ES2653646T3

ES2653646T3 - Diagnóstico para cáncer colorrectal

Info

Publication number: ES2653646T3
Application number: ES14178981.8T
Authority: ES
Inventors: Leah Jane Cosgrove; Bruce Tabor; Antony Wilks Burgess; Edouard Collins Nice
Original assignee: Vision Tech Bio Pty Ltd
Current assignee: Vision Tech Bio Pty Ltd
Priority date: 2010-07-14
Filing date: 2011-07-14
Publication date: 2018-02-08
Anticipated expiration: 2031-07-14
Also published as: JP2013533977A; EP2829881B1; EP2593795A1; US10877039B2; EP2829881A2; BR112013000745B1; CN103140760A; CN103140760B; PT2829881T; AU2011279555A1; BR112013000745A2; CN105755112A; DK2829881T3; NO2829881T3; EP2829881A3; CN105755112B; IN2013CN01129A; JP6061344B2; RU2013103995A; WO2012006681A1

Abstract

Un procedimiento para el diagnóstico o detección del cáncer colorrectal en un sujeto, comprendiendo el procedimiento: i) la determinación de la presencia y/o el nivel de tres biomarcadores, donde los tres biomarcadores son: (a) DKK-3 (dickkopf homólogo 3), M2PK (piruvato cinasa muscular 2), y IGFBP2 (factor de crecimiento similar a la insulina que fija la proteína-2); (b) M2PK, IGFBP2, y EpCAM (molécula de adhesión celular epitelial), (c) M2PK, IGFBP2 y IL-13 (interleucina-13); o (d) M2PK, IGFBP2 y IL-8 (interleucina-8) en una muestra del sujeto, donde la presencia y/o el nivel de tres biomarcadores es indicativo de cáncer colorrectal.

Description

DESCRIPCIÓN

Diagnóstico para cáncer colorrectal 5 CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a la determinación de la presencia y/o el nivel de biomarcadores para detectar o diagnosticar el cáncer colorrectal. La invención también se refiere a los kits de diagnóstico que comprenden reactivos para determinar la presencia y/o el nivel de biomarcadores y los procedimientos de detección o diagnóstico 10 del cáncer colorrectal.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El cáncer colorrectal, también conocido como cáncer de colon o cáncer de intestino, es la segunda causa más 15 común de cáncer en todo el mundo. Hay una incidencia anual de casi un millón de casos de cáncer colorrectal con una mortalidad anual aproximada de 500.000 (Cancer in Australia: an overview, 2008). Desafortunadamente, el 3050 % de los pacientes tiene metástasis oculta o manifiesta en la presentación y una vez que los tumores se han metastatizado, el pronóstico es muy pobre con cinco años de supervivencia de menos del 10 % (Etzioni y cols., 2003). Por el contrario, más del 90 % de los pacientes que se presentan mientras el tumor sigue localizado seguirán 20 estando vivos después de 5 años y se pueden considerar curados. La detección temprana de las lesiones colorrectales reduciría, por lo tanto, significativamente el impacto del cáncer de colon (Etzioni y cols. 2003).

Los ensayos de diagnóstico precoz actuales en el uso generalizado para el diagnóstico de cáncer colorrectal son la prueba de sangre oculta en las heces (FOBT, por sus siglas en inglés), la sigmoidoscopia flexible y la colonoscopia 25 (Lieberman, 2010). La FOBT tiene relativamente baja especificidad lo que resulta en una tasa alta de falsos positivos. Se debe, por lo tanto, realizar un seguimiento de todos los FOBT positivos con una colonoscopia. El muestreo se realiza por individuos en casa y requiere al menos analizar dos muestras fecales para lograr una óptima sensibilidad. Algunas versiones de la FOBT requieren también restricciones dietéticas antes de realizar el muestreo. La FOBT carece también de sensibilidad en la etapa temprana de las lesiones cancerosas que no sangran en el 30 intestino y, como se establece anteriormente, estas son las lesiones para las que el tratamiento tiene más éxito.

Mientras que el diagnóstico precoz de la FOBT no resulta en la reducción de la mortalidad debido a que el cáncer colorrectal experimenta una tasa baja de cumplimiento (30-40 %), muy probablemente debido a la naturaleza desagradable de la prueba, lo cual limita su utilidad como una herramienta de diagnóstico precoz. La colonoscopia 35 es el estándar de oro actual y tiene una especificidad mayor al 90 % pero es intrusiva y costosa con un riesgo pequeño pero definido de complicaciones (2,1 por cada 1000 intervenciones) (Levin, 2004). El desarrollo de un ensayo barato basado en sangre rápido y específico superaría los problemas de cumplimiento comúnmente vistos con otras pruebas de diagnóstico precoz (Tonus, 2006; Hundt y cols., 2007) y resultaría más aceptable como parte de un ensayo de diagnóstico precoz.

40

El documento WO2008/138522 divulga un procedimiento para el diagnóstico de cáncer colorrectal en muestras de heces basado en la detección de TIMP-1. La sensibilidad y especificidad de esta prueba diagnóstica no son sin embargo óptimas.

45 RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Los autores de la presente invención investigaron más de sesenta biomarcadores asociados con el cáncer colorrectal, pero encontraron que ninguno de los biomarcadores en solitario era adecuado como prueba de diagnóstico. Sorprendentemente, se ha descubierto que la determinación de la presencia y/o el nivel de al menos 50 tres biomarcadores asociados con el cáncer colorrectal en una muestra de un sujeto permitió la detección o diagnóstico del cáncer colorrectal en cualquiera de las etapas de la enfermedad, donde los tres biomarcadores son

(a) DKK-3, M2PK, y IGFBP2, (b) M2PK, IGFBP2 y EpCAM, (c) M2PK, IGFBP2 y IL-13, o (d) M2PK, IGFBP2 y IL-8. Determinar la presencia y/o el nivel de al menos tres biomarcadores (a), (b), (c) o (d) proporciona ventajosamente una prueba de diagnóstico que es al menos comparable en la sensibilidad y especificidad a la FOBT.

55

En consecuencia, en un aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para el diagnóstico o detección del cáncer colorrectal en un sujeto, comprendiendo el procedimiento:

i) la determinación de la presencia y/o el nivel de tres biomarcadores, donde los tres biomarcadores son:

(a) DKK-3 (dickkopf homólogo 3), M2PK (piruvato cinasa muscular 2), y IGFBP2 ( factor de crecimiento similar a la insulina que fija la proteína-2);

(b) M2PK, IgFbP2, y EpCAM (molécula de adhesión celular epitelial),

(c) M2PK, IGFBP2 y IL-13 (interleucina-13); o 5 (d) M2PK, IGFBP2 y IL-8 (interleucina-8)

en una muestra del sujeto,

donde la presencia y/o el nivel de tres biomarcadores es indicativo de cáncer colorrectal.

10 La descripción también divulga un procedimiento para el diagnóstico o detección del cáncer colorrectal en un sujeto, comprendiendo el procedimiento:

i) la determinación de la presencia y/o el nivel de al menos dos biomarcadores seleccionados de entre IL-8, IGFBP2, MAC2BP, M2PK, IL-13, DKK-3, EpCam, MIP1p, TGFp1, y TIMP-1 en una muestra del sujeto,

15

donde la presencia y/o el nivel de dos biomarcadores es indicativo de cáncer colorrectal.

En un aspecto de esta divulgación, el procedimiento comprende la determinación de la presencia y/o el nivel de dos biomarcadores seleccionados de entre M2PK, EpCam, IL-13, DKK-3, IL-8 y IGFBP2.

20

En otro aspecto de esta divulgación, el procedimiento comprende la determinación de la presencia y/o el nivel de la expresión de al menos tres de los biomarcadores.

En un aspecto de esta divulgación, los tres biomarcadores se seleccionan de entre M2PK, EpCam, IL-13, DKK-3, IL- 25 8, IGFBP2, MIP1 p, TGFp1 y MAC2BP.

En una forma de realización particular, el procedimiento comprende la determinación de la presencia y/o el nivel de tres biomarcadores, donde los tres biomarcadores son:

30 i) DKK-3, M2PK, y IGFBP2; o

ii) M2PK, IGFBP2, y EpCAM;

En otra forma de realización, el procedimiento comprende la determinación de la presencia y/o el nivel de la expresión de al menos cuatro de los biomarcadores.

35

En una forma de realización particular, el procedimiento comprende la determinación de la presencia y/o el nivel de cuatro biomarcadores, donde los cuatro biomarcadores son:

i) DKK-3, M2PK, MAC2BP, y IGFBP2;

40 (ii) DKK3-, M2PK, IL-8 y IGFBP2;

(iii) DKK-3, M2PK, IL-13 y IGFBP2;

(iv) DKK-3, M2PK, IGFBP2 y EpCAM;

(v) DKK-3, M2PK, MIP1beta y IGFBP2;

(vi) DKK-3, M2PK, TGFbeta1 y IGFBP2;

45 (vii) DKK-3, M2PK, IGFBP2 y TIMP1;

(viii) M2PK, Mac2BP, IGFBP2 y EpCAM;

(ix) M2PK, MIP1beta, IL-13, y IGFBP2;

(x) M2PK, IL-13, Mac2BP, IGFBP2;

(xi) M2PK, IL-13, IGFBP2, EpCAM;

50 (xii) M2PK, IL-8, IL-13 y IGFBP2;

(xiii) M2PK, IL-8, MAC2BP, IGFBP2;

(xiv) M2PK, IL-8, IGFBP2, EpCAM;

(xv) M2PK, IL-13, TGFbeta1 y IGFBP2;

(xvi) M2PK, IL-13, IGFBP2 y TIMP1;

55 (xvii) M2PK, TGFbeta1, IGFBP2 y EpCAM;

(xviii) M2PK, MIP1beta, IGFBP2 y EpCAM; o

(xix) M2PK, IGFBP2, TIMP1 y EpCAM.

En otra forma de realización más, el procedimiento comprende la determinación de la presencia y/o el nivel de la 60 expresión de al menos cinco de los biomarcadores.

En una forma de realización particular, los cinco biomarcadores son

(i) M2PK, TGFbetal, Mac2BP, IGFBP2 y EpCAM;

5 (ii) DKK-3, M2PK, MIP1beta, IGFBP2 y EpCAM;

(iii) DKK-3, M2PK, IL-8, IGFBP2 y EpCAM;

(iv) DKK-3, M2PK, TGFbeta1, Mac2BP y IGFBP2;

(v) M2PK, MIP1beta, Mac2BP, IGFBP2 y EpCAM;

(vi) DKK-3, M2PK, Mac2BP, IGFBP2 y EpCAM;

10 (vii) DKK-3, M2PK, IL-8, IL-13 y IGFBP2;

(viii) DKK-3, M2PK, IL-13, TGFbeta1 y IGFBP2;

(ix) DKK-3, M2PK, IL-13, IGFBP2 y EpCAM;

(x) M2PK, IL-13, Mac2BP, IGFBP2 y EpCAM;

(xi) M2PK, IL-8, IL-13, TGFbeta1 y IGFBP2;

15 (xii) M2PK, IL-8, TGFbeta1, Mac2BP y IGFBP2;

(xiii) DKK-3, M2PK, MIP1beta, IL-8 y IGFBP2;

(xiv) DKK-3, M2PK, MIP1beta, Mac2BP y IGFBP2;

(xv) M2PK, IL-8, IL-13, IGFBP2 y EpCAM;

(xvi) M2PK, IL-8, Mac2BP, IGFBP2 y EpCAM;

20 (xvii) DKK-3, M2PK, IGFBP2, TIMP1 y EpCAM;

(xviii) M2PK, MIP1beta, IL-13, IGFBP2 y EpCAM;

(xix) M2PK, IL-13, TGFbeta1, Mac2BP y IGFBP2;

(xx) M2PK, IL-13, TGFbeta1, IGFBP2 y EpCAM;

(xxi) DKK-3, M2PK, IL-8, TGFbeta1 y IGFBP2;

25 (xxii) DKK-3, M2PK, IL-8, Mac2BP y IGFBP2;

(xxiii) M2PK, IL-8, IL-13, IGFBP2 y TIMP1;

(xxiv) M2PK, IL-13, IGFBP2, TIMP1, EpCAM; o

(xxv) DKK-3, M2PK, MIP1beta, IL-13 y IGFBP2.

30 En otra forma de realización, el procedimiento comprende la determinación de la presencia y/o el nivel de la expresión de al menos seis de los biomarcadores.

En otra forma de realización, el procedimiento comprende la determinación de la presencia y/o el nivel de la expresión de al menos siete de los biomarcadores.

35

En una forma de realización particular, los siete biomarcadores son:

(i) DKK-3, M2PK, IL-8, Mac2BP, IGFBP2, TIMP1 y EpCAM;

(ii) DKK-3, M2PK, MIP1beta, IL-8, Mac2BP, IGFBP2 y EpCAM;

40 (iii) DKK-3, M2PK, IL-8, IL-13, Mac2BP, IGFBP2 y TIMP1;

(iv) DKK-3, M2PK, IL-8, TGFbeta1, Mac2BP, IGFBP2 y TIMP1;

(v) DKK-3, M2PK, IL-8, TGFbeta1, Mac2BP, IGFBP2 y EpCAM;

(vi) DKK-3, M2PK, MIP1beta, IL-8, Mac2BP, IGFBP2 y TIMP1;

(vii) DKK-3, M2PK, IL-8, IL-13, Mac2BP, IGFBP2 y EpCAM;

45 (viii) IL-8, IGFBP2, MAC2BP, M2PK, IL-13, DKK-3, y TGF p1;

(ix) M2PK, MIP1beta, IL-8, Mac2BP, IGFBP2, TIMP1 y EpCAM;

(x) DKK-3, M2PK, MIP1beta, IL-8, IL-13, Mac2BP y IGFBP2;

(xi) DKK-3, M2PK, MIP1beta, IL-8, TGFbeta1, Mac2BP y IGFBP2;

(xii) DKK-3, M2PK, MIP1beta, TGFbeta1, Mac2BP, IGFBP2 y TIMP1;

50 (xiii) DKK-3, M2PK, IL-8, IL-13, TGFbeta1, IGFBP2 y TIMP1;

(xiv) DKK-3, M2PK, IL-8, TGFbeta1, IGFBP2, TIMP1 y EpCAM;

(xv) DKK-3, M2PK, IL-13, TGFbeta1, Mac2BP, IGFBP2, y TIMP1;

(xvi) M2PK, MIP1beta, IL-8, IL-13, IGFBP2, TIMP1 y EpCAM;

(xvii) DKK-3, M2PK, MIP1beta, IL-8, TGFbeta1, IGFBP2, y EpCAM;

55 (xviii) DKK-3, M2PK, MIP1beta, IL-13, TGFbeta1, Mac2BP, y IGFBP2;

(xix) M2PK, MIP1beta, IL-8, TGFbeta1, Mac2BP, IGFBP2 y EpCAM;

(xx) DKK-3, M2PK, MIP1beta, IL-8, IGFBP2, TIMP1 y EpCAM;

(xxi) DKK-3, M2PK, MIP1beta, IL-13, Mac2BP, IGFBP2 y TIMP1;

(xxii) DKK3, MIP1bet IL8, IL13, Mac2BP, IGFBP2 y TIMP1,

60 (xxiii) M2PK, MIP1beta, IL-8, IL-13, Mac2BP, IGFBP2 y TIMP1;

(xxiv) M2PK, IL-8, TGFbetal, Mac2BP, IGFBP2, TIMP1 y EpCAM;

(xxv) DKK-3, M2PK, IL-8, IL-13, TGFbeta1, IGFBP2 y EpCAM;

(xxvi) DKK-3, M2PK, IL-13, TGFbeta1, Mac2BP, IGFBP2 y EpCAM; o

(xxvii) IL-8, IGFBP2, MAC2BP, M2PK, IL-13, EpCam, y MIP1p.

5

En otra forma de realización más, el procedimiento comprende la determinación de la presencia y/o el nivel de la expresión de al menos ocho de los biomarcadores.

En una forma de realización, el procedimiento comprende la determinación de la presencia y/o el nivel de al menos 10 nueve de los biomarcadores. En una forma de realización, los nueve biomarcadores son:

(i) DKK-3, M2PK, MIP1beta, IL-8, IL-13, TGFbeta1, Mac2BP, IGFBP2 y TIMP1;

(ii) DKK-3, M2PK, MIP1beta, IL-8, IL-13, TGFbeta1, Mac2BP, IGFBP2 y EpCAM;

(iii) DKK-3, M2PK, MIP1beta, IL-8, IL-13, TGFbeta1, IGFBP2, TIMP1 y EpCAM;

15 (iv) DKK-3, M2PK, MIP1beta, IL-8, IL-13, Mac2BP, IGFBP2, TIMP1 y EpCAM;

(v) DKK-3, M2PK, MIP1beta, IL-8, TGFbeta1, Mac2BP, IGFBP2, TIMP1 y EpCAM;

(vi) DKK-3, M2PK, MIP1beta, IL-13, TGFbeta1, Mac2BP, IGFBP2, TIMP1 y EpCAM;

(vii) DKK-3, M2PK, IL-8, IL-13, TGFbeta1, Mac2BP, IGFBP2, TIMP1 y EpCAM; o

(viii) M2PK, MIP1beta, IL-8, IL-13, TGFbeta1, Mac2BP, IGFBP2, TIMP1 y EpCAM.

20

En otra forma de realización más, el procedimiento comprende la determinación de la presencia y/o el nivel de al menos diez de los biomarcadores. En una forma de realización, los diez biomarcadores son DKK-3, M2PK, MIP1beta, IL-8, IL-13, TGFbeta1, Mac2BP, IGFBP2, TIMP1 y EpCAM.

25 En otro aspecto de la divulgación, el procedimiento comprende la determinación de la presencia y/o el nivel de una combinación de biomarcadores según cualquiera de las tablas de la 7 a la 18.

En otra forma de realización, el procedimiento comprende la detección de la presencia y/o el nivel de al menos un biomarcador adicional seleccionado de entre IGF-I, IGF-II, IGF-BP2, Anfirregulina, VEGfA, VEGFD, MMP-1, MMP-2, 30 MMP-3, MMP-7, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2, ENA-78, MCP-1, MIP-1 p, IFN-y, IL-10, IL-13, IL-1p, IL-4, IL-8, IL-6, MAC2BP, piruvato cinasa M2 tumoral, M65, OPN, DKK-3, EpCam, TGFp-1, y VEGFpan.

En otra forma de realización, el procedimiento diagnostica o detecta el cáncer colorrectal con una sensibilidad de al menos el 66 %.

35

En otra forma de realización más, el procedimiento diagnostica o detecta el cáncer colorrectal con una sensibilidad de al menos el 77 %.

En una forma de realización, el procedimiento diagnostica o detecta el cáncer colorrectal con una especificidad de al 40 menos el 75 %.

En una forma de realización, el procedimiento diagnostica o detecta el cáncer colorrectal con una especificidad de al menos el 80 %.

45 En otra forma de realización, el procedimiento diagnostica o detecta el cáncer colorrectal con una especificidad de al menos el 90 %.

En otra forma de realización más, el procedimiento diagnostica o detecta el cáncer colorrectal con una especificidad de al menos el 95 %.

50

En otra forma de realización, el procedimiento diagnostica o detecta el cáncer colorrectal en etapa A de Dukes con una sensibilidad de al menos el 50 % y una especificidad de al menos el 95 %.

En otra forma de realización más, el procedimiento diagnostica o detecta el cáncer colorrectal en etapa A de Dukes 55 con una sensibilidad de al menos el 60 % y una especificidad de al menos el 80 %.

En otra forma de realización, el procedimiento diagnostica o detecta el cáncer colorrectal en etapa A de Dukes con una sensibilidad de al menos el 50 % y una especificidad de al menos el 90 %.

60 Los expertos en la materia comprenderán que la etapa A de Dukes se corresponde a las clasificaciones TNM T1,

N0, M0 y T2, N0, M0.

Por lo tanto, en una forma de realización, el procedimiento diagnostica o detecta el cáncer colorrectal con clasificación TNM T1, N0, M0 o T2, N0, M0 con una sensibilidad de al menos el 50 % y una especificidad de al 5 menos el 95 %.

En otra forma de realización más, el procedimiento diagnostica o detecta un cáncer colorrectal con clasificación TNM T1, N0, M0 o T2, N0, M0 con una sensibilidad de al menos el 60 % y una especificidad de al menos el 80 %.

10 En otra forma de realización, el procedimiento diagnostica o detecta el cáncer colorrectal según la clasificación TNM T1, N0, M0 o T2, N0, M0 con una sensibilidad de al menos el 50 % y una especificidad de al menos el 90 %.

En los procedimientos de la invención se puede usar cualquier técnica adecuada para la detección de polipéptidos. En una forma de realización, el procedimiento comprende poner en contacto la muestra con al menos un compuesto 15 que une un polipéptido biomarcador. Alternativamente, el procedimiento comprende la detección de polipéptidos por espectrometría de masas.

En una forma de realización particular, el compuesto se marca detectablemente.

20 En otra forma de realización, el compuesto es un anticuerpo.

En una forma de realización, el compuesto está unido a un soporte sólido.

En el procedimiento de la invención, la determinación de la presencia y/o el nivel del biomarcador puede comprender 25 la determinación de la presencia y/o el nivel de un polinucleótido que codifica el biomarcador, como por ejemplo una transcripción genética del biomarcador. Por lo tanto, en una forma de realización, los biomarcadores son polinucleótidos.

En otra forma de realización más de los procedimientos de la invención, el procedimiento comprende:

30

i) la determinación de la presencia y/o el nivel de los biomarcadores en la muestra del sujeto; y

ii) la comparación de la presencia y/o el nivel de los biomarcadores con un control, donde una presencia y/o el nivel en la muestra que sea distinta a la del control es indicativo de cáncer colorrectal.

35 En una forma de realización, la muestra comprende sangre, plasma, suero, orina, plaquetas, magacariocitos o heces.

En otro aspecto, la presente descripción divulga un procedimiento de tratamiento que comprende:

40 (i) el diagnóstico o detección del cáncer colorrectal de acuerdo con el procedimiento de la invención; y

(ii) la administración o recomendación de un tratamiento terapéutico para el tratamiento del cáncer colorrectal.

En otro aspecto adicional, la presente descripción divulga un procedimiento para monitorizar la eficacia del tratamiento del cáncer colorrectal en un sujeto, comprendiendo el procedimiento el tratamiento del sujeto contra el 45 cáncer y después la detección de la presencia y/o el nivel de al menos dos biomarcadores seleccionados de entre IL-8, IGFBP2, MAC2BP, M2PK, IL-13, DKK-3, EpCam, MIP1 p, TGFp1, y TIMP-1 en una muestra del sujeto, donde una ausencia de y/o reducción en el nivel de expresión de los polipéptidos después del tratamiento al compararlos antes del tratamiento son indicativos de la eficacia del tratamiento.

50 En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de una matriz de compuestos para el diagnóstico o detección in vitro del cáncer colorrectal, donde cada uno de los compuestos se une a un polipéptido biomarcador distinto seleccionado de entre

(a) DKK-3, M2PK, y IGFBP2; o 55 (b) M2PK, IGFBP2, y EpCAM.

En otro aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso de un kit para el diagnóstico o detección in vitro del cáncer colorrectal en un sujeto, comprendiendo el kit compuestos que se unen cada uno a un polipéptido biomarcador distinto seleccionado de entre

(a) DKK-3, M2PK, y IGFBP2; o

(b) M2PK, IGFBP2, y EpCAM.

A lo largo de esta memoria descriptiva la palabra "comprender", o variaciones como "comprendiendo" o "que 5 comprende", se entenderá que implica la inclusión de un elemento declarado, un número entero o paso, o grupo de elementos, números enteros o pasos, pero no la exclusión de cualquier otro elemento, número entero o paso, o grupo de elementos, números enteros o pasos.

Como será evidente, las funciones y características preferidas de un aspecto de la invención se aplican a muchos 10 otros aspectos de la invención.

De ahora en adelante, la invención se describirá mediante los siguientes ejemplos no limitantes y con referencia a las figuras adjuntas.

15 BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS ADJUNTOS

Figura 1. En el Estudio 3 se descubrió una combinación óptima de 46 biomarcadores proteicos potenciales usando modelos de regresión logística, resultando en un panel de siete biomarcadores que se ilustra como una curva ROC (curva negra). Se estimó el rendimiento de este "panel" de datos independientes usando la validación cruzada "dejar 20 uno fuera" (curva gris). Las líneas verticales se dibujan en los puntos de especificidad del 80 % y del 90 %, puntos de interés de funcionamiento en las pruebas de diagnóstico precoz. Las estadísticas del rendimiento se presentan en la Tabla 5.

Figura 2. Rendimiento del modelo de siete biomarcadores que identifica a los pacientes con cáncer colorrectal entre los normales en cada etapa de Dukes ilustrada por las curvas ROC para cada etapa. A (roja)- Etapa A, B (verde)- 25 Etapa B, C (azul)- Etapa C, y D (negra)-Etapa D del Estudio 3a. Las características de rendimiento se presentan en la Tabla 6.

Figura 3. Cuando el resultado del biomarcador del Estudio 4 (también conocido como Estudio 3 recalculado) se modeló en pares en un total de 5 pares (de un máximo de 45 combinaciones seleccionadas de entre la lista anterior de 10 biomarcadores) se puede mostrar para producir una sensibilidad superior al 52 % a una especificidad de 95. 30 El rendimiento de este par de combinaciones de biomarcadores adecuadas se ilustra como curvas ROC (n = 5 curvas). Las características de rendimiento se presentan en la Tabla 7.

Figura 4. Un ejemplo de un modelo de 3 biomarcadores generado a partir de los datos del Estudio 4 que tiene una sensibilidad de al menos el 50 % a una especificidad del 95 %. Hay 968 posibles combinaciones de 3-10 biomarcadores y aproximadamente la mitad de esas combinaciones mostraron un rendimiento de al menos el 50 % 35 de sensibilidad a una especificidad del 90 %.

Figura 5. Las curvas ROC se ilustran para todas las combinaciones de 3-10 biomarcadores generadas a partir de los datos del Estudio 4 que tienen una sensibilidad de al menos el 50 % a una especificidad del 95 % (n = 485 curvas de validación cruzada de un total de 968 modelos posibles).

Figura 6. Frecuencia de cada biomarcador en los mejores 485 modelos. Estos BM representan todos los modelos 40 de suero que dieron una sensibilidad de al menos del 50 % al 95 %. La alta representación de todos los 10 biomarcadores en los modelos útiles demostró la unidad de nuestra selección de estos 10 biomarcadores.

Figura 7. Un modelo de 5 biomarcadores generado a partir de los datos del Estudio 4 se ilustra como una curva ROC (negra) y una curva ROC de validación cruzada (gris). Estos modelos mostraron una sensibilidad del 68 % a una especificidad del 95 % cuando todas las etapas de la enfermedad están incluidas y cuando la validación cruzada 45 ofrece una sensibilidad del 64 %. Los biomarcadores incluidos son [IL-8, IGFBP2, Mac2BP, DKK-3 y M2PK].

Figura 8. Un modelo de 6 biomarcadores generado a partir de los datos del Estudio 4 se ilustra como una curva ROC (negra) y una curva ROC de validación cruzada (gris). Estos modelos mostraron una sensibilidad del 77 % a una especificidad del 95 % cuando todas las etapas de la enfermedad están incluidas y cuando la validación cruzada ofrece una sensibilidad del 67 %. Los biomarcadores incluidos son [IL-8, IGFBP2, Mac2BP, DKK-3, 50 TGFbeta1&M2PK].

Figura 9. Se muestran dos modelos alternativos de siete biomarcadores generados a partir de los datos del Estudio 3a. Uno se optimizó para alta especificidad (negro/nuevo) y se muestra una alternativa o modelo optimizado para el área debajo de la cuerva (gris/antiguo). A una especificidad del 90 % la sensibilidad fue del 72 % para el modelo nuevo y del 77 % para el modelo antiguo. Los biomarcadores incluidos fueron los siguientes:

55 Nuevo: IL8,IGFBP2, s90MAC2BP, M2PK, DKK-3, IL-13 & TGFbeta,

Antiguo: IL8, IGFBP2, s90MAC2BP, M2PK, EpCAM, IL13 & MIP-1b.

Figura 10. Un modelo de siete biomarcadores generado a partir de los datos del Estudio 4 se ilustra como una curva ROC (negra) y una curva ROC de validación cruzada (gris). Este modelo mostró una sensibilidad del 84 % a una especificidad del 95 %. Los biomarcadores incluidos son [M2PK suero, IL8.plasma, TGF beta1.suero, 60 IGFBP2.plasma,Mac2BP.suero, TIMP1.plasma y Dkk3 plasma.

Figura 11. Se ilustran las curvas ROC de validación cruzada muestran el rendimiento de un modelo de 3 biomarcadores para cada etapa de Dukes. Estos datos demuestran la validez de la elección de los tres biomarcadores (DKK-3, M2PK y IGFBP2) para la detección del cáncer a etapas diferentes de la progresión de la enfermedad. Los datos indican que en la Etapa A si se usan los tres biomarcadores, la prueba aún logrará una 5 importante sensibilidad del 64 % a una especificidad del 95 % lo que es comparable a la sensibilidad lograda en la etapa tardía de la enfermedad (79 %). Que es el panel de los tres biomarcadores que recogerá etapas tempranas de la enfermedad permitiendo la detección temprana. Los biomarcadores incluidos son Dkk3, M2PK y IGFBP2.

CÓDIGO AL LISTADO DE SECUENCIAS

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SEQ ID NO:1 - secuencia de aminoácido de IL-8 SEQ ID NO:2 - secuencia de aminoácido de IGFBP2 SEQ ID NO:3 - secuencia de aminoácido de MAC2BP SEQ ID NO:4 - secuencia de aminoácido de M2PK variante 1 15 SEQ ID NO:5 - secuencia de aminoácido de M2PK variante 2 SEQ ID NO:6 - secuencia de aminoácido de M2PK variante 3 SEQ ID NO:7 - secuencia de aminoácido de IL-13 SEQ ID NO:8 - secuencia de aminoácido de DKK-3 variante 1 SEQ ID NO:9 - secuencia de aminoácido de DKK-3 variante 2 20 SEQ ID NO:10 - secuencia de aminoácido de DKK-3 variante 3 SEQ ID NO:11- secuencia de aminoácido de EpCam SEQ ID NO:12 - secuencia de aminoácido de MIP1 p SEQ ID NO:13 - secuencia de aminoácido de TGFp1 SEQ ID NO:14 - secuencia de aminoácido de TIMP-1 25

DESCRIPCIÓN DETALLADA Técnicas y definiciones generales

30 A menos que específicamente se defina de otro modo, debe entenderse que todos los términos técnicos y científicos usados en esta invención tienen el mismo significado que comúnmente entendería un experto en la materia cualquiera (p.ej. en cultivo celular, genética molecular, inmunología, inmunohistoquímica, química proteica y bioquímica).

35 A menos que se indique lo contrario la proteína recombinante, el cultivo celular y las técnicas inmunológicas utilizadas en la presente invención serán procedimientos estándar, muy conocidos por los expertos en la técnica. Dichas técnicas se describen y explican en toda la bibliografía en fuentes como por ejemplo J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook y cols., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edn, Cold Spring Harbour Laboratory Press (2001), R. Scopes, Protein Purification - Principals and 40 Practice, 3rd edn, Springer (1994), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996), and F.M. Ausubel y cols. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, including all updates until present), Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), and J.E. Coligan y cols. (editors) Current 45 Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (including all updates until present).

Como se usa en esta invención, el término "cáncer colorrectal", también conocido como "cáncer de colon", se refiere a todas las formas de cáncer originadas a partir de células epiteliales que recubren el intestino grueso y/o el recto.

50 Como se usa en esta invención, "biomarcador" se refiere a cualquier molécula, como por ejemplo un gen, transcripción genética (por ejemplo ARNm), péptido o proteína o fragmento del mismo producido por un sujeto que es útil en la diferenciación de sujetos que tienen cáncer colorrectal de los sujetos normales o sanos.

Como se usa en esta invención, el término "diagnóstico", y variantes del mismo como por ejemplo, pero sin limitarse 55 a, "diagnóstico", "diagnosticado" o "diagnosticar" no se debe limitar al diagnóstico principal de un estado clínico, pero se debe utilizar para incluir el diagnóstico de la enfermedad recurrente.

Como se usa en esta invención, el término "sujeto" se refiere a cualquier animal que pueda desarrollar cáncer colorrectal e incluye animales como por ejemplo mamíferos, p. ej. humanos o no humanos como por ejemplo gatos y 60 perros, animales de laboratorio como por ejemplo ratones, ratas, conejos o cobayas, y ganado. En una forma de

realización preferida, el sujeto es un humano.

La "muestra" puede ser de cualquier tipo adecuado y puede referirse, p.ej. a un material en el que se puede detectar el nivel de biomarcadores. Preferentemente, se obtiene la muestra a partir del sujeto para que la detección de la 5 presencia y/o el nivel de biomarcadores puedan realizarse in vitro. Alternativamente, la presencia y/o el nivel de biomarcadores se pueden detectar in vivo. La muestra se puede usar obtenida directamente de la fuente o siguiendo al menos un paso de purificación (parcial). La muestra se puede preparar en cualquier medio práctico que no interfiera con el procedimiento de la invención. Típicamente, la muestra es una solución acuosa, fluido biológico, células o tejido. Preferentemente, la muestra es sangre, plasma, suero, orina, plaquetas, magacariocitos o heces. El 10 pretratamiento puede implicar, por ejemplo, la preparación de plasma a partir de sangre, fluidos viscosos diluidos, y similares. Los procedimientos de tratamiento pueden implicar filtración, destilación, separación, concentración, inactivación o interferencia de los componentes, y la adición de reactivos. La selección y el pretratamiento de muestras biológicas antes de la prueba son bien conocidos en la técnica y no necesitan describirse más.

15 Como se usa en esta invención los términos "tratar", "trata" o "tratamiento" incluyen administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto lo suficiente para reducir o retrasar el comienzo o progresión del cáncer colorrectal, o para reducir o eliminar al menos un síntoma del cáncer colorrectal.

Biomarcadores

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Los autores de la presente invención han demostrado que determinar la presencia y/o el nivel de al menos tres biomarcadores en una muestra de un sujeto permite la detección o diagnóstico del cáncer colorrectal, ya sea la detección precoz en la etapa A de Dukes o a una etapa algo tardía como por ejemplo la Etapa B o C o D de Dukes, con especificidad y sensibilidad comparables a o mayores que la lograda con la FOBT. Al menos los tres 25 biomarcadores que son útiles en los procedimiento de la presente invención se seleccionan de entre IL-8 (interleucina-8), IGFBP2 (factor de crecimiento similar a la insulina que fija la proteína-2), MAC2BP (proteína que fija MAC2; proteína sérica 90K), M2PK (piruvato cinasa muscular 2, piruvato cinasa 3), IL-13 (interleucina-13), DKK-3 (dickkopf homólogo, 3), EpCAM (molécula de adhesión celular epitelial), MIP1p (proteína inflamatoria de macrófagos 1p, CCL4, MIP1beta), TGFp1 (actor del crecimiento transformante p1, TGFbeta1) y TIMP-1 (inhibidor tisular de 30 metaloproteinasa 1) y son más específicamente:

(a) DKK-3, M2PK y IGFBP2;

(b) M2PK, IGFBP2, y EpCAM,

(c) M2PK, IGFBP2 y IL-13; o 35 (d) M2PK, IGFBP2 y IL-8.

Entre la referencia a estos biomarcadores se incluye la referencia a todas las variantes de polipéptido y polinucleótido como por ejemplo isoformas y variantes de transcripción como conocería el experto en la materia. Los números de acceso NCBI de las secuencias representativas para cada uno de los biomarcadores se proporcionan 40 en la Tabla 1.

Tabla 1. Números de acceso NCBI para las secuencias representativas del biomarcador.

Biomarcador: Números de acceso NCBI representativos

IL-8: NM 000584.2 (SEQ ID NO:1)

IGFBP2: NM 000597.2 (SEQ ID NO:2)

MAC2BP: NM 005567.3 (SEQ ID NO:3)

M2PK: NM 002654.3; NM 182470.1; NM 182471.1 (SEQ ID NOs:4-6)

IL-13: NM 002188.2 (SEQ ID NO:7)

DKK-3: NM 015881.5; NM 013253; NM 001018057.1 (SEQ ID NOs:8-10)

EpCam: NM 002354.2 (SEQ ID NO:11)

MIP1p: NM 002984.2 (SEQ ID NO:12)

TGFp1: NM 000660.4 (SEQ ID NO:13)

TIMP-1: NM 003254.2 (SEQ ID NO:14)

Detección o diagnóstico del cáncer colorrectal

Será evidente a partir de la descripción anterior que los procedimientos de diagnóstico de la presente invención puedan involucrar un grado de cuantificación para determinar los niveles de biomarcadores en muestras de pacientes. Dichas cuantificaciones se proporcionan fácilmente mediante la inclusión de muestras de control

apropiadas.

En una forma de realización, se incluyen los controles internos en los procedimientos de la presente invención. Un control interno preferido es una o más muestras tomadas de uno o más individuos sanos.

En el presente contexto, el término "individuo sano" se entenderá como un individuo que se sabe que no padece cáncer colorrectal, dicho conocimiento derivado de datos clínicos sobre el individuo, incluyendo, pero sin limitarse a, un ensayo de diagnóstico distinto al descrito en esta invención.

10 Como será conocido por los expertos en la técnica, cuando los controles internos no se incluyen en cada ensayo realizado, el control puede derivarse de un conjunto de datos establecido.

Los datos relativos a los sujetos de control se seleccionaran preferentemente entre el grupo formado por:

15 1. un conjunto de datos que comprende mediciones de la presencia o el nivel de los biomarcadores para una población típica de sujetos que se conoce que tienen cáncer colorrectal;

2. un conjunto de datos que comprende mediciones de la presencia o el nivel de biomarcadores del sujeto a analizar donde dichas mediciones se han hecho anteriormente, como por ejemplo, cuando se sabía que el sujeto estaba sano o, en el caso de un sujeto que tiene cáncer colorrectal, cuando el sujeto fue diagnosticado o en una etapa

20 temprana en la progresión de la enfermedad;

3. un conjunto de datos que comprende mediciones de la presencia o el nivel de biomarcadores para un individuo sano o una población de individuos sanos; y

4. un conjunto de datos que comprende mediciones de la presencia o el nivel de los biomarcadores para un individuo normal o una población de individuos normales.

25

En el presente contexto, el término "población típica" con respecto a los sujetos conocidos por tener cáncer colorrectal se entenderá que se refiere a una población o muestra de sujetos diagnosticados con cáncer colorrectal que es representativa del espectro de pacientes con cáncer colorrectal. Esto no debe entenderse como una exigencia de una distribución normal estricta de parámetros morfológicos o clinicopatológicos en la población, dado 30 que algunas variaciones en dicha distribución son permisibles. Preferentemente, una "población típica" exhibirá un espectro de cáncer colorrectal en distintas etapas de progresión de la enfermedad. Se prefiere particularmente que una "población típica" exhiba las características de la expresión de una cohorte de sujetos como se describe en esta invención.

35 El término "individuo normal" se entenderá como un individuo que no expresa un biomarcador, o expresa un biomarcador a un nivel bajo en una muestra. Como será conocido por los expertos en la técnica, los datos obtenidos de una muestra lo suficientemente grande de población se normalizarán, permitiendo la generación de un conjunto de datos para determinar el nivel promedio de un biomarcador particular.

40 Los expertos en la materia son fácilmente capaces de determinar el valor de referencia para la comparación en cualquier ensayo diagnóstico de la presente invención sin experimentación innecesaria, basándose en la enseñanza proporcionada en esta invención.

Los compuestos que unen un biomarcador cuando se usa diagnósticamente pueden estar unidos a un reactivo de 45 diagnóstico como por ejemplo una etiqueta detectable para permitir la fácil detección de los eventos de unión in vitro o in vivo. Las etiquetas adecuadas incluyen radioisótopos, marcadores de colorantes u otros reactivos de imágenes para la detección y/o localización de moléculas diana. Los compuestos unidos a una etiqueta detectable se pueden usar con tecnologías de imágenes in vivo adecuadas como por ejemplo radiología, fluoroscopía, resonancia magnética nuclear (RM), exploración mediante tomografía axial computarizada (TAC), tomografía por emisión de 50 positrones (TEP), tomografía computarizada, etc.

Los procedimientos de diagnóstico de la presente invención son capaces de diagnosticar o detectar el cáncer colorrectal con una sensibilidad y especificidad que es al menos comparable a una FOBT, o mayor. Como entendería un experto en la materia, la sensibilidad se refiere a la proporción de los positivos reales en la prueba de 55 diagnóstico que se identifican correctamente como que tienen un cáncer colorrectal. La especificidad mide la proporción de negativos que se han identificado correctamente como que no tienen cáncer colorrectal. En una forma de realización los procedimiento de la invención son capaces de diagnosticar o detectar el cáncer colorrectal con una sensibilidad de al menos el 60 % o 66 %, o al menos el 77 %, 80 %, 83 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, o al menos el 93 %. En otra forma de realización, los procedimientos de la invención son capaces de diagnosticar o 60 detectar el cáncer colorrectal con una sensibilidad de al menos el 80 %, o al menos el 85 % o al menos el 90 % o al

menos el 95 %.

En otra forma de realización, los procedimientos de la invención son capaces de diagnosticar o detectar el cáncer colorrectal con una especificidad de al menos el 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % o al menos el 95 5 %.

Ventajosamente, los procedimientos de la presente invención son capaces de detectar el cáncer colorrectal en todas las etapas de Dukes con mayor sensibilidad que la FOBT. En la Etapa A de Dukes, el tumor ha penetrado en, pero no a través de la pared intestinal. En la Etapa B de Dukes, el tumor ha penetrado a través de la pared intestinal, pero 10 aún no ha afectado ningún ganglio linfático. En la Etapa C de Dukes, el cáncer afecta los ganglios linfáticos regionales. En la Etapa D de Dukes, hay una metástasis distante, por ejemplo al hígado o pulmón. En una forma de realización, el procedimiento de la presente invención es capaz de diagnosticar o detectar el cáncer colorrectal en cualquier Etapa de Dukes con una sensibilidad de al menos el 80 %.

15 Como conocen los expertos en la materia, hay otros sistemas para la estadificación del cáncer que se conocen en la técnica. Un ejemplo es la clasificación de tumores malignos (TNM) que usa el Comité Conjunto Estadounidense sobre el Cáncer (AJCC: Colon and rectum. in Edge y cols., eds; AJCC Cancer Staging Manual, 7th ed. New York, NY: Springer, 2010, pp:143-164). Otro ejemplo es la Clasificación Astler-Coller Modificada (MAC).

20 En consecuencia, Los expertos en la materia apreciarán que las Etapas de Dukes se corresponden con ciertas Clasificaciones TNM. Por ejemplo, la Etapa A de Dukes se corresponde con la T1, T2, N0 y M0; la Etapa B de Dukes se corresponde con T3, T4a, T4b, N0 y M0; y la Etapa C de Dukes se corresponde con i) T1-T2, N1/N1c, M0; ii) T1, N2a y M0; iii) T3-T4a, N1/N1c y M0; iv) T2-T3, N2a y M0; v) T1-T2, N2b y M0; vi) T4a, N2a y M0; vii) T3-T4a, N2b y M0; y viii) T4b, N1-N2 y M0. Por lo tanto, los expertos en la materia comprenderán que la referencia a una Etapa de 25 Dukes como se usa en esta invención incluye la referencia a la correspondiente clasificación TMN tal como es conocida en la técnica.

Técnicas de detección de proteínas

30 En una forma de realización, se detecta el polipéptido biomarcador en una muestra de paciente, donde la presencia y/o el nivel del polipéptido en la muestra son indicativos de cáncer colorrectal. Por ejemplo, el procedimiento puede comprender poner en contacto una muestra biológica derivada de un sujeto con un compuesto capaz de unirse a un polipéptido biomarcador, y detectar la formación de complejo entre el compuesto y el polipéptido biomarcador. El término "polipéptido biomarcador-, como se usa en esta invención incluye los fragmentos de los polipéptidos 35 biomarcadores, incluyendo, por ejemplo, los fragmentos y epítopos inmunogénicos del polipéptido biomarcador.

En una forma de realización, el compuesto que une el biomarcador es un anticuerpo.

El término "anticuerpo" como se usa en esta invención incluye moléculas intactas así como moléculas que 40 comprenden o están formadas por fragmentos de la misma, como por ejemplo Fab, F(ab')2, Fv y scFv, así como variantes diseñadas incluyendo diacuerpos, triacuerpos y minicuerpos y anticuerpos de dominio único que son capaces de unir un epítopo determinante. Por lo tanto, los anticuerpos pueden existir como inmunoglobulinas intactas, o como modificaciones en una variedad de formas.

45 En otra forma de realización, se detecta un anticuerpo frente a un polipéptido biomarcador en una muestra de paciente, donde la presencia y/o el nivel del anticuerpo de la muestra son indicativos de cáncer colorrectal.

Entre los sistemas de detección preferidos contemplados en esta invención se incluye cualquier ensayo conocido para la detección de proteínas o anticuerpos en una muestra biológica aislada de un sujeto humano, como por 50 ejemplo, SDS/PAGE, isoelectroenfoque, electroforesis en gel de 2 dimensiones que comprende SDS/PAGE e isoelectroenfoque, un inmunoensayo, citometría de flujo, p. ej. separación de células activadas por fluorescencia (FACS), un sistema basado en la detección usando un compuesto de anticuerpo y de no anticuerpo, como por ejemplo, una molécula pequeña (p. ej. un compuesto químico, agonista, antagonista, modulador alostérico, inhibidor competitivo, o inhibidor no competitivo, de la proteína). De acuerdo con estas formas de realización, el anticuerpo o 55 la molécula pequeña se pueden usar en cualquier fase sólida estándar o formato de ensayo de fase de solución susceptible a la detección de proteínas. La detección óptica o fluorescente, como por ejemplo, el uso de espectrometría de masas, MALDI-TOF, tecnología biosensora, fibra óptica evanescente o transferencia de energía por resonancia de fluorescencia, se incluye claramente en la presente invención. También se contemplan los sistemas de ensayo adecuados para el uso en cribado ultrarrápido de muestras de masa, p. ej. el procedimiento de 60 resonancia de espectroscopia ultrarrápido (p. ej. MALDI-TOF, MS electronebulizacion o MS nano

electronebulizacion). Otra técnica de detección de proteína adecuada implica el uso de Monitorización de Reacciones Múltiples (MRM) en LC-MS (LC/MRM-MS) (Anderson and Hunter, 2006).

Los formatos de inmunoensayo son particularmente adecuados, p. ej. seleccionados de entre el grupo formado por 5 una inmunotransferencia, un Western blot, un dot blot, un ensayo inmunoenzimático en fase sólida (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), inmunoensayo enzimático. También son útiles los inmunoensayos modificados que usan transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), etiquetas de afinidad codificadas con isótopos (ICAT), tiempo de vuelo de desorción/ionización por láser asistida por matriz (MALDI-TOF), ionización por electronebulizacion (ESI), tecnología biosensora, tecnología de fibra óptica evanescente, tecnología de chip de 10 proteína.

Técnicas de detección de ácidos nucleicos

Se puede usar cualquier técnica adecuada que permita la valoración cualitativa y/o cuantitativa del nivel de un 15 polinucleótido biomarcador en una muestra. Los términos "molécula de ácido nucleico" o "polinucleótido" como se usan en esta invención se refieren a un oligonucleótido, polinucleótido o cualquier fragmento de los mismos.

La comparación se puede hacer mediante la referencia a un control estándar, o a un nivel de control que se encuentra en el tejido sano. Por ejemplo, los niveles de un gen transcrito se pueden determinar mediante una 20 inmunotransferencia tipo Northern, y/o RT-PCR. Con la llegada del PCR cuantitativo (a tiempo real), los análisis cuantitativos de la expresión génica se pueden lograr usando los cebadores apropiados para el gen de interés. El ácido nucleico puede etiquetarse e hibridarse en una matriz génica, en cuyo caso la concentración génica será directamente proporcional a la intensidad de la señal radiactiva o fluorescente generada en la matriz.

25 Los procedimientos para la secuenciación directa de secuencias nucleótidas son muy conocidos par los expertos en la materia y se pueden encontrar por ejemplo en Ausubel y cols., eds., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley, (1995) and Sambrook y cols., Molecular Cloning, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001). La secuenciación se puede llevar a cabo mediante cualquier procedimiento adecuado, por ejemplo, secuenciación dideoxi, secuenciación química o variaciones de las mismas. La secuenciación directa tiene la ventaja de determinar 30 las variaciones en cualquier par de bases de una secuencia particular.

Otros procedimientos de PCR que se pueden usar en la realización de la invención incluyen la hibridación basada en los sistemas de detección por PCR, ensayo TaqMan (patente de EE.UU n.° 5.962.233) y el ensayo de baliza molecular (patente de EE.uU n.° 5.925.517).

35

El ácido nucleico se puede separar de la muestra para su análisis. Los expertos en la técnica conocerán los procedimientos adecuados. Por ejemplo, el ARN puede aislarse de la muestra para analizarlo usando procedimientos convencionales, como por ejemplo los suministrados por la tecnología QIAGEN. Después, este ARN se retrotranscribe en ADN usando transcriptasa reversa y la molécula de ADN de interés puede después 40 amplificarse mediante técnicas de PCR usando cebadores específicos.

Los procedimientos de diagnóstico también pueden realizarse directamente en las muestras de paciente. Los ensayos de hibridación o amplificación, como por ejemplo, los análisis Southern o Northern blot, inmunohistoquímica, análisis de polimorfismo conformacional de hebra simple (SSCP) y los análisis de PCR son 45 algunas técnicas que son útiles en este sentido. Si lo desea, el ácido nucleico diana o la sonda se pueden inmovilizar sobre un soporte sólido como por ejemplo una placa de microvaloración, membrana, perla de poliestireno, portaobjetos de vidrio u otra fase sólida.

Kits

50

La presente invención proporciona usos de los kits para el diagnóstico o detección del cáncer colorrectal. Dichos kits pueden ser adecuados para la detección de especies de ácido nucleico o, alternativamente pueden ser para la detección de un producto génico polipeptídico, como se analiza anteriormente.

55 Para la detección de polipéptidos, los anticuerpos se usarán más típicamente como componentes de los kits. Sin embargo, cualquier agente capaz de unirse específicamente a un producto génico biomarcador será útil en este aspecto de la invención. Otros componentes de los kits incluirán típicamente etiquetas, anticuerpos secundarios, sustratos (si el gen es una enzima), inhibidores, cofactores y preparaciones de productos génicos de control para permitir que el usuario cuantifique los niveles de expresión y/o evalúe si el experimento de diagnóstico ha funcionado 60 correctamente. Las pruebas basadas en ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA) y las pruebas ELISA

competitivas son ensayos particularmente adecuados que los expertos en la materia pueden llevar a cabo fácilmente usando los componentes del kit.

Opcionalmente, el kit comprende además medios para la detección de la unión de un anticuerpo a un polipéptido 5 biomarcador. Dichos medios incluyen una molécula indicadora como por ejemplo, una enzima (como por ejemplo peroxidasa de rábano picante, o fosfatasa alcalina), un colorante, un radionúclido, un grupo luminiscente, un grupo fluorescente, biotina o una partícula coloidal, como por ejemplo oro coloidal o selenio. Preferentemente dicha molécula indicadora está directamente unida al anticuerpo.

10 En otra forma de realización más, un kit puede comprender adicionalmente una muestra de referencia. En una forma de realización, una muestra de referencia comprende un polipéptido que es detectado por un anticuerpo. Preferentemente, el polipéptido es de concentración conocida. Dicho polipéptido es de uso particular como estándar. En consecuencia, varias concentraciones conocidas de dicho polipéptido pueden detectarse usando un ensayo de diagnóstico descrito en esta invención.

15

Para la detección de ácidos nucleicos, dichos kits pueden contener un primer recipiente como por ejemplo un vial o un tubo de plástico o una placa de microvaloración que contiene una sonda oligonucleótida. Estos kits pueden contener opcionalmente un segundo recipiente que incluya los cebadores. La sonda se puede hibridizar con ADN cuya expresión alterada se asocia con el cáncer colorrectal y los cebadores son útiles para amplificar ese ADN. Los 20 kits que contienen una sonda oligonucleótida inmovilizada en un soporte sólido se pueden también desarrollar, por ejemplo, usando matrices (véase Suplemento del número 21(1) Nature Genetics, 1999).

Para la amplificación por PCR del ácido nucleico, los cebadores de ácido nucleico pueden estar incluidos en el kit, y son complementarios a al menos una parte de un gen biomarcador como se describe en esta invención. El conjunto 25 de cebadores incluye típicamente al menos dos oligonucleótidos, preferentemente cuatro oligonucleótidos, que son capaces de la amplificación específica del ADN. Se pueden incluir oligonucleótidos etiquetados con fluorescente que permitirán la determinación por PCR cuantitativa (p. ej. química TaqMan, balizas moleculares). También se podrán incluir enzimas adecuadas para la amplificación del ADN.

30 Para propósitos de comparación o validación se puede incluir el ácido nucleico de control. Dichos controles pueden ser ARN/ADN aislado de un tejido sano, o de individuos sanos, o genes de mantenimiento como por ejemplo p- actina o GAPDH cuyos niveles de ARNm no están afectados por el cáncer colorrectal.

Algoritmos de regresión y estadísticas

35

Para desarrollar un panel de biomarcadores adecuado para el diagnóstico o detección del cáncer colorrectal, los autores de la presente invención han analizado numerosos biomarcadores en un modelo estadístico. Dicha mejora en el rendimiento de una prueba se conoce a veces como rendimiento "en la muestra". Una evaluación imparcial de una prueba requiere su evaluación con sujetos fuera de la muestra, es decir, sujetos nos incluidos en la construcción 40 del modelo predictivo inicial. Esto se logra mediante la evaluación del rendimiento de la prueba usando validación cruzada.

Las pruebas de importancia estadística incluyen regresión lineal y no lineal, incluyendo ANOVA, Kruskal-Wallis, Wilcoxon, Mann-Whitney y razón de posibilidades, algoritmos de probabilidad bayesianos. Sin embargo, a medida 45 que el número de biomarcadores medidos aumenta, puede resultar generalmente más cómodo usar técnicas más sofisticadas como por ejemplo bosques aleatorios, logística simple, red de Bayes por nombrar algunas.

Por ejemplo, se puede adoptar la probabilidad bayesiana. En esta circunstancia se puede usar una validación cruzada de 10 veces para estimar el rendimiento "fuera de la muestra" de los modelos en cuestión. Para cada 50 combinación de biomarcadores en consideración, se pueden dividir los datos aleatoriamente en 10 submuestras, cada una con proporciones similares de sujetos sanos y sujetos en cada etapa de la enfermedad. A su vez, se puede excluir cada submuestra, y construir un modelo logístico usando el 90 % restante de los sujetos. Después, este modelo se puede usar para estimar la probabilidad de cáncer de la submuestra excluida, proporcionando una estimación del rendimiento "fuera de la muestra". Repitiendo esto para las restantes 9 submuestras, se puede 55 estimar el rendimiento "fuera de la muestra" a partir de los datos del estudio por sí mismos. Estas probabilidades predichas fuera de la muestra pueden compararse después con el estado real de la enfermedad de los sujetos para crear una curva de eficacia diagnóstica (ROC), a partir de la que se puede estimar la sensibilidad de validación cruzada a una especificidad del 95 %.

60 Cada estimación del rendimiento "fuera de la muestra" usando validación cruzada (o cualquier otro procedimiento),

aunque imparcial, tiene un elemento de variabilidad. Por lo tanto una clasificación de modelos (basada en combinaciones de biomarcadores) puede ser indicativa solo del rendimiento relativo de dichos modelos. Sin embargo un conjunto de biomarcadores que es capaz de usarse en un gran número de combinaciones para generar una prueba de diagnóstico como se demostró mediante las evaluaciones de rendimiento "fuera de la muestra", 5 contiene dentro de sí mismo, casi con total seguridad, combinaciones de biomarcadores que soportarán la evaluación repetida.

Muchas combinaciones diferentes pueden calificar como pruebas de diagnóstico que puede resultar útiles y rentables y tener una sensibilidad aceptable para una especificidad dada. Como ejemplo considere los cinco 10 biomarcadores: IL-8, IGFBP2, MAC2BP, M2PK y DKK-3. Un modelo de discriminación de sujetos con cáncer a partir de controles sanos puede ser como sigue:

imagen1

15 Aquí p representa la probabilidad de que una persona tenga cáncer colorrectal. Cada Ci es el logaritmo de concentración del biomarcador i en el plasma (o suero) de una persona. Cada beta (8) es un coeficiente aplicado a dicho biomarcador en las unidades de concentración en las que se mide - 8 0 es "valor inicial" o "intersección". Este modelo lógico lineal es común a todos los resultados presentados en esta invención, pero está lejos de ser la única forma en la que una combinación de concentraciones de biomarcadores puede modelarse para predecir la 20 probabilidad de cáncer.

Otros algoritmos no lineales o lineales que pueden ser igualmente aplicables incluyen bosque aleatorio, ANOVA, prueba t, análisis Fisher, máquinas de vectores de soporte, modelos lineales de datos de la micromatriz (LIMMA) y/o análisis de importancia de datos de micromatrices (SAM), Primero mejor, algoritmo voraz por pasos, Naive Bayes, 25 selección lineal prospectiva, búsqueda dispersa, análisis discriminante lineal (LDA), regresión logística por pasos, característica operativa del receptor y árboles de clasificación (CT).

Por lo tanto, a luz de las enseñanzas de la presente especificación, el experto en la materia apreciará que la sensibilidad y especificidad de una prueba de diagnóstico de cáncer colorrectal se puede modular para seleccionar 30 una combinación diferente de biomarcadores como se describe en esta invención

Sistemas basados en el conocimiento

Será evidente a partir de la discusión en esta invención que el software y el hardware informático basado en el 35 conocimiento para implementar un algoritmo forma también parte de la presente divulgación. Dichos software y/o hardware informáticos serán útiles para realizar un procedimiento de diagnóstico o detección de cáncer colorrectal según la invención. Por lo tanto, la presente descripción divulga también el software o hardware programado para implementar un algoritmo que procese datos obtenidos mediante la realización del presente procedimiento de la invención mediante un análisis multivariado para proporcionar una puntuación de la enfermedad y proporcionar o 40 permitir un diagnóstico o detección del cáncer colorrectal y/o determinar la progresión o estado de un cáncer colorrectal o determinar si ha progresado o no el cáncer colorrectal o determinar si el sujeto está respondiendo o no al tratamiento del cáncer colorrectal de acuerdo con los resultados de la puntuación de la enfermedad en comparación con los valores predeterminados.

45 En un ejemplo, un procedimiento de la invención se puede usar en la arquitectura o plataformas basadas en el conocimiento existente asociadas con los servicios de patología. Por ejemplo, los resultados de un procedimiento descrito en esta invención se transmiten mediante una red de comunicaciones (p. ej. Internet) hasta un sistema de procesamiento en el que se almacena un algoritmo y se usa para generar un valor de probabilidad posterior predicho que se traduce a la puntuación de la probabilidad de la enfermedad o riesgo de recurrencia o metástasis o 50 capacidad de respuesta a un tratamiento que después se reenvía a un usuario final en la forma de un informe de diagnóstico o predictivo.

El procedimiento de la invención puede, por lo tanto, estar en forma de un kit o sistema basado en ordenador que comprende los reactivos necesarios para detectar la concentración de biomarcadores y el hardware y/o software 55 informático para facilitar la determinación y la transmisión de los informes a un médico.

El ensayo de la presente invención permite la integración en arquitectura de patología o sistemas de plataforma existentes o recién desarrollados. Por ejemplo, la presente invención contempla un procedimiento para permitir a un

usuario determinar el estado de un sujeto con respecto al cáncer colorrectal, incluyendo el procedimiento:

(a) la recepción de datos en forma de niveles, al menos tres biomarcadores seleccionados de entre IL-8, IGFBP2, MAC2BP, M2PK, IL-13, DKK-3, EpCam, MIP1p, TGFp1, y TIMP-1 en una muestra obtenida fácilmente,

5 opcionalmente en combinación con otro marcador de cáncer colorrectal;

(b) el procesamiento de datos del sujeto mediante análisis multivariados (por ejemplo, análisis de regresión) para proporcionar una puntuación de la enfermedad;

(c) la determinación del estado del sujeto de acuerdo con los resultados de la puntuación de la enfermedad en comparación con los valores predeterminados; y

10 (d) la transferencia de una indicación del estado del sujeto al usuario mediante la referencia de la red de

comunicaciones al análisis multivariable que incluye un algoritmo que realiza la función de análisis multivariable.

En una forma de realización, el procedimiento para el diagnóstico o detección del cáncer colorrectal de la invención puede realizarse tomando una muestra de sangre de un paciente y determinando la presencia y/o el nivel de uno o 15 más biomarcadores como se describe en esta invención. Si lo desea, las mediciones pueden realizarse, por ejemplo, en un biochip por lo que se puede usar un solo análisis para medir la presencia y/o el nivel de múltiples biomarcadores. Los resultados de este análisis se pueden introducir después en un programa informático que los somete a un análisis de regresión lineal. El ordenador también puede contener la información como para controlar los valores o intervalos esperados, o el médico, enfermera, administrador médico o el médico en medicina general 20 puede introducir dichos datos. Este análisis puede además proporcionar una puntuación o probabilidad de tener cáncer colorrectal. Si se realiza una segunda prueba al paciente, el análisis de regresión puede indicar un cambio en la puntuación, por lo tanto indicar que la enfermedad del paciente ha evolucionado o empeorado.

Otros aspectos de la descripción son los siguientes:

25

1. Un procedimiento para el diagnóstico o detección del cáncer colorrectal en un sujeto, comprendiendo el procedimiento:

i) la determinación de la presencia y/o el nivel de al menos dos biomarcadores seleccionados de entre IL-8, IGFBP2, MAC2BP, M2PK, IL-13, DKK-3, EpCam, MIP1 p, TGFp1, y TIMP-1 en una muestra del sujeto,

30 donde la presencia y/o el nivel de dos biomarcadores son indicativos de cáncer colorrectal.

2. El procedimiento del aspecto 1, donde el procedimiento comprende la determinación de la presencia y/o el nivel de dos biomarcadores seleccionados de entre M2PK, EpCam, IL-13, DKK-3, IL-8 y IGFBP2.

3. El procedimiento del aspecto 1, o del aspecto 2, donde el procedimiento comprende la determinación de la presencia y/o el nivel de la expresión de al menos tres de los biomarcadores.

35 4. El procedimiento del aspecto 3, donde los tres biomarcadores se seleccionan de entre M2PK, EpCam, IL-13, DKK-3, IL-8, IGFBP2, MIP1 p, TGFp1 y MAC2BP.

5. El procedimiento del aspecto 4, donde el procedimiento comprende la determinación de la presencia y/o el nivel de tres biomarcadores, donde los tres biomarcadores son:

i) DKK-3, M2PK, y IGFBP2;

40 ii) M2PK, IGFBP2, y EpCAM;

iii) M2PK, MIP1 p, y TGFp1; o

iv) IL-8, IL-13, y MAC2BP.

6. El procedimiento de cualquiera de los aspectos anteriores, donde el procedimiento comprende la determinación de la presencia y/o el nivel de la expresión de al menos cuatro de los biomarcadores.

45 7. El procedimiento del aspecto 6, donde el procedimiento comprende la determinación de la presencia y/o el nivel de cuatro biomarcadores, donde los cuatro biomarcadores son:

i) DKK-3, M2PK, MAC2BP, y IGFBP2;

ii) IL-8, IL-13, MAC2BP, y EpCam;

iii) DKK3, M2PK, TGFp1, y TIMP-1;

50 iv) M2PK, MIP1 p, IL-13, y TIMP-1; o

v) IL-8, MAC2BP, IGFBP2, y EpCam.

8. El procedimiento de cualquiera de los aspectos anteriores, donde el procedimiento comprende la determinación de la presencia y/o el nivel de al menos nueve de los biomarcadores.

9. El procedimiento de cualquiera de los aspectos anteriores, donde el procedimiento comprende la determinación 55 de la presencia y/o el nivel de al menos seis de los biomarcadores.

10. El procedimiento de cualquiera de los aspectos anteriores, donde el procedimiento comprende la determinación de la presencia y/o el nivel de al menos siete de los biomarcadores.

11. El procedimiento de cualquiera de los aspectos anteriores, donde el procedimiento comprende la determinación de la presencia y/o el nivel de al menos ocho de los biomarcadores.

60 12. El procedimiento de cualquiera de los aspectos anteriores, donde el procedimiento comprende la determinación

de la presencia y/o el nivel de al menos nueve de los biomarcadores.

13. El procedimiento de cualquiera de los aspectos anteriores, donde el procedimiento comprende la determinación de la presencia y/o el nivel de al menos diez de los biomarcadores.

14. El procedimiento de cualquiera de los aspectos anteriores, donde el procedimiento comprende la detección de la 5 presencia y/o el nivel de al menos un biomarcador adicional seleccionado de entre IGF-I, IGF-II, IGF-BP2,

Anfirregulina, VEGFA, VEGFD, MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2, ENA-78, MCP-1, MIP-1p, IFN-y, IL-10, IL-13, IL-1 p, IL-4, IL-8, IL-6, MAC2BP, piruvato cinasa M2 tumoral, M65, OPN, DKK-3, EpCam, TGFp-1, y VEGFpan.

15. El procedimiento de cualquiera de los aspectos anteriores, donde el procedimiento diagnostica o detecta el 10 cáncer colorrectal con una sensibilidad de al menos el 50 %.

16. El procedimiento del aspecto 15, donde el procedimiento diagnostica o detecta el cáncer colorrectal con una sensibilidad de al menos el 66 %.

17. El procedimiento del aspecto 16, donde el procedimiento diagnostica o detecta el cáncer colorrectal con una sensibilidad de al menos el 77 %.

15 18. El procedimiento de cualquiera de los aspectos anteriores, donde el procedimiento diagnostica o detecta la Etapa A de Dukes del cáncer colorrectal con una sensibilidad de al menos el 50 % y una especificidad de al menos el 95 %.

19. El procedimiento de cualquiera de los aspectos anteriores, donde el procedimiento diagnostica o detecta la Etapa A de Dukes del cáncer colorrectal con una sensibilidad de al menos el 60 % y una especificidad de al menos

20 el 80 %.

20. El procedimiento de cualquiera de los aspectos anteriores, donde el procedimiento diagnostica o detecta la Etapa A de Dukes del cáncer colorrectal con una sensibilidad de al menos el 50 % y una especificidad de al menos el 90 %.

21. El procedimiento de cualquiera de los aspectos anteriores, donde el procedimiento comprende poner en contacto 25 la muestra con al menos un compuesto que une un polipéptido biomarcador.

22. El procedimiento del aspecto 21, donde el compuesto se marca detectablemente.

23. El procedimiento del aspecto 21 o del aspecto 22, donde el compuesto es un anticuerpo.

24. El procedimiento de cualquiera de los aspectos del 21 al 23, donde el compuesto está unido a un soporte sólido.

25. El procedimiento de cualquiera de los aspectos del 1 al 20, donde los biomarcadores son polinucleótidos.

30 26. El procedimiento de cualquiera de los aspectos anteriores, donde el procedimiento comprende:

ii) la comparación de la presencia y/o el nivel de los biomarcadores con un control, donde una presencia y/o el nivel en la muestra que sea distinta a la del control son indicativos de cáncer colorrectal.

27. El procedimiento de cualquiera de los aspectos anteriores, donde la muestra comprende sangre, plasma, suero, 35 orina, plaquetas, magacariocitos o heces.

28. Un procedimiento de tratamiento que comprende:

(i) el diagnóstico o detección del cáncer colorrectal de acuerdo con el procedimiento de la invención; y

29. Un procedimiento para monitorizar la eficacia del tratamiento del cáncer colorrectal en un sujeto, comprendiendo 40 el procedimiento el tratamiento del sujeto contra el cáncer y después la detección de la presencia y/o el nivel de al

menos dos biomarcadores seleccionados de entre IL-8, IGFBP2, MAC2BP, M2PK, IL-13, DKK-3, EpCam, MIP1p, TGFp1, y TIMP-1 en una muestra del sujeto, donde una ausencia de y/o reducción en el nivel de expresión de los polipéptidos después del tratamiento al compararlos antes del tratamiento son indicativos de la eficacia del tratamiento.

45 30. Una matriz de al menos dos compuestos para el diagnóstico o detección del cáncer colorrectal, donde cada uno de los compuestos se une a un polipéptido biomarcador seleccionado de entre IL-8, IGFBP2, MAC2BP, M2PK, IL- 13, DKK-3, EpCam, MIP1p, TGFp1, y TIMP-1.

31. Un kit para el diagnóstico o detección del cáncer colorrectal en un sujeto, comprendiendo el kit dos compuestos que se unen cada uno a diferentes polipéptidos biomarcadores seleccionados de entre IL-8, IGFBP2, MAC2BP,

50 M2PK, IL-13, DKK-3, EpCam, MIP1p, TGFp1, y TIMP-1.

EJEMPLOS

Materiales y procedimientos

55

Muestras de paciente

Se tomó y procesó una recolección de muestras de plasma y suero a partir de una cohorte de pacientes con cáncer colorrectal (Etapas A-D de Dukes) que se estaban tratando en varios hospitales.

También se recogió y procesó sangre de un grupo de aproximadamente 50 voluntarios sanos de aproximadamente 65 años de edad y de un grupo de 15 sobre la edad de 50.

Se realizaron cuatro estudios separados con biomarcadores ligeramente diferentes. El Estudio 1 examinó 52 5 muestras de cáncer y 50 de controles, el Estudio 2 examinó 55 muestras de cáncer y 53 de controles, el Estudio 3 y el 4 examinaron a 96 muestras de cáncer y 50 de controles. En los estudios 2, 3 y 4 los pacientes fueron emparejados por edad y sexo en las Etapas de Dukes, véase la Tabla 2 para las estadísticas de resumen.

Tabla 2. Características de voluntarios normales y pacientes con cáncer colorrectal usadas en los estudios 2, 3 y 4.

: Controles Cáncer

: n= 50 n= 96

Sexo

hombre: 25 48

mujer: 25 48

Edad media (años): 68 68

Etapa de Dukes

A: 22

B: 30

C: 30

D: 14

Lugar del tumor

colon: 73

recto: 17

desconocido: 6

Proximal (incluye ciego, ascendente, flexura hepática y colon transverso): 43

Distal (incluye flexión esplénica, descendente, sigmoide y recto): 47

10

Análisis de biomarcadores

Los análisis de biomarcadores se hicieron con kits comerciales y anticuerpos extraídos (DSL, R&D Duoset, Calbiotech, Millipore, Abnova, Genway, Peviva, Schebo, Bender) y usando ensayos ELISA Luminex.

15

Evaluación estadística y modelado de biomarcadores por paneles

Los resultados de cada ensayo se analizaron usando los paquetes de software de estadística Prism y "R". El rendimiento individual de los marcadores se evaluó usando la prueba t Mann-Whitney no paramétrica y se generaron 20 curvas de eficacia diagnóstica (ROC) individuales.

La regresión logística y las estrategias de modelado relacionadas se usaron para encontrar las combinaciones de biomarcadores que mejor separaron controles y pacientes con cáncer colorrectal.

25 Se realizaron cuatro estudios separados con las mismas muestras/alícuotas. Los resultados de cada uno se dan a continuación.

Resultados del Estudio 1, 2 y 3

30 Los biomarcadores elegidos para medirse en el Estudio 1 y 2 y 3 se enumeran en la Tabla 3. Los biomarcadores en negrita son aquellos identificados como prometedores en cada estudio (es decir, fueron significativamente diferentes en las muestras de cáncer colorrectal frente a control y/o se identificaron en paneles de biomarcadores combinados que distinguían el cáncer colorrectal de los controles).

35 Tabla 3. Biomarcadores analizados en los estudios.

Estudio 1: Estudio 2 Estudio 3

IGF-I: IGF-BP2 IGF-BP2 (DSL)

IGF-II
IGF-II
IGF-II

IGF-BP2: IGF-BP3 IFNg

IGF-BP3: Her2 TNFa

BTC: VegFA IL-10

Anfirregulina: VegFC IL-6

VegFA: VegFD GM-CSF

VegFC: TiMp-1 IL-12

VegFD: TIMP-2 IL-13

MMP-2: MMP-1 IL-8

MMP-7: MMP-2 IL-4

MMP-9: MMP-3 I1-2

TIMP-2: MMP-7 IL-1 b

Her2: MMP-8 MMP-1

: MMP-12 MMP-2

: MMP-13 MMP-3

: ENA-78 MMP-7

: MCP-1 MMP-8

: MIP-1 beta MMP-9

: GM-CSF ENA-78

: IFN-gamma MIP-1alpha

: IL-10 MIP-1 beta

: IL-12 MCP-1

: IL-13 Mac-2BP

: IL-1 beta TIMP-1

: IL-2 TIMP-2

: IL-4 Gro-alpha

: IL-6 Piruvato cinasa M2 tumoral

: IL-8 M30-apoptosentido

: TNF-alpha M65

: Cripto Trail-R2


: P-cadherina


: OPN


: Dkk-3


: EpCam


: TGFbeta1


: REG IV


: CEA


: DcR3


: CA19.9


: Anfirregulina


: CEACAM6


: VegFA pan


: VegFA165b


: Espondina-2


: survivina

Evaluación estadística y modelado de biomarcadores por paneles

Para encontrar las combinaciones de biomarcadores que mejor separaron los controles y los pacientes con cáncer 5 colorrectal, se adoptó la selección de variable posterior con criterios de información bayesiana para penalizar la probabilidad logarítmica para impedir la sobrevaloración. Para estimar el rendimiento probable del panel de biomarcadores en un conjunto de datos independiente, se usó la validación cruzada "N-veces" o "dejar uno fuera". En este procedimiento se excluyó una observación cada vez mientras que todo el algoritmo de ajuste del modelo se aplicó a las observaciones restantes.

10

Después, el modelo resultante se usó para estimar la probabilidad de que la observación excluida es un caso. Esto se repitió para cada observación en el conjunto de datos. De esta forma, cada observación a su vez actuó como una prueba independiente del algoritmo de creación de modelos. El conjunto de datos resultante constituido por casos y controles, cada uno con una probabilidad de caso "independientemente prevista", se puede comparar después con 15 el modelo original. La capacidad de elegir entre numerosos biomarcadores y ponderarlos apropiadamente permite una estrategia de búsqueda que optimiza el rendimiento en las regiones de interés en la curva ROC. El coste por la baja especificidad es un gran número de colonoscopias innecesarias.

En el estudio 3, se evaluaron 48 biomarcadores potenciales para seleccionar un panel candidato de biomarcadores de cáncer colorrectal, aleatorización por bloques en las placas para evitar el sesgo. De esta lista de 48 solo 42 mostraron niveles medibles. Individualmente 14 biomarcadores mostraron diferencias significativas entre los 5 controles y CRC como evaluó la prueba t; (IGFII, IGFBP2, IL-8, IL-6, MMP-1, MMP-7, s90/Mac2BP, M2PK, EpCam, TIMP-1 (suero y plasma), M65, OPN, TGFp1, VEGFpan. Como se esperaba, ninguno de ellos tuvo la suficiente sensibilidad o especificidad para ser útil como biomarcador por sí mismo (no mostrado). Sin embargo, usando una variedad de estrategias de modelado, incluyendo el uso de valores logarítmicos, se demostró que varios paneles distintos de biomarcadores superaban el rendimiento de FOBT especialmente para etapas tempranas y tardías de la 10 enfermedad.

La Figura 1 muestra los resultados de un panel de 7 biomarcadores que incluyó IL8 (suero), IL-13 (suero), EpCAM (plasma), M2PK (plasma), IGFBP2 (suero) y Mac2BP (suero) y al que se realizó la validación cruzada para predecir su rendimiento en muestras independientes.

15

Este modelo de 7 biomarcadores que se describió al menos conceptualmente como

log

f_P_'

1 ~P

Po + PllfilLi + P ¡OFSPl^ 1GF3P2 + P iMC2BP^ MAC1BP + Pm2PK^¡í2PK + P DKK'fi D

20 proporcionó buen rendimiento a alta especificidad y resultó robusto bajo validación cruzada. Los coeficientes estimados para obtener el mejor modelo para esta combinación de biomarcadores en plasma se enumeran en la Tabla 4. Las estadísticas del rendimiento se proporcionan en la Tabla 5. Este rendimiento supera al citado para FOBT (65,8 % de sensibilidad, 95 % de especificidad) (Morikawa y cols., 2005).

25 _______________Tabla 4. Coeficientes para la combinación de biomarcador.

Biomarcador: Medido en Unidades de concentración Coeficiente

Intersección: ND ND -37,74

IL-8: suero pg/ml 1,07

IL-13: suero pg/ml -0,28

EpCAM: plasma pg/ml -0,33

M2PK: plasma unidades/ml 1,40

IGFBP2: suero ng/ml 1,99

Mac2BP: suero ng/ml 2,39

MIP1beta: Suero Pg/ml -1,19

Tabla 5. Rendimiento del modelo de 7 biomarcadores y validación cruzada.

: Estimación del modelo Validación cruzada

Área debajo de la curva ROC (AUC): 0,91 0,86

Sensibilidad a una especificidad del 80 %: 0,84 0,78

Sensibilidad a una especificidad del 90 %: 0,81 0,69

Este modelo también se aplicó separadamente en pacientes para cada etapa de cáncer colorrectal (Etapas A, B, C, 30 D de Dukes) y demostró que funcionaba igual de bien en cada etapa (Figura 2). Los AUC fueron de 0,88-0,93 y fueron casi igualmente buenos en discriminar todas las etapas del cáncer colorrectal. El modelo demostró la sensibilidad más alta del 90 % a una especificidad del 90 % para la Etapa de y la sensibilidad más baja al 73 % a una especificidad del 90 % para la Etapa B (Tabla 6).

35 ________________Tabla 6. Rendimiento del modelo por la Etapa de Dukes_______________

: Etapa A Etapa B Etapa C Etapa C

Área debajo de la curva ROC (AUC): 0,89 0,88 0,93 0,91

Sensibilidad a una especificidad del 80 %: 0,82 0,77 0,90 0,93

Sensibilidad a una especificidad del 90 %: 0,77 0,73 0,90 0,86

Estudio 4 (también conocido como "Estudio 3 recalculado")

En el estudio 4, se recalcularon 10 biomarcadores en la misma cohorte que en el Estudio 3. Se recogió sangre de 96 40 pacientes con cáncer colorrectal y de 50 sujetos normales (los controles). En este estudio la atención se centró en

10 biomarcadores, a saber IGFBP2, IL8, IL13,Mac2BP, M2PK, Dkk3, EpCam, TGFbetal, TIMP-1, MIP1beta. Los ensayos se realizaron como se describe previamente. Los niveles de suero y plasma de cada uno de los biomarcadores se midieron y compararon con los valores de control.

5 Cuando se modeló en pares (dos marcadores), un total de 5 pares (de un máximo de 45 combinaciones seleccionadas de entre la lista anterior de 10 biomarcadores) pueden demostrar que producen una sensibilidad superior al 52 % a una especificidad del 95 %. Véase la Tabla 7 y la Figura 3.

Tabla 7. Pares de biomarcadores que producen pruebas de diagnóstico precoz útiles en validación cruzada.

Biomarcador 1: Biomarcador 2 Sensibilidad estimada en la muestra (prueba) a una especificidad del 95 % Sensibilidad estimada fuera de la muestra (validación cruzada) a una especificidad del 95 %

M2PK: EpCAM 58,3 % 58,3 %

M2PK: IL13 56,3 % 57,3 %

Dkk3: M2PK 55,2 % 55,2 %

M2PK: IL8 60,4 % 54,2 %

M2PK: IGFBP2 58,3 % 52,1 %

10

Al analizar combinaciones de tres a diez de los biomarcadores nominados, hay 968 combinaciones posibles. Las 968 combinaciones de entre 3 y 10 biomarcadores consisten en 120 combinaciones de 3 marcadores; 210 combinaciones de 4 marcadores; 252 combinaciones de 5 marcadores; 210 combinaciones de 6 marcadores; 120 combinaciones de 7 marcadores; 45 combinaciones de 8 marcadores; 10 combinaciones de 9 marcadores y la 15 combinación única que incluye los 10 biomarcadores. Cuando se modelaron utilizando un modelo logístico lineal y se probaron después mediante validación cruzada de 10 veces, aproximadamente la mitad de las 968 combinaciones tenían una sensibilidad del 50 % con una especificidad del 95 %, véase la Figura 4 que muestra los resultados para una combinación de tres biomarcadores. Más de la mitad de esas combinaciones tendría una especificidad de 90 % y una sensibilidad del 50 %.

20

La Figura 5 muestra todas las 485 curvas ROC fuera de la muestra (validación cruzada de 10 veces) estimadas para las pruebas de un total posible de 968 modelos basados en todas las combinaciones posibles de 3 a 10 de los biomarcadores. Tenga en cuenta que los segmentos individuales de las 485 curvas ROC son coincidentes, a causa de que cada segmento horizontal representa un control y cada segmento vertical un caso. En este caso, el 50,1 % 25 de las combinaciones han superado el 50 % de la sensibilidad, el 95 % de la especificidad, el mejor rendimiento "fuera de la muestra" estimado es una sensibilidad del 76 % a una especificidad del 95 %. La repetición de la validación cruzada seleccionará un conjunto diferente de modelos, la sensibilidad de cualquier combinación puede variar en un 10 % a una especificidad del 95 % debido al muestreo aleatorio, pero resultará en una proporción similar de "pruebas de diagnóstico precoz útiles" útiles. La validación precisa de modelos individuales requiere de 30 experimentos repetidos y tamaños de muestras mayores.

La Figura 6 muestra cuántas de las 485 combinaciones con el 50 % de sensibilidad, el 95 % de especificidad, incluye cualquier marcado dado. Como máximo, 432 de las combinaciones "útiles" incluyen M2PK. Como mínimo, 227 de las combinaciones "útiles" incluyen MIP1beta. Esta alta representación de los 10 biomarcadores en modelos 35 "útiles" muestra la unidad y autocomplementación de la selección de estos 10 biomarcadores.

La Figura 7 a la Figura 11 demuestran algunos de los resultados de este último estudio (Estudio 4) para las combinaciones de 5 a 7 biomarcadores, incluyendo un modelo donde las muestras son de agrupaciones de plasma o de suero. La Figura 11 demuestra la validez de la elección de los tres biomarcadores (DKK-3, M2PK y IGFBP2) a 40 etapas diferentes de la progresión de la enfermedad. Los datos indican que en la Etapa A si se usan los tres biomarcadores, la prueba aún logrará una importante sensibilidad (64 %) a una especificidad del 95 % lo que es comparable a la sensibilidad lograda en la etapa tardía de la enfermedad (79 %). Que es el panel de los tres biomarcadores que recogerá etapas tempranas de la enfermedad permitiendo la detección temprana.

45 Las listas de las Tablas de la 8 a la 16 resultan de varias combinaciones de varios conjuntos de paneles de biomarcadores. Dependiendo de la regresión lineal que se usa, así como del control de cohorte y otros factores como por ejemplo la derivación de la muestra y la técnica del kit de ensayo, puede haber variaciones en las figuras actuales o en el orden de los biomarcadores. Independientemente, muchas de estas combinaciones lograrán buena selectividad a altas especificidades como para ser útiles para el diagnóstico o detección del cáncer colorrectal a 50 cualquier etapa de la progresión de la enfermedad.

Tabla 8. Combinación de tres biomarcadores en suero que iguala o supera el 50 % de sensibilidad a una _____________________________especificidad del 95 %.____________________________

BM1: BM2 BM3 Sensibilidad de la prueba a una especificidad del 95 % Sensibilidad de la validación cruzada a una especificidad del 95 %

Dkk3: M2PK IGFBP2 72,9 % 70,8 %

Dkk3: M2PK IL8 62,5 % 61,5 %

M2PK: IL13 IGFBP2 65,6 % 61,5 %

M2PK: IGFBP2 EpCAM 63,5 % 61,5 %

M2PK: IL8 IGFBP2 65,6 % 60,4 %

M2PK: IL8 IL13 61,5 % 58,3 %

M2PK: MIP1beta IL13 55,2 % 57,3 %

M2PK: IL8 Mac2BP 59,4 % 57,3 %

M2PK: MIP1beta TGFbeta1 57,3 % 56,3 %

M2PK: IL8 EpCAM 64,6 % 56,3 %

Dkk3: M2PK IL13 59,4 % 55,2 %

Dkk3: M2PK EpCAM 56,3 % 55,2 %

M2PK: MIP1beta EpCAM 59,4 % 55,2 %

M2PK: IL8 TGFbeta1 58,3 % 55,2 %

M2PK: IL8 TIMP1 57,3 % 55,2 %

TGFbeta1: Mac2BP TIMP1 54,2 % 55,2 %

M2PK: Mac2BP IGFBP2 58,3 % 54,2 %

Dkk3: IL8 Mac2BP 55,2 % 53,1 %

M2PK: MIP1beta Mac2BP 52,1 % 53,1 %

M2PK: MIP1beta IGFBP2 57,3 % 53,1 %

M2PK: TIMP1 EpCAM 58,3 % 53,1 %

M2PK: MIP1beta IL8 56,3 % 52,1 %

M2PK: IL13 TIMP1 58,3 % 52,1 %

Dkk3: M2PK Mac2BP 57,3 % 51,0 %

Dkk3: M2PK TIMP1 55,2 % 51,0 %

M2PK: IL13 Mac2BP 58,3 % 51,0 %

M2PK: TGFbeta1 IGFBP2 52,1 % 51,0 %

M2PK: TGFbeta1 TIMP1 57,3 % 51,0 %

M2PK: TGFbeta1 Mac2BP 56,3 % 50,0 %

IL8: IL13 Mac2BP 61,5 % 50,0 %

IL8: TGFbeta1 Mac2BP 53,1 % 50,0 %

M2PK: MIP1beta TIMP1 49,0 % 49,0 %

M2PK: TGFbeta1 EpCAM 49,0 % 47,9 %

IL8: IL13 IGFBP2 49,0 % 47,9 %

IL8: Mac2BP IGFBP2 57,3 % 47,9 %

Dkk3: M2PK MIP1beta 55,2 % 46,9 %

TGFbeta1: Mac2BP IGFBP2 46,9 % 46,9 %

Dkk3: Mac2BP IGFBP2 49,0 % 45,8 %

M2PK: IL13 EpCAM 50,0 % 45,8 %

IL8: Mac2BP TIMP1 52,1 % 45,8 %

IL13: Mac2BP IGFBP2 45,8 % 44,8 %

Dkk3: IL8 TGFbeta1 41,7 % 43,8 %

MIP1beta: IL8 Mac2BP 42,7 % 43,8 %

MIP1beta: IL8 EpCAM 44,8 % 43,8 %

IL8: TGFbeta1 EpCAM 46,9 % 43,8 %

Dkk3: IL8 EpCAM 51,0 % 42,7 %

IL8: IGFBP2 EpCAM 43,8 % 42,7 %

M2PK: Mac2BP TIMP1 51,0 % 41,7 %

Tabla 9. Combinación de cuatro biomarcadores incluyendo DKK-3 en suero que iguala o supera el 50 % de _____________________sensibilidad a una especificidad del 95 %. _____________________

BM1: BM2 BM3 BM4 Sensibilidad de la prueba a una especificidad del 95 % Sensibilidad de la validación cruzada a una especificidad del 95 %

Dkk3: M2PK Mac2BP IGFBP2 68,8 % 69,8 %

Dkk3: M2PK IL8 IL13 71,9 % 68,8 %

Dkk3: M2PK IL8 EpCAM 70,8 % 67,7 %

Dkk3: M2PK TGFbeta1 Mac2BP 67,7 % 65,6 %

Dkk3: M2PK IL8 IGFBP2 69,8 % 64,6 %

Dkk3: M2PK IL8 Mac2BP 69,8 % 63,5 %

Dkk3: M2PK MIP1beta TGFbeta1 65,6 % 61,5 %

Dkk3: M2PK IL8 TIMP1 68,8 % 61,5 %

Dkk3: M2PK IL13 IGFBP2 63,5 % 61,5 %

Dkk3: M2PK MIP1beta IL8 59,4 % 60,4 %

Dkk3: M2PK IGFBP2 EpCAM 68,8 % 60,4 %

Dkk3: M2PK MIP1beta IGFBP2 69,8 % 59,4 %

Dkk3: M2PK TGFbeta1 IGFBP2 61,5 % 59,4 %

Dkk3: M2PK IL13 Mac2BP 56,3 % 58,3 %

Dkk3: M2PK TGFbeta1 TIMP1 65,6 % 58,3 %

Dkk3: M2PK MIP1beta IL13 57,3 % 57,3 %

Dkk3: IL8 Mac2BP IGFBP2 62,5 % 56,3 %

Dkk3: M2PK IL8 TGFbeta1 65,6 % 55,2 %

Dkk3: M2PK IL13 TIMP1 57,3 % 55,2 %

Dkk3: M2PK Mac2BP TIMP1 57,3 % 55,2 %

Dkk3: M2PK MIP1beta Mac2BP 57,3 % 54,2 %

Dkk3: IL8 IL13 Mac2BP 61,5 % 54,2 %

Dkk3: M2PK TGFbeta1 EpCAM 61,5 % 53,1 %

Dkk3: M2PK IGFBP2 TIMP1 61,5 % 53,1 %

Dkk3: M2PK IL13 TGFbeta1 63,5 % 52,1 %

Dkk3: M2PK TIMP1 EpCAM 56,3 % 52,1 %

Dkk3: IL8 Mac2BP TIMP1 57,3 % 52,1 %

Dkk3: M2PK MIP1beta EpCAM 60,4 % 51,0 %

Dkk3: TGFbeta1 Mac2BP TIMP1 59,4 % 51,0 %

Tabla 10. Combinación de cuatro biomarcadores incluyendo M2PK en suero que iguala o supera el 50 % de 5 _____________________sensibilidad a una especificidad del 95 %. ____________________

M2PK: IL8 Mac2BP TIMP1 63,5 % 65,6 %

M2PK: Mac2BP IGFBP2 EpCAM 70,8 % 65,6 %

M2PK: IL8 IL13 Mac2BP 66,7 % 64,6 %

M2PK: IL8 TGFbeta1 Mac2BP 65,6 % 64,6 %

M2PK: MIP1beta IL13 IGFBP2 64,6 % 62,5 %

M2PK: IL8 IL13 TIMP1 64,6 % 62,5 %

M2PK: IL8 IL13 EpCAM 65,6 % 62,5 %

M2PK: IL13 Mac2BP IGFBP2 69,8 % 62,5 %

M2PK: MIP1beta IL8 IL13 63,5 % 61,5 %

M2PK: IL8 Mac2BP EpCAM 65,6 % 61,5 %

M2PK: IL13 IGFBP2 EpCAM 69,8 % 61,5 %

M2PK: MIP1beta IL8 TGFbeta1 58,3 % 58,3 %

M2PK: IL8 IL13 IGFBP2 67,7 % 58,3 %

M2PK: IL8 Mac2BP IGFBP2 61,5 % 58,3 %

M2PK: IL8 IGFBP2 EpCAM 64,6 % 58,3 %

M2PK: IL13 TGFbeta1 IGFBP2 64,6 % 58,3 %

M2PK: IL13 TGFbeta1 EpCAM 62,5 % 58,3 %

M2PK: IL13 IGFBP2 TIMP1 62,5 % 58,3 %

M2PK: TGFbeta1 Mac2BP TIMP1 62,5 % 58,3 %

M2PK: TGFbeta1 IGFBP2 EpCAM 61,5 % 58,3 %

M2PK: MIP1beta IL13 TIMP1 57,3 % 57,3 %

M2PK: MIP1beta TGFbeta1 TIMP1 58,3 % 57,3 %

M2PK: MIP1beta IGFBP2 EpCAM 65,6 % 57,3 %

M2PK: MIP1beta IL8 Mac2BP 54,2 % 56,3 %

M2PK: IL8 IL13 TGFbeta1 64,6 % 56,3 %

M2PK: IL8 TIMP1 EpCAM 62,5 % 56,3 %

M2PK: IL13 Mac2BP TIMP1 57,3 % 56,3 %

M2PK: TGFbeta1 Mac2BP IGFBP2 60,4 % 56,3 %

M2PK: IGFBP2 TIMP1 EpCAM 63,5 % 56,3 %

M2PK: MIP1beta IL8 TIMP1 57,3 % 55,2 %

M2PK: IL8 TGFbeta1 TIMP1 57,3 % 55,2 %

M2PK: MIP1beta IL13 Mac2BP 57,3 % 54,2 %

M2PK: MIP1beta IL8 EpCAM 62,5 % 53,1 %

M2PK: MIP1beta TIMP1 EpCAM 59,4 % 52,1 %

M2PK: IL13 TGFbeta1 TIMP1 64,6 % 52,1 %

M2PK: IL13 Mac2BP EpCAM 51,0 % 52,1 %

M2PK: MIP1beta IL13 TGFbeta1 57,3 % 51,0 %

M2PK: MIP1beta Mac2BP IGFBP2 57,3 % 51,0 %

M2PK: TGFbeta1 Mac2BP EpCAM 52,1 % 51,0 %

M2PK: TGFbeta1 TIMP1 EpCAM 59,4 % 51,0 %

M2PK: MIP1beta IL8 IGFBP2 52,1 % 50,0 %

M2PK: Mac2BP TIMP1 EpCAM 52,1 % 50,0 %

M2PK: MIP1beta TGFbeta1 Mac2BP 63,5 % 49,0 %

M2PK: MIP1beta IL13 EpCAM 50,0 % 47,9 %

M2PK: MIP1beta TGFbeta1 EpCAM 53,1 % 47,9 %

M2PK: IL13 TGFbeta1 Mac2BP 60,4 % 46,9 %

M2PK: MIP1beta TGFbeta1 IGFBP2 49,0 % 44,8 %

Tabla 11. Combinación de cinco biomarcadores en suero que iguala o supera el 50 % de sensibilidad a una __________________________ especificidad del 95 %.______________________________

BM1: BM2 BM3 BM4 BM5 Sensibilidad de la prueba a una especificidad del 95 % Sensibilidad de la validación cruzada a una especificidad del 95 %

Dkk3: M2PK IL8 IL13 Mac2BP 74,0 % 70,8 %

Dkk3: M2PK IL8 IL13 TIMP1 71,9 % 70,8 %

M2PK: TGFbeta1 Mac2BP IGFBP2 EpCAM 69,8 % 70,8 %

Dkk3: M2PK MIP1beta IL8 IL13 71,9 % 69,8 %

Dkk3: M2PK MIP1beta IGFBP2 EpCAM 71,9 % 69,8 %

Dkk3: M2PK IL8 IGFBP2 EpCAM 78,1 % 69,8 %

Dkk3: M2PK TGFbeta1 Mac2BP IGFBP2 68,8 % 69,8 %

M2PK: MIP1beta Mac2BP IGFBP2 EpCAM 69,8 % 68,8 %

Dkk3: M2PK IL8 TGFbeta1 Mac2BP 70,8 % 67,7 %

Dkk3: M2PK Mac2BP IGFBP2 EpCAM 70,8 % 67,7 %

M2PK: MIP1beta IL8 IL13 Mac2BP 66,7 % 67,7 %

Dkk3: M2PK IL8 IL13 IGFBP2 70,8 % 66,7 %

Dkk3: M2PK IL13 TGFbeta1 IGFBP2 68,8 % 66,7 %

Dkk3: M2PK IL13 IGFBP2 EpCAM 66,7 % 66,7 %

M2PK: IL13 Mac2BP IGFBP2 EpCAM 71,9 % 66,7 %

Dkk3: M2PK IL8 IL13 TGFbeta1 69,8 % 65,6 %

Dkk3: M2PK IL8 Mac2BP TIMP1 67,7 % 65,6 %

Dkk3: M2PK TGFbeta1 Mac2BP EpCAM 66,7 % 65,6 %

M2PK: IL8 IL13 TGFbeta1 Mac2BP 71,9 % 65,6 %

M2PK: IL8 IL13 TGFbeta1 IGFBP2 66,7 % 65,6 %

M2PK: IL8 TGFbeta1 Mac2BP IGFBP2 64,6 % 65,6 %

M2PK: IL8 TGFbeta1 Mac2BP EpCAM 69,8 % 65,6 %

Dkk3: M2PK MIP1beta IL8 IGFBP2 66,7 % 64,6 %

Dkk3: M2PK MIP1beta Mac2BP IGFBP2 70,8 % 64,6 %

M2PK: MIP1beta IL8 IL13 TIMP1 65,6 % 64,6 %

M2PK: MIP1beta IL8 TGFbeta1 Mac2BP 65,6 % 64,6 %

M2PK: IL8 IL13 Mac2BP EpCAM 76,0 % 64,6 %

M2PK: IL8 IL13 IGFBP2 EpCAM 72,9 % 64,6 %

M2PK: IL8 TGFbeta1 Mac2BP TIMP1 64,6 % 64,6 %

M2PK: IL8 Mac2BP IGFBP2 EpCAM 71,9 % 64,6 %

Dkk3: M2PK IL13 TGFbeta1 TIMP1 68,8 % 63,5 %

Dkk3: M2PK IGFBP2 TIMP1 EpCAM 67,7 % 63,5 %

M2PK: MIP1beta IL13 IGFBP2 EpCAM 67,7 % 63,5 %

M2PK: IL13 TGFbeta1 Mac2BP IGFBP2 66,7 % 63,5 %

M2PK: IL13 TGFbeta1 IGFBP2 EpCAM 70,8 % 63,5 %

Dkk3: M2PK MIP1beta IL13 TGFbeta1 69,8 % 62,5 %

Dkk3: M2PK IL8 IL13 EpCAM 65,6 % 62,5 %

Dkk3: M2PK IL8 TGFbeta1 IGFBP2 70,8 % 62,5 %

Dkk3: M2PK IL8 Mac2BP IGFBP2 69,8 % 62,5 %

Dkk3: M2PK IL13 TGFbeta1 Mac2BP 68,8 % 62,5 %

Dkk3: M2PK TGFbeta1 Mac2BP TIMP1 68,8 % 62,5 %

Dkk3: M2PK TGFbeta1 TIMP1 EpCAM 67,7 % 62,5 %

M2PK: IL8 IL13 Mac2BP TIMP1 64,6 % 62,5 %

M2PK: IL8 IL13 IGFBP2 TIMP1 66,7 % 62,5 %

M2PK: IL13 IGFBP2 TIMP1 EpCAM 68,8 % 62,5 %

Dkk3: M2PK MIP1beta IL13 IGFBP2 63,5 % 61,5 %

Dkk3: M2PK IL8 TGFbeta1 TIMP1 64,6 % 61,5 %

Tabla 12. Combinación de siete biomarcadores en suero que iguala o supera el 50 % de sensibilidad a una ____________________________especificidad del 95 %. _______________________________

BM1: BM2 BM3 BM4 BM5 BM6 BM7 Sensibilidad de la prueba a una especificidad del 95 % Sensibilidad de la validación cruzada a una especificidad del 95 %

Dkk3: M2PK IL8 Mac2BP IGFBP2 TIMP1 EpCAM 78 % 56 %

Dkk3: M2PK MIP1beta IL8 Mac2BP IGFBP2 EpCAM 76 % 64 %

Dkk3: M2PK IL8 IL13 Mac2BP IGFBP2 TIMP1 73 % 69 %

Dkk3: M2PK IL8 TGFbeta1 Mac2BP IGFBP2 TIMP1 72 % 68 %

Dkk3: M2PK IL8 TGFbeta1 Mac2BP IGFBP2 EpCAM 71 % 62 %

Dkk3: M2PK MIP1beta IL8 Mac2BP IGFBP2 TIMP1 70 % 64 %

Dkk3: M2PK IL8 IL13 Mac2BP IGFBP2 EpCAM 70 % 67 %

Dkk3: M2PK IL8 IL13 TGFbeta1 Mac2BP IGFBP2 69 % 66 %

M2PK: MIP1beta IL8 Mac2BP IGFBP2 TIMP1 EpCAM 69 % 55 %

Dkk3: M2PK MIP1beta IL8 IL13 Mac2BP IGFBP2 67 % 68 %

Dkk3: M2PK MIP1beta IL8 TGFbeta1 Mac2BP IGFBP2 67 % 64 %

Dkk3: M2PK MIP1beta TGFbeta1 Mac2BP IGFBP2 TIMP1 65 % 59 %

Dkk3: M2PK IL8 IL13 TGFbeta1 IGFBP2 TIMP1 65 % 52 %

Dkk3: M2PK IL8 TGFbeta1 IGFBP2 TIMP1 EpCAM 64 % 56 %

Dkk3: M2PK IL13 TGFbeta1 Mac2BP IGFBP2 TIMP1 64 % 57 %

M2PK: MIP1beta IL8 IL13 IGFBP2 TIMP1 EpCAM 64 % 50 %

Dkk3: M2PK MIP1beta IL8 IL13 Mac2BP TIMP1 63 % 55 %

Dkk3: M2PK MIP1beta IL8 TGFbeta1 IGFBP2 EpCAM 63 % 58 %

Dkk3: M2PK MIP1beta IL13 TGFbeta1 Mac2BP IGFBP2 63 % 53 %

Dkk3: M2PK IL8 IL13 TGFbeta1 Mac2BP TIMP1 63 % 59 %

M2PK: MIP1beta IL8 TGFbeta1 Mac2BP IGFBP2 EpCAM 63 % 59 %

Dkk3: M2PK MIP1beta IL8 TGFbeta1 Mac2BP TIMP1 62 % 51 %

Dkk3: M2PK MIP1beta IL8 IGFBP2 TIMP1 EpCAM 62 % 56 %

Dkk3: M2PK MIP1beta IL13 Mac2BP IGFBP2 TIMP1 62 % 39 %

Dkk3: M2PK IL8 IL13 TGFbeta1 TIMP1 EpCAM 62 % 43 %

Dkk3: M2PK IL8 TGFbeta1 Mac2BP TIMP1 EpCAM 62 % 50 %

Dkk3: MIP1beta IL8 IL13 Mac2BP IGFBP2 TIMP1 62 % 55 %

Dkk3: MIP1beta IL8 Mac2BP IGFBP2 TIMP1 EpCAM 62 % 47 %

M2PK: MIP1beta IL8 IL13 Mac2BP IGFBP2 TIMP1 62 % 56 %

M2PK: IL8 TGFbeta1 Mac2BP IGFBP2 TIMP1 EpCAM 62 % 49 %

Dkk3: M2PK IL8 IL13 TGFbeta1 IGFBP2 EpCAM 60 % 56 %

Dkk3: M2PK IL13 TGFbeta1 Mac2BP IGFBP2 EpCAM 60 % 55 %

M2PK: MIP1beta IL8 IL13 Mac2BP IGFBP2 EpCAM 60 % 53 %

Tabla 13. Siete combinaciones de biomarcadores con sensibilidad entre el 60 % y el 52 %.

Dkk3: M2PK MIP1beta IL8 IL13 TGFbeta1 EpCAM 59 % 54 %

Dkk3: M2PK MIP1beta IL8 IL13 IGFBP2 EpCAM 59 % 52 %

Dkk3: M2PK MIP1beta IL8 TGFbeta1 IGFBP2 TIMP1 59 % 52 %

Dkk3: M2PK TGFbeta1 Mac2BP IGFBP2 TIMP1 EpCAM 59 % 47 %

Dkk3: MIP1beta IL8 IL13 TGFbeta1 Mac2BP IGFBP2 59 % 52 %

Dkk3: MIP1beta IL8 TGFbeta1 Mac2BP IGFBP2 TIMP1 59 % 45 %

Dkk3: M2PK MIP1beta IL8 IL13 TGFbeta1 Mac2BP 58 % 41 %

Dkk3: M2PK MIP1beta IL8 TGFbeta1 TIMP1 EpCAM 58 % 50 %

Dkk3: M2PK IL8 IL13 IGFBP2 TIMP1 EpCAM 58 % 55 %

Dkk3: MIP1beta IL8 IL13 Mac2BP IGFBP2 EpCAM 58 % 50 %

Dkk3: IL8 IL13 TGFbeta1 Mac2BP IGFBP2 TIMP1 58 % 52 %

M2PK: IL8 IL13 Mac2BP IGFBP2 TIMP1 EpCAM 58 % 52 %

Dkk3: M2PK MIP1beta IL8 IL13 TGFbeta1 IGFBP2 57 % 49 %

Dkk3: M2PK MIP1beta IL8 IL13 TIMP1 EpCAM 57 % 48 %

Dkk3: M2PK MIP1beta IL13 Mac2BP IGFBP2 EpCAM 57 % 51 %

Dkk3: M2PK MIP1beta TGFbeta1 Mac2BP IGFBP2 EpCAM 57 % 46 %

Dkk3: M2PK MIP1beta TGFbeta1 IGFBP2 TIMP1 EpCAM 57 % 49 %

Dkk3: M2PK IL13 Mac2BP IGFBP2 TIMP1 EpCAM 57 % 49 %

Dkk3: MIP1beta IL8 TGFbeta1 Mac2BP IGFBP2 EpCAM 57 % 50 %

M2PK: MIP1beta IL8 IL13 TGFbeta1 TIMP1 EpCAM 57 % 43 %

M2PK: IL8 IL13 TGFbeta1 IGFBP2 TIMP1 EpCAM 57 % 52 %

Dkk3: M2PK MIP1beta Mac2BP IGFBP2 TIMP1 EpCAM 56 % 47 %

Dkk3: IL8 IL13 Mac2BP IGFBP2 TIMP1 EpCAM 56 % 48 %

MIP1beta: IL8 IL13 TGFbeta1 Mac2BP IGFBP2 TIMP1 56 % 54 %

Dkk3: M2PK MIP1beta IL8 TGFbeta1 Mac2BP EpCAM 55 % 35 %

Dkk3: M2PK MIP1beta IL13 IGFBP2 TIMP1 EpCAM 55 % 44 %

Dkk3: M2PK IL8 IL13 TGFbeta1 Mac2BP EpCAM 55 % 35 %

Dkk3: IL8 IL13 TGFbeta1 Mac2BP IGFBP2 EpCAM 55 % 50 %

Dkk3: IL8 IL13 TGFbeta1 IGFBP2 TIMP1 EpCAM 55 % 54 %

Dkk3: M2PK MIP1beta IL8 IL13 Mac2BP EpCAM 54 % 49 %

Dkk3: M2PK MIP1beta IL8 Mac2BP TIMP1 EpCAM 54 % 39 %

Dkk3: M2PK IL13 TGFbeta1 IGFBP2 TIMP1 EpCAM 54 % 42 %

Dkk3: IL8 TGFbeta1 Mac2BP IGFBP2 TIMP1 EpCAM 54 % 51 %

M2PK: MIP1beta IL8 IL13 TGFbeta1 IGFBP2 EpCAM 54 % 37 %

M2PK: MIP1beta IL13 Mac2BP IGFBP2 TIMP1 EpCAM 54 % 41 %

M2PK: IL8 IL13 TGFbeta1 Mac2BP IGFBP2 TIMP1 54 % 43 %

MIP1beta: IL8 IL13 TGFbeta1 Mac2BP IGFBP2 EpCAM 54 % 42 %

Dkk3: M2PK MIP1beta IL8 IL13 IGFBP2 TIMP1 53 % 52 %

Dkk3: M2PK IL8 IL13 Mac2BP TIMP1 EpCAM 53 % 42 %

M2PK: MIP1beta IL8 TGFbeta1 IGFBP2 TIMP1 EpCAM 53 % 34 %

M2PK: MIP1beta IL13 TGFbeta1 Mac2BP IGFBP2 EpCAM 53 % 45 %

: IL8 IL13 TGFbeta1 Mac2BP IGFBP2 EpCAM 53 % 51 %

MIP1beta: IL8 IL13 Mac2BP IGFBP2 TIMP1 EpCAM 53 % 39 %

MIP1beta: IL8 TGFbeta1 Mac2BP IGFBP2 TIMP1 EpCAM 53 % 51 %

Tabla 14. Siete combinaciones de biomarcadores con sensibilidad <53 %.

M2PK: MIP1beta IL8 IL13 TGFbeta1 Mac2BP EpCAM 52 % 42 %

Dkk3: M2PK MIP1beta IL13 TGFbeta1 IGFBP2 EpCAM 51 % 41 %

Dkk3: MIP1beta IL8 IL13 TGFbeta1 TIMP1 EpCAM 51 % 35 %

M2PK: MIP1beta IL8 IL13 TGFbeta1 IGFBP2 TIMP1 51 % 38 %

M2PK: MIP1beta IL8 TGFbeta1 Mac2BP IGFBP2 TIMP1 51 % 30 %

M2PK: IL13 TGFbeta1 Mac2BP IGFBP2 TIMP1 EpCAM 51 % 37 %

Dkk3: M2PK MIP1beta IL8 IL13 TGFbeta1 TIMP1 50 % 48 %

Dkk3: MIP1beta IL8 IL13 TGFbeta1 Mac2BP TIMP1 50 % 41 %

Dkk3: MIP1beta IL8 IL13 TGFbeta1 IGFBP2 TIMP1 50 % 42 %

M2PK: MIP1beta IL8 IL13 TGFbeta1 Mac2BP IGFBP2 50 % 49 %

M2PK: MIP1beta IL8 IL13 TGFbeta1 Mac2BP TIMP1 50 % 35 %

MIP1beta: IL8 IL13 TGFbeta1 IGFBP2 TIMP1 EpCAM 50 % 39 %

Dkk3: M2PK MIP1beta IL13 TGFbeta1 IGFBP2 TIMP1 49 % 44 %

Dkk3: MIP1beta IL8 IL13 TGFbeta1 Mac2BP EpCAM 49 % 33 %

M2PK: IL8 IL13 TGFbeta1 Mac2BP TIMP1 EpCAM 49 % 43 %

Dkk3: M2PK MIP1beta IL13 Mac2BP TIMP1 EpCAM 48 % 43 %

Dkk3: MIP1beta IL8 IL13 Mac2BP TIMP1 EpCAM 48 % 38 %

Dkk3: MIP1beta IL8 TGFbeta1 Mac2BP TIMP1 EpCAM 48 % 40 %

Dkk3: MIP1beta IL13 Mac2BP IGFBP2 TIMP1 EpCAM 48 % 31 %

Dkk3: IL8 IL13 TGFbeta1 Mac2BP TIMP1 EpCAM 48 % 38 %

M2PK: MIP1beta IL8 IL13 Mac2BP TIMP1 EpCAM 48 % 33 %

M2PK: MIP1beta IL13 TGFbeta1 IGFBP2 TIMP1 EpCAM 48 % 45 %

M2PK: MIP1beta TGFbeta1 Mac2BP IGFBP2 TIMP1 EpCAM 48 % 37 %

M2PK: MIP1beta IL13 TGFbeta1 Mac2BP TIMP1 EpCAM 47 % 41 %

IL8: IL13 TGFbeta1 Mac2BP IGFBP2 TIMP1 EpCAM 47 % 40 %

Dkk3: MIP1beta IL13 TGFbeta1 Mac2BP IGFBP2 TIMP1 46 % 42 %

M2PK: MIP1beta IL8 TGFbeta1 Mac2BP TIMP1 EpCAM 46 % 30 %

Dkk3: M2PK MIP1beta TGFbeta1 Mac2BP TIMP1 EpCAM 45 % 37 %

Dkk3: M2PK IL13 TGFbeta1 Mac2BP TIMP1 EpCAM 45 % 41 %

Dkk3: MIP1beta IL8 IL13 TGFbeta1 IGFBP2 EpCAM 45 % 33 %

Dkk3: MIP1beta IL8 IL13 IGFBP2 TIMP1 EpCAM 44 % 40 %

Dkk3: MIP1beta IL8 TGFbeta1 IGFBP2 TIMP1 EpCAM 44 % 43 %

Dkk3: MIP1beta IL13 TGFbeta1 Mac2BP TIMP1 EpCAM 44 % 43 %

MIP1beta: IL8 IL13 TGFbeta1 Mac2BP TIMP1 EpCAM 44 % 28 %

Dkk3: M2PK MIP1beta IL13 TGFbeta1 Mac2BP TIMP1 43 % 31 %

Dkk3: MIP1beta IL13 TGFbeta1 IGFBP2 TIMP1 EpCAM 42 % 40 %

MIP1beta: IL13 TGFbeta1 Mac2BP IGFBP2 TIMP1 EpCAM 42 % 31 %

Dkk3: M2PK MIP1beta IL13 TGFbeta1 Mac2BP EpCAM 41 % 23 %

Dkk3: M2PK MIP1beta IL13 TGFbeta1 TIMP1 EpCAM 41 % 33 %

Dkk3: MIP1beta IL13 TGFbeta1 Mac2BP IGFBP2 EpCAM 41 % 41 %

Dkk3: MIP1beta TGFbeta1 Mac2BP IGFBP2 TIMP1 EpCAM 41 % 39 %

Dkk3: IL13 TGFbeta1 Mac2BP IGFBP2 TIMP1 EpCAM 41 % 37 %

M2PK: MIP1beta IL13 TGFbeta1 Mac2BP IGFBP2 TIMP1 32 % 27 %

Tabla 15. Sensibilidad de nueve combinaciones de biomarcadores en muestras de plasma y suero a una _____________________________especificidad del 95 %.______________________________

BM1: BM2 BM3 BM4 BM5 BM6 BM7 BM8 BM9 Plasma Suero

Dkk3: M2PK MIP1beta IL8 IL13 TGFbeta1 Mac2BP IGFBP2 TIMP1 73 % 77 %

Dkk3: M2PK MIP1beta IL8 IL13 TGFbeta1 Mac2BP IGFBP2 EpCAM 73 % 77 %

Dkk3: M2PK MIP1beta IL8 IL13 TGFbeta1 Mac2BP TIMP1 EpCAM 54 % 72 %

Dkk3: M2PK MIP1beta IL8 IL13 TGFbeta1 IGFBP2 TIMP1 EpCAM 58 % 74 %

Dkk3: M2PK MIP1beta IL8 IL13 Mac2BP IGFBP2 TIMP1 EpCAM 74 % 70 %

Dkk3: M2PK MIP1beta IL8 TGFbeta1 Mac2BP IGFBP2 TIMP1 EpCAM 71 % 78 %

Dkk3: M2PK MIP1beta IL13 TGFbeta1 Mac2BP IGFBP2 TIMP1 EpCAM 57 % 72 %

Dkk3: M2PK IL8 IL13 TGFbeta1 Mac2BP IGFBP2 TIMP1 EpCAM 67 % 76 %

Dkk3: MIP1beta IL8 IL13 TGFbeta1 Mac2BP IGFBP2 TIMP1 EpCAM 54 % 55 %

M2PK: MIP1beta IL8 IL13 TGFbeta1 Mac2BP IGFBP2 TIMP1 EpCAM 58 % 69 %

5 Tabla 16. Sensibilidad de diez combinaciones de biomarcadores en muestras de plasma y suero a una especificidad

del 95 %.

BM1: BM2 BM3 BM4 BM5 BM6 BM7BM8 B9 BM1o Plasma Suero

Dkk3: M2PK MIP1beta IL8 IL13 TGFbeta1 Mac2BP IGFBP2 TIP1 EpCAM 70 % 55 %

Dkk3: M2PK MIP1beta IL8 IL13 TGFbeta1 Mac2BP IGFBP2 TIP1 EpCAM 73 % 68 %

Los expertos en la materia apreciarán que se pueden realizar numerosas variaciones y/o modificaciones a la invención como se muestra en las formas de realización específicas sin alejarse del alcance de la invención descrita 10 en líneas generales. Las presentes formas de realización tienen, por lo tanto, que se consideradas en conjunto como ilustrativas y no restrictivas.

La presente aplicación reivindica la prioridad del documento AU 2010903140.

15 Cualquier discusión de los documentos, actas, materiales, dispositivos, artículos o similares que se hayan incluido en la presente memoria descriptiva tiene solo el propósito de proporcionar un contexto para la presenta invención. No debe tomarse como una admisión de que alguno o todos estos asuntos forman parte del estado de la técnica anterior o eran conocimientos generales comunes en el campo relevante para la presente invención tal como existía antes de la fecha de prioridad de cada reivindicación de esta solicitud.

20

REFERENCIAS

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<110> <120> <130> <150> 5 <151> <160> <170> <210> <211 > 10 <212> <213> <400>

<210> 15 <211> <212> <213> <400>

20

Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation

Diagnostic for colorectal cancer

B10093A CA/CS

AU 2010903140

2010-07-14

14

PatentIn versión 3.4 1

99

PRT

Homo sapiens 1

Met: Thr Ser Lys Leu Ala val Ala Leu Leu Ala Ala Phe Leu ríe Ser

1: 5 10 15

Ala
Ala: leu Cys Glu Gly Ala Val Leu Pro Arg Ser Ala Lys Glu Leu



: 20 25 30

Arg: Cys Gln Cys lie Lys Thr Tyr Ser Lys Pro Phe His Pro Lys Phe


: 35 40 45

He: lys Glu Leu Arg Val He Glu Ser Gly Pro His Cys Ala Asn Thr

: 50 55 60

Glu: lie He Val Lys Leu Ser Asp Gly Arg Glu Leu Cys Leu Asp Pro

65: 70 75 80

Lys: Glu Asn Trp Val Gln Arg Val Val Glu Lys Phe Leu Lys Arg Ala




: 85 90 95

Glu: Asn Ser

2

328

PRT

Homo sapiens 2

Met 1: Leu Pro Arg Val 5 Gly Cys Pro Ala Leu 10 Pro Leu Pro Pro Pro 15 Pro

Leu
Leu: Pro Leu 20 Leu Pro Leu Leu Leu 25 Leu Leu Leu Gly Ala 30 Ser Gly

Gly
Gly: Gly 35 Gly Ala Arg Ala Glu 40 Val Leu Phe Arg Cys 45 Pro Pro Cys

Thr: Pro 50 Glu Arg Leu Ala Ala 55 Cys Gly Pro Pro Pro 60 Val Ala Pro Pro

Ala 65: Ala Val Ala Ala Val 70 Ala Gly Gly Ala Arg 75 Met Pro Cys Ala Glu 80

Leu: Val Arg Glu Pro 85 Gly Cys Gly Cys Cys 90 Ser Val Cys Ala Arg 95
Leu

Glu: Gly Glu Ala 100 Cys Gly Val Tyr Thr 105 Pro Arg Cys Gly Gln 110 Gly Leu

Arg: Cys Tyr 115 Pro His Pro Gly Ser 120 Glu Leu Pro Leu Gln 125 Ala Leu Val

Met: Gly 130 Glu Gly Thr Cys Glu 135 Lys Arg Arg Asp Ala 140 Glu Tyr Gly Ala

Ser: Pro Glu Gln Val Ala Asp Asn Gly Asp Asp His Ser Glu Gly Gly

145 Leu: Val Glu Asn His 150 Val Asp Ser Thr Met 155 Asn Met Leu Gly Gly 160 Gly

Gly: Ser Ala Gly 165 Arg Lys Pro Leu Lys 170 Ser Gly Met Lys Glu 175 Leu Ala

Val: Phe Arg 180 Glu Lys Val Thr Glu 185 Gln His Arg Gln Met 190 Gly Lys Gly

Gly: Lys 195 His His Leu Gly Leu 200 Glu Glu Pro Lys Lys 205 Leu Arg Pro Pro

Pro: 210 Ala Arg Thr Pro Cys 215 Gln Gln Glu Leu Asp 220 Gln Val Leu Glu Arg

225 lie: Ser Thr Met Arg 230 Leu Pro Asp Glu Arg 235 Gly Pro Leu Glu His 240 Leu

Tyr: Ser Leu His 245 lie Pro Asn Cys Asp 250 Lys His Gly Leu Tyr 255 Asn Leu

Lys: Gln Cys 260 Lys Met Ser Leu Asn 265 Gly Gln Arg Gly Glu 270 Cys Trp Cys

Val: Asn 275 Pro Asn Thr Gly Lys 280 Leu lie Gln Gly Ala 285 Pro Thr lie Arg

Gly: 290 Asp Pro Glu Cys His 295 Leu Phe Tyr Asn Glu 300 Gln Gln Glu Ala Arg

305 Gly: Val His Thr Gln 325 310 Arg Met Gln 315 320

<210>3 <211 > 585 <212> PRT

5 <213> Homo sapiens <400>3

Met 1: Thr Pro Pro Arg 5 Leu Phe Trp val Trp 10 Leu Leu Val Ala Gly 15 Thr

Gln: Gly Val Asn 20 Asp Gly Asp Met Arg 25 Leu Ala Asp Gly Gly 30 Ala Thr

Asn: Gln Gly 35 Arg Val Glu lie Phe 40 Tyr Arg Gly Gln Trp 45 Gly Thr Val

Cys: Asp 50 Asn Leu Trp Asp Leu 55 Thr Asp Ala Ser Val 60 Val Cys Arg Ala

Leu 65: Gly Phe Glu Asn Ala 70 Thr Gln Ala Leu Gly 75 Arg Ala Ala Phe Gly 80

Gln: Gly Ser Gly Pro 85 lie Met Leu Asp Glu 90 Val Gln Cys Thr Gly 95 Thr

Glu: Ala Ser Leu 100 Ala Asp Cys Lys Ser 105 Leu Gly Trp Leu Lys 110 Ser Asn

Cys: Arg His 115 Glu Arg Asp Ala Gly 120 Val Val Cys Thr Asn 125 Glu Thr Arg

Ser: Thr 130 His Thr Leu Asp Leu 135 Ser Arg Glu Leu Ser 140 Glu Ala Leu Gly

Gln 145: lie Phe Asp Ser Gln 150 Arg Gly Cys Asp Leu 155 Ser lie Ser Val Asn 160

val: Gln Gly Glu Asp 165 Ala Leu Gly Phe Cys 170 Gly His Thr Val lie 175 Leu

Thr: Ala Asn Leu 180 Glu Ala Gln Ala Leu 185 Trp Lys Glu Pro Gly 190 Ser Asn

Val: Thr Met 195 Ser val Asp Ala Glu 200 Cys Val Pro Met Val 205 Arg Asp Leu

Leu: Arg 210 Tyr Phe Tyr Ser Arg 215 Arg lie Asp lie Thr 220 Leu Ser Ser Val

Lys 225: Cys Phe His Lys Leu 230 Ala Ser Ala Tyr Gly 235 Ala Arg Gln Leu Gln 240

Gly: Tyr Cys Ala Ser 245 Leu Phe Ala lie Leu 250 Leu Pro Gln Asp Pro 255 Ser

Fhe: Gln Met Pro Leu Asp Leu Tyr Ala Tyr Ala Val Ala Thr Gly Asp



: 260 265 270

Ala: Leu Leu Glu Lys Leu Cys Leu Gln Phe Leu Ala Trp Asn Phe Glu


: 275 280 285

Ala: Leu Thr Gln Ala Glu Ala Trp Pro Ser Val Pro Thr Asp Leu Leu

: 290 295 300

Gln: Leu Leu Leu Pro Arg Ser Asp Leu Ala Val Pro Ser Glu Leu Ala

305: 310 315 320

Leu
Leu: Lys Ala Val Asp Thr Trp Ser Trp Gly Glu Arg Ala Ser His




: 325 330 335

Glu
Glu: Val Glu Gly Leu Val Glu Lys lie Arg Phe Pro Met Met Leu



: 340 345 350

Pro: Glu Glu Leu Phe Glu Leu Gln Phe Asn Leu Ser Leu Tyr Trp Ser


: 355 360 365

His: Glu Ala Leu Phe Gln Lys Lys Thr Leu Gln Ala Leu Glu Phe
His

: 370 375 380

Thr: Val Pro Phe Gln Leu Leu Ala Arg Tyr Lys Gly Leu Asn Leu
Thr

385: 390 395 400

Glu: Asp Thr Tyr Lys Pro Arg He Tyr Thr Ser Pro Thr Trp Ser Ala




: 405 410 415

Phe: Val Thr Asp Ser Ser Trp Ser Ala Arg Lys Ser Gln Leu Val Tyr



: 420 425 430

Gln: Ser Arg Arg Gly Pro Leu Val Lys Tyr Ser Ser Asp Tyr Phe
Gln


: 435 440 445

Ala: Pro Ser Asp Tyr Arg Tyr Tyr Pro Tyr Gln Ser Phe Gln Thr Pro

: 450 455 460

Gln: His Pro Ser Phe Leu Phe Gln Asp Lys Arg Val Ser Trp Ser Leu

465: 470 475 480

Val: Tyr Leu Pro Thr lie Gln Ser Cys Trp Asn Tyr Gly Phe Ser Cys




: 485 490 495

Ser
Ser: Asp Glu Leu Pro Val Leu Gly Leu Thr Lys Ser Gly Gly
Ser



: 500 505 510

Asp: Arg Thr lie Ala Tyr Glu Asn Lys Ala Leu Met Leu Cys Glu Gly


: 515 520 525

Leu: Phe Val Ala Asp Val Thr Asp Phe Glu Gly Trp Lys Ala Ala lie

: 530 535 540

Pro: Ser Ala Leu Asp Thr Asn Ser Ser Lys Ser Thr Ser Ser Phe
Pro

545: 550 555 560

Cys: Pro Ala Gly His Phe Asn Gly Phe Arg Thr Val lie Arg Pro Phe




: 565 570 575

Tyr: Leu Thr Asn Ser Ser Gly Val Asp



: 580 585

<210>4 <211> 531 <212> PRT

5 <213> Homo sapiens <400> 4

Met 1: Ser Lys Pro His 5 Ser Glu Ala Gly Thr 10 Ala Phe He Gln Thr 15 Gln

Gln: Leu His Ala 20 Ala Met Ala Asp Thr 25 Phe Leu Glu His Met 30 Cys Arg

Leu: Asp lie 35 Asp Ser Pro Pro He 40 Thr Ala Arg Asn Thr 45 Gly lie lie

Cys: Thr 50 lie Gly Pro Ala Ser 55 Arg Ser Val Glu Thr 60 Leu Lys Glu Met

lie 65: Lys Ser Gly Met Asn 70 Val Ala Arg Leu Asn 75 Phe Ser His Gly Thr 80

His: Glu Tyr His Ala 85 Glu Thr lie Lys Asn 90 Val Arg Thr Ala Thr 95 Glu

Ser: Phe Ala Ser Asp Pro He Leu Tyr Arg Pro Val Ala Val Ala Leu

Asp: Thr Lys 100 Gly Pro Glu lie

Thr: Ala 115 Glu Val Glu Leu Lys

Asp: 130 Asn Ala Tyr Met Glu 135 Lys

145 Tyr: Lys Asn lie Cys 150 Lys Val

Asp
Asp: Gly Leu 165 lie Ser Leu

Leu: Val Thr 180 Glu Val Glu Asn

Val: Asn 195 leu Pro Gly Ala Ala

Asp: 210 lie Gln Asp Leu Lys 215 Phe

225 Phe: Ala Ser Phe He 230 Arg Lys

Val: Leu Gly Glu 245 Lys Gly Lys

Asn: His Glu 260 Gly Val Arg Arg

Gly: lie 275 Met Val Ala Arg
Gly

Lys: 290 Val Phe Leu Ala Gln 295 Lys

305 Gly: Lys Pro Val lie 310 Cys Ala

Lys: Pro Arg Pro 325 Thr Arg Ala

Leu: Asp Gly 340 Ala Asp Cys lie

Asp: Tyr 355 Pro Leu Glu Ala Val

Ala: 370 Glu Ala Ala lie Tyr 375 His

385 Leu: Ala Pro lie Thr 390 Ser Asp

Val: Glu Ala Ser 405 Phe Lys Cys

Lys: Ser Gly 420 Arg Ser Ala His

Pro: lie 435 lie Ala Val Thr Arg

Leu: 450 Tyr Arg Gly He Phe 455 Pro

465 Ala: Trp Ala Glu Asp 470 Val Asp

Gly: Lys Ala Arg 485 Gly Phe Phe

Thr: Gly Trp 500 Arg Pro Gly Ser

Pro: Val 530 515 Pro

<210>5 <211> 531 <212> PRT

5 <213> Homo sapiens <400>5

: 105 110

Arg 120: Thr Gly Leu lie Lys 125 Gly Ser Gly

Lys: Gly Ala Thr Leu 140 Lys lie Thr Leu

Cys: Asp Glu Asn 155 lie Leu Trp Leu Asp 160

Val: Glu Val 170 Gly Ser Lys lie Tyr 175
Val

Gln: Val 185 Lys Gln Lys Gly Ala 190 Asp Phe

Gly 200: Gly Ser Leu Gly Ser 205 Lys Lys Gly

Val: Asp Leu Pro Ala 220 Val Ser Glu Lys

Gly: Val Glu Gln 235 Asp Val Asp Met Val 240

Ala: Ser Asp 250 Val His Glu Val Arg 255 Lys

Asn: lie 265 Lys lie lie Ser Lys 270 lie Glu

Phe 280: Asp Glu lie Leu Glu 285 Ala Ser Asp

Asp: Leu Gly lie Glu 300 lie Pro Ala Glu

Met
Met: lie Gly 315 Arg Cys Asn Arg Ala 320

Thr: Gln Met 330 Leu Glu Ser Met lie 335 Lys

Glu: Gly 345 Ser Asp Val Ala Asn 350 Ala Val

Met 360: Leu Ser Gly Glu Thr 365 Ala Lys Gly

Arg: Met Gln His Leu 380 lie Ala Arg Glu

Leu: Gln Leu Phe 395 Glu Glu Leu Arg Arg 400

Pro: Thr Glu 410 Ala Thr Ala Val Gly 415 Ala

Cys: Ser 425 Gly Ala lie He Val 430 Leu Thr

Gln 440: Val Ala Arg Tyr Arg 445 Pro Arg Ala

Asn: Pro Gln Thr Ala 460 Arg Gln Ala His

Val: Leu Cys Lys 475 Asp Pro Val Gln Glu 480

Leu: Arg Val 490 Asn Phe Ala Met Asn 495 Val

Lys: Lys 505 Gly Asp Val Val lie 510 Val Leu

Gly 520: Phe Thr Asn Thr Met 525 Arg Val Val

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para el diagnóstico o detección del cáncer colorrectal en un sujeto,

comprendiendo el procedimiento:

i) la determinación de la presencia y/o el nivel de tres biomarcadores, donde los tres biomarcadores son:

(a) DKK-3 (dickkopf homólogo 3), M2PK (piruvato cinasa muscular 2), y IGFBP2 (factor de crecimiento similar a la insulina que fija la proteína-2);

10 (b) M2PK, IgFbP2, y EpCAM (molécula de adhesión celular epitelial),

(c) M2PK, IGFBP2 y IL-13 (interleucina-13); o

(d) M2PK, IGFBP2 y IL-8 (interleucina-8)

en una muestra del sujeto,

15

donde la presencia y/o el nivel de tres biomarcadores es indicativo de cáncer colorrectal.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, donde el procedimiento comprende la determinación de la presencia y/o el nivel de tres biomarcadores, donde los tres biomarcadores son:

20

i) DKK-3, M2PK, y IGFBP2; o

ii) M2PK, IGFBP2, y EpCAM.
3. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, donde el procedimiento comprende la determinación de la 25 presencia y/o el nivel de expresión de cuatro biomarcadores, donde los biomarcadores son:

(i) DKK-3, M2PK, MAC2BP (proteína que fija MAC2) y IGFBP2;

(ii) DKK3-, M2PK, IL-8 y IGFBP2;

(iii) DKK-3, M2PK, IL-13 y IGFBP2;

30 (iv) DKK-3, M2PK, IGFBP2 y EpCAM;

(v) DKK-3, M2PK, MIP1beta (proteína inflamatoria de macrófagos 1p) y IGFBP2;

(vi) DKK-3, M2PK, TGFbeta1 (factor del crecimiento transformante beta 1) y IGFBP2;

(vii) DKK-3, M2PK, IGFBP2 y TIMP1 (inhibidor tisular de metaloproteinasa 1);

(viii) M2PK, Mac2BP, IGFBP2 y EpCAM;

35 (ix) M2PK, MIP1beta, IL-13, y IGFBP2;

(x) M2PK, IL-13, Mac2BP, IGFBP2;

(xi) M2PK, IL-13, IGFBP2, EpCAM;

(xii) M2PK, IL-8, IL-13 y IGFBP2;

(xiii) M2PK, IL-8, MAC2BP, IGFBP2;

40 (xiv) M2PK, IL-8, IGFBP2, EpCAM;

(xv) M2PK, IL-13, TGFbeta1 y IGFBP2;

(xvi) M2PK, IL-13, IGFBP2 y TIMP1;

(xvii) M2PK, TGFbeta1, IGFBP2 y EpCAM;

(xviii) M2PK, MIP1beta, IGFBP2 y EpCAM; o 45 (xix) M2PK, IGFBP2, TIMP1 y EpCAM.
4. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el procedimiento comprende la

determinación de la presencia y/o el nivel de expresión de cinco biomarcadores, donde los biomarcadores son:

50 (i) M2PK, TGFbeta1, Mac2BP, IGFBP2 y EpCAM;

(ii) DKK-3, M2PK, MIP1beta, IGFBP2 y EpCAM;

(iii) DKK-3, M2PK, IL-8, IGFBP2 y EpCAM;

(iv) DKK-3, M2PK, TGFbeta1, Mac2BP y IGFBP2;

(v) M2PK, MIP1beta, Mac2BP, IGFBP2 y EpCAM;

55 (vi) DKK-3, M2PK, Mac2BP, IGFBP2 y EpCAM;

(vii) DKK-3, M2PK, IL-8, IL-13 y IGFBP2;

(viii) DKK-3, M2PK, IL-13, TGFbeta1 y IGFBP2;

(ix) DKK-3, M2PK, IL-13, IGFBP2 y EpCAM;

(x) M2PK, IL-13, Mac2BP, IGFBP2 y EpCAM;

60 (xi) M2PK, IL-8, IL-13, TGFbeta1 y IGFBP2;

(xii) M2PK, IL-8, TGFbetal, Mac2BP y IGFBP2;

(xiii) DKK-3, M2PK, MIP1beta, IL-8 y IGFBP2;

(xiv) DKK-3, M2PK, MIP1beta, Mac2BP y IGFBP2;

(xv) M2PK, IL-8, IL-13, IGFBP2 y EpCAM;

5 (xvi) M2PK, IL-8, Mac2BP, IGFBP2 y EpCAM;

(xvii) DKK-3, M2PK, IGFBP2, TIMP1 y EpCAM;

(xviii) M2PK, MIP1beta, IL-13, IGFBP2 y EpCAM;

(xix) M2PK, IL-13, TGFbeta1, Mac2BP y IGFBP2;

(xx) M2PK, IL-13, TGFbeta1, IGFBP2 y EpCAM;

10 (xxi) DKK-3, M2PK, IL-8, TGFbeta1 y IGFBP2;

(xxii) DKK-3, M2PK, IL-8, Mac2BP y IGFBP2;

(xxiii) M2PK, IL-8, IL-13, IGFBP2 y TIMP1;

(xxiv) M2PK, IL-13, IGFBP2, TIMP1, EpCAM; o

(xxv) DKK-3, M2PK, MIP1beta, IL-13 y IGFBP2.

15
5. El procedimiento cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el procedimiento comprende la determinación de la presencia y/o el nivel de expresión de siete biomarcadores, donde los biomarcadores son:

(i) DKK-3, M2PK, IL-8, Mac2BP, IGFBP2, TIMP1 y EpCAM;

20 (ii) DKK-3, M2PK, MIP1beta, IL-8, Mac2BP, IGFBP2 y EpCAM;

(iii) DKK-3, M2PK, IL-8, IL-13, Mac2BP, IGFBP2 y TIMP1;

(iv) DKK-3, M2PK, IL-8, TGFbeta1, Mac2BP, IGFBP2 y TIMP1;

(v) DKK-3, M2PK, IL-8, TGFbeta1, Mac2BP, IGFBP2 y EpCAM;

(vi) DKK-3, M2PK, MIP1beta, IL-8, Mac2BP, IGFBP2 y TIMP1;

25 (vii) DKK-3, M2PK, IL-8, IL-13, Mac2BP, IGFBP2 y EpCAM;

(viii) DKK-3, M2PK, IL-8, IL-13, TGFbeta1, Mac2BP y IGFBP2;

(ix) M2PK, MIP1beta, IL-8, Mac2BP, IGFBP2, TIMP1 y EpCAM;

(x) DKK-3, M2PK, MIP1beta, IL-8, IL-13, Mac2BP y IGFBP2;

(xi) DKK-3, M2PK, MIP1beta, IL-8, TGFbeta1, Mac2BP y IGFBP2;

30 (xii) DKK-3, M2PK, MIP1beta, TGFbeta1, Mac2BP, IGFBP2 y TIMP1;

(xiii) DKK-3, M2PK, IL-8, IL-13, TGFbeta1, IGFBP2 y TIMP1;

(xiv) DKK-3, M2PK, IL-8, TGFbeta1, IGFBP2, TIMP1 y EpCAM;

(xv) DKK-3, M2PK, IL-13, TGFbeta1, Mac2BP, IGFBP2, y TIMP1;

(xvi) M2PK, MIP1beta, IL-8, IL-13, IGFBP2, TIMP1 y EpCAM;

35 (xvii) DKK-3, M2PK, MIP1beta, IL-8, TGFbeta1, IGFBP2, y EpCAM;

(xviii) DKK-3, M2PK, MIP1beta, IL-13, TGFbeta1, Mac2BP, y IGFBP2;

(xix) M2PK, MIP1beta, IL-8, TGFbeta1, Mac2BP, IGFBP2 y EpCAM;

(xx) DKK-3, M2PK, MIP1beta, IL-8, IGFBP2, TIMP1 y EpCAM;

(xxi) DKK-3, M2PK, MIP1beta, IL-13, Mac2BP, IGFBP2 y TIMP1;

40 (xxii) DKK3, MIP1beta, IL8, IL13, Mac2BP, IGFBP2 y TIMP1,

(xxiii) M2PK, MIP1beta, IL-8, IL-13, Mac2BP, IGFBP2 y TIMP1;

(xxiv) M2PK, IL-8, TGFbeta1, Mac2BP, IGFBP2, TIMP1 y EpCAM;

(xxv) DKK-3, M2PK, IL-8, IL-13, TGFbeta1, IGFBP2 y EpCAM;

(xxvi) DKK-3, M2PK, IL-13, TGFbeta1, Mac2BP, IGFBP2 y EpCAM; o 45 (xxvii) M2PK, MIP1beta, IL-8, IL-13, Mac2BP, IGFBP2 y EpCAM.
6. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 5, donde el procedimiento comprende la determinación de la presencia y/o el nivel de expresión de nueve biomarcadores, donde los biomarcadores son:

50 (i) DKK-3, M2PK, MIP1beta, IL-8, IL-13, TGFbeta1, Mac2BP, IGFBP2 y TIP1;

(ii) DKK-3, M2PK, MIP1beta, IL-8, IL-13, TGFbeta1, Mac2BP, IGFBP2 y EpCAM;

(iii) DKK-3, M2PK, MIP1beta, IL-8, IL-13, TGFbeta1, IGFBP2, TIMP1 y EpCAM;

(iv) DKK-3, M2PK, MIP1beta, IL-8, IL-13, Mac2BP, IGFBP2, TIMP1 y EpCAM;

(v) DKK-3, M2PK, MIP1beta, IL-8, TGFbeta1, Mac2BP, IGFBP2, TIMP1 y EpCAM;

55 (vi) DKK-3, M2PK, MIP1beta, IL-13, TGFbeta1, Mac2BP, IGFBP2, TIMP1 y EpCAM;

(vii) DKK-3, M2PK, IL-8, IL-13, TGFbeta1, Mac2BP, IGFBP2, TIMP1 y EpCAM; o

(viii) M2PK, MIP1beta, IL-8, IL-13, TGFbeta1, Mac2BP, IGFBP2, TIMP1 y EpCAM.
7. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el procedimiento comprende la 60 determinación de la presencia y/o el nivel de expresión de diez biomarcadores, donde los biomarcadores son DKK-3,

M2PK, MIP1 beta, IL-8, IL-13, TGFbetal, Mac2BP, IGFBP2, TIMP1 y EpCAM.
8. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el procedimiento comprende la detección de la presencia y/o el nivel de al menos un biomarcador adicional seleccionado de entre IGF-I, IGF-II,

5 IGF-BP2, Anfirregulina, VEGFA, VEGFD, MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-9, TIMP-2, ENA-78, MCP-1, MIP- 1p, IFN-y, IL-10, IL-1 p, IL-4, IL-6, MAC2BP, piruvato cinasa M2 tumoral, M65, OPN, DKK-3, TGFp-1, and VEGFpan.
9. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el procedimiento diagnostica o detecta el cáncer colorrectal con:

10

i) una sensibilidad de al menos el 66 %; o

ii) una sensibilidad de al menos el 77 %.
10. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el procedimiento comprende 15 poner en contacto la muestra con al menos un compuesto que une un polipéptido biomarcador.
11. El procedimiento de la reivindicación 10, donde el compuesto se marca detectablemente.
12. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el procedimiento comprende:

20

i) la determinación de la presencia y/o el nivel de los biomarcadores en la muestra del sujeto; y

ii) la comparación de la presencia y/o el nivel de los biomarcadores con un control, donde una presencia y/o el nivel en la muestra que sea distinta a la del control es indicativo de cáncer colorrectal.

25 13. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la muestra es sangre,

plasma, suero, orina, plaquetas, magacariocitos o heces.
14. El uso de una matriz de compuestos para el diagnóstico o detección in vitro del cáncer colorrectal, donde cada uno de los compuestos se une a un polipéptido biomarcador distinto seleccionado de entre

30

(a) DKK-3, M2PK, y IGFBP2; o

(b) M2PK, IGFBP2, y EpCAM.
15. El uso de un kit para el diagnóstico o detección in vitro del cáncer colorrectal en un sujeto, 35 comprendiendo el kit compuestos que cada uno se une a un polipéptido biomarcador distinto seleccionado de entre

(a) DKK-3, M2PK, y IGFBP2; o

(b) M2PK, IGFBP2, y EpCAM.

Sensibilidad para cáncer colorrectal

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P5

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

imagen1

Sensibilidad para cáncer colorrectal

B

imagen2

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

1 - Especificidad

Figura 2

Sensibilidad

imagen3

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

1 - Especificidad

Figura 3

o

o

p

M

05

imagen4

O

00

o

- Especificidad

Sensibilidad para cáncer colorrectal

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

imagen5

Sensibilidad

imagen6

imagen7

Sensibilidad para cáncer colorrectal

imagen8

1 - Especificidad

Sensibilidad para cáncer colorrectal

imagen9

1 - Especificidad

Figura 8

Sensibilidad para cáncer colorrectal

Modelo de siete optimizado a lata especificación (Negro): Modelo antiguo (Grey) Nuevos BM: IL8, IGFBP2, s90.MAC.BP, M2_PK, Dkk3, IL13 y TGFbeta Antiguos BM: IL8, IGFBP2, s90.MAC.BP, M2_PK, EpCAM, IL13 y MIP1b

imagen10

1 - Especificidad

Sensibilidad para cáncer colorrectal

imagen11

1 - Especificidad

imagen12

Curva ROC de validación cruzada por etapas para el modelo de 3 biomarcadores

Biomarcadores: Dkk3, M2PK y IGFBP2

Etapa A; 64 % de sensibilidad a una especificidad del 95

Etapa B: 70 % de sensibilidad a una especificidad del 95 %

Etapa C: 73 % de sensibilidad a una especificidad del 95 %

Etapa D: 79

de sensibilidad a una especificidad del 95

1 - Especificidad