CN111148998A - 通过质谱法进行的载脂蛋白e同种型检测 - Google Patents
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Abstract
提供了通过质谱法确定样品中载脂蛋白E(ApoE)表型的方法；其中由通过质谱法检测到的离子身份确定样品中存在的ApoE的等位基因(一种或多种)。在另一方面，本文提供了用于诊断或预后阿尔茨海默氏病或痴呆的方法。
Description
技术领域
本发明涉及载脂蛋白E的检测或定量。在具体方面，本发明涉及通过质谱法检测载脂蛋白E或其等位基因的方法。
背景技术
阿尔茨海默氏病是影响老年人群的最常见的痴呆形式。阿尔茨海默氏病的特征在于认知能力具体地是记忆和学习能力的逐渐衰退。载脂蛋白E(APOE)与发生阿尔茨海默氏病的明显增加相关联。人类APOE基因具有三个多态等位基因ε2、ε3和ε4，它们导致六种不同的表型：ε2/ε2、ε2/ε3、ε3/ε3、ε2/ε4、ε3/ε4和ε4/ε4。
目前用于预测或诊断阿尔茨海默氏病的临床诊断方法的准确度和灵敏度较低。需要用于检测载脂蛋白E的准确和灵敏的测定。具体地，需要用于检测多种同工型(isoform)的准确和灵敏的测定。
发明内容
本文提供了通过包括串联质谱法在内的质谱法检测或确定样品中载脂蛋白E(APOE)的量的方法。
在某些实施方式中，本文提供的方法用于检测或确定载脂蛋白E的量，其包括：(a)纯化样品中的载脂蛋白E；(b)电离样品中的载脂蛋白E；(c)通过质谱法检测或确定载脂蛋白E离子(一种或多种)的量；其中载脂蛋白E离子(一种或多种)的量与样品中载脂蛋白E的量有关。
在某些实施方式中，本文提供的方法用于确定样品中载脂蛋白E(ApoE)表型，所述方法包括：(a)纯化样品中的ApoE；(b)电离样品中的ApoE以产生一种或多种ApoE离子；(c)通过质谱法检测来自步骤(b)的离子(一种或多种)；其中样品中存在的ApoE等位基因(一种或多种)由步骤(c)中检测到的离子的身份来确定。
在一些实施方式中，本文提供的纯化包括液相色谱法。在一些实施方式中，液相色谱包括高效液相色谱法(HPLC)。
在一些实施方式中，样品中的ApoE被消化。在一些实施方式中，ApoE被胰蛋白酶消化。在一些实施方式中，被消化的ApoE是微波处理的。在一些实施方式中，通过快速酶消化微波技术消化ApoE。
在一些实施方式中，本文提供的纯化包括固相萃取(SPE)。
在一些实施方式中，电离包括电喷雾电离(ESI)。在一些实施方式中，电离包括以正模式电离。在一些实施方式中，电离包括以负模式电离。
在一些实施方式中，本文提供的方法进一步包括添加内标。在一些实施方式中，内标是同位素标记的。
在一些实施方式中，通过本文提供的方法确定的表型是ApoE2/ApoE2。在一些实施方式中，表型是ApoE2/ApoE3。在一些实施方式中，表型是ApoE2/ApoE4。在一些实施方式中，表型是ApoE3/ApoE3。在一些实施方式中，表型是ApoE3/ApoE4。在一些实施方式中，表型是ApoE4/ApoE4。
在一些实施方式中，ApoE2/ApoE2通过质/荷比为555.15±0.5的前体离子(一种或多种)的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE2/ApoE2通过质/荷比为612.19±0.5的前体离子(一种或多种)的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE2/ApoE2通过质/荷比选自665.72±0.5和835.93±0.5的碎片离子(一种或多种)的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE2/ApoE2通过质/荷比为665.72±0.5和835.93±0.5的碎片离子的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE2/ApoE2通过质/荷比选自866.99±0.5和982.08±0.5的碎片离子(一种或多种)的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE2/ApoE2通过质/荷比为866.99±0.5和982.08±0.5的碎片离子的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE2/ApoE2通过质/荷比选自665.72±0.5、835.93±0.5、866.99±0.5和982.08±0.5的碎片离子(一种或多种)的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE2/ApoE2通过质/荷比为665.72±0.5、835.93±0.5、866.99±0.5和982.08±0.5的碎片离子的存在来确定。
在一些实施方式中，ApoE2/ApoE3通过质/荷比为555.15±0.5的前体离子(一种或多种)的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE2/ApoE3通过质/荷比为612.19±0.5的前体离子(一种或多种)的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE2/ApoE3通过质/荷比为475.05±0.5的前体离子(一种或多种)的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE2/ApoE3通过质/荷比选自665.72±0.5和835.93±0.5的碎片离子(一种或多种)的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE2/ApoE3通过质/荷比为665.72±0.5和835.93±0.5的碎片离子的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE2/ApoE3通过质/荷比选自866.99±0.5和982.08±0.5的碎片离子(一种或多种)的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE2/ApoE3通过质/荷比为866.99±0.5和982.08±0.5的碎片离子的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE2/ApoE3通过质/荷比选自374.42±0.5和502.55±0.5的碎片离子(一种或多种)的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE2/ApoE3通过质/荷比为374.42±0.5和502.55±0.5的碎片离子的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE2/ApoE3通过质/荷比选自374.42±0.5、502.55±0.5、665.72±0.5、835.93±0.5、866.99±0.5和982.08±0.5的碎片离子(一种或多种)的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE2/ApoE3通过质/荷比为374.42±0.5、502.55±0.5、665.72±0.5、835.93±0.5、866.99±0.5和982.08±0.5的碎片离子的存在来确定。
在一些实施方式中，ApoE2/ApoE4通过质/荷比为555.15±0.5的前体离子(一种或多种)的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE2/ApoE4通过质/荷比为612.19±0.5的前体离子(一种或多种)的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE2/ApoE4通过质/荷比为475.05±0.5的前体离子(一种或多种)的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE2/ApoE4通过质/荷比为503.56±0.5的前体离子(一种或多种)的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE2/ApoE4通过质/荷比选自665.72±0.5和835.93±0.5的碎片离子(一种或多种)的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE2/ApoE4通过质/荷比为665.72±0.5和835.93±0.5的碎片离子的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE2/ApoE4通过质/荷比选自866.99±0.5和982.08±0.5的碎片离子(一种或多种)的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE2/ApoE4通过质/荷比为866.99±0.5和982.08±0.5的碎片离子的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE2/ApoE4通过质/荷比选自374.42±0.5和502.55±0.5的碎片离子(一种或多种)的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE2/ApoE4通过质/荷比为374.42±0.5和502.55±0.5的碎片离子的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE2/ApoE4根据质/荷比选自649.74±0.5和892.96±0.5的碎片离子(一种或多种)的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE2/ApoE4通过质/荷比为649.74±0.5和892.96±0.5的碎片离子的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE2/ApoE4通过质/荷比选自374.42±0.5、502.55±0.5、649.74±0.5、665.72±0.5、835.93±0.5、866.99±0.5、892.96±0.5和982.08±0.5的碎片离子(一种或多种)的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE2/ApoE4通过质/荷比为374.42±0.5、502.55±0.5、649.74±0.5、665.72±0.5、835.93±0.5、866.99±0.5、892.96±0.5和982.08±0.5的碎片离子的存在来确定。
在一些实施方式中，ApoE3/ApoE3通过质/荷比为612.19±0.5的前体离子(一种或多种)的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE3/ApoE3通过质/荷比为475.05±0.5的前体离子(一种或多种)的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE3/ApoE3通过质/荷比选自866.99±0.5和982.08±0.5的碎片离子(一种或多种)的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE3/ApoE3通过质/荷比为866.99±0.5和982.08±0.5的碎片离子的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE3/ApoE3通过质/荷比选自374.42±0.5和502.55±0.5的碎片离子(一种或多种)的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE3/ApoE3通过质/荷比为374.42±0.5和502.55±0.5的碎片离子的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE3/ApoE3通过质/荷比选自374.42±0.5、502.55±0.5、866.99±0.5和982.08±0.5的碎片离子(一种或多种)的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE3/ApoE3通过质/荷比为374.42±0.5、502.55±0.5、866.99±0.5和982.08±0.5的碎片离子的存在来确定。
在一些实施方式中，ApoE3/ApoE4通过质/荷比为612.19±0.5的前体离子(一种或多种)的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE3/ApoE4通过质/荷比为475.05±0.5的前体离子(一种或多种)的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE3/ApoE4通过质/荷比为503.56±0.5的前体离子(一种或多种)的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE3/ApoE4通过质/荷比选自866.99±0.5和982.08±0.5的碎片离子(一种或多种)的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE3/ApoE4通过质/荷比为866.99±0.5和982.08±0.5的碎片离子的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE3/ApoE4通过质/荷比选自374.42±0.5和502.55±0.5的碎片离子(一种或多种)的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE3/ApoE4通过质/荷比为374.42±0.5和502.55±0.5的碎片离子的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE3/ApoE4通过质/荷比选自649.74±0.5和892.96±0.5的碎片离子(一种或多种)的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE3/ApoE4通过质/荷比为649.74±0.5和892.96±0.5的碎片离子的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE3/ApoE4通过质/荷比选自374.42±0.5、502.55±0.5、649.74±0.5、866.99±0.5、892.96±0.5和982.08±0.5的碎片离子(一种或多种)的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE3/ApoE4通过质/荷比为374.42±0.5、502.55±0.5、649.74±0.5、866.99±0.5、892.96±0.5和982.08±0.5的碎片离子的存在来确定。
在一些实施方式中，ApoE3/ApoE4通过质/荷比为475.05±0.5的前体离子(一种或多种)的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE3/ApoE4通过质/荷比为503.56±0.5的前体离子(一种或多种)的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE3/ApoE4通过质/荷比选自374.42±0.5和502.55±0.5的碎片离子(一种或多种)的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE3/ApoE4通过质/荷比为374.42±0.5和502.55±0.5的碎片离子的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE3/ApoE4通过质/荷比选自649.74±0.5和892.96±0.5的碎片离子(一种或多种)的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE3/ApoE4通过质/荷比为649.74±0.5和892.96±0.5的碎片离子的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE3/ApoE4通过质/荷比选自374.42±0.5、502.55±0.5、649.74±0.5和892.96±0.5的碎片离子(一种或多种)的存在来确定。在一些实施方式中，ApoE3/ApoE4通过质/荷比为374.42±0.5、502.55±0.5、649.74±0.5和892.96±0.5的碎片离子的存在来确定。
在一些实施方式中，ApoE4等位基因的存在表明发生阿尔茨海默氏病的风险增加。在一些实施方式中，ApoE4/ApoE4等位基因的存在表明发生阿尔茨海默氏病的风险增加。
在一些实施方式中，总ApoE的定量包括测量质/荷比为485.06±0.5的前体离子。在一些实施方式中，总ApoE的定量包括测量质/荷比选自489.51±0.5和588.64±0.5的碎片离子(一种或多种)。
在某些实施方式中，所述方法的定量限小于或等于10ng/mL。在一些实施方式中，所述方法的定量限小于或等于5ng/mL。在一些实施方式中，所述方法的定量限小于或等于4ng/mL。在一些实施方式中，所述方法的定量限小于或等于3ng/mL。在一些实施方式中，所述方法的定量限小于或等于2ng/mL。在一些实施方式中，所述方法的定量限小于或等于1ng/mL。在一些实施方式中，所述方法的定量限小于或等于0.5ng/mL。在一些实施方式中，所述方法的定量限小于或等于0.2ng/mL。在一些实施方式中，所述方法的定量限小于或等于0.1ng/mL。
在一些实施方式中，所述方法的检测限小于或等于5ng/mL。在一些实施方式中，所述方法的检测限小于或等于1ng/mL。在一些实施方式中，所述方法的检测限小于或等于0.5ng/mL。在一些实施方式中，所述方法的检测限小于或等于0.1ng/mL。在一些实施方式中，所述方法的检测限小于或等于0.05ng/mL。在一些实施方式中，所述方法的检测限小于或等于0.01ng/mL。
在一些实施方式中，ApoE未在质谱法之前衍生化。
在一些实施方式中，ApoE在质谱法之前被衍生化。
在某些实施方式中，样品是体液。在一些实施方式中，样品是脑脊液(CSF)。在一些实施方式中，样品是血浆或血清。在一些实施方式中，样品是全血。在一些实施方式中，样品是唾液或尿液。
在一些实施方式中，方法可包括将试剂以足以使样品脱蛋白的量添加到样品中。
如本文所用，除非另有说明，否则单数形式“一(a/an)”和“该(the)”包括复数指代。因此，例如，提到“蛋白质”包括多种蛋白质分子。
如本文所用，术语“纯化”或“使纯化”不指从样品中除去除目标分析物(一种或多种)以外的所有物质。相反，纯化是指相对于样品中可能干扰目标分析物检测的其他组分，富集一种或多种目标分析物的量的过程。本文中通过多种手段纯化样品以允许去除一种或多种干扰物质，例如干扰通过质谱法检测所选ApoE母体和子体离子的一种或多种物质。
如本文所用，术语“测试样品”是指可包含ApoE的任何样品。如本文所用，术语“体液”是指可以从个体身体分离的任何流体。例如，“体液”可包括血液、血浆、血清、胆汁、唾液、尿液、泪液、汗液等。
如本文所用，术语“衍生化”是指使两个分子反应以形成新分子。衍生剂可包括异硫氰酸酯基团、二硝基-氟苯基基团、硝基苯氧基羰基基团和/或邻苯二甲醛(phthalaldehyde)基团等。
如本文所用，术语“色谱法”是指这样的过程，其中当化学实体在固定液相或固相周围或上方流动时，由于化学实体的差异分布，通过液体或气体携带的化学混合物被分离成多个组分。
如本文所用，术语“液相色谱法”或“LC”是指当流体均匀地渗透通过细分物质的柱或通过毛细管通道时，流体溶液的一种或多种组分的选择性延迟的方法。延迟是由于当该流体相对于固定相(一个或多个)移动时，混合物组分在一个或多个固定相与本体流体(即流动相)之间的分布导致的。“液相色谱法”的实例包括反相液相色谱法(RPLC)、高效液相色谱法(HPLC)和高湍流液相色谱法(HTLC)。
如本文所用，术语“高效液相色谱法”或“HPLC”是指这样的液相色谱法，其中通过在压力下迫使流动相通过固定相(通常为密集填充柱)来提高分离度。
如本文所用，术语“高湍流液相色谱法”或“HTLC”是指色谱法的一种形式，其利用被测定物质的湍流通过柱填料作为进行分离的基础。在通过质谱分析之前，HTLC已用于制备包含两种未命名药物的样品。参见，例如，Zimmer等，J.Chromatogr.A 854：23-35(1999)；还参见，美国专利号5,968,367、5,919,368、5,795,469和5,772,874，其进一步解释了HTLC。本领域普通技术人员理解“湍流”。当流体缓慢而平稳地流动时，该流动被称为“层流”。例如，以低流速移动通过HPLC柱的流体是层流的。在层流中，流体颗粒的运动是有序的，其中颗粒大体上沿直线运动。在更快的速度下，水的惯性克服了流体摩擦力和湍流产生。不与不规则边界接触的流体“超出”了由于摩擦而变慢或由于不平整表面而偏转的流体。当流体湍流地流动时，它会以漩涡和旋转(或涡流)流动，其具有比当流动是层流时更大的“阻力”。许多参考资料可用于帮助确定流体流动何时是层流或湍流(例如，Turbulent Flow Analysis：Measurement and Prediction，P.S.Bernard和J.M.Wallace，John Wiley&Sons，Inc.，(2000)；An Introduction to Turbulent Flow，Jean Mathieu和Julian Scott，剑桥大学出版社(2001))。
如本文所用，术语“气相色谱法”或“GC”是指这样的色谱法，其中将样品混合物汽化并注入载气流(作为氮气或氦气)，该载气流移动穿过包含由液体或颗粒固体组成的固定相的柱，并根据化合物对固定相的亲和力分离成其组分化合物。
如本文所用，术语“大颗粒柱”或“萃取柱”是指包含平均粒径大于约35μm的色谱柱。如本文所用，术语“约”是指±10％。在优选的实施方式中，该柱包含直径为约60μm的颗粒。
如本文所用，术语“分析柱”是指具有足够色谱板以实现样品中物质分离的色谱柱，该物质从柱上洗脱下来，足以允许确定分析物的存在或量。此类柱通常区别于“萃取柱”，萃取柱具有从非保留物质中分离或萃取保留物质的一般目的，以获得纯化的样品用于进一步分析。如本文所用，术语“约”是指±10％。在优选的实施方式中，分析柱包含直径为约4μm的颗粒。
如本文所用，术语“在线(on-line)”或“线上(inline)”，例如“在线自动化的方式”或“在线萃取”中所用的，是指无需操作员干预而进行的过程。相反，本文所用的术语“离线(off-line)”是指需要操作员手动干预的过程。因此，如果样品进行沉淀，并然后将上清液手动加载到自动进样器中，则沉淀和加载步骤与后续步骤是离线的。在该方法的多种实施方式中，可以以在线自动化的方式进行一个或多个步骤。
如本文所用，术语“质谱法”或“MS”是指通过化合物的质量鉴定化合物的分析技术。MS是指基于离子的质荷比或“m/z”过滤、检测和测量离子的方法。MS技术一般包括(1)电离化合物以形成带电化合物；和(2)检测带电化合物的分子量并计算质荷比。化合物可以通过任何适合的方法被电离和检测。“质谱仪”一般包括电离器和离子检测器。一般地，将一个或多个目标分子电离，并随后将离子引入质谱仪中，在质谱仪中由于磁场和电场的组合，离子沿着空间中的路径，该路径取决于质量(“m”)和电荷(“z”)。参见，例如标题为“MassSpectrometry From Surfaces(表面质谱法)”的美国专利号6,204,500；标题为“Methodsand Apparatus for Tandem Mass Spectrometry(串联质谱法的方法和装置)”的美国专利号6,107,623；标题为“DNA Diagnostics Based On Mass Spectrometry(基于质谱法的DNA诊断)”的美国专利号6,268,144；标题为“Surface-Enhanced Photolabile AttachmentAnd Release For Desorption And Detection Of Analytes(用于分析物解吸和检测的表面增强的光不稳定性附着和释放)”的美国专利号6,124,137；Wright等，Prostate Cancerand Prostatic Diseases 2：264-76(1999)；以及Merchant和Weinberger，Electrophoresis 21：1164-67(2000)。
如本文所用，术语“以负离子模式运行”是指其中产生和检测负离子的那些质谱方法。如本文所用，术语“以正离子模式运行”是指其中产生和检测正离子的那些质谱方法。
如本文所用，术语“电离”或“电离化”是指产生具有等于一个或多个电子单位的净电荷的分析物离子的方法。负离子是那些具有一个或多个电子单位的净负电荷的离子，而正离子是那些具有一个或多个电子单位的净正电荷的离子。
如本文所用，术语“电子电离”或“EI”是指这样的方法，其中气态或气相中目标分析物与电子流相互作用。电子与分析物的撞击产生了分析物离子，然后可以将其进行质谱技术。
如本文所用，术语“化学电离”或“CI”是指这样的方法，其中反应气体(例如氨)经历电子撞击，并且通过反应气体离子与分析物分子的相互作用形成分析物离子。
如本文所用，术语“快原子轰击”或“FAB”是指这样的方法，其中高能原子束(通常为Xe或Ar)撞击非挥发性样品，这解吸和电离样品中包含的分子。将测试样品溶解在粘性液体基质中，例如甘油、硫代甘油、间硝基苄醇、18-冠-6冠醚、2-硝基苯辛醚、环丁砜、二乙醇胺和三乙醇胺。用于化合物或样品的适合基质的选择是一个经验过程。
如本文所用，术语“基质辅助激光解吸电离”或“MALDI”是指这样的方法，其中将非挥发性样品暴露于激光辐照，该方法通过多种电离途径使样品中的分析物解吸和电离，所述电离途径包括光电离、质子化、去质子化和簇衰变。对于MALDI，将样品与能量吸收基质混合，其有助于分析物分子的解吸。
如本文所用，术语“表面增强激光解吸电离”或“SELDI”是指另一种方法，其中将非挥发性样品暴露于激光辐照，该方法通过多种电离途径使样品中的分析物解吸和电离，所述电离途径包括光电离、质子化、去质子化和簇衰变。对于SELDI，样品一般与优先保留一种或多种目标分析物的表面相结合。如同在MALDI中，此方法也可以使用能量吸收物质以促进电离。
如本文所用，术语“电喷雾电离”或“ESI”是指这样的方法，其中溶液沿毛细管的短长度通过，向该毛细管的末端施加高的正或负电势。到达管末端的溶液被汽化(雾化)成溶剂蒸汽中非常小的溶液滴的喷流或喷雾。该液滴雾气流经蒸发室，该蒸发室稍微加热以防止冷凝并蒸发溶剂。随着液滴变小，电表面电荷密度增加，直到同极性电荷之间的自然排斥导致离子以及中性分子被释放时为止。
如本文所用，术语“大气压化学电离”或“APCI”是指类似于ESI的质谱方法；然而，APCI通过离子-分子反应产生离子，该反应在大气压下于等离子体内发生。等离子体通过喷雾毛细管和对电极之间的放电来保持。然后，通常通过使用一组差动泵送撇取器站(differentially pumped skimmer stage)将离子提取到质量分析仪中。干燥和预热的N2气体的逆流可用于改善溶剂的去除。用于分析极性较小的种类时，APCI中的气相电离可以比ESI中的更有效。
如本文所用，术语“大气压光电离”或“APPI”是指质谱法的形式，其中用于分子M光电离的机制是光子吸收和电子喷射以形成分子离子M+。因为光子能一般地刚好在电离势之上，因此分子离子不易解离。在许多情况下，有可能无需色谱法来分析样品，从而节省大量时间和费用。在水蒸气或质子溶剂的存在下，分子离子可以提取H以形成MH+。如果M具有高质子亲和力，则该情况倾向于发生。这不会影响定量准确度，因为M+和MH+的总和是恒定的。质子溶剂中的药物化合物通常以MH+被观察到，而非极性化合物(例如萘或睾酮)通常形成M+。Robb，D.B.，Covey，T.R.和Bruins，A.P.(2000)：参见，例如Robb等，Atmosphericpressure photoionization：An ionization method for liquid chromatography-MassSpectrometry(大气压光电离：用于液相色谱-质谱法的电离方法)，Anal.Chem.72(15)：3653-3659。
如本文所用，术语“电感耦合等离子体”或“ICP”是指这样的方法，其中样品在足够高的温度下与部分电离的气体相互作用，以便大多数元素被原子化和电离。
如本文所用，术语“场解吸”是指这样的方法，其中将非挥发性测试样品放置在电离表面上并且使用强电场产生分析物离子。
如本文所用，术语“解吸”是指从表面去除分析物和/或使分析物进入气相。
如本文中所使用的，术语“量化限”、“定量限”或“LOQ”是指这样的点，在该点测量变得在定量上有意义。在此LOQ处的分析物响应是可鉴别的、离散的且可复现的，具有20％的精密度和80％至120％的准确度。
如本文中所使用的，术语“检测限”或“LOD”是这样的点，在该点测量值大于与其相关联的不确定性。LOD任意限定为距离零浓度的2个标准偏差(SD)。
如本文所用，体液样品中ApoE的“量”一般是指反映体液体积中可检测的ApoE质量的绝对值。然而，量也考虑与另一个ApoE量相比的相对量。例如，体液中ApoE量可以是大于或小于正常存在的ApoE的对照或正常水平的量。
如本文参考定量测量中所使用的术语“约”是指指示值加或减10％，该定量测量不包括离子质量的测量。质谱仪在确定给定分析物质量方面可略有不同。在离子的质量或离子的质/荷比的上下文中，术语“约”是指+/-0.5原子质量单位。
上面描述的发明内容是非限制性的，并且通过以下的本发明的具体实施方式和所附权利要求，本发明的其他特征和优点将变得显而易见。
附图说明
图1显示了ApoE2/E2表型的实例色谱图，其频率约为0.2％。
图2显示了ApoE2/E3表型的实例色谱图，其频率约为9.4％。
图3显示了ApoE2/E4表型的实例色谱图，其频率约为2.2％。
图4显示了ApoE3/E3表型的实例色谱图，其频率约为66％。
图5显示了ApoE3/E4表型的实例色谱图，其频率约为20％。
图6显示了ApoE4/E4表型的实例色谱图，其频率约为2.5％。
图7显示了基于通过LC-MS/MS确定的319个个体血清样品的ApoE等位基因频率。
图8显示了每种阿尔茨海默氏病生物标记物对风险评估模型的贡献。对于MCI或阿尔茨海默氏病计算线性预测值(分数)的式给出：Aβ42(pg/mL)/Aβ40(pg/mL)比率；ApoE4等位基因数量；总ApoE(ug/mL)。分数＝2.8336-9.9026×比率+0.7358×ApoE4–0.2183×总ApoE。风险分为三组：低风险；平均风险；高风险。
图9显示了用于Aβ42/40比率模型与等位基因数的疾病概率图。
图10显示了用于Aβ42/40比率+总ApoE模型与ApoE4等位基因数的疾病风险图。
图11显示了风险评估得分与ApoE4等位基因数。
图12显示了逻辑回归模型与ADMark。
图13显示了通过质谱法的ApoE同种型表型分型的图示。通过检测与独特的E2相关的离子(一种或多种)来确定ApoE2/E2表型。
具体实施方式
载脂蛋白E(ApoE)是迟发型阿尔茨海默病(AD)的明确遗传风险因子。人类APOE基因具有三个多态等位基因ε2、ε3和ε4，它们导致六种不同的表型：ε2/ε2、ε2/ε3、ε3/ε3、ε2/ε4、ε3/ε4和ε4/ε4。约有一半的AD患者携带ε4等位基因(相比较在一般人群中为14％)，大多数为杂合子(ε3/ε4)。与ε2或ε3等位基因的遗传相比，遗传的ε4等位基因数与疾病风险的增加和平均发病年龄的降低二者都相关。三种ApoE同工型之间的差异基于两个氨基酸，该氨基酸会影响其结构，并且因此影响蛋白质与多种脂质和β-淀粉样蛋白(Aβ)的相互作用和结合。ApoE和Aβ可以在大脑中共定位，因此已经广泛研究了它们在AD中的互补作用。最近发现循环血浆和CSF ApoE水平是AD的潜在生物标志物。此外，增加的CSF Apo-E2或-E3水平可能代表对AD中损伤的保护性反应，并且除了影响淀粉样蛋白清除之外，还可以通过减少不依赖于tau蛋白和淀粉样蛋白沉积的神经元损伤而具有神经保护效果。较低的ApoE水平也可能与影响脑脂质代谢的多发性硬化和其他神经退行性疾病相关。
在某些实施方式中，本文提供的方法用于确定样品中载脂蛋白E(ApoE)表型，所述方法包括：(a)纯化样品中的ApoE；(b)电离样品中的ApoE以产生一个或多个ApoE离子；(c)通过质谱法检测来自步骤(b)的离子(一种或多种)；其中根据在步骤(c)中检测的离子的身份确定样品中存在的ApoE的等位基因(一种或多种)。
在一些实施方式中，本文提供的纯化包括液相色谱法。在一些实施方式中，液相色谱法包括高效液相色谱法(HPLC)。
在一些实施方式中，本文提供的纯化包括固相萃取(SPE)。
在一些实施方式中，电离包括电喷雾电离(ESI)。在一些实施方式中，电离包括以正模式电离。在一些实施方式中，电离包括以负模式电离。
在一些实施方式中，本文提供的方法进一步包括添加内标。在一些实施方式中，内标被同位素标记。
在一些实施方式中，通过本文提供的方法确定的表型是ApoE2/ApoE2。在一些实施方式中，表型是ApoE2/ApoE3。在一些实施方式中，表型是ApoE2/ApoE4。在一些实施方式中，表型是ApoE3/ApoE3。在一些实施方式中，表型是ApoE3/ApoE4。在一些实施方式中，表型是ApoE4/ApoE4。
在一些实施方式中，存在ApoE4等位基因表明发生阿尔茨海默氏病的风险增加。在一些实施方式中，存在ApoE4/ApoE4等位基因表明发生阿尔茨海默氏病的风险增加。
在某些实施方式中，所述方法的定量限小于或等于10ng/mL。在一些实施方式中，所述方法的定量限小于或等于5ng/mL。在一些实施方式中，所述方法的定量限小于或等于4ng/mL。在一些实施方式中，所述方法的定量限小于或等于3ng/mL。在一些实施方式中，所述方法的定量限小于或等于2ng/mL。在一些实施方式中，所述方法的定量限小于或等于1ng/mL。在一些实施方式中，所述方法的定量限小于或等于0.5ng/mL。在一些实施方式中，所述方法的定量限小于或等于0.2ng/mL。在一些实施方式中，所述方法的定量限小于或等于0.1ng/mL。
在一些实施方式中，所述方法的检测限小于或等于5ng/mL。在一些实施方式中，所述方法的检测限小于或等于1ng/mL。在一些实施方式中，所述方法的检测限小于或等于0.5ng/mL。在一些实施方式中，所述方法的检测限小于或等于0.1ng/mL。在一些实施方式中，所述方法的检测限小于或等于0.05ng/mL。在一些实施方式中，所述方法的检测限小于或等于0.01ng/mL。
在一些实施方式中，ApoE未在质谱法之前衍生化。
在一些实施方式中，ApoE在质谱法之前被衍生化。
在某些实施方式中，样品是体液。在一些实施方式中，样品是脑脊液(CSF)。在一些实施方式中，样品是血浆或血清。在一些实施方式中，样品是全血。在一些实施方式中，样品是唾液或尿液。
在一些实施方式中，方法可包括将试剂以足以使样品脱蛋白的量添加到样品中。
适合的测试样品包括可能包含目标分析物的任何测试样品。在一些优选的实施方式中，样品是生物样品；就是说，从任何生物来源例如动物、细胞培养物、器官培养物等获得的样品。在某些优选的实施方式中，样品从哺乳动物例如狗、猫、马等中获得。具体优选的哺乳动物是灵长类动物，最优选为男性或女性人类。具体优选的样品包括血液、血浆、血清、头发、肌肉、尿液、唾液、泪液、脑脊液或其他组织样品。这样的样品可以例如从患者即活着的人(男性或女性)获得，其在临床环境中呈现自身，用于疾病或状况的诊断、预后或治疗。测试样品优选地从患者例如血清中获得。
用于质谱法的样品制备
可用于相对于样品中的其他组分(例如蛋白质)富集ApoE的方法包括例如过滤、离心、薄层色谱法(TLC)、包括毛细管电泳在内的电泳、包括免疫亲和分离在内的亲和分离、包括乙酸乙酯萃取和甲醇萃取在内的萃取方法、以及离液剂的使用或上述任意组合等。
蛋白质沉淀是制备测试样品的一种优选方法。这样的蛋白质纯化方法是本领域众所周知的，例如，Polson等，Journal of Chromatography B 785：263-275(2003)，描述了适用于该方法的蛋白质沉淀技术。蛋白质沉淀可用于从样品中去除大部分蛋白质而将ApoE留在上清液中。可以离心样品以分离液体上清液与沉淀的蛋白质。然后可以将所得上清液应用于液相色谱法和随后的质谱分析。在某些实施方式中，使用蛋白质沉淀，例如乙腈蛋白质沉淀消除了在HPLC和质谱法之前对高湍流液相色谱法(HTLC)或其他在线萃取的需要。因此，在这样的实施方式中，该方法涉及(1)进行目标样品的蛋白质沉淀；和(2)将上清液直接加载到HPLC质谱仪上，而无需使用在线萃取或高湍流液相色谱法(HTLC)。
在一些优选的实施方式中，HPLC单独或与一种或多种纯化方法组合可在质谱法之前用来纯化ApoE。在这样的实施方式中，可以使用捕获分析物的HPLC提取柱(extractioncartridge)提取样品，然后在电离之前在第二HPLC柱上或在分析型HPLC柱上洗脱和色谱分析。因为可以以自动方式关联这些色谱过程中涉及的步骤，所以可以最小化在分析物纯化期间对操作员参与的需求。该特征可以导致时间和成本的节省，并消除操作员出错的机会。
相信湍流例如由HTLC柱和方法提供的湍流，可以提高质量传递速率，这改善了分离特性。HTLC柱借助通过包含硬质颗粒的填充柱的高色谱流速来分离组分。通过采用高流速(例如3-5mL/min)，该柱中产生了湍流，其导致固定相和目标分析物(一种或多种)之间几乎完全的相互作用。使用HTLC柱的优势在于，避免了与生物流体基质相关的大分子堆积，这是因为在湍流条件下不会保留高分子量种类。在一个过程中结合多个分离的HTLC方法减少了冗长的样品制备的需求，并以显著更快的速度运行。此类方法还实现了优于层流(HPLC)色谱法的分离性能。HTLC允许直接注入生物样品(血浆、尿液等)。由于变性蛋白质和其他生物碎片会迅速阻塞分离柱，因此在传统形式的色谱法中很难实现直接注入。HTLC还允许小于1mL的非常低的样品体积，优选地为小于0.5mL，优选地为小于0.2mL，优选为0.1mL。
在其他地方已经描述了在通过质谱分析之前应用于样品制备的HTLC实例。参见，例如，Zimmer等，J.Chromatogr.A 854：23-35(1999)；还参见，美国专利号5,968,367；5,919,368；5,795,469；和5,772,874。在方法的某些实施方式中，在加载到HTLC柱之前，将样品进行如上所述的蛋白质沉淀；在可选的优选实施方式中，样品可以直接加载到HTLC上而不进行蛋白质沉淀。HTLC萃取柱优选是大颗粒柱。在多种实施方式中，可以以在线、自动化方式进行方法的多个步骤之一。例如，在一个实施方式中，以在线、自动化方式进行步骤(i)-(v)。在另一方面，电离和检测步骤在步骤(i)-(v)之后在线进行。
包括高效液相色谱法(HPLC)在内的液相色谱法(LC)依赖于相对缓慢的层流技术。传统的HPLC分析依赖于柱填充，其中通过柱的样品层流是用于将目标分析物与样品分离的基础。技术人员将理解，在这种柱中的分离是扩散过程。HPLC已成功地应用于生物样品中的化合物分离，但是在分离和随后以质谱仪(MS)分析之前，需要显著量的样品制备，这使该技术劳动力密集。此外，大多数HPLC系统没有充分利用质谱仪的完全潜能，只允许一个HPLC系统连接到单个MS仪上，这导致由于进行大量测定造成的冗长时间需求。
已经描述了在质谱分析之前使用HPLC进行样品净化的多种方法。参见，例如，Taylor等，Therapeutic Drug Monitoring 22：608-12(2000)；和Salm等，Clin.Therapeutics 22Supl.B：B71-B85(2000)。
本领域技术人员可以选择适合与ApoE一起使用的HPLC仪和柱。色谱柱通常包括介质(即填充物质)以促进化学部分的分离(即分馏)。介质可以包括微小的颗粒。颗粒包括与多种化学部分相互作用以促进化学部分分离的结合表面。一种适合的结合表面是疏水结合表面，例如烷基结合表面。烷基结合表面可以包括C-4、C-8、C-12或C-18结合烷基基团，优选地为C-18结合基团。色谱柱包括用于接收样品的入口和用于排出包括分馏样品的流出物(effluent)的出口。在一个实施方式中，将样品(或预纯化的样品)在入口处施加到柱，用溶剂或溶剂混合物洗脱，并在出口处排出。可以选择不同的溶剂模式以洗脱目标分析物(一种或多种)。例如，可以使用梯度模式、等度模式或多型(polytyptic)(即混合)模式进行液相色谱法。在色谱法期间，物质的分离通过变量例如洗脱液(也称为“流动相”)的选择、洗脱模式、梯度条件、温度等实现。
在某些实施方式中，可以通过在如下条件下将样品施加到柱来纯化分析物，在该条件下将目标分析物通过柱填充物质可逆地保留，同时不保留一种或多种其他物质。在这些实施方式中，可以使用第一流动相条件，其中目标分析物被柱保留，并且一旦将非保留的物质洗涤通过，可以随后使用第二流动相条件以从柱中移出保留的物质。可选地，可以通过在流动相条件下将样品施加到柱来纯化分析物，在该流动相条件下目标分析物在与一种或多种其他物质相比不同的速率下洗脱。此类过程可以相对于样品的一种或多种其他组分，富集一种或多种目标分析物的量。
在一个优选的实施方式中，在疏水性柱色谱系统上，HTLC之后可以是HPLC。在某些优选的实施方式中，使用来自Cohesive Technologies的基于TurboFlow Cyclone
聚合物的柱(粒径为60μm，柱尺寸为50×1.0mm，孔径为
)。在相关的优选实施方式中，使用了来自Phenomenex Inc.的Synergi Polar-
带有亲水性封端的醚连接苯基分析柱(粒径为4μm，柱尺寸为150×2.0mm，孔径为
)。在某些优选的实施方式中，使用HPLC级超纯水和100％甲醇作为流动相进行HTLC和HPLC。
通过仔细选择阀门和连接器管道，根据需要可以连接两个或更多个的色谱柱，使得物质从一个色谱柱传递到下一个色谱柱，而无需任何手动步骤。在优选的实施方式中，阀门和管道的选择通过预编程以进行必要步骤的计算机控制。最优选地，色谱系统还以这种在线方式连接至检测器系统，例如MS系统。因此，操作员可以将一托盘样品放在自动进样器中，并且在计算机控制下进行剩余操作，这导致所有选定的样品的纯化和分析。
在某些优选的实施方式中，可以在电离之前纯化样品中的ApoE或其片段。在具体优选的实施方式中，色谱法不是气相色谱法。
通过质谱法检测和定量
在多种实施方式中，可以通过技术人员已知的任何方法将ApoE或其片段电离。使用质谱仪进行质谱法，质谱仪包括用于离子化分馏样品并创建带电分子以进一步分析的离子源。例如，可以通过电子电离、化学电离、电喷雾电离(ESI)、光子电离、大气压化学电离(APCI)、光电离、大气压光电离(APPI)、快原子轰击(FAB)、液体二次电离(LSI)、基质辅助激光解吸电离(MALDI)、场电离、场解吸、热喷雾/等离子喷雾电离、表面增强激光解吸电离(SELDI)、电感耦合等离子体(ICP)和粒子束电离进行样品电离。技术人员将理解，基于待测量的分析物、样品的类型、检测器的类型、正与负模式的选择等可确定电离方法的选择。
在优选的实施方式中，通过加热电喷雾电离(HESI)以正或负模式将ApoE或其片段电离。在可选的实施方式中，通过电喷雾电离(ESI)或大气压化学电离(APCI)以正或负模式将ApoE或其片段电离。
在电离样品之后，可以分析由此产生的带正电或带负电的离子以确定质荷比。用于确定质荷比的适合的分析仪包括四极杆分析仪(quadrupole analyzer)、离子阱分析仪和飞行时间分析仪。可以使用数种检测模式检测离子。例如，即，使用选择性离子监测模式(SIM)可以检测选择的离子，或可选地，可以使用例如多种反应监测(MRM)或选择的反应监测(SRM)的扫描模式检测离子。优选地，使用四极杆分析仪确定质荷比。例如，在“四极杆”或“四极离子阱”仪中，振荡的无线射频场中的离子经受与施加在电极之间的直流电势、RF信号的振幅以及质/荷比成比例的力。可以选择电压和振幅，以便只有具有特定质/荷比的离子行进四极杆的长度，而所有其他离子都将偏转。因此，四极杆仪可以充当用于注入仪器中的离子的“质量过滤器”和“质量检测器”二者。
通过采用“串联质谱法”或“MS/MS”增强MS技术的分辨率。在该技术中，可以在MS仪中过滤从目标分子产生的前体离子(也称为母体离子)，和随后将前体离子碎片化以产生一个或多个碎片离子(也称为子体离子或产物离子)，然后其在第二个MS过程中进行分析。通过仔细选择前体离子，只有某些分析物产生的离子传递至碎片化室，在此处与惰性气体原子碰撞产生碎片离子。因为在给定组的电离/碎片化条件下，前体离子和碎片离子二者均以可复现的方式产生，所以MS/MS技术可提供极其强大的分析工具。例如，过滤/碎片化的组合可用于消除干扰物质，并且可能在复杂的样品(例如生物样品)中尤其有用。
质谱仪通常为用户提供离子扫描；也就是说，在给定范围内(例如100至1000amu)具有具体质/荷的每个离子的相对丰度。通过本领域已知的多种方法分析物测定的结果即质谱可以与原始样品中的分析物量有关。例如，假设取样和分析参数被仔细控制，则可以将给定离子的相对丰度与将该相对丰度转换为原始分子绝对量的表格进行比较。可选地，可以将分子标准品与样品一起运行，并基于那些标准品产生的离子构建标准曲线。使用这样的标准曲线，给定离子的相对丰度可以转换为原始分子的绝对量。在某些优选的实施方式中，使用内标以产生用于计算ApoE数量的标准曲线。产生和使用这种标准曲线的方法在本领域中是众所周知的，并且本领域的普通技术人员能够选择适当的内标。例如，可以使用ApoE的同位素作为内标。对于本领域普通技术人员来说，用于将离子的量与原始分子的量相关联的许多其他方法是众所周知的。
所述方法的一个或多个步骤可以使用自动化机器进行。在某些实施方式中，在线进行一个或多个纯化步骤，并且更优选地，可以以在线方式进行所有纯化和质谱法步骤。
在某些实施方式中，例如MS/MS，其中前体离子被分离用于进一步碎片化，碰撞活化解离通常用来产生碎片离子以进一步检测。在CAD中，前体离子通过与惰性气体碰撞获得能量，并然后通过被称为“单分子分解”的过程碎片化。必须在前体离子中沉积足够的能量，以使离子中的某些键由于增加的振动能而断裂。
在具体优选的实施方式中，如下使用MS/MS检测和/或定量ApoE。样品进行液相色谱，优选是HPLC，来自色谱柱的液体溶剂流进入MS/MS分析仪的加热的雾化器接口，并且溶剂/分析物混合物在接口的加热管中转化为蒸气。通过选择的离子发生器将分析物电离。离子例如前体离子穿过仪器的孔并进入第一个四极杆。四极杆1和3(Q1和Q3)是质量过滤器，其允许基于离子(即“前体”和“碎片”离子)的质荷比(m/z)选择离子。四极杆2(Q2)是碰撞室，在其中离子被碎片化。质谱仪的第一个四极杆(Q1)选择具有ApoE的质/荷比的分子。允许具有正确ApoE的质/荷比的前体离子传递到碰撞室(Q2)，同时具有任何其他质/荷比的不需要的离子碰撞该四极杆的侧面并被消除。进入Q2的前体离子与中性氩气分子碰撞并碎片化。此方法称为碰撞活化解离(CAD)。产生的碎片离子被传递到四极杆3(Q3)中，在此处选择ApoE的碎片离子，而其他离子则被消除。
该方法可涉及以正离子或负离子模式进行的MS/MS。使用本领域中众所周知的标准方法，本领域的普通技术人员能够鉴定可用于在四极杆3(Q3)中选择的ApoE具体前体离子的一个或多个碎片离子。
如果ApoE的前体离子包括醇或胺基团，则通常形成碎片离子，其分别表示前体离子的脱水或脱氨。在前体离子包括醇基团的情况下，这种通过脱水形成的碎片离子是由前体离子损失一个或多个水分子造成的(即，其中前体离子与碎片离子之间的质荷比差异对一个水分子的损失约为18；或对两个水分子的损失约为36等)。在前体离子包括胺基团的情况下，这种通过脱氨形成的碎片离子是由一个或多个氨分子的损失造成的(即，其中前体离子与碎片离子之间的质荷比的差异是一个氨分子的损失约为17，或两个氨分子的损失约为34等等)。同样地，包括一个或多个醇和胺基团的前体离子通常形成这样的碎片离子，其表示一个或多个水分子和/或一个或多个氨分子的损失(即，前体离子和碎片离子之间的质荷比差异对一个水分子的损失和一个氨分子的损失约为35)。一般地，代表前体离子脱水或脱氨的碎片离子不是用于具体分析物的特定碎片离子。因此，在本发明的优选实施方式中，进行MS/MS，致使至少一个ApoE的碎片离子被检测到，其不代表由前体离子仅一个或多个水分子的损失和/或一个或多个氨分子的损失。
当离子与检测器碰撞时，它们产生电子脉冲，该电子脉冲被转换为数字信号。所获取的数据被中继到计算机，该计算机绘制所收集的离子数与时间的图。所得的质谱图类似于传统HPLC方法中生成的色谱图。测量对应于具体离子的峰下面积或此类峰的振幅，并且将该面积或振幅与目标分析物的量相关联。在某些实施方式中，测量碎片离子(一种或多种)和/或前体离子的曲线下面积或峰振幅以确定ApoE的量。如上所述，可以使用基于分子内标的一个或多个离子的峰的校准标准曲线，将给定离子的相对丰度转换为原始分析物的绝对量。
以下实施例用于说明本发明。这些实施例绝不旨在限制方法的范围。
实施例
实施例1：通过质谱法的ApoE表型确定
试剂总结：表1
通过LC-MS/MS测定鉴定CSF载脂蛋白E(ApoE)同工型测量了ApoE的三种不同同工型，然后可将其用于推断表型。有三个等位基因编码载脂蛋白E蛋白，ApoE2、ApoE3和ApoE4，其共同表达产生六种独特的表型；ApoE2/E2、ApoE2/E3、ApoE2/E4、ApoE3/E3、ApoE3/E4和ApoE4/E4。
为了测量每种ApoE表型，进行胰蛋白酶蛋白消化，并且使用独特的肽作为替代以鉴定每种蛋白质同工型。对于ApoE2同工型和ApoE4同工型二者都有独特的肽。通过使用ApoE2和ApoE3同工型之间的共享肽，以及ApoE3和ApoE4同工型之间的共享肽确定ApoE3同工型。将用于每种同工型的内标加标到每个样品中，以作为保留时间参考点。
使用串联质谱法，利用与Thermo Fisher Quantiva三重四极杆质谱仪连接的Thermo Aria Cohesive TLX-4高流量LC分析CSF ApoE样品。数据通过多反应监测(MRM)进行监测，并使用Thermo Fisher LC Quan数据分析软件进行分析。
在图中描述了和在下表2中总结了鉴定多种ApoE等位基因的所有质荷比(m/z)。
| 化合物 | 前体(m/z) | 产物(m/z) | 碰撞能量(V) | 射频透镜(V) |
| ApoE3/4:LAVYQAGAR | 475.05 | 374.42 | 21 | 55 |
| ApoE3/4:LAVYQAGAR | 475.05 | 502.55 | 21 | 55 |
| ApoE3/4 IS:LAVYQAGAR(13C,15N) | 482 | 516.45 | 21 | 55 |
| ApoE3/4 IS:LAVYQAGAR(13C,15N) | 482 | 679.62 | 21 | 55 |
| ApoE4:LGADMEDVR | 503.56 | 649.74 | 20 | 56 |
| ApoE4:LGADMEDVR | 503.56 | 892.96 | 19 | 56 |
| ApoE4 IS:LGADMEDVR(13C,15N) | 511.5 | 665.63 | 20 | 56 |
| ApoE4 IS:LGADMEDVR(13C,15N) | 511.5 | 908.84 | 20 | 56 |
| ApoE2:C[+57.1]LAVYQAGAR | 555.15 | 665.72 | 21 | 54 |
| ApoE2:C[+57.1]LAVYQAGAR | 555.15 | 835.93 | 21 | 54 |
| ApoE2 IS:C[+57.1]LAVYQAGAR(13C,15N) | 562.1 | 679.62 | 21 | 54 |
| ApoE2 IS:C[+57.1]LAVYQAGAR(13C,15N) | 562.1 | 849.83 | 21 | 54 |
| ApoE2/3:LGADMEDVC[+57.1]GR | 612.19 | 866.99 | 22 | 89 |
| ApoE2/3:LGADMEDVC[+57.1]GR | 612.19 | 982.08 | 22 | 89 |
| ApoE2/3 IS:LGADMEDVC[+57.1]GR(13C,15N) | 620.13 | 882.87 | 22 | 89 |
| ApoE2/3 IS:LGADMEDVC[+57.1]GR(13C,15N) | 620.13 | 997.96 | 22 | 89 |
预期值：CSF中的载脂蛋白E：2.84-7.24ug/mL；血清中的载脂蛋白E：20.07-101.68ug/mL。
每个质量控制水平的五个技术复制品在五个不同日子的时程里以低、中和高的顺序运行。
CSF低质量对照：1.2ug/mL
载脂蛋白E：
平均值：1.16至1.37
SD：0.03至0.12
％CV：2.27至10.35％
％回收：97.00至104.00％
CSF中质量对照：3.0ug/mL
载脂蛋白E：
平均值：2.68至3.37
SD：0.05至0.33
％CV：1.74至10.59％
％回收：89.27至112.40％
CSF高质量对照：15.0ug/mL
载脂蛋白E：
平均值：13.38至16.54
SD：0.40至1.65
％CV：4.71至11.36％
％回收：89.20至110.29％
准确度：通过LC-MS/MS分析了二十个具有已知APOE基因型的患者样品(分析方法：限制长度多态性(RLPM))。然后将ApoE表型与已知基因型进行比较。如下表3所示，每个患者样品的基因型和表型之间有100％的一致性。
| RLPM(基因型分型) | LC-MS/MS(表型分型) | |
| 患者1 | E3/E3 | E3/E3 |
| 患者2 | E3/E3 | E3/E3 |
| 患者3 | E3/E3 | E3/E3 |
| 患者4 | E3/E4 | E3/E4 |
| 患者5 | E3/E4 | E3/E4 |
| 患者6 | E3/E3 | E3/E3 |
| 患者7 | E2/E3 | E2/E3 |
| 患者8 | E3/E4 | E3/E4 |
| 患者9 | E3/E3 | E3/E3 |
| 患者10 | E3/E3 | E3/E3 |
| 患者11 | E3/E3 | E3/E3 |
| 患者12 | E4/E4 | E4/E4 |
| 患者13 | E3/E3 | E3/E3 |
| 患者14 | E2/E4 | E2/E4 |
| 患者15 | E3/E4 | E3/E4 |
| 患者16 | E4/E4 | E4/E4 |
| 患者17 | E3/E3 | E3/E3 |
| 患者18 | E3/E3 | E3/E3 |
| 患者19 | E3/E4 | E3/E4 |
| 患者20 | E3/E4 | E3/E4 |
冻融稳定性：通过分析六个加标表型进行冻融分析，表型被分成四个均匀等分试样。每种表型的所有四个等分试样均在-90至-60℃下冷冻。将等分试样两至四解冻至18-25℃的环境温度并冷冻，进行一次冻融。将等分试样三和四解冻至18-25℃的环境温度并冷冻，进行两次冻融。然后将等分试样四解冻至环境温度18-25℃并冷冻，进行三次冻融。
最后将所有等分试样解冻至环境温度18-25℃，和技术上一式三份分析。冻融分析包含跨越三个冻融循环的数据。ApoE表型在多达三个冻融循环中具有可接受的稳定性。表4：
提取样品稳定性：在样品提取当日分析十个样品的基线值。第二天，重新注入相同的样品，以针对基线值分析。该测定产生足以用于两次注射的样品。ApoE显示在CTC自动进样器的C堆栈中，在2至8℃下，至少1天的提取样品稳定性。表5：
| 基线 | 1天的提取样品稳定性 | ％准确度 | |
| 患者1 | 3/4 | 3/4 | 100％ |
| 患者2 | 3/3 | 3/3 | 100％ |
| 患者3 | 3/4 | 3/4 | 100％ |
| 患者4 | 2/3 | 2/3 | 100％ |
| 患者5 | 3/4 | 3/4 | 100％ |
| 患者6 | 3/4 | 3/4 | 100％ |
| 患者7 | 3/3 | 3/3 | 100％ |
| 患者8 | 3/4 | 3/4 | 100％ |
| 患者9 | 3/4 | 3/4 | 100％ |
| 患者10 | 2/4 | 2/4 | 100％ |
室温稳定性：在18至25℃下样品稳定多达7天。表6：
冷藏稳定性：在2至8℃下样品稳定多达7天。表7：
冷冻稳定性：在-30至-10℃下样品稳定至少31天。表8：
干扰研究：可接受标准：潜在干扰物质造成的差异应≤2SD或20％CV，这被认为是可接受的。
溶血干扰：向六个患者库中加标血红蛋白(Sigma目录编号H7379)并一式三份分析基线、轻微、中度和严重溶血干扰。10mg/mL的血红蛋白溶液用于“严重(gross)”干扰。将10mg/mL的溶液分别用10mM BS以1:10和1:20稀释用于中度和轻微干扰。
由于血清源的载脂蛋白E的可能污染，所有水平的溶血都是不可接受的。
表9：
脂血干扰：向六个患者库中加标脂肪乳剂(Sigma目录编号I141)，并一式三份地分析基线、轻度、中度和严重的脂血干扰。1:5稀释(脂肪乳剂：10mM PBS)用于“严重”干扰。将1:5溶液分别用10mM PBS以1:10和1:20稀释用于中度和轻微干扰。ApoE对于所有程度的脂血CSF样品都是可以接受的。表10：
胆红素干扰：向六个患者库中加标胆红素(Sigma目录编号B4126)，并一式三份地分析基线、轻度、中度和严重的黄疸干扰。1mg/mL的胆红素溶液用于“严重”干扰。将1mg/mL的溶液分别用10mM PBS以1:10和1:20稀释用于中度和轻微干扰。ApoE对于任何程度的黄疸CSF样品都是可以接受的。表11：
离子抑制：提取十个患者样品。将十个样品注入通过分析柱，同时将ApoE的消化肽混合物柱后输注。如果当洗脱ApoE的内标时，ApoE的总离子色谱图(TIC)显示了信号强度≥15％的降低，那么确定该测定中存在离子抑制。当分析物正洗脱时，消化肽ApoE的TIC在梯度中未显示抑制作用。TIC信号强度为一条平直线，并显示出≤15％的信号强度差异，这在测定的可接受参数内。
总ApoE的定量分析：通过LC-MS/MS测定的CSF载脂蛋白E(ApoE)测量了CSF中ApoE的总水平。为了测量总ApoE，进行胰蛋白酶蛋白消化，并使用所有三种同工型(ApoE2、ApoE3和ApoE4)的独特肽作为替代以测量总ApoE蛋白浓度。使用串联质谱法，利用与ThermoFisher Quantiva三重四极杆质谱仪连接的Thermo Aria Cohesive TLX-4高流量LC分析CSF ApoE样品。数据以多反应监测(MRM)进行监测，并使用Thermo Fisher LC Quan数据分析软件进行分析。测量了以下离子：
| 化合物 | 前体(m/z) | 产物(m/z) | 碰撞能量(V) | 射频透镜(V) |
| 总ApoE:LGPLVEQGR | 485.06 | 489.51 | 18 | 55 |
| 总ApoE:LGPLVEQGR | 485.06 | 588.64 | 18 | 55 |
| 总ApoE IS:LQAEAFQA R(13C,15N) | 522.54 | 602.6 | 18 | 55 |
| 总ApoE IS:LQAEAFQA R(13C,15N) | 522.54 | 731.71 | 18 | 55 |
对于CSF ApoE的检测限(LOD)：0.33μg/mL。对于CSF ApoE的定量限确定为1.0ug/mL。对于CSF ApoE的LOB：0.3ug/mL。
本文中提到或引用的文章、专利和专利申请以及所有其他文件和电子可得到的信息的内容以其全部内容通过引用并入本文至这样的程度，如同每一单独的出版物被明确且单独地表明通过引用并入。申请人保留将任何和所有来自这些文章、专利、专利申请或其他物理和电子文件的物质和信息物理上并入本申请的权利。
本文说明性描述的方法可在本文没有明确公开的任何一个或多个要素、一个或多个限制不存在的情况下合适地实践。因此，例如，术语“包括(comprising)”、“包含(including)”、“含有(containing)”等应当广义且非限制性地理解。此外，本文所用的术语和表述已经作为描述性术语而非限制性术语使用，并且没有意图使用这种将所示和所述特征的任何等价形式或其部分排除的术语和表述。应当认识到在所要求保护的发明范围内各种改变是可能的。因此，应当理解，尽管本发明通过优选的实施方式和任选特征具体地公开，但是本领域普通技术人员可采取本文公开的其中具体实施的本发明的改变和变化，并且这种改变和变化被认为在本发明的范围内。
本发明在本文中已经作了广泛且一般性的描述。落入一般公开内容中的每一个较窄类别和亚组分组也构成了所述方法的部分。这包括本方法的一般描述，条件或者否定性的限制是从种类中去除了任何主题内容，无论排除的物质是否在本文中明确描述。
其他实施方式在所附权利要求之内。此外，在所述方法的特征或方面按照马库什组进行描述的情况下，本领域普通技术人员应认识到本发明也因此按照马库什组的任何单个成员或成员亚组进行描述。
Claims (27)
1.一种用于确定样品中载脂蛋白E(ApoE)表型的方法，所述方法包括：
(a)纯化所述样品中的ApoE；
(b)电离所述样品中的ApoE以产生一种或多种ApoE离子；
(c)通过质谱法检测来自步骤(b)的所述离子(一种或多种)；其中从步骤(c)中检测到的所述离子的身份确定所述样品中存在所述ApoE等位基因(一种或多种)。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述纯化包括液相色谱法。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述液相色谱法包括高效液相色谱法(HPLC)。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述纯化包括固相萃取(SPE)。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述电离包括电喷雾电离(ESI)。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述电离包括以正模式电离。
7.根据权利要求1所述的方法，进一步包括添加内标。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述内标是同位素标记的。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是脑脊液(CSF)。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是血清。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括在纯化之前消化ApoE。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述消化包括胰蛋白酶消化。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述消化包括微波消化。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述表型是ApoE2/ApoE2。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述ApoE2/ApoE2表型通过质/荷比选自665.72±0.5、835.93±0.5、866.99±0.5和982.08±0.5的碎片离子(一种或多种)的存在来确定。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述表型是ApoE2/ApoE3。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述ApoE2/ApoE3表型通过质/荷比选自374.42±0.5、502.55±0.5、665.72±0.5、835.93±0.5、866.99±0.5和982.08±0.5的碎片离子(一种或多种)的存在来确定。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述表型是ApoE2/ApoE4。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述ApoE2/ApoE4表型通过质/荷比选自374.42±0.5、502.55±0.5、649.74±0.5、665.72±0.5、835.93±0.5、866.99±0.5、892.96±0.5和982.08±0.5的碎片离子(一种或多种)的存在来确定。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述表型是ApoE3/ApoE3。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述ApoE3/ApoE3表型通过质/荷比选自374.42±0.5、502.55±0.5、866.99±0.5和982.08±0.5的碎片离子(一种或多种)的存在来确定。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述表型是ApoE3/ApoE4。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述ApoE3/ApoE4表型通过质/荷比选自374.42±0.5、502.55±0.5、649.74±0.5、866.99±0.5、892.96±0.5和982.08±0.5的碎片离子(一种或多种)的存在来确定。
24.根据权利要求1所述的方法，其中所述表型是ApoE4/ApoE4。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述ApoE3/ApoE4表型通过质/荷比选自374.42±0.5、502.55±0.5、649.74±0.5和892.96±0.5的碎片离子(一种或多种)的存在来确定。
26.根据权利要求1所述的方法，其中ApoE4等位基因的存在表明发生阿尔茨海默氏病的风险增加。
27.根据权利要求1所述的方法，其中ApoE4/ApoE4等位基因的存在表明发生阿尔茨海默氏病的风险增加。
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