KR20140024860A - 난소암에 대한 바이오마커 패널，진단 방법 및 시험 키트 - Google Patents

난소암에 대한 바이오마커 패널，진단 방법 및 시험 키트 Download PDF

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KR20140024860A
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그렉 피. 베르텐샤우
핑 에프. 이프
파르타 세샤이아
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Abstract

난소암의 존재, 아류형 및 단계를 예측할 뿐 아니라 암 치료의 치료적 효능을 평가하고 피검체가 잠재적으로 암을 발생시킬지를 결정하는 방법이 제공된다. 관련 시험 키트, 컴퓨터 및 분석 시스템뿐 아니라 소트프웨어 및 진단 모델이 또한 제공된다.

Description

난소암에 대한 바이오마커 패널，진단 방법 및 시험 키트{BIOMARKER PANELS, DIAGNOSTIC METHODS AND TEST KITS FOR OVARIAN CANCER}
관련 출원
본 출원은 그 전체 내용이 본원에 참조로서 포함되는 2011년 2월 24일 출원된 미국 가특허출원 61/463,870호의 이익을 주장한다.
정부 지원의 진술:
본 출원의 요지는 국립 암 연구소로부터의 "난소암에 대한 유망 MAP의 개선"이라는 명칭의 SBIR 어워드 HHSN261200800045C호에 의해 지원된 연구를 포함한다.
발명의 분야:
본 발명은 난소암, 특히 상피성 난소암을 예측하고 진단하는 방법을 제공하고, 관련 분석 시약, 진단 모델, 시험 키트 및 임상 레포트를 추가로 제공한다.
배경기술:
미국 암학회는 2007년 미국에서 난소암이 22,430명의 여성을 공격하여 15,280명의 여성의 생명을 앗아갈 것이라고 추정한다. 난소암은 단일 질환이 아니며, 실제로 30개가 넘는 유형 및 아류형의 난소 악성종양이 존재하고, 이들 각각은 그 고유의 병리학 및 임상적 거동을 지닌다. 따라서, 대부분의 전문가는 이들이 형성된 세포의 유형에 따라 3개의 주요 범주 내에서 난소암을 분류한다: 상피성 종양은 난소를 싸거나 덮고 있는 세포로부터 발생하고; 생식 세포 종양은 난소 내에 알을 형성하도록 예정된 세포로부터 비롯되며; 성삭 기질 세포 종양은 함께 난소를 유지하고 여성 호르몬을 생성하는 결합조직 세포에서 발생한다.
보통의 상피성 종양은 난소의 표면 상피에서 발생하며 미국에서의 모든 난소암의 약 90%의 원인이 된다 (그리고 하기 비율은 이러한 암의 미국 유병률을 반영한다). 이들은 양성 또는 악성 종양으로서 추가로 하위분류될 수 있는 다수의 아류형 -- 장액, 자궁내막유사, 점액, 및 투명 세포 종양을 포함함 -- 으로 추가로 분류된다. 장액 종양은 가장 광범위한 형태의 난소암이다. 이들은 보통의 상피성 종양의 40%의 원인이다. 이러한 장액 종양 중 약 50%는 악성이고, 33%는 양성이며, 17%는 경계성 악성이다. 장액 종양은 연령이 40세 내지 60세인 여성에서 가장 흔히 발생한다.
자궁내막유사 종양은 보통의 상피성 종양의 약 20%를 나타낸다. 개체들 중 약 20%에서, 이러한 암은 자궁내막암 (자궁 내층의 암)과 관련된다. 병증의 5%에서, 이들은 또한 골반강내 자궁내막 (자궁 내층 조직)의 비정상적인 발생인 자궁내막증과 관련된다. 이러한 종양의 대다수 (약 80%)는 악성이며, 나머지 (대략 20%)는 일반적으로 경계성 악성이다. 자궁내막유사 종양은 연령이 50세 내지 70세인 여성에서 주로 발생한다.
투명 세포 종양은 보통의 상피성 종양의 약 6%의 원인이다. 이러한 종양의 거의 전부가 악성이다. 모든 투명 세포 종양의 대략 절반은 자궁내막증과 관련된다. 투명 세포 종양을 갖는 대부분의 환자는 연령이 40세 내지 80세이다.
점액 종양은 모든 보통의 상피성 종양의 약 1%를 구성한다. 이러한 종양의 대부분 (약 80%)은 양성이며, 15%는 경계성 악성이고, 단지 5%만이 악성이다. 점액 종양은 30세 내지 50세의 여성에서 가장 빈번하게 나타난다.
난소암은 부인과 암 중 단연 가장 치명적이며, 모든 부인과 암 사망 중 55%가 넘는 사망의 원인이다. 그러나 난소암은 또한 초기에 발견된 경우 그 중 가장 치료가 가능하다. 난소암이 초기에 발견되어 적절하게 치료된 경우, 5년 생존률은 93%이다. 예를 들어, 문헌[Luce et al, "Early Diagnosis Key to Epithelial Ovarian Cancer Detection," The Nurse Practitioner, Dec 2003 at p.41]을 참조하라. 난소암에 대한 광범위한 배경 지식은 인터넷, 예를 들어 미국 암학회에서 제공하는 캔서 레퍼런스 인포메이션의 "Overview: Ovarian Cancer" 및 종양학 TM Ovarian Cancer V.1.2007에서의 NCCN 클리니컬 프랙티스 가이드라인으로부터 용이하게 입수할 수 있다.
난소암의 진단에 대한 현재의 실상을 보면 대부분의 병증 -- 모든 난소암 병증의 81% -- 이 가장 초기 단계에 발견되지 못하고 있다. 이는 초기 단계 난소암이 매우 진단하기 어렵기 때문이다. 이의 증상이 나타나지 않을 수 있거나 이 시점에 인지되지 않을 수 있다. 또는, 팽만감(bloating), 소화불량, 설사, 변비 등과 같은 증상이 애매할 수 있고 수많은 흔하고 덜 심각한 질환과 관련될 수 있다. 가장 중요하게는, 초기 검출을 위한 효과적인 시험이 존재하지 않았다. 난소암의 초기 및 정밀 검출을 위한 효과적인 툴은 충족되지 않은 결정적인 의학적 요구이다.
부인과 종양학의 분야에서 긴급하게 요구되는 것은 다수의 다양한 세트의 샘플에서 확인된 샘플 특징 및 바이오마커의 견고한 세트에 기반하여 난소암의 존재를 평가하고 예측하기 위한 최소 침습성의 (바람직하게는 혈청-기반) 임상 시험과 함께, 난소암의 다양한 단계에서 난소암을 높은 정확도로 예측, 진단 및 모니터하기 위한 방법 및 관련 컴퓨터 시스템 및 소프트웨어 툴이다.
발명의 개요:
본 발명은 일반적으로 암 바이오마커에 관한 것이고, 특히 난소암과 관련된 바이오마커에 관한 것이다. 본 발명은 특정 바이오마커를 측정함에 의해 암, 특히 난소암을 예측, 평가, 진단 및 모니터하는 방법을 제공하고, 난소암과 관련된 바이오마커의 발현 수준을 평가하기 위한 시약의 세트 또는 어레이를 추가로 제공한다. 바이오마커의 바람직한 세트는 피검체에서 난소암의 검출가능한 분자 사인을 제공한다. 본 발명은 난소암, 특히 상피성 난소암, 보다 특히 초기-단계 난소암 (I기, II기 또는 I기와 II기가 함께 있는)에 대한 예측 또는 진단 검사를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 일반적으로 피검체로부터 수득된 생물학적 유체의 샘플 중 CA-125 및 HE4의 수준을 측정하고 IL-2 수용체 알파 (IL-2Rα), 알파-1-항트립신 (AAT), C-반응성 단백질 (CRP), YKL-40, 세포 피브로넥틴 (cFib), 프로스타신, 메탈로프로테이나제 1의 조직 억제제 (TIMP-1), IL-8, IL-6, 혈관 내피 성장 인자 B (VEGF-B), 기질 메탈로프로테이나제-7 (MMP-7), 칼프로텍틴, 인슐린-유사 성장 인자-결합 단백질 2 (IGFBP-2), 렉틴-유사 산화 LDL 수용체 1 (LOX-1), 뉴로필린-1, TNFR2, 및 MPIF-1로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오마커의 수준을 측정하는 단계; 및 측정치를 난소암 상태와 관련시키는 단계를 포함하는, 피검체의 난소암 상태를 예측하는 방법을 특징으로 한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 CA-125 및 HE4 그리고 인터류킨-2 수용체 알파 (IL-2 수용체 알파), 알파-1-항트립신 (AAT), C-반응성 단백질 (CRP), YKL-40, 세포 피브로넥틴 (cFib), 암 항원 72-4 (CA-72-4), 프로스타신, 메탈로프로테이나제 1의 조직 억제제 (TIMP-1), IL-8, 기질 메탈로프로테이나제-7 (MMP-7), IL-6, 혈관 내피 성장 인자 B (VEGF-B), 칼프로텍틴, 인슐린-유사 성장 인자-결합 단백질 2 (IGFBP-2), 렉틴-유사 산화 LDL 수용체 1 (LOX-1), 뉴로필린-1, TNFR2, 및 MPIF-1로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오마커에 각각 선택적으로 결합하는 친화성 시약의 패널; 및 CA-125 및 HE4 그리고 인터류킨-2 수용체 알파 (IL-2 수용체 알파), 알파-1-항트립신 (AAT), C-반응성 단백질 (CRP), YKL-40, 세포 피브로넥틴 (cFib), 암 항원 72-4 (CA-72-4), 프로스타신, 메탈로프로테이나제 1의 조직 억제제 (TIMP-1), IL-8, 기질 메탈로프로테이나제-7 (MMP-7), IL-6, 혈관 내피 성장 인자 B (VEGF-B), 칼프로텍틴, 인슐린-유사 성장 인자-결합 단백질 2 (IGFBP-2), 렉틴-유사 산화 LDL 수용체 1 (LOX-1), 뉴로필린-1, TNFR2, 및 MPIF-1로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오마커를 각각 포함하는 컨테이너의 패널을 포함하는 키트를 특징으로 한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 CA-125 및 HE4 그리고 인터류킨-2 수용체 알파 (IL-2 수용체 알파), 알파-1-항트립신 (AAT), C-반응성 단백질 (CRP), YKL-40, 세포 피브로넥틴 (cFib), 암 항원 72-4 (CA-72-4), 프로스타신, 메탈로프로테이나제 1의 조직 억제제 (TIMP-1), IL-8, 기질 메탈로프로테이나제-7 (MMP-7), IL-6, 혈관 내피 성장 인자 B (VEGF-B), 칼프로텍틴, 인슐린-유사 성장 인자-결합 단백질 2 (IGFBP-2), 렉틴-유사 산화 LDL 수용체 1 (LOX-1), 뉴로필린-1, TNFR2, 및 MPIF-1로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오마커를 함유하는 정제된 펩티드의 패널을 특징으로 한다.
본원에 기술된 본 발명의 상기 임의의 양태 또는 어떠한 그 밖의 양태의 다양한 구체예에서, 방법은 암 항원 72-4 (CA-72-4)의 수준을 측정하는 것을 포함한다. 또 다른 구체예에서 난소암 상태는 난소암의 존재이다. 추가의 구체예에서 난소암은 I기 난소암이다. 또 다른 구체예에서 난소암은 II기 난소암이다. 그 밖의 구체예에서 난소암은 III기 난소암이다. 또한 또 다른 구체예에서 난소암은 IV기 난소암이다. 추가의 구체예에서 난소암은 I기, II기, III기, 또는 IV기 난소암이다. 다른 구체예에서, 방법은 상태에 기반하여 피검체 치료를 관리하는 것을 추가로 포함한다. 또 다른 구체예에서 피검체 치료를 관리한다는 것은 더 많은 시험을 지시하고, 수술을 수행하고, 추가 행위를 취하지 않는 것으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 또한 또 다른 구체예에서, 방법은 피검체 관리 후 피검체로부터의 생물학적 유체의 샘플 중 CA-125 및 HE4의 수준을 측정하고 인터류킨-2 수용체 알파 (IL-2 수용체 알파), 알파-1-항트립신 (AAT), C-반응성 단백질 (CRP), YKL-40, 세포 피브로넥틴 (cFib), 암 항원 72-4 (CA-72-4), 프로스타신, 메탈로프로테이나제 1의 조직 억제제 (TIMP-1), IL-8, 기질 메탈로프로테이나제-7 (MMP-7), IL-6, 혈관 내피 성장 인자 B (VEGF-B), 칼프로텍틴, 인슐린-유사 성장 인자-결합 단백질 2 (IGFBP-2), 렉틴-유사 산화 LDL 수용체 1 (LOX-1), 뉴로필린-1, TNFR2, 및 MPIF-1로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오마커의 수준을 측정하고; 측정치를 난소암 상태와 관련시키고; 피검체 관리가 남소암 상태에서 변화를 발생시켰는지를 결정하는 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 측정은 바이오마커의 존재 또는 부재를 검출하는 것, 바이오마커의 양을 정량하는 것, 및 바이오마커의 유형을 결정하는 것으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 바이오마커는 면역검정에 의해 측정된다. 추가의 구체예에서, 관련시키는 것은 소프트웨어 분류 알고리듬에 의해 수행된다. 또한 또 다른 구체예에서 샘플은 혈액, 혈청, 및 혈장으로부터 선택된다. 일부 구체예에서 친화성 시약은 항체이다. 또 다른 구체예에서 키트는 피검체로부터의 샘플 중 바이오마커의 수준을 결정하기 위해 친화성 시약을 이용하기 위한 서면 지시서를 추가로 포함한다. 또한 또 다른 구체예에서 키트는 피검체의 난소암 상태를 결정하기 위해 키트를 이용하기 위한 서면 지시서를 포함한다. 특정 구체예에서 펩티드 중 하나 이상은 검출가능한 표지를 지닌다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 피검체의 난소암 상태를 예측하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 피검체로부터의 생물학적 유체의 샘플 중 CA-125 및 HE4의 농도 및 피검체의 연령 (총괄적으로, "바이오마커")을 측정하는 단계; 및 바이오마커를 평가하는 단계를 포함하며, 난소암을 지니지 않은 환자의 대조군에 비해 바이오마커의 수준 또는 평가에서의 변화로부터 피검체가 난소암을 지님을 예측한다. 보다 바람직한 구체예에서, 상기 방법은 폐경후인지 또는 폐경후가 아닌지와 같은 피검체의 폐경 상태, 및 피검체로부터의 생물학적 유체의 샘플 중 CA15-3 및 CA72-4의 농도의 평가를 추가로 포함한다.
다양한 추가의 바이오마커는 또한 본 발명의 추가의 구체예에서 상기 바이오마커를 이용하여 평가된다. 이들은 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 인터류킨-2 수용체 알파 (IL-2 수용체 알파), 인슐린-유사 성장 인자-결합 단백질 2 (IGFBP-2), 합토글로빈, 페리틴 (FRTN), 프로스타신, 인터류킨-8 (IL- 8), 마스핀(Maspin), 오스테오폰틴, 혈청 아밀로이드 P-성분 (SAP), 혈소판-유래 성장 인자 BB (PDGF-BB) 및 B 세포-활성화 인자 (BAFF)를 포함한다. 임의로, 특정 추가의 바이오마커도 평가된다: 칼프로텍틴, 폰 빌레브란트 인자 (vWF), 알파-1-항트립신 (AAT), C-반응성 단백질 (CRP), 인터류킨-6 (IL-6), 렙틴, 트랜스티레틴 (TTR), 암배아 항원 (CEA), 인슐린-유사 성장 인자-결합 단백질 1 (IGFBP-1) 및 티록신-결합 글로불린 (TBG).
바람직한 구체예에서, 평가는 로지스틱 회귀분석, 대조 테이블(look-up table), 판단 트리, 서포트 벡터 머신(support vector machine), 군집 분석, 근린 분석, 유전자 알고리듬, 베이지안(Bayesian) 및 비베이지안 접근방식 등으로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법에 의해 이루어진다. 추가로, 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 뇌척수액, 복수, 소변 및 조직 생검을 포함하는 환자로부터 뽑아낸 유체 및 조직의 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법은 또한 난소암 예측의 서면 또는 전자 레포트를 제공하는 단계를 포함하고, 임의로 상기 레포트는 피검체에서 난소암의 존재 또는 부재 또는 난소암의 가능성에 관한 예측 또는 임의로 암의 단계에 의해, 피검체에 대한 난소암의 계층화 위험성에 관한 예측을 포함한다.
그 밖의 바람직한 구체예는 a) 민감성이 약 95% 이상일 때, 상기 방법에 대한 민감성 및 특이성의 합계가 약 150%를 초과하거나; b) 특이성이 95% 이상일 때, 상기 방법에 대한 민감성 및 특이성의 합계가 약 170%를 초과하고; c) 민감성과 특이성의 상기 합계가 적어도 약 50개의 암 샘플과 150개의 양성 샘플을 포함하는 샘플의 세트의 분석에 의해 지지되는 방법을 제공한다.
상기 방법을 달성하기 위해 시약의 세트, 시험 키트 및 다분석물 및 ELISA 패널 및 키트가 제공된다.
본 발명의 방법에 유용한 그 밖의 바이오마커는 전립선 산 포스파타제 (PAP), 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 카텝신 D, YKL-40, 기질 메탈로프로테이나제-7 (MMP-7), 혈관 내피 성장 인자 D (VEGF-D), 메탈로프로테이나제 1의 조직 억제제 (TIMP-1), 메소텔린 (MSLN), 소르틸린, 세포 피브로넥틴 (cFib), 오스테오프로테게린 (OPG), EN-RAGE, CD 40 항원 (CD40), 렉틴-유사 산화 LDL 수용체 1 (LOX-1), 뉴로필린-1, 페투인-A, 레시스틴, 기질 메탈로프로테이나제-2 (MMP-2), 퍼옥시레독신 4 (Prx-IV), 포스포세린 아미노트랜스퍼라제 (PSAT), 알파-1-마이크로글로불린 (A1Micro), 헤파린-결합 EGF-유사 성장 인자 (HB-EGF), 간세포 성장 인자 (HGF), 트레포일 인자 3 (TFF3), 보체 인자 H, 클러스테린 (CLU), 알도스 리덕타제, 대식세포 이동 억제 인자 (MIF), 엠피레귤린 (AR), 대식세포 염증 단백질-1 알파 (MIP-1 알파), FASLG 수용체 (FAS), 혈관 내피 성장 인자 수용체 1 (VEGFR-1), 기질 메탈로프로테이나제-1 (MMP-1), 단핵구 화학주성 단백질 2 (MCP-2) 및 혈관 내피 성장 인자 B (VEGF-B)를 포함하고, 이들은 하기 첨부된 청구항 1 내지 4의 방법에서 하나 이상의 추가의 마커로서 측정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 하기 바이오마커 중 임의의 3개 이상이 측정되고 평가된다: HE4, CA-125, IL-2 수용체 알파, AAT, CRP, YKL-40, 피브로넥틴 및 CA-72-4.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 임의로 HE4를 포함하는 하기 바이오마커의 수준이, 몇몇 경우에 연령의 측정과 함께, 측정되고 평가된다: CA-125, CA72-4, VEGF-B, 마스핀, VEGF-D 및 YKL-40; CA-125, CA72-4, VEGF-B, 마스핀, VEGF-D, YKL-40, OSP, 연령 및 CRP; CA-125, CA72-4, VEGF-B, 마스핀, 및 OSP; CA-125, CA72-4, VEGF-B, 마스핀, YKL-40 및 연령; CA-125, 마스핀 및 연령; CA-125, CA72-4, VEGF-B, 마스핀, OSP 및 연령; CA-125, VEGF-B 및 연령.
본 발명의 추가의 구체예에서, 임의로 HE4를 포함하는 하기 바이오마커의 수준이 측정되고 평가된다: HE4, 암 항원 125 (CA-125), 암 항원 72-4 (CA-72-4), 암 항원 15-3 (CA-15-3), 연령, 인슐린-유사 성장 인자-결합 단백질 2 (IGFBP-2), 인터류킨-2 수용체 알파 (IL-2 수용체 알파); HE4, 암 항원 125 (CA-125) 및 YKL-40, 임의로 또한 연령을 포함함; HE4, 암 항원 72-4(CA-72-4), 암 항원 15-3 (CA-15-3), 연령, 인슐린-유사 성장 인자-결합 단백질 2 (IGFBP-2), 및 인터류킨-2 수용체 알파 (IL-2 수용체 알파); CA-125, CA-72-4, 프로스타신, CA-15-3, 연령, IL-2 수용체 알파, IL-8, 임의로 또한 HE4를 포함함; 및 CA-125, CA-72-4, 프로스타신, CA-15-3, 연령, IL-2 수용체 알파, IL-8, FRTN. VEGF, 오스테오폰틴, 마스핀, 및 합토글로빈, 임의로 또한 연령을 포함함.
보다 특히, 예측 시험과 관련 방법 및 생성물은 또한 난소암 진행의 단계, 즉, I기, II기, III기 및 IV기 그리고 III기 또는 IV기로서 용이하게 분류될 수 없는 비교적 진행된 종양을 반영하는 후기 단계에 관한 유용한 임상적 정보를 제공한다. 전체적으로, 본 발명은 또한 체액, 바람직하게는 혈청 및 혈장에서 특정 그룹의 마커의 발현에 관한 상대 수준 및 피검체의 난소암 상태간의 새롭게 발견된 관련성에 관한 것이다.
일 구체예에서, 본 발명은 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 뇌척수액, 복수 또는 소변과 같은 환자로부터 뽑아낸 유체 샘플 중 바이오마커의 패널 또는 세트의 발현 수준을 측정하기 위한 시약의 세트를 제공한다. 추가의 구체예에서 시약은 이러한 바이오마커 패널의 발현 수준을 평가하기 위한 시약을 포함하는 다분석물 패널 검정이다.
본 발명의 구체예에서, 피검체의 샘플은 조직 생검과 같은 조직 샘플 또는 일차 세포 배양액 또는 배양 유체로부터 제조된다. 추가의 구체예에서, 바이오마커의 발현은 폴리펩티드 수준에서 측정된다. 관련 구체예는 이러한 목적을 위해 면역검정, 효소-결합된 면역흡수 검정 및 다중 면역검정을 활용한다.
바이오마커의 바람직한 패널은 분자 및 이들의 측정가능한 단편의 하기 세트로 구성되는 군으로부터 선택된다: (a) 미오글로빈, CRP (C 반응성 단백질), FGF 염기성 단백질 및 CA 19-9; (b) C형 간염 NS4, 리보솜 P 항체 및 CRP; (c) CA 19-9, TGF 알파, EN-RAGE, EGF 및 HSP 90 알파 항체, (d) EN-RAGE, EGF, CA 125, 피브리노겐, 아포지단백질 CIII, EGF, 콜레라 독소 및 CA 19-9; (e) 프로테이나제 3 (cANCA) 항체, 피브리노겐, CA 125, EGF, CD40, TSH, 렙틴, CA 19-9 및 림포택틴; (f) CA125, EGFR, CRP, IL-18, 아포지단백질 CIII, 테나신 C 및 아포지단백질 A1; (g) CA125, 베타-2 마이크로글로불린, CRP, 페리틴, TIMP-1, 크레아틴 키나제-MB 및 IL-8; (h) CA125, EGFR, IL-10, 합토글로빈, CRP, 인슐린, TIMP-1, 페리틴, 알파-2 매크로글로불린, 렙틴, IL-8, CTGF, EN-RAGE, 림포택틴, TNF-알파, IGF-1, TNF RII, 폰 빌레브란트 인자 및 MDC; (i) CA-125, CRP, EGF-R, CA-19-9, Apo-AI, Apo-CIII, IL-6, IL-18, MIP-1a, 테나신 C 및 미오글로빈; (j) CA-125, CRP, EGF-R, CA-19-9, Apo-AI, Apo-CIII, IL-6, MIP-1a, 테나신 C 및 미오글로빈; 및 (k) 표 II 및 표 III에 제시된 임의의 바이오마커 패널.
또 다른 구체예에서, 그러한 바이오마커를 측정하는 시약은 생화학적 경로의 상류 또는 하류에서 발견되는 그 밖의 분자 종을 측정할 수 있거나 그러한 바이오마커 및 분자 종의 단편을 측정할 수 있다. 일부 예에서, 동일한 시약이 바이오마커 및 이의 단편을 정밀하게 측정할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예는 바이오마커 및 관련 분자 및 단편을 측정하기 위한 결합 분자 (또는 결합 시약)에 관한 것이다. 고려되는 결합 분자는 모노클로날 및 폴리클로날 둘 모두의 항체, 앱타머 등을 포함한다.
그 밖의 구체예는, 임의로 피검체에서 난소암의 가능성을 예측하기 위해 바이오마커의 평가를 수행하기 위한 서면 지시서와 함께, 시험 키트의 형태로 제공되는 그러한 결합 시약을 포함한다.
이의 다른 구체예에서, 본 발명은 피검체로부터의 견본 또는 생물학적 샘플 중 상기 바이오마커의 수준을 검출하거나 측정하는 것에 기반하여 피검체에서 난소암의 가능성을 예측하는 방법을 제공한다. 본 명세서에 기재된 대로, 이러한 바이오마커의 발현 수준, 특히 난소암을 지니지 않은 환자의 대조군에 비해 이들의 상대 발현 수준에서의 변화로부터 그 피검체에서의 난소암을 예측한다.
이의 다른 양태에서, 예측되는 난소암의 유형은 장액, 자궁내막유사, 점액, 및 투명 세포 종양이다. 그리고 난소암의 예측은 I기 (IA, IB 또는 IC), II기, III기 및 IV기 종양과 같은 질병의 특수한 단계의 예측을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 의사를 위해 바이오마커의 상대 수준의 레포트를 작성하고 메일, 팩스, 이메일 또는 기타 수단에 의해 상기 레포트를 전송하는 것에 관한 것이다. 구체예에서, 바이오마커 평가의 레포트를 함유하는 데이터 스트림은 인터넷을 통해 전송된다. 추가의 구체예에서, 레포트는 피검체에서 난소암의 존재 또는 부재 또는 임의로 암의 아류형 또는 단계에 의해, 피검체에 대한 난소암의 계층화된 위험성에 관한 예측을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 바이오마커 발현 수준의 상기 평가는 진단을 목적으로 위장관 평가, 흉부 x-선, HE4 시험, CA-125 시험, 온혈구 계산, 초음파 또는 복부/골반 컴퓨터 단층촬영법, 혈액 화학 프로파일 및 간기능 시험과 같은 다른 진단 절차와 합쳐진다.
본 발명의 다른 구체예는 난소암의 증상을 보이거나 난소암에 걸릴 위험성이 높은 피검체로부터 뽑아낸 샘플의 평가에 관한 것이다. 다른 구체예는 난소암의 증상이 없는 피검체에 관한 것이다. 증상을 보이는 피검체는 하기 중 하나 이상을 지닌다: 골반 종괴; 복수; 복부 팽만; 일반적인 복부 불쾌감 및/또는 동통 (가스, 소화불량, 복압, 창종, 팽만감, 경련); 구역, 설사, 변비, 또는 빈뇨; 식욕 부진; 가벼운 식사 후에도 포만감; 알려진 아무런 이유 없이 체중 증가 또는 감소; 및 질로부터 이상 출혈. 바이오마커의 수준을 난소암을 진단하기 위한 그러한 증상의 발견과 조합시킬 수 있다.
본 발명의 구체예는 난소암의 존재를 측정하기에 매우 정확하다. "매우 정확하다"라는 것은 민감성 및 특이성이 각각 적어도 약 85% 또는 그 초과이고, 보다 바람직하게는 적어도 약 90% 또는 92%이고, 가장 바람직하게는 적어도 약 95% 또는 97% 정확한 것을 의미한다. 본 발명의 구체예는 민감성이 적어도 약 85%, 90% 또는 95%이고 특이성이 적어도 약 55%, 65%, 75%, 85% 또는 90% 또는 그 초과인 방법을 추가로 포함한다. 그 밖의 구체예는 특이성이 적어도 약 85%, 90% 또는 95%이고 민감성이 적어도 약 55%, 65%, 75%, 85% 또는 90% 또는 그 초과인 방법을 포함한다.
민감성 및 특이성에 관한 본 발명의 구체예는 난소암의 증상을 보이나 난소암을 지니지 않은 피검체의 대조군에 비해 난소암의 증상을 보이고 난소암을 지니는 피검체의 집단에 대해 측정된다. 또 다른 구체예에서, 민감성 및 특이성은 난소암의 위험성이 증가되었으나 난소암을 지니지 않은 피검체의 대조군에 비해 난소암의 위험성이 증가되었고 난소암을 지니는 집단에 대해 측정된다. 그리고 또 다른 구체예에서, 민감성 및 특이성은 난소암의 증상을 보이지 않고 난소암을 지니지 않은 피검체의 대조군에 비해 난소암의 증상을 보이고 난소암을 지니는 피검체의 집단에 대해 측정된다.
다른 양태에서, 바이오마커의 수준은 지식 발견 엔진(knowledge discovery engine)(KDE™), 회귀 분석, 판별 분석, 분류 트리 분석, 랜덤 포리스트, ProteomeQuest®, 서포트 벡터 머신, One R, kNN 및 휴리스틱 나이브 베이즈 분석(heuristic naive Bayes analysis), 신경망 및 이들의 변형과 같은 통계적 방법을 적용시켜 평가된다.
또 다른 구체예에서, 바이오마커의 발현 수준에 기반한 예측 또는 진단 모델이 제공된다. 모델은 소프트웨어 코드의 형태, 컴퓨터 판독가능한 포맷 또는 바이오마커의 상대 발현을 평가하기 위한 서면 지시서의 형태일 수 있다.
환자의 주치의는 정해진 환자가 난소암을 지닐 위험성의 비교적 더욱 완벽한 평가를 나타내기 위해, 바이오마커 평가의 레포트를 보다 폭넓은 진단 상황에 활용할 수 있다. 이러한 평가를 작성함에 있어서, 주치의는 의심스러운 골반 종괴 및/또는 복수, 복부 팽만 및 다른 명백한 악성의 근원이 없는 그 밖의 증상과 같은 증상들을 포함하는, 환자의 임상적 표시를 고려할 것이다. 증상을 보이는 환자에 대한 일반적인 실험실 정밀검사는 임상적으로 지시되는 경우 GI 평가, 흉부 x-선, CA-125 시험, CBC, 임상적으로 지시되는 경우 초음파 또는 복부/골반 CT, LFT를 이용한 화학 프로파일을 포함하고 BRCA-1 및 BRCA-2와 같은 유전자 마커 시험과 함께 가족력 평가를 포함할 수 있다 (일반적으로 문헌[NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology™ for Ovarian Cancer, V.I.2007.]을 참조하라).
본 발명은 환자가 난소암을 지닐 위험성을 계층화하고 다음에 취할 진단 단계를 계획함에 있어서 주치의에게 도움이 되는 새롭고도 중요한 추가 정보원을 제공한다. 본 발명은 또한 무증상 고위험성 피검체에서 난소암의 위험성을 평가할 뿐 아니라 일반 대중에 대해 스크리닝 툴로서 비슷하게 유용하다. 본 발명의 방법은 그 밖의 예측 및 진단 지표에 대한 전반적인 평가의 일부로서 임상의에 의해 이용될 수 있는 것으로 고려된다.
본 발명은 또한 현존하는 화학요법제와 후보 화학요법제 및 다른 유형의 암 치료제의 치료적 효능을 평가하는 방법을 제공한다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 바이오마커 패널의 상대 발현 수준 -또는 바이오마커 프로파일-은 치료 전과 치료 후에 다시 피검체로부터 취해진 견본에서 또는 임의로, 치료 중 진행 단계에서 상기 기재된 대로 측정된다. 발현 수준의 비-암 프로파일 (또는 비-암에 더욱 근접한 발현 프로파일) 또는 상대 바이오마커 발현 수준의 안정한 불변 프로파일에 비해 이러한 바이오마커의 상대 발현에서의 변화는 치료적 효능으로서 해석된다. 당업자는 그러한 발현 수준의 프로파일이 암 또는 전암, 또는 전-악성 질환의 진단에 도움이 될 수 있거나 바이오마커의 상대 비율이 이전보다 암-관련 프로파일에 더욱 유사해진 그러한 진단 프로파일을 단순히 지향할 수 있음을 용이하게 이해할 것이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 피검체가 잠재적으로 암을 발생시키고 있는지를 측정하기 위한 방법을 제공한다. 바이오마커의 발현의 상대 수준은 시간 경과에 따라 피검체로부터 취해진 견본에서 측정되며, 암 프로파일을 향한 바이오마커 발현 프로파일의 변화는 암을 발생시키는 쪽으로의 진행으로서 해석된다.
견본의 바이오마커의 발현 수준은 일단 피검체의 분석이 완료되면 전자적으로 저장되고 추후 그러한 비교 목적으로 리콜될 수 있다.
본 발명은 방법, 소프트웨어 제품, 컴퓨터 시스템 및 네트워크, 및 난소암에 대한 고도로 정밀한 시험을 제공하는 관련 기계를 추가로 제공한다.
명세서에 기재된 마커의 조합물은 난소암의 진행의 다양한 단계에서 난소암의 존재를 예측하거나 난소암을 검출하는 민감하고, 특이적이며 정밀한 방법을 제공한다. 기재된 바와 같은 샘플의 평가는 또한 환자에서 전-악성종양 또는 전-임상 질환의 존재와 관련될 수 있다. 따라서, 기재된 방법은 샘플에서 난소암의 존재, 피검체로부터 뽑아낸 샘플 중 난소암의 부재, 난소암의 단계, 난소암의 등급, 난소암의 양성 또는 악성 특징, 난소암의 전이 가능성, 난소암과 관련된 신생물의 조직학적 유형, 암의 무통성 또는 공격성, 및 환자에서 난소암의 예방, 진단, 특성화 및 치료와 관련된 난소암의 다른 특징들을 예측하고 검출하는데 유용한 것으로 고려된다.
기재된 방법은 또한 난소암을 억제하기 위한 하나 이상의 시험 작용제의 효능을 평가하고, 난소암에 대한 치료의 효능을 평가하고, 난소암의 진행을 모니터하고, 난소암을 억제하기 위한 작용제 또는 치료를 선택하고, 난소암에 걸린 환자의 치료를 모니터하고, 환자에서 난소암의 억제를 모니터하고, 노출 이후 시험 동물의 바이오마커를 평가함에 의해 시험 화합물의 발암 가능성을 평가하는데 유용한 것으로 추가로 고려된다.
도 1은 연구 피검체의 인구학을 도시하는 표이다.
도 2는 연구에서 검정되는 바이오마커를 도시하는 표이다.
도 3은 상위 20개 마커의 수신자 조작 특성 (ROC) 곡선 분석으로부터의 곡선하 면적 (AUC) 값을 도시하는 표이다.
도 4는 곡선하 면적 (AUC) 값이 통계적으로 0.5보다 큰 것으로 확인된 유익한 바이오마커를 열거하는 표이다.
도 5는 곡선하 면적 값이 0.800보다 큰 9개의 가장 유익한 바이오마커에 대한 수신자 조작 특성 곡선을 도시하는 그래프의 세트이다.
도 6은 곡선하 면적 값이 0.800보다 큰 9개의 가장 유익한 바이오마커에 대한 부인과학 및 산과학 (FIGO)의 국제 연맹에 의해 알려진 난소암 단계의 혈청 수준 분포를 도시하는 그래프의 세트이다.
도 7은 곡선하 면적 값이 0.800보다 큰 9개의 가장 유익한 바이오마커에 대한 난소암 단계의 아류형에 의해 알려진 혈청 수준 분포를 도시하는 그래프의 세트이다.
도 8은 곡선하 면적 값이 0.600보다 큰 바이오마커에 대한 상관 행렬이다.
도 9는 클러스터 A 내지 D에서 마커의 실체를 열거하는 표이다.
도 10은 클러스터 A에서 마커의 상관 데이터를 도시하는 표이다.
도 11은 클러스터 B에서 마커의 상관 데이터를 도시하는 표이다.
도 12는 클러스터 C에서 마커의 상관 데이터를 도시하는 표이다.
도 13은 클러스터 D에서 마커의 상관 데이터를 도시하는 표이다.
도 14는 9개의 가장 유익한 마커 및 OVA1 바이오마커를 이용한 로지스틱 회귀분석 모델의 랜드마크 역치 특이성 값에서의 민감성을 도시하는 표이다.
도 15는 9개의 가장 유익한 마커 및 OVA1 바이오마커를 이용한 로지스틱 회귀분석 모델의 랜드마크 역치 민감성 값에서의 특이성을 도시하는 표이다.
도 16은 폐경 상태에 의해 발생된 상위 20개 마커의 수신자 조작 특성 (ROC) 곡선 분석으로부터의 곡선하 면적 (AUC) 값을 도시하는 표이다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 보통 이해되는 의미를 지닌다. 하기 참고문헌은 본 발명에 이용된 다수의 용어의 일반적인 정의를 당업자에게 제공한다: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); and Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). 본원에서 사용된 바와 같이, 하기 용어는 달리 명시되지 않는 한 이에 부여된 의미를 지닌다.
"바이오마커 패널"은 본원에 개시된 바이오마커 패널 중 하나를 언급한다. 바람직한 바이오마커 패널은 CA-125 및 HE4 그리고 인터류킨-2 수용체 알파 (IL-2 수용체 알파), 알파-1-항트립신 (AAT), C-반응성 단백질 (CRP), YKL-40, 세포 피브로넥틴 (cFib), 암 항원 72-4 (CA-72-4), 프로스타신, 메탈로프로테이나제 1의 조직 억제제 (TIMP-1), IL-8, 기질 메탈로프로테이나제-7 (MMP-7), IL-6, 혈관 내피 성장 인자 B (VEGF-B), 칼프로텍틴, 인슐린-유사 성장 인자-결합 단백질 2 (IGFBP-2), 렉틴-유사 산화 LDL 수용체 1 (LOX-1), 뉴로필린-1, TNFR2, 및 MPIF-1으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오마커를 포함한다.
"용리액" 또는 "세척 용액"은 친화성 시약에 대한 분석물의 흡착에 영향을 주거나 변형시키고/거나 시약으로부터 결합되지 않은 재료를 제거하기 위해 이용되는 작용제, 통상적으로 용액을 언급한다. 용리액의 용리 특성은, 예를 들어 pH, 이온 강도, 소수성, 카오트로피즘(chaotropism)의 정도, 세제 강도 및 온도에 의존적일 수 있다.
"분석물"은 검출이 요망되는 샘플의 어떠한 성분을 언급한다. 상기 용어는 샘플 중 단일 성분 또는 복수의 성분을 언급할 수 있다.
"분자 결합 파트너" 및 "특이적 결합 파트너"는 분자의 쌍, 통상적으로 특이적 결합을 나타내는 바이오분자의 쌍을 언급한다. 분자 결합 파트너는 비제한적으로 수용체와 리간드, 항체와 항원, 바이오틴과 아비딘, 및 바이오틴과 스트렙타비딘을 포함한다.
"모니터링"은 계속 변화하는 파라메터에서의 변화를 기록하는 것을 언급한다.
본 발명의 문맥에서 "마커"는 대조군 피검체 (예컨대, 음성 진단 또는 검출불가능한 암을 지니는 사람, 정상 또는 건강한 피검체)에서 취해진 필적할 만한 샘플에 비해 인간 암을 지니는 환자로부터 취해진 샘플에 차별적으로 존재하는 (특정 겉보기 분자량의) 폴리펩티드를 언급한다. 용어 "바이오마커"는 용어 "마커"와 상호교환적으로 이용된다.
"측정"이라는 용어는 샘플 중 마커(들)의 존재 또는 부재를 검출하는 것, 샘플 중 마커(들)의 양을 정량하는 것, 및/또는 바이오마커의 유형을 확인하는 것을 포함하는 방법을 의미한다. 측정은 당 분야에 공지된 방법 및 본원에 추가로 기재된 방법에 의해 수행될 수 있고, 비제한적으로 SELDI 및 면역검정을 포함한다. 본원에 개시된 마커 중 하나 이상을 검출하고 측정하기 위해 어떠한 적합한 방법을 이용할 수 있다. 이러한 방법으로는, 비제한적으로, 질량 분광분석법 (예컨대, 레이저 탈착/이온화 질량 분광분석법), 형광 (예컨대, 샌드위치 면역검정), 표면 플라즈몬 공명, 타원계측법 및 원자력 현미경이 있다.
"차별적으로 존재한다"라는 표현은 대조군 피검체에 비해 인간 암을 지니는 환자로부터 취해진 샘플에 존재하는 마커의 양 및/또는 빈도에서의 차이를 언급한다. 게다가, 마커는 대조군 피검체의 샘플에 비해 인간 암 환자의 샘플에서 더욱 자주 또는 덜 빈번하게 검출되는 폴리펩티드일 수 있다. 마커는 양, 빈도 또는 둘 모두의 관점에서 차별적으로 존재할 수 있다.
하나의 샘플 중 폴리펩티드의 양이 다른 샘플 중 폴리펩티드의 양과 통계적으로 유의하게 다른 경우 폴리펩티드는 두 샘플 간에 차별적으로 존재하는 것이다. 예를 들어, 폴리펩티드가 다른 샘플에 존재할 때보다 적어도 약 120%, 적어도 약 130%, 적어도 약 150%, 적어도 약 180%, 적어도 약 200%, 적어도 약 300%, 적어도 약 500%, 적어도 약 700%, 적어도 약 900%, 또는 적어도 약 1000% 더 많이 존재하거나, 이것이 한 샘플에서는 검출될 수 있고 다른 샘플에서는 검출될 수 없을 때, 폴리펩티드는 두 샘플 간에 차별적으로 존재한다.
대안적으로 또는 추가로, 난소암 환자의 샘플에서 폴리펩티드가 검출되는 빈도가 대조군 샘플에서보다 통계적으로 유의하게 높거나 낮을 때 폴리펩티드는 두 세트의 샘플 간에 차별적으로 존재하는 것이다. 예를 들어, 폴리펩티드가 다른 세트의 샘플보다 한 세트의 샘플에서 적어도 약 120%, 적어도 약 130%, 적어도 약 150%, 적어도 약 180%, 적어도 약 200%, 적어도 약 300%, 적어도 약 500%, 적어도 약 700%, 적어도 약 900%, 또는 적어도 약 1000%만큼 더 자주 또는 덜 빈번하게 검출되는 경우 폴리펩티드는 두 세트의 샘플 간에 차별적으로 존재한다.
"진단"은 병리적 상태, 즉 난소암의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 진단 방법은 이들의 민감성 및 특이성에 있어서 상이하다. 진단 검정의 "민감성"은 양성으로 검사된 질병에 걸린 개체의 백분율이다 ("진정한 양성"의 퍼센트). 검정에서 검출되지 않은 질병에 걸린 개체는 "위음성(false negative)"이다. 질병에 걸리지 않았고 검정에서 음성으로 검사된 피검체는 "진정한 음성"으로 명명된다. 진단 검정의 "특이성"은 1 빼기 위양성률이고, 이 때 "위양성"률은 양성으로 검사된 질병이 없는 피검체의 비율로서 정의된다. 특정 진단 방법은 질병의 확고한 진단을 제공할 수는 없으나, 상기 방법이 진단에 도움이 되는 긍정적인 표시를 제공하는 것으로 충분한다.
마커의 "시험량"은 시험되는 샘플에 존재하는 마커의 양을 언급한다. 시험량은 절대량 (예컨대, ㎍/ml) 또는 상대량 (예컨대, 신호의 상대 세기)일 수 있다.
마커의 "진단량"은 난소암의 진단과 일치하는 피검체의 샘플 중 마커의 양을 언급한다. 진단량은 절대량 (예컨대, ㎍/ml) 또는 상대량 (예컨대, 신호의 상대 세기)일 수 있다.
마커의 "대조량"은 마커의 시험량과 비교되어야 하는, 어떠한 양 또는 양의 범위일 수 있다. 예를 들어, 마커의 대조량은 난소암이 없는 사람에서의 마커의 양일 수 있다. 대조량은 절대량 (예컨대, ㎍/ml) 또는 상대량 (예컨대, 신호의 상대 세기)일 수 있다.
"항체"는 에피토프 (예컨대, 항원)에 특이적으로 결합하고 이를 인지하는, 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자들에 의해 실질적으로 엔코딩되는 폴리펩티드 리간드 또는 이의 단편을 언급한다. 인지되는 면역글로불린 유전자는 카파 및 람다 경쇄 불변 영역 유전자, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 중쇄 불변 영역 유전자, 및 무수한 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 항체는, 예컨대 무손상 면역글로불린으로서 또는 다양한 펩티다제로의 분해에 의해 생성된 다수의 잘 특성화된 단편으로서 존재한다. 단편은, 예컨대 Fab' 및 F(ab)'2 단편을 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "항체"는 또한 전체 항체의 변형에 의해 생성되거나 재조합 DNA 방법을 이용하여 새로이 합성된 항체 단편을 포함한다. 이것은 또한 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 단일 쇄 항체를 포함한다. 항체의 "Fc"부분은 하나 이상의 중쇄 불변 영역 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함하지만 중쇄 가변 영역은 포함하지 않는 면역글로불린 중쇄의 부분을 언급한다.
본원에서 사용된 용어 "샘플"은 환자와 특히 관련될 수 있는 재료를 의미하고 이로부터 환자에 관한 특수한 정보가 측정, 산출 또는 추리될 수 있다. 샘플은 전체적으로 또는 부분적으로 환자로부터의 생물학적 재료로 구성될 수 있다. 샘플은 또한 환자에 대한 정보를 제공하는 샘플에 대해 시험이 수행되는 것을 허용하는 방식으로 환자와 접촉한 재료일 수 있다. 샘플은 또한 환자의 것이 아닌 다른 재료와 접촉하지만 환자에 대한 정보를 측정하기 위해 이후 첫 번째 재료가 시험되는 것을 허용하는 재료일 수 있다. 샘플은 환자 이외의 생물학적 재료의 공급원과 접촉할 수 있지만, 그것은 그럼에도 불구하고 당업자가 샘플로부터 환자에 대한 정보를 측정할 수 있는 경우이다. 또한 샘플이 아닌 외부 재료 또는 정보가 환자를 샘플에 확정적으로 연결시키기 위해 활용될 수 있었다고 이해된다. 비제한적인 예로서, 이중 맹검 시험은 샘플을 환자에 맞추기 위해 차트 또는 데이터베이스를 요구한다.
본원에서 사용된 용어 "체액"은 점조도에 있어서 실질적으로 유체이지만 이와 관련된 고체 또는 미립자 물질을 지닐 수 있는 환자로부터 수득된 재료를 의미한다. 체액은 또한 환자로부터 비롯되지 않은 재료 및 부분을 함유할 수 있다. 예를 들어, 체액은 물로 희석될 수 있거나, EDTA와 같은 보존제를 함유할 수 있다. 체액의 비제한적인 예는 혈액, 혈청, 세로살 유체, 혈장, 림프, 소변, 뇌척수액, 타액, 분비 조직 및 기관의 점막 분비물, 질 분비물, 모유, 눈물, 및 비고형 종양과 관련된 것들과 같은 복수액을 포함한다. 추가의 예는 늑막, 심막, 복막, 복부 및 그 밖의 체강의 유체 등을 포함한다. 생물학적 유체는 피검체 또는 생물학적 공급원과 접촉하는 액체 용액, 예를 들어 세포 또는 기관 조건화된 배지를 포함하는 세포 및 기관 배양 배지, 세척액 등을 추가로 포함할 수 있다.
"피검체 치료를 관리"하는 것은 난소암 상태의 측정 이후에 임상의 또는 주치의의 행위를 언급한다. 예를 들어, 본 발명의 방법의 결과가 결론에 이르지 못했거나 상태의 확정이 필요한 이유가 있을 때, 주치의는 더 많은 시험을 지시할 수 있다. 대안적으로, 상태가 수술이 적절하다고 지시하는 경우, 주치의는 환자의 수술을 예정할 수 있다. 유사하게, 상태가 음성, 예컨대 후기 난소암이거나 상태가 심각인 경우, 더 이상 행동을 취하지 않을 수 있다. 더욱이, 결과가 치료가 성공적이었음을 나타낼 때, 추가 관리가 불필요할 수 있다.
용어 "기" 또는 "암 단계"는 피검체에서 암의 크기, 침습성, 진행, 이동 등에 기반한 난소암의 분류를 의미하고자 한다. 난소암의 단계는 잘 정의되어 있다. I기는 암이 여전히 난소 (또는 난소들) 내에 함유되어 있는 난소암을 언급한다. 특히, IA기 암은 하나의 난소에서 발생하였고, 종양은 난소의 내부로 제한된다. 난소의 외부 표면에는 암이 존재하지 않는다. 복부 및 골반으로부터의 세척액의 실험실 조사는 어떠한 암 세포도 발견하지 못했다. IB기 암은 둘 모두의 난소의 외부 표면에 어떠한 종양 없이 두 개 모두의 난소 내에 발생하였다. 복부 및 골반으로부터의 세척액의 실험실 조사는 어떠한 암 세포도 발견하지 못했다. IC기 암은 하나 또는 둘 모두의 난소에 존재하며 하기 중 하나 이상이 존재한다: 난소 중 하나 이상의 외부 표면 상에 암; 낭성 종양의 경우 (유체로 채워진 종양), 캡슐 (종양의 외벽)이 파열되었음 (터짐); 또는 실험실 조사는 복부로부터의 유체 또는 세척액에서 암 세포를 발견하였음.
II기 암은 하나 또는 둘 모두의 난소에 존재하고 골반내 다른 기관 (예컨대, 자궁, 자궁관, 방광, S상 결장, 또는 직장)이 관련되었다. 특히, IIA기 암은 자궁 또는 자궁관, 또는 둘 모두에 퍼져 있거나 실제로 침범하였다. 복부로부터의 세척액의 실험실 조사는 어떠한 암 세포도 발견하지 못했다. IIB기 암은 방광, S상 결장, 또는 직장과 같은 다른 골반에 가까운 기관에 퍼져 있다. 복부로부터의 유체의 실험실 조사는 어떠한 암 세포도 발견하지 못했다. IIC기 암은 IIA기 또는 IIB기에서처럼 골반 기관에 퍼져 있고 복부로부터의 세척액의 실험실 조사는 암 세포의 증거를 발견하였다.
III기 암은 하나 또는 둘 모두의 난소와 관련되며 하기 중 하나 또는 둘 모두가 존재한다: (1) 암이 골반을 지나 복부의 내층까지 퍼져 있음; (2) 암이 림프절까지 퍼져 있음. 수술을 진행하는 동안, 외과의가 난소 또는 난소들을 감싼 암을 볼 수 있으나 복부에서 암이 육안으로(grossly) (현미경을 이용하지 않고 볼 수 있음) 보이지 않고 암이 림프절까지 퍼지지 않은 경우, 암은 IIIA기이다. 그러나, 현미경 하에서 생검을 조사했을 때, 암의 작은 침전물이 상복부의 내층에서 발견된다. IIIB기 암은 하나 또는 둘 모두의 난소에 존재하고, 외과의가 보기에 충분히 크지만 폭이 2 cm (약 3/4인치)보다 작은 암의 침전물이 복부에 존재한다. 암은 림프절까지 퍼지지 않았다. IIIC기의 암의 경우, 암은 하나 또는 둘 모두의 난소에 존재하고 하기 중 하나 또는 둘 모두가 존재한다: 암이 림프절까지 퍼져 있고/거나 폭이 2 cm (약 3/4인치)보다 큰 암의 침전물이 복부에서 관찰된다.
IV기 암은 난소암의 가장 진행된 단계이다. 암은 하나 또는 둘 모두의 난소에 존재한다. 원격 전이 (간, 폐, 또는 복강의 외부에 있는 다른 기관의 내부까지 암이 퍼짐)가 발생하였다. 늑막액 (폐를 둘러싼 공동으로부터)에서 난소암 세포의 발견도 IV기 질병의 증거이다.
본원에서 사용된 용어 "재발 난소암"은 질병이 치료 완료 후에 재기 (재발)되었음을 의미한다.
바이오마커
"CA-125"는 NCBI 수탁 번호 NP_078966.2 또는 AAL65133과 85% 이상의 서열 동일성을 지니는 폴리펩티드 바이오마커 또는 이의 단편을 의미한다. CA-125의 예시적인 서열은 다음과 같다:
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"HE4"는 NCBI 수탁 번호 AA052683 또는 CAA44869와 85% 이상의 서열 동일성을 지니는 폴리펩티드 바이오마커 또는 이의 단편을 의미한다. HE4의 예시적인 서열은 다음과 같다:
Figure pct00014
"IL-2 수용체 알파 (IL-2Rα)"는 NCBI 수탁 번호 CAK26553 또는 NP_000408과 85% 이상의 서열 동일성을 지니는 폴리펩티드 바이오마커 또는 이의 단편을 의미한다. IL-2Rα의 예시적인 서열은 다음과 같다:
Figure pct00015
"알파-1-항트립신 (AAT)"은 NCBI 수탁 번호 AAB59495 또는 CAJ15161과 85% 이상의 서열 동일성을 지니는 폴리펩티드 바이오마커 또는 이의 단편을 의미한다. AAT의 예시적인 서열은 다음과 같다:
Figure pct00016
"C-반응성 단백질 (CRP)"는 NCBI 수탁 번호 CAA39671 또는 P02741과 85% 이상의 서열 동일성을 지니는 폴리펩티드 바이오마커 또는 이의 단편을 의미한다. CRP의 예시적인 서열은 다음과 같다:
Figure pct00017
Figure pct00018
"키티나제-3-유사 단백질"로도 알려진 "YKL-40"은 NCBI 수탁 번호 P36222 또는 NP_001267과 85% 이상의 서열 동일성을 지니는 폴리펩티드 바이오마커 또는 이의 단편을 의미한다. YKL-40의 예시적인 서열은 다음과 같다:
Figure pct00019
"세포 피브로넥틴 (cFib)"은 NCBI 수탁 번호 P02751과 85% 이상의 서열 동일성을 지니는 폴리펩티드 바이오마커 또는 이의 단편을 의미한다. cFib의 예시적인 서열은 다음과 같다:
Figure pct00020
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Figure pct00022
"TAG-72"로도 언급되는 "암 항원 72-4 (CA-72-4)"는 모노클로날 항체 B72.3에 의해 인지되는 당단백질 바이오마커를 의미한다.
"프로스타신"은 NCBI 수탁 번호 AAB19071 또는 AAC41759와 85% 이상의 서열 동일성을 지니는 폴리펩티드 바이오마커 또는 이의 단편을 의미한다. 프로스타신의 예시적인 서열은 다음과 같다:
Figure pct00023
"메탈로프로테이나제 1의 조직 억제제 (TIMP-1)"는 NCBI 수탁 번호 NP_003245 또는 P01033과 85% 이상의 서열 동일성을 지니는 폴리펩티드 바이오마커 또는 이의 단편을 의미한다. TIMP-1의 예시적인 서열은 다음과 같다:
Figure pct00024
"인터류킨 8 (IL-8)"은 NCBI 수탁 번호 P10145 또는 AAH13615와 85% 이상의 서열 동일성을 지니는 폴리펩티드 바이오마커 또는 이의 단편을 의미한다. IL-8의 예시적인 서열은 다음과 같다:
Figure pct00025
"기질 메탈로프로테이나제-7 (MMP-7)"은 NCBI 수탁 번호 P09237 또는 NP_002414와 85% 이상의 서열 동일성을 지니는 폴리펩티드 바이오마커 또는 이의 단편을 의미한다. MMP-7의 예시적인 서열은 다음과 같다:
Figure pct00026
"인터류킨 6 (IL-6)"은 NCBI 수탁 번호 P05231, NP_000591, 또는 AAH15511과 85% 이상의 서열 동일성을 지니는 폴리펩티드 바이오마커 또는 이의 단편을 의미한다. IL-6의 예시적인 서열은 다음과 같다:
Figure pct00027
"혈관 내피 성장 인자 B (VEGF-B)"는 NCBI 수탁 번호 P49765, AAC50721, 또는 AAB06274와 85% 이상의 서열 동일성을 지니는 폴리펩티드 바이오마커 또는 이의 단편을 의미한다. VEGF-B의 예시적인 서열은 다음과 같다:
Figure pct00028
"칼프로텍틴"은 NCBI 수탁 번호 AAB33355, AAB25118, 또는 P06702와 85% 이상의 서열 동일성을 지니는 폴리펩티드 바이오마커 또는 이의 단편을 의미한다. 칼프로텍틴의 예시적인 서열은 다음과 같다:
Figure pct00029
"인슐린-유사 성장 인자-결합 단백질 2 (IGFBP-2)"는 NCBI 수탁 번호 AAA03246 또는 AAA36048과 85% 이상의 서열 동일성을 지니는 폴리펩티드 바이오마커 또는 이의 단편을 의미한다. IGFBP-2의 예시적인 서열은 다음과 같다:
Figure pct00030
"렉틴-유사 산화 LDL 수용체 1 (LOX-1)"은 NCBI 수탁 번호 P78380 또는 NP_002534와 85% 이상의 서열 동일성을 지니는 폴리펩티드 바이오마커 또는 이의 단편을 의미한다. LOX-1의 예시적인 서열은 다음과 같다:
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Figure pct00032
"뉴로필린-1"은 NCBI 수탁 번호 AAP80144, AAP78927, AAG41895, 또는 ABY87548과 85% 이상의 서열 동일성을 지니는 폴리펩티드 바이오마커 또는 이의 단편을 의미한다. 뉴로필린-1의 예시적인 서열은 다음과 같다:
Figure pct00033
"TNFR2"는 NCBI 수탁 번호 P20333 또는 NP_001057과 85% 이상의 서열 동일성을 지니는 폴리펩티드 바이오마커 또는 이의 단편을 의미한다. TNFR2의 예시적인 서열은 다음과 같다:
Figure pct00034
"MPIF-1"은 NCBI 수탁 번호 AAB51134 또는 P55773과 85% 이상의 서열 동일성을 지니는 폴리펩티드 바이오마커 또는 이의 단편을 의미한다. MPIF-1의 예시적인 서열은 다음과 같다:
Figure pct00035
상세한 설명:
바이오마커 패널 및 관련 방법과 생성물은 다양한 단계 및 아류형의 난소암을 지니는 피검체, 비-암 부인과 질환을 갖는 피검체 및 정상 피검체로부터 뽑아낸 인간 혈청에서 다양한 분자 종의 분석물 수준을 분석함으로써 확인되었다. 하기 기재된 면역검정은 Multi-Analyte Profile (MAP) Luminex® 플랫폼을 이용하여 텍사스 오스틴의 Rules-Based Medicine에 있는 동업자에 의해 호의적으로 수행되었다.
바람직한 샘플은 혈청이지만, 적절한 샘플은 임의의 생물학적 공급원 또는 샘플, 예컨대 조직, 추출물, 세포(예를 들어, 종양 세포)를 포함하는 세포 배양물, 세포 용해물, 및 생리학적 유체, 예컨대, 예를 들어 전혈, 혈장, 혈청, 타액, 유관 세척물, 수정체 분비물, 뇌 척수액, 땀, 소변, 모유, 복수액, 윤활액, 복막액 등으로부터 유래될 수 있는 것으로 고려된다. 샘플은 동물, 바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 영장류, 가장 바람직하게는 인간으로부터 인간 샘플 분석에 관해 하기 논의된 것들과 동등한 종 특이적인 결합제를 이용하여 수득될 수 있다. 이러한 기법 및 마커 패널을 이용하여 유전자 이식 동물을 포함하는 설치류 및 그 밖의 동물에서 인간 및 수의적 요법의 개발과 관련된 약물 치료를 평가할 수 있는 것으로 추가로 고려된다.
샘플은 혈액으로부터 혈장을 제조하고, 점성 유체를 희석시키는 등과 같이, 통상적인 기법에 의해 사용되기에 앞서 처리될 수 있다. 샘플 처리의 방법은 여과, 증류, 추출, 농축, 간섭 성분의 불활성화, 카오트로프의 첨가, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다. 핵산 (사일런서(silencer), 조절 및 간섭 RNA 포함)을 분리시킬 수 있고 하기 기재된 분석물에 대한 그 발현 수준을 또한 본 발명의 방법에 이용할 수 있다.
샘플 및 분석 플랫폼
하기 논의된 데이터의 대부분을 생성하기 위해 분석된 혈청 샘플의 세트는 150개의 난소암 샘플 및 150개의 비난소암 샘플을 함유하였다. 난소암 샘플은 추가로 하기 상피성 난소암 아류형으로 구성된다: 장액 (64), 투명 세포 (22), 자궁내막유사 (35), 점액 (15), 혼합 (14), 즉 하나를 초과하는 아류형으로 구성됨. 난소암 샘플의 단계 분포는 다음과 같았다: I기 (41), II기 (23), III기 (68), IV기 (12) 및 알려지지 않은 단계 (6).
비난소암 샘플 세트는 하기 난소 조건을 포함한다: 양성 (104), 정상 난소 (29) 및 "저악성 잠재성/경계성 (3). 샘플 세트는 또한 다른 암을 지닌 환자로부터의 혈청을 포함한다: 자궁경부암 (7), 자궁내막암 (6) 및 자궁암 (1).
본 발명의 바이오마커 항원 폴리펩티드에 특이적인 항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항혈청으로서 용이하게 생성되거나, 당 분야에 널리 알려진 방법을 이용하여 요망되는 특성을 지니도록 설계된 유전적으로 공학처리된 면역글로불린 (Ig)으로서 생성될 수 있다. 예를 들어, 예시를 위해 비제한적으로, 항체는 재조합 IgG, 면역글로불린 유래 서열을 지니는 키메라 융합 단백질 또는 "인간화" 항체 (예컨대, U.S. Pat. Nos. 5,693,762; 5,585,089; 4,816,567; 5,225,539; 5,530,101; 및 거기에 인용된 참고문헌들을 참조하라)를 포함할 수 있고, 이들 모두는 본원에 기재된 방법에 따라 인간 바이오마커 폴리펩티드를 검출하는데 이용될 수 있다. 상기 항체는 하기 기재된 대로 바이오마커 폴리펩티드를 이용한 면역화에 의한 것을 포함하여, 본원에 제공된 대로 제조될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 제공된 대로, 바이오마커 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 서열이 개시되며, 이로써 당업자는 이러한 면역원으로서 이용되는 폴리펩티드를 통상적으로 제조할 수 있다.
용어 "항체"는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 이의 단편, 예컨대 F(ab').sub.2, 및 Fab 단편뿐만 아니라 바이오마커 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 분자인 천연 발생 또는 재조합에 의해 생성된 결합 파트너를 포함한다. 항체는 이들이 HE4a 폴리펩티드에 약 10-4 M 이상, 바람직하게는 약 10-5 M 이상, 보다 바람직하게는 약 10 이상, 또한 더욱 바람직하게는 약 10.sup..sup.7 M.sup.-1 이상의 K.sub.a로 결합하는 경우 "면역특이적" 또는 특이적으로 결합한다고 정의된다. 결합 파트너 또는 항체의 친화성은 통상적인 기법, 예를 들어 문헌[Scatchard et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660 (1949)]에 기재된 기법을 이용하여 용이하게 측정될 수 있다. 바이오마커 폴리펩티드의 결합 파트너로서 다른 단백질의 측정은 다른 단백질 또는 폴리펩티드와 특이적으로 상호작용하는 단백질을 동정하고 수득하기 위한 다수의 임의의 공지된 방법, 예를 들어 U.S. Pat. No. 5,283,173 및 U.S. Pat. No. 5,468,614에 기재된 것과 같은 효모 2-하이브리드 스크리닝 시스템 또는 이의 등가물을 이용하여 수행될 수 있다. 본원에 기재된 방법은 또한 바이오마커 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 결합 파트너 및 항체를 제조하기 위해, 바이오마커 폴리펩티드, 및 바이오마커 폴리펩티드의 아미노산 서열에 기반한 펩티드를 이용하는 것을 포함한다.
항체는 당업자에게 공지된 임의의 다양한 기법에 의해 일반적으로 제조될 수 있다 (예컨대, 문헌[Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]을 참조하라). 그러한 한 기법에서, 바이오마커 폴리펩티드를 포함하는 면역원, 예를 들어 그 표면에 바이오마커 폴리펩티드를 지니는 세포 또는 분리된 바이오마커 폴리펩티드를, 바람직하게는 1회 이상의 부스터 면역화를 포함시킨 소정의 스케쥴에 따라, 적합한 동물 (예컨대, 마우스, 랫트, 토끼, 양 및 염소)에게 처음에 주입시키고, 주기적으로 동물에게서 채혈한다. 그 후 바이오마커 폴리펩티드에 특이적인 폴리클로날 항체를, 예를 들어 적합한 고체 지지체에 커플링된 폴리펩티드를 이용한 친화성 크로마토그래피에 의해 상기 항혈청으로부터 정제시킬 수 있다.
바이오마커 폴리펩티드에 특이적인 모노클로날 항체 또는 이의 변이체를, 예를 들어 Kohler 및 Milstein의 기법 (1976 Eur. J. Immunol. 6:511-519), 및 이의 개선된 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 간단히 말해, 이러한 방법은 요망되는 특이성 (즉, 관심있는 메소텔린 폴리펩티드와의 반응성)을 지니는 항체를 생성할 수 있는 무한증식 세포주의 제조를 포함한다. 상기 세포주는, 예를 들어 상기 기재된 대로 면역화된 동물로부터 수득되는 비장 세포로부터 생성될 수 있다. 그 후 비장 세포는 예를 들어 골수종 세포 융합 파트너, 바람직하게는 면역화된 동물과 동계인 것과의 융합에 의해 무한증식된다. 예를 들어, 비장 세포 및 골수종 세포는 폴리에틸렌 글리콜 또는 비이온성 세제와 같은 막 융합 촉진제와 수 분간 조합된 다음 하이브리드 세포의 성장을 지지하지만 골수종 세포의 성장은 지지하지 않는 선택적인 배지에 저밀도로 플레이팅될 수 있다. 바람직한 선택 기법은 HAT (하이포크산틴, 아미노프테린, 티미딘) 선택을 이용한다. 충분한 시간 후에, 일반적으로 약 1 내지 2주 후에, 하이브리드의 콜로니가 관찰된다. 단일 콜로니를 선택하여 폴리펩티드에 대한 결합 활성에 대해 시험한다. 높은 반응성 및 특이성을 지니는 하이브리도마가 바람직하다. 바이오마커 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마가 본원에 기재된 방법에 의해 고려된다.
모노클로날 항체는 성장하는 하이브리도마 콜로니의 상청액으로부터 분리될 수 있다. 또한, 마우스 또는 그 밖의 적합한 숙주와 같은 적합한 척추동물 숙주의 복강으로 하이브리도마 세포주를 주입시키는 것과 같은 다양한 기법을 이용하여 수율을 향상시킬 수 있다. 그 후 모노클로날 항체를 복수액 또는 혈액으로부터 회수할 수 있다. 통상적인 기법, 예컨대 크로마토그래피, 겔 여과, 침전, 및 추출에 의해 항체로부터 오염물질을 제거할 수 있다. 예를 들어, 표준 기법을 이용하여 고정된 단백질 G 또는 단백질 A 상에서 크로마토그래피에 의해 항체를 정제할 수 있다.
특정 구체예 내에서, 항체의 항원-결합 단편의 이용이 바람직할 수 있다. 그러한 단편은 표준 기법 (예컨대, Fab 및 Fc 단편을 수득하기 위해 파파인으로 분해함에 의해)을 이용하여 제조될 수 있는 Fab 단편을 포함한다. Fab 및 Fc 단편은 표준 기법을 이용하여 친화성 크로마토그래피 (예컨대, 고정된 단백질 A 컬럼 상에서)에 의해 분리될 수 있다. 그러한 기법은 당 분야에 잘 알려져 있다 (예컨대, 문헌[Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology, 1986, Blackwell Scientific, Boston]을 참조하라).
다양한 이펙터 단백질을 엔코딩하는 서열에 인-프레임(in-frame)으로 연결된 DNA 서열에 의해 엔코딩되는 면역글로불린 V-영역 도메인에 의해 미리-선택된 항원에 특이적 결합 친화성을 지니는 다기능적인 융합 단백질이, 예를 들어 EP-B1-0318554, U.S. Pat. No. 5,132,405, U.S. Pat. No. 5,091,513 및 U.S. Pat. No. 5,476,786에 기재된 대로 당 분야에 공지되어 있다. 그러한 이펙터 단백질은 비제한적으로 바이오틴 모방 서열 (예컨대, 문헌[Luo et al., 1998 J. Biotechnol. 65:225] 및 여기에 인용된 참고문헌을 참조하라), 검출가능한 표지화 모이어티를 이용한 직접 공유 변형, 특이적 표지된 리포터 분자에 대한 비공유 결합, 검출가능한 기질의 효소적 변형 또는 고체-상 지지체 상에 고정 (공유 또는 비공유)을 포함하는, 당업자에게 친숙할 임의의 다양한 기법에 의해 융합 단백질의 결합을 검출하는데 이용될 수 있는 폴리펩티드 도메인을 포함한다.
본원에 기재된 방법에 이용되는 단일 쇄 항체는 또한 파지 디스플레이 (예컨대, 문헌[U.S. Pat. No. 5,223,409; Schlebusch et al., 1997 Hybridoma 16:47]; 및 여기에 인용된 참고문헌을 참조하라)와 같은 방법에 의해 생성되고 선택될 수 있다. 간단히 말해, 이러한 방법에서, DNA 서열은 M13과 같은 사상 파지의 유전자 III 또는 유전자 VIII 유전자로 삽입된다. 멀티클로닝 부위를 갖는 여러 벡터가 삽입을 위해 개발되었다 (McLafferty et al., Gene 128:29-36, 1993; Scott and Smith, Science 249:386-390, 1990; Smith and Scott, Methods Enzymol. 217:228-257, 1993). 삽입되는 DNA 서열은 임의로 생성될 수 있거나 바이오마커 폴리펩티드와의 결합을 위한 공지된 결합 도메인의 변이체일 수 있다. 단일 쇄 항체는 이러한 방법을 이용하여 용이하게 생성될 수 있다. 일반적으로, 삽입물은 6 내지 20개의 아미노산을 엔코딩한다. 삽입된 서열에 의해 엔코딩되는 펩티드는 박테리오파지의 표면에 디스플레이된다. 바이오마커 폴리펩티드에 대한 결합 도메인을 발현시키는 박테리오파지는 고정된 바이오마커 폴리펩티드, 예를 들어 당 분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 제조된 재조합 폴리펩티드 및 본원에 기재된 핵산 코딩 서열과의 결합에 의해 선택된다. 결합되지 않은 파지는 통상적으로 10 mM Tris, 1 mM EDTA를 함유하고 염이 없거나 저염 농도를 지니는 세척물에 의해 제거된다. 결합된 파지는 예를 들어 염 함유 완충제로 용리된다. NaCl 농도는 모든 파지가 용리될 때까지 단계식(step-wise) 양상으로 증가한다. 전형적으로, 높은 친화성으로의 파지 결합은 보다 높은 염 농도에 의해 방출될 것이다. 용리된 파지는 박테리아 숙주로 전파된다. 추가의 선택 라운드를 수행하여 높은 친화성을 지니는 소수의 파지 결합을 선택할 수 있다. 그 후 결합 파지에서 삽입물의 DNA 서열을 결정한다. 일단 결합 펩티드의 예측 아미노산 서열이 알려지면, 본원에서 바이오마커 폴리펩티드에 특이적인 항체로서 이용하기에 충분한 펩티드가 재조합 수단 또는 합성에 의해 제조될 수 있다. 재조합 수단은 항체가 융합 단백질로서 생성될 때 이용된다. 펩티드는 또한 친화성 또는 결합성을 최대화하기 위해 2개 이상의 유사하거나 유사하지 않은 펩티드의 일렬 어레이로서 생성될 수 있다.
바이오마커 폴리펩티드에 특이적인 항체와 반응성인 항원성 결정인자를 검출하기 위한 검출 시약은 통상적으로 항체이고, 이러한 항체는 본원에 기재된 대로 제조될 수 있다. 샘플 중 폴리펩티드를 검출하기 위해 항체를 이용하는 당업자에게 공지된 다양한 검정 포맷이 존재하며, 이는 비제한적으로 효소 결합된 면역흡수 검정 (ELISA), 방사면역측정법 (RIA), 면역형광법, 면역침전법, 평형 투석법, 면역확산법 및 그 밖의 기법을 포함한다. 예컨대, 문헌[Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology, 1986, Blackwell Scientific, Boston]을 참조하라. 예를 들어, 검정은 웨스턴 블롯 포맷으로 수행될 수 있고, 여기서 생물학적 샘플로부터의 단백질 제조물은 겔 전기영동에 제공되고, 적합한 막으로 옮겨지며, 항체와 반응하게 된다. 그 후 막 상에 항체의 존재는 당 분야에 잘 알려져 있고 하기 기재된 적합한 검출 시약을 이용하여 검출될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 검정은 표적 바이오마커 폴리펩티드에 결합하여 샘플의 나머지로부터 이를 제거하기 위해 고체 지지체 상에 고정된 항체의 이용을 포함한다. 그 후 결합된 바이오마커 폴리펩티드를 별개의 바이오마커 폴리펩티드 항원성 결정인자, 예를 들어 검출가능한 리포터 모이어티를 함유하는 시약과 반응성인 제 2 항체를 이용하여 검출할 수 있다. 대안적으로, 경쟁적인 검정을 이용할 수 있는데, 여기서 바이오마커 폴리펩티드는 검출가능한 리포터 모이어티로 표지되고 고정된 항체와 샘플과의 인큐베이션 후에 고정된 바이오마커 폴리펩티드 특이적인 항체와 결합하게 된다. 샘플의 성분이 항체에 대한 표지된 폴리펩티드의 결합을 억제하는 정도는 고정된 항체와 샘플의 반응성을 나타내고, 결과적으로 샘플 중 바이오마커 폴리펩티드의 수준을 나타낸다.
고체 지지체는 항체가 부착될 수 있는 당업자에게 알려진 임의의 물질, 예컨대 미세역가 플레이트의 시험 웰, 니트로셀룰로스 필터 또는 또 다른 적합한 막일 수 있다. 대안적으로, 지지체는 비드 또는 디스크, 예컨대 유리, 섬유유리, 라텍스 또는 플라스틱, 예컨대 폴리스티렌 또는 폴리비닐클로라이드일 수 있다. 항체는 특허 및 과학 문헌에 충분히 기재되어 있는 당업자에게 공지된 다양한 기법을 이용하여 고체 지지체 상에 고정될 수 있다.
특정 바람직한 구체예에서, 샘플 중 바이오마커 항원 폴리펩티드를 검출하기 위한 검정은 2-항체 샌드위치 검정이다. 이러한 검정은 먼저 고체 지지체, 일반적으로 미세역가 플레이트의 웰 상에 고정된 바이오마커 폴리펩티드-특이적 항체를 생물학적 샘플과 접촉시켜, 항체와 반응성인 항원성 결정인자를 지니는 샘플 중 천연 발생 용해성 분자가 고정화된 항체와 결합하도록 함으로써 (예컨대, 실온에서 30분의 인큐베이션 시간이 일반적으로 충분하다) 항원-항체 복합체 또는 면역 복합체를 형성함에 의해 수행될 수 있다. 그 후, 샘플의 결합되지 않은 구성요소를 고정된 면역 복합체로부터 제거시킨다. 이어서, 바이오마커 항원 폴리펩티드에 특이적인 제 2 항체를 첨가시키며, 이 때 제 2 항체의 항원 결합 부위는 바이오마커 폴리펩티드에 대한 고정된 제 1 항체의 항원 결합 부위의 결합을 경쟁적으로 억제하지 않는다. 제 2 항체는 본원에 제공된 대로 검출가능하게 표지될 수 있어서, 직접 검출될 수 있다. 대안적으로, 제 2 항체는 검출가능하게 표지된 이차 (또는 "제 2 단계") 항-항체의 이용을 통해서나, 본원에 제공된 대로 특이적 검출 시약을 이용함에 의해 간접적으로 검출될 수 있다. 본원에 기재된 방법은 임의의 특정 검출 절차로 제한되지 않으며, 면역검정에 익숙한 기술자들은 2-항체 샌드위치 면역검정에서 특정 항원 (예컨대, 메소텔린 폴리펩티드)을 면역학적으로 검출하기 위한 다수의 시약 및 구성이 존재함을 이해할 것이다.
상기 기재된 2-항체 샌드위치 검정을 이용하는 본원에 기재된 방법의 특정 바람직한 구체예에서, 바이오마 항원 폴리펩티드에 특이적인 제 1 고정된 항체는 폴리클로날 항체이고 바이오마커 항원 폴리펩티드에 특이적인 제 2 항체는 폴리클로날 항체이다. 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 및 이들의 조합물을 포함하는 비경쟁적인 바이오마커 항체의 임의의 조합물을 본원에 기재된 방법에 이용할 수 있었다. 본원에 개시된 방법의 특정한 그 밖의 구체예에서, 바이오마커 항원 폴리펩티드에 특이적인 제 1 고정된 항체는 모노클로날 항체이고 바이오마커 항원 폴리펩티드에 특이적인 제 2 항체는 폴리클로날 항체이다. 본원에 기재된 방법의 특정한 그 밖의 구체예에서, 바이오마커 항원 폴리펩티드에 특이적인 제 1 고정된 항체는 폴리클로날 항체이고 바이오마커 항원 폴리펩티드에 특이적인 제 2 항체는 모노클로날 항체이다. 본원에 기재된 방법의 매우 바람직한 특정한 그 밖의 구체예에서, 바이오마커 항원 폴리펩티드에 특이적인 제 1 고정된 항체는 모노클로날 항체이고 바이오마커 항원 폴리펩티드에 특이적인 제 2 항체는 모노클로날 항체이다. 본원에 기재된 방법의 다른 바람직한 구체예에서, 바이오마커 항원 폴리펩티드에 특이적인 고정된 항체 및/또는 바이오마커 항원 폴리펩티드에 특이적인 제 2 항체는 당 분야에 공지되고 본원에서 언급된 항체의 임의의 유형일 수 있고, 예를 들어 예시에 의해서 비제한적으로 Fab 단편, F(ab').sub.2 단편, 면역글로불린 V-영역 융합 단백질 또는 단일 쇄 항체이다. 당업자는 본원에 기재된 방법이 본원에 기재되고 청구된 방법에서의 그 밖의 항체 형태, 단편, 유도체 등의 이용을 포함함을 이해할 것이다.
특히 바람직한 특정 구체예에서, 제 2 항체는 효소, 염료, 방사성핵종, 발광 그룹, 형광 그룹 또는 바이오틴 등과 같은 검출가능한 리포터 모이어티 또는 표지를 함유할 수 있다. 임의의 리포터 모이어티 또는 표지는 그러한 신호가 세척 후에 지지체 상에 남아 있는 항체의 양과 직접 관련되거나 이에 비례하는 한, 본원에 기재된 방법에 이용될 수 있었다. 그 후 고체 지지체에 결합된 채로 남아 있는 제 2 항체의 양을 검출가능한 특수한 리포터 모이어티 또는 표지에 적절한 방법을 이용하여 측정한다. 방사성 그룹의 경우, 섬광 계수 또는 방사선 사진촬영법이 일반적으로 적절하다. 항체-효소 컨쥬게이트는 다양한 커플링 기법을 이용하여 제조될 수 있다 (검토를 위해, 예컨대 문헌[Scouten, W. H., Methods in Enzymology 135:30-65, 1987]을 참조하라). 분광학적 방법을 이용하여 염료 (예를 들어, 효소 반응의 비색 생성물 포함), 발광 그룹 및 형광 그룹을 검출할 수 있다. 바이오틴은 상이한 리포터 그룹 (일반적으로 방사성 또는 형광 그룹 또는 효소)에 커플링된 아비딘 또는 스트렙타비딘을 이용하여 검출될 수 있다. 효소 리포터 그룹은 일반적으로 기질을 첨가한 후 (일반적으로 특수한 기간 동안), 반응 생성물의 분광, 분광광도 또는 그 밖의 분석에 의해 검출될 수 있다. 표준들 및 표준 첨가를 이용하여 샘플 중 항원의 수준을 널리 공지된 기법을 이용하여 측정할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본원에 개시된 방법은 생물학적 공급원 또는 피검체로부터의 생물학적 샘플 중 면역특이적으로 반응성인 항체의 검출에 의해 악성 질환의 존재를 스크리닝하기 위해 본원에 제공된 바이오마커 항원 폴리펩티드의 이용을 포함한다. 이러한 구체예에 따라서, 바이오마커 항원 폴리펩티드 (또는 본원에 제공된 트렁케이션된(truncated) 바이오마커 항원 폴리펩티드를 포함하는 이의 단편 또는 변이체)는 샘플 중 용해성 형태의 천연 발생 항체의 바이오마커 항원 폴리펩티드에 대한 결합을 검출하기 위해 검출가능하게 표지되고 생물학적 샘플과 접촉한다. 예를 들어, 바이오마커 항원 폴리펩티드는 용이하게 검출가능한 (예컨대, 방사성으로 표지된) 아미노산의 시험관내 번역 동안 혼입과 같은 널리 공지된 방법과 협조된 본원에 개시된 서열을 이용하거나, 상기 기재된 것들과 같은 그 밖의 검출가능한 리포터 모이어티를 이용함에 의해 생합성적으로 표지될 수 있다. 이론에 구속시키고자 하는 것은 아니지만, 본원에 개시된 방법의 이러한 구체예는 본원에 개시된 바이오마커 융합 폴리펩티드와 같은 특정 바이오마커 폴리펩티드가 특히 면역원성이어서 특이적이고 검출가능한 항체를 발생시키는 펩티드를 제공할 수 있다고 고려한다. 예를 들어, 이러한 이론에 따르면 특정 바이오마커 융합 폴리펩티드는 강력한 면역 반응을 일으키는 "비-자가" 항원을 나타낼 수 있는 반면, 융합 도메인이 결여된 바이오마커 폴리펩티드는 체액 또는 세포-매개된 면역성을 용이하게 유도하지 않는 더욱 유사한 "자가" 항원으로서 면역계에 의해 간주될 수 있다.
본 명세서에서 논의되는 샘플 중 분석물 수준은 고-처리량, 다분석물 면역검정 플랫폼을 이용하여 측정되었다. 바람직한 플랫폼은 텍사스주 오스틴 소재의 Rules-Based Medicine, Inc.에 의해 개발된 Luminex® MAP 시스템이다. 이는 회사의 웹사이트는 물론, 예를 들어 간행물, 예컨대 Chandler et al., "Methods and kits for the diagnosis of acute coronary syndrome, 2007년 1월 4일 공개된 U.S. 특허 출원 2007/0003981, 및 Spain et al.의 관련 출원 "Universal Shotgun Assay," 2005년 10월 6일 공개된 U.S. 특허 출원 2005/0221363에 기재되어 있다. 이러한 플랫폼은 Lokshin (2007)에서 이미 기재되었고 난소암 바이오마커의 다른 분석에 이용되는 데이터를 발생시켰다. 그러나, 임의의 면역검정 플랫폼 또는 시스템을 이용할 수 있다.
간단히 말해, 바람직한 분석물 측정 시스템을 기술하기 위해, MAP 플랫폼은 스펙트럼이 별개인 2개의 형광색소로 내부적으로 염색된 폴리스티렌 미소구체를 통합시킨다. 정밀한 비율의 형광색소를 이용함에 의해, 특수한 스펙트럼 주소를 지니는 100개의 상이한 미소구체 세트로 구성된 어레이가 생성된다. 각각의 미소구체 세트는 상이한 표면 반응물을 나타낼 수 있다. 미소구체 세트가 이들의 스펙트럼 주소에 의해 구별될 수 있으므로, 이들은 100개 이하의 상이한 분석물이 단일 반응 용기에서 동시에 측정되도록 조합될 수 있다. 리포터 분자에 커플링된 제 3 형광색소는 미소구체 표면에서 발생한 생체분자 상호작용을 정량한다. 미소구체는 이들이 Luminex® 분석기에서 두 별개의 레이저에 의해 통과함에 따라 빠르게 유동하는 유체 스트림에서 개별적으로 정보를 보낸다. 고속 디지털 신호 프로세싱은 그 스펙트럼 주소에 기반하여 미소구체를 분류하고 수 초 후에 샘플당 표면상의 반응을 정량한다.
또 다른 구체예에서, 면역검정은 샘플 중 마커를 검출하고 분석하기 위해 이용될 수 있다. 이러한 방법은 (a) 마커에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하고; (b) 샘플을 항체와 접촉시키고; (c) 샘플 중 마커에 결합된 항체의 복합체의 존재를 검출하는 것을 포함한다.
면역검정은 항원 (예컨대, 마커)에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하는 검정이다. 면역검정은 항원을 분리, 표적화, 및/또는 정량하기 위해 특정 항체의 특이적 결합 특성을 이용하는 것을 특징으로 한다. 단백질 또는 펩티드를 언급할 때 항체에 "특이적으로 (또는 선택적으로) 결합"하거나 "특이적으로 (또는 선택적으로) 면역반응성"이라는 표현은 단백질 및 다른 생물학적 물질의 이종 집단에서 단백질의 존재에 결정적인 결합 반응을 언급한다. 따라서, 지정된 면역검정 조건하에, 명시된 항체는 2회 이상 백그라운드에서 특정 단백질에 결합하고 샘플에 존재하는 다른 단백질에는 상당한 양으로 실질적으로 결합하지 않는다. 그러한 조건하에 항체에 대한 특수한 결합은 특정 단백질에 대한 이의 특이성에 대해 선택되는 항체를 요구할 수 있다. 예를 들어, 랫트, 마우스, 또는 인간과 같은 특정 종으로부터의 마커에 대해 생성된 폴리클로날 항체를 선택하여, 마커의 다형성 변이체 및 대립유전자 외에, 그 마커에는 특이적으로 면역반응성이지만 다른 단백질에는 그렇지 않은 폴리클로날 항체만을 수득할 수 있다. 이러한 선택은 다른 종으로부터의 마커 분자와 교차 반응하는 항체를 제함에 의해 달성될 수 있다.
정제된 마커 또는 이들의 핵산 서열을 이용하여, 마커에 특이적으로 결합하는 항체를 당 분야에 공지된 임의의 적합한 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 예컨대 문헌[Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (1988); Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed. 1986); and Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975)]을 참조하라. 그러한 기법은 비제한적으로 파지 또는 유사한 벡터에서 재조합 항체의 라이브러리로부터 항체의 선택에 의한 항체 제조뿐 아니라 토끼 또는 마우스를 면역시킴에 의해 폴리클로날 및 모노클로날 항체의 제조를 포함한다 (예컨대, 문헌[Huse et al ., Science 246:1275-1281 (1989); Ward et al., Nature 341:544-546 (1989)]을 참조하라). 전형적으로 특수하거나 선택적인 반응은 적어도 2회의 백그라운드 신호 또는 노이즈, 더욱 전형적으로 10회 초과 내지 100회의 백그라운드일 것이다.
일반적으로, 피검체로부터 수득된 샘플은 마커에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉할 수 있다. 임의로, 항체는 항체를 샘플과 접촉시키기 전에, 복합체의 세척 및 후속 분리를 촉진시키기 위해 고체 지지체에 고정될 수 있다. 고체 지지체의 예는, 예컨대 미세역가 플레이트, 스틱, 비드, 또는 마이크로비드 형태의 유리 또는 플라스틱을 포함한다. 항체는 또한 상기 기재된 프로브 기질 또는 ProteinChip® 어레이에 부착될 수 있다. 샘플은 바람직하게는 피검체로부터 취해진 생물학적 유체 샘플이다. 생물학적 유체 샘플의 예는 혈액, 혈청, 혈장, 유두 흡입물, 소변, 눈물, 타액 등을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 생물학적 유체는 혈청을 포함한다. 샘플은 샘플을 항체에 접촉시키기 전에 적합한 용리액으로 희석될 수 있다.
샘플을 항체와 인큐베이션시킨 후에, 혼합물을 세척하고 형성된 항체-마커 복합체를 검출할 수 있다. 이것은 세척된 혼합물을 검출 시약과 인큐베이션시킴에 의해 수행될 수 있다. 이러한 검출 시약은, 예컨대 검출가능한 표지로 표지된 제 2 항체일 수 있다. 예시적인 검출가능한 표지는 자기 비드 (예컨대, DYNABEADS™), 형광 염료, 방사선표지, 효소 (예컨대, 호스래디쉬 퍼옥사이드, 알칼린 포스파타제 및 ELISA에서 일반적으로 사용되는 다른 것들), 및 콜로이드 골드 또는 색유리 또는 플라스틱 비드와 같은 비색 표지를 포함한다. 대안적으로, 샘플 중 마커는 간접 검정을 이용하여 검출될 수 있고, 여기서, 예를 들어 제 2 표지된 항체를 이용하여 결합된 마커-특이적 항체를 검출하고/거나, 경쟁 또는 억제 검정에서, 예를 들어 마커의 별개의 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체를 혼합물과 동시에 인큐베이션시킨다.
항체-마커 복합체의 양 또는 존재를 측정하는 방법은, 예를 들어 형광, 발광, 화학발광, 흡광도, 반사율, 투과율, 복굴절 또는 굴절률의 검출 (예컨대, 표면 플라스몬 공명, 타원계측법, 공명거울법, 격자 결합 도파로법 또는 간섭법)을 포함한다. 광학 방법은 현미경 (공초점 및 비-공초점 둘 모두), 영상 기법 및 비-영상 기법을 포함한다. 전기화학적 방법은 전압 전류법 및 전류법을 포함한다. 방사 주파수 방법은 다극 공명 분광법을 포함한다. 이러한 검정을 수행하는 방법은 당 분야에서 용이하게 입수된다. 유용한 검정은, 예를 들어 효소 면역 검정 (EIA), 예컨대 효소-결합된 면역흡수 검정 (ELISA), 방사면역 검정 (RIA), 웨스턴 블롯 검정, 또는 슬롯 블롯 검정을 포함한다. 이러한 방법은 문헌[Methods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology, volume 37 (Asai, ed. 1993); Basic and Clinical Immunology (Stites & Terr, eds., 7th ed. 1991); and Harlow & Lane, supra]에도 기재되어 있다.
검정을 통틀어, 인큐베이션 및/또는 세척 단계는 시약의 각각의 조합 후에 요구될 수 있다. 인큐베이션 단계는 약 5초부터 수 시간까지 다양할 수 있고, 바람직하게는 약 5분 내지 약 24시간이다. 그러나, 인큐베이션 시간은 검정 포맷, 마커, 용액의 부피, 농도 등에 좌우될 것이다. 일반적으로 검정은 주위 온도에서 수행될 것이나, 10℃ 내지 40℃와 같은 온도 범위에 걸쳐 수행될 수 있다.
면역검정을 이용하여 샘플 중 마커의 존재 또는 부재뿐 아니라 샘플 중 마커의 양을 측정할 수 있다. 항체-마커 복합체의 양은 표준과 비교하여 결정될 수 있다. 표준은, 예컨대 샘플에 존재하는 것으로 알려진 공지된 화합물 또는 또 다른 단백질일 수 있다. 상기 주목된 대로, 마커의 시험 양은 측정 단위가 대조군과 비교될 수 있는 한, 절대 단위로 측정될 필요는 없다.
샘플에서 이러한 마커를 검출하는 방법은 다양하게 응용될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 마커는 인간암 진단 또는 예후를 보조하기 위해 측정될 수 있다. 또 다른 예에서, 마커의 검출 방법을 이용하여 암 치료에 대한 피검체의 반응을 모니터할 수 있다. 또 다른 예에서, 마커의 검출 방법을 이용하여 생체내 또는 시험관내에서 이러한 마커의 발현을 조절하는 화합물을 검정하고 이를 확인할 수 있다. 바람직한 예에서, 바이오마커를 이용하여 종양 진행의 상이한 단계들을 구별함으로써 적절한 치료 및 종양의 전이 정도를 측정하는 것을 돕는다.
바이오마커를 측정하는 또 다른 방법은 본원에 참조로서 포함되는 "Methods for Reducing the range in Concentrations of Analyte Species in a Sample"이라는 명칭의 2006년 7월 28일 출원된 USSN: 11/495,842에 기재된 대로 비드 상에서 합성된 조합 리간드 라이브러리의 이용을 포함한다.
당업자는 본 명세서에 기재되고 청구된 대로 샘플 중 바이오마커의 수준을 측정하기 위해 광범하게 다양한 분석적 기법이 이용될 수 있음을 인지할 것이다. 당업자가 이용가능한 다른 유형의 결합 시약을 샘플 중 지시된 분석물의 수준을 측정하는데 활용할 수 있다. 예를 들어, 주어진 분석물의 수준을 평가하기에 적절한 다양한 결합제 또는 결합 시약은 과학 문헌에서 용이하게 확인할 수 있다. 일반적으로, 적절한 결합제는 분석물에 특이적으로 결합할 것이고, 바꾸어 말해, 이것은 분석물과 검출가능한 수준으로 반응하지만 그 밖의 분석물 또는 관련이 없는 분석물과는 검출가능하게 반응하지 않는다 (또는 제한된 교차-반응성으로 반응한다). 적절한 결합제는 폴리클로날 및 모노클로날 항체, 앱타머, RNA 분자 등을 포함하는 것으로 고려된다. 면역형광법, 질량분석법, 핵자기공명 및 광학 분광학 방법을 포함하는 분광학적 방법을 또한 이용하여 분석물의 수준을 측정할 수 있다. 활용되는 결합에에 따라, 샘플을, 예를 들어 희석, 정제, 변성, 분해, 단편화 등에 의해 가공시킨 후 당업자에게 공지된 대로 분석할 수 있다. 또한, 종양 세포 또는 림프구에서의 유전자 발현도 측정할 수 있다.
확인된 바이오마커는 면역검정을 위해 다수의 에피토프 및/또는 결합제의 다른 유형에 대한 결합 부위를 지닐 수 있는 것으로 또한 고려된다. 따라서, 확인된 바이오마커의 펩티드 단편 또는 다른 에피토프, 특수한 단백질의 아이소형 및 심지어 생물학적 경로의 상류 또는 하류에 있거나 번역후 변형된 화합물은 관련 및 상대 화학량론이 적절하게 고려되는 한 확인된 분석물 또는 바이오마커를 대신할 수 있는 것으로 고려된다. 당업자는 대안적인 항체 및 결합제의 다양한 특이성 및 결합 친화성이 분석에 감안되는 한 임의의 특정 분석물의 수준을 측정하기 위해 대안적인 항체 및 결합제가 사용될 수 있음을 인지할 것이다.
본 발명의 방법 및 시험 키트에 이용된 분석물 또는 바이오마커의 발현 수준을 측정 또는 결정하기 위해 다양한 알고리듬을 이용할 수 있다. 그러한 알고리듬은 단순한 컷-오프 값의 측정을 넘어선 분석물 수준을 측정할 수 있을 것으로 일반적으로 고려된다. 따라서, 그러한 알고리듬의 결과는 일반적으로 미국 식품의약국에 의한 다지표 검사로서 분류될 것으로 고려된다. 특수한 유형의 알고리듬은 다음을 포함한다: 지식 발견 엔진(KDE™), 회귀 분석, 판별 분석, 분류 트리 분석, 랜덤 포리스트, ProteomeQuest®, 서포트 벡터 머신, One R, kNN 및 휴리스틱 나이브 베이즈 분석, 신경망 및 이들의 변형.
알려지지 않은 샘플이 암일 가능성을 에측하기 위한 다수의 매우 세련된 알고리듬이 존재하지만, 단순한 로지스틱 회귀분석 모델은 전형적으로 소수의 마커 (바람직하게는 약 5개 미만)의 측정에 기반하여 진단 모델을 만드는데 매우 잘 동작한다. 그 이면의 이론은 당업자에게 널리 알려져 있다. 또한 소프트웨어가 사용될 수 있는 다양한 옵션이 또한 존재한다 --- 상업적 및 무료 (및 오픈 소스) 패키지 둘 모두.
로지스틱 모델의 트레이닝은 샘플을 병증 및 대조군으로 분리시키는 것으로 구성되고, 그 후 하나의 바이어스 파라메터뿐 아니라 하나는 각각의 마커에 대한 것인 회귀 계수를 최적화하기 위해 선택된 소프트웨어를 이용함으로써, 트레이닝 데이터에 적용된 로지스틱 모델의 우도(likelihood)를 최대화시킨다.
일단 트레이닝되면, 회귀 계수의 세트는 로지스틱 모델을 규정한다. 당업자는 바이오마커의 수준을 로지스틱 방정식에 넣음으로써, 임의의 새로운 샘플이 병증 또는 대조군으로서 확인될 가능성을 예측하는 이러한 유형의 진단 모델을 용이하게 이용할 수 있다. 더욱이, ROC는 또한 계산된 가능성의 컷오프 값이 0 내지 1로 변화됨에 따라 민감성 및 특이성을 계산함에 의해 구성될 수 있다. 가능성을 계산하기 위한 로지스틱 회귀분석의 이용은 하기 단계를 포함한다: 1) 바이오마커의 수준을 측정한다:
각각의 바이오마커에 대해, 그 수준을 측정하고 기록한다. 전문가에게 하는 안내로서, 하기 논의는 N 바이오마커의 이용을 가정하며, 이들의 지정된 측정 수준은 x1, x2, … xn - 이다.
2) 'z' 값을 계산한다:
로지스틱 회귀분석 모델에서 계산되는 중심 수량이 'z' 파라메터이다. 이것은 다음과 같이 정의된다.
z = β0 + β1x1 + β2x2 + … + βnxn. 방정식 (1)
파라메터 β0는 바이어스 또는 절편이라 불리는 한편, β1, β2,… βn은 가중치라고 불린다. β들을 명시하는 것은 로지스틱 회귀분석 모델을 규정할 것이다. 전형적으로, 트레이닝 프로세스는 β들을 결정하는데, β들을 변화시킴에 의해 우도 함수를 최적화하기 위해 공지된 상태의 "질병" 또는 "양성"을 지니는 샘플을 이용한다. 일단 트레이닝 프로세스가 완료되면, β들의 값은 정확한 측정의 최적 우도를 산출하도록 선택될 것이다.
측정된 바이오마커 수준: x1, x2, … xn 및 미리 결정된 β들의 세트를 지니는 공지되지 않은 샘플의 경우, 당업자는 방정식 (1)에 따라 z의 값을 계산할 수 있다.
3) 로지스틱 함수의 값을 계산한다:
로지스틱 함수, f(z)는 다음과 같이 정의된다:
f(z) = ez/(ez+1) 방정식 (2)
2)에서 계산된 z의 값이 주어지면 방정식 (2)에 따라 f(z)의 값을 구할 수 있다. 일부 응용에서, z의 자연 로그를 방정식 (2)에서 바로 z 대신에 사용한다.
4) 진단 콜(Diagnostic Call)을 만든다:
로지스틱 함수는 어떠한 z 값에 대해 (0.0 내지 1.0)의 값을 산출한다. 전형적인 응용에서, 0.5의 컷오프를 이용하여 대조군과 병증을 구별한다. 따라서, 점수가 > 0.5인 샘플을 병증이라 부르는 한편, 점수가 <= 0.5인 샘플을 대조군이라 부를 것이다. 진단 프로세스의 일부 응용에서, 다른 컷오프 값 (예를 들어, 0.65)을 이용한다.
실시예
실시예 1
하기 논의 및 실시예는 본 발명을 기재하고 설명하기 위해 제공된 것이다. 이와 같이, 이들은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어선 안 된다. 당업자는 다수의 다른 구체예가 또한 본 명세서 및 청구범위에 기재된 본 발명의 범위 내에 있음을 잘 이해할 것이다.
지식 발견 엔진을 이용한 데이터의 분석
코레로직(Correlogic)은 지식 발견 엔진 (KDE™) 및 ProteomeQuest®을 포함하는 복합 데이터 세트를 평가함에 있어서 진화 및 패턴 인지 알고리듬의 이용을 기재하였다. 예를 들어, 문헌[Hitt et al., U.S. Patent No. 6,925,389, "Process for Discriminating Between Biological States Based on Hidden Patterns From Biological Data" (issued August 2, 2005); Hitt, U.S. Patent No. 7,096,206, "Heuristic Method of Classification," (issued August 22, 2006) and Hitt, U.S. Patent No. 7,240,038, "Heuristic Method of Classification," (to be issued July 3, 2007)]을 참조하라. 난소암 샘플로부터 유래된 질량 스펙트럼 데이터를 평가하는 이러한 기법의 이용은 문헌[Hitt et al., "Multiple high-resolution serum proteomic features for ovarian cancer detection," U.S. Published Patent Application 2006/0064253, published March 23, 2006]에서 추가로 설명된다.
코레로직의 지식 발견 엔진에 의해 데이터 세트를 분석할 때, 하기 5개-바이오마커 패널이 표 I에 개시된 다양한 단계의 난소암에 대해 민감성 및 특이성을 제공하는 것으로 나타났다. 특히, KDE 모델 1 [2_0008_20]은 I기 난소암에 대해 비교적 높은 정확도를 복귀시켰고 하기 마커들을 포함하였다: 암 항원 19-9 (CA19-9, Swiss-Prot 수탁 번호: Q9BXJ9), C 반응성 단백질 (CRP, Swiss-Prot 수탁 번호: P02741), 섬유아세포 성장 인자-염기성 단백질 (FGF-염기성, Swiss-Prot 수탁 번호: P09038) 및 미오글로빈 (Swiss-Prot 수탁 번호: P02144). KDE 모델 2 [4_0002-10]는 III기, IV 및 "진행된" 난소암에 대해 비교적 높은 정확도를 복귀시켰고 하기 마커들을 포함하였다: C형 간염 NS4 항체 (Hep C NS4 Ab), 리보솜 P 항체 및 CRP. KDE 모델 3 [4_0009_140]은 I기에 대해 비교적 높은 정확도를 복귀시켰고 하기 마커들을 포함하였다: CA 19-9, TGF 알파, EN-RAGE (Swiss-Prot 수탁 번호: P80511), 표피 성장 인자 (EGF, Swiss-Prot 수탁 번호: P01133) 및 HSP 90 알파 항체. KDE 모델 4 [4_0026_100]는 II기 및 III기, IV기 및 "진행된" 난소암에 대해 비교적 높은 정확도를 복귀시켰고 하기 마커들을 포함하였다: EN-RAGE, EGF, 암 항원 125 (CA125, Swiss-Prot 수탁 번호: Q14596), 피브리노겐 (Swiss-Prot 수탁 번호: 알파 사슬 P02671; 베타 사슬 P02675; 감마 사슬 P02679), 아포지단백질 CIII (ApoCIII, Swiss-Prot 수탁 번호: P02656), 콜레라 독소 및 CA 19-9. KDE 모델 5 [4_0027_20]도 II기 및 III기, IV기 및 "진행된" 난소암에 대해 비교적 높은 정확도를 복귀시켰고 하기 마커들을 포함하였다: 프로테이나제 3 (cANCA) 항체, 피브리노겐, CA 125, EGF, CD40 (Swiss-Prot 수탁 번호: Q6P2H9), 갑상선 자극 호르몬 (TSH, Swiss-Prot 수탁 번호: 알파 P01215; 베타 P01222 P02679, 렙틴 (Swiss-Prot 수탁 번호: P41159), CA 19-9 및 림포택틴 (Swiss-Prot 수탁 번호: P47992). 당업자는 선택된 분석물의 수준에 기반한 예측 또는 진단 값에 대하여 그 밖의 잠재적으로 유용한 바이오마커의 세트를 확인하기 위해 KDE 분석 툴을 이용할 수 있었다고 고려된다. KDE 알고리듬은 마커의 상대적 풍부함에 기반하여 다양한 마커를 선택하고 활용할 수 있고; 주어진 마커, 예를 들어 모델 IV에서 콜레라 독소의 수준은 0일 수 있으나 특정 그룹에서 선택된 그 밖의 마커와의 조합에 적절함을 주목하라.
당업자는 KDE의 상대 성능을 다른 분석 기법과 비교해 볼 때 본 명세서에 이용된 제한된 크기 데이터 세트가 상이한 결과, 예를 들어 마커의 상이한 패널 및 다양한 정확도를 발생시킬 수 있음을 인지할 것이다. 이러한 특정 KDE 모델은 40개의 I기 난소암 및 40개의 정상/양성을 이용한 비교적 적은 데이터로 만들어졌고 상기 기재된 대로 나머지 II기, III/IV기에 대해 블라인드 시험되었다. 따라서, 특이성은 I기 샘플의 것이고 샘플 세트 크기 및 잠재적인 과적합을 반영한다. 트레이닝 세트에 비해 비교적 큰 크기의 시험 세트가 주어지면, 나머지 비-난소암 샘플에 대한 특이성의 하락이 또한 예상된다. 대체로, I기 샘플에 대해 개발된 바이오마커 패널은 또한 고 민감도 값이 주어지면 난소암의 후기 단계에 대해 잠재적으로 유용한 예측 및 진단 검정을 제공한다.
그러나, 바이오마커 패널의 이러한 예는 모델 성능에 영향을 주도록 조정될 수 있는 다수의 파라메터가 존재함을 예시한다. 예를 들어 상이한 수의 다양한 피쳐가 함께 조합되는 이러한 경우에, 다양한 매치 값(match value)이 이용되고, 유전자 알고리듬의 상이한 길이의 다양한 진화가 이용되며 마디의 수가 상이한 모델이 생성된다. 당업자에게 명백한 통상적인 실험에 의해, 이러한 파라메터의 조합을 이용하여 임상적으로 적절한 성능의 다른 모델을 생성할 수 있다.
표 I. I기 특이적 분류 모델을 개발하기 위해 지식 발견 엔질을 이용한 분석 결과
Figure pct00036
랜덤 포리스트를 이용하는 방법 및 분석
당업자에게 공지된 바람직한 분석 기법은 Breiman의 기법인 랜덤 포리스트이다. [Machine Learning, 2001. 45:5-32; as further described by Segel, Machine Learning Benchmarks and Random Forest Regression, 2004; and Robnik-Sikonja, Improving Random Forests, in Machine Learning, ECML, 2004 Proceedings, J.F.B.e. al., Editor, 2004, Springer: Berlin]. 랜덤 포리스트의 그 밖의 변형이 또한 유용하고 본 발명의 방법을 위해 고려되며, 예를 들어 회귀 포리스트, 서바이벌 포리스트, 및 가중된 집단 랜덤 포리스트이다.
각각의 분석물 검정은 당업자에게 공지된 일부 상황에서 변수의 독립적인 측정이므로, 각각의 검정의 상이한 분산에 대해 조정하기 위해 데이터의 크기를 변경하는 것이 적절하다. 그러한 경우에, 비록 일부 경우, 크기변경이 상당한 영향력을 지니지 않을 것으로 예상되나, 쌍가중, MAD 또는 동등한 크기변경이 적절할 것이다. 랜덤 포리스트의 꼭대기에 있는 부트스트랩 층은 하기 논의되는 결과를 수득하는데 이용되었다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 하기와 같은 바이오마커의 패널이 고려된다:
a. 암 항원 125 (CA125, Swiss-Prot 수탁 번호: Q14596) 및 표피 성장 인자 수용체 (EGF-R, Swiss-Prot 수탁 번호: P00533).
b. CA125 및 C 반응성 단백질 (CRP, Swiss-Prot 수탁 번호: P02741)
c. CA125, CRP 및 EGF-R.
d. CA125, CRP 및 EGF-R 중 임의의 하나 이상, 이에 더하여 페리틴 (Swiss-Prot 수탁 번호: 중쇄 P02794; 경쇄 P02792), 인터류킨-8 (IL-8, Swiss-Prot 수탁 번호: P10145), 및 메탈로프로테이나제 1의 조직 억제제 (TIMP-1, Swiss-Prot 수탁 번호: P01033) 중 임의의 하나 이상,
e. 표 II 및 표 III에 제시된 바이오마커 패널들 중 임의의 하나.
f. 바이오마커의 상기 임의의 패널 (a-e)에 더하여 상기 패널 (a-e)에 미리 포함되지 않은 경우 하기 목록에 있는 그 밖의 바이오마커들 중 임의의 하나 이상: 알파-2 매크로글로불린 (A2M, Swiss-Prot 수탁 번호: P01023), 아포지단백질 A1-1 (ApoA1, Swiss-Prot 수탁 번호: P02647), 아포지단백질 C-III (ApoCIII, Swiss-Prot 수탁 번호: P02656), 아포지단백질 H (ApoH, Swiss-Prot 수탁 번호: P02749), 베타-2 마이크로글로불린 (B2M, Swiss-Prot 수탁 번호: P23560), 베타셀룰린 (Swiss-Prot 수탁 번호: P35070), C 반응성 단백질 (CRP, Swiss-Prot 수탁 번호: P02741). 암 항원 19-9 (CA19-9, Swiss-Prot 수탁 번호: Q9BXJ9), 암 항원 125 (CA125, Swiss-Prot 수탁 번호: Q14596), 콜라겐 유형 2 항체, 크레아틴 키나제-MB (CK-MB, Swiss-Prot 수탁 번호: 뇌 P12277; 근육 P06732), C 반응성 단백질 (CRP, Swiss-Prot 수탁 번호: P02741), 결합 조직 성장 인자 (CTGF, Swiss-Prot 수탁 번호: P29279), 이중 가닥 DNA 항체 (dsDNA Ab), EN-RAGE (Swiss-Prot 수탁 번호: P80511), 이오탁신 (C-C 모티프 케모카인 11, 소-유도성 사이토카인 A11 및 호산구 화학주성 단백질, Swiss-Prot 수탁 번호: P51671), 표피 성장 인자 수용체 (EGF-R, Swiss-Prot 수탁 번호: P00533), 페리틴 (Swiss-Prot 수탁 번호: 중쇄 P02794; 경쇄 P02792), 난포 자극 호르몬 (FSH, 난포 자극 호르몬 베타 서브유닛, FSH-베타, FSH-B, 폴리트로핀 베타 사슬, 폴리트로핀 서브유닛 베타, Swiss-Prot 수탁 번호: P01225), 합토글로빈 (Swiss-Prot 수탁 번호: P00738), HE4 (주요 부고환-특이적 단백질 E4, 부고환 분비 단백질 E4, 추정 프로테아제 억제제 WAP5 및 WAP 4-디설파이드 코어 도메인 단백질 2, Swiss-Prot 수탁 번호: Q14508), 인슐린 (Swiss-Prot 수탁 번호: P01308), 인슐린-유사 성장 인자 1 (IGF-1, Swiss-Prot 수탁 번호: P01343), 인슐린 유사 성장 인자 II (IGF-II, 소마토메딘-A, Swiss-Prot 수탁 번호: P01344), 인슐린 인자 VII (Swiss-Prot 수탁 번호: P08709), 인터류킨-6 (IL-6, Swiss-Prot 수탁 번호: P05231), 인터류킨-8 (IL-8, Swiss-Prot 수탁 번호: P10145), 인터류킨-10 (IL-10, Swiss-Prot 수탁 번호: P22301), 인터류킨-18 (IL-18, Swiss-Prot 수탁 번호: Q14116), 렙틴 (Swiss-Prot 수탁 번호: P41159), 림포택틴 (Swiss-Prot 수탁 번호: P47992), 대식세포-유래 케모카인 (MDC, Swiss-Prot 수탁 번호: O00626), 대식세포 억제 인자 (SWISS PROT), 대식세포 염증 단백질 1 알파 (MIP-1알파, Swiss-Prot 수탁 번호: P10147), 대식세포 이동 억제 인자 (MIF, 페닐피루베이트 토토머라제, 글리코실화-억제 인자, GIF, Swiss-Prot 수탁 번호: P14174), 미오글로빈 (Swiss-Prot 수탁 번호: P02144), 오스테오폰틴 (골 시알로단백질 1, 분비된 인단백질 1, SPP-1, 요로 결석 단백질, 네프로폰틴, 유로폰틴, Swiss-Prot 수탁 번호: P10451), 이자섬 세포 (GAD) 항체, 프로락틴 (Swiss-Prot 수탁 번호: P01236), 줄기 세포 인자 (SCF, Swiss-Prot 수탁 번호: P21583), 테나신 C (Swiss-Prot 수탁 번호: P24821), 메탈로프로테이나제 1의 조직 억제제 (TIMP-1, Swiss-Prot 수탁 번호: P01033), 종양 괴사 인자-알파 (TNF-알파, Swiss-Prot 수탁 번호: P01375), 종양 괴사 인자 RII (TNF-RII, Swiss-Prot 수탁 번호: Q92956), 폰 빌레브란트 인자 (vWF, Swiss-Prot 수탁 번호: P04275) 및 본 명세서에 인용된 참고문헌에서 암에 대한 정보를 주는 것으로 확인된 그 밖의 바이오마커.
랜덤 포리스트 분석적 접근법을 이용하여, I기 난소암에 대해 높은 예측 값을 지니는 바람직한 7개의 바이오마커 패널을 동정하였다. 이것은 ApoA1, ApoCIII, CA125, CRP, EGF-R, IL-18 및 테나신을 포함한다. 이러한 바이오마커를 이용하여 랜덤 포리스트에 의해 생성된 I기 암에 대한 비교적 더욱 정밀한 모델을 만들고 선택하는 동안, I기 난소암에 대한 민감성은 약 80% 내지 약 85%의 범위였다. 민감성은 또한 II기에 대해 약 95%이고 III기/IV기에 대해서는 약 94% 민감하다. 전반적인 특이성은 약 70%였다.
유사하게, II기에 대해 높은 예측 값을 지니는 바람직한 7개의 바이오마커 패널을 동정하였다. 이것은 B2M, CA125, CK-MB, CRP, 페리틴, IL-8 및 TIMP1을 포함한다. II기에 대한 바람직한 모델은 약 82%의 민감성 및 약 88%의 특이성을 지녔다.
III기, IV기 및 진행된 난소암의 경우, 하기 19개 바이오마커 패널이 동정되었다: A2M, CA125, CRP, CTGF, EGF-R, EN-RAGE, 페리틴, 합토글로빈, IGF-1, IL-8, IL-10, 인슐린, 렙틴, 림포택틴, MDC, TIMP-1, TNF-알파, TNF-RII, vWF. III기/IV기에 바람직한 모델은 약 86%의 민감성 및 약 89%의 특이성을 지녔다.
난소암을 검출, 진단 및 모니터하기 위한 그 밖의 바람직한 바이오마커 또는 분석물 패널이 표 II 및 표 III에 도시된다. 이러한 패널은 CA-125, CRP 및 EGF-R을 포함하고, 대부분의 경우, CA19-9이다. 표 II에서, 20개의 바람직한 분석물로부터 각각 선택된 7개의 분석물의 20개의 그러한 패널을 1 내지 20으로 번호 매긴 컬럼에 디스플레이한다. 표 III에서, 23개의 바람직한 분석물로부터 각각 선택된 7개의 분석물의 또 다른 20개의 그러한 패널을 1 내지 20으로 번호 매긴 컬럼에 디스플레이한다.
Figure pct00037
Figure pct00038
난소암의 모든 단계에 대해 다른 바람직한 바이오마커 패널 (또는 모델)은 다음을 포함한다: (a) CA-125, CRP, EGF-R, CA-19-9, Apo-AI, Apo-CIII, IL-6, IL-18, MIP-1a, 테나신 C 및 미오글로빈; (b) CA125, CRP, CA19-9, EGF-R, 미오글로빈, IL-18, Apo CIII; 및 (c) CA125, CRP, EGF-R, CA19-9, Apo CIII, MIP-1a, 미오글로빈, IL-18, IL-6, Apo AI, 테나신 C, vWF, 합토글로빈, IL-10. 임의로, 하기 바이오마커 중 임의의 하나 이상을 이러한 바이오마커 패널 또는 본문 또는 표에서 상기 기재된 임의의 다른 바이오마커 패널에 첨가할 수 있다 (어떠한 그러한 패널이 거기에서 이미 특이적으로 확인되지 않을 만큼): vWF, 합토글로빈, IL-10, IGF-I, IGF-II, 프로락틴, HE4, ACE, ASP 및 레시스틴.
추가의 유익한 분석물의 세트 (또는 바이오마커)는 표 IV에서 하기 제시된 분석물 중 임의의 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상 및 4개 이상뿐 아니라 표 IV에 있는 분석물 중 임의의 하나 이상과 조합된 표 I, II 또는 III에 있는 임의의 바이오마커 세트, 및 상기 문단 70-75에서 논의되거나 본 명세서의 다른 부분에서 발견되는 임의의 다른 바이오마커 세트와 조합된 표 IV에 있는 마커 중 임의의 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 시험 키트 및 방법에 사용되는 추가의 유익한 분석물 세트는 표 IV의 바이오마커 중 임의의 하나 이상과 함께 CA-125, CRP, ECG-R 및 HE-4 중 임의의 하나 이상을 포함한다.
따라서, 고려되는 바이오마커의 세트는 조합물, 예컨대 CA-125, CRP 및 표 IV의 바이오마커 중 임의의 하나 이상 (또는 2개 이상); CA-125, EGF-R 및 표 IV의 바이오마커 중 임의의 하나 이상 (또는 2개 이상); CA-125, HE-4 및 표 IV의 바이오마커 중 임의의 하나 이상 (또는 2개 이상); CRP, EGF-R 및 표 IV의 바이오마커 중 임의의 하나 이상 (또는 2개 이상); CRP, HE-4 및 표 IV의 바이오마커 중 임의의 하나 이상 (또는 2개 이상); 및 EGF-R, HE-4 및 표 IV의 바이오마커 중 임의의 하나 이상 (또는 2개 이상)을 포함한다. 본 발명에 따른 상기 바이오마커 세트에서 유익한 가치의 마커는 VCAM-1, IL-6R, IL-18R 및 소르틸린을 포함하는 것으로 고려된다.
추가로, 바이오마커 패널은 바이오마커의 3개 세트: (a) CA125, 트랜스티레틴, ApoA-I, B2-마이크로글로불린 및 트랜스페린; (b) CA125 및 렙틴, 프로락틴, 오스테오폰틴, 및 인슐린-유사 성장 인자-II; 및 (c) OvaPlex: CA125, C-반응성 단백질, 혈청 아밀로이드 A, IL-6 및 IL-8 중 임의의 2개 이상, 3개 이상 및 4개 이상과 함께 표 IV의 바이오마커 중 임의의 하나 이상 (또는 2개 이상)을 포함한다.
일반적으로, 단백질 및 펩티드 단편 및 순환 혈액 및 림프 흐름으로 발산되는 도메인을 포함하는 이러한 분석물의 가용성 형태가 고려된다. 이러한 분석물은 혈액, 림프, 혈청, 소변 및 다른 체액에서 검출되고 분석될 수 있다. 또한 기재된 임의의 바이오마커에 대한 자가항체뿐 아니라 이러한 바이오마커를 엔코딩하고 이러한 마커의 수준을 평가하기 위해 또 다른 간접적인 방식으로서 검출되고 정량될 수 있는 누클레오티드가 본 발명의 조성물 및 방법에서 고려된다. 그러한 분자 종의 검출에 유용한 앱타머 및 다른 화합물은 당업자에게 잘 알려져 있다
표 IV .
Figure pct00039
Figure pct00040
상기 기재된 바람직한 바이오마커 중 임의의 2개 이상은 예측 값을 지닐 것이나, 다른 바람직한 마커의 하나 이상을 본원에 개시된 임의의 분석 패널에 첨가하는 것은 임상 목적을 위한 패널의 예측 값을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 열거되거나 그렇지 않으면 본 명세서에 인용된 참고문헌에서 발견된 상이한 바이오마커 중 하나 이상을 첨가시키는 것도 바이오마커 패널의 예측 값을 증가시킬 수 있으므로 특별히 고려된다. 당업자는 그러한 추가의 바이오마커의 활용성을 용이하게 평가할 수 있다. 본 명세서에 기재되거나 청구된 바이오마커의 세트(또는 패널)에 첨가하기에 적절한 추가의 바이오마커는 민감성 또는 특이성에서의 상응하는 증가 없이 또는 바이오마커 패널 전부의 견고성에서의 상응하는 증가 없이 민감성 또는 특이성의 감소를 초래하지 않을 것이다. 적어도 약 80% 이상의 민감성 및/또는 특이성이 바람직하고, 적어도 약 85% 이상이 더욱 바람직하며, 적어도 약 90% 또는 95% 이상이 가장 바람직하다.
기재된 진단 결과는 사용자 또는 진단자의 이익에 대해 산출될 수 있거나, 비제한적으로 컴퓨터 스크린, 컴퓨터 판독가능한 매체, 한 장의 종이 또는 어떠한 다른 가시적인 매체와 같은 매체 상에 표시될 수 있다.
본 발명의 상기 구체예 및 이익은 전술한 설명 및 실시예에 일부 개시되어 있고 이러한 설명 및 실시예로부터 당업자에게 일부 자명할 것이며 본원에 개시된 바와 같이 본 발명을 실시함에 의해 추가로 실현될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 기법은 상기 기재된 대로 견본 또는 생물학적 샘플을 평가한 다음 1회 이상의 이후 시점에 평가를 반복함에 의해 개체에서 난소암의 진행을 모니터하는데 용이하게 적용될 수 있고, 이에 따라 경시적으로 관련 바이오마커의 발현 또는 조절이상에서의 차이는 그 개체에서 난소암의 진행 또는 요법에 대한 반응성을 나타낸다. 본 특허 출원에 표시된 모든 참고문헌, 특허, 저널 기사, 웹 페이지 및 다른 문서는 그 전문이 본원에 참고로서 포함된다.
실시예 2
난소암 시험의 성능을 발전시키고 확인하기 위해 특수하게 수행된 전향적 수집물에서 혈청을 얻었다. 모든 샘플은 부착에 대해 모니터된 11개의 상이한 부위로부터 한결같은 프로토콜하에 수집되었다. 웨스턴 생명윤리심의위원회(Western Institutional Review Board)(Olympia, WA) 및 IRB의 개별 사이트는 FDA 허가전 임상연구 (IDE) 번호 G050132 하에 연구를 승인하였다. 수집 사이트 (및 IRB)는 다음과 같았다: 세다스-시나이 메디컬 센터, 로스엔젤레스, CA (Cedars-Sinai Institutional Review Board); 플로리다 부인과 종양학, 포트 메이어스, FL (Lee Memorial Health System Institutional Review Committee); 플로리다 호스피탈 센터 인스티튜트, 올랜도, FL (Florida Hospital Institutional Review Board); 더 해리 앤 자넷 바인베르그 캔서 인스티튜트 앳 프랭클린 스퀘어 호스피틀, 발티모어, MD (MedStar Research Institute Georgetown Oncology Institutional Review Board); 홀리 크로스 호스피틀, 실버 스프링, MD (Holy Cross Institutional Review Board); 노스 쇼어 - 롱 아일랜드 쥬이시 헬스 시스템, 맨하셋, NY (Institutional Review Board North Shore-Long Island Jewish Health System); SUNY 앳 스토니 브룩, NY, 스토니 브룩, NY (Committee on Research Involving Human Subjects SUNY Stony Brook); 유니버시티 오브 앨버바마 앳 버밍엄, 버밍엄, AL (The University of Alabama at Birmingham Institutional Review Board for Human Use); 유니버시티 오브 서던 캘리포니아, 노리스 캔서 센터, 로스엔젤레스, CA 및 위민즈 앤 칠드런즈 호스피틀, 로스엔젤레스, CA (University of Southern California Health Sciences Campus Institutional Review Board); 웨이크 포리스트 유니버시티 헬스 사이언시즈, 윈스턴-살렘, NC (Institutional Review Board Wake Forest University School of Medicine); 및 위민 및 인펀츠 호스피틀 오프 로드 아일랜드, 프로비덴스, RI (Institutional Review Board Women and Infants' Hospital of Rhode Island). 연구 포함 기준은 골반 종괴가 있거나 없는 여성을 포함하는 내셔널 컴프리헨시브 캔서 네스워크 (NCCN) 난소암 치료 가이드라인에 따라 난소암의 증후를 나타내는 18세 이상의 여성이었다. 관계자는 난소암을 지녔는지 여부에 따라 부인과 수술을 예정하여야 하고, 난소의 수술후 병리학적 평가 및 절제된 조직은 질병 상태의 임상적 진상을 확증할 필요가 있었다. 제외 기준은 포함 기준을 충족하지 못했거나, 사전 동의를 제공할 수 없었거나, 임신했거나, 난소암에 대해 사전에 치료된 여성이었다. 연구에서 각각의 관계자에 대해 서면으로 된 사전 동의를 얻었다. 모든 데이터를 탈-식별시켰고 어떠한 결과도 의사나 환자에게 돌려보내지 않았다.
병리학-확인된 난소암을 지니는 환자로부터의 149개의 샘플 및 병리학-확인된 양성 질환을 지니는 환자로부터의 350개 샘플을 이용하였다 (도 1). 난소암 샘플은 모든 단계 및 일반적인 아류형의 질병을 포함하였다. 양성 샘플은 전체 연구 집단에서 보여진 양성 질환의 일반적인 유형을 포함하였다. 각 샘플에는 환자 연령, 인종, 기, 아류형 및 코딩된 수집 사이트와 함께 수술 이후 수득된 완전한 임상병리학 레포트가 수반되었다.
어떠한 중재 이전에, 혈액 샘플 (10 ml)을 레드 탑 글라스 진공채혈관에 수집하였다. 혈액을 실온에서 30분 이상 응고시키고, 3,500 g에서 10분간 원심분리시키고, 생성된 혈청을 미리-표지된 동결튜브로 옮기고, 신속히 -80℃에서 저장하였다. 채혈에서 동결까지의 과정은 2시간 내에 완료되었다. 모든 샘플을 저장을 위해 드라이 아이스 상에서 단일 지정된 장소로 수송하였다. 분취를 위해, 모든 샘플을 물과 얼음 슬러리에서 해동시킨 다음, 샘플 질환 상태에 대해 모든 후속 실험자에게 맹검된 코딩된 식별자로 라벨링된 샘플 튜브로 옮겼다.
다중 면역검정법
독점 다중 면역검정법 (Human DiscoveryMAP® v1.0 and Human OncologyMAP® v1.0의 세트를 이용하여 259개의 혈청 바이오마커를 측정하였다 (도 2). 이중으로 수행된 각각의 검정을 8-점 표준 곡선을 이용하여 조정하였다. 중간 형관 세기 (MFI) 측정치를 곡선-맞춤 소프트웨어를 이용하여 최종 단백질 농도로 보간하였다. 검정 성능은 각 분석물에 대해 저, 중 및 고 수준의 품질 관리 (QC) 샘플을 이용하여 이중으로 입증되었다. 모든 표준 및 QC 샘플은 샘플 백그라운드 기질을 매칭시키기 위해 복합체 혈청-기반 매트릭스에 있었다. 혈청이 사전에 최적화된 희석물로 분석되었기 때문에, 조정 곡선의 최고 농도보다 높은 임의의 판독은 가장 높은 표준의 농도에 할당되는 한편, 최저 농도 아래의 것은 0 값으로 할당되었다. 분석을 위해, 샘플 런 속도를 임의화하여, 질병의 존재 또는 부재, 질병의 아류형 또는 단계, 환자 연령, 또는 혈청 샘플의 에이지로 인한 임의의 연속되는 바이어스를 회피하였다.
데이터 분석
시판되는 소프트웨어 패키지를 이용하여 혈청 분석물 농도에 대해 기술 통계, 수신자 조작 특성 (ROC) 곡선 및 그래픽 디스플레이 (점 그림)를 수행하였다. 비모수 Kruskal-Wallis 시험(ANOVA)에 이어 Dunn의 다중 비교 사후-시험을 이용하여 통계적 차이를 결정하였다. 모든 통계적 비교에 P-값 <0.05은 통계적으로 유의한 것으로 해석되었다. 다중-스펙트럼 분석 적용을 이용하여 피어슨 상관분석 매트릭스를 생성하였다.
다중 면역검정법을 이용하여, 259개 분자의 수준을 병리학-확인된 상피성 난소암을 지니는 149명의 환자 및 양성 난소 질환을 지니는 350명 개체로부터의 혈청에서 동시에 측정하였다 (도 1). 징후가 유사한 암과 양성 부인과 질환을 구별하는 바이오마커의 능력의 측정을 촉진하기 위해, 모든 샘플을 동일한 임상 집단 - 자궁부속기 종양의 존재에 기반하여 주로 수술이 제시된 여성으로부터 수득하였다. 모든 샘플을 어떠한 중재 전에 그리고 질병 상태가 알려지기 전에 수집하였다. 후속하여 절제된 조직의 병리학 조사에 의해 질병 상태를 확인하였다. 순응도에 대해 모니터되는 단일 샘플 수집 프로토콜을 이용하여 혈청을 수집하였다. 또한 프로토콜 고수에 대해 모니터되는 가망이 있는 11개 부위에서 연구를 수행하였다. 이것은 샘플 품질을 보장하며 수많은 다른 연구의 관심사인 샘플 세트에서 어떠한 수집, 프로세싱 또는 생물학적 바이어스의 가능성을 불식시킨다. 어떠한 정상적인 건강한 샘플을 본 연구에 사용하지 않았는데, 이들은 양성 질환보다 통상적으로 분류하기 쉽고 수술을 앞둔 환자에 비해 낮은 스트레스 수준과 같은 교란 요인을 도입시키기 때문이다. 예상된 바와 같이, 중간 환자 연령은 양성 질환에 걸린 개체 (51세)보다 난소암에 걸린 개체(61세)에서 더 높았고 존재하는 질병 단계에 따라 증가하였다 (도 1). 난소암 아류형의 분포는 US 집단에서 전체적으로 모든 난소암 병증에 대해 나타난 분포와 유사하였고, 장액 암종의 비율(55%)이 다른 아류형에 비해 컸다 (도 1). 연구에서의 양성 대조군은 낭샘종(cystadenoma), 낭샘섬유종(cystadenofibroma) 및 섬유종(fibroma)을 포함하는 일반적인 양성 난소 질환을 대표하였다.
일관성을 확보하고 바이오마커 비교를 돕기 위해, 모든 259개 마커 및 499개 샘플을 엄격히 자격을 갖춘 고 처리량 다중 면역검정법의 패널을 이용하여 단일 부위에서 단일 플랫폼 상에서 측정하였다. 이러한 조사는 본 발명자들의 104개 혈청 바이오마커에 대한 프로파일링을 이루었다. 본 연구에서 추가의 155개 혈청 바이오마커의 대다수는 암 바이오마커에서의 상당한 역할을 시사함이 타당한 문헌 지지를 갖는 마커에 특이적으로 표적화되는 두 NCI-펀딩된 스몰 비즈니스 이노베이티브 리서치 (SBIR) 어워드의 일부로서 개발되었다. 선택된 바이오마커는 암 항원, 호르몬, 응고 인자, 조직 모델링 인자, 지단백질 구성요소, 프로테아제 및 프로테아제 억제제, 심혈관계 위험성의 마커, 성장 인자, 사이토카인/케모카인, 세포-신호전달 수용체의 가용성 형태, 및 염증성 및 급성기 반응물을 포함하는 주로 암에 관련된 광범한 범위의 생물학적 기능을 담당한다 (도 2). 본 연구는 충분히 특성화된 품질-관리된 샘플을 이용한 분자의 면역검정 프로파일링의 가장 광범하고 가장 일관된 단일 연구이다.
각각의 바이오마커에 대해, ROC 곡선을 생성하고 이의 곡선하 면적 (AUC) 값을 충분한 정보가 없는 마커의 곡선하 면적 값과 비교하였다 (AUC = 0.500). 총 175개의 바이오마커가 양성 부인과 질환에 비해 난소암 샘플에서 이상조절되었다 (P-값>0.05). 이 중에서, 136개 바이오마커는 상향조절되었고 39개는 하향조절되었다 (도 3 및 4). 가장 큰 AUC 값을 갖는 바이오마커는 0.599 내지 0.933 범위의 값으로 난소암 (도 3, 4 및 5)에서 우세하게 상향조절되었다. 가장 상향조절된 마커는 각각 0.933 및 0.907의 AUC 값을 갖는 HE4 및 CA-125였고, 이어서 0.829 내지 0.800의 AUC 값을 갖는 인터류킨-2 수용체 α (IL-2 수용체 α), α1-항트립신, C-반응성 단백질, YKL-40, 세포 피브로넥틴, 암 항원 72-4 (CA-72-4) 및 프로스타신이었다 (도 3). 나머지 127개의 상향조절된 바이오마커는 0.797 내지 0.556의 연속된 AUC 값을 지녔다 (도 4). 남아 있는 127개 마커 중 34개는 0.700보다 높은 AUC 값을 지녔다. 하향조절된 바이오마커의 경우, AUC 값은 0.556 내지 0.745의 범위였다 (도 4). 이 중 가장 유익한 두 개는 트랜스티레틴 (0.745) 및 아포지단백질 A-IV (0.713)으로 나타난 반면, 나머지 바이오마커는 0.700 아래의 AUC 값을 지녔다.
가장 높은 AUC 값을 지니는 20개 바이오마커 중 13개, 즉 HE4, IL-2 수용체 α, YKL-40, 세포 피브로넥틴, CA 72-4, 프로스타신, MMP-7, VEGF-B, 칼프로텍틴, IGFBP-2, LOX-1, 뉴로필린-1 및 MPIF-1이 난소암에 대한 이들의 차별력을 결정하기 위해, 균일하게 제어된 분석적 조건하에 샘플의 코히런트 세트 상에서 함께 정밀하게 정량된 것은 처음이다. 이러한 접근법은 바이오마커 비교를 향상시키고 다중-바이오마커 패널의 개발에서 바이오마커의 선택을 도울 것이다.
본 연구에서 두 개의 가장 유익한 바이오마커간의 비교로서, HE4 및 CA-125에 대한 민감성을 소정 범위의 특이성 범위에 걸쳐 측정하였다. 또한, 특이성과 민감성의 최대 합계를 산출하는 것으로 정의되는 최적 컷오프 값을 각각의 바이오마커에 대해 계산하였다. HE4 단독에 대한 민감성은 특이성이 80%에서 99.6%로 증가함에 따라 89.0%에서 57.1%로 감소한 반면, CA-125 단독의 경우 민감성은 85.2%에서 30.2%로 감소하였다. HE4 및 CA-125에 대한 최적 컷오프는 각각 54.8 pM 및 52.5 U/mL이었고 각각 86.6% 및 74.5%의 민감성 값과 각각 89.4% 및 93.7%의 특이성 값을 제공하였다. ROC 곡선에서 예상된 바와 같이, 어떠한 개별적인 바이오마커도 소정의 높은 민감성 값에서 높은 특이성을 나타내지 않을 때 트레이드 오프(trade-off)가 존재한다. 예를 들어, 100% 민감성에서, HE4 및 CA-125 둘 모두는 0% 특이적이었다. 98% 민감성에서, HE4는 30.6% 특이성을 지녔고 CA-125는 35.4% 특이성을 지녔다. 그러나, 비교적 양호한 특이성 값을 보이기 위해, 민감성은 약 95%로 낮아져야 했다. 95% 민감성에서, HE4는 50.9% 특이성을 지녔고 CA-125는 45.4% 특이성을 지녔다. AUC 값과 함께 이러한 값들은 상기 집단에 대해, HE4가 CA-125보다 약간 더 좋게 작동함을 나타내었다. 또한, 이러한 결과는 본 연구에서 바이오마커 중 어떤 것도 광범한 적용을 위해 독립적인 난소암 바이오마커로서 충분히 유익하지 않고 그 바이오마커는 임상적으로 허용가능한 수준으로 성능을 향상시키는데 요구됨을 나타낸다.
일부 바이오마커가 암의 상이한 단계, 특히 초기 단계의 암에 더 큰 식별력을 지니는 지를 결정하기 위해, FIGO I기 및 II기 샘플 상에서 0.800 이상의 AUC 값을 갖는 9개의 바이오마커를 비교하였는데, 이는 마커-기반 검출을 위한 가장 큰 요구사항이다 (도 6). FIGO I기 샘플의 경우, HE4 및 CA-125 둘 모두는 매우 식별력이 있었고 (P-값<0.001), 이어서 C-반응성 단백질 및 CA 72-4 (P-값 0.001-0.01) 다음에 α1-항트립신, YKL-40 및 프로스타신 (P-값 0.01-0.05)으로 낮아지는 순서였다. IL2-수용체 α 및 세포 피브로넥틴의 경우, I기 암과 양성 질환 사이에 통계적 차이가 없었다 (P-값>0.05). FIGO II기 샘플의 경우, HE4 및 CA-125 둘 모두는 다시 매우 식별력이 있었고 (P-값<0.001), 이어서 IL2-수용체 α, α1-항트립신, YKL-40 및 CA 72-4 (P-값 0.001-0.01) 다음에 C-반응성 단백질 및 세포 피브로넥틴 (P-값 0.01-0.05)이었다. 프로스타신의 경우, 어떠한 통계적 차이도 없었다 (P-값>0.05).
양성 질환을 갖는 여성과 각각의 개별적인 아류형의 난소암을 갖는 여성간에 통계적으로 유의한 차이가 있는 지를 결정하기 위해 동일한 9개의 바이오마커를 평가하였다 (도 7). 투명 세포 암종의 경우, α1-항트립신 및 C-반응성 단백질은 매우 식별력이 있었고 (P-값<0.001), 이어서 HE4, CA-125 및 IL2-수용체 α (P-값 0.01-0.05)로 낮아지는 순서였다. YKL-40, 세포 피브로넥틴, CA 72-4 및 프로스타신의 경우 통계적 차이는 없었다 (P-값>0.05). 자궁내막유사 암종의 경우, HE4 및 CA-125 (P-값<0.001)에 대해 매우 현저한 차이가 있었고 C-반응성 단백질, 세포 피브로넥틴, CA 72-4 (P-값 0.01-0.05)에 대해 현저한 차이가 있었다. α1-항트립신, IL2-수용체 α, YKL-40 및 프로스타신의 경우, 통계적 차이는 없었다 (P-값>0.05). 점액 암종의 경우, CA 72-4만이 현저한 차이를 지녔다 (P-값 0.01-0.05). 장액 및 혼합 암종의 경우, 9개의 모든 바이오마커가 매우 현저한 차이를 지녔다 (P-값<0.001). 따라서, 점액 암종을 제외하고, 9개의 바이오마커는 모든 일반적인 난소암 아류형에 유익하지만, 이들의 상이한 식별력은 마커의 상이한 조합이 상이한 아류형에 유용할 수 있음을 시사한다. 점액 아류형에 더욱 유익한 바이오마커를 찾는 것이 바람직하였을 것이나, 이것은 비교적 드물다. 실제로, 연구에서의 암들 중 6.0%만이 점액 아류형을 지녔다 (도 1).
단순성 및 비용 유효성을 위해, 다수의 바이오마커에 비해 단일 바이오마커의 이용이 바람직하다. 그러나, 단일 바이오마커는 난소암과 같은 복합 질병 고유의 다양성을 잡아낼 수 없을 것이 명백하다. 유익한 시험은 각각의 마커가 전체 환자 집단 또는 다른 마커에 의해 만들어진 집단 세분에 상이한 유형의 식별력을 더하는 방식으로 다수의 바이오마커를 합치고자 한다. 단순히 말해, 또 다른 하나와 불충분한 상관관계를 갖는 마커는 또 다른 하나와 강력한 상관관계를 갖는 마커보다 패널에 개별적으로 기여할 더 큰 기회를 갖는다. 따라서, 상관관계 분석은 가장 강력한 난소암 마커 - 0.600보다 큰 AUC 값을 갖는 124개 바이오마커에 대해 수행되었다. 함께 변화하는(co-varying) 분자를 거리 척도로서 피어슨 상관관계 계수를 이용하여 계층 클러스터링으로 병합적으로 분류하였다. 페어-와이즈(pair-wise) 결과를 124×124 매트릭스 (0-123으로 번호 매김)로 어셈블링하고 히트 맵을 이용하여 디스플레이하였으며, 여기서 강렬한 레드 컬러는 강력한 양성 상관관계를 의미하고 블루는 음성 상관관계를 의미한다 (도 8). 4개의 주요 클러스터가 존재하였고 (클러스터 A 내지 D; 도 8-13), 각 클러스터는 서로 강력하게 상관관계가 있는 마커를 나타낸다. 이러한 클러스터 각각은 강력한 난소암 마커인 마커들을 함유하였다. 클러스터 A (마커 1-10)은 2개의 강력한 난소암 마커, CA 72-4 및 MPIF-1을 함유하였다 (도 9 및 10). TNFR2는 클러스터 B에서 발견되었다 (마커 58-67; 도 XXX (표 S3 및 S5). 클러스터 C (마커 79-87)는 2개의 가장 강력한 난소암 마커 (HE4, CA-125)는 물론 프로스타신과 VEGF-B를 함유하였다 (도 9 및 12). CA-125와 가장 강력한 상관관계는 메소텔린 (피어슨 상관관계 계수 = 0.600), 마스핀 (0.599), VEGF-D (0.568), 프로스타신 (0.551), 칼리크레인-7 (0.507) 및 VEGF-B (0.505)였다. 마스핀 (0.517)은 HE4와 가장 강한 상관관계를 나타내었고, 이어서 TIMP-1 (0.470), 프로스타신 (0.463), IL-2 수용체 α (0.424), VEGF-B (0.413) 및 VEGF-D (0.409)였다. 마지막으로, 가장 큰 클러스터 (클러스터 D; 바이오마커 32-55)는 칼프로텍틴, LOX-1, IL-6, YKL-40, 세포 피브로넥틴, 뉴로필린-1, α1-항트립신, TIMP-1, C-반응성 단백질 및 IL-2 수용체 α를 포함하는 여러 개의 우수한 난소암 마커를 함유하는 느슨한 상관관계를 나타내는 마커로 구성되었다 (도 9 및 13). 이러한 상관관계 데이터는 바이오마커 패널의 개발을 가동하는데 도움이 될 수 있고 난소암에서 붕괴된 경로를 간파할 수 있다.
0.800보다 큰 AUC 값을 지니는 9개 마커의 조합된 성능을 평가하여 단순한 다중-마커 시나리오의 예측 값을 결정하였다. 0.950의 AUC를 산출한 9개의 마커를 로지스틱 회귀분석을 이용하여 합쳤다 (표준 오차: 0.01213; 95% CI: 0.926-0.974; P-값: <0.0001). 이어서 이러한 성능을 FDA-승인된 OVA1 시험에서 5개의 마커에 대해 비교하였다. 본 연구에서 샘플을 부인과 종양학자가 수집하였다. 유사한 연구 집단은 100% 민감성 (침습성 난소암만) 및 32.9% 특이성을 갖는 OVA1 510(k) 개요로 보고되었다. 5개의 마커를 합치고 로지스틱 회귀분석 모델을 만들었다. OVA1 510(k) 개요와 일관되게, 이러한 샘플 세트 이용시, 32.9%의 특이성에서, OVA1 바이오마커는 98.0%의 민감성을 제공하였다. 흥미롭게도, 이러한 샘플 이용시, 32.9%의 특이성에서, CA-125만이 98.0%의 민감성을 지녔다. 이는 추가의 OVA1 마커가 어떤 것이라도 전체 분류에 거의 기여하지 않음을 나타내었다. 실제로, 5개의 OVA1 바이오마커에 대한 AUC 값은 0.912이었고 (표준 오차: 0.0157; 95% CI: 0.881-0.943; P-값: <0.0001), 0.907의 AUC를 갖는 (표준 오차: 0.01571; 95% CI: 0.877-0.938; P-값: <0.0001) CA-125 단독에 비해 거의 높지 않았다. 고정된 특이성 값에서 모델의 민감성 및 고정된 민감성 값에서 모델의 특이성을 결정함에 의해 2개의 모델을 추가로 비교하였다 (도 14 및 15). 일반적으로, 상위 9개 마커에 대해 세워진 로지스틱 회귀분석 모델은 ROC 곡선의 모든 포인트에서 OVA1 마커에 대해 세워진 모델을 능가하였다. 80 내지 95%의 고정된 특이성 값에서, 상위 9개 모델은 OVA1 마커에 대해 세워진 모델보다 8 내지 10%만큼 더욱 민감하였다. 보다 높은 특이성 (99%)에서, 상위 9개 모델은 약 19%만큼 더욱 민감하였다. 80 내지 99%의 고정된 민감성에서, 상위 9개 모델은 OVA1 마커에 대해 세워진 모델보다 8 내지 25%만큼 더욱 특이적이었다.
상위 9개 패널 및 OVA1 패널 둘 모두가 폐경전 및 폐경후 여성에 대해 상이하게 수행될 수 있는 마커를 함유하였기 때문에, 두 패널의 성능을 폐경 상태에 의해 비교하였다. 상위 9개 패널의 경우, 폐경전 여성에 대한 AUC 값(0.937)은 폐경후 여성(0.953)보다 낮았다. 이는 상위 3개의 개별적인 마커 (HE4, CA-125 및 IL2-Rα) 모두가 폐경후 여성 (각각 0.927, 0.927 및 0.824)(도 16)에 대해 폐경전 여성 (각각 0.912, 0.907 및 0.812)보다 양호하게 동작함을 입증한 개별적인 마커 분석과 일치하는 것이다. OVA1 패널의 경우, 폐경전 여성에 대한 AUC 값(0.920)은 폐경후 여성(0.924)보다 다소 낮았다. 다시, 이는 OVA1 패널을 성능을 가동시키는 것으로 보이는 마커인 CA-125가 폐경후 여성의 그룹(0.927)보다 폐경전 여성의 그룹(0.907)에서 보다 나쁘게 동작함을 입증한 개별적인 마커 분석과 일치하는 것이다.
양성 난소 질환을 갖는 여성으로부터 뽑아낸 샘플과 난소암을 갖는 여성으로부터 뽑아낸 샘플을 식별할 수 있는 새로운 바이오마커가 동정되었다. 9개의 가장 유익한 바이오마커에 대한 로지스틱 회귀분석을 이용한 예비 다변량 분석은 OVA1 바이오마커에 비해 현저하게 개선된 성능을 지니는 것으로 나타났다. 이러한 분석은 본 발명자들의 데이터가 OVA1 및 그 밖의 시험을 개선시킬 가능성을 지님을 나타낸다.

Claims (16)

  1. 피검체의 난소암 상태를 예측하는 방법으로서,
    피검체로부터 수득된 생물학적 유체의 샘플 중 CA-125 및 HE4의 수준을 측정하고, IL-2 수용체 알파 (IL-2Rα), 알파-1-항트립신 (AAT), C-반응성 단백질 (CRP), YKL-40, 세포 피브로넥틴 (cFib), 프로스타신, 메탈로프로테이나제 1의 조직 억제제 (TIMP-1), IL-8, IL-6, 혈관 내피 성장 인자 B (VEGF-B), 기질 메탈로프로테이나제-7 (MMP-7), 칼프로텍틴, 인슐린-유사 성장 인자-결합 단백질 2 (IGFBP-2), 렉틴-유사 산화 LDL 수용체 1 (LOX-1), 뉴로필린-1, TNFR2, 및 MPIF-1로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오마커의 수준을 측정하는 단계; 및
    측정치를 난소암 상태와 관련시키는 단계를 포함하는, 피검체의 난소암 상태를 예측하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 암 항원 72-4 (CA-72-4)의 수준을 측정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 난소암 상태가 난소암의 존재인 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 상태에 기반하여 피검체 치료를 관리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 피검체 치료를 관리한다는 것이 더 많은 시험을 지시하고, 수술을 수행하고, 추가 행위를 취하지 않는 것으로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
  6. 제 4항에 있어서, 피검체 관리 후 피검체로부터 수득된 생물학적 유체의 샘플 중 CA-125 및 HE4의 수준을 측정하고, 인터류킨-2 수용체 알파 (IL-2 수용체 알파), 알파-1-항트립신 (AAT), C-반응성 단백질 (CRP), YKL-40, 세포 피브로넥틴 (cFib), 암 항원 72-4 (CA-72-4), 프로스타신, 메탈로프로테이나제 1의 조직 억제제 (TIMP-1), IL-8, 기질 메탈로프로테이나제-7 (MMP-7), IL-6, 혈관 내피 성장 인자 B (VEGF-B), 칼프로텍틴, 인슐린-유사 성장 인자-결합 단백질 2 (IGFBP-2), 렉틴-유사 산화 LDL 수용체 1 (LOX-1), 뉴로필린-1, TNFR2, 및 MPIF-1로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오마커의 수준을 측정하고;
    측정치를 난소암 상태와 관련시키고;
    피검체 관리가 남소암 상태에서 변화를 발생시켰는지를 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 측정이 바이오마커의 존재 또는 부재를 검출하는 것, 바이오마커의 양을 정량하는 것, 및 바이오마커의 유형을 결정하는 것으로부터 선택되는 방법.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 바이오마커가 면역검정에 의해 측정되는 방법.
  9. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 관련시키는 것이 소프트웨어 분류 알고리듬에 의해 수행되는 방법.
  10. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 혈액, 혈청, 및 혈장으로부터 선택되는 방법.
  11. a) CA-125 및 HE4, 그리고 인터류킨-2 수용체 알파 (IL-2 수용체 알파), 알파-1-항트립신 (AAT), C-반응성 단백질 (CRP), YKL-40, 세포 피브로넥틴 (cFib), 암 항원 72-4 (CA-72-4), 프로스타신, 메탈로프로테이나제 1의 조직 억제제 (TIMP-1), IL-8, 기질 메탈로프로테이나제-7 (MMP-7), IL-6, 혈관 내피 성장 인자 B (VEGF-B), 칼프로텍틴, 인슐린-유사 성장 인자-결합 단백질 2 (IGFBP-2), 렉틴-유사 산화 LDL 수용체 1 (LOX-1), 뉴로필린-1, TNFR2, 및 MPIF-1로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오마커에 각각 선택적으로 결합하는 친화성 시약의 패널; 및
    b) CA-125 및 HE4, 그리고 인터류킨-2 수용체 알파 (IL-2 수용체 알파), 알파-1-항트립신 (AAT), C-반응성 단백질 (CRP), YKL-40, 세포 피브로넥틴 (cFib), 암 항원 72-4 (CA-72-4), 프로스타신, 메탈로프로테이나제 1의 조직 억제제 (TIMP-1), IL-8, 기질 메탈로프로테이나제-7 (MMP-7), IL-6, 혈관 내피 성장 인자 B (VEGF-B), 칼프로텍틴, 인슐린-유사 성장 인자-결합 단백질 2 (IGFBP-2), 렉틴-유사 산화 LDL 수용체 1 (LOX-1), 뉴로필린-1, TNFR2, 및 MPIF-1로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오마커를 각각 포함하는 컨테이너의 패널을 포함하는 키트.
  12. 제 11항에 있어서, 친화성 시약이 항체인 키트.
  13. 제 11항에 있어서, 피검체로부터의 샘플 중 바이오마커의 수준을 측정하기 위해 친화성 시약을 이용하기 위한 서면 지시서를 추가로 포함하는 키트.
  14. 제 11항에 있어서, 피검체의 난소암 상태를 결정하기 위해 키트를 이용하기 위한 서면 지시서를 추가로 포함하는 키트.
  15. CA-125 및 HE4, 그리고 인터류킨-2 수용체 알파 (IL-2 수용체 알파), 알파-1-항트립신 (AAT), C-반응성 단백질 (CRP), YKL-40, 세포 피브로넥틴 (cFib), 암 항원 72-4 (CA-72-4), 프로스타신, 메탈로프로테이나제 1의 조직 억제제 (TIMP-1), IL-8, 기질 메탈로프로테이나제-7 (MMP-7), IL-6, 혈관 내피 성장 인자 B (VEGF-B), 칼프로텍틴, 인슐린-유사 성장 인자-결합 단백질 2 (IGFBP-2), 렉틴-유사 산화 LDL 수용체 1 (LOX-1), 뉴로필린-1, TNFR2, 및 MPIF-1로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오마커를 포함하는 정제된 펩티드의 패널.
  16. 제 15항에 있어서, 펩티드 중 하나 이상이 검출가능한 표지를 포함하는 펩티드.
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