CN102762986A - 阿尔茨海默病的诊断方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供帮助诊断患者阿尔茨海默病的离体方法，所述方法包括如下步骤：测定选自单胺氧化酶B，凝集因子XIIIa，总原肌球蛋白（a和13）,WD重复蛋白1和载脂蛋白E4的患者血小板样品中至少4种血小板蛋白的表达含量；并且将（i）的结果与对照值作比较，其中高于对照值的结果指示阿尔茨海默病。优选地，发明方法还包括测定野生型GSTO-1或突变GSTO-1的表达水平。

Description

阿尔茨海默病的诊断方法
发明领域
本发明涉及使用定量阿尔茨海默病周围生物标记的离体诊断方法。
发明背景
阿尔茨海默病是神经变性疾病，影响全世界约2千4百万人。该疾病表征是由大脑皮层和大脑某些皮质下区域的神经元和突触缺失造成的认知和行为紊乱
所述疾病可以在最终诊断前的很多年即已开始。在早期，短期记忆丧失是最常见症状。后来，症状包括混乱，愤怒，情绪不稳，语言衰退，长期失忆，感觉和身体机能普遍下降。
阿尔茨海默病是老年人中最常见的痴呆类型并且影响所有痴呆患者的几乎一半。相应的，年龄增长是疾病的主要危险因子。65岁的人中，2-3%显示疾病征兆，而85岁的人中，25-50%有阿尔茨海默病症状，并且甚至更多人没有特征症状但有疾病的一些病理特点。世界卫生组织预测阿尔茨海默病和其他痴呆的全球总伤残调整生命年（DALY）在2005年超过1千1百万，预计每年有3.4%的增加。阿尔茨海默病目前没有已知治愈法，并且可用的治疗提供相对较小症状益处且性质是缓解性。
抑郁是阿尔茨海默病常见早期症状，并且认为归因于单胺氧化酶（MAO）上调等因子。所述酶有两个同种型，MAO-A和MAO-B。发现两者都遍及中枢神经系统（CNS）细胞，其中，它们的功能是使包括苯乙胺和多巴胺在内的单胺能神经递质失活。MAO-B在血小板中也丰富。阿尔茨海默病的开始和进展与淀粉样斑块和神经纤维缠结的发展有关。淀粉样斑块（也称为“老年斑”）包括β淀粉样蛋白的致密不溶性沉淀，所述β淀粉样蛋白来自跨膜蛋白淀粉样前体蛋白（APP）。
APP水解后，β淀粉样蛋白在细胞外聚集，形成斑块。神经纤维缠结由于tau的过度磷酸化形成，所述tau是CNS中丰富的微管相关蛋白。多个过度磷酸化tau分子成为缠结并且在神经细胞体内形成块。这些神经纤维缠结造成微管崩解，导致神经元转运系统的瓦解。
阿尔茨海默病通常从病史，亲戚观察和临床观察上进行临床诊断。然而，阿尔茨海默病特征性神经和神经心理学特性，例如淀粉样斑块和神经纤维缠结的存在经常在死后才能确定。
大部分阿尔茨海默病的示例不显示家族遗传，但是至少80%散发性阿尔茨海默病例涉及遗传风险因子。载脂蛋白E（ApoE）基因的ε4等位基因的遗传被认为是多至50%晚发型散发阿尔茨海默病例发展的风险因子。
谷胱甘肽S-转移酶Ω-1（GSTO-1）是催化还原型谷胱甘肽（GSH）与多种带亲电中心的疏水底物连接的谷胱甘肽S-转移酶家族成员。编码GSTO-1的基因已知存在不同遗传同种型。这些同种型关联阿尔茨海默病和帕金森病的发病年龄（AAO）（Li，Y等，Hum Mol Genet.（2003）12（24）:3259-67）。Li和同事描述GSTO-1h SNP 7-1（rs4825，一种核苷酸）与阿尔茨海默病AAO延迟6.8年（+/-4.41）和帕金森病AAO延迟8.6年相关（Li，Y等，Neurobiol Aging（2006）27（8）:1087-93）。
当治疗化合物有最大潜在效果时，神经疾病的诊断标记在病程早期诊断中特别重要。然而，难于准确诊断。可用的早期神经疾病的诊断标记很少，并且可用的那些标记依赖于样品材料分析（如脑脊液），得到这些材料困难并且令人疼痛。
因此，需要确定使用易得到患者样品周围可用的阿尔茨海默病生物标记的新诊断方法，从而有助于简单和准确诊断。
发明内容
本发明的第一个方面提供帮助患者中阿尔茨海默病诊断的离体方法，包括：
（i）测定选自单胺氧化酶B，凝集因子XIIIa，总原肌球蛋白，WD重复蛋白1载脂蛋白E4的患者血小板样品中至少4种血小板蛋白的表达水平；和
（ii）将（i）的结果与对照值作比较，
其中，结果高于对照值指示阿尔茨海默病。
本发明的第二个方面针对一种或多种表3或表4中确定的蛋白以使一种或多种本发明第一方面所述诊断方法包括的血小板蛋白标准化。
本发明的第三个方面提供的固体支持物包括选自其上固定的单胺氧化酶B，凝集因子XIIIa，总原肌球蛋白，WD重复蛋白1和ApoE4的至少4种血小板蛋白的一种或多种配体。
附图说明
图1显示使用模型1，2，3和4单独算法的决策过程。
图2a和2b显示使用模型1的各发现组的ROC曲线和散点图。图2c和2d显示使用模型1的各验证组的ROC曲线和散点图；
图3a和3b显示使用模型2的各发现组的ROC曲线和散点图。图3c和3d显示使用模型2的各验证组的ROC曲线和散点图；
图4a和4b显示使用模型3的各发现组的ROC曲线和散点图。图4c和4d显示使用模型3的各验证组的ROC曲线和散点图；
图5显示模型4的ROC曲线；
图6是显示作为内部提取标准的14-3-3γ合适性的1D Western印迹。
图7是蛋白测定（P<0.01）后和用内部提取标准蛋白14-3-3γ标准化（P<0.00000007）后所分析Mao-B表达增加的对比；
图8是应用ERK2作为内部提取标准的代表性Western印迹；
图9显示三个GSTO-1同种型的2D Western印迹；
图10显示使用模型1的阿尔茨海默病和帕金森病患者样品的散点图；
图11显示使用模型2的阿尔茨海默病和帕金森病患者样品的散点图；和
图12显示使用模型3的阿尔茨海默病和帕金森病患者样品的散点图。
具体实施方式
本发明基于下述令人惊讶的发现，相较年龄和性别相符健康对照，血小板蛋白单胺氧化酶B、凝集因子XIIIa、α原肌球蛋白、β原肌球蛋白、WD重复蛋白1和载脂蛋白E4（ApoE4）的表达在阿尔茨海默病患者中明显改变。这些血小板蛋白因此作为疾病的生物标记。另外，已经发现，wtGSTO-1（位点140的丙氨酸）在没有携带任何ApoE4等位基因的阿尔茨海默病患者中过多出现，而wtGSTO-1在ApoE4阳性阿尔茨海默病患者中出现不足。
本发明提供帮助诊断患者阿尔茨海默病的离体方法，包括测定选自单胺氧化酶B、凝集因子XIIIa、总原肌球蛋白（α和β）、WD重复蛋白1和ApoE4的患者血小板样品中至少4种血小板蛋白的表达水平，并且将所述组合表达水平与对照值作比较（作为标准化丰度测量），其中高于对照值的结果指示阿尔茨海默病。高于对照值的结果因此可以用于阳性诊断阿尔茨海默病。
发明的方法，结合其他方法例如简易精神状态量表（MMSE）评分和医师咨询，能用于帮助诊断阿尔茨海默病。
本文使用的术语“患者”指哺乳动物，优选人，怀疑有阿尔茨海默病或认为有此疾病倾向的人。
在一个优选实施方式中，样品材料从例如使用标准静脉切开术技术获得的血液血小板裂解液中分离。
术语“同种型”在本文中定义为与另一蛋白有相同功能的蛋白，并有相似或相同序列，但由不同基因编码。
本文所用的术语“基因产物”指基因转录而来的mRNA或蛋白产物。
本文所用的术语“表达水平”指血小板样品中特定蛋白（或者编码蛋白的mRNA）的量。测定蛋白表达水平的技术对技术人员显而易见，并且包括使用生物芯片阵列技术或2D DIGE（2维凝胶电泳差异）。
优选的，特定血小板蛋白的表达水平以术语“标准丰度”定量，提供考虑到血小板蛋白浓度自然变化的数字值。标准丰度值能与已知对照值作比较。
术语“外周生物标记”定义为在血液血小板外周出现的蛋白，其中蛋白的外周表达改变反映了CNS中的显著病理学变化，其中所述变化涉及阿尔茨海默病病理。
本文所用的术语“GSTO-1”指鉴定为EC 2.5.1.18的蛋白，具有UniProtKB/SwissProt初级登录号P78417（序列版本2），或其变体和同种型。
本文所用的术语“单胺氧化酶”或“MAO”指鉴定为EC 1.4.3.4的蛋白，所述蛋白是催化单胺氧化的酶。人中存在两种MAO形式，有UniProtKB/SwissProt初级登录号P21397的MAO-A和有UniProtKB/SwissProt初级登录号P27338的MAO-B。两者在神经元和星形胶质细胞中都出现。MAO-A还出现在肝，胃肠道和胎盘中，而MAO-B在血液血小板中发现。
本文所用的术语“凝集因子XIIIa”指有UniProtKB/SwissProt初级登录号P00488的蛋白，并且由人中F13A1基因编码。凝集因子XIIIa是凝集因子XIII的催化活性亚基，并且在凝血级联系统中有稳定纤维蛋白凝块的功能。
原肌球蛋白是调节肌动蛋白力学的肌动蛋白结合蛋白。两个原肌球蛋白链组装成平行和配准卷曲螺旋二聚体。原肌球蛋白α由人中TPM1基因编码，并有UniProtKB/SwissProt初级登录号P09493。原肌球蛋白β由人中TPM2基因编码，并有UniProtKB/SwissProt初级登录号P07951。为了本发明方法的目的，α原肌球蛋白和β原肌球蛋白的标准丰度组合给出随后用于此分析的“总原肌球蛋白”值。
本文所用的术语“WD重复蛋白1”指有UniProtKB/SwissProt初级登录号O75083的蛋白。WD重复蛋白1（也称为肌动蛋白相互作用蛋白1）是真核生物中的高度保守蛋白，能与ADF/cofilin家族蛋白结合诱导肌动蛋白纤丝的解聚。
术语“ApoE”是载脂蛋白E的缩写。有三种主要ApoE同种型，称为ApoE2，E3和E4，分别由z2，ε3和z4等位基因编码。ApoE3是最常见同种型。已知ApoE4与晚发性阿尔茨海默病相关，其有两拷贝的ε4等位基因，代表疾病发展风险高于一拷贝等位基因或无拷贝。阿尔茨海默病患者能因此分类为ApoE4和非ApoE4或者。
如表1详述，GSTO-1基因型分布取决于ApoE3和ApoE4基因型，并且在非ApoE4阿尔茨海默和帕金森患者中明显改变。发现普通人群中野生型（WT）GSTO-1的正常分布为约40%，而73%非ApoE4阿尔茨海默患者和71%非ApoE4帕金森患者有WT GSTO-1。因此，使用ApoE4表型或基因型分析，结合GSTO-1表型或基因型分析，能测定阿尔茨海默病风险。
表1
  阿尔茨海默病   帕金森病  年老对照   年轻对照
  ApoE3   ApoE3  ApoE3   ApoE3
  73％GST(wt)   71％GST(wt)  34％GST(wt)   36％GST(wt)
  ApoE4   ApoE4  ApoE4   ApoE4
  38％GST(wt)   0％GST(wt)  43％GST(wt)   0％GST(wt)
野生型GSTO-1因此是非ApoE4阿尔茨海默病患者的有用外周生物标记，并且如表1所示，能区分阿尔茨海默病和帕金森病。
本发明人已经发现使用至少四个阿尔茨海默病生物标记的组合提供比单一生物标记分析更精确的诊断。因此，本发明提供帮助阿尔茨海默病诊断的离体方法，包括步骤：
（i）测定选自单胺氧化酶B，凝集因子XIIIa，总原肌球蛋白，WD重复蛋白1和ApoE4的患者血小板样品中至少4种血小板蛋白的表达水平；和
（ii）将（i）的结果与对照值作比较，
其中，结果高于对照值指示阿尔茨海默病。
在一个优选实施方式中，发明方法的步骤（i）还包括测定野生型或突变GSTO-1的表达水平。参考患者基因组的ApoE4等位基因数目来决定本分析中包括何种GSTO-1形式。因此，发明方法的优选实施方式还包括测定ApoE4等位基因数目。如果患者有一个或两个等位基因，测定突变GSTO-1的表达水平。如果患者没有ApoE4等位基因，则测定野生型GSTO-1的表达水平。
在一个优选实施方式中，每个血小板蛋白的表达水平用精确测定蛋白水平的蛋白分析测定。
在一个优选实施方式中，每个血小板蛋白的表达水平用生物芯片阵列测定。具有针对固定于其表面待测定血小板蛋白的配体的生物芯片与患者血小板细胞裂解液样品接触，并且然后清洗生物芯片表面，从而样品中存在的蛋白根据与固定配体的可检测相互作用来鉴定。
为了在蛋白表达水平进行ApoE4基因分型，需要测定ApoE4蛋白水平和总ApoE4水平。
生物标记统计分析的标准方法使用单变量方法来比较不同组的生物标记水平并且突出浓度在不同组之间明显不同的生物标记。
发明方法所用选定的单独生物标记用接受者操作特征（ROC）分析来加以研究。ROC曲线是评价诊断测试的精确性的优选方法，因为其解决测试的灵敏度（即真阳性数目）和特异性（即假阳性数目）问题。给出高灵敏度和特异性的生物标记（约80%灵敏度和特异性在诊断领域是可接受值）形成逻辑回归方程的基础。生物标记的检测蛋白浓度值输入到逻辑回归方程以给出能用于帮助诊断阿尔茨海默病的最终值。
为了构建多个生物标记的ROC曲线，通过输入患者样品中每个生物标记的检测蛋白浓度值到方程，导出感兴趣生物标记组合的逻辑回归方程。
尽管逻辑回归方程是本发明的优选统计方法，也能使用其他传统统计方法。
例如，考虑到两个假拟分析物A和B，分析物A和分析物B的衍生逻辑回归方程是：
y=3.2027 x log[A]-0.9506 x log[B]+0.1548
其中，[A]是患者样品中分析物A的检测浓度，和[B]是分析物B的检测浓度。
如果y高于ROC曲线所得截留值，支持诊断患者的阿尔茨海默病。如果y低于ROC曲线所得截留值，不支持诊断患者的阿尔茨海默病。
术语“对照值”和“截留值”在本中可互换使用，并且指可与根据发明方法所得患者样品值作比较的参照值，用于帮助阿尔茨海默病诊断。
为了得到对照值，发明方法步骤（i）列出的血小板蛋白的表达含量从健康个体群样品中测定。然后对结果应用ROC曲线分析和线性回归的统计工具以得到单一截留值。
应理解截留值根据对照群的大小而改变。对照群内生物变化通过增加群体大小而降低。因此，优选对照值衍生自含至少30例健康个体的对照群，优选至少50例健康个体的和更优选至少100例健康个体。
发明方法的另一个实施方式提供阿尔茨海默病诊断的四个不同模型；这些模型概括于表2。模型1包括单独算法。模型2，3和4各包括两个算法，根据有或没有ApoE4基因型而选择。图1显示对给定患者样品选择最合适算法的决策过程。
模型1
模型1基于独立于ApoE4存在的算法A（即无论患者有0、1或2个ApoE4等位基因，所述算法都能使用）。标记“X”的分析检测结果相加。
对本文所述四个模型的每一个，权重因子能用于每个生物标记的表达值，并且这些可就不同生物标记而不同，并取决于是否使用生物芯片或2DDIGE进行分析。
在最简单形式中，对所有生物标记使用1的权重因子，检测对象的结果会通过应用下列计算使用模型1测定：
1x标准化丰度（Mao-B）+1x标准化丰度（总原肌球蛋白）+1x标准化丰度（凝集因子XIIIa）+1x标准化丰度（wtGSTO-1）+1x标准化丰度（ApoE4）。
然后结果与对照值作比较。结果高于对照指示患者中的阿尔茨海默病。
模型2
模型2使用两个不同算法，考虑到非ApoE4阿尔茨海默病患者的wtGSTO-1过高表达。不同算法的使用取决于患者有或没有ApoE4，从而说明非ApoE4患者的wt GSTO-1过高表达。如果ApoE4等位基因在患者样品中缺失，使用算法A。否则，使用算法B。通过对每个生物标记应用标准化丰度的权重因子得到结果，如模型1的上述解释。
模型3
模型3也使用两个不同算法与模型2类似，如果ApoE4等位基因从患者基因组中缺失，那么应用算法A。如果患者有1个或2个ApoE4等位基因，那么应用算法C。通过对每个生物标记应用标准化丰度的权重因子得到结果，如模型1的上述解释。
模型4
模型4类似于模型2和3，根据患者基因组有或没有ApoE4使用不同算法（即D或E）。然而，模型4包括额外生物标记-WD重复蛋白1。
使用算法模型1，2，3或4计算的结果值与预定对照值作比较，以帮助疾病诊断。关于如何测定对照值的解释在实施例1中提供。
表2
Figure BDA00001971239800091
X单独分析包括在算法中
-单独分析不包括在算法中
上述模型1-4描述的每个算法也能包括基于患者基因组中出现的ApoE4等位基因数目的权重因子。如果患者有一个或两个ApoE4等位基因，+1或+2值分别加入到给定算法中包括的所有血小板蛋白的总标准化丰度值。然后对比所得值与对照以作出诊断。或者，如果患者没有ApoE4等位基因，那么没有附加权重因子加入总标准化丰度值。
根据本发明，通过比较经分离血小板样品中每个生物标记的总表达水平与对照值能帮助阿尔茨海默病的诊断。疾病诊断能结合其他因子，例如临床观察和病历来完成，并且参考患者之前的分析结果。
然而，因为血小板在血液中浓度不同，所以血小板蛋白浓度也不同。血小板富集血浆和胶过滤血小板的血小板浓度变化系数分别是38%和32%，并且血小板计数与血小板浓度的关联性差（对通过血小板计数的血小板生物标记的分析标准化，K=0.58）。这造成血液样品中血小板蛋白浓度不是测定大脑中病理改变的可靠指示物，并且需要额外步骤来标准化血小板蛋白浓度。
因此，本发明使用内部提取标准以在“标准化丰度”方面精确定量血小板蛋白表达。
在一个优选实施方式中，内部提取标准衍生自人血小板蛋白质组并且存在于患者样品或对照样品血小板裂解液。
本文所用的术语“低生物学变异”指CV值小于0.18的细胞提取蛋白。
本文所用的术语“标准化自然生物学变异”指与样品间变化可忽略的蛋白浓度对应的参考值使用，根据其能精确测定样品间自然变异更高的蛋白浓度。
使用生物信息分析、质谱和2D PAGE，通过分析110例个体血小板蛋白质组中908个不同蛋白的生物学变异来鉴定内部提取标准的候选蛋白。表3列出了pH范围为4-7的凝胶鉴定的低生物学变异候选物。表4列出了pH范围为6-9的凝胶鉴定的低生物学变异候选物。
表3
Figure BDA00001971239800111
表4
Figure BDA00001971239800112
因此，发明的第二个方面涉及使用一种或多种表3或4中所列蛋白来对本发明第一方面方法所含一种或多种血小板蛋白表达水平的生物学变异进行标准化。
合适蛋白可以根据其SwissProt初级登录号确定。SwissProt登录号确定编码每个蛋白的mRNA产物。
UniProtKB/SwissProt蛋白知识库是有注解的蛋白序列数据库，由SwissProt和UniProt知识库蛋白数据库合并建立。由瑞士生物信息学协会（SIB），欧洲生物信息研究所（EBI）和国家生物医学研究基金会共同维护。本文涉及的UniProtKB/SwissProt发布是2008年4月8日的v55.2，并能在http://expasy.org/sprot获得。
从所述mRNA衍生的所有蛋白在发明范围内，即所有变体和翻译后修饰。
在发明的一个优选实施方式中，内部提取标准蛋白是14-3-3蛋白γ。
本发明的第三个方面提供包括含离散测试区域的固体支持物的生物芯片，其中至少固定选自单胺氧化酶B、凝集因子XIIIa、原肌球蛋白（α和β）、WD重复蛋白1和ApoE4的血小板蛋白。在一个优选实施方式中，固体支持物还包括一个或多个表3或表4所确定蛋白的固定配体。优选地，固体支持物还包括一个或多个野生型GSTO-1，突变GSTO-1和载脂蛋白E的配体。
使用发明的生物芯片能以快速、精确并易于使用的格式对患者样品进行多分析物筛选。多分析物方法有节约时间和成本的优点，其对增加效率和提高临床表现上重要。尽管通常需要数个分析物，但传统诊断采用单个分析物分析的形式，因此增加样品体积，可能需要多个患者参与和增加诊断前时间。多分析物分析降低患者不适，因为所有分析使用单独患者样品，不需要多个患者样品。
本文所用的术语“配体”指结合到靶标的分子。
发明的生物芯片的配体可以是抗体，抗原或核酸。
从表2中能理解到，算法A的应用需要生物芯片包括单胺氧化酶B，凝集因子XIIIa，α原肌球蛋白，β原肌球蛋白，载脂蛋白E4，载脂蛋白E，和野生型（wt）GSTO-1的配体。算法B的应用需要生物芯片只包括单胺氧化酶B，凝集因子XIIIa，α原肌球蛋白，β原肌球蛋白，载脂蛋白E4，载脂蛋白E的配体。算法C的应用需要生物芯片包括单胺氧化酶B，凝集因子XIIIa，α原肌球蛋白，β原肌球蛋白，载脂蛋白E4，载脂蛋白E和突变（mt）GSTO-1的配体。算法D和E的应用需要生物芯片包括单胺氧化酶B，凝集因子XIIIa，α原肌球蛋白，β原肌球蛋白，WD重复蛋白1，载脂蛋白E4，载脂蛋白E和wt-GSTO-1（只有算法D）和mt-GSTO-1（只有算法E）的配体。
如果只有（wt）GSTO-1和（mt）GSTO-1的基因型数据包括在模型中，那么野生（wt）GSTO-1和突变（mt）GSTO-1的分析可以互换。如果通过蛋白表达水平进行基因分型可行，（wt）GSTO-1和（mt）GSTO-1的蛋白分析也可互换。然而，使用基因型数据只会造成诊断精确度降低，因为当使用各蛋白浓度时，所述模型表现更好。
根据发明的患者样品中特定血小板蛋白的表达用标准化丰度定量，优选使用生物芯片阵列系统。发明的生物芯片与患者血小板细胞裂解液样品接触，然后清洗表面，从而样品中出现的蛋白根据生物芯片表面固定配体形成的相互作用来确定。配体-蛋白相互作用产生化学发光信号，所述信号能用成像系统例如电荷耦合器件（CCD）超级冷却相机快速检测并分析以同时确定单独分析物。样品加入生物芯片和随后清洗，孵育和信号试剂步骤能完全自动或人工应用。血小板蛋白表达检测的结果经过两个连续标准化过程。第一个涉及生物芯片阵列系统所得信号的技术变化校正过程，例如背景校正，参照点和修正点验证。
未知样品的信号与校准曲线的比较给出未知样品的蛋白浓度。全血和分离样品中血小板浓度在个体间不同，并因此影响样品中AD生物标记蛋白浓度。因此，需要第二标准化过程，计算阿尔茨海默病生物标记的标准化丰度。一个或多个内部提取标准蛋白（选自表3和4）与阿尔茨海默病生物标记平行检测。标准化丰度值对应于阿尔茨海默病生物标记表达水平和内部提取标准间的比率，或多个内部提取标准的和。
或者，表达水平能用2D DIGE分析测定和使用软件，如DeCyder软件6.5（GE医疗保健公司（GE Healthcare））计算凝胶上不同点的标准化丰度。
2D DIGE系统中，也有两个连续过程，用于得到蛋白的标准化丰度。第一个过程（标准化）涉及通过计算初始和第二凝胶图像之间点比率数据柱状图来计算标准化因子。正常分布曲线适合柱状图并且所得模型曲线中心是标准化因子。然后，初始点图的点体积使用标准化因子进行标准化
C:V1 i'=V1ix 10C'(ii)
其中：V1 i'是初始凝胶图像中点i的标准化体积；和V1 i是初始凝胶图像中点i的体积。
第二个过程涉及内部标准使用，通常是研究中所有检测样品的集合，并且在每个2维DIGE胶中出现。不同胶的每个标准图像的标准化体积比率设为值1.0。每个样品点的表达比率然后与相同凝胶中的其相应标准点关联，因此可能比较不同凝胶中相符蛋白点之间的比率。
所得标准化丰度值是标准化蛋白点体积和标准化内部标准点体积的比率，用倍数改变描述。
上述计算能用标准化值的Log10修正，以帮助缩放图示和统计分析。
下述非限制性实施例描述了本发明的各方面。
实施例1：用于诊断阿尔茨海默病的单个生物标记实验和包括三、四和五个生物标记实验的分析
在两个期收集样品，并分成发现组和确认组。产生使用2D-DIGE和ROC曲线的每个血小板蛋白标准丰度的测量，以得到每个生物标记的最佳截留值，实际截留值，灵敏度和特异性值。表5显示这些单独蛋白分析的结果。
表5
Figure BDA00001971239800151
开发了同时分析三个和四个生物标记组合的算法，以获得截留值（对照）值，用作阿尔茨海默病诊断中的参考值。这些算法总结在表6中。
表6
Figure BDA00001971239800152
上述设定的所有理论阈值指示阳性AD诊断。将每个算法的计算值与理论阈值作比较，并且高于阈值的结果对应阳性阿尔茨海默病诊断。这些诊断然后与从两个测试组（AD组和对照组）的实际诊断作比较。根据此比较，测定假阳性和假阴性并且计算特异性和灵敏度。ROC曲线的每个点对应于有特定灵敏度和特异性的阈值（对照值）。
为获得全部ROC曲线，理论阈值的值持续增加并且测定各阈值的灵敏度和特异性。最靠近图片左上角的ROC曲线的点对应于最优截留值，即最高灵敏度和特异性的值。ROC曲线中各点离左上角（0，1）的距离使用以下公式计算：距离=√（（1-灵敏度）2+（1-特异性）2）
最低距离值的点对应有最好灵敏度和特异性的对照值。从ROC曲线衍生的结果示于表7。
最终，设计模型1-4的算法。这些考虑到发明的七个生物标记的表达（见表2）。
对这些生物标记组合生成ROC曲线，并且从所得散点图计算对照值（见图2-4）。另外，模型2和3考虑到发现野生型GSTO-1在没有携带APOE4等位基因的阿尔茨海默病患者中过高表达，而wtGSTO-1在APOE4阳性阿尔茨海默病患者中表达不足。
模型1-3的结果列于表8。评价数据时，需要ROC曲线（AUC）下的高面积值和高灵敏度和特异性值，因为其指示最高精确度分析。突出“实际截留”值；这些是用于本发明方法诊断阿尔茨海默病的对照值。
如表8结果所示，模型3有最高AUC值（0.949），且是最精确分析。可能模型3给出优于模型1的结果，因为其考虑到ApoE4阳性和ApoE4阴性AD患者涉及GSTO-1基因型的差异。
模型3中，算法A只用于ApoE4阴性测试对象。为诊断ApoE4阳性对象，需要更适合ApoE4阳性测试对象的第二个算法。因此，模型3有两种算法（A和C），并且每一个只用于特定测试对象组（ApoE4阴性测试人或ApoE4阳性测试人），因此增加AD诊断的精确性。
模型4包括算法D和E（分别为ApoE4阴性和ApoE4阳性）。这些算法与A-C的差异在于其包括血小板蛋白WD重复蛋白1。使用截留值8.1所得每个蛋白的权重因子示于表9。ROC曲线（AUC）见图5。
表7
Figure BDA00001971239800171
表8
Figure BDA00001971239800181
Figure BDA00001971239800191
表9
Figure BDA00001971239800192
然而，应该注意到这些模型和算法对2D DIGE数据优化，并且用于说明但不是限制本发明。生物芯片数据的优化模型和优化算法可以不同于2DDIGE数据。模型的原理可以保持相同但是特定AD生物标记的权重很可能不同。
实施例2：选择14-3-3γ作为内部提取标准蛋白
来自24例阿尔茨海默病患者和24例性别和年龄相符对照的12.5μg血小板蛋白用1D Western印迹分析。结果示于图6，并且显示阿尔茨海默病患者血小板样品中的Mao-B信号比对照样品更加敏感，而14-3-3γ的信号强度在所有样品中相同。如图7显示，通过测量没有任何标准化的12.5pg血小板蛋白的Mao-B信号，仅能在阿尔茨海默病样品中检测到低显著性增加（P<0.01）。然而，用14-3-3γ标准化后，显著性增加到P<0.00000007，显示样品中定量蛋白的准确度用内部提取标准可大幅增加。
图8显示应用ERK2作为内部提取标准的代表性Western印迹；阿尔茨海默患者血小板的Mao-B表达信号比对照样品更强，而14-3-3γ和ERK2信号在所有血小板样品中都没有变化。
实施例3：GSTO-1中阿尔茨海默病多态性的确认
2D凝胶电泳分析显示三个GSTO-1同种型，pI值为6.19，5.87和5.64（图9）。这些同种型显示三个组的不同表达模式：AD患者，PD患者和年龄及性别相符对照。非ApoE阿尔茨海默病患者的凝胶过滤血小板样品显示pI 6.19的GSTO-1同种型显著上调（增加35%），而pI 5.87的GSTO-1同种型下调60%。
图9的结果显示GSTO-1外显子4的两个错义多态性（Ala140Asp和Glu155Δ）。pI 6.19的GSTO-1点对应于WT。pI 5.87的点代表Ala140被Asp取代的同种型（Ala140Asp）。pI 5.64的点可以涉及未知来源的翻译后修饰。pI 6.19和pI 5.87的GSTO-1点的相同表达分别对应WT同种型和包括Ala140Asp取代的同种型。pI 5.87的唯一点显示在氨基酸位点140的纯合Asp/Asp GSTO-1基因型。或者，可以在个体中观察到一个等位基因上有Glu155Δ缺失和另一个等位基因上有Ala140Asp GSTO-1基因型。仅检测到包含Asp 140的多肽，因为有Glu155Δ缺失的多肽可能不表达或快速降解。
实施例4：阿尔茨海默病和帕金森病的区分
本发明方法能用于区分阿尔茨海默病患者和帕金森病（PD）患者，并且表10显示AD样品和PD样品的比较。
图10显示阿尔茨海默病患者（AD发现组）组和帕金森病患者组的散点图。这些结果根据发明方法通过对帕金森病患者组和阿尔茨海默病患者组所得血小板样品应用模型1的算法根据而获得。发现期的阿尔茨海默病患者的计算平均值为6.92±1.25（SD）且帕金森病患者为5.00±0.74（SD）。截留值设定在5.535，其是模型1所设阿尔茨海默病发现组的测定截留值（见图2a和2b）。如所得散点图可见，两个患者组的结果之间有明显区别。
相似地，图11显示阿尔茨海默病患者组（AD发现组）和帕金森病患者组的散点图，这是通过对从两个患者组的血小板样品应用模型2获得。发现期的阿尔茨海默病患者的计算平均值为6.12±0.82（SD）且帕金森病患者为4.87±0.83（SD）。截留值设定在5.405，其是模型2所设阿尔茨海默病发现组的测定截留值（见图3a和3b）。再一次，每个患者组的散点图上点分布之间有明显区别。
图12显示阿尔茨海默病患者组（AD发现组）和帕金森病患者组的散点图，这是通过对从两个患者组的血小板样品应用模型3获得。发现期的阿尔茨海默病患者的计算平均值为6.28±0.93（SD）且帕金森病患者为5.01±0.77（SD）。截留值设定在5.535，其是模型3所设阿尔茨海默病发现组的测定截留值（见图4a和4b）。此结果显示发明方法的所有三个模型能用于区分阿尔茨海默病和帕金森病的诊断分析。
表10

Claims (19)

1.一种在患者中帮助诊断阿尔茨海默病的离体方法，包括：
（i）测定患者血小板样品中选自单胺氧化酶B，凝集因子XIIIa，总原肌球蛋白（α和β），WD重复蛋白1和载脂蛋白E4的至少4种血小板蛋白的表达水平；和
（ii）将（i）的结果与对照值作比较，
其中，结果高于对照值指示阿尔茨海默病。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述（i）还包括测定野生型GSTO-1或突变GSTO-1的表达水平。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述（i）还包括测定患者基因组中ApoE4等位基因数目。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述患者基因组中没有ApoE4等位基因，并且权利要求1所述的步骤（i）包括测定单胺氧化酶B，凝集因子XIIIa，总原肌球蛋白（α和β）和野生型GSTO-1的表达水平。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括测定WD重复蛋白1的表达水平。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述患者基因组中有一个或两个ApoE4等位基因，并且权利要求1所述的步骤（i）包括测定单胺氧化酶B，凝集因子XIIIa，总原肌球蛋白（α和β）和载脂蛋白E4的表达水平。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法还包括测定突变GSTO-1的表达水平。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法还包括测定WD重复蛋白1的表达水平。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述高于对照值的结果对应于阿尔茨海默病的阳性诊断。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述血小板蛋白表达的生物学变异通过参照一种或多种表3或表4中的蛋白表达进行标准化。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述用于将生物学变异标准化的蛋白是14-3-3蛋白γ。
12.一种或多种表3或表4中的蛋白将权利要求1-11中任一项所述诊断方法中一种或多种血小板蛋白表达水平的生物学变异标准化的应用。
13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述表3或表4中的蛋白与要定量的蛋白存在于同一血小板样品中。
14.如权利要求12或13所述的蛋白应用，其特征在于，所述选自表3或表4的蛋白是14-3-3蛋白γ。
15.一种固体支持物，所述固体支持物具有固定其上的选自单胺氧化酶B，凝集因子XIIIa，总原肌球蛋白（α和β），WD重复蛋白1和ApoE4的至少4种血小板蛋白的一种或多种配体。
16.如权利要求15所述的固体支持物，其特征在于，所述固体支持物还具有固定其上的一种或多种表3或表4中蛋白的一种或多种配体。
17.如权利要求15或16所述的固体支持物，其特征在于，所述固体支持物还具有野生型GSTO-1蛋白的一种或多种配体。
18.如权利要求15-17中任一项所述的固体支持物，其特征在于，所述固体支持物还具有突变GSTO-1蛋白的一种或多种配体。
19.如权利要求15-18中任一项所述的固体支持物，其特征在于，所述固体支持物还具有载脂蛋白E蛋白的一种或多种配体。
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