平行处理3个,分别进行检测,计算加标样品的回收率结果,回收率在85-115%范围内,认为方法准确;
c.回收率实验结果如表15~18所示。由结果可知,方法的回收率在92.00~105%之间,满足要求。
表15 17α-羟基孕酮加标回收率试验结果
表16 17α-羟基孕烯醇酮加标回收率试验结果
表17孕酮加标回收率试验结果
表18孕烯醇酮加标回收率试验结果
由上述的检测结果显示,本发明的四种孕激素的检测方法检测血清样品或者质控物质结果准确,17α-羟基孕酮的定量限为0.00975μg/L,检测限为0.004μg/L,精密度RSD<12%,线性范围为0.00975-20μg/L,加标回收率在90%-105%之间;17α-羟基孕烯醇酮的定量限为0.0975μg/L,检测限为0.035μg/L,精密度RSD<7%,线性范围为0.0975-200μg/L,加标回收率在90%-105%之间;孕酮的定量限为0.195μg/L,检测限为0.031μg/L,精密度RSD<11%,线性范围为0.195-400μg/L,加标回收率在90%-105%之间;孕烯醇酮的定量限为0.0785μg/L,检测限为0.033μg/L,精密度RSD<11%,线性范围为0.078-20μg/L,加标回收率在85%-115%之间,检测时间时间约8.5min,检测效率高。总结如表19所示:
表19四种孕激素的检测方法的方法学验证结果
|
定量限 |
检测限 |
精密度 |
线性范围 |
加标回收率 |
17α-羟基孕酮 |
0.00975μg/L |
0.004μg/L |
RSD<12% |
0.00975-20μg/L |
90%-105% |
17α-羟基孕烯醇酮 |
0.0975μg/L |
0.035μg/L |
RSD<7% |
0.0975-200μg/L |
90%-105% |
孕酮 |
0.195μg/L |
0.031μg/L |
RSD<11% |
0.195-400μg/L |
90%-105% |
孕烯醇酮 |
0.0785μg/L |
0.033μg/L |
RSD<11% |
0.078-20μg/L |
85%-115% |
可见,说明本方法检测消耗时间段、检测效率高、且准确可靠、精密度高、灵敏度高、检测通量高、成本低。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。