ES2612482T3 - Marcadores en la orina para la detección del cáncer de vejiga - Google Patents

Abstract

Un método para la detección de cáncer de vejiga en un sujeto, que comprende: detectar una cantidad incrementada de mRNA específico de un marcador tumoral de vejiga urinaria ("UBTM") en la orina de dicho sujeto en comparación con la cantidad de dicho mRNA en la orina de sujetos que no padecen un cáncer de vejiga maligno, caracterizado porque el UBTM es Midkina (factor promotor de crecimiento de neurita 2).

Description

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segundo anticuerpo conjugado con una molécula indicadora o de detección. Después del lavado y de la activación de cualquier molécula indicadora, la presencia del BTM puede visualizarse al microscopio.

Los métodos también pueden usarse para la inmunodetección de miembros de la familia del marcador en el suero o en el plasma de pacientes con cáncer de vejiga, tomados antes y después de la cirugía para eliminar el tumor, para la inmunodetección de miembros de la familia del marcador en pacientes con otros cánceres que incluyen, pero no se limitan a, colorrectal, pancreático, ovárico, melanoma, de hígado, de esófago, de estómago, de endometrio y de cerebro, y para la inmunodetección de miembros de la familia del marcador en la orina y en las heces de pacientes con cáncer de vejiga.

Los BTM y los UBTM también pueden ser detectados en los tejidos o en la orina mediante el uso de otras técnicas de inmunodetección habituales tales como la inmunotransferencia o la inmunoprecipitación (Harlow, E. y Lane, D., Using antibodies: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor (1999)). En la inmunotransferencia preparaciones de proteínas procedentes de tejidos o de fluidos que contienen el BTM / UBTM se someten a electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes o no desnaturalizantes. Después, las proteínas se transfieren a un soporte de membrana tal como de nailon. Después el BTM / UBTM se hace reaccionar directa o indirectamente con anticuerpos monoclonales o policlonales según se describió para la inmunohistoquímica. Como alternativa, en algunas preparaciones, las proteínas pueden ser manchadas directamente sobre las membranas sin una separación electroforética previa. La señal puede ser cuantificada mediante una densitometría.

En la inmunoprecipitación se incuba una preparación soluble que contiene el BTM o el UBTM con un anticuerpo monoclonal o policlonal contra el BTM / UBTM. La reacción se incuba entonces con microesferas inertes hechas de agarosa o de poliacrilamida con proteína A o proteína G unida covalentemente. Las microesferas de proteína A o G interactúan específicamente con los anticuerpos que forman un complejo inmovilizado de anticuerpo-BTM / UBTMantígeno unido a la microesfera. Después de un lavado, el BTM / UBTM unido puede ser detectado y cuantificado mediante una inmunotransferencia o un ELISA.

Análisis de los datos de la matriz o de la qPCR mediante el uso de ordenadores

Se recogen los datos primarios y el análisis del nº de veces de cambio se realiza mediante la comparación de los niveles de expresión génica del tumor de vejiga con la expresión de los mismos genes en tejido no tumoral. Se proporciona un umbral para concluir que la expresión está aumentada (por ejemplo, un aumento de 1,5 x, un aumento de 2 veces, y en formas de realización alternativas, un aumento de 3 veces, un aumento de 4 veces o un aumento de 5 veces). Puede apreciarse que pueden elegirse otros umbrales para concluir que se ha producido un aumento en la expresión sin desviarse del ámbito de esta invención. Un análisis adicional de la expresión génica del tumor incluye el emparejamiento de aquellos genes que muestran un aumento en la expresión con los perfiles de expresión de tumores de vejiga conocidos, para proporcionar un diagnóstico de los tumores.

Uso de BTM y de UBTM para monitorizar la progresión de las terapias del TCC

Además de un diagnóstico rápido y una detección precoz del TCC, los marcadores BTM y UBTM detectados en tejido, suero u orina pueden usarse para monitorizar la respuesta de un paciente a la terapia. En estas aplicaciones pueden tomarse muestras de orina y/o de suero a unos intervalos después del inicio de la quimioterapia, de la radioterapia o de la inmunoterapia sistémica, intravesical o intravascular. Un descenso en la acumulación del marcador puede indicar una reducción en el tamaño del tumor, indicativa de un tratamiento eficaz. La tasa de descenso puede usarse para predecir las dosis terapéuticas óptimas para cada paciente o tratamiento.

Los marcadores evaluados se eligen de entre genes humanos conocidos. Los genes evaluados están indicados en las Figuras 3 y 4. En las Figuras 3 y 4 están incluidos en nombre del gen, el identificador HUGO, el número del oligo MWG, el número de la secuencia de referencia del ARNm NCBI y el número de referencia de la proteína. Las secuencias completas pueden encontrarse en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/.

Los marcadores identificados como útiles para el diagnóstico y la evaluación del cáncer de vejiga están identificados en la Figura 2 y en la Lista de Secuencias anexa a esta solicitud.

Aspectos de la divulgación

Por lo tanto, en ciertos aspectos, esta divulgación incluye métodos para la detección del cáncer de vejiga, que comprenden la detección de la acumulación de un miembro de la familia de UBTM en la orina según se define en las reivindicaciones anexas.

En otros aspectos, el miembro de la familia de UBTM no está asociado a la sangre en un grado sustancial.

En algunos aspectos adicionales, el UBTM se elige de entre el grupo mostrado en las Figuras 3 o 4.

Adicionalmente, en ciertos aspectos, la etapa de detección se realiza mediante la detección de la acumulación del ARNm del BTM o del UBTM.

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En algunos aspectos, la etapa de detección se realiza mediante el uso de una micromatriz.

En otros aspectos, la etapa de detección se realiza mediante el uso de una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa o métodos de hibridación.

En algunos aspectos adicionales, la etapa de detección se realiza mediante la detección de la acumulación de una proteína del UBTM.

En algunos aspectos adicionales más, la etapa de detección se realiza mediante la detección de la acumulación de un péptido del UBTM.

En algunos de estos aspectos, la etapa de detección se realiza mediante el uso de un anticuerpo UBTM que puede ser policlonal o monoclonal.

En algunos aspectos adicionales, un método incluye la detección de la acumulación de dos o más miembros de la familia de UBTM en dicha muestra.

En ciertos de estos aspectos adicionales, un método implica la detección de TOP2A, de MDK o de BIRC5.

Algunos aspectos adicionales más incluyen la detección de uno o más pares de marcadores elegidos de entre el grupo que consiste en TOP2A-HOXA13, TOP2A-IGFBP5 y TOP2A-SEMA3F.

En otros aspectos de esta divulgación, un método para la detección del cáncer de vejiga comprende la detección de la acumulación de una combinación de dos o más miembros de la familia de BTM elegidos de entre las Figuras 14a

o 14b en una muestra biológica de un paciente sospechoso de padecer cáncer de vejiga.

En algunos de estos aspectos, la muestra biológica se elige de entre el grupo que consiste en sangre, suero, plasma, tejido, orina, heces, líquido cefalorraquídeo y lavado peritoneal.

Algunos aspectos adicionales más incluyen anticuerpos específicos para un BTM o para un UBTM, y métodos para su producción, bien como anticuerpos policlonales o monoclonales.

En ciertos de estos aspectos puede dirigirse un anticuerpo monoclonal hacia un BTM o un UBTM y se elige del grupo mostrado en las Figuras 3 o 4.

En otro de estos aspectos, un método comprende adicionalmente otro anticuerpo dirigido contra otro BTM o UBTM.

Algunos aspectos adicionales incluyen dispositivos para la detección de un BTM, que comprenden un sustrato que tiene una combinación de reactivos de captura del BTM o del UBTM en el mismo, eligiéndose la combinación de las Figuras 14a o 14b; y un detector asociado a dicho sustrato, siendo el detector capaz de detectar dicha combinación de BTM o UBTM asociada a dichos reactivos de captura.

En ciertos de estos aspectos, un reactivo de captura comprende un oligonucleótido.

En algunos aspectos adicionales, un reactivo de captura comprende un anticuerpo.

En algunos aspectos, un BTM o un UBTM se elige del grupo especificado en las Figuras 3 o 4.

Esta divulgación también incluye un kit para la detección del cáncer, que comprende un sustrato; una combinación de, al menos, dos reactivos de captura de BTM o de UBTM en el mismo, eligiéndose la combinación de las Figuras 14a o 14b; e instrucciones para su uso.

Algunos kits incluyen reactivos de captura que son oligonucleótidos específicos para el BTM o para el UBTM, o anticuerpos específicos para el BTM.

En algunos kits, los BTM o los UBTM se eligen de entre el grupo representado en las Figuras 3 o 4.

En ciertos kits, un marcador se elige de entre el grupo que consiste en IGFBP5, MGP, SEMA3F y HOXA13.

Algunos aspectos adicionales incluyen métodos para la detección de la presencia del cáncer de vejiga, que comprenden la determinación de la presencia en una muestra de orina de uno o más marcadores elegidos de entre el grupo que consiste en BIRC2, CDC2, HOXA13, IGFBP5, MDK, MGP, NOV, NRP1, SEMA3F, SPAG5, TOP2A, y en el que dicho marcador no está sustancialmente presente en la sangre.

Otros aspectos de esta divulgación incluyen métodos para distinguir una enfermedad de vejiga maligna de una enfermedad de vejiga no maligna, que comprenden la determinación de la acumulación en dicha orina del paciente de uno o más marcadores elegidos de entre el grupo que consiste en HOXA13, IGFBP5, MDK, MGP, NRP1, SEMA3F, SMC4L1, TOP2A y UBE2C; y la determinación de las proporciones de dichos marcadores en dicha muestra, estando la proporción asociada con la presencia del cáncer de vejiga.

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mediante el uso de ensayo de tipo sándwich de inmunoadsorción enzimática (ELISA). Para los ensayos con plasma

o con suero se añade una alícuota de 5 μl de una muestra diluida apropiadamente o diluida sucesivamente de BTM estándar, y 75 μl de un anticuerpo antiBTM humano conjugado con peroxidasa a los pocillos de una placa de microtitulación. Después de un periodo de incubación de 30 minutos a 30 ºC, los pocillos se lavan con un 0,05 % de Tween 20 en solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar el anticuerpo no unido. Los complejos unidos de BTM y de anticuerpo anti-BTM se incuban entonces con o-fenilendiamina que contiene H2O2 durante 15 minutos a 30 ºC. La reacción se detiene mediante la adición de H2SO4 1 M, y se mide la absorbancia a 492 nm con un lector de placas de microtitulación. Puede apreciarse que los anticuerpos anti-BTM pueden ser anticuerpos monoclonales o antisueros policlonales.

Debido a que muchas proteínas (1) son secretadas por células, (2) son escindidas de las membranas celulares, (3) se pierden de las células tras la muerte celular, o (4) están contenidas en células descamadas, se apreciará que los BTM también pueden ser detectados en la orina. Adicionalmente, el diagnóstico del cáncer de vejiga puede ser determinado mediante la medición bien de la expresión de los BTM en una muestra, o bien de la acumulación de los BTM en una muestra. Los métodos de diagnóstico de la técnica anterior incluyen una cistoscopia, una citología y un examen de las células extraídas durante estos procedimientos. Dichos métodos se han basado en la identificación de las células tumorales en la orina o en una muestra de raspado de urotelio, o en otros casos, en especímenes de biopsias de la pared de la vejiga. Estos métodos adolecen de diversos tipos de errores, incluyendo el error en la toma de muestra, errores en la identificación entre observadores, y similares.

PCR cuantitativa en tiempo real

Una PCR en tiempo real, o cuantitativa (qPCR), se usa para la cuantificación absoluta o relativa del número de copias del molde de la PCR. Se diseñaron conjuntos de sonda y cebador de Taqman™ mediante el uso de Primer Express V 2.0™ (Applied Biosystems). Cuando fue posible se incluyeron todas las potenciales variantes de corte en el amplicón resultante, dándose preferencia en el amplicón a las regiones cubiertas por el oligonucleótido de la micromatriz derivada de MWG-Biotech. Las secuencias de cebado y de la sonda se muestran en la Figura 2. Como alternativa, si el gen diana estaba representado por un ensayo de expresión Assay-on-Demand™ (Applied Biosystems) que cubría los amplicones deseados, se usaron éstos. En los ensayos diseñados internamente se tituló la concentración del cebador mediante el uso de un protocolo de marcaje SYBR green y un ADNc creado a partir del ARN de referencia. La amplificación se llevó a cabo en un sistema de detección de secuencias ABI Prism™ 7000 en unas condiciones de ciclación estándar. Cuando se observaron productos de amplificación individuales en las curvas de disociación, se generaron las curvas estándar a lo largo de un intervalo de concentraciones de 625 veces mediante el uso de las concentraciones óptimas de cebador y sondas de fosfato de 5’FAM -3’TAMRA Taqman™ (Proligo) a una concentración final de 250 nM. Los ensayos que proporcionaban unas curvas estándar con unos coeficientes de regresión superiores a 0,98 se usaron en los ensayos posteriores.

Los ensayos pueden llevarse a cabo en dos placas de 96 pocillos con cada muestra de ARN representada por un único ADNc. Cada placa contenía una curva estándar del ADNc de referencia, a lo largo de un intervalo de concentración de 625 veces por duplicado. El análisis consistía en el cálculo de la ΔCT (CT del gen diana -CT media del ADNc de referencia). La ΔCT es directamente proporcional al log2 negativo del nº de veces de cambio. Entonces se calcularon los log2 del nº de veces de cambio con respecto a la mediana del log2 del nº de veces de cambio no maligno (log2 del nº de veces de cambio -mediana del log2 del nº de veces de cambio normal). Entonces pueden agruparse los nº de veces de cambio en clases de frecuencia y representarse gráficamente o en gráficas de caja y bigote.

Selección de los marcadores en suero y en orina para el cáncer de vejiga

Los supuestos marcadores séricos pueden seleccionarse a partir de los datos de la matriz basándose en (i) la probabilidad de que la proteína codificada sea secretada desde la célula o escindida desde la membrana; la probabilidad de secreción se basaba en el análisis con TargetP™ (Emanuelsson et al; J. Mol. Biol. 300, 1005 -1006 (2000)) y (ii) su puntuación de la suma de rangos emparejados. Sin embargo, una variación en el grado de sobreexpresión en las muestras tumorales no sólo refleja la heterogeneidad del tumor, sino también variaciones en el grado de contaminación de las muestras tumorales con tejido "normal", incluyendo células de músculo liso, de tejido conectivo y de submucosa (véase la Patente de EE.UU. 6.335.170), células estromales y epitelio no maligno. En muchas situaciones, la contaminación "normal" variaba desde el 5 hasta el 70 %, con una mediana de aproximadamente el 25 %.

Por lo tanto, hemos sido capaces de disminuir estos resultados "falsos positivos" mediante el análisis de los BTM en las muestras de orina, que están muy contaminadas por células normales de la vejiga. Además, mediante el uso de métodos de qPCR, hemos sido capaces de determinar de forma más precisa los niveles de ARNm en una muestra de orina en comparación con el uso de métodos con micromatrices, como en la técnica anterior. Por lo tanto, hemos sido capaces de evitar una contaminación importante con otros tipos celulares de la vejiga, y por lo tanto hemos evitado uno de los problemas más intratables en la materia del análisis con micromatrices de muestras clínicas.

Mediante la medición de la acumulación de marcadores en la orina, y no basándonos en la tasa de expresión en tumores, hemos encontrado inesperadamente varios BTM que son útiles en la detección del cáncer de vejiga y en la

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La media del nº de veces de cambio (tumor:tejido no maligno) para los 199 genes en el análisis del marcador del cáncer de vejiga invasivo variaban desde 1,3 hasta 5,3, y el análisis del máximo del nº de veces de cambio variaba desde 2,1 hasta 60,9. Para los análisis del cáncer de vejiga superficial, los 170 marcadores variaban desde una sobreexpresión media de desde 1,1,3 hasta 3,0, y la sobreexpresión máxima variaba desde 1,9 hasta 144. Para cada uno de los marcadores mostrados, se encontró que la significación estadística de su especificidad como marcadores del cáncer era extremadamente alta. Los valores de la prueba de la t de Student estaban todos, con pocas excepciones, por debajo de 10-3, lo que indica que el diagnóstico mediante el uso de estos marcadores está muy asociado con el cáncer de vejiga. Debería apreciarse que los nos de veces de cambio generados por los estudios con micromatrices tienden a subestimar los cambios en la expresión real observados mediante el uso de técnicas más precisas tales como una qPCR. Sin embargo, por las razones descritas en otro sitio, los análisis con micromatrices pueden adolecer de uno o más artefactos graves. Por lo tanto, hemos desarrollado un método basado en una qPCR para detectar de forma más precisa la presencia y la fase del cáncer de vejiga.

Ejemplo 2: análisis mediante qPCR

Se obtuvo una cuantificación más sensible y precisa de la expresión génica para un subconjunto de los genes mostrados en las Figuras 3 y 4 mediante el uso de una qPCR. Se analizó el ARN mensajero de hasta 30 tumores de vejiga invasivos, de 25 tumores de vejiga superficiales y de 18 muestras de urotelio normal para 18 genes identificados mediante el análisis con micromatriz (Figuras 3 y 4), estando los resultados mostrados en la Figura 5. Se muestran los datos de ambos tipos de cánceres de vejiga invasivo y superficial para los marcadores SPAG5, TOP2a, CDC2, ENG, NRP1, EGFL6, SEM2, CHGA, UBE2C, HOXA13, MDK, THY1, BIRC5 y SMC4L1. Los marcadores SEMA3F, IGFBP5, y NOV sólo estaban sobreexpresados en comparación con el urotelio normal en el tipo superficial solo, y MGP sólo estaba sobreexpresado en el tipo invasivo solo; estos marcadores mantenían una expresión similar a la del urotelio normal en las muestras tumorales que no estaban sobreexpresadas. La Figura 5 incluye el nombre del gen, los alias de gen, el símbolo del gen, la mediana del nº de veces de cambio entre tejido tumoral (T) y no maligno (N), el máximo del nº de veces de cambio entre las muestras tumorales individuales y la expresión mediana de tejido no maligno y el % de muestras tumorales con unos niveles de expresión mayores del percentil 95º de los niveles de expresión de las muestras no malignas.

La mediana del nº de veces de cambio (tejidos tumorales comparados con la mediana de la expresión en tejido no maligno) para los marcadores de la Figura 5, excepto para CHGA, variaba entre 2 y 128 veces para los tumores de vejiga invasivos, y entre 2 y 39 veces para los tumores de vejiga superficiales. El máximo del nº de veces de cambio para los tumores invasivos variaba entre 24 y 2526 veces, y para los tumores superficiales desde 6 veces hasta 619 veces. El patrón de expresión de CHGA era notable debido a que tenía una expresión muy alta en una proporción de los tumores (Fig. 6s -6t), pero una expresión indetectable en el resto. La expresión era indetectable en 15 / 25 tumores superficiales, en 15 / 29 tumores invasivos y en 9 / 10 muestras normales. La baja expresión en muestras normales descarta una cuantificación precisa del nivel de sobreexpresión en tumores como una proporción en comparación con la normal, pero cuando la acumulación del ARNm del BTM puede ser medida y cuantificada, y usada como una base para el diagnóstico del cáncer de vejiga. Para los tumores invasivos, el nivel de expresión de los genes SPAG5, TOP2A y CDC2 era mayor en los tumores que en el percentil 95º del intervalo ’normal’ para el > 90 % de los casos. Con la excepción de BIRC5, el resto de los genes de la Figura 5 que fueron examinados en tumores invasivos tenían una expresión mayor del percentil 95º de lo normal en > 45 % de las muestras. En los tumores superficiales, el nivel de expresión de los genes SPAG5, TOP2A, CDC2, ENG y NRP1 era mayor en los tumores que en el percentil 95º del intervalo no maligno para el > 80 % de los casos. Con la excepción de CHGA, UBE2C y BIRC5, el resto de los genes de la Figura 5 que fueron examinados en tumores superficiales tenían una expresión mayor del percentil 95º de lo normal en > 40 % de las muestras.

Las Figuras 6a -6af representan los histogramas que comparan la frecuencia de observación de la expresión de cada uno de una serie de 18 genes (eje vertical) y el log2 del nº de veces de cambio en la expresión para ese gen (eje horizontal), tanto para el tejido normal (barras claras) como para los tejidos tumorales superficiales o invasivos (barras oscuras). Sorprendentemente averiguamos que para cada uno de estos 18 genes, había una separación sustancial en las distribuciones de frecuencia entre el tejido normal y el tumoral. Por ejemplo, la Figura 6c representa los resultados para la expresión de TOP2a en tumores invasivos. Sólo se observaron dos muestras tumorales con un nivel de expresión en el intervalo normal.

La acumulación de 18 BTM, SPAG5, TOP2A, CDC2, ENG, IGFBP5, NOV, NRP1, SEMA3F, EGFL6, MGP, SEM2, CHGA, UBE2C, HOXA13, MDK, THY1, BIRC5 y SMC4L1, en la orina de los pacientes y de los controles (Figura 1: serie de muestras 1) se determinó mediante el uso de una qPCR sobre el ARN total extraído a partir de volúmenes iguales de orina. 17 de los BTM mostraron una mayor acumulación en la orina de los pacientes en comparación con las muestras de orina de control, siendo EGFL6 la excepción (Figura 7). La mediana del número de veces de diferencia para los 17 BTM variaba entre 2 veces y 265 veces. La diferencia máxima entre la muestra de un único paciente y el nivel mediano en los controles variaba entre 26 veces y > 10.000 veces.

La Figura 8 muestra las diferencias en la acumulación del BTM transcrito para 13 BTM representadas como gráficas de caja y bigote, y estandarizada a la expresión mediana en las muestras de control. La Figura 8 muestra que MDK, SEMA3F y TOP2A no se solapan en la orina de los pacientes con cáncer y de los controles. Adicionalmente, los altos niveles de acumulación de los transcritos para IGFBP5, HOXA13, MGP, NRP1, SMC4L1, SPAG4 y UBE2C

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están casi siempre asociados con el cáncer de vejiga. Para el resto de los BTM representados en la Figura 8, BIRC5, NOV y CDC2, su expresión en la orina de los pacientes con cáncer de vejiga está aumentada en al menos aproximadamente 3 veces en comparación con las muestras de control normales.

El principal síntoma clínico que provoca la realización del ensayo para comprobar la presencia de cáncer de vejiga es la hematuria (es decir, la presencia de niveles macroscópicos o microscópicos de sangre en la orina). La sangre se detecta normalmente visualmente o mediante la detección química de la hemoglobina mediante el uso de tiras reactivas de orina. Sólo aproximadamente el 15 % y el 4 % de los casos de hematuria macroscópica y microscópica, respectivamente, están asociados con el cáncer de vejiga. Consecuentemente, para que un ensayo de cáncer de vejiga tenga una elevada especificidad, es importante que los niveles de expresión del marcador en la sangre completa sean bajos, o en algunos casos, indetectables. Por lo tanto, para mejorar la identificación de los marcadores que tienen una alta especificidad, se determinó la expresión de entre doce y trece marcadores de la Figura 8 en ARN sanguíneo mediante el uso de una qPCR. La qPCR se realizó sobre 5 μg de ARN total extraído de sangre y de tejido tumoral de vejiga mediante el uso de los cebadores y las sondas descritos en la Figura 2. La Figura 9 muestra el número de ciclos por encima del fondo para cada uno de los marcadores. Para los marcadores MGP, IGFBP5, SEMA3F y HoxA13, no pudieron detectarse los transcritos en sangre, pero los marcadores SMC4L1 y UBE2c, en particular, se expresaban en la sangre. Apreciamos que los datos, que mostraban el número de ciclos de la PCR, son inherentemente una gráfica en log2, por lo que un aumento de 1 en el número de ciclos indica una duplicación de la señal. Por lo tanto, en la evaluación de las diferencias entre la presencia del marcador en tejido tumoral y en sangre, una diferencia de dos (2) ciclos indica una diferencia en la expresión de 4 veces. De forma análoga, una diferencia de 5 ciclos (por ejemplo, para TOP2A) indica una diferencia de 25, o de 32 veces. Otros marcadores tales como TOP2A y MDK tienen una expresión en sangre detectable, pero siguen siendo unos marcadores razonables debido a la gran diferencia entre la expresión en sangre y la expresión en los tumores de vejiga.

Para examinar adicionalmente la expresión diferencial de un marcador entre la sangre y los tumores de vejiga, y para refinar la selección de los marcadores en orina del cáncer de vejiga, se seleccionaron nueve marcadores para un análisis adicional mediante el uso del ARN de la orina de 20 pacientes adicionales, 13 controles normales y 26 controles no malignos (Figura 1: serie de muestras 2). Los controles no malignos incluían 20 muestras bien con sangre oculta o bien con glóbulos blancos detectados en la orina mediante una citología. Los nueve marcadores mostraron una diferenciación entre las muestras de los controles y las de los pacientes con cáncer, con una sobrerrepresentación de la mediana del log2 en las muestras de los pacientes con cáncer que variaba entre 5,4 y 10,4, y entre 4,0 y 10,1 en comparación con las muestras sanas y las muestras no malignas, respectivamente (Figura 10). Las gráficas de cajas y bigotes que ilustran estos datos se muestran en la Figura 11.

Como se predijo por los datos de la qPCR sanguínea, los marcadores UBE2C y SMC4L1 mostraron unos notables aumentos en la acumulación en la orina de los controles no malignos en comparación con los controles sanos. El NRP1 también estaba significativamente elevado en las muestras de orina de las muestras no malignas en comparación con las muestras de orina de los controles sanos, y mostró un solapamiento considerable entre las muestras de los pacientes con cáncer y las muestras de los pacientes no malignos, TOP2A y MDK también mostraron aumentos, pero debido a su expresión muy alta en las células de TCC, mantuvieron una fuerte diferencia entre la acumulación del ARN en las muestras de orina de los pacientes no malignos y la de los pacientes con cáncer. Por el contrario, HOXA13, IGFBP5, SEMA3F y MGP sólo mostraron unos pequeños aumentos en las muestras de orina no maligna en comparación con las muestras de los controles sanos.

Globalmente, seis marcadores (SEMA3F, HOXA13, MDK, IGFBP5, MGP y TOP2A) mostraron un solapamiento mínimo entre las muestras de los pacientes con cáncer y los controles no malignos. El resto de los tres marcadores (NRP1, UBE2C, SMC4L1) mostró un aumento significativo en un subconjunto de los controles no malignos y un solapamiento con las muestras de los pacientes con cáncer. El aumento en la acumulación de los marcadores de ARN en la orina de los controles no malignos en comparación con los controles sanos es coherente con la expresión de estos marcadores en las células de origen hematopoyético o endotelial que están presentes en la orina de los pacientes con una enfermedad no maligna. Por lo tanto, el uso de marcadores individuales para el diagnóstico del cáncer de vejiga mediante el uso de muestras de orina muestra un aumento en la sensibilidad y en la especificidad en comparación con los métodos de la técnica anterior, que no tienen en cuenta la expresión del marcador en sangre. Este resultado era completamente inesperado basándose en la técnica anterior.

Los datos ilustran el sorprendente hallazgo de que la utilidad del uso de los marcadores en orina para el cáncer de vejiga que muestra una elevada sensibilidad y especificidad no puede ser predicha de forma precisa mediante el uso de un análisis con micromatriz de los datos de la expresión génica tumoral solos. Es necesario tener en cuenta la expresión de posibles marcadores en células de origen hematopoyético y/o endotelial. Esto puede conseguirse mediante: (i) un análisis mediante una qPCR del ARN sanguíneo, (ii) un análisis de las bases de datos de la expresión (por ejemplo, genotecas EST de ARN sanguíneo de células vasculares / endoteliales) y/o (iii) un análisis mediante una qPCR del ARN extraído a partir de orina no fraccionada.

Sensibilidad y especificidad

Tomando como base las dos series de muestras analizadas y divulgadas en el presente documento, la sensibilidad

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para la detección del cáncer de vejiga excede el 95 %. La especificidad en la serie 2, que incluía las muestras de pacientes con una enfermedad no maligna, también excede el 95 %.

Ejemplo 3: uso de múltiples marcadores en la detección del cáncer de vejiga

Las Figuras 12a -12b representan histogramas del número de genes que muestran una expresión significativamente aumentada ("sobreexpresión") en muestras tumorales individuales en comparación con las muestras normales. Los histogramas se basaban en los datos de la qPCR obtenidos de los doce primeros marcadores mostrados en la Figura 5. De los 30 tumores invasivos en el análisis de la PCR, 27 (el 90 %) sobreexpresaban al menos cuatro genes por encima del percentil 95º (Figura 12a). De los 25 tumores superficiales del análisis, 23 (92 %) sobreexpresaban al menos cuatro genes por encima del percentil 95º (Figura 12b). Estos hallazgos indican que, en las situaciones en las que hay múltiples genes sobreexpresados con respecto al tejido normal, la fiabilidad de la detección del cáncer puede ser muy alta, haciendo que el diagnóstico del cáncer sea más inequívoco. Sin embargo, en algunos casos, la elevación de la expresión de un único gen marcador es suficiente para dar lugar a un diagnóstico de cáncer.

La fiabilidad de la discriminación con éxito entre muestras tumorales y no tumorales mediante el uso de combinaciones de marcadores se ilustra adicionalmente mediante el análisis estadístico representado en la Figura

13. Este análisis comparaba las distribuciones normales de los datos de la expresión génica de la qPCR de muestras tumorales y no malignas. Los datos de la qPCR se han resumido en la Figura 5. El análisis muestra el efecto del aumento del número de marcadores usados para discriminar entre muestras tumorales y no malignas sobre la sensibilidad del ensayo (con una especificidad fija del 95 %). Aunque pocos de los 18 marcadores tienen una sensibilidad de más del 90, del 95 o del 99 % cuando se usan solos en este análisis, la combinación de dos o tres marcadores permitió alcanzar una elevada sensibilidad con grandes cifras, de combinaciones de dos o tres marcadores (Figuras 14a y 14b).

Las Figuras 14a y 14b muestran la sensibilidad de los marcadores y las combinaciones de marcadores específicas para la detección del carcinoma de células de transición invasivo y superficial (TCC), cuando la especificidad se ha fijado en el 95 %. Únicamente se han mostrado las combinaciones con una sensibilidad de > 90 %. De los 15 marcadores mostrados en la Figura 14a, el cáncer de vejiga invasivo puede ser detectado con una sensibilidad de aproximadamente el 95 % para TOP2A, SPAG5 y CDC2 de forma individual. Otros marcadores mostrados tienen una sensibilidad menor cuando se usan de forma individual.

Sin embargo, las combinaciones de dos de los anteriores marcadores mejoraron drásticamente la sensibilidad de la detección del cáncer de vejiga invasivo (Figura 13a y Figura 14a). Una sensibilidad mayor del 95 % puede conseguirse mediante el uso de 13 de las 105 combinaciones de dos marcadores. De hecho, mediante el uso de dos marcadores se obtiene una sensibilidad mínima del 90 % en 42 de las 105 combinaciones de marcadores.

Para el cáncer de vejiga superficial (Figura 13b y Figura 14b), no puede conseguirse una sensibilidad mayor del 90 % con ninguno de los marcadores de forma individual, sin embargo, este umbral se alcanzó con 11 de las 136 combinaciones de dos marcadores. Una sensibilidad del > 95 % se alcanzó con 22 combinaciones de tres marcadores.

El uso de combinaciones de marcadores también puede mejorar drásticamente la sensibilidad de la detección del cáncer de vejiga mediante el uso de muestras de orina. Las Figuras15 y 16 muestran la sensibilidad de la detección de los marcadores individuales y de las combinaciones de marcadores mediante el uso de los datos de la qPCR de la orina.

Como se observa en la Figura 16, aunque únicamente el IGFBP5 solo tenía una sensibilidad del > 95 %, ocho combinaciones de dos marcadores y 37 combinaciones de tres marcadores alcanzaron este umbral.

Ejemplo 4: acumulación diferencial de transcritos en pacientes con cáncer de vejiga superficial e invasivo

A partir de la Figura 5 puede observarse que varios BTM, incluyendo SEMA3F, HOXA13, TOP2A y SPAG5, muestran una expresión diferencial entre los cánceres de vejiga invasivos y los cánceres de vejiga superficiales. Para ampliar esta observación se comparó la acumulación de estos transcritos en la orina de pacientes con cáncer de vejiga invasivo y superficial.

Se extrajo ARN a partir de volúmenes iguales de orina procedentes de los pacientes descritos en la Figura 1 y se determinó la acumulación de los BTM mediante una qPCR. La acumulación de las combinaciones específicas de BTM se expresó entonces en forma de proporciones. Las combinaciones de BTM consistían en un BTM con una mayor sobreexpresión en los tumores de vejiga invasivos en comparación con los tumores de vejiga superficiales, y un BTM con una mayor sobreexpresión en los tumores superficiales en comparación con los tumores invasivos.

La Figura 17 muestra una combinación de tres marcadores analizados en muestras de orina de 20 pacientes con TCC superficial y 14 con invasivo. Las tres combinaciones mostradas son: (i) TOP2A y HOXA13, (ii) TOP2A e IGFBP5, y (iii) TOP2A y SEMA3F. Puede observarse que estas combinaciones de marcadores son capaces de diferenciar entre las muestras de orina de los pacientes con un TCC superficial y con uno invasivo. Otros

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marcadores de la Figura 5 que muestran una diferencia en la expresión entre los tipos superficial e invasivo de TCC también son capaces de determinar el tipo de TCC, basándose en el análisis de una muestra de orina.

Además, la Figura 18 muestra que el uso de la combinación de dos marcadores que incluyen TOP2A puede usarse para distinguir entre el cáncer de vejiga invasivo en fase 1 -2 y los tumores en fase 3.

Estas observaciones muestran que la determinación de la acumulación de varios transcritos de BTM en la orina permite la distinción entre las formas invasiva y superficial del cáncer de vejiga. Lo que es más, las proporciones de los BTM determinadas mediante una qPCR de las muestras de orina de pacientes con cáncer de vejiga permite una diferenciación más potente entre los tipos invasivo y superficial que los mismos análisis realizados sobre el ARN tumoral. Esto está ilustrado en la Figura 19, que muestra una representación de cajas y bigotes para: (i) TOP2A y HOXA13, (ii) TOP2A y IGFBP5, y (iii) TOP2A y SEMA3F, mediante el uso de los datos de la qPCR de aproximadamente 23 preparaciones de ARN tumoral de vejiga superficial y 28 de invasivo; aunque las proporciones de estos BTM todavía permiten una distinción entre los tipos superficial e invasivo del cáncer de vejiga, existe un mayor solapamiento entre las proporciones del superficial y del invasivo. Este hallazgo puede reflejar la contaminación de las preparaciones de ARN tumoral con tipos celulares tales como muscular y fibroblastos, que no tienen la misma proporción de BTM que las células malignas. Como alternativa, puede reflejar una expresión diferencial más potente de los BTM en las células malignas, que están descamadas en la orina, que aquellas células que permanecen en el cuerpo del tumor. Independientemente de la razón de esta observación, hemos concluido que la detección de la acumulación de los BTM en la orina presenta unas ventajas sustanciales sobre los análisis convencionales con micromatriz de muestras de tejido.

Ejemplo 5: anticuerpos contra los marcadores tumorales de vejiga

En algunos aspectos adicionales, esta divulgación incluye la elaboración de anticuerpos contra los BTM. Mediante el uso de los métodos descritos en el presente documento, pueden identificarse nuevos BTM mediante el uso de un análisis con micromatriz y/o de una qPCR. Una vez identificado un supuesto marcador, puede ser producido en una cantidad suficiente para que sea adecuado para desencadenar una respuesta inmunitaria. En algunos casos puede usarse un BTM completo, y en otros puede ser suficiente un fragmento peptídico de un BTM como inmunógeno. El inmunógeno puede ser inyectado en un hospedador adecuado (por ejemplo, un ratón, un conejo, etc.) y si se desea, puede inyectarse un coadyuvante, tal como el coadyuvante completo de Freund, el coadyuvante incompleto de Freund, para aumentar la respuesta inmunitaria. Puede apreciarse que la elaboración de anticuerpos es rutinaria en las técnicas inmunológicas y no necesita ser descrita adicionalmente en el presente documento. Como resultado pueden producirse anticuerpos contra los BTM o los UBTM identificados mediante el uso de los métodos descritos en el presente documento.

En algunas formas de realización adicionales más, pueden elaborarse anticuerpos contra la proteína o el núcleo de la proteína de los marcadores tumorales identificados en el presente documento, o contra una secuencia oligonucleotídica única de un BTM. Aunque algunas proteínas pueden estar glucosiladas, las variaciones en el patrón de glucosilación pueden dar lugar, en ciertas circunstancias, a una incorrecta detección de las formas de los BTM que carezcan de los patrones de glucosilación habituales. Por lo tanto, en algunos aspectos de esta invención, los inmunógenos de BTM pueden incluir BTM desglucosilados o fragmentos de BTM desglucosilados. La desglucosilación puede llevarse a cabo mediante el uso de una o más glucosidasas conocidas en la materia. Como alternativa, puede expresarse el ADNc del BTM en líneas celulares deficientes en glucosilación, tales como líneas celulares procariotas, incluyendo E. coli y similares.

Pueden elaborarse vectores con oligonucleótidos que codifican el BTM en los mismos. Muchos de dichos vectores pueden basarse en los vectores habituales conocidos en la materia. Los vectores pueden usarse para transfectar diversas líneas celulares para producir líneas celulares productoras de BTM, que pueden usarse para producir las cantidades deseadas de BTM para el desarrollo de anticuerpos específicos o de otros reactivos para la detección de los BTM o para el desarrollo de ensayos estandarizados para los BTM o los UBTM.

Ejemplo 6: kits

Tomando como base los descubrimientos de esta divulgación pueden contemplarse y producirse varios tipos de kits de ensayo. En primer lugar pueden elaborarse kits que tienen un dispositivo de detección precargado con una molécula de detección (o "reactivo de captura"). En las formas de realización para la detección del ARNm de los BTM, dichos dispositivos pueden comprender un sustrato (por ejemplo, vidrio, sílice, cuarzo, metal, etc.) sobre el que se unen los oligonucleótidos como reactivos de captura que hibridan con el ARNm que se va a detectar. En algunas formas de realización, puede realizarse la detección directa del ARNm mediante la hibridación del ARNm (marcado con cy3, cy5, radiomarcado o con otro marcaje) con los oligonucleótidos del sustrato. En otras formas de realización, la detección del ARNm puede realizarse creando en primer lugar un ADN complementario (ADNc) del ARNm deseado. Después puede hibridarse el ADNc marcado con los oligonucleótidos del sustrato, y ser detectado.

Independientemente del método de detección empleado, es deseable la comparación de la expresión del BTM del ensayo con una medición estándar. Por ejemplo, puede estandarizarse la expresión del ARN al ADN celular total, a la expresión de los ARN expresados constitutivamente (por ejemplo, ARN ribosómico) o a otros marcadores

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Claims (1)

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