KR101300694B1 - 부인과 질환을 탐지하기 위한 분석법 - Google Patents

부인과 질환을 탐지하기 위한 분석법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 일반적으로 부인과 질환을 위한 진단 및 예후 분석법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 부인과 암 또는 이의 아형의 존재 또는 부인과 암 또는 이의 아형을 가질 위험 또는 암 또는 암으로부터 발생한 합병증 또는 염증 질환을 포함하는 다른 부인과 질환의 단계를 진단하는 분석법을 제공한다.

Description

부인과 질환을 탐지하기 위한 분석법{An Assay to Detect a Gynecological Condition}
본 발명은 일반적으로 부인과 질환을 위한 진단 및 예후 분석법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 부인과 암 또는 이의 아형의 존재 또는 부인과 암 또는 이의 아형을 가질 위험 또는 암 또는 암으로부터 발생한 합병증 또는 염증 질환을 포함하는 다른 부인과 질환의 단계를 진단하는 분석법을 제공한다. 본 발명의 분석법은 진단 및 보고 시스템을 제공하기 위해 병리학적 아키텍처에 통합될 수 있다.
본 명세서에서 저자에 의해 언급된 간행물 목록의 상세내용은 상세한 설명의 말단에 알파벳 순서로 모아 놓았다.
본 명세서에서 임의의 종래 기술을 참조하는 것은 이 종래 기술이 임의의 나라에서 공통의 일반적인 지식의 일부를 형성한다는 것을 인정하거나 주장하는 것이 아니며 이를 인정하거나 주장하는 것으로 해석되어서도 안 된다.
난소암은 가장 치명적인 부인과 악성종양 중 하나이고 여성 사망원인의 5번째의 가장 흔한 원인이다. 사망률을 높게 유지하는 하나의 가장 중요한 인자는 초기의 치료가능한 상태의 질환들의 초기 탐지의 부족이다.
질환의 초기 단계(단계 I 및 II) 동안, 암은 난소(단계 I) 또는 골반의 다른 장기(단계 II) 내에 들어있다. 질환의 단계 I의 탐지는 80%를 초과하는 5년 생존율을 가지며, 단계 II의 경우 70% 이상으로 떨어진다. 말기 단계에서, 암은 골반을 넘어 복부의 벽 또는 림프절까지 퍼진다. 이 시점에서, 탐지 후 5년 생존율은 50% 미만으로 감소한다. 이런 질환의 최종의 가장 진행된 단계는 단계 IV이고, 이 시점까지는 간, 폐 또는 다른 장기들로 전이가 일어나며 생존율은 30% 미만이다.
일반적으로 초기 난소암은 자각증상이 없으며, 대다수의 진단은 질환이 근거리 또는 원거리 전이가 이미 일어난 때에 이루어진다. 질환의 단계 I에 대한 치료율은 주로 90퍼센트를 초과하지만, 공격적인 종양감축술(cytoreductive surgery) 및 백금-기초 화학요법에도 불구하고 임상적으로 진행된 난소암을 가진 환자들의 5년 생존은 단지 15 내지 20 퍼센트이다(Holschneider and Berek, Semin Surg Oncol, 19 (1):3-10,2000). 이런 통계는 난소암 스크리닝 및 초기 동정을 개량하기 위한 중요한 근본적 이유를 제공한다.
난소암과 관련된 사망률은 어느 정도는 효과적인 초기 탐지 방법들의 부족 때문에 높다. 초기에 탐지되면, 생존율은 급격하게 증가한다. 연구는, 특히 난소암의 첫 번째 징후에 대한 위험이 큰 여성들을 평가하는 개량된 방법을 개발하는데 집중되어 있다. 그러나, 아직까지, 전암성 병소는 동정되지 않았다. 비록 c-erb-B2, c-myc 및 p53과 같은 여러 유전자의 변형이 난소암의 상당 부분에서 동정되었지만, 이런 돌연변이들 중 어떤 것도 악성종양으로 진단되거나 시간이 지남에 따라 종양 작용이 예측되지 않는다(Veikkola et al, Cancer Res 60 (2):202-12, 2000; Berek et al, Am J Obstet Gynecol, 164(4j:1038-42, 1991; Cooper et al, Clin Cancer Res. 8 (10):3193-7, 2002; and Di Blasio et al, J Steroid Biochem MoI Biol. 53 (1-6):375-9, 1995). 대신에, 고위험 여성들은 유전자 상담과 검사뿐만 아니라 혈청 CA125 수준 및 질경유 초음파(transvaginal ultrasound)에 의지해야 한다(Oehler and Caffier, Anticancer Res, 20 (6D):5109-12, 2000;Santin et al, Eur J Gynaecol Onco 20 (3): 177-81, 1999; and Senger et al, Science 219 (4587):983-5, 1983). 그러나, CA125는 초기 단계 질환을 탐지하는데 민감하거나 특이적이지 않다. 따라서, CA125는 일반적인 스크리닝에 적합하지 않다. CA125는 질환의 반응 또는 진행을 관찰하는데 강하나, 진단 또는 예후 마커로서는 강하지 못하다(Gadducci et al, Anticancer Res 19 (2B): 1401-5, 1999)
질경유 초음파, 도플러 및 형태학적 지수들을 사용하는 스크리닝은 약간 격려가 되는 결과를 보였으나, 단독으로 사용되면, 일반적인 인구에 대한 스크리닝 검사에 필요한 특이성이 현재는 부족하다(Karayiannakis et al, Surgery 131 (5):548-55, 2002 and Lee et al, Int J Oncol 17(1):149-52, 2000). 종양 마커들과 초음파를 사용하는 조합된 멀티모드 스크리닝(combinational multimodal screenin)은 높은 민감성과 특이성을 나타낸다. 이런 조합 방법이 가장 비용 효율적이고 효과적인 스크리닝 전략이다(상기 Karayiannakis et al, 2002 and Lee et al, 2000). 그러나, 조합 방법도 일반 인구에서의 효과에 의문이 있다. 따라서, 질환의 초기 탐지를 위한 다른 마커들을 개발해야하는 중대한 요구가 있다.
개량된 특이성과 민감성은 CA125와 조합해서 혈청/혈장 단백질 마커들을 사용함으로써 성취될 수 있다는 것이 제안되었다.
고렐릭 등, Cancer Epidemiol, Biomarkers Prev 14(4):98l-981, 2005는 난소암으로부터 대조군들을 구별하기 위해 최종 분류 나무 분석(final classification tree analysis)을 가진 다중 분석 계획을 사용하였다. 이들의 다중 계획은 특히 EGF 및 VEGF와 조합해서 CA125를 사용하였고 단지 70-80%를 얻은 CA125 마커 단독과 비교해서 향상된 80-90% 특이성에서 90-100%의 민감성 수준을 나타내었다.
유사한 맥락에서, 비신틴 등, Clin Cancer Res 14(4):1065-1072, 2008은 연구를 보고하였고, 이 연구에서 다중 및 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 모두는 마커들의 한 패널을 기초로 하여 건강한 대조군들과 난소암 환자들을 검사하기 위해 사용되었다. 이들의 선택된 마커들은 렙틴, 프로락틴, 오스테오폰틴, 인슐린 유사 성장 인자 II 및 대식세포 억제 인자와 조합된 CA125 이었다. 바이오마커들 중 어떤 것도 자체로는 질환과 대조군을 구별할 수 없었고, 조합은 95% 특이성에서 72% 민감성을 얻은 CA125 단독과 비교해서 향상된 95% 특이성에서 84-98%의 민감성 수준을 나타내었다.
난소암 및 이로부터 발생한 합병증과 같은 부인과 질환 및 특히 초기 단계 난소암뿐만 아니라 염증 질환을 포함하는 부인과 질환에 대한 매우 민감한 분석법을 개발해야 할 요구가 있다.
본 명세서 전체에서, 내용이 달리 나타내지 않는 한, "포함한다"("comprise", "comprises" 또는 "comprising")라는 단어는 언급된 원소 또는 정수 또는 원소들 또는 정수들의 그룹을 포함하나 임의의 다른 원소 또는 정수 또는 원소들 또는 정수들의 그룹을 배제하지 않는 것을 암시하는 것으로 이해될 것이다.
부인과 암과 같은 부인과 질환을 탐지 및 관찰하는 방법이 제공된다. "부인과 질환"이란 용어는 부인과 암으로부터 발생한 합병증뿐만 아니라 자궁내막증(endometriosis)과 같은 염증 질환을 포함한다. 본 방법은 특히 부인과 질환의 초기 단계 탐지를 가능하게 하고, 조직학적 검사를 용이하게 하고 치료 요법들의 관찰을 허용한다. 본 발명은 증상을 나타내는 여성들의 진단에 사용될 때 특히 효과적이나, 증상을 나타내지 않는 여성들 및/또는 부인과 질환이 발생할 위험이 큰 여성들의 진단에도 동일하게 사용될 수 있다. 본 발명의 방법의 한 태양은 단백체학이고 한 특정 실시예에서, 둘 이상의 바이오마커 또는 전경 기울기 단백질-2(AGR-2), 미드카인, CA125(cancer antigen 125), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-8(IL-8), C-반응성 단백질(CRP), 혈청 아밀로이드 A(SAA) 및 혈청 아밀로이드 P(SAP)를 포함하는 목록으로부터 선택된 분석물질의 조합의 수준이 탐지되는 다원적 분석법(multifactorial assay)이다. 이런 바이오마커들은 특히 ARG-2, 미드카인, CA125, IL-6, IL-8, CRP, SAA 및 SAP는 임의의 유도체 또는 다형체 변이체, 절단된 형태, 결합된 또는 멀티머 형태뿐만 아니라 이의 동족체와 같은 변형 형태를 포함한다. 본 발명의 분석법은 병리학적 플랫폼 또는 아키텍처에 통합하는데 특히 적합하다.
한 실시예에서, 한 대조군과 비교된 둘 이상의 바이오마커의 농도에서 상대 변화는 부인과 질환 상태 또는 치료에 대한 반응의 수준을 나타낸다. 다른 실시예에서, 수준은 질환의 존재 또는 부존재의 가능성 지수의 결정을 가능하게 하는 알고리즘을 만들기 위해 다변량 분석(multivariate analysis)을 받는다. 다른 태양에서, AGR-2 또는 미드카인 단독 또는 CA125를 포함하는 다른 마커들과 조합한 AGR-2 또는 미드카인의 농도에서 변화된 수준의 탐지는 부인과 질환을 나타낸다. "변화된"은 대조군 샘플 또는 임계 수준 또는 표준 정상값들 또는 다음 알고리즘 분석의 데이터베이스에 비해 조직 또는 혈장과 같은 유체에서 바이오마커들의 농도의 증가 또는 감소를 포함한다. 일반적으로, 변화는 바이오마커들의 농도의 증가이다.
단백체학적 방법에도 불구하고, 본 발명은 상기한 바이오마커들을 암호화하는 유전자들의 발현을 측정하는 유전자 방법에 관한 것이다.
둘 이상의 바이오마커들의 바이오마커 농도(즉, 수준)는 환자들의 바이오마커 수준과 질환 상태 사이의 측정가능한 관계를 제공한다. 바이오마커의 "수준"이외에, 본 발명은 대조군에 대한 비교를 위한 또는 알고리즘으로 유도되는 다변량 분석을 위한 입력 데이터로서 둘 이상의 마커의 비율에 관한 것이다. 본 발명은 AGR-2 또는 미드카인 단독 또는 CA125와 조합한 AGR-2 또는 미드카인의 농도에서 변화된 수준을 스크리닝함으로써 부인과 질환을 탐지하는 것에 관한 것이다. 한편, AGR-2 또는 미드카인 농도 단독 또는 CA125 또는 다른 바이오마커들과 조합한 AGR-2 또는 미드카인 농도에서 변화된 수준은 질환을 나타낸다. 또한, AGR-2 또는 미드카인 단독 또는 다른 마커들과 조합한 AGR-2 또는 미드카인의 수준은 다원적 알고리즘 방법에서 사용될 수 있다.
선택된 바이오마커들은 조직의 조직학적 평가에서 전체적으로 또는 개별적으로 사용될 수 있거나 치료 요법의 효과를 관찰하기 위해서 사용될 수 있다. 바이오마커들은 부인과 암을 아형(sub-type)화하거나 사용된 항암 치료의 형태에 영향을 줄 수 있는 암의 단계를 측정하는데 효과적이다. 한편, 본 발명은 부인과 암을 치료하기 위한 개인화된 의료 방법에 관한 것이다. 본 발명은 염증 질환들과 같은 다른 부인과 질환에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 한 태양은 피험자에서 부인과 질환의 존재를 측정하기 위한 분석법에 관한 것이고, 분석법은 피험자의 생물학적 샘플에서 AGR-2, 미드카인 및/또는 CA125 또는 이의 변형 형태 또는 동족체 형태 중 둘 이상의 농도를 측정하는 단계를 포함하며, AGR-2 또는 미드카인 및/또는 CA125 또는 이의 변형 형태 또는 동족체 형태 중 둘 이상에서 변화된 수준은 피험자가 부인과 질환을 갖는 것을 나타낸다. AGR-2, 미드카인 또는 CA125 또는 이의 변형 형태 또는 동족체 형태의 수준은 단독으로 다른 마커들과 조합해서 스크리닝될 수 있다. 상기한 대로, "변화된"이란 용어는 농도의 증가 또는 상승 또는 농도에서 감소 또는 하강을 의미한다. 검사는 혈장 또는 혈청을 포함하는 조직, 조직 유체 또는 혈액 속일 수 있다.
더욱 구체적으로 본 발명은 피험자에서 부인과 질환의 존재를 측정하기 위한 분석법을 제공하며, 분석법은 피험자의 생물학적 샘플에서 바이오마커들의 수준을 측정하는 단계를 포함하며, 바이오마커는 CA125 및 AGR-2, 미드카인 및 CRP 또는 이의 변형 형태 또는 동족체 형태로부터 선택된 적어도 하나이고 대조군에 대한 바이오마커들의 수준들에서 변화는 질환을 가진 또는 질환을 갖지 않은 피험자의 존재를 나타낸다.
다른 실시예에서, 본 발명은 피험자에서 부인과 질환의 존재를 측정하기 위한 분석법을 제공하며, 분석법은 피험자의 생물학적 샘플에서 AGR-2, 미드카인 및 CA125 또는 이의 변형 형태 또는 동족체 형태 중 둘 이상; CA125, IL-6, IL-8, CRP, SAA 및 SAP 또는 이의 변형 형태 또는 동족체 형태 중 둘 이상; IL-6, IL-8, CRP, SAA 및 SAP 또는 이의 변형 형태 또는 동족체 형태 중 둘 이상; 또는 CA125, IL-6, IL-8, CRP, SAA 및 SAP 또는 이의 변형 형태 또는 동족체 형태 중 적어도 하나 및 미드카인 또는 AGR-2 또는 이의 변형 형태 또는 동족체 형태 중 적어도 하나로부터 선택된 바이오마커들의 농도를 측정하는 단계; 질환에 대해 알려진 상태의 피험자로부터의 동일한 바이오마커들의 수준을 포함하는 데이터의 제 1 지식 베이스(knowledge base)로부터 생성된 알고리즘을 농도에 적용하는 단계를 포함하며 알고리즘은 질환을 가진 또는 질환을 갖지 않은 피험자의 확률 지수를 제공한다.
한편, 한 실시예에서, 본 발명은 대조군 샘플들에 대한 바이오마커들의 수준의 비교의 사용을 기초로 한 진단 규칙을 제공한다. 다른 실시예에서, 진단 규칙은 통계적 및 기계적 학습 알고리즘의 사용을 기초로 한다. 이런 알고리즘은 알려지지 않은 상태를 가진 환자들의 상태를 예측하는데 사용되는 관계를 의미하기 위해서 트레이닝 데이터(알려진 질환 상태를 가진)에서 관찰된 바이오마커들과 질환 상태 사이의 관계를 사용한다. 데이터 분석의 기술분야에서 당업자들은 트레이닝 데이터에서 암시하는 관계의 많은 다른 형태는 본 발명을 상당히 변화시키지 않고 사용될 수 있다는 것을 인식한다.
한 실시예에서, 질환은 난소암 또는 이로부터 발생한 합병증과 같은 암이다. 다른 실시예에서, 질환은 자궁내막증을 포함하나 이에 제한되지 않는 부인과 염증 질환이다.
질환의 "존재"를 측정하는 것은 질환을 가질 위험을 측정하는 것을 포함한다. "위험"은 질환을 갖지 않는 피험자에 대해 질환을 가질 확률 지수를 측정하는데 편리하게 고려된다.
한편, 본 발명은 부인과 질환을 가진 피험자의 바이오마커들의 수준을 포함하는 트레이닝 데이터의 지식 베이스의 용도를 고려하며, 알려지지 않은 부인과 질환을 가진 환자의 동일한 바이오마커들의 농도를 포함하는 데이터의 제 2 지식 베이스를 입력하자마자, 부인과 질환의 성질 또는 질환의 부존재를 예측하는 확률 지수를 제공한다.
본 발명은 피험자에서 난소암을 탐지하기 위한 분석법을 추가로 고려하며, 분석법은 AGR-2 또는 미드카인 또는 CA125 또는 이의 변형 형태 또는 동족체 형태가 AGR-2, 미드카인 및/또는 CA125 또는 이의 변형 형태 또는 동족체 형태의 농도의 표시를 제공하는 이의 리간드에 결합하도록 피험자의 샘플을 AGR-2, 미드카인 또는 CA125 또는 이의 변형 형태 또는 동족체 형태 중 둘 이상에 대한 고정화 리간드와 접촉하는 단계를 포함하며 AGR-2, 미드카인 및/또는 CA125 또는 이의 변형 형태 또는 동족체 형태 중 둘 이상의 변화된 농도는 난소암을 나타낸다.
다른 실시예에서, 본 발명은 피험자에서 난소암을 탐지하기 위한 분석법을 고려하며, 분석법은 바이오마커가 리간드와 결합하는데 충분한 시간과 조건하에서 피험자의 샘플을 AGR-2, 미드카인 및/또는 CA125 또는 이의 변형 형태 또는 동족체 형태 중 둘 이상; CA125, IL-6, IL-8, CRP, SAA 및/또는 SAP 또는 이의 변형 형태 또는 동족체 형태 중 둘 이상; IL-6, IL-8, CRP, SAA 및/또는 SAP 또는 이의 변형 형태 또는 동족체 형태 중 둘 이상; 또는 CA125, IL-6, IL-8, SAA 및/또는 SAP 또는 이의 변형 형태 또는 동족체 형태 중 적어도 하나 및 미드카인 및/또는 AGR-2 단독 또는 CA125 또는 이의 변형 형태 또는 동족체 형태와 조합한 미드카인 및/또는 AGR-2 중 적어도 하나에 대한 고정화 리간드들과 접촉시키고 바이오마커의 농도를 나타내는 결합의 수준을 탐지하는 단계 및 피험자가 난소암을 갖거나 갖지 않는다는 확률의 지수를 제공하기 위해 난소암을 가진 피험자에서 바이오마커들의 수준을 사용하여 생성된 알고리즘을 농도에 적용하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 태양은 부인과 질환의 탐지에 효과적인 바이오마커들에 대한 리간드들의 패널에 관한 것이고, 패널은 AGR-2, 미드카인 및/또는 CA125 또는 이의 변형 형태 또는 동족체 형태 중 둘 이상; CA125, IL-6, IL-8, CRP, SAA 또는 SAP 또는 이의 변형 형태 또는 동족체 형태 중 둘 이상; IL-6, IL-8, CRP, SAA 또는 SAP 또는 이의 변형 형태 또는 동족체 형태 중 둘 이상; 또는 CA125, IL-6, IL-8, SAA 또는 SAP 또는 이의 변형 형태 또는 동족체 형태 중 적어도 하나 및 미드카인 또는 AGR-2 단독 또는 CA125 또는 이의 변형 형태 또는 동족체 형태와 조합한 미드카인 또는 AGR-2 중 적어도 하나에 대한 리간드를 포함한다.
특히, 본 발명은 피험자에서 부인과 질환의 탐지를 위한 바이오마커들의 패널을 제공하며, 패널은 둘 이상의 바이오마커의 수준을 측정하기 위해 AGR-2, 미드카인 및/또는 CA125 또는 이의 변형 형태 또는 동족체 형태 중 둘 이상; CA125, IL-6, IL-8, CRP, SAA 및 SAP 또는 이의 변형 형태 또는 동족체 형태 중 둘 이상; IL-6, IL-8, CRP, SAA 및 SAP 또는 이의 변형 형태 또는 동족체 형태 중 둘 이상; 및 CA125, IL-6, IL-8, SAA 및 SAP 또는 이의 변형 형태 또는 동족체 형태 중 적어도 하나 및 미드카인 또는 AGR-2 단독 또는 CA125 또는 이의 변형 형태 또는 동족체 형태와 조합한 미드카인 또는 AGR-2 중 적어도 하나로부터 선택된 바이오마커들에 특이적으로 결합하는 물질들을 포함하고 바이오마커 수준에서 증가와 같은 임의의 변화를 측정하기 위해 수준을 분석한다.
한 실시예에서, 농도는 대조군 또는 "정상" 또는 "비정상" 값들의 데이터베이스와 비교된다. 다른 실시예에서, 농도는 질환에 대해 공지된 상태의 피험자로부터 동일한 바이오마커들의 수준을 포함하는 데이터의 제 1 지식 베이스로부터 생성된 알고리즘에 적용되며 알고리즘은 질환을 갖거나 갖지 않은 피험자의 확률 지수를 제공한다.
본 발명의 또 다른 태양은 부인과 질환의 존재 또는 부존재를 진단하기 위한 키트를 고려하며, 키트는 원소들 [X]n, Y 및 [Z]m을 포함하는 물질의 조성물을 포함한다:
X는 CA125 또는 이의 변형 형태 또는 동족체 형태로부터 선택된 바이오마커에 대한 리간드이고 n은 0 또는 1이며;
Y는 n 0일 때, AGR-2 및/또는 미드카인 또는 이의 변형 형태 또는 동족체 형태 중 하나 이상; IL-6, IL-8, CRP, SAA 및 SAP 또는 이의 변형 형태 또는 동족체 형태 중 둘 이상 또는 n이 1일 때, IL-6, IL-8, CRP, SAA 및 SAP 또는 이의 변형 형태 또는 동족체 형태 중 적어도 하나를 포함하는 목록으로부터 선택된 바이오마커에 대한 리간드이고
Z는 미드카인 및 AGR-2 또는 이의 변형 형태 또는 동족체 형태로부터 선택된 바이오마커에 대한 리간드이고 m은 0 또는 1이며;
키트는 리간드에 결합하는 바이오마커의 농도의 측정을 용이하게 하는 시약들을 더 포함한다. 사용시에, 키트는 바이오마커 수준의 측정을 용이하게 한다. 이런 수준들은 대조군 또는 값들의 데이터베이스와 비교될 수 있다. 다른 실시예에서, 수준들은 질환에 대해 알려진 상태의 피험자의 동일한 바이오마커들의 수준들을 포함하는 데이터의 제 1 지식 베이스로부터 생성된 알고리즘에 적용되며 알고리즘은 질환을 갖거나 갖지 않은 피험자의 확률 지수를 제공한다.
본 발명은 목록 [X]n, [Y]x 및 [Z]m을 포함하는 마커들의 패널을 추가로 제공한다:
X는 CA125 또는 이의 변형 형태 또는 동족체 형태이고 n은 0 또는 1이고;
Y는 n이 O일 때 IL-6, IL-8, CRP, SAA 및 SAP 또는 이의 변형 형태 또는 동족체 형태로부터 선택된 마커이고, Y는 마커들 중 둘 이상을 포함하며 x는 0 또는 1이고;
Z는 AGR-2 또는 미드카인 및/또는 CA125 또는 이의 변형 형태 또는 동족체 형태 중 둘 이상이고 m은 0 또는 1이다.
키트 및 지식-기초 컴퓨터 소프트웨어 및 하드웨어는 본 발명의 일부를 형성한다.
특히, 본 발명의 분석법들은 병리학적 서비스와 관련된 현존하는 지식-기반 아키텍처 또는 플랫폼에 사용될 수 있다. 예를 들어, 분석법들에 의한 결과는 통신 네트워크(예를 들어, 인터넷)를 통해 프로세싱 시스템으로 전달되며 프로세싱 시스템에는 알고리즘이 저장되고 진단 또는 예측 보고서의 형태로 최종 사용자에게 전달되는 질환 확률 지수로 바꾸는 예측된 사후 확률 값을 생성하는데 사용된다.
따라서, 분석법은 바이오마커들의 농도를 탐지하는데 필수적인 시약들 및 측정 및 보고서들의 임상 의사로의 전달을 용이하게 하는 컴퓨터 하드웨어 및/또는 소프트웨어를 포함하는 키트 또는 컴퓨터-기반 시스템의 형태일 수 있다.
본 발명의 분석법은 현존하는 또는 새롭게 개발된 병리학적 아키텍처 또는 플랫폼 시스템으로의 통합을 허용한다. 예를 들어, 본 발명은 사용자가 부인과 암 또는 이의 아형 또는 암의 단계에 대한 피험자의 상태를 측정하게 하는 방법을 고려하며,
(a) 통신 네트워크를 통해 사용자로부터 CA125 및 AGR-2, 미드카인, CRP, IL-6, IL-8, SAA 및 SAP 중 하나 이상의 수준 또는 농도의 형태의 데이터를 수신하는 단계;
(b) 질환 지수 값을 제공하기 위해 다변량 분석을 통해 피험자 데이터를 처리하는 단계;
(c) 소정의 값들과 비교해서 질환 인덱스 값의 결과들에 따라 피험자의 상태를 측정하는 단계; 및
(d) 다변량 분석을 참조하여 통신 네트워크를 통해 사용자에게 피험자의 상태의 표시를 전달하는 단계를 포함하는 방법은 다변량 분석 기능을 수행하는 알고리즘을 포함한다.
편리하게, 본 방법은 일반적으로 다음을 더 포함한다:
(a) 사용자가 원거리 엔드 스테이션을 사용하여 데이터를 측정하게 하는 단계; 및
(b) 통신 네트워크를 통해 엔드 스테이션으로부터 베이스 스테이션으로 데이터를 전달하는 단계.
베이스 스테이션은 제 1 및 제 2 프로세싱 시스템을 포함할 수 있고, 이 경우 본 방법은 다음을 포함할 수 있다:
(a) 데이터를 제 1 프로세싱 시스템에 전달하는 단계
(b) 데이터를 제 2 프로세싱 시스템에 전달하는 단계; 및
(c) 제 1 프로세싱 시스템이 질환 지수 값을 생성하도록 다변량 분석 기능을 수행하게 하는 단계.
본 방법은 다음을 포함할 수 있다:
(a) 다변량 분석 기능의 결과들을 제 1 프로세싱 시스템으로 전달하는 단계; 및
(b) 제 1 프로세싱 시스템이 피험자의 상태를 측정하게 하는 단계.
이런 경우, 본 방법은 다음 중 적어도 하나를 포함한다:
(a) 제 1 방화벽을 통해 통신 네트워크와 제 1 프로세싱 시스템 사이에 데이터를 전달하는 단계; 및
(b) 제 2 방화벽을 통해 제 1 및 제 2 프로세싱 시스템 사이에 데이터를 전달하는 단계.
제 2 프로세싱 시스템은 소정의 데이터 및/또는 다변량 분석 기능을 저장하는데 적합한 데이터베이스와 결합될 수 있고, 본 방법은
(a) 적어도 선택된 소정의 데이터를 얻기 위해 또는 데이터베이스로부터 알고리즘에 접근하기 위해 데이터베이스에 질문하는 단계; 및
(b) 선택된 소정의 데이터를 피험자 데이터와 비교하는 단계 또는 예측된 확률 지수를 생성하는 단계를 포함한다.
제 2 프로세싱 시스템은 데이터베이스와 결합될 수 있고, 본 방법은 데이터베이스에 데이터를 저장하는 단계를 포함한다.
본 방법은 사용자가 바이오마커의 수준을 측정할 수 있는 시큐어 어레이(secure array)를 사용하여 데이터를 측정하게 하는 단계 및 개별 위치(들)에 각각 위치된 여러 피처가 각각의 코드 상에 위치시키는 단계를 포함할 수 있다. 이 경우에, 본 방법은 베이스 스테이션이
(a) 데이터로부터 코드를 측정하고;
(b) 어레이 상에 각각의 피처의 위치를 나타내는 레이아웃을 측정하고; 및
(c) 측정된 레이아웃과 데이터에 따라 변수 값들을 측정하게 하는 것을 포함한다.
본 발명은 베이스 스테이션이
(a) 사용자에 의한 지급의 제공을 나타내는 지급 정보를 측정하고;
(b) 지급 정보의 측정에 반응하여 비교를 수행하게 하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명은 부인과 암 또는 이의 아형 또는 암의 단계에 대한 피험자의 상태를 측정하기 위한 베이스 스테이션을 제공하며, 베이스 스테이션은
(a) 저장 방법;
(b) 프로세싱 시스템, 프로세싱 시스템은:
(i) 통신 네트워크를 통해 사용자로부터 피험자의 AGR-2, 미드카인, CA125, IL-6, IL-8, CRP, SAA 및 SAP로부터 선택된 둘 이상의 바이오마커들의 수준들 또는 농도들을 포함하는 데이터를 받고
(ii) 데이터를 소정의 데이터와 비교하는 단계를 포함하여 알고리즘 기능을 수행하고;
(iii) 비교를 포함하는 알고리즘 기능의 결과에 따라 피험자의 상태를 측정한다; 및
(c) 통신 네트워크를 통해 사용자에게 피험자의 상태를 표시하는 출력부를 포함한다.
프로세싱 시스템은 데이터를 측정하는 원거리 엔드 스테이션으로부터 데이터를 수신한다.
프로세싱 시스템은 다음을 포함할 수 있다:
(a) 제 1 프로세싱 시스템, 이것은:
(i) 데이터를 수신하고; 및
(ii) 데이터를 비교하는 것을 포함하여 다변량 분석 기능의 결과들에 따라 피험자의 상태를 측정한다; 및
(b) 제 2 프로세싱 시스템, 이것은:
(i) 프로세싱 시스템으로부터 데이터를 수신하고;
(ii) 비교를 포함하는 다변량 분석 기능을 수행하고; 및
(iii) 제 1 프로세싱 시스템에 결과들을 전달한다.
베이스 스테이션은 통상적으로 다음을 포함한다:
(a) 통신 네트워크에 제 1 프로세싱 시스템을 결합하기 위한 제 1 방어벽; 및
(b) 제 1 및 제 2 프로세싱 시스템을 위한 제 2 방어벽.
프로세싱 시스템은 데이터베이스에 연결될 수 있고, 프로세싱 시스템은 데이터베이스에 데이터를 저장한다.
본 발명의 또 다른 태양은 피험자에서 난소암 또는 다른 부인과 질환을 탐지하기 위해, AGR-2, 미드카인, CA125, IL-6, IL-8, CRP, SAA 및 SAP 또는 이의 변형 형태 또는 동족체 형태로부터 선택된 둘 이상의 바이오마커의 수준들의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 태양은 피험자에서 난소암 또는 다른 부인과 질환을 탐지하기 위한 분석법의 제조에서 AGR-2 또는 미드카인 또는 이의 변형 형태 또는 동족체 형태의 수준들의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 태양은 피험자에서 난소암 또는 다른 부인과 질환을 탐지하기 위한 분석법의 제조에서 AGR-2, 미드카인 및 CA125 또는 이의 변형 형태 또는 동족체 형태의 수준들의 용도를 제공한다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있음
도 1은 피험자가 부인과 질환을 갖거나 갖지 않는 확률의 지수를 생성하는 알고리즘을 제공하기 위한 모델링의 도식이다.
도 2는 바이오마커 데이터의 모델링과 입증 모두를 나타내는 도식이다.
도 3a 및 3b는 부인과 암을 갖거나 갖지 않는 피험자의 질환 확률 지수에 대한 보고서를 제공하기 위해 병리학적 플랫폼에 연결된 본 발명의 분석법의 개략도이다.
도 4 및 5는 보고서를 제공하기 위한 병리학적 플랫폼과 연결된 분석법의 개략도이다. 1, 엔드 스테이션; 2, 베이스 스테이션; 3, 클라이언트 서버(예를 들어, 단순 물체 사용 프로토콜(SOAP); 4, 통신 네트워크(예를 들어, 인터넷); LEVIS, 실험실 정보 관리 시스템; 분석 보고서의 예는 도 6에 도시된다.
도 6은 도 3에 도시된 분석법에 의해 생성된 보고서의 데이터이다.
도 7은 정상 인간 난소의 조각에서 면역반응성(ir)-AGR-2의 면역조직화학적 위치결정을 나타내는 사진이다. 정상 난소 상피(화살표)는 ir-AGR-2(A,B)에 지속적으로 음성적이었다. 정상 난소 내의 소형 낭종은 ir-AGR-2(D)에 대한 뚜렷한 세포질 염색된 우발적인 세포들(화살표)을 나타내었다. 배율은 A, C의 경우 x 200이고 B, D의 경우 x 400이다.
도 8은 상피 세포-유도 난소 종양에서 ir-AGR-2의 면역조직화학적 위치결정을 나타내는 사진이다. (A) 자궁경관 형태의 양성 점액종양. 상피의 거의 전부는 강한 과립 세포질 염색을 나타낸다. 염색은 특히 기부와 세포막을 따라 강하다. (B) 변하는 강도의 강한 과립 염색을 나타내는 상피 세포들을 가진 장액성 경계 종양(serous borderline tumor). (C) 잘 성장된 과립 패턴을 가진 잘 분화된 등급 1 자궁내막양 종양(endometrioid tumors). 종양은 상피 전체에서 세포들의 그룹들의 강한 과립 세포질 염색을 나타내다. 여러 세포들에서, 염색은 세포/세포 막들 및 첨부 표면을 따라 더욱 강하게 보인다. (D) 잘 분화된 과립 패턴을 가진 등급 1 자궁내막양 종양. 종양은 샘 내의 가변 강도의 짙은 과립 세포질 염색을 나타낸다. (E) 등급 2 장액성 종양. 잘 형성된 면역반응성 세포들의 섬은 대개 음성적인 염색, 알맞게 분화된 종양 내에 존재한다. 염색은 과립형이고, 세포질의 대부분을 차지하고 선단 근처에서 더욱 밀집하게 축적된다. (F) ir-AGR-2에 대해 강하고, 짙은 과립 염색을 나타내는 분리된 세포들의 산개된 그룹들을 가진 주도적으로 약하게 분화된 등급 3 장액성 종양. (G) 약하게 분화된 등급 3 종양에 인접한 나머지, 잘 분화된, 강하게 면역염색된 샘을 나타내는 등급 3 장액성 종양 부분. (H) 유두 안벽에 붙은 종양 세포들의 그룹들의 강한 세포질 면역염색을 나타내는 유두모양을 가진 장액성 등급 3 암종. (I) 전형적인 투명 세포 패턴을 나타내는 등급 3 투염 세포 암종. 종양 둥지 및 코드 내의 세포들의 광범위한 세포질 면역염색이 있다(C, E, G 및 I에 대한 x 200 배율 및 A, B, D, F 및 H에 대한 x 400 배율).
도 9는 친화 정제된 토끼 안티-AGR-2(1:500)를 사용하는 수집 인간 혈장 샘플들(pooled human plasma samples)의 웨스턴 블럿의 사진이다. 개개의 혈장 샘플들(그룹당 3-6)은 대조 피험자들과 다양한 단계의 진단된 장액성, 점액성 및 투명 세포 난소 암종을 가진 환자들로부터 얻었다. 각 그룹에서 동일한 양의 개별 혈장 샘플들은 잔존하는 혈장 단백질을 농축하고 탐지를 향상시키기 위해서 다중 친화 제거 시스템(Agilent)을 사용하여 상부 6개 혈장 단백질을 수집하고 제거하였다. 각 그룹의 결실된 혈장 단백질의 12㎍의 등가물(equivalent)은 화학발광 탐지를 사용하는 안티-AGR-2를 사용하여 웨스턴 블럿하였다. 대략 18kDa(성숙한 AGR-2)의 약한 면역반응성 종들은 점액성 및 투명 세포 난소 암종 혈장에서 분명하나 대조군 혈장 또는 장액성 나소암 환자들로부터 얻은 혈장에서는 분명하지 않아서, 다른 난소 종양 형태들과 결합된 ir-AGR-2의 차등 발현 및 분비를 나타낸다. 여러 고 분자량 면역반응성 종들은 안티-AGR-2 항체로 표지화된다. 이들 종들은 다른 난소암 형태들을 가진 환자들로부터 유도된 혈장 샘플들에서 차등적으로 발현되는 것처럼 보인다.
도 10은 표 9에 도시된 CA125 및 바이오마커 패널을 비교하는 모델 샘플 하부세트로 얻은 표 10에 개시된 ROC 곡선 분석의 그래프이다.
도 11은 표 11에 도시된 CA125 및 바이오마커 패널을 비교하는 입증 샘플 하부세트로 얻은 표 12에 개시된 ROC 곡선 분석의 그래프이다.
도 12는 표 13에 도시된 CA125 및 바이오마커 패널을 비교하는 전체 샘플 세트로 얻은 표 14에 개시된 ROC 곡선 분석의 그래프이다.
도 13은 표 9에 도시된 CA125 및 바이오마커 패널을 비교하는 모델 샘플 하부세트로 얻은 표 17에 개시된 ROC 곡선 분석의 그래프이다.
도 14는 표 11에 도시된 CA125 및 바이오마커 패널을 비교하는 입증 샘플 하부세트로 얻은 표 18에 개시된 ROC 곡선 분석의 그래프이다.
도 15는 표 13에 도시된 CA125 및 바이오마커 패널을 비교하는 전체 샘플 세트로 얻은 표 19에 개시된 ROC 곡선 분석의 그래프이다.
도 16은 초기 단계 난소암 환자들 vs 정상 샘플들에서 AGR-2의 평균 농도 +/- SEM의 그래프이다.
도 17은 초기 단계(단계 I/II) 난소암 환자들 vs 정상 샘플들에서 AGR-2의 평균 혈장 농도 ± SEM의 그래프이다.
도 18은 초기 단계(단계 I/II) 난소암 환자들 및 건강한 대조군들에서 AGR-2 및 CA125의 혈장 농도들 사이의 상관관계의 그래프이다.
도 19는 개별적으로 및 두 개의 마커 패널로서 CA125 및 AGR-2에 대해 표 21에 개시된 ROC 곡선 분석의 그래프이다.
도 20은 난소암 환자들 vs 대조군들에서 AGR-2의 혈장 농도의 그래프이다. 막대는 61개 대조군 및 46개 난소암 혈장 샘플(모든 경우)의 평균 ± SEM을 나타내고, 난소암 샘플들 중 35개는 초기 단계(단계 I/II) 질환을 나타내었다. *P<0.05 vs 대조군.
도 21은 난소암 환자들 vs 대조군들(0, 대조군; 1, 장액성 형태 OVCA; 2, 자궁내막증; 3, 점액성; 4, 뮬러 혼합 형태(mullerian mixed type); 5, 투명 세포)에서 AGR-2의 평균±SEM 혈장 농도의 그래프이다.
본 명세서에서 사용된 대로, 단수 형태("a", "an" 및 "the")는 내용이 분명하게 달리 나타내지 않는 한 복수 형태를 포함한다. 따라서, "바이오마커"는 하나의 바이오마커뿐만 아니라 둘 이상의 바이오마커를 포함하며; "분석물질"은 하나의 분석물질뿐만 아니라 둘 이상의 분석물질을 포함하며; "본 발명"은 본 발명의 하나 및 여러 태양을 포함한다.
본 출원에서 구체화한 다양한 범위에서 수치 값들의 사용은 상기 범위 내에서 최소 및 최대 값은 "약"이란 단어가 붙었지만, 달리 나타내지 않는 한, 근사치로 나타낸다. 이와 관련하여, 상기 범위의 위와 아래의 약간 변형은 범위들 내의 값들과 실질적으로 동일한 결과를 얻도록 사용될 수 있다. 또한, 이런 범위들의 개시는 최소 및 최대 값 사이의 각각의 값을 포함하는 연속된 범위로 생각된다. 또한, 본 발명은 난소암 발생 또는 존재의 위험의 수준과 관련된 수치 값을 제공하는 둘 이상의 마커의 비율에 관한 것이다.
빠르고 효과적이고 민감한 분석법이 부인과 질환의 동정을 위해 제공된다. 부인과 질환은 난소암과 같은 암 또는 암 또는 자궁내막증과 같은 염증 질환으로부터 발생한 합병증을 포함한다. 특정 실시예에서, 분석법은 난소암의 초기 탐지를 가능하게 한다. 그럼에도 불구하고, 본 발명은 부인과 질환의 임의의 단계 또는 이의 치료 또는 이로부터 발생한 임의의 합병증에 사용될 수 있기 때문에 단지 난소암의 초기 탐지에 제한되지 않는다.
"부인과 질환"에 대한 "암"은 난소암뿐만 아니라 점액성 또는 자궁내막 난소암과 같은 난소암의 아형 또는 단계 I, II, III 또는 IV와 같은 난소암의 단계를 포함한다. "난소암", "상피 난소암" 및 "난소 악성종양"과 같은 용어는 본 발명에서 상호교환해서 사용될 수 있다. 본 발명은 증상을 나타내는 여성의 진단에 사용될 때 특히 효과적이나, 증상을 나타내지 않는 여성들 및/또는 부인과 질환이 발생할 위험이 큰 여성들의 진단에도 동일하게 사용될 수 있다.
부인과 질환 및 특히 난소암 또는 이로부터 발생한 합병증 또는 부인과 염증질환의 탐지에 효과적인 사이토카인 또는 분석물질 바이오마커들이 아래 동정된다. 일괄해서, 이들은 "바이오마커" 또는 "부인과 질환 마커" 또는 "부인과 질환의 마커"로 불린다.
한 실시예에서, 바이오마커들은 AGR-2, 미드카인 및/또는 CA125 중 둘 이상으로부터 선택된다. 다른 실시예에서, 바이오마커들은 IL-6, IL-8, CRP, SAA 및/또는 SAP 중 하나 이상으로부터 선택된다. 또 다른 실시예에서, 바이오마커들은 선택적으로, CA125 및 IL-6, IL-8, CRP, SAA 및/또는 SAP 중 하나 이상을 포함하고 후자 바이오마커들 중 적어도 하나는 미드카인 또는 AGR-2 중 하나 이상에 의해 치환될 수 있다. 그럼에도불구하고, 본 발명은 바이오마커들 중 임의의 하나 이상을 부인과 질환의 탐지를 함께 또는 개별적으로 지원하는 다른 분석물질로 대체하는 것에 관한 것이다. 또한, AGR-2, 미드카인, CA125, IL-6, IL-8, CRP, SAA 및 SAP 중 임의의 하나 이상은 이의 변형 형태 또는 동족체 형태를 포함한다. 변형 형태는 유도체, 다형 변이체, 절단된 형태(절단) 및 덩어리진 또는 멀미터 형태 또는 팽창 원소들(예를 들어, 아미노산 팽창 원소들)을 가진 형태를 포함한다. 간단히, 이런 변형 형태 및 동족체 형태는 바이오마커들의 임의의 것 또는 일부 또는 전부를 언급하는데 포함된다.
한편, 바이오마커들은 목록 [X]n, [Y]x 및 [Z]m을 포함하는 마커들의 패널을 나타낸다:
X는 CA125이고 n은 0 또는 1이고;
Y는 n이 O일 때 IL-6, IL-8, CRP, SAA 및 SAP로부터 선택된 마커이고, Y는 마커들 중 둘 이상을 포함하며 x는 0 또는 1이고;
Z는 AGR-2 또는 미드카인 및/또는 CA125 중 둘 이상이고 m은 0 또는 1이다.
따라서, 본 발명의 한 태양은 피험자에서 난소암의 존재를 측정하기 위한 분석법을 제공하며, 분석법은 AGR-2, 미드카인, CA125 중 둘 이상; CA125, IL-6, IL-8, CRP, SAA 및 SAP 중 둘 이상; IL-6, IL-8, CRP, SAA 및/또는 SAP 중 둘 이상; 또는 CA125, IL-6, IL-8, SAA 및 SAP 중 적어도 하나 및 미드카인 또는 AGR-2 중 적어도 하나로부터 선택된 피험자의 생물학적 샘플에서 바이오마커들의 농도를 측정하는 단계를 포함하며; 대조군에 대한 바이오마커들의 수준에서 변화는 부인과 질환의 존재의 표시를 제공한다.
다른 실시예에서, 본 발명은 피험자에서 난소암의 존재를 측정하기 위한 분석법을 고려하며, 분석법은 AGR-2, 미드카인 및/또는 CA125 중 둘 이상; CA125, IL-6, IL-8, CRP, SAA 및/또는 SAP 중 둘 이상; IL-6, IL-8, CRP, SAA 및 SAP 중 둘 이상; 또는 CA125, IL-6, IL-8, SAA 및/또는 SAP 중 적어도 하나 및 미드카인 및/또는 AGR-2 중 적어도 하나로부터 선택된 피험자의 생물학적 샘플에서 바이오마커들의 농도를 측정하는 단계; 질환에 대해 알려진 상태의 피험자로부터의 동일한 바이오마커들의 수준을 포함하는 데이터의 제 1 지식 베이스로부터 생성된 알고리즘에 수준들을 적용하는 단계를 포함하며 알고리즘은 질환을 갖거나 갖지 않은 피험자의 확률 지수를 제공한다. "알고리즘"은 다변량 분석 기능을 수행하는 알고리즘이다.
다른 실시예에서, 본 발명은 피험자에서 부인과 질환의 존재를 측정하기 위한 분석법을 고려하며, 분석법은 피험자의 생물학적 샘플에서 AGR-2의 농도를 측정하는 단계를 포함하고 AGR-2에서 변화된 농도는 부인과 질환을 가진 피험자를 나타낸다. 이 실시예에 따라, AGR-2의 수준들은 단독으로 또는 다른 바이오마커들과 조합해서 스크린될 수 있다.
다른 실시예에서, 본 발명은 피험자에서 부인과 질환의 존재를 측정하기 위한 분석법을 고려하며, 분석법은 피험자의 생물학적 샘플에서 미드카인의 농도를 측정하는 단계를 포함하며 미드카인에서 변화된 농도는 부인과 질환을 가진 피험자를 나타낸다. 이 실시예에 따라, 미드카인의 수준들은 단독으로 또는 다른 바이오마커들과 조합해서 스크린될 수 있다.
본 발명의 나중 세 태양은 CA125의 농도를 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
특정 실시예에서, 부인과 질환은 난소암 또는 이로부터 발생한 합병증 또는 단계 I 또는 II 또는 III 또는 IV와 같은 난소암의 단계이다.
다른 실시예에서, 본 발명은 피험자에서 난소암의 존재를 측정하기 위한 분석법을 제공하며, 분석법은 AGR-2, 미드카인 및 CA125 중 둘 이상; CA125, IL-6, IL-8, CRP, SAA 및 SAP 중 둘 이상; IL-6, IL-8, CRP, SAA 및 SAP 중 둘 이상; 또는 CA125, IL-6, IL-8, SAA 및 SAP 중 적어도 하나 및 미드카인 또는 AGR-2 중 적어도 하나로부터 선택된 피험자의 생물학적 샘플에서 바이오마커들의 수준을 측정하는 단계를 포함하며; 바이오마커들의 농도에서 변화는 난소암의 존재의 나타낸다.
본 발명의 다른 태양은 피험자에서 난소암의 존재를 측정하기 위한 분석법을 고려하며, 분석법은 AGR-2, 미드카인, CA125 중 둘 이상; CA125, IL-6, IL-8, CRP, SAA 및 SAP 중 둘 이상; IL-6, IL-8, CRP, SAA 및 SAP 중 둘 이상; 또는 CA125, IL-6, IL-8, SAA 및 SAP 중 적어도 하나 및 미드카인 또는 AGR-2 중 적어도 하나로부터 선택된 피험자의 생물학적 샘플에서 바이오마커들의 수준을 측정하는 단계; 질환에 대해 알려진 상태의 피험자로부터의 동일한 바이오마커들의 수준을 포함하는 데이터의 제 1 지식 베이스로부터 생성된 알고리즘에 수준을 적용하는 단계를 포함하며 알고리즘은 질환을 갖거나 갖지 않은 피험자의 확률 지수를 제공한다.
데이터의 제 1 지식 베이스는 여러 피험자로부터 얻을 수 있다.
다른 실시예에서, 본 발명은 피험자에서 난소암의 존재를 측정하기 위한 분석법을 제공하며, 분석법은 피험자의 생물학적 샘플에서 AGR-2 또는 미드카인의 농도를 측정하는 단계를 포함하며 AGR-2 또는 미드카인에서 변화된 농도는 난소암을 가진 피험자를 나타낸다. 이런 실시예에 따라, AGR-2 또는 미드카인의 수준은 단독으로 또는 다른 바이오마커들과 조합해서 스크린될 수 있다. "변화된" 수준은 AGR-2 또는 미드카인의 농도에서 증가 또는 상승 또는 감소 또는 하강을 의미한다.
이 태양은 CA125의 농도를 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
바이오마커들의 농도 또는 수준의 측정은 대조군에 대한 농도를 기초로 한 진단 규칙의 설정을 가능하게 한다. 또한, 진단 규칙은 통계적 및 기계적 학습 알고리즘의 사용을 기초로 한다. 이런 알고리즘은 알려지지 않은 상태를 가진 환자들의 상태를 예측하는데 사용되는 관계를 의미하기 위해서 트레이닝 데이터(알려진 질환 상태를 가진)에서 관찰된 바이오마커들과 질환 상태 사이의 관계를 사용한다. 환자가 부인과 질환을 갖는다는 확률 지수를 제공하는 알고리즘이 사용된다. 알고리즘은 다변량 분석 기능을 수행한다.
한 실시예에서, 본 발명은 통계적 및 기계적 학습 알고리즘의 사용을 기초로 한 진단 규칙을 제공한다. 이런 알고리즘은 알려지지 않은 상태를 가진 환자들의 상태를 예측하는데 사용되는 관계를 의미하기 위해서 트레이닝 데이터(알려진 질환 상태를 가진)에서 관찰된 바이오마커들과 질환 상태 사이의 관계를 사용한다. 데이터 분석의 기술분야에서 당업자들은 트레이닝 데이터에서 암시하는 관계의 많은 다른 형태는 본 발명을 상당히 변화시키지 않고 사용될 수 있다.
한편, 본 발명은 알고리즘을 생성하기 위해 부인과 질환을 가진 피험자의 바이오마커들의 수준을 포함하는 트레이닝 데이터의 지식 베이스의 용도를 고려하며, 알려지지 않은 부인과 질환을 가진 환자의 동일한 바이오마커들의 수준을 포함하는 데이터의 제 2 지식 베이스를 입력하자마자, 부인과 질환의 성질을 예측하는 확률 지수를 제공한다.
또한, AGR-2의 변화된 수준은 부인과 질환을 나타낸다.
또한, 미드카인의 변화된 수준은 부인과 질환을 나타낸다.
후자의 두 태양은 CA125의 변화된 수준과 조합될 수 있다.
"피험자"는 일반적으로 인간 여성이다. 그러나, 본 발명은 동물 사용에도 해당된다. 한편, 피험자는 소, 말, 동물 또는 비-인간 영장류와 같은 비-인간 암컷 포유류일 수 있다. 그럼에도불구하고, 본 발명은 인간 여성에서 부인과 암을 탐지하는데 특히 사용될 수 있다.
"트레이닝 데이터"라는 용어는 대조군에 대한 바이오마커들의 수준의 지식을 포함한다. "대조군"은 부인과 질환이 없거나 질환이 치료된 피험자에서 바이오마커들의 수준과의 비교를 포함할 수 있거나 실험을 기초로 통계적으로 측정된 수준일 수 있다. "수준"이란 용어는 바이오마커들의 수준의 비율을 포함한다.
"트레이닝 데이터"는 AGR-2 및/또는 미드카인 중 하나 이상의 농도를 포함한다. 데이터는 AGR-2 및/또는 미드카인 농도에서 증가 또는 감소에 대한 정보를 포함할 수 있다.
본 발명은 피험자에서 부인과 질환의 탐지를 위한 바이오마커들의 패널을 고려하며, 패널은 둘 이상의 바이오마커들의 수준을 측정하기 위해 AGR-2, 미드카인 및 CA125 중 둘 이상; CA125, IL-6, IL-8, CRP, SAA 및 SAP 중 둘 이상; IL-6, IL-8, CRP, SAA 및 SAP 중 둘 이상; 및 CA125, IL-6, IL-8, SAA 및 SAP 중 적어도 하나 및 미드카인 또는 AGR-2 중 적어도 하나로부터 선택된 바이오마커들과 특이적으로 결합하는 물질을 포함하며 질환에 대해 공지된 상태의 피험자로부터의 동일한 바이오마커들의 수준을 포함하는 데이터의 제 1 지식 베이스로부터 생성된 알고리즘에 수준을 적용하며, 알고리즘은 질환을 갖거나 갖지 않은 피험자의 확률 지수를 제공한다.
특히, 본 발명은 부인과 질환의 탐지에 효과적인 바이오마커들의 리간드들의 패널을 제공하며, 패널은 AGR-2, 미드카인 또는 CA125 중 둘 이상; CA125, IL-6, IL-8, CRP, SAA 또는 SAP 중 둘 이상; IL-6, IL-8, CRP, SAA 또는 SAP 중 둘 이상; 또는 CA125, IL-6, IL-8, SAA 또는 SAP 중 적어도 하나 및 미드카인 또는 AGR-2 중 적어도 하나를 포함한다.
다른 실시예에서, 본 발명은 피험자에서 부인과 질환의 탐지를 위한 바이오마커들의 패널을 고려하며, 패널은 둘 이상의 바이오마커의 수준을 측정하기 위해 AGR-2, 미드카인 및 CA125 중 둘 이상; CA125, IL-6, IL-8, CRP, SAA 및 SAP 중 둘 이상; IL-6, IL-8, CRP, SAA 및 SAP 중 둘 이상; CA125, IL-6, IL-8, CRP, SAA 및 SAP 중 적어도 하나; 및 미드카인 또는 AGR-2 중 적어도 하나로부터 선택된 바이오마커들과 특이적으로 결합하는 물질을 포함하며 바이오마커들의 수준에서 변화는 부인과 질환을 나타낸다.
본 발명에서 고려된 바이오마커들의 조합은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개 바이오마커와 같은 2개 바이오마커 내지 9개 바이오마커를 포함한다. 바이오마커들의 수준 또는 농도는 "데이터의 제 2 지식 베이스"로 불리는 입력 검사 데이터를 제공한다. 데이터의 제 2 지식 베이스는 대조군에 비교해서 고려되거나 알려진 부인과 질환을 가진 피험자에서 바이오마커들의 수준의 정보를 포함하는 "데이터의 제 1 지식 베이스"에 의해 생성된 알고리즘으로 공급된다. 데이터의 제 2 지식 베이스는 부인과 질환에 대해 알려지지 않은 상태의 피험자로부터의 것이다. 알고리즘의 출력은 특정 부인과 질환을 갖거나 질환을 갖지 않는 피험자의, 확률 지수로 불리는 확률 또는 위험 인자이다.
둘 이상의 바이오마커는 CA125, AGR-2; CA125, 미드카인; CA125, IL-6; CA125, IL-8; CA125, CRP; CA125, SAA; CA125, SAP; CA125; IL-6, IL-8; IL-6, CRP; IL-6, SAA; IL-6, SAP; IL-6; IL-6, 미드카인; IL-6, AGR-2; IL-8, CRP; IL-8, SAA; IL-8 SAP; IL-8; IL-8, 미드카인; IL-8, AGR-2; CRP, SAA; CRP, SAP; CRP; CRP, 미드카인; CRP, AGR-2; SAA, SAP; SAA; SAA, 미드카인; SAA, AGR-2; SAP; SAP, 미드카인; SAP, AGR-2; 및 미드카인, AGR-2를 함유하고 포함한다. 또한, 본 발명은 CA125, IL-6; CA125, IL-8; CA125, CRP; CA125, SAA; CA125, SAP; CA125; CA125, 미드카인; CA125, AGR-2; IL-6, IL-8; IL-6, CRP; IL-6, SAA; IL-6, SAP; IL-6; IL-6, 미드카인; IL-6, AGR-2; IL-8, CRP; IL-8, SAA; IL-8 SAP; IL-8; IL-8, 미드카인; IL-8, AGR-2; CRP, SAA; CRP, SAP; CRP; CRP, 미드카인; CRP, AGR-2; SAA, SAP; SAA; SAA, 미드카인; SAA, AGR-2; SAP; SAP, 미드카인; SAP, AGR-2; 및 미드카인, AGR-2의 비율과 같은 둘 이상의 마커의 비율을 포함하는 데이터의 제 2 지식 베이스에 해당한다.
다른 실시예에서, 하나의 바이오마커는 AGR-2 또는 미드카인의 형태로 관찰된다. 또한, AGR-2 또는 미드카인은 하나 이상의 다른 마커와 조합해서 스크린될 수 있다. CA125는 본 발명의 이 태양에 따라 측정될 수 있다.
바이오마커들에 "특이적으로 결합하는" 물질은 일반적으로 항체 또는 하이브리드, 이의 재조합 또는 변형 형태를 포함하는 유도체 또는 이의 항원-결합 단편과 같은 면역 상호작용 분자를 포함한다. 물질들은 수용체 또는 다른 리간드일 수 있다. 이런 물질들은 바이오마커들의 수준을 측정하는 것을 돕는다. 수준에 대한 정보는 알고리즘에 대한 입력 데이터이다.
한편, 본 발명은 AGR-2, 미드카인 및/또는 CA125 중 둘 이상; CA125, IL-6, IL-8, CRP, SAA 및/또는 SAP 중 둘 이상; IL-6, IL-8, CRP, SAA 및/또는 SAP 중 둘 이상; 또는 CA125, IL-6, IL-8, CRP, SAA 및/또는 SAP 중 적어도 하나; 및 미드카인 및/또는 AGR-2 중 적어도 하나에 대한 고정화 리간드들의 패널을 추가로 제공한다.
본 발명의 또 다른 태양은 부인과 질환의 존재 또는 부존재를 진단하기 위한 키트를 고려하며, 키트는 원소들 [X]n, Y 및 [Z]m을 포함하는 물질의 조성물을 포함한다:
X는 CA125로부터 선택된 바이오마커에 대한 리간드이고 n은 0 또는 1이며;
Y는 n 0일 때, IL-6, IL-8, CRP, SAA 및 SAP 중 둘 이상 또는 n이 1일 때, IL-6, IL-8, CRP, SAA 및 SAP 중 적어도 하나를 포함하는 목록으로부터 선택된 바이오마커에 대한 리간드이고
Z는 미드카인 및 AGR-2로부터 선택된 바이오마커에 대한 리간드이고 m은 0 또는 1이며;
키트는 리간드에 결합하는 바이오마커의 농도의 측정을 용이하게 하는 시약들을 더 포함한다. 사용시에, 키트는 바이오마커들의 측정을 용이하게 한다. 이 수준은 대조군과 비교되거나 질환에 대해 공지된 상태의 피험자의 동일한 바이오마커들의 수준들을 포함하는 데이터의 제 1 지식 베이스로부터 생성된 알고리즘에 적용을 받고 알고리즘은 질환을 갖거나 갖지 않은 피험자의 확률 지수를 제공한다.
키트는 AG-2 또는 미드카인 단독 또는 CA125와 조합한 AGR-2 또는 미드카인의 농도를 탐지하기 위한 시약들을 선택적으로 포함할 수 있다.
본 발명은 목록 [X]n, [Y]x 및 [Z]m을 포함하는 마커들의 패널을 추가로 제공한다:
X는 CA125이고 n은 0 또는 1이고;
Y는 n이 O일 때 IL-6, IL-8, CRP, SAA 및 SAP로부터 선택된 마커이고, Y는 마커들 중 둘 이상을 포함하며 x는 0 또는 1이고;
Z는 AGR-2, 미드카인 및/또는 CA125 중 둘 이상이고 m은 0 또는 1이다.
바이오마커들의 각각에 특이적인 항체들과 같은 리간드들은 적어도 둘 이상의 바이오마커의 수준의 정량적 또는 정성적 탐지 또는 측정을 가능하게 한다. "수준"은 부피당 중량으로서 농도, 부피당 활성 또는 부피당 단위 또는 다른 편리한 예뿐만 아니라 수준의 비율을 포함한다.
본 발명은 피험자에서 난소암을 탐지하기 위한 분석법을 추가로 고려하며, 분석법은 바이오마커가 리간드와 결합하는데 충분한 시간과 조건하에서 피험자의 샘플을 AGR-2, 미드카인 및/또는 CA125 중 둘 이상; CA125, IL-6, IL-8, CRP, SAA 및/또는 SAP 중 둘 이상; IL-6, IL-8, CRP, SAA 및/또는 SAP 중 둘 이상; 또는 CA125, IL-6, IL-8, SAA 및/또는 SAP 중 적어도 하나 및 미드카인 및/또는 AGR-2 중 적어도 하나에 대한 고정화 리간드들과 접촉시키고 바이오마커의 농도를 나타내는 결합의 수준을 탐지하는 단계를 포함하며 바이오마커들의 수준에서 변화는 난소암을 나타낸다.
다른 실시예에서, 본 발명은 피험자에서 난소암을 탐지하기 위한 분석법에 관한 것이고, 분석법은 바이오마커가 리간드와 결합하는데 충분한 시간과 조건하에서 피험자의 샘플을 AGR-2, 미드카인 및/또는 CA125 중 둘 이상; CA125, IL-6, IL-8, CRP, SAA 및/또는 SAP 중 둘 이상; IL-6, IL-8, CRP, SAA 및/또는 SAP 중 둘 이상; 또는 CA125, IL-6, IL-8, SAA 및/또는 SAP 중 적어도 하나 및 미드카인 및/또는 AGR-2 중 적어도 하나에 대한 고정화 리간드들과 접촉시키고 바이오마커의 농도를 나타내는 결합의 수준을 탐지하고 피험자가 난소암을 갖거나 갖지 않는다는 확률의 지수를 제공하기 위해 난소암을 가진 피험자에서 바이오마커들의 수준을 사용하여 생성된 알고리즘을 농도에 적용하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 피험자에서 난소암을 탐지하기 위한 분석법을 제공하며, 분석법은 AGR-2 또는 미드카인이 AGR-2 또는 미드카인의 농도의 표시를 제공하는 리간드에 결합하기 위한 시간과 조건하에서 피험자의 샘플과 AGR-2 또는 미드카인에 대한 고정화 리간드를 접촉시키는 단계를 포함하며 AGR-2 또는 미드카인의 변화된 농도는 난소암을 나타낸다. 이 태양은 CA125의 농도를 측정하는 단계와 결합될 수 있다.
"샘플"은 일반적으로, 혈액, 혈장 또는 혈청, 복수, 림프액, 조직 삼출물, 점액, 소변 또는 호흡기 액이다. 또한, 샘플은 조직학적으로 검사되는 조직 샘플이다.
난소암 환자들에 존재하는 마커들의 수준을 동정하고 어떤 마커들 및 마커들의 그룹이 난소암 환자들을 동정하는데 효과적이라는 것을 확인하는데 효과적인 통계학적 방법을 사용함으로써, 본 발명에 개시된 것을 기초로, 당업자는 뛰어난 선택성과 민감성을 제공하는 패널들을 동정할 수 있다. 분별 능력을 제공하는 패널들의 예는, 제한 없이, CA125, AGR-2; CA125, 미드카인; CA125, IL-6; CA125, IL-8; CA125, CRP; CA125, SAA; CA125, SAP; CA125; CA125, 미드카인; CA125, AGR-2; IL- 6, IL-8; IL-6, CRP; IL-6, SAA; IL-6, SAP; IL-6; IL-6, 미드카인; IL-6, AGR-2; IL-8, CRP; IL-8, SAA; IL-8 SAP; IL-8; IL-8, 미드카인; IL-8, AGR-2; CRP, SAA; CRP, SAP; CRP; CRP, 미드카인; CRP, AGR-2; SAA, SAP; SAA; SAA, 미드카인; SAA, AGR-2; SAP, 미드카인; SAP, AGR-2; 및 미드카인, AGR-2를 포함하는 바이오마커들을 포함한다. 패널은 상기한 바이오마커들 대한 리간드들을 포함할 수 있다.
패널은 AGR-2 단독 또는 하나 이상의 다른 마커와 조합한 AGR-2를 포함할 수 있다.
패널은 미드카인 단독 또는 하나 이상의 다른 마커와 조합한 AGR-2를 포함할 수 있다.
상기한 대로, "리간드" 또는 "결합제" 등의 용어는 바이오마커 상의 에피토프에 특이적으로 또는 실질적으로 특이적으로(즉 제한된 교차-반응성을 가짐) 결합할 수 있는 임의의 화합물, 조성물 또는 분자를 의미한다. "결합제"는 일반적으로 단일 특이성을 가진다. 그럼에도불구하고, 둘 이상의 마커에 대한 다중 특이성을 가진 결합제들이 본 발명에서 고려된다. 결합제들(또는 리간드들)은 통상적으로 단클론 항체들과 같은 항체 또는 이의 유도체 또는 유사체를 통상적으로 포함하나, 제한 없이 다음을 포함한다: Fv 단편; 단사슬 Fv(scFv) 단편; Fab' 단편; F(ab')2 단편; 인간화된 항체 및 항체 단편; 및 이들의 다가 버전. 다가 결합제들은, 적합한 경우 사용될 수 있고, 제한 없이 다음을 포함한다: 통상적으로 공유결합되거나 다른 안정화된(즉, 루신 지퍼 또는 나선 안정화된) scFv 단편인 이황화 안정화 Fv 단편, scFv 텐텀[(scFv)2 단편], 2가 항체, 3가 항체 또는 4가 항체와 같은 단일특이적 또는 이중특이적 항체들. "결합제"는 당업계에 개시된 대로, 앱타머를 포함한다.
항체 및 이들의 유도체 및 유사체 및 앱타머를 포함하는 항원-특이적 결합제들을 제조하는 방법은 당업계에 주지되어 있다. 다클론 항체는 동물의 면역화에 의해 생성될 수 있다. 단클론 항체는 표준(하이브리도마) 방법에 따라 제조될 수 있다. 인간화된 항체를 포함하는 항체 유도체 및 유사체는 단클론 항체를 암호화하는 DNA로부터 DNA 단편을 분리하고 적절한 V 영역을 표준 방법에 따라 적절한 발현 벡터 속에 서브클로닝하여 재조합적으로 제조될 수 있다. 파아지 디스플레이 및 앱타머 기술은 문헌에 개시되며 매우 친화성 낮은 교차-반응성을 가진 항원-특이적 결합제들의 인 비트로 클론 증폭을 허용한다. 파아지 디스플레이 시약과 시스템은 구입할 수 있고, 뉴저지, 피스카타어웨이의 아머샴 파머시아 바이오텍으로부터 구입할 수 있는 재조합 파이지 항체 시스템(RPAS) 및 플로리다, 마코 아일랜드의 MoBiTec, LLC로부터 구입할 수 있는 pSKAN 파이지미드 디스플레이 시스템을 포함한다. 앱타머 기술은 예를 들어 제한 없이 미국특허 제 5,270,163호; 제 5,475,096호; 제 5,840,867호 및 제 6,544,776호에서 개시된다.
ECLIA(electrochemiluminescence immunoassay), ELISA 및 루미넥스 LabMAP 면역분석법은 바이오마커들의 수준을 탐지하기 위한 적절한 분석법들의 예이다. 한 실시예에서, 제 1 결합제/항체는 표면과 제 1 항체와 결합하는 탐지가능한 그룹을 포함하는 제 2 결합제/항체에 결합된다. 탐지가능한 그룹들의 예는, 예로서 제한 없이, 형광색소, 효소, 제 2 결합제와 결합하기 위한 에피토프(예를 들어, 제 2 결합제/항체가 형광-표지된 안티-생쥐 항체에 의해 탐지되는 생쥐 항체일 때)예를 들어, 항원 또는 바이오틴과 같은 결합 쌍의 구성원을 포함한다. 표면은 전형적인 그리드-형 어레이(예를 들어, 제한 없이, 96-웰 플레이트 및 평면 마이크로어레이)에서와 같은 평면 표면 또는 비드의 각 "종들"은, 예를 들어, 형광색소로 표지화된 코팅된 비드 어레이 기술들(미국특허 제 6,599,331호, 제 6,592,822호 및 제 6,268,222호에 개시된 루미넥스 기술), 또는 퀀텀 도프 기술(미국특허 제 6,306,610호에 개시)에 의한 비-평면 표면의 경우와 평면 표면일 수 있다. 이런 분석법들은 실험실 정보 관리 시스템(LIMS)으로 생각될 수 있다.
비드-형 면역분석법에서, 루미넥스 LabMAP 시스템이 사용될 수 있다. LabMAP 시스템은 두 개의 스펙트럼이 구별된 형광색소로 내부로 염색된 폴리스티렌 미세구들을 포함한다. 이런 형광색소들의 정확한 비율을 사용하여, 특이적인 스펙트럼 어드레스(spectral addressess)를 가진 100개 다른 미세구 세트로 구성된 분석법이 만들어진다. 각 미세구 세트는 이의 표면상에 다른 반응물을 가질 수 있다. 미세구 세트들은 이들의 스펙트럼 어드레스에 의해 구별될 수 있기 때문에, 결합되어, 하나의 반응 용기에서 동시에 측정될 100개의 다른 분석물을 만들 수 있다. 리포터 분자에 결합된 제 3 형광색소는 미세구 표면에서 발생된 생체분자 상호작용을 정량화한다. 미세구들은 루미넥스 분석기에서 두 개의 개별 레이저를 통과함에 따라 빠르게 흐르는 유체 흐름에서 개별적으로 분석된다. 고속 디지털 신호 처리는 스펙트럼 어드레스를 기초로 미세구를 분리하며 샘플당 수초 후 표면상에서 반응을 정량화한다.
본 발명에서 사용한 대로, "면역분석법"은 통상적으로 면역 분석법을 의미하나, 전적으로 CA125, IL-6, IL-8, CRP, SAA, SAP, 미드카인 및/또는 AGR-2 중 하나인 원하는 바이오마커를 탐지하고 정량화할 수 있는 샌드위치 분석법을 의미하진 않는다.
마커 CA125, AGR-2, 미드카인, IL-6, IL-8, CRP, SAA 및/또는 SAP 중 둘, 셋 또는 넷 또는 다섯 또는 여섯 또는 일곱 또는 여덟 또는 아홉의 유체 또는 조직 수준을 측정하기 위해 분석법으로부터 생성된 데이터는 피험자에서 부인과 질환의 가능성 또는 진행을 특정하는데 사용될 수 있다. 둘 이상의 바이오마커의 수준을 포함하는 데이터의 입력은 대조군과 비교되거나 피험자가, 예를 들어, 난소암을 갖는 가능성의 위험 값을 제공하는 알고리즘 속에 입력된다. 치료 요법뿐만 아니라 재발 가능성도 관찰될 수 있다.
본 상세한 설명의 내용에서, "유체"는 본 발명에 개시된 방법들에 따라 분석될 수 있는 혈청 또는 혈장과 같은 임의의 혈액 단편을 포함한다. 특정 바이오마커의 혈액 수준을 측정함으로써, 임의의 적절한 혈액 단편이 혈액 수준을 측정하기 위해 검사될 수 있고 데이터는 그 단편에 존재하는 값으로 보고될 수 있다는 것을 의미한다. 본 발명에서 고려되는 다른 유체들은 복수, 조직 삼출물, 소변, 림프액, 점액 및 호흡기 액을 포함한다.
위에서 논의한 대로, 특이적인 동정된 바이오마커들의 수준을 측정하고 이 수준을 제 1 지식 베이스 데이터에 의해 생성된 알고리즘에서 제 2 지식 베이스 데이터로서 사용하거나 또는 알려진 질환을 가진 환자들에서 동일한 바이오마커들의 수준을 사용함으로써 부인과 질환을 진단하기 위한 방법이 제공된다. 또한, 피험자의 샘플에서 특이적인 동정된 바이오마커들의 존재 및/또는 속도를 측정하는 것을 포함하여 임상 전 난소암을 탐지하는 방법들이 제공된다. "속도"는 시간에 따라 환자의 샘플에서 바이오마커의 농도의 변화를 의미한다.
상기한 대로, 부인과 질환은 암 또는 이의 합병증을 포함한다. 본 발명에서 사용된 "암" 이란 용어는 일반적으로 "부인과 암"에 포함된 모든 암을 포함한다. 한 실시예에서, 부인과 암은 경관 이형성, 낫소 장액성 경계성 종양, 장액성 샘암종, 저등급 점액성 종양 및 자궁내막 종양을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특정 실시예에서, 부인과 암은 변종 뮬러관 상피 분화를 겪고 있는 난소암 종양이다. 본 발명에서 고려되는 다른 부인과 질환은 자궁내막증과 같은 염증성 질환을 포함한다.
본 발명에 사용된 "샘플"이란 용어는 생물학적 유체(혈액, 혈장, 혈청, 복수 포함), 조직 추출물, 새로 수확한 세포 및 세포 배양액에서 배양된 세포들의 용해물을 포함하나 이에 제한되지 않는, 탐지하기 원하는 암 세포들을 함유하는 임의의 샘플을 의미한다. 특정 실시예에서, 샘플은 부인과 조직, 혈액, 혈청, 혈장 또는 복수이다.
상기한 대로, "피험자"는 부인과 질환을 갖거나 갖지 않는 것으로 생각된 임의의 포유류, 일반적으로 인간일 수 있다. 피험자는 환자로 불릴 수 있고 부인과 질환 또는 이를 발생시킬 위험을 갖거나 갖지 않는 것으로 생각된 암컷 포유류이다. "질환"이란 용어는 이로부터 발생한 합병증을 포함한다.
"대조군 샘플"이란 용어는 알려진 질환 상태를 가진 피험자들로부터의 데이터의 제 1 지식 베이스를 규정하는데 사용될 수 있는 임의의 샘플을 포함한다.
본 발명의 방법은 난소암을 포함하는 부인과 질환과 같은 부인과 질환의 진단과 스테이징(staging)에서 사용될 수 있다. 본 발명은 질환의 진행을 관찰하고 특정 치료가 효과적이지 않은 지를 관찰하는데 사용될 수 있다. 특히, 본 방법은 수술, 화학요법 및/또는 방사선 치료 이후와 같은 질환의 증상들의 사라짐 또는 완화를 확인하는데 사용될 수 있다. 본 방법은 화학요법과 변종 조직 재발을 관찰하는데 추가로 사용될 수 있다.
한 실시예에서, 본 발명은 다음을 포함하여 환자에서 부인과 질환의 진행을 관찰하는 방법을 고려한다:
(a) 환자의 샘플을 제공하는 단계;
(b) AGR-2, 미드카인 및/또는 CA125 중 둘 이상; CA125, IL-6, IL-8, CRP, SAA, SAP, 미드카인 및/또는 AGR-2 바이오마커 중 둘 이상 또는 AGR-2 또는 미드카인 단독의 수준을 측정하고 부인과 질환을 가진 환자의 확률 지수를 제공하기 위해 알고리즘에 수준을 적용하는 단계; 및
(c) 시간이 지난 후 단계(a) 및 (b)를 반복하고 단계(b)의 결과를 단계(c)의 결과와 비교하는 단계, 확률 지수에서의 차이는 환자에서 질환의 진행을 나타낸다.
다른 실시예에서, 본 발명은 다음을 포함하여 환자에서 부인과 질환의 진행을 관찰하기 위한 방법을 고려한다:
(a) 환자의 샘플을 제공하는 단계;
(b) AGR-2, 미드카인 및/또는 CA125 중 둘 이상; CA125, IL-6, IL-8, CRP, SAA, SAP, 미드카인 및/또는 AGR-2 바이오마커 중 둘 이상 또는 AGR-2 또는 미드카인 단독의 수준을 측정하고 대조군과 수준을 비교하는 단계, 수준에서 변화는 부인과 질환을 가진 환자의 확률 지수를 제공한다;
(c) 시간이 지난 후 단계(a) 및 (b)를 반복하고 단계(b)의 결과를 단계(c)의 결과와 비교하는 단계를 포함하며 확률 지수에서의 차이는 환자에서 질환의 진행을 나타낸다.
특히, 시간이 지난 후 질환의 증가된 확률 지수는 질환이 진행되고 있고 치료(사용가능한 경우) 효과적이지 않다는 것을 나타낼 수 있다. 반대로, 시간이 지난 후 감소된 확률 지수는 질환이 퇴보하고 치료가(사용가능한 경우) 효과적이라는 것을 나타낼 수 있다.
다른 실시예에서, 다음을 포함하여 부인과 암이 환자에서 양성인지 아닌 지를 측정하기 위한 방법이 제공된다:
(a) 환자의 샘플을 제공하는 단계;
(b) AGR-2, 미드카인 및/또는 CA125 중 둘 이상; CA125, IL-6, IL-8, CRP, SAA, SAP, 미드카인 및/또는 AGR-2 바이오마커 중 둘 이상 또는 AGR-2 또는 미드카인 단독의 수준을 측정하고 부인과 암을 가진 환자의 확률 지수를 제공하기 위해 알고리즘에 수준을 적용하는 단계; 및
(c) 시간에 따라 확률 지수를 관찰하는 단계, 시간에 따라 감소된 지수는 암이 양성이라는 것을 나타낸다.
다른 실시예에서, 다음을 포함하여 부인과 암이 환자에서 양성인지 아닌 지를 측정하기 위한 방법이 제공된다:
(a) 환자의 샘플을 제공하는 단계;
(b) AGR-2, 미드카인 및/또는 CA125 중 둘 이상; CA125, IL-6, IL-8, CRP, SAA, SAP, 미드카인 및/또는 AGR-2 바이오마커 중 둘 이상 또는 AGR-2 또는 미드카인 단독의 수준을 측정하고 대조군과 수준을 비교하는 단계, 수준에서 변화는 부인과 암을 가진 환자의 확률 지수를 제공한다; 및
(c) 시간에 따라 확률 지수를 관찰하는 단계, 시간에 따라 감소된 지수는 암이 양성이라는 것을 나타낸다.
본 발명의 한 실시예에서, 다음을 포함하여 비 침투성과 침투성 부인과 암을 구별하기 위한 방법이 제공된다:
(a) 환자의 샘플을 제공하는 단계;
(b) AGR-2, 미드카인 및/또는 CA125 중 둘 이상; CA125, IL-6, IL-8, CRP, SAA, SAP, 미드카인 및/또는 AGR-2 바이오마커 중 둘 이상 또는 AGR-2 또는 미드카인 단독의 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 시간에 따라 확률 지수를 비교하고 부인과 질환을 가진 환자의 확률 지수를 제공하기 위해 알고리즘에 수준을 적용하는 단계, 증가된 지수는 암이 침투성이라는 것을 나타낸다.
본 발명의 다른 실시예에서, 다음을 포함하여 비 침투성과 침투성 부인과 암을 구별하기 위한 방법이 제공된다:
(a) 환자의 샘플을 제공하는 단계;
(b) AGR-2, 미드카인 및/또는 CA125 중 둘 이상; CA125, IL-6, IL-8, CRP, SAA, SAP, 미드카인 및/또는 AGR-2 바이오마커 중 둘 이상 또는 AGR-2 또는 미드카인 단독의 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 시간에 따라 확률 지수를 비교하고 수준을 대조군에 비교하는 단계, 수준에서 변화는 부인과 암을 가진 환자의 확률 지수를 제공한다.
다른 실시예에서, 본 발명은 다음을 포함하여 부인과 종양이 성장하는 환자에 대한 잠재 위험을 측정하는 방법을 고려한다:
(a) 환자의 샘플을 제공하는 단계;
(b) AGR-2, 미드카인 및/또는 CA125 중 둘 이상; CA125, IL-6, IL-8, CRP, SAA, SAP, 미드카인 및/또는 AGR-2 바이오마커 중 둘 이상 또는 AGR-2 또는 미드카인 단독의 수준을 측정하고 부인과 질환을 가진 환자의 확률 지수를 제공하기 위해 알고리즘에 수준을 적용하는 단계; 및
(c) 시간에 따라 확률 지수를 비교하는 단계, 감소된 지수는 부인과 종양이 성장하는 위험이 낮다는 것을 나타낸다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 다음을 포함하여 부인과 종양이 성장하는 환자에 대한 잠재 위험을 측정하는 방법을 고려한다:
(a) 환자의 샘플을 제공하는 단계;
(b) AGR-2, 미드카인 및/또는 CA125 중 둘 이상; CA125, IL-6, IL-8, CRP, SAA, SAP, 미드카인 및/또는 AGR-2 바이오마커 중 둘 이상 또는 AGR-2 또는 미드카인 단독의 수준을 측정하고 수준을 대조군과 비교하는 단계, 수준에서 변화는 부인과 암을 가진 환자의 확률 지수를 제공한다; 및
(c) 시간에 따라 확률 지수를 비교하는 단계, 감소된 지수는 부인과 종양이 성장하는 위험이 낮다는 것을 나타낸다.
AGR-2 또는 미드카인 단독의 농도를 측정하는 것에 관해서, AGR-2 또는 미드카인 중 하나 이상에서 변화된 농도(즉, 증가 또는 감소)는 질환의 존재의 확률 지수를 증가시킨다. 이런 태양은 CA125의 농도를 측정하는 것과 조합될 수 있다.
상기한 대로, 항체들은 바이오마커의 항원 결정부와 항체들 사이의 결합 상호작용에 의존하는 임의의 여러 면역분석법에 사용될 수 있다. 이런 분석법들의 예는 방사능면역분석법, 효소 면역분석법(예를 들어, ECLIA, ELISA), 면역형광, 면역침전, 라텍스 응집반응, 혈구응집반응 및 조직화학적 검사이다. 항체들은 암에서 역할을 측정하고 암을 진단하기 위해서 샘플에서 바이오마커의 수준을 탐지하고 정량하는데 사용될 수 있다.
특히, 본 발명의 항체들은 바이오마커를 탐지하고, 특정 세포 및 조직 및 특정 세포 이하 위치로 국소화하고, 발현의 수준을 정량화하기 위해, 세포 및 세포 이하 수준에서, 면역조직화학적 분석에 사용될 수 있다.
빛과 전자 현미경을 사용하여 항원들을 국소화하기 위한 당업계에 공지된 세포화학적 기술들은 바이오마커를 탐지하기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 항체는 탐지가능한 물질로 표지화될 수 있고 바이오마커 단백질은 탐지 가능한 물질의 존재를 기초로 조직들과 세포들에서 국소화될 수 있다. 탐지가능한 물질들의 예들은 방사능 동위원소(예를 들어, 3H, 14C, 35S, 125I, 131I), 형광 표지(예를 들어, FITC, 로다민, 란탄족 원소 인), 루미놀과 같은 발광 표지; 효소 표지(호오스래디쉬 퍼록사이드, 베타-갈락토시다아제, 루시페라제, 알칼리성 포스파타제, 아세틸클로린스테라제), (광학 또는 열량 측정법에 의해 탐지될 수 있는 형광 마커 또는 효소 활성을 함유하는 스트렙타비딘과 같은 마크된 아비딘에 의해 탐지될 수 있는) 바이오틴일기, 제 2 리포터에 의해 인식된 소정의 폴리펩타이드 에피토프(예를 들어, 루신 지퍼 상 서열, 보조 항체들의 결합 위치, 금속 결합 도메인; 에피토프 태그)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 실시예들에서, 표지들은 잠재적인 입체 장애를 줄이기 위해 여러 길이의 스페이서 암(spacer arms)을 통해 부착된다. 항체들은 페리틴 또는 콜로이드 금과 같은 전자 밀집 물질들에 결합될 수 있어서, 전자 현미경에 의해 쉽게 볼 수 있다.
항체 또는 샘플은 세포들, 항체들 등을 고정할 수 있는 담체 또는 고체 지지체 상에 고정될 수 있다. 예를 들어, 담체 또는 지지체는 나이트로셀룰로오스 또는 유리, 폴리아크릴아마이드, 가브로스 및 자철광일 수 있다. 지지 물질은 구형(예를 들어, 비드), 원통형(예를 들어, 검사 튜브 또는 벽의 내부 표면 또는 막대의 외부 표면) 또는 평면(예를 들어, 시트, 검시 스트립)을 포함하는 임의의 가능한 형상을 가질 수 있다. 간접 방법들이 사용될 수 있고 1차 항원-항체 반응은 바이오마커 단백질에 대해 반응성인 항체에 대한 특이성을 가진, 제 2 항체의 주입에 의해 증폭된다. 예를 들어, 바이오마커 단백질에 대해 특이성을 가진 항체가 토끼 IgG 항체인 경우, 제 2 항체는 상기한 대로 탐지가능한 물질로 표지화된 염소 안티-토끼 감마-글로불린일 수 있다.
방사성 표지가 탐지가능한 물질로 사용되는 경우, 바이오마커는 자가방사선술에 의해 국소화될 수 있다. 자가방사선술의 결과들은 다양한 광학 방법들 또는 알갱이를 셈으로써 자가방사선그래프에서 입자들의 밀도를 측정함으로써 정량화될 수 있다.
바이오마커 단백질들에 대한 표지화된 항체들은 수술을 받는 환자들에서 종양 조직의 위치를 확인하는데, 즉, 이미징에 사용될 수 있다. 통상적으로 인 비보 사용의 경우, 항체들은 방사성 표지(예를 들어, 요오드-123, 요오드-125, 요오드-131, 갈륨-67, 네크네튬-99 및 인듐-111)로 표지화된다. 표지화된 항체 제제들은 조직을 영상으로 나타내기 전 수시간 내지 4일에 적절한 담체에서 정맥으로 환자에게 투여될 수 있다. 이 기간 동안 결합되지 않은 단편들은 환자로부터 제거되고 단지 남아있는 항체들은 종양 조직과 결합된 것들이다. 동위원소의 존재는 적절한 감마 카메라를 사용하여 탐지된다. 표지화된 조직은 수술을 위한 종양의 위치를 정확히 나타내기 위해 환자의 몸에 있는 공지된 마커들과 연관이 있을 수 있다.
따라서, 다른 실시예에서 본 발명은 다음을 포함하여 환자에서 암을 탐지하기 위한 방법을 제공한다:
(a) 환자로부터 샘플을 제공하는 단계;
(b) 둘 이상의 바이오마커의 수준 또는 AGR-2 또는 미드카인 단독 또는 CA125와 조합된 AGR-2 또는 미드카인의 수준을 측정하기 위해 샘플을 AGR-2, 미드카인, CA125, IL-6, IL-8, CRP, SAA 및/또는 SAP 바이오마커에 결합하는 항체들과 접촉하는 단계 및 부인과 질환을 가진 환자의 확률 지수를 제공하기 위해 알고리즘에 수준을 적용하는 단계; 및
(c) 확률 지수를 기초로 암을 가진 환자의 위험을 진단하는 단계.
또한, 본 발명은 다음을 포함하여 환자에서 암을 탐지하기 위한 방법을 제공한다:
(a) 환자의 샘플을 제공하는 단계;
(b) 둘 이상의 바이오마커의 수준 또는 AGR-2 또는 미드카인 단독 또는 CA125와 조합된 AGR-2 또는 미드카인의 수준을 측정하기 위해 샘플을 AGR-2, 미드카인, CA125, IL-6, IL-8, CRP, SAA 및/또는 SAP 바이오마커에 결합하는 항체들과 접촉하는 단계 및 수준을 대조군과 비교하는 단계, 수준에서 변화는 부인과 질환을 가진 환자의 확률 지수를 제공할 수 있다.
(c) 확률 지수를 기초로 암을 가진 환자의 위험을 진단하는 단계.
본 발명의 방법들은 올리고뉴클레오티드 분석법, cDNA 분석법, 게놈 DNA 분석법 또는 조직 분석법과 같은 미세분석법을 사용하여 수행될 수 있다. 바람직하게는 분석법은 조직 미세분석법이다.
한 실시예에서, 본 발명의 방법은 바이오마커들을 암호화하는 핵산 분자들의 발현의 탐지하는 단계 및 발현의 수준을 기초로 바이오마커들의 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 당업자는 샘플들에서 바이오마커를 암호화하는 mRNA 서열들의 탐지에 사용하기 위한 뉴클레오티드 프로브를 제조할 수 있다. 적절한 프로브들은 바이오마커의 영역들로부터 적어도 5개 연속된 아미노산을 암호화하는 핵산 서열들을 기초로 한 핵산 분자들을 포함하며, 바람직하게는 프로브들은 15 내지 30개 뉴클레오티드를 포함하는 것이 바람직하다. 뉴클레오티드 프로브는 32P, 3H, 44C 등과 같이 적절한 신호를 제공하고 충분한 반감기를 가진 방사성 표지와 같은 탐지가능한 물질로 표지화될 수 있다. 사용될 수 있는 다른 탐지가능한 물질들은 특이적인 표지화된 항체, 형광 화합물, 효소, 표지화된 항원에 특이적인 항체들 및 발광 화합물에 의해 인식되는 항원들을 포함한다. 적절한 표지는 탐지될 뉴클레오티드에 대한 프로브의 혼성화와 결합의 속도 및 혼성화에 사용될 뉴클레오티드의 양에 대한 관계를 갖게 선택될 수 있다. 표지화된 프로브들은 Sambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual. (2nd ed.), 1989에 일반적으로 개시된 대로 나이트로셀룰로오스 또는 나일론 막과 같은 고체 지지체 상의 핵산들에 혼성화될 수 있다. 핵산 프로브들은 바이오마커를 암호화하는, 바람직하게는 인간 세포들에 있는 유전자들을 탐지하는데 사용될 수 있다. 뉴클레오티드 프로브들은 바이오마커를 포함하는 질환들의 진단에 효과적이고, 이런 질환들의 진행을 관찰하거나 치료를 관찰하는데 효과적일 수 있다. 한 실시예에서, 프로브들은 난소암과 같은 부인과 암의 진단 및 진행의 관찰에 사용된다.
프로브는 바이오마커 단백질들을 암호화하는 유전자들의 발현을 탐지하는 혼성화 기술들에 사용될 수 있다. 이 기술은 환자 또는 다른 세포 소스의 샘플로부터 얻은 핵산들(예를 들어, mRNA)을 핵산들에서 상보적 서열들에 대한 프로브들의 특이적 어닐링에 유리한 조건하에서 프로브와 접촉하고 배양하는 단계를 일반적으로 포함한다. 배양 후, 어닐링되지 않은 핵산들은 제거되고, 만약 있는 경우 프로브에 혼성화된 핵산들의 존재가 탐지된다.
mRNA의 탐지는 mRAN를 cDNA로 전환하는 단계 및/또는 중합효소 연쇄 반응(PCR)과 같은 증폭 방법을 사용하여 특이적 유전자 서열들의 증폭하고, 당업자에게 공지된 기술들을 사용하여 증폭된 분자들을 분석하는 단계를 포함할 수 있다. 적절한 프라이머들은 당업자에 의해 일상적으로 디자인될 수 있다.
본 발명에 개시된 혼성화 및 증폭 기술들은 바이오마커를 암호화하는 유전자들의 발현의 정량적 및 정성적 태양을 분석하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, RNA는 바이오마커를 암호화하는 유전자를 발현하는 것으로 공지된 세포 타입 또는 조직으로부터 분리될 수 있고, 본 발명에서 언급한 혼성화(예를 들어, 표준 노던 분석) 또는 PCR 기술들을 사용하여 검사될 수 있다. 이 기술들은 정상적인 또는 비정상적인 다른 접합 때문에 전사체 크기의 차이를 탐지하는데 사용될 수 있다. 기술들은 바이오마커 단백질 또는 유전자를 포함하는 암의 증상들을 나타내는 개인들에 대해 정상 개인들에서 탐지된 전장 및/또는 선택적으로 접합 전사체의 수준들 사이의 정량적 차이를 탐지하는데 사용될 수 있다.
프라이머들 및 프로브들은 상기한 제 위치 방법에 사용될 수 있는데, 즉, 생체 검사 또는 절제로부터 얻은 환자 조직의 조직 조각(고정 및/또는 동결)에 직접적으로 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 다음을 포함하여 환자에서 암을 탐지하는 방법을 제공한다:
(a) 환자의 샘플을 제공하는 단계;
(b) 샘플의 바이오마커 유전자 또는 일부로부터 mRNA를 포함하는 핵산 분자들을 추출하는 단계;
(c) 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 추출된 mRNA를 증폭하는 단계;
(d) 바이오마커를 암호화하는 mRNA의 수준을 측정하는 단계; 및
(e) 암을 가진 환자의 확률 지수를 제공하는 알고리즘에 둘 이상의 바이오마커들의 수준을 적용하는 단계.
바이오마커 mRNA는 AGR-2, 미드카인, CA125, IL-6, IL-8, CRP, SAA 및/또는 SAP 중 둘 이상을 암호화하는 mRNA로부터 선택된다.
본 발명에 개시된 방법들은 본 발명의 방법들 중 임의의 것을 수행하기 위해 필수적인 시약들을 포함하는 미리 포장된 진단 키트를 사용함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 키트는 본 발명에 개시된 적어도 하나의 특이적 핵산 또는 항체를 포함할 수 있고, 예를 들어, 임상 환경에서, 환자들을 스크린하고 진단하고 암이 성장하는 소인을 나타내는 개인들을 확인하기 위해 편리하게 사용될 수 있다. 키트는 중합효소 연쇄 반응에서 바이오마커를 암호화하는 핵산을 증폭하기 위한 핵산 프라이머들을 포함할 수 있다. 키트는 본 발명의 방법에서 효과적인 뉴클레오티드, 효소 및 버퍼뿐만 아니라 200bp 래더와 같은 전기이동 마커를 포함할 수 있다. 키트는 본 발명의 방법을 수행하기 위한 상세한 지시들을 포함한다.
본 발명은 환자들의 샘플을 스크리닝하기 위해 알고리즘-기반 스크리닝 분석법을 추가로 제공한다. 일반적으로, 입력 데이터는 둘 이상의 바이오마커의 수준(또는 둘 이상의 바이오마커를 암호화하는 유전자들의 발현 수준)을 기초로 수집되고 수준에서 임의의 증가 또는 감소의 통계적 의미를 분석하기 위한 알고리즘에 적용되고 이 정보가 출력 데이터이다. 입력 데이터를 분석하기 위한 컴퓨터 소프트웨어 및 하드웨어는 본 발명에 포함된다.
본 발명의 다른 태양은 난소암과 같은 부인과 질환을 가진 환자를 치료하는 방법을 고려하며, 질환을 가진 환자의 확률 지수를 측정하기 위해 진단 분석법을 환자에게 적용하는 단계, 바이오마커는 AGR-2, 미드카인 및/또는 CA125 중 둘 이상; CA125, IL-6, IL-8, CRP, SAA 및/또는 SAP 중 둘 이상; IL-6, IL-8, CRP, SAA 및/또는 SAP 중 둘 이상; 또는 CA125, IL-6, IL-8, SAA 및/또는 SAP 중 적어도 하나 및 미드카인 및/또는 AGR-2 중 적어도 하나로부터 선택된다; 및 질환을 가진 환자의 위험이 있는 경우, 환자에게 수술적 제거, 화학요법 및/또는 방사선치료를 적용하는 단계 및 시간에 따라 확률 지수를 관찰하는 단계를 포함한다.
제 2 탐지된 바이오마커들은 제 1 탐지된 바이오마커들과 동일하거나 다를 수 있다.
본 발명은 피험자에서 난소암을 탐지하기 위해 진단 분석법에서 사용하기 위한 확률 지수의 생성에서 CA125, IL-6, IL-8, CRP, SAA 및 SAP로부터 선택된 둘 이상의 바이오마커의 수준의 용도를 제공한다.
본 발명의 다른 태양은 피험자에서 난소암을 탐지하기 위해 진단 분석법에서 사용하기 위한 알고리즘의 생성에서 CA125, IL-6, IL-8, CRP, SAA 및 SAP로부터 선택된 둘 이상의 바이오마커의 수준의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 태양은 피험자에서 난소암 또는 다른 부인과 질환을 탐지하기 위해 분석법의 생성에서 AGR-2의 수준의 용도를 제공한다.
본 발명의 분석법은 현존하는 또는 새롭게 개발된 병리학적 아키텍처 또는 플랫폼 시스템 속에 통합될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 다음을 포함하여 사용자가 부인과 암 또는 이의 아형 또는 암의 단계에 대한 피험자의 상태를 측정하게 하는 방법을 고려한다:
(a) 통신 네트워크를 통해 사용자로부터 CA125 및 AGR-2, 미드카인, CRP, IL-6, IL-8, SAA 및 SAP 중 하나 이상의 수준 또는 농도의 형태로 데이터를 수신하는 단계;
(b) 질환 지수 값을 제공하는 알고리즘을 통해 피험자 데이터를 처리하는 단계;
(c) 소정의 값들과 비교한 질환 지수 값의 결과에 따라 피험자의 상태를 측정하는 단계; 및
(d) 통신 네트워크를 통해 사용자에게 피험자의 상태의 표시를 전달하는 단계.
편리하게는, 이 방법은 다음을 추가로 포함한다:
(a) 사용자가 원거리 엔드 스테이션을 사용하여 데이터를 측정하는 단계; 및
(b) 통신 네트워크를 통해 엔드 스테이션으로부터 베이스 스테이션으로 데이터를 전달하는 단계.
베이스 스테이션은 제 1 및 제 2 프로세싱 시스템을 포함할 수 있고, 이 경우 이 방법은 다음을 포함한다:
(a) 데이터를 제 1 프로세싱 시스템으로 전달하는 단계;
(b) 데이터를 제 2 프로세싱 시스템으로 전달하는 단계; 및
(c) 제 1 프로세싱 시스템이 질환 지수 값을 생성하는 알고리즘 기능을 수행하게 하는 단계.
이 방법은 다음을 포함한다:
(a) 알고리즘 기능의 결과들을 제 1 프로세싱 시스템에 전달하는 단계; 및
(b) 제 1 프로세싱 시스템이 피험자의 상태를 측정하게 하는 단계.
이 경우에, 이 방법은 다음 중 적어도 하나를 포함한다:
(a) 제 1 방화벽을 통해 통신 네트워크와 제 1 프로세싱 시스템 사이에 데이터를 전달하는 단계; 및
(b) 제 2 방화벽을 통해 제 1 및 제 2 프로세싱 시스템 사이에 데이터를 전달하는 단계.
제 2 프로세싱 시스템은 소정의 데이터 및/또는 알고리즘을 저장하는데 적합한 데이터베이스에 결합될 수 있고, 이 방법은 다음을 포함한다:
(a) 적어도 선택된 소정의 데이터를 얻기 위해 또는 데이터베이스로부터 알고리즘을 분석하기 위해 데이터베이스를 조회하는 단계; 및
(b) 선택된 소정의 데이터를 피험자 데이터와 비교하거나 예측된 확률 지수를 생성하는 단계.
제 2 프로세싱 시스템은 데이터베이스에 결합될 수 있고, 이 방법은 데이터베이스에 데이터를 저장하는 단계를 포함한다.
본 방법은 사용자가 바이오마커의 수준을 측정할 수 있는 시큐어 어레이(secure array)를 사용하여 데이터를 측정하게 하는 단계 및 개별 위치(들)에 각각 위치된 여러 피처가 각각의 코드 상에 위치시키는 단계를 포함할 수 있다. 이 경우에, 본 방법은 베이스 스테이션이
(a) 데이터로부터 코드를 측정하고;
(b) 어레이 상에 각각의 피처의 위치를 나타내는 레이아웃을 측정하고; 및
(c) 측정된 레이아웃과 데이터에 따라 변수 값들을 측정하게 하는 것을 포함한다.
이 방법은 베이스 스테이션이
(a) 사용자에 의한 지급의 제공을 나타내는 지급 정보를 측정하는 단계; 및
(b) 지급 정보의 측정에 반응하여 비교를 수행하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 부인과 암 또는 이의 아형 또는 암의 단계에 대한 피험자의 상태를 측정하기 위해 베이스 스테이션을 제공하며, 베이스 스테이션은:
(a) 저장 방법;
(b) 프로세싱 시스템, 프로세싱 시스템은
(i) 통신 네트워크를 통해 사용자로부터 피험자의 AGR-2, 미드카인, CA125, IL-6, IL-8, CRP, SAA 및 SAP로부터 선택된 둘 이상의 바이오마커의 수준 또는 농도를 포함하는 피험자 데이터를 수신하고;
(ii) 상기 데이터를 소정의 데이터와 비교하는 단계를 포함하는 알고리즘 기능을 수행하며;
(iii) 비교하는 단계를 포함하여 알고리즘 기능의 결과에 따라 피험자의 상태를 측정한다; 및
(c) 통신 네트워크를 통해 사용자에게 피험자의 상태를 표시하는 출력부를 포함한다.
프로세싱 시스템은 데이터를 측정하기 위한 원거리 엔드 스테이션으로부터 데이터를 수신할 수 있다.
프로세싱 시스템은 다음 시스템을 포함할 수 있다:
(a) 제 1 프로세싱 시스템, 이 시스템은
(i) 데이터를 수신하고
(ii) 데이터를 비교하는 단계를 포함하여 알고리즘 기능의 결과에 따라 피험자의 상태를 측정한다; 및
(b) 제 2 프로세싱 시스템, 이 시스템은
(i) 프로세싱 시스템으로부터 데이터를 수신하고
(ii) 비교를 포함하여 알고리즘 기능을 수행하고
(iii) 제 1 프로세싱 시스템에 결과들을 전달한다.
베이스 스테이션은 통상적으로 다음을 포함한다:
(a) 통신 네트워크에 제 1 프로세싱 시스템을 결합하기 위한 제 1 방화벽; 및
(b) 제 1 및 제 2 프로세싱 시스템을 결합하기 위한 제 2 방화벽.
프로세싱 시스템은 데이터베이스에 결합될 수 있고, 프로세싱 시스템은 데이터베이스에 데이터를 저장한다.
위에서 설명한 "알고리즘" 또는 "알고리즘 기능"은 다변량 분석 기능의 수행을 포함한다. 다른 아키텍처와 플랫폼이 상기한 것들 이외에 사용될 수 있다. 본 발명을 수행하는데 적합한 아키텍처의 임의의 형태가 사용될 수 있다고 이해될 것이다. 그러나, 한 유익한 기술은 분포된 아키텍처들의 사용이다. 특히, 여러 엔드 스테이션 (1)(도 3)은 개개의 지리적인 위치에 제공될 수 있다. 이것이 데이터 밴드 폭 비용과 필요조건을 감소시킬뿐만 아니라 한 베이스 스테이션이 혼잡하게 되거나 결함이 발생되는 경우, 다른 엔드 스테이션(1)이 인계받는 것을 확실히 함으로써 시스템의 효율을 증가시킬 수 있다. 이것이 부하 나눔(load sharing) 등을 허용하고, 항상 이용할 수 있는 시스템에 대한 접근을 보장한다.
이런 경우, 베이스 스테이션(2)은 다른 엔드 스테이션(1)이 사용될 수 있도록 동일한 정보와 서명을 포함하는 것을 확실히 할 필요가 있다.
한 실시예에서, 엔드 스테이션(1)은 인터넷과 같은 통신 네트워크(4)를 통해 베이스 스테이션으로 피험자 데이터를 전달할 수 있고 보고서를 받을 수 있는 PDAs, 모바일 폰 등과 같은 휴대용 장치일 수 있는 것을 알 것이다.
상기한 태양에서, "데이터"라는 용어는 바이오마커들의 수준 또는 농도를 의미한다. "통신 네트워크"는 인터넷을 포함한다. 서버가 사용될 때, 서버는 일반적으로 클라이언트 서버 또는 더욱 구체적으로 샘플 오브젝트 어플리케이션 프로토콜(SOAP)이다.
피험자에 의해 부인과 질환의 가능성을 요약하는 보고서가 만들어진다. 이런 보고서의 한 예는 도 6에 제공된다.
본 발명은 다음 비 제한적인 예들에 의해 추가로 개시된다. 이런 예들에 대한 재료들 및 방법들은 아래 제공된다.
IL-6 및 IL-8 분석법에 대한 다중 ELISA 분석법은 바이오라드(Biorad)로부터 얻을 수 있다. 혈청 아밀로이드 A, 혈청 아밀로이드 P 및 C-반응성 단백질을 측정하는 심혈관 패널 2 분석법(CVD2)은 린코플렉스로부터 얻을 수 있다. 또한, CA125 분석법은 로체 분석기 플랫폼에서 수행된 로체 분석 키트를 사용하여 모든 샘플에 대해 수행되었다. 로체 분석법은 전기화학발광 면역분석법 "ECLIA"이고, 바이오마커/두 개의 표지화된 항체 샌드위치가 미세입자들에 결합한다. 미세입자들은 전극의 표면상에 자기적으로 포획된다. 전압을 전극에 인가하면 광전자증배관에 의해 측정되는 화학발광 방출을 유도한다.
미드카인 및 AGR2는 통상적인 96웰 플레이트 포맷에서 표준 샌드위치 ELISA 기술들에 의해 측정되었다.
면역반응성(ir)-AGR-2의 면역조직화학적 위치결정은 친화성 정제 토끼 안티-AGR-2 항체(Liu et al, Cancer Res 65 (9):3796-3805, 2005)를 사용하여 수행되었다. 항체는 0.5% v/v Tween-20 및 w/v 탈지유 분말을 함유하는 트리스-버퍼 식염수에서 희석(1:500)하였고 실온에서 2시간 동안 재수화된 파라핀 조각들로 배양되었다. 조각들은 바이오틴-결합 안티-토끼 IgG로 배양하고 스트렙타비딘-HRP 시약으로 배양하였고 ir-AGR-2는 색원체로서 다이아미노벤지딘을 사용하여 가시화되었다. 조각들은 시각 검사 이전에 헤마톡실린으로 대조염색되었다.
난소암으로 진단된 여성들의 혈장 샘플들은 소스 I 내지 IV로 표시한 여러 병원 또는 클리닉으로부터 얻었다. 건강한 개인들로부터의 대조군 혈장 샘플들은 동일한 소스들로부터 얻었다. 받을 때 모든 샘플들은 가공할 때까지 -80℃로 동결하여 저장하였다. 자궁내막증으로 진단된 여성들의 다른 대조군 혈장 샘플들을 얻었다.
실시예 1
바이오마커들의 선택
다음 바이오마커들은 CA125: IL-6, IL-8, CRP, SAA 및 SAP를 갖거나 갖지 않은 패널에 삽입하기 위해 선택하였다. 다른 바이오마커들은 미드카인과 AGR-2를 포함하였다.
실시예 2
확률 지수의 측정
도 1은 진단 분석법에 사용된 알고리즘을 유도하는 모델링의 도표를 제공한다. 알려진 질환 상태의 환자들의 바이오마커들의 농도 형태의 트레이닝 데이터는 알고리즘을 생성하기 위해 다변량 분석에 적용된다. 사실은, 분석법은 통계적 및 기계적 학습 알고리즘의 사용을 기초로 한 진단 규칙이다. 이런 알고리즘은 알려지지 않은 상태를 가진 환자들의 상태를 예측하는데 사용되는 관계를 암시하는 트레이닝 데이터(알려진 질환 상태를 가진)에서 관찰된 바이오마커들과 질환 상태 사이의 상관관계를 사용한다. 데이터 분석의 당업자는 트레이닝 데이터에서 관계를 암시하는 여러 다른 형태가 본 발명을 크게 바꾸지 않고 사용될 수 있다는 것을 인식한다.
트레이닝 데이터에서 바이오마커들 중 둘 이상의 바이오마커 농도(즉, 수준)는 환자들에서 바이오마커 수준과 질환 상태 사이의 측정가능한 관계를 제공하는 알고리즘의 생성을 가능하게 한다. 바이오마커의 "수준" 이외에, 본 발명은 알고리즘으로 유도하는 다변량 분석을 위한 입력 데이터로서 둘 이상의 마커의 비율에 해당한다.
알려지지 않은 상태의 환자들의 바이오마커들의 농도 형태의 검사 데이터는 알고리즘 속에 삽입되고 확률 지수는 환자가 부인과 질환을 갖는지 아닌 지를 제공한다.
실시예 3
분석법의 개발
CA125 분석법은 로체 CA125 II 키트를 사용하여 수행하였고 로체 E170 모듈 분석기를 사용하여 수행하였다. 35U/ml의 컷오프 값을 사용하였다.
생성물 삽입 데이터를 기초로 CA125 분석법의 예측된 성능 수준은 표 1에 도시된다.
컷오프 값(U/ ml ) 민감성 특이성
65 79% 82%
150* 69% 93%
190 63% 95%
* 최적의 임상 값의 수준(로체 CA125 II 키트에 정의)
바이오마커 패널 분석법은 바이오레드 바이오플렉스 100 장치상에서, 다중 비드 분석법을 사용하여 수행하였다. 샘플들은 장액성(64%), 점액성(7%), 자궁내막성(10%) 및 뮬러(4%) 형태(mullerian type)를 포함하였다.
병리학을 기초로 암 샘플 은행은 단계 I 내지 IV 난소암들을 포함하였다.
통계적 분석은 통상적인 CA125 분석법과 바이오마커 분석법의 민감성과 특이성을 비교하기 위해 수행하였다.
이 분석법은 알고리즘 모델을 생성하기 위해 샘플들의 무작위로 선택된 세트를 사용하였다. 생성된 모델의 성능은 제 2 독립적 샘플 세트의 예측에 의해 입증하였다. 이것이 모델 및 입증 샘플 세트에 대한 민감성과 특이성을 제공한다. ROC 곡선 분석은 바이오마커와 CA125 결과 사이의 통계적 의미를 비교하기 위해 수행하였다.
모델 구조 및 입증 전략은 도 2에 도시된다. 결과들은 표 2에 도시된다.
모든 단계 CA125 바이오마커
진단 효율 90.70% 94.00%
AUC 0.960 0.982*
부트스트랩 한계 0.924-0.988 0.966-0.994
민감성 92.6% 91.2%
특이성 89.6% 95.7%
* 5% 수준에서 통계적으로 의미가 있음(꼬리 면적 확률 = 0.012)
단계 I 및 II 난소암들을 비교하였고 결과들을 표 3에 도시하였다.
단계 I 및 II CA125 바이오마커
진단 효율 89.50% 92.8%
AUC 0.933 0.984
민감성 89.20% 89.2%
특이성 89.60% 93.9%
모든 암들의 비교는 표 4에 도시된다.
모든 암 CA125 바이오마커
진단 효율 92.0% 95.3%
AUC 0.951 0.988
민감성 91.4% 92.1%
특이성 92.5% 97.6%
분석은 통상적인 CA125 분석법과 비교된 바이오마커 분석법의 성능의 더 높은 수준을 입증하였다. 이 증가된 성능 수준은 모든 난소암들 또는 단지 초기 단계(단계 I 및 II)로 분류된 것들을 고려할 때 나타난다.
실시예 4
진단 분석법
혈장을 포함하는 샘플들은 얼음 위에서 해동하고, 30초 동안 와류하고 14,000g에서 5분 동안 원심분리하였다. 혈장의 희석은 분석 버퍼에서 1:3 내지 1:40,000로 만들었다.
전체 149개 난소암 샘플에서, 212개 대조군 샘플(57개 자궁내막성 샘플을 포함한다)은 검사를 위해 제공하였다. 난소암들은 질환 진행의 단계에 따라, 통상적인 수단에 의해 분류하였다. 분석을 위해서 모든 단계 I 및 단계 II 샘플들은 초기 단계로 표시하고 단계 III 및 IV 샘플들은 후기 단계 질환으로 표시하였다.
전체 난소암 세트에 대한 단계 분석은 표 5에 도시된다.
단계 I 단계 II 단계 III 단계 IV
샘플들의 수 28 62 46 8
샘플 세트에 대한 이런 질환 형태진단은 표 6에 포함된다.
장액성 투명 세포 점액성 기타
샘플들의 수 97 12 11 8
ROC 곡선은 난소암을 탐지하는데 이들의 개별 진단 성능을 나타내는 개별 분석물질에 대해 만들어졌다. 결과들은 표 7에 도시된다.
분석물질 마커 곡선 아래 ROC 도표 면적
CA125 0.9600
CRP 0.8491
SAA 0.7887
IL-6 0.7089
SAP 0.5810
IL-8 0.6954
또한, CAP 및 SAP의 비율은 개별 마커들 단독의 비율에 비해 향상된 성능을 나타낼 수 있는 것으로 확인되었다. 이 비율은 질환 상태에 대한 CAR 대 SAP의 농도에 관한 것이고, SAP 농도가 난소암과 관련이 있을 수 있다는 것에 대한 증거가 없었다.
실시예 5
모델링
최초 분석은 모든 질환과 대조군 샘플들의 구별을 위해 마커들의 다양한 조합을 분석하는 weka 소프트웨어를 사용하였다. 이 분석은 데이터 세트를 두 개의 무작위로 선택한 세트로 분리하여 수행하였다. 한 세트는 모델을 만들기 위한 모델링 세트로 사용된 반면, 제 2 데이터 세트는 독립된 데이터를 가진 모델의 성능을 측정하기 위해 입증 그룹으로 사용되었다. 다른 분석은 입증 그룹 내에 단지 초기 단계 피험자들과 대조군들을 포함함으로써, 초기 단계(단계 I 및 II) 피험자들의 동정을 조사하였다. 모든 경우에, 마커 세트의 성능은 CA125 분석법의 성능에 대해 분석하였다.
"모든 단계 암" 및 "초기 단계 암"을 가진 마커 조합들의 분석은 아래 표 8에 요약된다. 마커들의 세 조합을 검사하였고, 입증 세트 및 결합된 모델과 입증에 대한 결과("모든 데이터"로 표시)는 CA125와 비교하기 위해 제공된다. 모든 세 모델의 경우, ROC 도표에 대한 곡선 아래 면적은 CA125의 면적보다 크며, 진단 유용성이 더 크다는 것을 나타낸다. ROC 곡선들의 분석은 한 데이터 세트 이외 모두에서, 증가된 진단 유용성은 통계적으로 현저했다는 것을 발견하였다.

 입증 세트 모든 데이터
(모델 + 입증 세트)
모든 단계 초기 단계
CA125 단독 0.960 0.933 0.950
CA125+CRP+SAA+IL-6+IL-8 0.984 0.978 0.972
통계적 의미 1% 수준에서 Yes 5% 수준에서 Yes 0.1% 수준에서 Yes
CA125+IL-6+IL-8+비율CRP:SAP+비율SAA+SAP 0.984 0.976 0.971
통계적 의미 5% 수준에서 Yes 5% 수준에서 Yes 1% 수준에서 Yes
CA125+비율 CRP:SAP+비율 SAA:SAP 0.977 0.946 0.966
통계적 의미 5% 수준에서 Yes 없음 5% 수준에서 Yes
위 표에서, "CRP:SAP"는 CRP가 SAP에 의해 나뉜다는 의미이고, "SAA:SAP"는 SAA가 SAP에 의해 나뉜다는 의미이다.
CA125의 진단 효율에 대한 개선은 난소암을 위한 통상적인 "골드 스탠다드" 진단법을 다른 마커들과 결합함으로써 성취되었다는 것을 증명하였다.
모든 단계 난소암을 진단하는데 CA125에 비해 개선된 성능을 가진 마커들의 세 조합뿐만 아니라, 이런 마커 조합 중 둘은 초기 단계 질환, 환자 생존에 중요한 인자를 탐지하는데 CA125보다 통계적으로 우수하다.
이런 분석에 포함된 한 마커는 사용될 수 있는 두 개의 급성기 염증 마커(CRP 및 SAA)와 비율이 조합된 SAP이다. 이전에, SAP 또는 다른 마커들과의 이의 비율은 난소암과 연결되지 않았다.
실시예 6
분석법의 병리학적 플랫폼으로의 통합
바이오마커들의 조합들의 수준 또는 농도는 예측된 사후 확률 값, 즉 여성으로부터 얻은 샘플이 난소암을 가진 가능성의 생성을 가능하게 한다. 바이오마커들의 수준 또는 농도는 결국은 난소암을 갖거나 갖지 않은 피험자로부터 얻은 그 샘플의 환자 샘플에 대한 확률 지수를 제공한다. 멀티마커 진단 분석법은 바이오마커들의 수준 또는 농도를 측정하기 위해 사용된 다양한 병리학적 플랫폼과 완전히 상보적이도록 설계된다. 이런 플랫폼은 실험실 정보 제어 시스템(LIMS)으로 불릴 수 있다. 바이오마커들의 수준 또는 농도 데이터는 다변량 분류 알고리즘을 통해 예측된 확률 지수를 생성하기 위해 중앙 처리 서버로 편리하게 전달된다. 보고서는 난소암의 가능성을 임상의사에게 알리도록 만들어진다. 도 6은 보고서의 예를 제공한다. 도 3a 및 3b 및 도 4 및 5는 LIMS 속에 분석법의 통합의 개략적 도표를 제공한다. 서버는 일반적으로 심플 오브젝트 어플리케이션 프로토콜(SOAP)과 같은 클라이언트 서버이다.
도 3a 및 3b에 대해서, 사용자는 바이오마커들의 수준 또는 농도에 대한 데이터를 얻는다. AGR-2, 미드카인, CA125, IL-6, IL-8, CRP, SAA 및 SAP 중 둘 이상이 선택된다. 엔드 스테이션(1)은 전송가능한 형태로 데이터를 생성한다. 데이터는 통신 네트워크(4)와 클라이언트 서버(예를 들어, SOAP)를 통해 베이스 스테이션(2)으로 전달된다.
프로세싱 시스템은 질환의 존재 또는 부존재의 가능성의 확률 지수 및 표시를 생성한다. 그런 후에 이 정보는 엔드 스테이션(1)에 전달된다. 그런 후에 보고서를 만든다(예를 들어, 도 6 참조). 계획은 도 4 및 5에 나타내어진다.
실시예 7
전경 기울기-2( AGR -2)
전경 기울기 2(AGR-2)는 이미 제노푸스 라에비스(Aberger et al, Mech Dev 72(1-2):115-130, 1998)에 개시된 시멘트-선 유전자 XAG-2의 인간 동족체이며 이 유전자는 세포 분화 및 성장에 관여하는 중요 인자로 보인다. 여러 인간 유방암 세포주들에서, AGR-2에 대한 mRNA 전사체들은 AGR-2는 호르몬 반응성 유방암들의 분화에 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 나타내는 에스트로겐 수용체(ER)와 공동발현되는 것으로 보인다(Thompson and Weigel, Biochem Biophys Res Commun 251(1):111-116,1998).
비록 AGR-2 유전자가 단백질 분비를 나타내는 신호 서열을 포함하고 XAG-2 동족체가 제노푸스 옥사이테스(상기, Aberger et al, 1998)에서 발현될 때 분비되는 것으로 보일지라도, AGR-2가 비인간 또는 인간 암 환자들에서 순환계 속으로 분비된다는 것을 나타내는 증거가 현재 없다.
인간 AGR-2에 대해 증가된 토끼 다클론 안티혈청을 사용하면(상기 Liu et al, 2005) 면역조직화학적 염색에 의해 면역반응성(ir)-AGR-2는 정상 인간 난소의 상피세포들에 완전히 없는 반면 난소 암종 환자들의 난소 상피는 변하는 강도의 뚜렷한 세포질성, 과립성 ir-AGR-2 염색을 나타낸다는 것이 증명되었다. 검사된 모든 정상 난소 조직에서(n=5), ir-AGR-2는 표면 상피에서 탐지되지 않았고, 우발적 세포 내막 봉입 낭종들은 ir-AGR-2에 대해 포지티브 염색을 나타내었다. 양성 낭종들(두 개의 점액성 및 세 개의 장액성)을 함유하는 일련의 다섯 개 난소 샘플들 검사하였고 특히 점액성 낭종들은 거의 모든 원주 상피의 강한 ir-AGR-2 염색을 나타내었다. 더 약한 ir-AGR-2 염색은 장액성 양성 낭종들의 분산된 분화 상피에서 관찰되었다. 경계 장액성 난소 종양(n=5)에서, 표면 상피의 대략 50%가 AGR-2에 대해 면역염색되었고 이 염색은 주로 종양들의 복합 샘 영역(complex glandular areas) 내에서 주로 보였다. 5개의 등급 1 자궁내막 종양 중 4개가 상피 세포들의 대부분에서 강한 ir-AGR-2 염색을 나타낸 반면에, 나머지 1개는 상피의 대략 10%에 한정된 ir-AGR-2 염색을 나타내었다. 비교적 나쁜 세포 분화 및 적은 샘 형성을 나타내는 등급 2 장액성 난소 암종의 세 번째 경우, ir-AGR-2는 주로 더욱 분화된 영역들 내에서 분산된 세포들에서 탐지되었다. 더욱 분화된 유두형의 두 개의 다른 등급 2 장액성 종양은 더 강한 ir-AGR-2 면역염색을 나타내며, 상피의 50% 이상이 포지티브 염색이다. 검사된 4개 등급 3 장액성 종양 중, 한 종양은 ir-AGR-2 염색을 나타내지 않은 반면, 나머지는 분산된 세포들, 주로 종양의 더욱 분화된 지역들 전체에서 뚜렷한 ir-AGR-2를 나타내었다. 다른 등급 3 투명 세포 암종은 상응하는 등급 3 장액성 종양들보다 훨씬 더 큰 비율로 존재하였던 강한 ir-AGR-2 염색을 나타내었다.
전체로, 다양한 형태와 등급의 상피-유도 난소 암종의 면역염색은 ir-AGR-2가 난소 암종 조직의 거의 100%에서 탐지될 수 있다는 것을 입증하나, 정상 인간 난소의 상피에는 존재하지 않는다. 또한, 점액성, 자궁내막 및 투명 세포뿐만 아니라 장액성 난소 상피 종양에서 탐지된 두드러진 ir-AGR-2 염색은 AGR-2가 상피 난소 종양들의 여러 형태를 정의할 수 있는 효과적인 바이오마커로 작용할 수 있다는 것을 나타낸다. 또한, 본 데이터는 비록 ir-AGR-2가 변하는 등급의 난소 종양들에서 보일 수 있으나, 면역염색은 더욱 크게 분화된 세포들을 나타내는 낮은 등급 종양들에서 더욱 널리 퍼지는 것으로 보인다는 것을 암시한다. 결과들은 도 7 내지 8에 도시된다.
연구들은 난소암 환자들의 하부세트의 혈장에서 순환하는 추정 ir-AGR-2 종들의 존재를 입증하였다(도 9). 개별 환자 혈장은 대조군, 장액성, 점액성 및 투명 세포 난소암 환자들(그룹당 3-6)로부터 얻었고 수집하였다. 수집 혈장 샘플들은 남아있는 혈장 단백질을 농축하고 AGR-2와 같은 풍부하지 않은 단백질들 탐지하는 확률을 향상시키기 위해 어질런트 멀티플 어피니티 리무벌 시스템(Agilent Multiple Affinity Removal System)을 사용하여 상부 6개 혈장 단백질의 친화성 결실이 일어나게 하였다. 각 풀로부터의 결실된 혈장 단백질들의 12㎍의 등가물은 토끼 안티-AGR-2를 사용하여 웨스턴 블럿하였고 리우 등, 2005에 개시된 화학발광 탐지에 의해 가시화되었다. 점액성 및 투명한 세포 난소암 환자들로부터 얻은 혈장은 AGR-2의 질량과 일치하는 대략 18kDa의 약한 면역반응성 종들을 나타내는 반면, 대조군 피험자와 장액성 난소암 환자들로부터 얻은 혈장은 탐지가능한 ir-AGR-2를 나타내지 않았다(도 9). 더 높은 식별가능한 분자 질량의 다른 면역반응성 종들은 차별적이고 종양 특이적 방식으로 발현될 것으로 보였다.
전체적으로, 이런 데이터는 ir-AGR-2가 난소 종양들에 의해 생성되고 순환계 속으로 분비된다는 것을 나타낸다. 조직 발현과 탐지가능한 ir-AGR-2의 수준에서 차이는 AGR-2가 차별적으로 발현되고 다른 난소 종양 형태에 의해 분비된다는 것을 나타낸다. 그럼에도불구하고, 임의의 변형, 즉, ir-AGR-2 농도의 증가 또는 감소는 부인과 질환을 나타낸다고 제안된다.
실시예 8
마커 CA125 , 혈청 아밀로이드-A, IL -8 및 미드카인 사용
혈장 샘플들을 단계 I, II 및 III 수준 질환을 가진 사람들로부터 얻었다. 수준 IV 질환을 가진 모든 환자들은 이들의 단계 데이터를 사용할 수 없기 때문에 생략하였다. 나이가 일치된 대조군들은 분석하였다.
모든 환자와 대조군은 바이오마커 패널 분석의 목적을 위해, 모델링 또는 입증 데이터 하부 세트로 무작위로 배정하였다.
모델 세트는 74개 질환과 96개 대조군을 포함하였다. 이들 중 7개 질환 샘플은 CA125 검사에 의해 음성이었고 35U/ml보다 낮은 값들을 가졌다. 대조군 중 4개는 CA125 검사에서 거짓 양성 결과(예를 들어, 값 >/=35U/ml)가 제공되었다.
weka 소프트웨어에서 logitboost 모델링을 사용하여, 모델을 만들었다. 이 모델에서, 1개 대조군 샘플은 거짓 양성 결과가 제공되었고, 3개 질환 샘플은 난소암에 대해 음성으로서 거짓으로 배정되었다(표 9).
진단
검사 		거짓
음성 		거짓
양성 		참
음성 		참
양성 		민감성 특이성 진단
효율
CA125 7 4 92 67 90.5% 95.8% 93.15%
CA125/SAA/IL8/MK 3 1 95 71 95.9% 99.0% 97.45%
추가 분석은 CA125 검사에 대한 ROC 곡선들과 바이오마커 패널 결과(양성 예측 값) 사이의 현저한 차이에 대해 검사함으로써 수행하였다. ROC 곡선들은 P = 0.004의 수준에서 현저하게 달랐고, CA125 결과 단독에 비해 바이오마커 패널의 뛰어난 성능을 나타낸다(도 10 및 표 10).
AUC SE 95% Cl
CA125 0.937 0.0206 0.890 내지 0.969
패널 0.996 0.00546 0.970 내지 0.999
R0C 곡선들의 쌍별 비교
CA125 ~ 패널
면적들 사이의 차이 0.0582
표준 에러 0.0204
95% 신뢰 기간 0.0182 내지 0.0982
z 통계 2.851
유의 수준 P=0.004
바이오마커 패널 제 2 샘플 하위 세트의 성능을 입증하기 위해서, 입증 세트를 모델 알고리즘에서 검사하였다. 마커 패널을 사용하여 각 샘플을 정확하게 분류하는 능력은 CA125 단독과 함께 민감성과 특이성 수단의 면에서 분석되었고 ROC 분석에 대해 분석되었다.
모델링을 위한 입증 샘플 하위 세트는 단계 I, II 및 III 질환 수준과 건강한 대조군을 포함하였다. 단계 IV 또는 비-단계 샘플은 포함되지 않았다. 전체 58개 질환과 113개 대조군 샘플들에서 모델 알고리즘을 통과하였다(표 11 및 12 및 도 11).
진단
검사 		거짓
음성 		거짓
양성 		참
음성 		참
양성 		민감성 특이성 진단
효율
CA125 4 12 101 54 93.1% 89.4% 91.25%
CA125/SAA/IL8/MK 3 6 107 55 94.8% 94.7% 94.75%
AUC SE 95% Cl
CA125 0.956 0.0193 0.914 내지 0.981
패널 0.975 0.0148 0.938 내지 0.992
R0C 곡선들의 쌍별 비교
CA125 ~ 패널
면적들 사이의 차이 0.0184
표준 에러 0.0222
95% 신뢰 기간 -0.0251 내지 0.0619
z 통계 0.829
유의 수준 P=0.407
마지막으로, 모든 샘플들에 대한 전체 결과는 CA125과 비교를 위해 모델과 입증 결과를 결합함으로써 모델을 통해 비교하였다.
따라서, 전체 질환 인구는 132명이고 전체 대조군 인구는 209명이다(표 13 및 14 및 도 12).
진단
검사 		거짓
음성 		거짓
양성 		참
음성 		참
양성 		민감성 특이성 진단
효율
CA125 11 16 193 121 91.7% 92.3% 92.0%
CA125/SAA/IL8/MK 6 7 202 126 95.5% 96.7% 96.1%
ROC 곡선들을 비교하였을 때, 난소암을 진단하는데 CA125 단독에 비해 상당히 개선되었다.
AUC SE 95% Cl
CA125 0.945 0.0143 0.916 내지 0.967
패널 0.985 0.00746 0.966 내지 0.995
R0C 곡선들의 쌍별 비교
CA125 ~ 패널
면적들 사이의 차이 0.040
표준 에러 0.015
95% 신뢰 기간 0.0107 내지 0.0694
z 통계 2.674
유의 수준 P=0.008
다른 알고리즘 모델링, 예를 들어, bayesNET, NBTree 또는 AdaBoostM1이 수행될 수 있다. 표 15 및 16 참조.
모델링 샘플의 경우
모델 민감성 특이성 진단 효율 곡선 아래 면적
CA125 90.5% 95.8% 93.15% 0.937
bayesNET 91.9% 99.0% 95.45% 0.982
NBTree 93.2% 99.0% 96.1% 0.961
AdaBoostM1 91.9% 99.0% 95.45% 0.991
입증 샘플의 경우
모델 민감성 특이성 진단 효율 곡선 아래 면적
CA125 93.1% 89.4% 91.25% 0.956
bayesNET 96.6% 91.2% 93.9% 0.975
NBTree 93.1% 95.6% 94.35% 0.963
AdaBoostM1 93.1% 95.6% 94.35% 0.970
상기한 예로서, CA125에 대한 ROC 곡선 비교는 AdaBoostM1 알고리즘 모델링의 경우 아래 도시된다(표 17 내지 19; 도 13 내지 15).
모델 세트 분석
AUC SE 95% Cl
CA125 0.937 0.0206 0.890 내지 0.969
패널 0.991 0.00769 0.963 내지 0.999
R0C 곡선들의 쌍별 비교
CA125 ~ 패널
면적들 사이의 차이 0.0539
표준 에러 0.020
95% 신뢰 기간 0.0146 내지 0.0932
z 통계 2.690
유의 수준 P=0.007
ROC 곡선들의 입증 세트 분석
AUC SE 95% Cl
CA125 0.956 0.0193 0.914 내지 0.981
패널 0.970 0.016 0.932 내지 0.990
R0C 곡선들의 쌍별 비교
CA125 ~ 패널
면적들 사이의 차이 0.0138
표준 에러 0.0213
95% 신뢰 기간 -0.028 내지 0.0556
z 통계 0.647
유의 수준 P=0.517
결합된 데이터 세트
AUC SE 95% Cl
CA125 0.945 0.0143 0.916 내지 0.967
패널 0.980 0.00865 0.959 내지 0.992
R0C 곡선들의 쌍별 비교
CA125 ~ 패널
면적들 사이의 차이 0.0349
표준 에러 0.0146
95% 신뢰 기간 0.00634 내지 0.0635
z 통계 2.394
유의 수준 P=0.017
실시예 9
AGR -2
단계 I 및 II의 14개 난소암 샘플들을 AGR-2의 탐지를 위해 개발된 ELISA에서, 16개 여성 대조군 혈장 샘플과 함께 분석하였다.
결과는 AGR-2 농도는 대조군 샘플과 비교해서 초기 단계 난소암 환자들의 혈장에서 상승한다는 것을 나타내었다(도 16).
또한, 질환 그룹이 단계, 즉, 단계 I 및 단계 II 질환에 따라 나뉠 때, 질환이 진행함에 따라 순환하는 혈장 AGR-2의 농도는 계속 상승한다는 표시가 있다(도 17).
상관관계 분석은 직접 상관관계, 즉 AGR-2과 CA125 사이에 선형 관계가 없었고, 0.27의 계산된 상관관계 계수를 갖는다는 것을 나타내었다.
AGR-2를 사용하여 진단을 향상시키는 능력은 weka 소프트웨어를 사용하는 logitbost 모델링에 의해 측정하였다. 모델은 두 개의 마커 CA125 및 AGR-2를 사용하여 만들었다.
분석을 위해 CA125 분석 만은 35 단위 임상적 컷-오프를 기초로 하였다(표 20).
진단
검사 		거짓
양성 		참
양성 		거짓
음성 		참
음성 		민감성 특이성 진단
효율
CA125 3 12 2 13 85.7% 81.25% 83.5%
CA125/AGR-2 패널 1 14 0 15 100% 93.75% 96.7%
CA125/AGR-2/MK 패널 0 14 0 16 100% 100% 100%
임상적 효능의 추가 분석은 AGR-2와 함께 CA125의 ROC 도표 분석 및 모델화된 CA125/AGR-2 조합에 의해 측정된 사후 확률 값에 의해 이루어졌다.
ROC 결과들은 모델화된 CA125/AGR-2는 난소암 진단 검사에서 표준으로 인식된 CA125의 임상적 진단 성능보다 뛰어난 성능을 제공한다는 것을 나타낸다(표 21; 도 19).
AUC SE 95% Cl
CA125 0.857 0.0714 0.677 내지 0.958
AGR-2 0.871 0.0679 0.695 내지 0.965
패널 0.990 0.0185 0.862 내지 1.000
R0C 곡선들의 쌍별 비교
CA125 ~ AGR-2
면적들 사이의 차이 0.0143
표준 에러 0.0931
95% 신뢰 기간 -0.168 내지 0.197
z 통계 0.154
유의 수준 P=0.878
CA125 ~ 패널
면적들 사이의 차이 0.133
표준 에러 0.0691
95% 신뢰 기간 -0.00204 내지 0.269
z 통계 1.931
유의 수준 P=0.054
AGR-2 ~ 패널
면적들 사이의 차이 0.119
표준 에러 0.0655
95% 신뢰 기간 -0.00942 내지 0.248
z 통계 1.816
유의 수준 P=0.069
다른 모델링은 CA125, AGR-2 및 미드카인 조합의 효능을 검사하기 위해 수행하였다. 이 경우 결과는 100% 민감성이었고 특이성은 거짓 양성 또는 거짓 음성 없이 얻었고 결과적으로 1.000의 ROC 값이었다.
61개 대조군과 46개 난소암 혈장 샘플들을 포함하는 샘플들의 제 2 세트를 분석하였다. 결과들은 AGR-2의 혈장 수준들은 초기 단계 난소암 환자들에서 증가하고 질환의 나중 단계 끝까지 증가한 상태로 존재한다는 것을 확인시킨다. 모든 난소암 샘플들뿐만 아니라 초기 단계 샘플들에서 AGR-2에서 변화는 대조군들과 상당히 다른 것을 나타내었다(크루스칼-왈리스 비-모수 ANOVA(Kruskal-Wallis non-parametric ANOVA) 이후 던의 다중 비교 검사(Dunn's Multiple Comparison Test)(도 20)).
질환 형태에 따른 혈장 AGR-2 분석(도 21)은 CA125는 일반적으로 장액성 형태를 진단하는데 더욱 효과적이고 OVCA 질환의 다른 형태에 대해서는 우수한 진단 효능이 없고, AGR-2는 다른 형태의 질환에서 최대 증가를 보인다는 것을 나타낸다.
실시예 10
CA125 와 미드카인
혈장 샘플들을 단계 I, II 및 III 수준 질환을 가진 사람들로부터 얻었다. 수준 IV 질환을 가진 모든 환자들은 이들의 단계 데이터를 사용할 수 없기 때문에 생략하였다. 나이가 일치된 대조군들은 분석하였다.
모든 환자와 대조군은 바이오마커 패널 분석의 목적을 위해, 모델링 또는 입증 데이터 하부 세트로 무작위로 배정하였다.
모델 세트는 74개 질환과 96개 대조군을 포함하였다. 이들 중 7개 질환 샘플은 CA125 검사에 의해 음성이었고 35U/ml보다 낮은 값들을 가졌다. 대조군 중 4개는 CA125 검사에서 거짓 양성 결과(예를 들어, 값 >/=35U/ml)가 제공되었다.
weka 소프트웨어에서 logitboost 모델링을 사용하여, 모델을 만들었다. 이 모델에서, 1개 대조군 샘플은 거짓 양성 결과가 제공되었고, 3개 질환 샘플은 난소암에 대해 음성으로서 거짓으로 배정되었다(표 22).
진단
검사 		거짓
음성 		거짓
양성 		참
음성 		참
양성 		민감성 특이성 진단
효율
CA125 7 4 92 67 90.5% 95.8% 93.15%
CA125/MK 5 1 95 69 93.2% 99.0% 96.1%
추가 분석은 CA125 검사에 대한 ROC 곡선들과 바이오마커 패널 결과(양성 예측 값) 사이의 현저한 차이에 대해 검사함으로써 수행하였다. ROC 곡선들은 P = 0.004의 수준에서 현저하게 달랐고, CA125 결과 단독에 비해 바이오마커 패널의 뛰어난 성능을 표시한다(도 21).
입증 세트로
바이오마커의 성능을 입증하기 위해서 제 2 샘플 하부 세트, 입증 세트를 모델 알고리즘에서 검사하였다. 마커 패널을 사용하여 각 샘플을 정확하게 분류하는 능력은 CA125와 함께 민감성 및 특이성 측정의 면에서 분석되었고 ROC 분석에 대해 분석하였다.
모델링을 위한 입증 샘플 하부 세트는 단계 I, II 및 III 질환 수준과 건강한 대조군을 포함하였다. 단계 IV 또는 비 단계 샘플들은 포함하지 않았다. 전체에서 58개 질환 및 113개 대조군 샘플을 모델 알고리즘으로 조사하였다(표 23).
진단
검사 		거짓
음성 		거짓
양성 		참
음성 		참
양성 		민감성 특이성 진단
효율
CA125 4 12 191 54 93.1% 89.4% 91.25%
CA125/MK 7 6 107 51 87.9% 94.7% 91.3%
결합된 모델 + 입증 세트
마지막으로, 전체 결과는 CA125와 비교한 모델과 입증 결과를 결합함으로써 모델을 통해 모든 샘플들에 대해 비교하였다(표 24).
따라서, 전체 질환 인구는 132명이고 전체 대조군 인구는 209명이다.
진단
검사 		거짓
음성 		거짓
양성 		참
음성 		참
양성 		민감성 특이성 진단
효율
CA125 11 16 193 121 91.7% 92.3% 92.0%
CA125/MK 12 7 202 120 90.9% 96.7% 93.8%
당업자는 본 발명은 구체적으로 개시된 것 이외의 변화와 변형을 잘 받아들일 수 있다는 것을 알 것이다. 본 발명은 모든 이런 변화와 변형을 포함하는 것으로 이해된다. 또한 본 발명은 본 명세서에서 언급하거나 나타낸 단계, 특징, 조성물 및 화합물을 모두 개별적으로 또는 전체적으로 포함하며 상기 단계 또는 특징의 임의의 둘 이상의 임의의 조합 및 전체 조합을 포함한다.
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Claims (45)

  1. 대상에서 난소암의 존재 또는 부재를 결정하기 위한 분석법으로서,
    상기 분석법은 생물학적 샘플에서 바이오마커의 패널의 수준을 결정하는 것을 포함하고, 여기서 상기 바이오마커의 패널은 암 항체 125(cancer antigen 125, CA125); C-반응성 단백질(C-reactive protein, CRP), 세럼 아밀로이드 A(serum amyloid A, SAA), 인터루킨-6(interleukin-6, IL-6) 및 인터루킨-8(interleukin-8, IL-8)을 포함하고, 상기 수준을 다변량 분석에 넣어 난소암의 존재 또는 부재의 가능성을 하나의 지수로 제공하는 알고리즘을 생성하는 것인 분석법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 바이오마커의 패널은 전경 기울기 단백질(anterior gradient protein-2, AGR-2)을 더욱 포함하는 것인 분석법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 바이오마커의 패널은 세럼 아밀로이드 P(serum amyloid P, SAP)를 더욱 포함하는 것인 분석법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 대상이 인간인 분석법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    난소암은 초기 단계 난소암인 분석법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 바이오마커의 패널의 수준은 통신 네트워크를 통하여 사용자로부터 수신되고, 이어서 다변량 분석을 통하여 처리되어 난소암의 부재 또는 존재의 가능성의 지수를 생성하고, 이는 통신 네트워크를 통하여 사용자에게 전달되는 것인 분석법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 분석법은 치료 개입 전, 치료 개입 동안 또는 치료 개입 후에 수행되는 것인 분석법.
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