ES2940157A1 - Metodos y usos diagnosticos/pronosticos de la enfermedad de wilson basados en la determinacion de los niveles de mir-192 y/o mir-885 - Google Patents

Abstract

Métodos y usos diagnósticos/pronósticos de la enfermedad de Wilson basado en la determinación de los niveles de miR-192 y/o miR-885. La presente invención se relaciona con métodos de diagnóstico y monitorización de la evolución de la enfermedad de Wilson, y evaluación de tratamientos para la misma, basados en la determinación y comparación con valores de referencia de los niveles de miARN-885 y miARN-192. Además, la invención también se refiere a kits y usos para dichos fines.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y usos diagnósticos/pronósticos de la enfermedad de Wilson basados en la determinación de los niveles de miR-192 y/o miR-885

La presente invención se encuentra dentro del campo del diagnóstico y pronóstico clínico. En concreto, la presente invención se refiere a métodos de diagnóstico, monitorización y evaluación de tratamientos para la enfermedad de Wilson, basados en la determinación de los niveles miR-192 y/o miR-885, solos o en combinación con otros analitos, y usos de los mismos para estos fines.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La enfermedad de Wilson es un trastorno hereditario causado por mutaciones en el gen ATP7B que afecta al metabolismo del cobre, el cual se acumula en los tejidos, principalmente hígado y cerebro. La presentación clínica de esta enfermedad es muy variable, predominando la afectación hepática y neurológica. Es por ello, que es necesario en muchas ocasiones la combinación de hallazgos clínicos y determinaciones bioquímicas para establecer un diagnóstico, monitorizar y predecir su evolución, o evaluar tratamientos para dicha enfermedad. Además, dado que la enfermedad de Wilson cuenta con tratamiento específico, es importante un diagnóstico certero y temprano en los pacientes, ya que, en caso de no recibirlos a tiempo, se convierte en un trastorno con mal pronóstico.

Habitualmente para su diagnóstico se emplea la escala de Leipzig que considera signos clínicos, histopatología, bioquímica y genética (European Association For The Study Of The Liver. EASL Clinical Practice Guidelines: Wilson’s disease. J. Hepatol. 2012, 56, 671-685). Entre los métodos diagnósticos de la enfermedad de Wilson descritos en el estado del arte, se encuentra la determinación de los niveles de ceruloplasmina circulantes, una proteína encargada de transportar cobre circulante en la sangre. No obstante, debido a que los niveles ceruloplasmina pueden verse alterados en los sujetos por distintos motivos, encontrándose en pacientes neurológicos disminuidos, o en niveles normales en hasta el 50% de los casos en pacientes hepáticos, se cuestiona su valor predictivo por sí solo para el diagnóstico de la enfermedad de Wilson (Patil M, et al., H. J Clin Exp Hepatol.;3(4):321-36 (2013)).

La determinación del cobre sérico, cuyos niveles se encuentran disminuidos en la enfermedad de Wilson, y cobre no unido a ceruloplasmina (NCC, por sus siglas en inglés) son otras aproximaciones usadas en el diagnóstico de la enfermedad. Varias condiciones clínicas pueden influir en los niveles de cobre en sangre, por ejemplo, daño a los hepatocitos durante la insuficiencia hepática aguda o la lesión hepática grave. En estos casos, el cobre sérico se eleva notablemente debido a la liberación repentina de cobre del tejido hepático. Por otro lado, el cálculo de NCC, que se obtiene de la diferencia entre el cobre sérico total y el unido a ceruloplasmina, ha sido objeto de un intenso debate, y las prácticas clínicas no recomiendan el NCC en el diagnóstico de la enfermedad de Wilson (Mohr I, Weiss KH. Clin Biochem Rev.;40(2):59-77 (2019)).

Otra prueba diagnóstica habitual en el diagnóstico de esta enfermedad es la medición del cobre en orina. Sin embargo, otras condiciones clínicas como la hepatitis autoinmune, síndromes colestáticos y fallo hepático crónico o agudo presentan niveles de cobre en orina altos, pudiendo arrojar falsos positivos (Roberts EA, Schilsky ML; American Association for Study of Liver Diseases (AASLD). Hepatology;47(6):2089-111 (2008)).

La biopsia hepática es otro método empleado, pero debido a que se trata de un método invasivo, se recomienda únicamente si previamente otras pruebas diagnósticas han sido insuficientes o si se sospecha de otra patología hepática además de la enfermedad de Wilson.

Pese a los diferentes métodos de diagnóstico y pronóstico descritos en el estado del arte, muchos de ellos presentan inconvenientes relacionados con la sensibilidad, especificidad, o desventajas asociadas a los métodos invasivos en su caso.

Una aproximación alternativa en el diagnóstico y pronóstico no invasivo de las enfermedades se centra en el uso de microARNs (miARNs), ya que la desregulación de miARNs puede estar implicada en cáncer, enfermedades neurodegenerativas, cardiovasculares y hepáticas, entre otras. Así, alteraciones en los niveles de miARNs pueden servir como biomarcadores diagnósticos, pronósticos o para testar la eficacia de tratamientos.

En el estado del arte, se describen diferentes aplicaciones de miARNs en el diagnóstico y pronóstico clínico:

En M. Kweon et al., 2020, Int. J. Mol. Sci., 22(1), 239, se divulgan perfiles de miARN en las enfermedades hepáticas, así como miARNs candidatos a ser utilizados como biomarcadores para monitorizar la eficacia de tratamientos de enfermedades hepáticas basadas en terapias con células madre mesenquimales.

En A. Garcia Garcia de Paredes et al., 2020, Hepatol Commun., 5(2), 309-322, se describe la caracterización y validación de una firma de miARNs para discriminar pacientes con cirrosis descompensada, un tipo de enfermedad hepática.

En Siaj et al., 2012, Hepatol Int., 6(4), 770-777, se describe la variación de los niveles de miARN-122 en suero en un modelo de rata de enfermedad de Wilson, indicando que este análisis longitudinal de miR-122 permitiría la detección de enfermedad hepática severa en estadios tempranos y seguimiento de terapias

Debido a la presentación clínica variable que caracteriza la enfermedad de Wilson, y a la importancia de un diagnóstico certero y temprano en los pacientes, es crucial contar con diferentes métodos diagnósticos y pronósticos de la enfermedad.

Por tanto, a la vista del estado de la técnica, existe la necesidad de encontrar biomarcadores y métodos no invasivos alternativos a los ya existentes, que mejoren el diagnóstico y el pronóstico de la enfermedad de Wilson, así como la evaluación de la eficacia de los tratamientos para la misma.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Los inventores han observado que los niveles en plasma de miR-192-5p y/o miR-885-5p se encuentran elevados en pacientes con enfermedad de Wilson con respecto a los niveles de los mismos en sujetos control que no padecen dicha enfermedad, siendo esto de utilidad en el diagnóstico in vitro de la enfermedad de Wilson. Además, la determinación y comparación de los niveles de miR-192-5p y/o miR-885-5p con valores de referencia permiten predecir o monitorizar la evolución de la enfermedad de Wilson, así como evaluar la respuesta o eficacia de tratamientos de la misma.

Los inventores llegaron a esta conclusión mediante un estudio dividido en dos fases. En una primera fase, los análisis de miARNs se realizaron mediante secuenciación masiva de miARNs (miARN-seq) en un primer grupo de 20 pacientes con enfermedad de Wilson, identificándose 18 miARNs incrementados, entre ellos miR-192-5p y/o miR-885-5p, respecto a los niveles de los mismos con sujetos sanos control (Tabla 4). En una segunda fase, para validar los hallazgos obtenidos, se analizaron mediante PCR cuantitativa (qPCR, por sus siglas en inglés) los niveles en plasma de los miARNs de las muestras del primer grupo, así como de un segundo grupo independiente de 21 pacientes con enfermedad de Wilson comparados con sujetos sanos control. En ambos grupos se confirmó que los niveles de miR-192-5p y/o miR-885-5p eran más elevados en los pacientes con enfermedad de Wilson, y correlacionaban con marcadores bioquímicos de función hepática (Fig. 3 y Fig. 5).

Además, los inventores evaluaron la utilidad de miR-192-5p y/o miR-885-5p para predecir el riesgo de evolución de la enfermedad de Wilson en pacientes del primer grupo, mediante estudios de regresión logística, generándose modelos de regresión logística simple con cada miARN. Cada modelo mostró un buen rendimiento para clasificar al grupo de pacientes con factores de evolución desfavorable de la enfermedad (Fig. 4).

Así, la invención solventa problemas del estado de la técnica relacionadas con el diagnóstico y pronóstico de la enfermedad de Wilson, representando una aproximación alternativa no invasiva. En base a la determinación y comparación de los niveles miR-192-5p y/o miR-885-5p con valores de referencia, los inventores han desarrollado métodos in vitro de diagnóstico de la enfermedad de Wilson, monitorización de la evolución de la enfermedad, y de evaluación de la respuesta a tratamientos para la misma, así como kits y usos para dichos fines, que serán descritos en detalle a continuación.

Métodos de la invención

Basándose en los niveles de miR-192-5p y/o miR-885-5p en plasma de un sujeto, los inventores han desarrollado tres aplicaciones en función de dichos niveles, como son, el diagnóstico, la monitorización y la respuesta al tratamiento de la enfermedad de Wilson, dando lugar a los tres métodos de la invención.

En la presente invención se entiende por “enfermedad de Wilson” a un trastorno hereditario del metabolismo del cobre con tratamiento específico, que se caracteriza por una acumulación patológica de cobre. La enfermedad de Wilson está causada por mutaciones en el gen ATP7B, que codifica una ATPasa transmembrana transportadora de cobre, lo que provoca el depósito anómalo de cobre en el hígado, el cerebro y otros órganos. Su curso clínico puede variar en gravedad, pero la enfermedad hepática progresiva es una característica común, aunque los pacientes también pueden presentar principalmente trastornos neurológicos y síntomas psiquiátricos.

Asimismo, cabe señalar que los métodos de la invención que van a describirse a continuación, son aplicables a cualquier sujeto. En la presente invención, el término “sujeto” o “individuo”, tal como se utiliza en la presente invención, hace referencia a cualquier animal, preferiblemente un mamífero, e incluye, pero no se limita a, animales domésticos y de granja, primates, y humanos. En una realización preferida de los métodos de la invención, el sujeto es un ser humano, de cualquier sexo, edad o raza. Además, la muestra en la que se van a medir los niveles de miR-192-5p y/o miR-885-5p puede ser cualquier muestra biológica procedente o aislada del sujeto. Así, en la presente invención se entiende por “muestra” a una parte o cantidad pequeña de una cosa que se considera representativa del total y que se toma o se separa de ella para someterla a estudio, análisis o experimentación. En particular, en la presente invención el término muestra abarca muestras de origen biológico, que son aisladas del sujeto, que incluyen sin limitar a, muestras de sangre y otras muestras líquidas de origen biológico, muestras de tejidos sólidos, como muestras de biopsia o cultivos de tejidos o células derivadas de ellos y su progenie, como células en cultivo celular, sobrenadantes celulares, lisados celulares, suero, el plasma, los fluidos biológicos y las muestras de tejidos. No obstante, en una realización preferida de los métodos de la invención, la muestra biológica aislada es suero o plasma. El término “aislado/a” implica que la muestra biológica ha sido separada o extraída del resto de componentes que la acompañan de forma natural. Técnicas para obtener muestras biológicas de un individuo son ampliamente conocidas en el estado de la técnica, y cualquiera de ellas puede emplearse en la puesta en práctica de la presente invención.

Método de diagnóstico de la invención

Dicho lo anterior, en un aspecto la presente invención se refiere a un método in vitro para diagnosticar la enfermedad de Wilson en un sujeto, de aquí en adelante el ‘método de diagnóstico de la invención’, que comprende las siguientes etapas:

(a) determinar los niveles de miR-192-5p y/o miR-885-5p en una muestra biológica aislada del sujeto, y

(b) comparar dichos niveles con un valor control,

en donde unos niveles elevados de miR-192-5p y/o miR-885-5p respecto al valor control indican que el sujeto padece la enfermedad de Wilson.

El término "diagnosticar”, tal como se emplea en la presente invención, se refiere al acto de identificar una determinada enfermedad, entidad nosológica, síndrome o cualquier condición de salud-enfermedad, mediante el análisis de una serie de parámetros clínicos o síntomas característicos de dicha enfermedad, y que la distinguen de otras enfermedades con cuadros clínicos semejantes y/o de un sujeto que no padece dicha enfermedad. En la presente invención, la enfermedad a identificar es la enfermedad de Wilson, y el parámetro clínico son los niveles de miR-192-5p y/o miR-885-5p.

En una primera etapa [etapa (a)], el método de diagnóstico de la invención comprende determinar los niveles de miR-192-5p y/o miR-885-5p en una muestra biológica aislada del sujeto. Previamente a esta etapa, es posible tratar la muestra para aislar el ácido ribonucleico. Técnicas para aislar ácidos ribonucleicos son práctica de rutina en un laboratorio y ampliamente conocidas por el experto en la materia.

En la presente invención, el término "microARN (miARN)” se refiere a una clase de ARN no codificante que desempeña un importante papel en la regulación de la expresión génica. La mayoría de los miARNs se transcriben a partir de secuencias de ADN en miARNs primarios y se procesan en miARNs precursores y, finalmente, en miARNs maduros. La desregulación de los procesos en los que intervienen, puede ser causante de varias patologías, a la vez que cambios en niveles de los mismos pueden ser indicadores de determinadas condiciones y patologías. En el presente documento, se utilizan indistintamente los términos microARN, miARN o miR. Los miR cuyos niveles tiene que determinarse son el miR-192-5p y/o miR-885-5p, solos o en combinación con otros marcadores.

El miR-192-5p es un miARN que comprende, o consiste en, una secuencia de nucleótidos con una identidad de secuencia de, al menos, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% con la secuencia SEQ ID NO: 1.

SEQ ID NO: 1

CUGACCUAUGAAUUGACAGCC

La secuencia SEQ ID NO: 1 corresponde a la secuencia de miR-192-5p en homo sapiens (hsa-miR-192-5p, miRBase versión 22 accession number: MIMAT0000222). En una realización más preferida del método de la invención, el miR-192-5p comprende, o consiste en, la secuencia SEQ ID NO: 1.

El miR-885-5p es un miARN que comprende, o consiste en, una secuencia de nucleótidos con una identidad de secuencia de, al menos, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% con la secuencia SEQ ID NO: 2.

SEQ ID NO: 2

UCCAUUACACUACCCUGCCUCU

La secuencia SEQ ID NO: 2 corresponde a la secuencia de miR-885-5p de homo sapiens (hsa-miR-885-5p, miRBase versión 22 accession number: MIMAT0004947). En una realización más preferida del método de la invención, el miR-192-5p comprende, o consiste en, la secuencia SEQ ID NO: 2

En la presente invención se entiende por "identidad de secuencia” al grado de similitud entre dos secuencias de nucleótidos (o aminoácidos) obtenido mediante el alineamiento de las dos secuencias. Dependiendo del número de residuos comunes entre las secuencias alineadas, se obtendrá un grado de identidad expresado en tanto por ciento. El grado de identidad entre dos secuencias de nucleótidos (o aminoácidos) puede determinarse por métodos convencionales, por ejemplo, mediante algoritmos estándar de alineamiento de secuencias conocidos en el estado de la técnica, como por ejemplo BLAST [Altschul S.F. et al. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 1990 Oct 5; 215(3):403-10]. Los programas BLAST, por ejemplo, BLASTN, BLASTX, and TBLASTX, BLASTP and TBLASTN, son de dominio público en la página web de The National Center for Biotechonology Information (NCBI).

Como entiende un experto en la materia, el nivel de un miARN puede determinarse mediante metodologías convencionales bien conocidas en el estado de la técnica. Ejemplos de métodos para determinar los niveles de miARN incluyen, sin limitar a, inmunoensayos, por ejemplo, ELISA (por sus siglas, Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay), ensayos de biología molecular, por ejemplo, PCR cuantitativa (qPCR), métodos de secuenciación (por ejemplo, secuenciación de ARN de pequeño tamaño, miARN-seq, Next-Generation-Sequencing), matrices o microarrays de miARN, detección por NanoString nCounter, hibridación in situ de miARN, o ensayos bioquímicos, por ejemplo, ensayos colorimétricos u otros. En una realización particular del método de diagnóstico de la invención, los niveles de miARN se determinan mediante miARN-seq o qPCR.

Una vez determinados los niveles de miARN en la etapa (a), el método de diagnóstico de la invención comprende comparar dichos niveles con un valor control.

En el método de diagnóstico de la invención, el término "valor control” se refiere a los niveles miR-192-5p y/o miR-885-5p en un sujeto sano, o a la media de los niveles miR-192-5p y/o miR-885-5 en una cohorte de sujetos sanos. Métodos para determinar los niveles de miARN han sido descritos en párrafos anteriores.

Finalmente, de la comparación entre los niveles de miR-192-5p y/o miR-885-5p con dicho valor control, se puede saber si un individuo padece o no la enfermedad de Wilson. Así, unos niveles elevados de miR-192-5p y/o miR-885-5p respecto al valor control indican que el sujeto padece la enfermedad de Wilson.

En la presente invención se entiende que unos niveles son "elevados” o "mayores” o "incrementados” respecto a un valor control, cuando un valor es superior en, al menos, 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4, veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces o incluso más con respecto al valor control.

Otro de los parámetros que puede medirse en combinación con miR-192-5p y/o miR-885-5p son (i) los niveles de miR-122-5p y/o (ii) los niveles de, al menos, un analito seleccionado del grupo que consiste en alanino aminotransferasa (ALT), aspartato aminotransferasa (AST), gamma glutamil transpeptidasa (GGT), bilirrubina total (BT), triglicéridos y colesterol, que son analitos relacionados con daño hepático, u otras características fisiopatológicas que pueden darse en la enfermedad de Wilson, que contribuyen a mejorar, o tienen interés clínico en, el diagnóstico, la monitorización y la eficacia o la evaluación de la respuesta a tratamientos de la enfermedad de Wilson.

Así, en una realización preferida del método de diagnóstico de la invención, la etapa (a) comprende, además, determinar los niveles de miR-122-5p, en donde unos niveles elevados de miR-122-5p con respecto a al valor control indican que el sujeto padece la enfermedad de Wilson.

El miR-122-5p es un miARN que comprende, o consiste en, una secuencia de nucleótidos con una identidad de secuencia de, al menos, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% con la secuencia SEQ ID NO: 3.

SEQ ID NO: 3

UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG

La secuencia SEQ ID NO: 3 corresponde a la secuencia de miR-122-5p en homo sapiens (hsa-miR-122-5p, miRBase versión 22 accession number: MIMAT0000421). En una realización más preferida del método de la invención, el miR-122-5p comprende, o consiste en, la secuencia SEQ ID NO: 3.

En otra realización preferida del método de diagnóstico de la invención, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, la etapa (a) comprende, además, determinar los niveles de, al menos, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 analitos que se selecciona del grupo que consiste en alanino aminotransferasa (ALT), aspartato aminotransferasa (AST), gamma glutamil transpeptidasa (GGT), bilirrubina total (BT), triglicéridos y colesterol, en donde unos niveles elevados de dicho analito con respecto a un valor control indica que el sujeto padece la enfermedad de Wilson. Estos analitos son ampliamente conocidos en la literatura científica, así como las técnicas para medir sus niveles.

Como sabe un experto en la materia, un analito puede determinarse en una muestra mediante técnicas y métodos conocidos en el estado de la técnica, que incluyen, sin limitarse a, métodos enzimáticos, colorimetría, pruebas de anticuerpos, Western Blot, ELISA, PCR o PCR cuantitativa, cromatografía líquida-espectrometría de masas (LCMS), SELDI-TOF (por sus siglas en inglés, Surface-Enhanced Laser Desorption/ionization-Time of Flight), electroforesis en dos dimensiones, uso de anticuerpos, inmunohistoquímica, citometría de flujo, espectroscopia de masas, inmunofluorescencia, cromatografía, ensayos espectrofotométricos, espectroscopia ultravioleta (UV), espectroscopía visible, o cualquier combinación de los mismos.

En otra realización todavía más preferida de método de diagnóstico de la invención, la etapa (a) comprende determinar los niveles de miR-885-5p y ALT; miR-885-5p y triglicéridos; miR-885-5p, ALT y triglicéridos; miR-885-5p, miR-122-5p y ALT; miR-885-5p y colesterol; miR-885-5p, miR-122-5p y colesterol; miR-192-5p y BT; miR-192-5p y ALT; miR-192-5p y AST; miR-192-5p, ALT y AS; miR-192-5p, BT y ALT; miR-192-5p, BT y AST; miR-192-5p, BT, ALT y AST; miR-192-5p, miR-122-5p y ALT; miR-192-5p, miR-122-5p y AST; miR-192-5p, miR-122-5p, ALT y AST; miR-192-5p, miR-885-5p y ALT; miR-192-5p, miR-885-5p y AST; miR-192-5p, miR-885-5p, ALT y AST; miR-192-5p, miR-885-5p, miR-122-5p y ALT; miR-192-5p, miR-885-5p, miR-122-5p y AST; o miR-192-5p, miR-885-5p, miR-122-5p, ALT y AST, en donde unos niveles elevados de estos parámetros con respecto a un valor control indican que el sujeto padece la enfermedad de Wilson.

Además, debido a que la enfermedad de Wilson se caracteriza por una acumulación patológica de cobre, y que la liberación de cobre de los hepatocitos a la circulación y su acumulación en tejidos induce estrés oxidativo que activa la respuesta inflamatoria, el método de diagnóstico de la invención puede comprender la determinación de otros analitos marcadores de estrés oxidativo e inflamación, por ejemplo, marcadores de peroxidación de lípidos como el malondialdehído (MDA), o marcadores de excitotoxicidad como el glutamato, y elevación de citoquinas (IL6, IL8, IL10 y TNF-a).

Así, en otra realización preferida del método de diagnóstico de la invención, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas del método de diagnóstico de la invención, la etapa (a) comprende, además, determinar los niveles de, al menos, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 analitos seleccionados del grupo que consiste en MDA, glutamato, IL6, IL8, IL10 y TNF-a, en donde unos niveles elevados de estos analitos con respecto a un valor control indican que el sujeto padece la enfermedad de Wilson.

Método de monitorización de la invención

Otro de los métodos de la invención basados en los niveles de miR-192-5p y/o miR-885-5p es un método para monitorizar la enfermedad de Wilson. Así, otro aspecto de la presente invención se refiere a un método in vitro para monitorizar la evolución de la enfermedad de Wilson en un sujeto, de aquí en adelante el "método de monitorización de la invención”, que comprende las siguientes etapas:

(a) determinar los niveles de miR-192-5p y/o miR-885-5p en una muestra biológica aislada del sujeto en al menos dos momentos distintos en el tiempo, y

(b) comparar entre sí los niveles de miR-192-5p y/o miR-885-5p determinados en la etapa (a),

en donde un incremento en los niveles de miR-192-5p y/o miR-885-5p a lo largo del tiempo indican que la enfermedad de Wilson en el sujeto evoluciona negativamente.

Los términos empleados para definir el presente aspecto de la invención han sido explicados en el aspecto inventivo anterior, y tanto ellos como sus realizaciones preferidas, son aplicables al presente aspecto de la invención.

En la presente invención, la frase "monitorizar la evolución de la enfermedad de Wilson” se refiere a predecir y/o evaluar el curso de dicha enfermedad en un sujeto. Monitorizar la evolución de una enfermedad, en la presente invención la enfermedad de Wilson, puede facilitar decisiones clínicas, como seleccionar un tratamiento adecuado, definir grupos de pacientes según el riesgo de progresión o regresión de la enfermedad de interés, o mejorar el diseño y análisis de estudios y ensayos clínicos mediante la estratificación de los pacientes. En la presente invención, la evolución o curso de la enfermedad, puede monitorizarse mediante la determinación y comparación de los niveles de miR-192-5p y/o miR-885-5p en dos momentos distintos del tiempo.

La etapa (a) del método de monitorización de la invención comprende determinar los niveles de miR-192-5p y/o miR-885-5p en una muestra biológica aislada del sujeto en dos momentos distintos en el tiempo. Los términos "miR-192-5p”, "miR-885-5p” y técnicas para determinar los niveles de miARNs han sido definidos/explicados para el método de diagnóstico de la invención y son aplicables al presente método.

En la presente invención, la expresión "momentos distintos en el tiempo” se entiende como momentos separados de forma suficiente a nivel temporal, es decir, el lapso de tiempo mínimo entre los dos momentos, que permiten concluir cómo evoluciona la enfermedad a lo largo del tiempo Preferiblemente, en la presente invención se considera que el lapso de tiempo entre los dos momentos suficientes para concluir cómo evoluciona la enfermedad es de, al menos, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 semanas.

Una vez determinados los niveles de los miARNs, éstos se comparan entre sí para ver si el nivel ha disminuido o se ha incrementado a lo largo del tiempo (etapa (b) del método de monitorización de la invención). De este modo, un incremento en los niveles de miR-192-5p y/o miR-885-5p a lo largo del tiempo indican que la enfermedad de Wilson en el sujeto evoluciona negativamente.

Tal y como se utiliza aquí la frase "un incremento en los niveles de 192-5p y/o miR-885-5p a lo largo del tiempo”, se refiere a que los niveles de miR-192-5p y/o miR-885-5p determinados se encuentran elevados respecto a los niveles del mismo determinados en un momento anterior.

En la presente invención, se considera que la enfermedad de Wilson “evoluciona negativamente” a que el sujeto presenta un empeoramiento en su condición de salud debido, por ejemplo, pero sin limitar a, una progresión del daño hepático, y/o un mayor riesgo de progresión de la enfermedad de Wilson. En este método de monitorización de la invención, el sujeto evoluciona negativamente cuando los niveles de miR-192-5p y/o miR-885-5p se incrementan a lo largo del tiempo.

En una realización preferida del método de monitorización de la invención, la etapa (a) comprende, además, determinar los niveles de miR-122-5p, en donde un incremento en los niveles de miR-122-5p a lo largo del tiempo indica que la enfermedad de Wilson en el sujeto evoluciona negativamente.

En otra realización preferida del método de monitorización de la invención, solo o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, la etapa (a) comprende, además, determinar los niveles de, al menos, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 analitos que se selecciona del grupo que consiste en ALT, AST, GGT, BT, triglicéridos y colesterol, en donde un incremento en los niveles de dicho analito a lo largo del tiempo indica que la enfermedad de Wilson en el sujeto evoluciona negativamente. Técnicas para medir analitos han sido descritos en párrafos anteriores.

En otra realización todavía más preferida de método de monitorización de la invención, la etapa (a) comprende determinar los niveles de miR-885-5p y ALT; miR-885-5p y triglicéridos; miR-885-5p, ALT y triglicéridos; miR-885-5p, miR-122-5p y ALT; miR-885-5p y colesterol; miR-885-5p, miR-122-5p y colesterol; miR-192-5p y BT; miR-192-5p y ALT; miR-192-5p y AST; miR-192-5p, ALT y AS; miR-192-5p, BT y ALT; miR-192-5p, BT y AST; miR-192-5p, BT, ALT y AST; miR-192-5p, miR-122-5p y ALT; miR-192-5p, miR-122-5p y AST; miR-192-5p, miR-122-5p, ALT y AST; miR-192-5p, miR-885-5p y ALT; miR-192-5p, miR-885-5p y AST; miR-192-5p, miR-885-5p, ALT y AST; miR-192-5p, miR-885-5p, miR-122-5p y ALT; miR-192-5p, miR-885-5p, miR-122-5p y AST; o miR-192-5p, miR-885-5p, miR-122-5p, ALT y AST, en donde unos niveles elevados de estos parámetros a lo largo del tiempo indica que la enfermedad de Wilson en el sujeto evoluciona negativamente.

En otra realización preferida del método de monitorización de la invención, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas del método de monitorización de la invención, la etapa (a) comprende, además, determinar los niveles de, al menos, uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis analitos seleccionados del grupo que consiste en MDA, glutamato, IL6, IL8, IL10 y TNF-a, en donde unos niveles elevados de estos analitos a lo largo del tiempo indica que la enfermedad de Wilson en el sujeto evoluciona negativamente.

Método de evaluación del tratamiento de la invención

El tercer método de la invención se refiere al empleo de los niveles de miR-192-5p y/o miR-885-5p para evaluar la eficacia y/o respuesta al tratamiento de la enfermedad de Wilson. Así, en otro aspecto, la presente invención se refiere a un método in vitro para evaluar la eficacia y/o respuesta de un sujeto a un tratamiento para la enfermedad de Wilson, de aquí en adelante el "método de evaluación del tratamiento de la invención”, que comprende las siguientes etapas:

(a) determinar los niveles de miR-192-5p y/o miR-885-5p en una muestra biológica aislada del sujeto antes y después del tratamiento, y

(b) comparar los niveles de miR-192-5p y/o miR-885-5p determinados antes del tratamiento con los obtenidos después del mismo,

en donde unos niveles de miR-192-5p y/o miR-885-5p después del tratamiento menores que antes del mismo, indican que el tratamiento es eficaz y/o que el sujeto responde de forma positiva al tratamiento.

Los términos empleados para definir el presente aspecto inventivo han sido explicados en aspecto inventivos anteriores, y tanto ellos como sus realizaciones preferidas, son aplicables al presente aspecto inventivo.

La frase "evaluar la eficacia y/o respuesta a un tratamiento” se refiere en la presente invención a analizar la capacidad de un tratamiento, en particular para la enfermedad de Wilson, de producir un resultado o efecto deseado en un sujeto, y/o comprobar si el tratamiento provoca un cambio en la condición de salud o patología de la enfermedad de Wilson en el sujeto.

El método de evaluación del tratamiento de la invención comprende una primera etapa dirigida a determinar los niveles de miR-192-5p y/o miR-885-5p en una muestra biológica aislada del sujeto antes y después del tratamiento aplicado al sujeto y, una vez determinados dichos niveles, se comparan entre sí en una segunda etapa. De esta manera, si los niveles de miR-192-5p y/o miR-885-5p después del tratamiento son menores que antes del mismo, entonces el tratamiento es eficaz y/o el sujeto responde de forma positiva al tratamiento.

En la presente invención, se entiende que un sujeto "responde de forma positiva al tratamiento”, a que el tratamiento ha tenido un efecto en el sujeto de mejora en su condición de salud o patología de la enfermedad de Wilson.

Los profesionales de la salud tratan la enfermedad de Wilson tomando medidas para mejorar las causas o los síntomas del trastorno en un paciente. El tratamiento puede consistir en terapias farmacológicas o no farmacológicas. Las terapias basadas en fármacos pueden incluir: la selección y administración de uno o más fármacos al paciente, el ajuste de la dosis de un fármaco, el ajuste del programa de dosificación de un fármaco y el ajuste de la duración de la terapia con un fármaco. Los profesionales sanitarios pueden seleccionar los fármacos, ajustar la dosis, el programa de dosificación de un fármaco y la duración de la terapia en función de la naturaleza del fármaco, la naturaleza de los síntomas del paciente, la respuesta del paciente al tratamiento anterior y la respuesta del paciente al fármaco.

Los tratamientos no farmacológicos pueden incluir, cirugía u otro tipo de intervenciones, por ejemplo, sin limitar a, trasplante de tejidos y/o órganos.

Un experto en la materia puede identificar un tratamiento apropiado basándose en la literatura médica. Ejemplos de tratamientos para la enfermedad de Wilson, incluyen, sin limitar a, quelantes de cobre como la D-penicilamina (Cuprimine, Depen) o la trientina (Syprine), acetato de zinc (Galzin), tetratiomolibdato de amonio (TTMo), tetratiomolibdato de bis-colina (Bis-colinaTTM) o trasplante de hígado.

En una realización preferida del método de evaluación del tratamiento de la invención, la etapa (a) comprende, además, determinar los niveles de miR-122-5p, en donde unos niveles de miR-122-5p después del tratamiento menores que antes del mismo, indican que el tratamiento es eficaz y/o que el sujeto responde de forma positiva al tratamiento. En otra realización preferida del método de evaluación del tratamiento de la invención, solo o en combinación con el resto de realizaciones preferidas, la etapa (a) comprende, además, determinar los niveles de, al menos, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 analitos que se selecciona del grupo que consiste en ALT, AST, GGT, BT, triglicéridos y colesterol, en donde unos niveles del analito después del tratamiento menores que antes del mismo, indican que el tratamiento es eficaz y/o que el sujeto responde de forma positiva al tratamiento. Técnicas para medir analitos han sido descritos en párrafos anteriores.

En otra realización todavía más preferida de método de evaluación del tratamiento de la invención, la etapa (a) comprende determinar los niveles de miR-885-5p y ALT; miR-885-5p y triglicéridos; miR-885-5p, ALT y triglicéridos; miR-885-5p, miR-122-5p y ALT; miR-885-5p y colesterol; miR-885-5p, miR-122-5p y colesterol; miR-192-5p y BT; miR-192-5p y ALT; miR-192-5p y AST; miR-192-5p, ALT y AS; miR-192-5p, BT y ALT; miR-192-5p, BT y AST; miR-192-5p, BT, ALT y AST; miR-192-5p, miR-122-5p y ALT; miR-192-5p, miR-122-5p y AST; miR-192-5p, miR-122-5p, ALT y AST; miR-192-5p, miR-885-5p y ALT; miR-192-5p, miR-885-5p y AST; miR-192-5p, miR-885-5p, ALT y AST; miR-192-5p, miR-885-5p, miR-122-5p y ALT; miR-192-5p, miR-885-5p, miR-122-5p y AST; o miR-192-5p, miR-885-5p, miR-122-5p, ALT y AST, en donde unos niveles después del tratamiento menores que antes del mismo, indican que el tratamiento es eficaz y/o que el sujeto responde de forma positiva al tratamiento.

En otra realización preferida del método de evaluación del tratamiento de la invención, sola o en combinación con el resto de realizaciones preferidas del método de evaluación del tratamiento de la invención, la etapa (a) comprende, además, determinar los niveles de, al menos, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 analitos seleccionados del grupo que consiste en MDA, glutamato, IL6, IL8, IL10 y TNF-a, en donde unos niveles del analito después del tratamiento menores que antes del mismo, indican que el tratamiento es eficaz y/o que el sujeto responde de forma positiva al tratamiento. Técnicas para medir analitos han sido descritas en párrafos anteriores

Usos de la invención

Tal como se ha explicado al principio de la presente descripción, los niveles de miR-192-5p y/o miR-885-5p son útiles para el diagnóstico, monitorización y evaluación de la eficacia y/o de la respuesta al tratamiento in vitro de la enfermedad de Wilson. Por lo tanto, en la presente invención, también se contemplan como aspectos inventivos los usos de dichos miRs.

Uso diagnóstico de la invención

Así, otro aspecto de la presente invención se relaciona con el uso de los niveles de miR-192-5p y/o miR-885-5p para diagnosticar in vitro la enfermedad de Wilson en un sujeto, de aquí en adelante el "uso diagnóstico de la invención”, en donde unos niveles elevados respecto al valor control indican que el sujeto padece la enfermedad de Wilson. Los términos "diagnosticar” , "miR-192-5p”, "miR-885-5p”, "enfermedad de Wilson”, "sujeto” y "valor control” han sido definidos y explicado en párrafos anteriores y son aplicables al presente aspecto inventivo, así como sus realizaciones preferidas.

Al igual que en el método de diagnóstico de la invención, el uso diagnóstico de la invención se basa en la determinación de los niveles de miR-192-5p y/o miR-885-5p, pero puede comprender, adicionalmente, la determinación de los niveles de miR-122-5p, y/o la determinación de los niveles de, al menos, un analito seleccionado del grupo que consiste en ALT, AST, GGT, BT, triglicéridos y colesterol.

Por lo tanto, en una realización preferida, el uso diagnóstico de la invención comprende, además, el uso de los niveles de miR-122-5p, en donde unos niveles de miR-122-5p elevados respecto a un valor control indican que el sujeto padece la enfermedad de Wilson. El término "miR-122-5p” ha sido definido en párrafos anteriores.

En otra realización preferida, sola o en combinación con las anteriores, el uso diagnóstico de la invención comprende, además, el uso de los niveles de, al menos, un analito, más preferiblemente, 2, 3, 4, 5 o 6 analitos, que se selecciona del grupo que consiste en ALT, AST, GGT, BT, triglicéridos y colesterol, en donde unos niveles elevados del mismo respecto a un valor control indican que el sujeto padece la enfermedad de Wilson.

El uso diagnóstico de la invención también contempla la combinación de los miRs con los analitos como parámetros para diagnosticar la enfermedad de Wilson. Así, en otra realización todavía más preferida, el uso diagnóstico de la invención comprende, además, el uso de los niveles de miR-885-5p y ALT; miR-885-5p y triglicéridos; miR-885-5p, ALT y triglicéridos; miR-885-5p, miR-122-5p y ALT; miR-885-5p y colesterol; miR-885-5p, miR-122-5p y colesterol; miR-192-5p y BT; miR-192-5p y ALT; miR-192-5p y AST; miR-192-5p, ALT y AS; miR-192-5p, BT y ALT; miR-192-5p, BT y AST; miR-192-5p, BT, ALT y AST; miR-192-5p, miR-122-5p y ALT; miR-192-5p, miR-122-5p y AST; miR-192-5p, miR-122-5p, ALT y AST; miR-192-5p, miR-885-5p y ALT; miR-192-5p, miR-885-5p y AST; miR-192-5p, miR-885-5p, ALT y AST; miR-192-5p, miR-885-5p, miR-122-5p y ALT; miR-192-5p, miR-885-5p, miR-122-5p y AST; o miR-192-5p, miR-885-5p, miR-122-5p, ALT y AST, en donde unos niveles elevados de estos parámetros con respecto a un valor control indican que el sujeto padece la enfermedad de Wilson.

En otra realización preferida, sola o en combinación con las realizaciones preferidas anteriores, el uso diagnóstico de la invención comprende, además, determinar los niveles de, al menos, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 analitos seleccionados del grupo que consiste en MDA, glutamato, IL6, IL8, IL10 y TNF-a, en donde unos niveles elevados del mismo respecto a un valor control indican que el sujeto padece la enfermedad de Wilson.

Uso de monitorización de la invención

Otro aspecto de la presente invención se relaciona con el uso in vitro de los niveles de miR-192-5p y/o miR-885-5p para monitorizar la evolución de la enfermedad de Wilson en un sujeto, de aquí en adelante el "uso de monitorización de la invención”, en donde un incremento en los niveles de miR-192-5p y/o miR-885-5p a lo largo del tiempo indica que la enfermedad de Wilson en el sujeto evoluciona negativamente.

Los términos “monitorizar”, “miR-192-5p”, “miR-885-5p”, “enfermedad de Wilson”, "sujeto” y “evolución negativa” han sido definidos y explicado en párrafos anteriores y son aplicables al presente aspecto inventivo, así como sus realizaciones preferidas.

En una realización preferida, el uso de monitorización de la invención comprende, además, el uso de los niveles de miR-122-5p, en donde un incremento en los niveles de miR-122-5p a lo largo del tiempo indica que la enfermedad de Wilson en el sujeto evoluciona negativamente.

En otra realización preferida, sola o en combinación con las realizaciones preferidas anteriores, el uso de monitorización de la invención comprende, además, el uso de los niveles de, al menos, un analito, preferiblemente 2, 3, 4, 5, o 6 analitos, que se selecciona del grupo que consiste en ALT, AST, GGT, BT, triglicéridos y colesterol, en donde un incremento en los niveles de dicho analito a lo largo del tiempo indica que la enfermedad de Wilson en el sujeto evoluciona negativamente.

El uso de monitorización de la invención puede comprender la combinación de los miRs con los analitos como parámetros para monitorizar la evolución la enfermedad de Wilson en un sujeto. Así, en otra realización todavía más preferida, el uso de monitorización de la invención comprende, además, el uso de los niveles de miR-885-5p y ALT; miR-885-5p y triglicéridos; miR-885-5p, ALT y triglicéridos; miR-885-5p, miR-122-5p y ALT; miR-885-5p y colesterol; miR-885-5p, miR-122-5p y colesterol; miR-192-5p y BT; miR-192-5p y ALT; miR-192-5p y AST; miR-192-5p, ALT y AS; miR-192-5p, BT y ALT; miR-192-5p, BT y AST; miR-192-5p, BT, ALT y AST; miR-192-5p, miR-122-5p y ALT; miR-192-5p, miR-122-5p y AST; miR-192-5p, miR-122-5p, ALT y AST; miR-192-5p, miR-885-5p y ALT; miR-192-5p, miR-885-5p y AST; miR-192-5p, miR-885-5p, ALT y AST; miR-192-5p, miR-885-5p, miR-122-5p y ALT; miR-192-5p, miR-885-5p, miR-122-5p y AST; o miR-192-5p, miR-885-5p, miR-122-5p, ALT y AST, en donde un incremento en los niveles de dichos parámetros a lo largo del tiempo indica que la enfermedad de Wilson en el sujeto evoluciona negativamente.

En otra realización preferida, sola o en combinación con las realizaciones preferidas anteriores, el uso de monitorización de la invención comprende, además, determinar los niveles de, al menos, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 analitos seleccionados del grupo que consiste en MDA, glutamato, IL6, IL8, IL10 y TNF-a en donde un incremento en los niveles de dicho analito a lo largo del tiempo indica que la enfermedad de Wilson en el sujeto evoluciona negativamente.

Uso de evaluación del tratamiento de la invención

Otro aspecto de la presente invención se relaciona con el uso de los niveles de miR-192-5p y/o miR-885-5p para evaluar in vitro la eficacia y/o respuesta de un sujeto a un tratamiento de la enfermedad de Wilson, de aquí en adelante el "uso de evaluación del tratamiento de la invención”, en donde unos niveles de miR-192-5p y/o miR-885-5p después del tratamiento menores que antes del mismo, indican que el tratamiento es eficaz y/o que el sujeto responde de forma positiva al tratamiento.

Los términos y expresiones "sujeto”, "enfermedad de Wilson”, "miR-192-5p”, "miR-885-5p” y "evaluar la eficacia y/o respuesta a un tratamiento” han sido definidos en otros aspectos de la presente invención y son aplicables al uso de evaluación del tratamiento de la invención, así como sus realizaciones preferidas. Asimismo, el tratamiento empleado en la enfermedad de Wilson también ha sido definido en párrafos anteriores y es aplicable al presente aspecto.

En una realización preferida, el uso de evaluación del tratamiento de la invención comprende, además, el uso de los niveles de miR-122-5p, en donde unos niveles de miR-122-5p después del tratamiento menores que antes del mismo, indican que el tratamiento es eficaz y/o que el sujeto responde de forma positiva al tratamiento.

En otra realización preferida, sola o en combinación con realizaciones preferidas anteriores, el uso de evaluación del tratamiento de la invención comprende, además, el uso de los niveles de, al menos, un analito, preferiblemente 2, 3, 4, 5, o 6 analitos, que se selecciona del grupo que consiste en ALT, AST, GGT, BT, triglicéridos y colesterol, en donde unos niveles de dicho analito después del tratamiento menores que antes del mismo, indican que el tratamiento es eficaz y/o que el sujeto responde de forma positiva al tratamiento.

Por otro lado, al igual que en los usos de la invención anteriores, en el presente aspecto inventivo también se contempla la combinación de los miRs con los analitos para evaluar in vitro la eficacia y/o respuesta de un sujeto a un tratamiento de la enfermedad de Wilson. Así, en una realización todavía más preferida, el uso de evaluación del tratamiento de la invención comprende, además, el uso de los niveles de miR-885-5p y ALT; miR-885-5p y triglicéridos; miR-885-5p, ALT y triglicéridos; miR-885-5p, miR-122-5p y ALT; miR-885-5p y colesterol; miR-885-5p, miR-122-5p y colesterol; miR-192-5p y BT; miR-192-5p y ALT; miR-192-5p y AST; miR-192-5p, ALT y AS; miR-192-5p, BT y ALT; miR-192-5p, BT y AST; miR-192-5p, BT, ALT y AST; miR-192-5p, miR-122-5p y ALT; miR-192-5p, miR-122-5p y AST; miR-192-5p, miR-122-5p, ALT y AST; miR-192-5p, miR-885-5p y ALT; miR-192-5p, miR-885-5p y AST; miR-192-5p, miR-885-5p, ALT y AST; miR-192-5p, miR-885-5p, miR-122-5p y ALT; miR-192-5p, miR-885-5p, miR-122-5p y AST; o miR-192-5p, miR-885-5p, miR-122-5p, ALT y AST, en donde unos niveles de dichos parámetros después del tratamiento menores que antes del mismo, indican que el tratamiento es eficaz y/o que el sujeto responde de forma positiva al tratamiento.

En otra realización preferida, sola o en combinación con las realizaciones preferidas anteriores, el uso de evaluación del tratamiento de la invención comprende, además, determinar los niveles de, al menos, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 analitos seleccionados del grupo que consiste en MDA, glutamato, IL6, IL8, IL10 y TNF-a en donde unos niveles de dicho analito después del tratamiento menores que antes del mismo, indican que el tratamiento es eficaz y/o que el sujeto responde de forma positiva al tratamiento.

Kit de la invención y sus usos

La puesta en práctica de los usos y los métodos de la invención se basan en la determinación de los niveles de miR192-5p y/o miR-885-5p en muestras biológicas aisladas de un sujeto. Los medios empleados para esta determinación de los niveles de miR192-5p y/o miR-885-5p pueden estar formando parte de un kit.

Así, otro aspecto de la presente invención se refiere a un kit, de ahora en adelante el "kit de la invención”, que comprende medios para determinar in vitro los niveles de miR192-5p y/o miR-885-5p.

En una realización preferida del kit de la invención, los medios para determinar in vitro los niveles de miR-192-5p y/o miR-885-5p comprenden los reactivos necesarios para llevar a cabo la técnica qPCR. Preferiblemente, los medios del kit de la invención comprenden cebadores y sondas, más preferiblemente, los medios comprenden sondas que detectan de forma específica miR-192-5p, y/o miR-885-5p.

En una realización aún más preferida del kit de la invención, las sondas son:

SEQ ID NO: 4

CTGACCTAT GAATT GACAGCC

La SEQ ID NO: 4 corresponde a la secuencia de la sonda que detecta de forma específica el miR-192-5p.

SEQ ID NO: 5

TCCATTACACTACCCTGCCTCT

La SEQ ID NO: 5 corresponde a la secuencia de la sonda que detecta de forma específica el miR-885-5p.

Como sabe un experto en la materia, los niveles de miARN pueden determinarse mediante técnicas y métodos conocidos en el estado de la técnica, tal y como se ha explicado en aspectos inventivos anteriores, y tanto ellas como sus realizaciones preferidas, son aplicables al kit de la invención.

Además, como entiende un experto en la materia, el kit puede comprender otros componentes útiles en la puesta en práctica de la presente invención, tales como, soluciones tamponadoras, vehículos de entrega, soportes del material, componentes de controles positivos y/o negativos, etc. Además de los componentes mencionados, los kits podrán incluir también instrucciones para practicar el objeto de la invención. Estas instrucciones pueden estar presentes en los kits mencionados en una variedad de formas, uno o más de los cuales pueden estar presentes en el kit. Una forma en la que estas instrucciones pueden estar presentes es como información impresa en un medio o sustrato adecuado, p. ej., una hoja o hojas de papel en las que se imprime la información, en el embalaje del kit, en un inserto de paquete, etc. Otro medio sería un medio legible por ordenador, por ejemplo, un CD, un USB, etc., en el que se haya registrado la información. Otro medio que puede estar presente es una dirección de sitio web que puede utilizarse a través de Internet para acceder a la información en un sitio remoto. Cualquier medio conveniente puede estar presente en los kits.

Por otro lado, el kit de la invención puede comprender además medios para determinar in vitro los niveles de miR-122-5p, que también se encuentran elevados en pacientes con enfermedad de Wilson respecto a valores control. Así, en una realización preferida, sola o en combinación con las realizaciones preferidas anteriores, el kit de la invención además comprende medios para determinar in vitro los niveles de miR-122-5p. Preferiblemente, los medios para determinar in vitro los niveles de miR-122-5p comprenden los reactivos necesarios para llevar a cabo la técnica qPCR. Preferiblemente, los medios comprenden cebadores y sondas. Más preferiblemente, los medios comprenden cebadores y sondas que detectan de forma específica miR-122-5p.

En una realización aún más preferida del kit de la invención, la sonda es:

SEQ ID NO: 6

TGGAGTGTGACAATGGTGTTTG

La SEQ ID NO: 6 corresponde a la secuencia de la sonda que detecta de forma específica el miR-122-5p.

Adicionalmente, el kit de la invención puede comprender medios para determinar in vitro los niveles de analitos relacionados con daño hepático, u otra característica fisiopatológica de la enfermedad de Wilson, que contribuyen a mejorar, o tienen interés clínico en, el diagnóstico, monitorización y eficacia o evaluación de la respuesta a tratamientos de enfermedad de Wilson.

Así, en una realización preferida, sola o en combinación con las realizaciones preferidas anteriores, el kit de la invención además comprende medios para determinar in vitro los niveles de, al menos, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 analitos, seleccionado del grupo que consiste en ALT, AST, GGT, BT, triglicéridos y colesterol.

Los niveles de analitos pueden ser determinados in vitro mediante metodologías conocidas en el estado de la técnica. Ejemplos de técnicas y métodos para medir los niveles de analito en una muestra, incluyen, sin limitar a métodos enzimáticos, colorimetría, pruebas de anticuerpos, Western Blot, ELISA, PCR o PCR cuantitativa, cromatografía líquida-espectrometría de masas (LCMS), SELDI-TOF (por sus siglas en inglés, Surface-EnhancedLaserDesorption/Ionization -Time Of Flighf), electroforesis en dos dimensiones, uso de anticuerpos, inmunohistoquímica, citometría de flujo, espectroscopía de masas, inmunofluorescencia, cromatografía, ensayos espectrofotométricos, espectroscopía ultravioleta (UV), espectroscopía visible, o cualquier combinación de los mismos.

Así, en una realización preferida del kit de la invención, sola o en combinación con las realizaciones preferidas anteriores, los medios para determinar in vitro los niveles del analito comprenden los reactivos necesarios para llevar a cabo las técnicas seleccionadas de la lista que consiste en: métodos enzimáticos, pruebas de anticuerpos, Western Blot, ELISA, PCR o PCR cuantitativa, cromatografía líquida-espectrometría de masas (LCMS), SELDI-TOF (por sus siglas en inglés Surface-Enhanced Laser Desorption/Ionization-Time Of Flight), electroforesis en dos dimensiones, inmunohistoquímica, citometría de flujo, espectroscopía de masas, inmunofluorescencia, cromatografía, ensayos espectrofotométricos, espectroscopía ultravioleta (UV), espectroscopía visible, y cualquiera de sus combinaciones.

El kit de la invención, que comprende medios para la determinación de niveles miR-192-5p y/o miR-885-5p, y que además puede comprender medios para la determinación de otros miARNs, en particular miR-122-5p, y/o medios para la determinación de otros analitos, tiene utilidad en el diagnóstico, monitorización y eficacia, y/o evaluación de la respuesta a tratamientos in vitro de enfermedad de Wilson, y puede emplearse en cualquiera de los métodos de la invención que han sido descritos previamente.

Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con el uso del kit de la invención en cualquiera de los métodos de la invención.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso del kit de la invención para diagnosticar in vitro la enfermedad de Wilson en un sujeto.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso del kit de la invención para monitorizar in vitro evolución de la enfermedad de Wilson en un sujeto.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso del kit de la invención para evaluar in vitro la eficacia y/o respuesta de un sujeto a un tratamiento de la enfermedad de Wilson.

Los términos empleados para definir el kit y usos del kit de la invención han sido explicados para los usos de la invención, y tanto ellos como sus realizaciones preferidas son aplicables a los diferentes usos del kit de la invención. Asimismo, los términos "sujeto” y "muestra” han sido definidos en otros aspectos de la presente invención y son aplicables al kit de la invención y sus usos. Asimismo, las realizaciones preferidas de dichos términos también son aplicables al kit de la invención y sus usos. Así, en una realización preferida el sujeto es ser humano. En otra realización preferida, la muestra biológica aislada es de suero o plasma.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Fig. 1. Control del procesamiento de lecturas obtenidas mediante miARN-seq en las 40 muestras de la primera cohorte de investigación. A) Distribución de lecturas brutas y tras quitar adaptadores y seleccionar por tamaño. B) Distribución de lecturas de tamaño entre 16-28 pb alineadas frente a las regiones 5p y 3p de miARNs precursores (hairpin) anotados en la base de datos miRBase versión 22. Los diagramas de cajas representan el rango intercuartílico del número (N) de lecturas de las muestras.

Fig. 2. Concordancia de miARNs maduros detectados en muestras de plasma de pacientes entre las cuatro estrategias de análisis de representación diferencial.

Fig. 3. Validación del perfil de miARNs circulantes en plasma mediante PCR cuantitativa (qPCR) en muestras de la primera cohorte de investigación. A) Análisis comparativo entre grupos de los niveles en plasma de miR-122-5p, miR-192-5p, miR-885-5p, miR-485-3p y miR-340-3p. Para cada miARN, se representa el rango intercuartílico del log² de la expresión relativa (2-AACt) de las muestras de cada grupo. B) Análisis comparativo de los niveles de expresión relativa de los cinco miARNs mostrados en el apartado A) entre mujeres y hombres del grupo de pacientes. C) Matriz de correlación entre parámetros bioquímicos, edad y niveles de expresión de los cinco miARNs mostrados en el apartado A) en el grupo de pacientes. En cada casilla, se indica el valor del coeficiente rho de Spearman (Rs) para cada pareja de variables. Las casillas sombreadas indican correlación significativa (p valor<0,05). ****P valor <0,0001;**P valor <0,01; *P valor <0,05; ns: no significativo; FA: fosfatasa alcalina; BT: bilirrubina total; AST: aspartato aminotransferasa; ALT: alanina aminotransferasa; GGT: gammaglutamil transferasa.

Fig. 4. Evaluación del rendimiento de los modelos de regresión logística simple para predecir el riesgo de progresión hepática. Para cada modelo, se muestra el análisis comparativo de los niveles de expresión relativa del miARN utilizado como predictor entre pacientes según si presentan o no factores de riesgo (izquierda) y el análisis de la curva Receiver Operating Characterístic (por sus siglas en inglés ROC, característica operativa del receptor), en el que se indica la probabilidad óptima para clasificar a los pacientes, con su sensibilidad y especificidad asociadas (derecha). Intervalos de confianza del AUC: 60,40-100 % para miR-122-5p, 56,90-100 % para miR-192-5p y 52,10-100 % para miR-885-5p. **P valor <0,01; *P valor <0,05; VP: verdaderos positivos; FP: falsos positivos; AUC: Area under the curve (área bajo la curva).

Fig. 5. Validación del perfil de miARNs circulantes en plasma mediante PCR cuantitativa (qPCR) en muestras de la segunda cohorte de validación. A) Análisis comparativo entre grupos de los niveles en plasma de miR-122-5p, miR-192-5p, miR-885-5p, miR-485-3p y miR-340-3p. Para cada miARN, se representa el rango intercuartílico del log² de la expresión relativa (2-AACt) de las muestras de cada grupo. B) Análisis comparativo de los niveles de expresión relativa de los cinco miARNs mostrados en el apartado A) entre mujeres y hombres del grupo de pacientes. C) Matriz de correlación entre parámetros bioquímicos, edad y niveles de expresión de los cinco miARNs mostrados en el apartado A) en el grupo de pacientes. En cada casilla, se indica el valor del coeficiente rho de Spearman (Rs) para cada pareja de variables. Las casillas sombreadas indican correlación significativa (p valor <0,05). ****^p valor <0,0001;***P valor <0,001; ns: no significativo; FA: fosfatasa alcalina; BT: bilirrubina total; AST: aspartato aminotransferasa; ALT: alanina aminotransferasa; GGT: gamma-glutamil transferasa.

EJEMPLOS

A continuación, se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la efectividad del producto de la invención.

1. Materiales y métodos

1.1. Población de estudio

En la primera fase del estudio, se realizó un cribado de miARNs circulantes en plasma mediante secuenciación masiva para identificar aquellos que pudieran estar diferencialmente expresados en pacientes con enfermedad de Wilson (EW). Con este fin, se reclutó una primera cohorte de investigación, en la que se incluyeron muestras de un grupo de 20 pacientes procedente del Hospital U. i P. La Fe de Valencia y del Hospital Gral. U. d’Elx con diagnóstico genético de EW y en terapia con quelantes. No se incluyeron pacientes con trasplante de hígado.

En la segunda fase del estudio, con el fin de validar mediante qPCR el resultado de los estudios de miARNs circulantes en plasma de la primera fase, se reclutó una segunda cohorte de validación. Siguiendo los mismos criterios de inclusión que para la primera cohorte, se incluyeron muestras de un grupo de 21 pacientes con EW, que pertenecen a una amplia serie clínica publicada por García-Villarreal et al. J Gastroenterol., 56(1):78-89, (2021).

En el reclutamiento de muestras de pacientes de ambas cohortes, se emplearon tubos BD Vacutainer® con EDTA-K2 (6 mL). En primer lugar, tras la venopunción se dejó reposar el tubo en posición vertical al menos 30 minutos, y a continuación, en un plazo de máximo 2 a 3 h durante el cual se mantuvo en condiciones de refrigeración, se centrifugó a 1900 g (3000 rpm; rotor oscilante) durante 10 minutos a 4 °C. La fracción de plasma (sobrenadante) se alicuotó en tubos estériles con rosca de 2 mL (entre 2-3 alicuotas de 500 ^L/tubo) que se etiquetaron y almacenaron a -80 °C hasta su uso.

Para poder determinar los miARNs diferencialmente expresados en la cohorte de pacientes, se emplearon muestras de plasma de una cohorte de población control independiente. En ellas, se incluyeron individuos control sanos pareados por sexo y edad con el grupo de pacientes correspondiente. Estas muestras fueron cedidas por el Biobanco para la Investigación Biomédica y en Salud Pública de la Comunidad Valenciana (IBSP-CV).

Se recogieron datos demográficos (sexo, edad, peso y talla) y se descartaron aquellas que asociaban neoplasias u otras enfermedades cardiovasculares, respiratorias, óseas, mentales y/o endocrinas. En la Tabla 1 se indican las características demográficas y clínicas de los dos grupos de pacientes estudiados; para cada ítem, se indica el valor absoluto o la media ± desviación típica y el rango entre paréntesis, según corresponda.

Tabla 1. Características clínicas y demográficas de los grupos de pacientes.

1a Cohorte 2a Cohorte P Investigación Validación valor

^N 20 21

D atos dem ográficos§

Mujeres 11 10

Hombres 9 11

Edad 36,20 ± 9,10 (21-56) 43,30 ± 15,23 (15-70) ns Años desde diagnóstico 18,45 ± 9,27 27,25 ± 10,28 ^** Perfil al d iagnóstico

Edad diagnóstico (años) 16 ± 12,40 (2-48) 15,60 ± 9,94 (6-38) ns Hepático 10 9

Neurológico 4 7

Mixto 2 -Asintomático 4 5

P arám etro s clínicos§

Colesterol (mg/dL) 178,60 ± 44,14 181,70 ± 31,22 ns Triglicéridos (mg/dL) 129,70 ± 53,31 129,60 ± 62,94 ns AST (U/L) 39,16 ± 25,25 32,32 ± 11,37 ns ALT (U/L) 63,80 ± 74,92 45,80 ± 29,01 ns GGT (U/L) 42,35 ± 24,38 43,90 ± 41,43 ns Fosfatasa alcalina (U/L) 84,55 ± 35,64 93,95 ± 28,70 ns Bilirrubina total (mg/dL) 0,66 ± 0,35 0,99 ± 0,81 ns Riesgo de progresión

hepática ^{8 -}§: corresponden al momento de inclusión en el estudio; **p-valor <0.01; ns: no significativo; AST: aspartato aminotransferasa; ALT: alanina aminotransferasa; GGT: gamma-glutamil transferasa

En el seguimiento clínico de los pacientes incluidos en la primera cohorte de investigación, en ocho casos se registraron factores asociados a mayor riesgo de progresión de la enfermedad hepática. Los factores principalmente detectados han sido presencia de fibrosis avanzada mediante elastografía de transición (Fibroscan), presencia de esteatosis por ecografía, y elevación de ALT persistente, acompañado de niveles de triglicéridos superiores al valor de referencia.

Para la realización del estudio, se emplearon además cohortes de población control independientes para cada una de las cohortes de pacientes, pareadas por edad y sexo con el grupo de pacientes. En la Tabla 2 se muestran las características demográficas de los grupos control. Para cada ítem, se indica el valor absoluto o la media ± desviación típica y el rango entre paréntesis, según corresponda.

Tabla 2. Características demográficas de los grupos de individuos control.

Controles Controles P

1a cohorte 2a cohorte valor

N 20 21

Mujeres 11 10

Hombres 9 11

Edad estudio

_(años) 35,60 ± 8,33 (20-56) 43,14 ± 15,28 (15-70) ns

IMC 24,13 ± 3,75 26,44 ± 3,50 ns

IMC: índice de masa corporal

1.2 Extracción de ARN total circulante

Para el aislamiento de ARN total circulante a partir de muestra de plasma y en particular para enriquecer la fracción de miARNs, se utilizó el kit miRNeasy Mini (Qiagen). Se siguió el protocolo del fabricante para muestras de suero/plasma pero con algunas modificaciones para procesar 400 ^L de plasma por individuo y columna de purificación del kit. Por individuo, se descongeló una alícuota de 500 ^L de plasma en hielo, que se centrifugó a 16.000 g durante 5 minutos a 4 °C para descartar restos de células dañadas que pudieran haber sido arrastrados de la separación de plasma. Evitando tocar el pellet, se recogieron dos alícuotas de 200 ^L de plasma que se trataron en paralelo con 1 mL de Qiazol (Qiagen) y 200 ^L de cloroformo cada una, y se centrifugaron a 12.000 g durante 15 minutos a 4 °C. De cada tubo, se obtuvieron aproximadamente 600 ^L de sobrenadante (fase acuosa), a la que se le añadieron 900 ^L de etanol absoluto. Tras mezclar bien con vórtex, se pasaron por la misma columna y se continuó con el protocolo de lavados y elución final indicado por el fabricante.

1.3 Preparación de librerías de ARN de pequeño tamaño y secuenciación masiva

Se obtuvieron librerías individuales de ARNs de pequeño tamaño con el kit NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep (New England Biolabs) compatibles con la plataforma de secuenciación Illumina.

En primer lugar, se adicionó el adaptador 3’ SR, seguido por un paso de hibridación del cebador SR RT para la retrotranscripción y otro de ligación del adaptador 5’ SR. Por último, tras retrotranscribir las moléculas de ARN a cDNA, se amplificaron por PCR para aumentar su cantidad. En esta etapa tuvo lugar la identificación de librerías con la introducción de índices, esto son secuencias cortas conocidas de 6 pb que forman parte de los cebadores empleados para la PCR (kit NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep (New England Biolabs)). Se utilizaron 6 ^L de muestra de ARN total circulante aislada de plasma de cada individuo. En general, se asumió que este tipo de muestras presentan una cantidad total de ARN igual o inferior a 10 ng, por lo que es necesario optimizar el protocolo de preparación de librerías para minimizar la formación de dímeros de adaptadores y obtener un buen rendimiento de secuenciación de miARNs. Las modificaciones que se llevaron a cabo con respecto al protocolo del fabricante consistieron en la dilución 1:5 de los adaptadores 3’ y 5’ SR y del SR RT cebador así como el aumento de ciclos de PCR finales (16 ciclos en lugar de los 15 ciclos máximos recomendados).

Una vez amplificadas e indexadas las librerías por PCR, se realizó la selección por tamaño mediante electroforesis en geles TBE PAGE 6% Novex (Invitrogen) empleando el marcador de tamaños moleculares Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest (New England Biolabs).

La electroforesis se llevó a cabo a 120 V durante una hora a temperatura ambiente en dilución 1X de tampón TBE Novex (Invitrogen). Tras la tinción del gel con GelRed (Biotium), se cortaron en un transiluminador las bandas correspondientes al tamaño de inserto de librería esperado, esto es, en torno a 140 pb para miARNs y 150 pb para otros ARN de pequeño tamaño, que orientativamente migraron a la misma altura que la banda de 147 pb del marcador de tamaños moleculares utilizado.

Tanto para la purificación de las librerías indexadas pre-gel y post-gel se empleó el kit Nucleospin Gel and PCR Clean-Up (Macherey-Nagel) siguiendo los protocolos del fabricante para clean-up de PCR y purificación de DNA desde gel de poliacrilamida, respectivamente. Asimismo, se realizaron controles de calidad de las librerías indexadas pre y post-gel mediante electroforesis capilar automatizada en un equipo TapeStation 4200 con el kit High Sensitivity D1000 ScreenTape (Agilent Technologies).

Para generar el pool de librerías para secuenciación masiva, se cuantificaron individualmente las librerías indexadas y purificadas post-gel mediante qPCR con KAPA Library Quantification Kit (Kapa Biosystems) en un equipo LightCycler 480 II (Roche). Finalmente, se secuenció el conjunto de librerías en la plataforma Illumina HiSeq 2500 (1x50 pb, versión 4).

1.4. Análisis bioinformáticos

1.4.1 Análisis primario

De las lecturas generadas en la secuenciación y almacenadas en ficheros FASTQ, se eliminaron restos de adaptadores de librería y se realizó una selección por tamaño de lectura compatible con miARNs maduros (entre 16-28 pb) con el programa Cutadapt.

Con el programa FastQC se realizaron controles de calidad de los datos de secuenciación brutos y tras la eliminación de adaptadores, en este último caso para comprobar que la distribución y cantidad de lecturas en torno al tamaño esperado para miARNs maduros era adecuada. Las lecturas seleccionadas se alinearon frente a las secuencias de referencia de miARNs precursores (hairpin) anotados en la miRBase versión 22 mediante el algoritmo de Bowtie (versión 1.1.2). Para ello, se fijaron los siguientes parámetros descritos en la Tabla 3 para conseguir alineamientos únicos.

Tabla 3. Parámetros utilizados para el alineamiento con Bowtie de lecturas de 16-28 pb frente a miARNs precursores.

Con el programa Subread (versión 1.6.0) se obtuvieron los recuentos de lecturas alineadas frente a los brazos 5p y 3p de cada miARN precursor que corresponden al miARN maduro. Para ello, se generó un fichero GFF (de sus siglas en inglés, SignalMap Gene-Finding Formaf) customizado con la anotación de los miARNs maduros recogidas en miRBase versión 22, con el fin de proporcionar al programa las coordenadas de las regiones en las que debe realizar el recuento.

1.4.2 Análisis de representación diferencial y enriquecimiento funcional

Para la identificación de miARNs maduros que pudieran estar diferencialmente representados en plasma entre los grupos experimentales establecidos (pacientes y controles) se utilizó el paquete edgeR (Robinson et al., Bioinformatics, 139-40 (26) (2010)).

A partir del recuento de lecturas alineadas correspondientes a miARNs maduros, se filtraron aquellos con baja representación, tras lo cual se definió el tamaño de librería de cada muestra, esto es, la suma total de conteos de miARNs maduros de cada una. Dado que el tamaño de librería fluctúa entre muestras, se realizó un paso de normalización con el método TMM (de sus siglas en inglés, Trimmed Mean of M valúes), en el que se definió un factor para escalar los tamaños de cada una para que fueran comparables entre sí. Para determinar qué miARNs se encontraban diferencialmente representados entre pacientes y controles, se utilizaron los métodos QLF (Quasi-Likelihood F Test) y LRT (Likelihood Ratio Test), ambos basados en modelos lineales generalizados (GLM, GeneralizedLinearModel), que permiten incluir covariables experimentales para ajustar las comparaciones. En cada una de las comparaciones realizadas, se determinó como significativamente desregulados aquellos miARNs con FDR (False Discovery Rate, proporción esperada de errores tipo I o falsos positivos) <0,05.

Por otro lado, se llevó a cabo un análisis de enriquecimiento funcional para resumir la información acerca de las interacciones miARN-gen, identificando mediante test de Fisher grupos de genes significativamente incrementados implicados en una misma ruta o proceso biológico. Se utilizaron las herramientas web mirPath y miRWalk para análisis de enriquecimiento funcional en rutas y procesos biológicos anotados en la base de datos KEGG. En el caso de mirPath, se escogió el algoritmo microT-CDS para el que se fijó un umbral de 0,70 en la predicción de interacciones miARN-gen, mientras que en miRWalk se tuvieron en cuenta las predicciones del algoritmo TargetScan con una probabilidad de unión del 95 %.

1.5 Validación de miARNs circulantes en plasma mediante qPCR

Para la obtención de cDNA molde mediante transcripción reversa, se utilizó el kit TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis (Applied Biosystems). Este kit presenta la ventaja de que, a partir de una pequeña cantidad de ARN total circulante aislado de suero o plasma (2 ^L), se lleva a cabo un procedimiento de amplificación universal que permite la detección de un amplio repertorio de miARNs maduros presentes en la muestra. Para ello, se basa en la unión de colas poli-A y adaptador 5’ a las moléculas de ARN previos al paso de transcripción reversa utilizando un cebador universal. Por último, desde el cDNA sintetizado, se realizó una pre-amplificación para aumentar uniformemente el número de moléculas y mejorar la detección mediante qPCR.

Para cada miARN seleccionado para validación, se llevó a cabo la amplificación por qPCR con las sondas (Tabla 4) y master mix de TaqMan Advanced (Applied Biosystems) en un equipo LightCycler 480 II (Roche). Los experimentos de qPCR se diseñaron para placas de 384, utilizando 2,5 ^L de una dilución 1/10 del cDNA pre­ amplificado en tampón TE 0,1X, y escalando el resto de componentes de la reacción a un volumen final de 10 ^L. El programa de qPCR indicado por el fabricante se adaptó al equipo utilizado, y consistió en una preincubación inicial a 95 °C durante 5 minutos, seguida de 50 ciclos de amplificación, con desnaturalización a 95 °C de 10 segundos e hibridación de sonda y cebadores y extensión en un único paso a 60 °C de 30 segundos.

Tabla 4. Sondas TaqMan Advanced utilizadas para la validación de miARNs circulantes mediante qPCR.

Inicialmente, se escogieron miR-191-5p, miR-16-5p y miR-484 como miARNs de referencia, ya que en diversas publicaciones han sido utilizados con dicha finalidad. Se comprobó su estabilidad en las muestras analizadas con los algoritmos NormFinder y geNorm incluidos en el paquete de R NormqPCR. El análisis mostró que la combinación miR-16-5p y miR-484 era la más estable, por lo que se utilizó la media de Ct (cycle threshold, ciclo umbral) de ambos para la normalización de la expresión de los miARNs a validar. El nivel de expresión relativa de cada miARN en muestra de cada paciente con respecto a controles se calculó como 2-(ACt Paciente - Media ACt contraes), siendo ACt = Ct miARN de interés - Promedio Ct miARNs de referencia.

1.6 Análisis estadísticos

Se comprobó mediante el test de Shapiro-Wilk si las variables bioquímicas seguían una distribución normal. Como no cumplían este criterio, se aplicó el test de Wilcoxon para establecer si existían diferencias significativas entre medias de cada variable entre grupos de pacientes. Siguiendo el mismo criterio, se calculó el coeficiente de correlación de Spearman (Rs) para determinar si existía asociación entre variables bioquímicas, la edad y la expresión relativa de cada miARN.

En el caso de la expresión relativa de cada miARN detectada mediante qPCR, para todos los análisis estadísticos ejecutados, ésta se expresó como logaritmo en base 2 (log2). Para establecer comparaciones entre pacientes y controles, se aplicó el T-test para muestras pareadas. Cuando las comparaciones se establecían dentro de cada grupo (entre hombres y mujeres o pacientes con riesgo de progresión o no), se aplicaba el T-test para muestras independientes.

Con el fin de analizar la capacidad predictora de los miARNs validados en el perfil para clasificar a los pacientes según si presentan factores riesgo de progresión de enfermedad hepática, se utilizaron modelos de regresión logística binaria. En ellos, se calculó la probabilidad de cada paciente de pertenecer a una de las categorías indicadas por la variable categórica en función de los valores indicados por la variable predictora. Posteriormente, se evaluó el rendimiento de cada modelo con el análisis de la curva ROC (de sus siglas en inglés Receiver Operating Characterístic, característica operativa del receptor).

2. Resultados

2.1. Determinación de miARNs circulantes en plasma mediante miARN-seq

2.1.1. Análisis primario

En primer lugar, se comprobó que la cantidad y calidad de lecturas obtenidas en la secuenciación miARN-seq y su procesamiento eran adecuados para llevar a cabo el análisis de representación diferencial. Como se observa en la Fig. 1A, en cada una de las 40 muestras secuenciadas se obtuvieron entre 4-8 millones de lecturas brutas, que se redujeron a entre 4-6 millones tras eliminar adaptadores de librería y descartar lecturas de tamaño inferior a 15 pb. De éstas, entre 2-4 millones por muestra se correspondían a lecturas de la fracción de miARNs maduros (tamaño 16-28 pb).

Dichas lecturas se seleccionaron para ser alineadas frente a secuencias de miARNs precursores (hairpin) anotadas en la miRBase versión 22. Para el análisis de representación diferencial, se obtuvieron los conteos de secuencias mapeadas en las coordenadas determinadas en los brazos 5p y 3p de cada precursor que corresponden al miARN maduro. Proporcionalmente, el número de lecturas mapeadas correspondientes a secuencias de miARNs maduros fue superior en el grupo de pacientes frente a controles, lo cual es representativo del estado fisiológico que diferencia ambos grupos (Fig. 1B).

2.1.2. Análisis de representación diferencial

Como paso previo a la realización del análisis de representación diferencial, fue necesario preparar los datos de conteos de miARNs maduros obtenidos llevando a cabo una etapa de filtrado y posterior normalización entre muestras. Para un total de 2650 miARNs maduros, se asignó al menos un conteo en una de las 40 muestras estudiadas. En el paso de filtrado se eliminaron miARNs con baja representación, lo que redujo el número de miARNs maduros a considerar a 2158.

Para el análisis de representación diferencial se siguieron dos diseños experimentales distintos. En el diseño 1 se realizó un análisis comparativo entre ambos grupos sin tener en cuenta otras covariables, mientras que en el diseño 2 se incluyeron las covariables "sexo” y "edad” como factor bloque para controlar la variabilidad aportada por estos dos parámetros. Para ello, se aplicaron los métodos QLF (por sus siglas en inglés, Quasi-Likelihood F Test) y LRT (por sus siglas en inglés, Likelihood Ratio Test), que forman parte del paquete de análisis edgeR y que permiten incluir covariables experimentales.

En la Fig. 2 se representa la concordancia de miARNs maduros detectados como significativamente desregulados en muestras de plasma de pacientes, al aplicar los métodos de análisis QLF y LRT en ambos diseños experimentales. Teniendo en cuenta una FDR (por sus siglas en inglés, False Discovery Rate, proporción esperada de errores tipo I o falsos positivos) inferior al 5 %, el método LRT identificó 42 y 37 miARNs diferencialmente representados entre los diseños 1 y 2, respectivamente. En contraste, método QLF reveló 29 miARNs desregulados en el diseño 1 y 30 miARNs en el diseño 2, todos ellos también detectados por el método LRT.

En la puesta en común de los resultados obtenidos, destaca la presencia de un grupo de 18 miARNs detectados por las cuatro estrategias de análisis aplicadas (Fig. 2). Esto indica que las diferencias detectadas en ellos no dependerían de las covariables "edad” y "sexo”. Por tanto, siguiendo criterios de robustez del análisis y control de la proporción esperada de falsos positivos, para continuar con el estudio se seleccionaron estos 18 miARNs. Como se puede observar en la Tabla 5, los 18 miARNs presentan un valor de logFC (logaritmo del factor de cambio) positivo, es decir, se encontrarían incrementados en muestra de plasma de pacientes EW con respecto a controles.

Tabla 5. miARNs maduros significativamente desregulados en plasma de pacientes mediante el método QLF en los diseños 1 y 2.

logFC p valor§ FDR logFC p valor§ FDR ^{h sa-m iR -122 -5p} 3,38 1,02E-08 1,23E-05 2,77 2,39E-06 1,72E-03 ^{hsa-m iR -122b -3p} 3,38 1,14E-08 1,23E-05 2,77 3,44E-06 1,86E-03 ^{hsa-m iR -193b -5p} 2,64 1,76E-07 1,27E-04 1,92 1,83E-07 1,97E-04 ^{h sa-m iR -885 -3p} 3,23 2,38E-07 1,28E-04 2,67 7,91E-06 2,42E-03 ^{hsa-m iR -125b -5p} 1,33 1,53E-06 5,50E-04 1,07 1,02E-04 1,57E-02 ^{h sa-m iR -192 -5p} 1,76 2,14E-06 6,59E-04 1,33 6,47E-05 1,16E-02 ^{hsa-m iR -200b -3p} 1,31 3,54E-06 9,56E-04 1,18 8,96E-06 2,42E-03 ^{h sa-m iR -885 -5p} 2,47 4,81E-06 1,15E-03 2,17 1,50E-04 1,94E-02 ^{h sa-m iR -200a-3p} 1,33 6,84E-06 1,48E-03 1,11 1,53E-04 1,94E-02 ^{h sa-m iR -455 -5p} 2,02 1,08E-05 2,11E-03 1,76 8,42E-06 2,42E-03 ^{h sa-m iR -99a -5p} 1,31 1,45E-05 2,38E-03 1,05 3,50E-04 2,90E-02 ^{hsa-m iR -122b -5p} 2,23 1,54E-05 2,38E-03 2,09 2,22E-04 2,28E-02 ^{h sa-m iR -193a-5p} 1,42 2,69E-05 3,77E-03 1,11 3,36E-04 2,90E-02 ^{h sa-m iR -30a -5p} 1,17 2,79E-05 3,77E-03 1,00 2,49E-04 2,34E-02 ^{h sa-m iR -485 -3p} 1,96 4,13E-05 5,24E-03 1,76 1,79E-08 3,86E-05 ^{h sa-m iR -511 -5p} 1,09 4,86E-05 5,52E-03 0,97 2,09E-04 2,25E-02 ^{h sa-m iR -340 -3p} 1,43 1,05E-04 1,08E-02 1,44 4,81E-06 2,07E-03 ^{hsa-m iR -23b -3p} 1,18 3,68E-04 3,46E-02 1,10 1,91E-04 2,17E-02 §: p valor ajustado por el método de Benjamini-Hochberg; FDR: False Discovery Rate (proporción esperada de errores tipo I o falsos positivos); logFC: logaritmo del factor de cambio.

2.1.3. Caracterización mediante enriquecimiento funcional

Se realizó un análisis de enriquecimiento funcional para conocer en qué rutas de señalización y otros procesos biológicos estarían implicados los 18 miARNs desregulados detectados en plasma de pacientes. Para ello, en primer lugar, se utilizó la herramienta mirPath, empleando el algoritmo microT-CDS para la predicción de interacciones miARNgen. En paralelo, se realizó un análisis equivalente con la herramienta miRWalk, con el algoritmo TargetScan para la predicción de genes diana.

Con un p valor ajustado <0,05, la herramienta mirPath identificó un total de 60 rutas de señalización y/o procesos biológicos anotados en la base de datos KEGG. A partir de este listado, se seleccionaron aquellos relevantes en procesos de daño hepático, de los cuales se comprobó si también habían sido detectados en el análisis con miRWalk como método de validación (Tabla 6). Entre ellos, destacan procesos implicados en regeneración hepática (vías de señalización de ErbB, Hippo, mTOR, Wnt y uniones adherentes entre células) y fibrosis (N-glicosilación de proteínas, adhesiones focales entre células, vías de señalización TGF-p, FoxO, HIF-1 y AMPK), además de otros característicos de NAFLD (síntesis de esfingolípidos y vía de señalización de la insulina).

Tabla 6. Rutas de señalización y otros procesos biológicos de interés

significativamente desregulados por los 18 miARNs incrementados en el grupo

de pacientes de la primera cohorte de investigación.

m irPath (m icroT- m iRW alk CDS)

TargetScan) Ruta KEGG P valor§ N genes valor§ N genes Vía de señalización ErbB <1,00E-04 67 <1,00E-04 16 Uniones adherentes <1,00E-04 54 4,70E-03 11 Vía de señalización Hippo 1,33E-03 76 2,63E-02 15 Vía de señalización mTOR 5,82E-03 38 7,60E-03 17 Vía de señalización Wnt 3,72E-02 75 <1,00E-04 23 Vía de señalización de 2,75E-04 68 3,00E-02 11 esfingolípidos

Vía de señalización de la insulina 2,22E-02 76 1,10E-03 19 Biosíntesis N-glicanos 4,63E-03 25 6,22E-02 24 Vía de señalización TGF-p 1,30E-03 45 3,87E-02 10 Vía de señalización FoxO 5,35E-04 79 4,30E-03 16 Vía de señalización HIF-1 3,48E-03 63 1,17E-02 13 Adhesión focal 1,86E-03 114

8,30E-03 20 Vía de señalización AMPK 8,55E-03 70 <1,00E-04 19 §: p valor ajustado por el método de Benjamini-Hochberg; N: número

2.2. Perfil de miARNs circulantes candidatos en plasma como biomarcadores

Del listado de 18 miARNs circulantes con mayor presencia en muestras de plasma de pacientes, se escogieron una serie de miARNs para analizar su expresión mediante qPCR con el fin de determinar su validez como posibles biomarcadores en plasma. Para ello, se tuvieron en cuenta los siguientes criterios:

a) Valor de logFC en el análisis de representación diferencial superior a 1,4 en ambos diseños experimentales (Tabla 5).

b) Relación con enfermedad hepática y/o metabolismo de metales descrita en bibliografía.

Atendiendo a estos criterios, se seleccionaron para validación por qPCR siete miARNs: miR-122-5p, miR-193b-5p, miR-885-5p y 3p, miR-455-5p, miR-485-5p y miR-340-3p. A esta selección se añadió miR-192-5p, ya que si bien sólo presenta un valor de logFC superior a 1,4 en el análisis del diseño 1, ha sido ampliamente descrito en la bibliografía como marcador de daño hepático. Por otra parte, no se seleccionaron miR-122b-5p y 3p ya que pertenecen a la misma familia que miR-122-5p, y esta isoforma ha sido la más estudiada en el contexto de enfermedad hepática.

2.2.1. Primera cohorte de investigación

Se analizaron los niveles en plasma de los miARNs seleccionados mediante qPCR en el grupo de pacientes (N=20) y de controles (N=20) de la primera cohorte de investigación, con el propósito de confirmar que las diferencias detectadas por miARN-seq se ratificaban con esta estrategia alternativa. Para ello, se utilizó la misma muestra de miARNs aislados de plasma empleada en la obtención de librerías para miARN-seq. Finalmente, de los ocho miARNs seleccionados, sólo cinco pudieron ser analizados correctamente en todas las muestras mediante qPCR. Ello se debió a que para miR-193b-5p, miR-455-5p y miR-885-3p, no fue posible detectar su amplificación, al ser la intensidad de la señal de fluorescencia obtenida indistinguible de la reacción sin miARN molde (control negativo de la qPCR).

Como se observa en la Fig. 3A, los niveles de expresión relativa de miR-122-5p, miR-192-5p, miR-885-5p, miR-485-3p y miR-340-3p fueron significativamente superiores en el grupo de pacientes con respecto al de controles. Es especialmente llamativa la significatividad lograda para miR-122-5p y miR-885-5p, asociados con enfermedad hepática, y miR-340-3p (Fig. 3A). miR-485-3p participa en el metabolismo del hierro; y miR-340-3p juega un papel en el metabolismo de lípidos y en la ruta de la insulina. Estos resultados confirmaron los obtenidos con la primera aproximación experimental (miARN-seq), y por tanto, se puede concluir que hay una expresión incrementada para los miARNs miR-122-5p, miR-192-5p, miR-885-5p, miR-485-3p y miR-340-3p en el grupo de pacientes de la cohorte de investigación comparado con el grupo correspondiente de individuos sanos.

Se analizó si existía diferencias de expresión relativa para los cinco miARNs amplificados mediante qPCR entre pacientes con diferente sexo, viéndose que no la había (Fig. 3B). Tampoco se detectó influencia alguna de la edad en los resultados (Fig.

3C). Consecuentemente, en esta primera cohorte, no se aprecia relación entre los niveles en plasma de los miARNs seleccionados, el género y la edad.

Mediante análisis de correlación, se investigó si existía una relación entre los niveles de expresión relativa de estos cinco miARNs seleccionados tras el análisis por qPCR y los analitos bioquímicos con el fin de valorar su posible utilidad como biomarcador de la progresión de la enfermedad (Fig. 3C). Se detectó correlación positiva y significativa (p valor <0,05) entre valores de actividad de ALT, AST, GGT y los miARNs miR-122-5p, miR-192-5p y miR-885-5p, que están los tres relacionados con enfermedades hepáticas. De entre estos hallazgos, llama la atención AST con valores de Rs superiores a 0,60 en todos los casos. Valores altos de ALT, AST y/o GGT se asocian con hígado dañado por diferentes causas (hepatitis, cirrosis, etc). En conclusión, se observa una correlación directa positiva entre los miARNs miR-122-5p, miR-192-5p y miR-885-5p con las enzimas hepáticas ALT, AST y GGT.

Adicionalmente, para miR-885-5p se observó una correlación positiva con los niveles de triglicéridos. Un aumento de triglicéridos en las células hepáticas se podría relacionar con enfermedad del hígado graso que suele ir acompañada de valores altos de colesterol. El miR-885-5p no parece presentar correlación con el colesterol en este análisis.

En cuanto a los miARNs miR-485-5p y miR-340-3p, no se identificó ninguna correlación con los analitos estudiados, excepto para la actividad de las enzimas FA y GGT que mostraron una asociación negativa significativa con el miR-340-3p. Valores altos concomitantes de GGT y FA se asocian con enfermedad del tracto biliar, y la bilis generada en el hígado, se encarga de ayudar a la digestión y descomponer las grasas en ácidos grasos. Los resultados obtenidos podrían indicar relación entre este miARN implicado en el metabolismo de lípidos y afectación del tracto biliar. En este sentido, se debe destacar la ausencia de correlación significativa con el colesterol si bien marca una tendencia negativa. De hecho, el colesterol no presentó ninguna correlación significativa con ninguno de los miARNs investigados ni tampoco la BT.

Es relevante señalar que, entre los miARNs, se detectó una alta correlación (Rs >0,80) para los niveles de expresión relativa de miARNs relacionados con daño hepático miR-122-5p, miR-192-5p, y miR-885-5p. Con respecto a los restantes dos miARNs, miR-4855p y miR-340-3p, no se observó ninguna correlación ni entre ellos ni con los tres anteriormente mencionados. Son esperables en cierta medida estas relaciones ya que miR-485-5p y miR-340-3p participan en rutas metabólicas diferentes (metabolismo del hierro y de lípidos/insulina, respectivamente).

Tras validar la mayor presencia de miR-122-5p, miR-192-5p y miR-885-5p en plasma de pacientes, se evaluó su posible utilidad para predecir el riesgo de progresión hepática en pacientes con enfermedad de Wilson. Como se mencionó en la descripción de las características de la población de estudio, en el seguimiento clínico de los pacientes de la primera cohorte de investigación, en ocho casos se registraron factores que podrían contribuir a la progresión de la enfermedad hepática. Para ello, se llevó a cabo un estudio de regresión logística simple, en el que se usaron como variables predictoras los niveles en plasma detectados por qPCR para miR-122-5p, miR-192-5p y miR-885-5p en los pacientes de la primera cohorte de investigación, generándose modelos con cada uno de ellos.

En la Tabla 7 se resumen los parámetros del modelo generado con cada miARN. En los tres modelos, los coeficientes de regresión de la variable predictora (nivel de expresión relativa del miARN) son positivos y significativos (p valor <0,05). Expresados estos coeficientes en término de odds ratio, los intervalos de confianza asociados son superiores a 1. Todo ello indica que, conforme incrementan los niveles en plasma de estos miARNs, también aumenta de forma significativa la probabilidad de pertenecer al grupo de riesgo de progresión.

Tabla 7. Parámetros de los modelos de regresión logística para predecir el riesgo de progresión hepática.

hsa-m iR-122- hsa-m iR-192- hsa-m iR-885-5p 5p 5p

^{C o efic ien te de regresión} 0,92 1,57 0,67

^{P v a lo r} 0,025 0,026 0,040 Odds ratio 2,50 4,83 1,94 Odds ratio ^{IC 95%} 1,29-6,92 1,50-27,97 1,14-4,34

^{A IC} 22,52 23,32 24,61 IC: Intervalo de confianza; AIC: Akaike Information Criterion (Criterio de información de Akaike)

A continuación, se evaluó el rendimiento de cada modelo para predecir el riesgo de progresión hepática. Como se observa en la Fig. 4, los modelos generados clasificarían correctamente al presentar un valor de AUC en torno al 80% en los tres casos. Atendiendo a las diferencias de expresión relativa de cada miARN entre pacientes con y sin factores de riesgo, para miR-122-5p son más significativas, lo que coincide con que su modelo asociado presenta el mayor AUC de entre los tres (83,30 %). Con respecto a las probabilidades óptimas de clasificación, para miR-122-5p, con una probabilidad de pertenecer al grupo de riesgo del 20 %, se consigue una especificidad del 75 % y sensibilidad del 87,50 %, mientras que para miR-885-5p, con mismo valor de probabilidad, la sensibilidad es menor (75 %). En cuanto a miR-192-5p, la probabilidad óptima para clasificar a los pacientes es del 60 %, con sensibilidad del 75 % y alta especificidad (100 %).

2.2.2. Segunda cohorte de validación

En la segunda cohorte de validación, que como se ha indicado anteriormente, está formada por muestras procedentes de una serie independiente de pacientes (N=21) y controles (N=21), se replicó el estudio hecho en la primera cohorte de los cinco miARNs mediante qPCR (Fig. 5).

Como se muestra en la Fig. 5A, de nuevo, se evidenciaron los niveles de expresión relativa de miR-122-5p, miR-192-5p y miR-885-5p significativamente superiores en el grupo de pacientes. De esta forma, los tres miARNs asociados con enfermedad hepática se confirmaban con candidatos robustos a biomarcadores de la EW. Sin embargo, la expresión relativa de miR-485-3p y miR-340-3p fue significativamente inferior en éstos, cuando en el estudio de la cohorte de investigación los resultados mostraban un incremento de la expresión.

Al igual que para la primera cohorte, se investigó la posible influencia de género y/o edad en la expresión de los miARNs analizados. Tampoco en este caso se detectaron diferencias significativas de expresión para ninguno de los cinco miARNs ni en función del sexo (Fig. 5B) ni en función de la edad (Fig. 5C). Junto con los datos obtenidos en la primera cohorte de investigación, se refuerza que ni género ni edad influyen en la desregulación de estos miARNs en estos pacientes.

El análisis de correlación entre los miARNs investigados y los analitos bioquímicos incluidos con el propósito de evaluar su papel como biomarcador de la progresión de la enfermedad (Fig. 5C) mostró resultados un tanto dispares con respecto a los observados en la primera cohorte. Con ALT correlaciona positiva y significativamente los niveles en plasma de miR-122-5p y miR-885-5p, no así miR-192-5p, aunque los tres miARNs correlacionan entre sí positivamente.

miR-885-5p correlacionó positiva y significativamente con los niveles de colesterol y triglicéridos. En la primera cohorte, esta última correlación ya se apreció, y con respecto al colesterol, la tendencia era positiva, aunque no significativa, sugiriendo un posible nexo entre la expresión del miR-885-5p y metabolismo de lípidos.

Por último, se detectó asociación positiva significativa con BT para la expresión de miR-192-5p. La BT alta está implicada en necrosis y colestasis, lo que puede tener potencial uso para anticiparse a la evolución de la patología en combinación de miR-192-5p.

Tampoco en esta cohorte se logró establecer alguna relación de miR-485-5p con ninguno de los analitos incluidos. Respecto a miR-340-3p, se halló una correlación significativamente inversa entre la expresión de miR-340-3p con la actividad de las enzimas ALT y GGT, así como positiva con la FA (Fig. 5C). En la primera cohorte, miR-340-3p mostró una asociación negativa no significativa con ALT, y significativa con GGT. En ambos casos, la tendencia es la misma. Sin embargo, para FA, en la primera cohorte presentó una correlación negativa.

De forma equivalente y tal como se ha comentado anteriormente, en los pacientes de la segunda cohorte de validación también se detectó correlación positiva y significativa de los niveles de expresión relativa de miR-122-5p, miR-192-5p y miR-885-5p entre sí. Este hallazgo refuerza el obtenido con la primera cohorte y que muestra la relación funcional de estos tres miARNs entre sí. En cuanto a miR-485-5p y miR-340-3p, tampoco en esta cohorte se detectó ninguna correlación ni entre ellos ni con los tres anteriormente mencionados, lo que indica que se trata de miARNs implicados en diferentes rutas, tal y como se ha comentado anteriormente.

Claims (32)

REIVINDICACIONES

1. Método in vitro para diagnosticar la enfermedad de Wilson en un sujeto, que comprende las siguientes etapas:

(a) determinar los niveles de miR-192-5p y/o miR-885-5p en una muestra biológica aislada del sujeto, y

(b) comparar dichos niveles con un valor control,

en donde unos niveles elevados de miR-192-5p y/o miR-885-5p respecto al valor control indican que el sujeto padece la enfermedad de Wilson.

2. Método in vitro según la reivindicación 1, en donde la etapa (a) comprende, además, determinar los niveles de miR-122-5p, en donde unos niveles elevados de miR-122-5p con respecto a al valor control indican que el sujeto padece la enfermedad de Wilson.

3. Método in vitro según la reivindicación 1 o 2, en donde la etapa (a) comprende, además, determinar los niveles de, al menos, un analito que se selecciona del grupo que consiste en alanino aminotransferasa (ALT), aspartato aminotransferasa (AST), gamma glutamil transpeptidasa (GGT), bilirrubina total (BT), triglicéridos y colesterol, en donde unos niveles elevados de dicho analito con respecto a un valor control indica que el sujeto padece la enfermedad de Wilson.

4. Método in vitro para monitorizar la evolución de la enfermedad de Wilson en un sujeto, que comprende las siguientes etapas:

(a) determinar los niveles de miR-192-5p y/o miR-885-5p en una muestra biológica aislada del sujeto en al menos dos momentos distintos en el tiempo, y

(b) comparar entre sí los niveles de miR-192-5p y/o miR-885-5p determinados en dichos momentos,

en donde un incremento en los niveles miR-192-5p y/o miR-885-5p a lo largo del tiempo indica que la enfermedad de Wilson en el sujeto evoluciona negativamente.

5. Método in vitro según la reivindicación 4, en donde la etapa (a) comprende, además, determinar los niveles de miR-122-5p, en donde un incremento en los niveles de miR-122-5p a lo largo del tiempo indica que la enfermedad de Wilson en el sujeto evoluciona negativamente.

6. Método in vitro según la reivindicación 4 o 5, en donde la etapa (a) comprende, además, determinar los niveles de, al menos, un analito que se selecciona del grupo que consiste en alanino aminotransferasa (ALT), aspartato aminotransferasa (AST), gamma glutamil transpeptidasa (GGT), bilirrubina total (BT), triglicéridos y colesterol, en donde un incremento en los niveles de dicho analito a lo largo del tiempo indica que la enfermedad de Wilson en el sujeto evoluciona negativamente.

7. Método in vitro para evaluar la eficacia y/o respuesta de un sujeto a un tratamiento para la enfermedad de Wilson, que comprende las siguientes etapas:

(a) determinar los niveles de miR-192-5p y/o miR-885-5p en una muestra biológica aislada del sujeto antes y después del tratamiento, y

(b) comparar los niveles de miR-192-5p y/o miR-885-5p determinados antes del tratamiento con los obtenidos después del mismo,

en donde unos niveles de miR-192-5p y/o miR-885-5p después del tratamiento menores que antes del mismo, indican que el tratamiento es eficaz y/o que el sujeto responde de forma positiva al tratamiento.

8. Método in vitro según la reivindicación 7, en donde la etapa (a) comprende, además, determinar los niveles de miR-122-5p, en donde unos niveles de miR-122-5p después del tratamiento menores que antes del mismo, indican que el tratamiento es eficaz y/o que el sujeto responde de forma positiva al tratamiento.

9. Método in vitro según la reivindicación 7 u 8, en donde la etapa (a) comprende, además, determinar los niveles de, al menos, un analito que se selecciona del grupo que consiste en alanino aminotransferasa (ALT), aspartato aminotransferasa (AST), gamma glutamil transpeptidasa (GGT), bilirrubina total (BT), triglicéridos y colesterol, en donde unos niveles del analito después del tratamiento menores que antes del mismo, indican que el tratamiento es eficaz y/o que el sujeto responde de forma positiva al tratamiento.

10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el sujeto es ser humano.

11. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la muestra biológica aislada del sujeto es suero o plasma.

12. Uso de los niveles de miR-192-5p y/o miR-885-5p para diagnosticar in vitro la enfermedad de Wilson en un sujeto, en donde unos niveles elevados respecto a un valor control indican que el sujeto padece la enfermedad de Wilson.

13. Uso según la reivindicación 12, que comprende, además, el uso de los niveles de miR-122-5p, en donde unos niveles elevados respecto a un valor control indican que el sujeto padece la enfermedad de Wilson.

14. Uso según la reivindicación 12 o 13, que comprende, además, el uso de los niveles de, al menos, un analito que se selecciona del grupo que consiste en alanino aminotransferasa (ALT), aspartato aminotransferasa (AST), gamma glutamil transpeptidasa (GGT), bilirrubina total (BT), triglicéridos y colesterol, en donde unos niveles elevados del mismo respecto a un valor control indican que el sujeto padece la enfermedad de Wilson.

15. Uso de los niveles de miR-192-5p y/o miR-885-5p para monitorizar in vitro la evolución de la enfermedad de Wilson en un sujeto, en donde un incremento en los niveles a lo largo del tiempo indica que la enfermedad de Wilson en el sujeto evoluciona negativamente.

16. Uso según la reivindicación 15, que comprende, además, el uso de los niveles de miR-122-5p, en donde un incremento en los niveles de miR-122-5p a lo largo del tiempo indica que la enfermedad de Wilson en el sujeto evoluciona negativamente.

17. Uso según la reivindicación 15 o 16, que comprende, además, el uso de los niveles de, al menos, un analito que se selecciona del grupo que consiste en alanino aminotransferasa (ALT), aspartato aminotransferasa (AST), gamma glutamil transpeptidasa (GGT), bilirrubina total (BT), triglicéridos y colesterol, en donde un incremento en los niveles de dicho analito a lo largo del tiempo indica que la enfermedad de Wilson en el sujeto evoluciona negativamente.

18. Uso de los niveles de miR-192-5p y/o miR-885-5p para evaluar in vitro la eficacia y/o respuesta de un sujeto a un tratamiento para la enfermedad de Wilson, en donde unos niveles después del tratamiento menores que antes del mismo, indican que el tratamiento es eficaz y/o que el sujeto responde de forma positiva al tratamiento.

19. Uso según la reivindicación 18, que comprende, además, el uso de los niveles de miR-122-5p, en donde unos niveles de miR-122-5p después del tratamiento menores que antes del mismo, indican que el tratamiento es eficaz y/o que el sujeto responde de forma positiva al tratamiento.

20. Uso según la reivindicación 18 o 19, que comprende, además, uso de los niveles de, al menos, un analito que se selecciona del grupo que consiste en alanino aminotransferasa (ALT), aspartato aminotransferasa (AST), gamma glutamil transpeptidasa (GGT), bilirrubina total (BT), triglicéridos y colesterol, en donde unos niveles de dicho analito después del tratamiento menores que antes del mismo, indican que el tratamiento es eficaz y/o que el sujeto responde de forma positiva al tratamiento.

21. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 20, en donde el sujeto es ser humano.

22. Un kit que comprende medios para determinar in vitro los niveles de miR-192-5p y/o miR-885-5p en una muestra aislada de un sujeto.

23. Kit según la reivindicación 22, que además comprende medios para determinar in vitro los niveles de miR-122-5p.

24. Kit según la reivindicación 22 o 23, en donde los medios comprenden cebadores y sondas que detectan de forma específica miR-192-5p, y/o miR-885-5p y/o miR-122-5p.

25. Kit según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, que además comprende medios para determinar in vitro los niveles de, al menos, un analito que se selecciona del grupo que consiste en ALT, AST, GGT, BT, triglicéridos y colesterol.

26. Kit según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25, en donde el sujeto es ser humano.

27. Kit según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26, en donde la muestra biológica aislada es de suero o plasma.

28. Uso de un kit según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 27, en un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

29. Uso de un kit según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 27, para diagnosticar in vitro la enfermedad de Wilson en un sujeto.

30. Uso de un kit según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 27, para monitorizar la evolución de la enfermedad de Wilson in vitro en un sujeto.

31. Uso de un kit según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 27, para evaluar la eficacia y/o respuesta de un sujeto a un tratamiento para la enfermedad de Wilson.

32. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 31, en donde el sujeto es ser humano.