DE112012000990T5 - Biomarker-Panels, Diagnostische Verfahren und Testkits für Eierstockkrebs - Google Patents

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Abstract

Es werden Verfahren zum Vorhersagen von Anwesenheit, Subtyp und Stadium von Eierstockkrebs, sowie zum Prüfen der therapeutischen Wirksamkeit einer Krebsbehandlung und Bestimmen, ob ein Subjekt potentiell Krebs entwickelt, bereitgestellt. Assoziierte Testkits, Computer und analytische Systeme sowie Software und diagnostische Modelle werden ebenfalls bereitgestellt.

Description

  • Verwandte Anmeldungen
  • Diese Anmeldung beansprucht die Vorteile aus der am 24. Februar 2011 eingereichten vorläufigen US-Anmeldung Ser. Nr. 61/463 870, deren gesamter Inhalt hiermit durch die Bezugnahme darauf hierin eingezogen ist.
  • Erklärung zu Förderung seitens der Regierung:
  • Der Gegenstand der vorliegenden Anmeldung umfasst Arbeiten, die unter der SBIR Zuschuss Nr. HHSN261200800045C mit dem Titel ”Verbesserung eines vielversprechenden MAP für Eierstockkrebs” vom National Cancer Institute unterstützt wurden.
  • Gebiet der Erfindung:
  • Diese Erfindung stellt Verfahren zur Vorhersage und Diagnose von Eierstockkrebs, insbesondere epithelialem Ovarialkrebs, bereit und sie stellt weiterhin damit verbundene analytische Reagenzien, diagnostische Modelle, Testkits und klinische Berichte zur Verfügung.
  • Hintergrund:
  • Die American Cancer Society schätzt, dass Eierstockkrebs im Jahr 2007 in den Vereinigten Staaten 22.430 Frauen betreffen und 15.280 Frauen das Leben kosten wird. Eierstockkrebs ist jedoch nicht eine einzelne Krankheit, und es gibt tatsächlich mehr als 30 Typen und Unterarten von Eierstock-Malignitäten, jeweils mit ihrer eigenen Pathologie und ihrem eigenen klinischem Verhalten. Die meisten Experten ordnen Eierstockkrebse daher in drei große Kategorien ein, je nach der Art der Zellen, aus denen sie gebildet wurden: epitheliale Tumoren entstehen aus Zellen, die die Eierstöcke auskleiden oder bedecken; Keimzelltumoren gehen von Zellen aus, die dazu bestimmt sind, Eizellen innerhalb der Eierstöcke zu bilden; und Keimstrang-Stromazelltumoren gehen von den Bindegewebszellen aus, die die Eierstöcke zusammenhalten und weibliche Hormone produzieren.
  • Gängige epitheliale Tumoren beginnen im Oberflächenepithel der Eierstöcke und machen etwa 90 Prozent aller Eierstockkrebse in den USA aus (und die folgenden Prozentsätze reflektieren die Häufigkeit dieser Krebse in den USA). Sie werden weiter in eine Reihe von Subtypen unterteilt – einschließlich serösen, endometrioiden, muzinösen und klarzelligen Tumoren – die weiter als gutartige oder bösartige Tumoren unterklassifiziert werden können. Seröse Tumoren sind die am weitesten verbreiteten Formen von Eierstockkrebs. Auf sie entfallen 40 Prozent der üblichen epithelialen Tumoren. Etwa 50 Prozent dieser serösen Tumoren sind bösartig, 33 Prozent sind gutartig, und 17 Prozent sind an der Grenze zur Malignität. Seröse Tumoren treten am häufigsten in Frauen auf, die zwischen 40 und 60 Jahre alt sind.
  • Endometrioide Tumoren machen etwa 20 Prozent der gängigen epithelialen Tumoren aus. In etwa 20 Prozent der Individuen sind diese Krebsarten mit Endometriumkarzinom (Krebs der Gebärmutterauskleidung bzw. -schleimhaut) verbunden. In 5 Prozent der Fälle sind sie auch mit Endometriose, einem abnormen Auftreten von Endometrium (Gebärmutterschleimhaut-Gewebe) innerhalb der Beckenhöhle, verknüpft. Die Mehrheit (etwa 80 Prozent) dieser Tumoren sind bösartig, und der Rest (rund 20 Prozent) sind üblicherweise Grenzfälle zur Malignität bzw. ”Borderline”-Malignitäten. Endometrioide Tumoren treten vor allem bei Frauen auf, die zwischen 50 und 70 Jahre alt sind.
  • Klarzellige Tumoren machen etwa 6 Prozent der gängigen epithelialen Tumoren aus. Fast alle diese Tumoren sind bösartig. Etwa die Hälfte aller klarzelligen Tumoren sind mit Endometriose verbunden. Die meisten Patientinnen mit klarzelligen Tumoren sind zwischen 40 und 80 Jahre alt.
  • Muzinöse Tumoren machen etwa 1 Prozent aller gängigen epithelialen Tumoren aus. Die meisten (ungefähr 80 Prozent) dieser Tumoren sind gutartig, 15 Prozent sind an der Grenze zur Malignität, und nur 5 Prozent sind bösartig. Muzinöse Tumoren erscheinen am häufigsten bei Frauen, die 30 bis 50 Jahre alt sind.
  • Eierstockkrebs ist die bei weitem die tödlichste der gynäkologischen Krebserkrankungen, die für mehr als 55 Prozent aller gynäkologischen Krebs-Todesfälle verantwortlich ist. Aber Eierstockkrebs zählt auch zu den am besten behandelbaren Krebsarten – wenn er früh erkannt wird. Wenn Eierstockkrebs frühzeitig erkannt und angemessen behandelt wird, beträgt die 5-Jahres-Überlebensrate 93 Prozent. Siehe zum Beispiel, Luce et al, ”Early Diagnosis Key to Epithelial Ovarian Cancer Detection,” The Nurse Practitioner, Dez. 2003, auf S. 41. Umfangreiche Hintergrundinformationen über Eierstockkrebs kann man leicht über das Internet abrufen, zum Beispiel von ”Overview: Ovarian Cancer (Übersicht: Eierstockkrebs)” der Cancer Reference Information, die von der American Cancer Society bereitgestellt wird, und den NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology TM Ovarian Cancer V.1.2007.
  • Die derzeitige Realität bei der Diagnose von Eierstockkrebs ist, dass die meisten Fälle – 81 Prozent aller Fälle von Eierstockkrebs – nicht im frühesten Stadium erkannt werden. Dies liegt daran, dass Eierstockkrebs im Frühstadium sehr schwer zu diagnostizieren ist. Seine Symptome können an diesem Zeitpunkt nicht augenscheinlich sein oder bemerkt werden. Oder Symptome – wie Blähungen, Verdauungsstörungen, Durchfall, Verstopfung und sonstige – können vage und mit vielen gängigen und weniger schweren Erkrankungen verbunden sein. Am bedeutsamsten ist, dass, es keinen wirksamen Test zur Früherkennung gegeben hat. Ein wirksames Instrument zur frühen und präzisen Erkennung von Eierstockkrebs ist eine kritische unerfüllte medizinische Notwendigkeit.
  • Was dringend auf dem Gebiet der gynäkologischen Onkologie erforderlich gewesen war, ist ein minimal-invasiver (vorzugsweise Serum-basierter) klinischer Test für die Beurteilung und die Vorhersage der Präsenz von Eierstockkrebs, der auf einem robusten Satz von Biomarkern und Probenmerkmalen, die aus einem großen und vielfältigen Satz von Proben identifiziert werden, basiert, zusammen mit Verfahren und zugehörigen Computer-Systemen und Software-Tools, um Eierstockkrebs mit hoher Genauigkeit bei seinen verschiedenen Stadien vorherzusagen, zu diagnostizieren und zu verfolgen.
  • Zusammenfassung der Erfindung:
  • Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemein Krebsbiomarker und insbesondere mit Eierstockkrebs assoziierte Biomarker. Sie stellt Verfahren zur Vorhersage, beurteilenden Diagnose und Überwachung von Krebs, insbesondere Eierstockkrebs, durch Messen bestimmter Biomarker bereit, und stellt ferner einen Satz oder eine Anordnung von Reagenzien bereit, um die Expressionsspiegel von Biomarkern, die mit Eierstockkrebs assoziiert sind, auszuwerten. Ein bevorzugter Satz von Biomarkern liefert eine nachweisbare molekulare Signatur von Eierstockkrebs in einem Subjekt. Die Erfindung stellt einen prädiktiven oder diagnostischen Test für Eierstockkrebs, insbesondere für epithelialen Eierstockkrebs, und ganz besonders für Frühphasen-Eierstockkrebs (d. h. Stufe I, Stufe II oder Stufe I und II zusammen) bereit.
  • In einem Aspekt betrifft die vorliegende Offenbarung im Allgemeinen ein Verfahren zum Vorhersagen des Eierstockkrebs-Status eines Subjekts, das die Schritte des Messens des Spiegels von CA-125 und HE4 und Messens des Spiegels von einem oder mehreren Biomarker(n), die ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus IL-2-Rezeptor-alpha (IL-2Rα), Alpha-1-Antitrypsin (AAT), C-Reaktivem Protein (CRP), YKL-40, Zellulärem Fibronectin (cFib), Prostasin, Gewebe-Inhibitor von Metalloproteinasen 1 (TIMP-1), IL-8, IL-6, Vaskulär-Endothelial-Wachstumsfaktor B (VEGF-B), Matrix-Metalloproteinase-7 (MMP-7), Calprotectin, Insulin-ählicher-Wachstumsfaktor-Bindungsprotein 2 (IGFBP-2), Lectin-ähnlichem Oxidiertes-LDL-Rezeptor 1 (LOX-1), Neuropilin-1, TNFR2 und MPIF-1 besteht, in einer Probe eines biologischen Fluids, die aus einer Patientin erhalten wurde; und das Korrelieren der Messungen mit dem Eierstockkrebs-Status beinhaltet.
  • In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Kit, enthaltend eine Palette bzw. ein Panel von Affinitätsreagenzien, die jeweils selektiv an CA-125 und HE4 binden, und einen oder mehrere Biomarker, die aus der Gruppe gewählt sind, die aus Interleukin-2-Rezeptor-alpha (IL-2-Rezeptor alpha), Alpha-1-Antitrypsin (AAT), C-reaktivem Protein (CRP), YKL-40, Zellulärem Fibronectin (cFib), Krebs-Antigen 72-4 (CA-72-4), Prostasin, Gewebe-Inhibitor von Metalloproteinasen 1 (TIMP-1), IL-8, Matrix-Metalloproteinase-7 (MMP-7), IL-6, Vaskulär-Endothelial-Wachstumsfaktor B (VEGF-B), Calprotectin, Insulin-ählicher-Wachstumsfaktor-Bindungsprotein 2 (IGFBP-2), Lectin-ähnlichem Oxidiertes-LDL-Rezeptor 1 (LOX-1), Neuropilin-1, TNFR2 und MPIF-1 besteht, und eine Reihe von Behältern, jeweils umfassend CA-125 und HE4, und einen oder mehrere Biomarker, gewählt aus der Gruppe, die aus Interleukin-2-Rezeptor-alpha (IL-2-Rezeptor alpha), Alpha-1-Antitrypsin (AAT), C-reaktivem Protein (CRP), YKL-40, Zellulärem Fibronectin (cFib), Krebs-Antigen 72-4 (CA-72-4), Prostasin, Gewebe-Inhibitor von Metalloproteinasen 1 (TIMP-1), IL-8, Matrix-Metalloproteinase-7 (MMP-7), IL-6, Vaskulärem endothelialien Wachstumsfaktor B (VEGF-B), Calprotectin, Insulin-ählicher-Wachstumsfaktor-Bindungsprotein 2 (IGFBP-2), Lectin-ähnlichem Oxidiertes-LDL-Rezeptor 1 (LOX-1), Neuropilin-1, TNFR2 und MPIF-1 besteht.
  • In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Offenbarung eine Palette bzw. ein Panel von gereinigten Peptiden, die CA-125 und HE4 enthalten, und einem oder mehreren Biomarkern, gewählt aus der Gruppe, die aus Interleukin-2-Rezeptor-alpha (IL-2-Rezeptor alpha), Alpha-1-Antitrypsin (AAT), C-reaktivem Protein (CRP), YKL-40, Zellulärem Fibronectin (cFib), Krebs-Antigen 72-4 (CA-72-4), Prostasin, Gewebe-Inhibitor von Metalloproteinasen 1 (TIMP-1), IL-8, Matrix-Metalloproteinase-7 (MMP-7), IL-6, Vaskulärem endothelialien Wachstumsfaktor B (VEGF-B), Calprotectin, Insulin-ählicher-Wachstumsfaktor-Bindungsprotein 2 (IGFBP-2), Lectin-ähnlichem Oxidiertes-LDL-Rezeptor 1 (LOX-1), Neuropilin-1, TNFR2 und MPIF-1 besteht.
  • In verschiedenen Ausführungsformen von beliebigen der oben genannten Aspekte oder jedwedem anderen Aspekt der hierin umschriebenen Offenbarung, umfassen die Verfahren das Messen des Spiegels von Krebs-Antigen 72-4 (CA-72-4). In einer weiteren Ausführungsform ist der Eierstockkrebs-Status das Vorhandensein von Eierstockkrebs. In weiteren Ausführungsformen ist der Eierstockkrebs Eierstockkrebs der Stufe I. In noch einer anderen Ausführungsform ist der Eierstockkrebs Stufe-II-Eierstockkrebs. In anderen Ausführungsformen ist der Eierstockkrebs Stufe-III-Eierstockkrebs. In noch einer anderen Ausführungsform ist der Eierstockkrebs Stufe-IV-Eierstockkrebs. In weiteren Ausführungsformen ist der Eierstockkrebs Eierstockkrebs in der Stufe I, II, III oder IV. In anderen Ausführungsformen umfasst das Verfahren ferner das Verwalten der Behandlung des Subjekts basierend auf dem Status. In noch einer anderen Ausführungsform wird das Verwalten der Behandlung des Subjekts ausgewählt aus der Gruppe, die aus dem Anordnen von weiteren Tests, dem Durchführen einer chirurgischen Operation, und dem Unterlassen weiterer Aktionen besteht. In noch einer anderen Ausführungsform umfasst das Verfahren das Messen des Spiegels von CA-125 und HE4 und das Messen des Spiegels von einem oder mehren Biomarkern, gewählt aus der Gruppe, die aus Interleukin-2-Rezeptor-alpha (IL-2-Rezeptor-alpha), Alpha-1-Antitrypsin (AAT), C-reaktivem Protein (CRP), YKL-40, Zellulärem Fibronectin (cFib), Krebs-Antigen 72-4 (CA-72-4), Prostasin, Gewebe-Inhibitor von Metalloproteinasen 1 (TIMP-1), IL-8, Matrix-Metalloproteinase-7 (MMP-7), IL-6, Vaskulärem Endothelialien Wachstumsfaktor B (VEGF-B), Calprotectin, Insulin-ählicher-Wachstumsfaktor-Bindungsprotein 2 (IGFBP-2), Lectin-ähnlichem Oxidiertes-LDL-Rezeptor 1 (LOX-1), Neuropilin-1, TNFR2 und MPIF-1 besteht, in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit, die aus dem Subjekt nach dem Verwalten des Subjekts erhalten wurde; das Korrelieren der Messungen mit dem Eierstockkrebs-Status; und das Bestimmen, ob das Verwalten des Subjekts zu einer Änderung beim Eierstockkrebs-Status führte. In anderen Ausführungsformen wird die Messung aus dem Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit der Biomarker, dem Quantifizieren der Menge an Biomarkern und dem Qualifizieren des Typs des Biomarkers ausgewählt. In bestimmten Ausführungsformen werden die Biomarker durch einen Immunassay gemessen. In weiteren Ausführungsformen wird das Korrelieren durch einen Software-Klassifikationsalgorithmus durchgeführt. In noch einer anderen Ausführungsform wird die Probe aus Blut, Serum und Plasma ausgewählt. In manchen Ausführungsformen ist das Affinitätsreagens ein Antikörper. In noch einer anderen Ausführungsform können die Kits weiterhin schriftliche Anweisungen für die Verwendung des Affinitätsreagens zum Messen der Spiegel der Biomarker in einer Probe aus einem Subjekt einschließen. In noch einer anderen Ausführungsform schließen die Kits schriftliche Anweisungen für die Verwendung des Kits zum Bestimmen des Eierstockkrebs-Status eines Subjekts ein. In bestimmten Ausführungsformen weisen eines oder mehrere der Peptide eine nachweisbare Markierung auf.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Vorhersage des Eierstockkrebs-Status eines Subjekts bereitgestellt, welche die folgenden Schritte umfasst: Bestimmen der Konzentration von CA-125 und HE4 in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit aus dem Subjekt und des Alters des Subjekts (zusammen die ”Biomarker”); und Auswerten der Biomarker, wobei eine Änderung beim Spiegel oder Auswerten der Biomarker, verglichen mit einer Kontrollgruppe von Patientinnen, die keinen Eierstockkrebs haben, voraussagt, dass das Subjekt Eierstockkrebs hat. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform umfasst das vorstehende Verfahren ferner die Auswertung des Menopausen-Status eines Subjekts als entweder post-menopausal oder nicht-postmenopausal, und die Konzentrationen von CA15-3 und CA72-4 in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit aus dem Subjekt.
  • Eine Vielzahl zusätzlicher Biomarker wird ebenfalls mit den vorstehenden Biomarkern in zusätzlichen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ausgewertet. Dazu gehören: Vaskulärer Endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF), Interleukin-2-Rezeptor alpha (IL-2-Rezeptor alpha), Insulin-ähnlicher-Wachstumsfaktor-Bindungsprotein 2 (IGFBP-2), Haptoglobin, Ferritin (FRTN), Prostasin, Interleukin-8 (IL-8), Maspin, Osteopontin, Serum-Amyloid-P-Komponente (SAP), Plättchen-abgeleiteter Wachstumsfaktor BB (PDGF-BB) und B-Zell-aktivierender Faktor (BAFF). Optional werden auch bestimmte zusätzliche Biomarker ausgewertet: Calprotectin, von-Willebrand-Faktor (vWF), Alpha-1-Antitrypsin (AAT), C-reaktives Protein (CRP), Interleukin-6 (IL-6), Leptin, Transthyretin (TTR), Carcinoembryonisches Antigen (CEA), Insulin-ähnlicher-Wachstumfaktor-Bindungsprotein 1 (IGFBP-1) und Thyroxin-bindendes Globulin (TBG).
  • In bevorzugten Ausführungsformen erfolgt die Auswertung durch ein Verfahren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: logistischer Regression, Nachschlagetabellen, Entscheidungsbaum, Support-Vektor-Maschine, Clusteranalyse, Nachbar-Analyse, genetischer Algorithmus, Bayes- und Nicht-Bayes-Ansätze und dergleichen. Zusätzlich wird die Probe vorzugsweise aus der Gruppe der aus einer Patientin entnommenen Flüssigkeiten und Gewebe, die Blut, Serum, Plasma, Lymphe, Liquor, Aszites, Urin und Gewebebiopsie einschließen, ausgewählt.
  • In anderen bevorzugten Ausführungsformen schließen die Verfahren der vorliegenden Erfindung auch den Schritt der Bereitstellung eines schriftlichen oder elektronischen Berichts der Vorhersage von Eierstockkrebs ein, und gegebenenfalls beinhaltet der Bericht eine Vorhersage über das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein oder die Wahrscheinlichkeit von Eierstockkrebs in dem Subjekt oder das geschichtete Risiko von Eierstockkrebs für das Subjekt, gegebenenfalls gemäß dem Stadium bzw. der Stufe des Krebses.
  • Andere bevorzugte Ausführungsformen stellen ein Verfahren bereit, in dem a) die Summe aus Empfindlichkeit und Spezifität für das Verfahren mehr als etwa 150% beträgt, wenn die Empfindlichkeit größer als etwa 95% ist, oder b) die Summe aus Empfindlichkeit und Spezifizität für das Verfahren größer als etwa 170% ist, wenn die Spezifität über 95% beträgt; und c) die vorangehende Summe aus Empfindlichkeit und Spezifität durch Analyse eines Satzes von Proben, der mindestens etwa 50 Krebsproben und 150 gutartige Proben umfasst, untermauert wird.
  • Sätze von Reagenzien, Testkits und Multianalyt- und ELISA-Panels und Kits werden zur Verfügung gestellt, um die vorgenannten Verfahren zu bewerkstelligen.
  • Zu weiteren Biomarkern, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, zählen die folgenden, die als ein oder mehrere zusätzliche Marker in den Verfahren der nachstehend beigefügten Ansprüche 1 bis 4 bestimmt werden können: Prostata-Saure Phosphatase (PAP), Epidermaler-Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR), Cathepsin D, YKL-40, Matrix-Metalloproteinase-7 (MMP-7), Vaskulär-Endothelial-Wachstumsfaktor D (VEGF-D), Gewebe-Inhibitor von Metalloproteinasen 1 (TIMP-1), Mesothelin (MSLN), Sortilin, Zelluläres Fibronectin (cFib), Osteoprotegerin (OPG), EN-RAGE, CD40-Antigen (CD40), Lectin-ähnlicher-Oxidiertes-LDL-Rezeptor 1 (LOX-1), Neuropilin-1, Fetuin-A, Resistin, Matrix-Metalloproteinase-2 (MMP-2), Peroxiredoxin 4 (Prx-IV), Phosphoserin-Aminotransferase (PSAT), Alpha-1-Mikroglobulin (A1Micro), Heparin-bindender EGF-ähnlicher Wachstumsfaktor (HB-EGF), Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF), Trefoil-Faktor 3 (TFF3), Komplement-Faktor H, Clusterin (CLU), Aldose-Reduktase, Makrophagen-Migration-inhibierender Faktor (MIF), Amphiregulin (AR), Makrophagen-Inflammatorisches-Protein-1 alpha (MIP-1 alpha), FASLG-Rezeptor (FAS), Vaskulär-Endothelial-Wachstumsfaktor-Rezeptor 1 (VEGFR-1), Matrix-Metalloproteinase-1 (MMP-1), Monozyten-Chemotaxis-Protein 2 (MCP-2) und Vaskulär-Endothelial-Wachstumsfaktor B (VEGF-B).
  • In noch anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden drei oder mehrere beliebige der folgenden Biomarker bestimmt und ausgewertet: HE4, CA-125, IL-2-Rezeptor-alpha, AAT, CRP, YKL-40, Fibronectin und CA-72-4.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden die Spiegel der folgenden Biomarker, gegebenenfalls einschließlich HE4, bestimmt und ausgewertet, in einigen Fällen mit einer Bestimmung des Alters: CA-125, CA72-4, VEGF-B, Maspin, VEGF-D und YKL-40; CA-125, CA72-4, VEGF-B, Maspin, VEGF-D, YKL-40, OSP, Alter und CRP; CA-125, CA72-4, VEGF-B, Maspin, und OSP; CA-125, CA72-4, VEGF-B, Maspin, YKL-40 und Alter; CA-125, Maspin und Alter; CA-125, CA72-4, VEGF-B, Maspin, OSP und Alter; CA-125, VEGF-B und Alter.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden die Werte der folgenden Biomarker, gegebenenfalls einschließlich HE4, bestimmt und ausgewertet: HE4, Krebs-Antigen 125 (CA-125), Krebs-Antigen 72-4 (CA-72-4), Krebs-Antigen 15-3 (CA-15-3), Alter, Insulin-ähnlicher-Wachstumsfaktor-Bindungsprotein 2 (IGFBP-2), Interleukin-2-Rezeptor alpha (IL-2-Rezeptor alpha); HE4, Krebs-Antigen 125 (CA-125) und YKL-40, gegebenenfalls auch einschließlich Alter; HE4, Krebs-Antigen 72-4 (CA-72-4), Krebs-Antigen 15-3 (CA-15-3), Alter, Insulin-ähnlicher-Wachstumsfaktor-Bindungsprotein 2 (IGFBP-2) und Interleukin-2-Rezeptor-alpha (IL-2-Rezeptor-alpha); CA-125, CA-72-4, Prostasin, CA-15-3, Alter, IL-2-Rezeptor-alpha, IL-8, gegebenenfalls auch einschließlich HE4; und CA-125, CA-72-4, Prostasin, CA-15-3, Alter, IL-2-Rezeptor-alpha, IL-8, FRTN. VEGF, Osteopontin, Maspin und Haptoglobin, gegebenenfalls auch einschließlich Alter.
  • Genauer gesagt, liefern prädiktive Tests und die damit verbundenen Verfahren und Produkte auch nützliche klinische Informationen über das Stadium der Eierstockkrebs-Progression, d. h.: Stufe I, Stufe II, Stufe III und Stufe IV, und ein fortgeschrittenes Stadium, dass die relativ fortgeschrittenen Tumoren widerspiegelt, die nicht ohne weiteres entweder als Stufe III oder Stufe IV klassifiziert werden können. Insgesamt betrifft die Erfindung auch neu festgestellte Korrelationen zwischen den relativen Spiegeln der Expression bestimmter Gruppen von Markern in Körperflüssigkeiten, bevorzugt Serum und Plasma, und dem Eierstockkrebs-Status eines Subjekts.
  • In einer Ausführungsform stellt die Erfindung einen Satz von Reagenzien bereit, um die Expressionsspiegel von einem Panel oder Auswahlsatz von Biomarker in einer aus einer Patientin entnommen Flüssigkeitsprobe, wie Blut, Serum, Plasma, Lymphe, Liquor, Aszites oder Urin, zu messen. Die Reagenzien in einer weiteren Ausführungsform sind ein Multianalyt-Panel-Assay, umfassend Reagenzien, um die Expressionsspiegel dieser Biomarker-Panels auszuwerten.
  • In Ausführungsformen der Erfindung wird eine Probe eines Subjekts aus Gewebeproben, wie einer Gewebe-Biopsie, oder aus primären Zellkulturen oder Kulturflüssigkeit hergestellt. In einer weiteren Ausführungsform wird die Expression der Biomarker auf der Polypeptid-Ebene bestimmt. Verwandte Ausführungsformen verwenden Immunoassays, Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assays und Multiplex-Immunassays für diesen Zweck.
  • Bevorzugte Panels von Biomarkern sind aus der Gruppe gewählt, bestehend aus den folgenden Sätzen von Molekülen und deren messbaren Fragmenten: (a) Myoglobin, CRP (C-reaktives Protein), FGF-basisches Protein und CA 19-9; (b) Hepatitis C NS4, Ribosomal-P-Antikörper und CRP; (c) CA 19-9, TGF alpha, EN-RAGE, EGF und HSP 90 alpha-Antikörper, (d) EN-RAGE, EGF, CA 125, Fibrinogen, Apolipoprotein CIII, EGF, Choleratoxin und CA 19-9; (e) Proteinase 3(cANCA)-Antikörper, Fibrinogen, CA 125, EGF, CD40, TSH, Leptin, CA 19-9 und Lymphotactin; (f) CA125, EGFR, CRP, IL-18, Apolipoprotein CIII, Tenascin C und Apolipoprotein A1; (g) CA125, Beta-2-Mikroglobulin, CRP, Ferritin, TIMP-1, Creatinkinase-MB und IL-8; (h) CA125, EGFR, IL-10, Haptoglobin, CRP, Insulin, TIMP-1, Ferritin, Alpha-2-Makroglobulin, Leptin, IL-8, CTGF, EN-RAGE, Lymphotactin, TNF-alpha, IGF-1, TNF RII, von-Willebrand-Faktor und MDC; (i) CA-125, CRP, EGF-R, CA-19-9, Apo-AI, Apo-CIII, IL-6, IL-18, MIP-1a, Tenascin C und Myoglobin; (j) CA-125, CRP, EGF-R, CA-19-9, Apo-AI, Apo-CIII, IL-6, MIP-1a, Tenascin C und Myoglobin; und (k) ein beliebiges der Biomarker-Panels, die in der Tabelle II und Tabelle III dargestellt sind.
  • In einer anderen Ausführungsform können die Reagenzien, die solche Biomarker messen, andere molekulare Spezies messen, die stromaufwärts oder stromabwärts in einem biochemischen Weg gefunden werden, oder Fragmente solcher Biomarker und molekularen Spezies messen. In manchen Fällen kann das gleiche Reagenz akkurat einen Biomarker und seine Fragmente messen.
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf bindende Moleküle (oder Bindungsreagenzien), um die Biomarker und verwandte Moleküle und Fragmente zu messen. In Betracht gezogene Bindungsmoleküle schließen Antikörper, sowohl monoklonale als auch polyklonale, Aptamere und dergleichen ein.
  • Andere Ausführungsformen schließen solche Bindungsreagenzien ein, die in der Form eines Test-Kit bereitgestellt werden, gegebenenfalls zusammen mit schriftlichen Anleitungen zum Durchführen einer Auswertung von Biomarkern, um die Wahrscheinlichkeit von Eierstockkrebs in einem Subjekt vorherzusagen.
  • In anderen ihrer Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Vorhersage der Wahrscheinlichkeit von Eierstockkrebs in einem Subjekt bereit, basierend auf dem Erfassen oder Messen der Spiegel der vorangehenden Biomarker in einer Stichprobe oder biologischen Probe aus dem Subjekt. Wie in dieser Patentschrift beschrieben, ist eine Veränderung in den Expressionsspiegeln dieser Biomarker, insbesondere ihren relativen Expressionshöhen, im Vergleich zu einer Kontrollgruppe von Patientinnen, die keinen Eierstockkrebs aufweisen, eine Vorhersage von Eierstockkrebs in diesem Subjekt.
  • In anderen ihrer Aspekte handelt es sich bei dem Typ von Eierstockkrebs, der vorhergesagt wird, um seröse, endometrioide, muzinöse und klarzellige Tumoren. Und die Vorhersage von Eierstockkrebs beinhaltet die Vorhersage eines bestimmten Stadiums der Erkrankung, wie etwa Tumoren der Stufe I (IA, IB oder IC), II, III und IV.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung die Erstellung eines Berichts für einen Arzt über die relativen Spiegel der Biomarker und die Übertragung eines solchen Berichts per Post, Fax, E-Mail oder auf andere Weise. In einer Ausführung wird ein Datenstrom, der die Berichte der Biomarker-Auswertungen enthält, über das Internet übertragen. In einer weiteren Ausführungsform enthält der Bericht die Vorhersage über das Vorhandensein oder die Abwesenheit von Eierstockkrebs in dem Subjekt oder das geschichtete Risiko von Eierstockkrebs für das Subjekt, gegebenenfalls gemäß Subtyp oder Stadium des Krebses.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die vorausgehende Auswertung von Biomarker-Expressionsspiegeln zu diagnostischen Zwecken mit anderen diagnostischen Verfahren kombiniert, wie Magen-Darm-Trakt-Auswertung, Thorax-Röntgenuntersuchung, HE4-Test, CA-125-Test, Komplett-Blutbild, Ultraschall oder Bauch/Becken-Computertomographie, Blutwerten bzw. Blutchemieprofil und Leberwerten bzw. Leberfunktionstests.
  • Noch andere Ausführungsformen der Erfindung beziehen sich auf die Auswertung von Proben, die aus einem Subjekt entnommen wurden, das symptomatisch für Eierstockkrebs ist oder ein hohes Risiko für Eierstockkrebs aufweist. Andere Ausführungen beziehen sich auf Subjekte, die asymptomatisch für Eierstockkrebs sind. Symptomatische Subjekte weisen eines oder mehrere von Folgendem auf: pelvine Geschwulst; Aszites; Abdominaldistention, allgemeine Bauchbeschwerden und/oder -schmerzen (Gas, Verdauungsstörungen, Druck, Schwellung, Blähungen, Krämpfe); Übelkeit, Durchfall, Verstopfung oder häufiges Wasserlassen; Verlust des Appetits; Völlegefühl sogar nach einer leichten Mahlzeit; Gewichtszunahme oder -verlust ohne bekannte Ursache; und abnormale Blutung aus der Vagina. Die Spiegel von Biomarkern können mit den Ergebnissen derartiger Symptome für eine Diagnose von Eierstockkrebs kombiniert werden.
  • Ausführungsformen der Erfindung sind sehr genau für die Bestimmung der Gegenwart von Eierstockkrebs. Mit ”sehr genau” ist eine Empfindlichkeit und eine Spezifität gemeint, die jeweils mindestens etwa 85 Prozent oder höher, stärker bevorzugt mindestens etwa 90 Prozent oder 92 Prozent, und am meisten bevorzugt mindestens etwa 95 Prozent oder 97 Prozent genau sind. Ausführungsformen der Erfindung beinhalten ferner Verfahren mit einer Empfindlichkeit von mindestens etwa 85 Prozent, 90 Prozent oder 95 Prozent und einer Spezifität von mindestens etwa 55 Prozent, 65 Prozent, 75 Prozent, 85 Prozent oder 90 Prozent oder höher. Andere Ausführungsformen schließen Verfahren mit einer Spezifität von mindestens etwa 85 Prozent, 90 Prozent oder 95 Prozent und einer Empfindlichkeit von mindestens etwa 55 Prozent, 65 Prozent, 75 Prozent, 85 Prozent oder 90 Prozent oder höher ein.
  • Ausführungsformen der Erfindung in Bezug auf Empfindlichkeit und Spezifität sind für eine Population von Subjekten, die symptomatisch für Eierstockkrebs sind und Eierstockkrebs haben, im Vergleich zu einer Kontrollgruppe von Subjekten, die symptomatisch für Eierstockkrebs sind aber keinen Eierstockkrebs haben, bestimmt. In einer anderen Ausführungsform werden Empfindlichkeit und Spezifität für eine Population von Subjekten bestimmt, die ein erhöhtes Risiko für Eierstockkrebs haben und Eierstockkrebs aufweisen, im Vergleich zu einer Kontrollgruppe von Subjekten, die ein erhöhtes Risiko für Eierstockkrebs haben aber keinen Eierstockkrebs aufweisen. Und in einer anderen Ausführungsform werden Empfindlichkeit und Spezifität für eine Population von Subjekten bestimmt, die symptomatisch für Eierstockkrebs sind und Eierstockkrebs aufweisen, im Vergleich zu einer Kontrollgruppe von Subjekten, die nicht für Eierstockkrebs symptomatisch sind, aber keinen Eierstockkrebs haben.
  • In anderen Aspekten werden die Spiegel der Biomarker durch Anwendung eines statistischen Verfahrens, wie der ”Knowledge Discovery Engine” (KDETM), Regressionsanalyse, Diskriminanzanalyse, Klassifikations-Baumanalyse, ”Random Forests” bzw. Zufalls-Wälder, ProteomeQuest®, Support-Vektor-Maschine, One R, kNN und heuristische naive Bayes-Analyse, neuronale Netze und Varianten davon ausgewertet.
  • In einer anderen Ausführungsform wird ein prädiktives oder diagnostisches Modell basierend auf den Expressionsniveaus der Biomarker bereitgestellt. Das Modell kann in Form von Software-Code, Computer-lesbarem Format oder in Form von schriftlichen Anweisungen zum Auswerten der relativen Expression der Biomarker vorliegen.
  • Ein Arzt des Patienten kann einen Bericht über die Biomarker-Auswertung, in einem breiteren diagnostischen Kontext, nutzen, um eine verhältnismäßig vollständigere Einschätzung des Risikos zu entwickeln, dass ein bestimmter Patient Eierstockkrebs hat. Beim Vornehmen dieser Beurteilung wird ein Arzt die klinische Präsentation eines Patienten berücksichtigen, welche Symptome einschließt, wie eine verdächtige pelvine Geschwulst und/oder Aszites, abdominale Distention und andere Symptome ohne eine weitere offensichtliche Quelle von Malignität. Die allgemeine Labor-Aufarbeitung für symptomatische Patienten beinhaltet derzeit eine GI-Auswertung, wenn klinisch indiziert, Röntgen-Thorax, CA-125-Test, CBC, Ultraschall oder Bauch/Becken-CT, wenn klinisch indiziert, Chemie-Profil mit Leberwerten bzw. ”LFTs”, und kann eine Auswertung der Familienvorgeschichte zusammen mit Tests genetischer Marker, wie BRCA-1 und BRCA-2, einschließen. (Siehe allgemein die ”NCCN Clinical Practice Guidelines in OncologyTM for Ovarian Cancer”, V.1.2007.)
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine neue und wichtige zusätzliche Informationsquelle bereit, um einen Arzt bei der Stratifizierung bzw. Schichtung des Risikos einer Patientin, Eierstockkrebs aufzuweisen, und bei der Planung der zu ergreifenden nächsten diagnostischen Schritte, zu unterstützen. Die vorliegende Erfindung ist auch in ähnlicher Weise bei der Beurteilung des Risikos von Eierstockkrebs in nicht-symptomatischen, Hochrisiko-Subjekten sowie für die allgemeine Bevölkerung als Screening-Instrument brauchbar. Es wird in Betracht gezogen, dass die Verfahren der vorliegenden Erfindung von Klinikern als Teil einer umfassenden Beurteilung anderer prädiktiver und diagnostischer Indikatoren verwendet werden können.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren bereit, um die therapeutische Wirksamkeit von bestehenden und Kandidaten-artigen Chemotherapeutika und anderen Typen von Krebsbehandlungen abzuschätzen. Wie von Fachleuten auf dem Gebiet erkannt werden wird, bestimmt man die relativen Expressionsspiegel der Biomarkerpanels – oder Biomarkerprofile – wie oben beschrieben, in Proben, die aus einem Subjekt vor und erneut nach einer Behandlung, oder gegebenenfalls bei progressiven Stadien während einer Behandlung, entnommen werden. Eine Veränderung der relativen Expression dieser Biomarker hin zu einem Nichtkrebs-Profil der Expressionsspiegel (oder zu einem stärker Beinahe-Nichtkrebs-Expressionsprofil) oder einem stabilen, sich nicht ändernden Profil der relativen Biomarker-Expressionsspiegel, wird als therapeutische Wirksamkeit interpretiert. Der Fachmann auf dem Gebiet wird ohne Weiteres verstehen, dass ein Profil solcher Expressionsspiegel diagnostisch für Krebs oder eine Krebs-Vorstufe, einen vormalignen Zustand, sein kann oder sich einfach hin zu einem solchen diagnostischen Profil bewegen kann, während die relativen Verhältnisse der Biomarker ähnlicher zu einem Krebs-verwandten Profil werden, als zuvor.
  • In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung, ob ein Subjekt möglicherweise Krebs entwickelt, bereit. Die relativen Expressionsspiegel der Biomarker werden in Proben bestimmt, die aus einem Subjekt im Verlauf der Zeit entnommen werden, wodurch eine Änderung im Biomarker-Expressionsprofil hin zu einem Krebs-Profil als eine Progression hin zur Entwicklung von Krebs interpretiert wird.
  • Die Expressionsspiegel der Biomarker einer Probe können elektronisch gespeichert werden, sobald die Analyse eines Subjekts abgeschlossen ist, und zu derartigen Vergleichszwecken an einem zukünftigen Zeitpunkt wieder aufgerufen werden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Verfahren, Software-Produkte, Computer-Systeme und Netzwerke, und die damit verbundenen Instrumente, bereit, die einen sehr genauen Test für Eierstockkrebs zur Verfügung stellen.
  • Die Kombinationen von Markern in dieser Beschreibung stellen empfindliche, spezifische und genaue Verfahren zur Vorhersage des Vorhandenseins von oder zum Detektieren von Eierstockkrebs in verschiedenen Stadien seiner Progression bereit. Die Auswertung von Proben, wie beschrieben, kann auch mit der Anwesenheit eines prä-malignen oder eines vorklinischen Zustands in einer Patientin korrelieren. So wird es in Betracht gezogen, dass die offenbarten Verfahren für die Vorhersage oder die Detektion des Vorhandenseins von Eierstockkrebs in einer Probe, die Abwesenheit von Eierstockkrebs in einer Probe, die aus einer Patientin entnommen wurde, des Stadiums eines Eierstockkrebs, des Grades eines Eierstockkrebs, der gutartigen oder bösartigen Natur eines Eierstockkrebs, des metastatischen Potentials eines Eierstockkrebs, des histologischen Typs von Neoplasma, das mit dem Eierstockkrebs assoziiert ist, der Trägheit oder Aggressivität des Krebses, und anderer Merkmale von Eierstockkrebs, die für die Prävention, Diagnose, Charakterisierung und Therapie von Eierstockkrebs in einer Patientin relevant sind, brauchbar sind.
  • Es wird ferner in Betracht gezogen, dass die offenbarten Verfahren auch für die Beurteilung der Wirksamkeit einer oder mehreren Testsubstanzen hinsichtlich der Hemmung von Eierstockkrebs, die Beurteilung der Wirksamkeit einer Therapie für Eierstockkrebs, die Überwachung des Verlaufs bzw. der Progression von Eierstockkrebs, das Auswählen eines Mittels oder einer Therapie zur Hemmung von Eierstockkrebs, die Überwachung der Behandlung einer Patientin, die an Eierstockkrebs leidet, die Überwachung der Hemmung von Eierstockkrebs bei einer Patientin, und die Beurteilung des karzinogenen Potenzials einer Testverbindung durch Auswerten von Biomarkern von Versuchstieren nach einer Exposition nützlich sind.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Die 1 ist eine Tabelle, welche die Demografie der Studien-Subjekte zeigt.
  • Die 2 ist eine Tabelle, die die Biomarker zeigt, die in der Studie untersucht wurden.
  • Die 3 ist eine Tabelle, die die Werte der Fläche unter der Kurve (AUC) aus einer Receiver-Operating-Charakteristik(ROC)-Kurvenanalyse der besten 20 Marker zeigt.
  • Die 4 ist eine Tabelle, welche die informativen Biomarker, identifiziert mit Fläche-unter-der-Kurve-(AUC)-Werten, die statistisch größer als 0,5 sind, auflistet.
  • Die 5 ist ein Satz von Graphen, die die Receiver-Operating-Charakteristik-Kurven für die neun informativsten Biomarker mit größeren Fläche-unter-der-Kurve-Werten als 0,800 zeigt.
  • Die 6 ist ein Satz von Graphen, welche die Serumspiegel-Verteilungen, aufgeschlüsselt nach dem ”International Federation of Gynecology and Obstetrics (Internationale Vereinigung für Gynäkologie und Geburtskunde)”(FIGO)-Eierstockkrebs-Stadium für die neun informativsten Biomarker mit größeren Fläche-unter-der-Kurve-Werten als 0,800 zeigen.
  • Die 7 ist ein Satz von Graphen, welche die Serumspiegel-Verteilungen, aufgeschlüsselt nach Subtyp des Eierstockkrebs-Stadium, für die neun informativsten Biomarker mit größeren Fläche-unter-der-Kurve-Werten als 0,800 zeigen.
  • Die 8 ist eine Korrelationsmatrix für Biomarker mit größeren Fläche-unter-der-Kurve-Werten als 0,600.
  • Die 9 ist eine Tabelle, welche die Identitäten von Marker in den Clustern A bis D auflistet.
  • Die 10 ist eine Tabelle, die die Korrelationsdaten der Marker in Cluster A zeigt.
  • Die 11 ist eine Tabelle, die die Korrelationsdaten der Marker in Cluster B zeigt.
  • Die 12 ist eine Tabelle, die die Korrelationsdaten der Marker in Cluster C zeigt.
  • Die 13 ist eine Tabelle, die die Korrelationsdaten der Marker in Cluster D zeigt.
  • Die 14 ist eine Tabelle, die die Empfindlichkeit bei Richtlinien-Schwellen-Spezifitätswerten von logistischen Regressions-Modellen unter Verwendung der neun informativsten Marker und der OVA1-Biomarker zeigt.
  • Die 15 ist eine Tabelle, die die Spezifität bei Richtlinien-Schwellen-Empfindlichkeitswerten von logistischen Regressionsmodellen unter Verwendung der neun informativsten Marker und der OVA1-Biomarker zeigt.
  • Die 16 ist eine Tabelle, die die Fläche-unter-der-Kurve(AUC)-Werte aus Receiver-Operating-Charakteristik(ROC)-Kurvenanalyse der Top-20-Marker, aufgeschlüsselt nach dem menopausalen Status, zeigt.
  • DEFINITIONEN
  • Sofern nicht anders definiert, haben alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe, die hierin verwendet werden, die Bedeutung, die allgemein von einem Fachmann auf dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört, verstanden wird. Die folgenden Bezugsstellen geben einem Fachmann eine allgemeine Definition von vielen der Begriffe, die in dieser Erfindung verwendet werden: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2. Ausg. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker Hrsg., 1988); The Glossary of Genetics, 5. Ausg., R. Rieger et al. (Hrsg.), Springer Verlag (1991); und Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). Wie hierin verwendet, haben die folgenden Ausdrücke die Bedeutungen, die ihnen zugeschrieben warden, wenn es nicht in anderer Weise angegeben ist.
  • ”Biomarker-Panel” bezieht sich auf eines der hier dargelegten Biomarker-Panels. Eine bevorzugtes Biomarker-Panel umfasst CA-125 und HE4 und einen oder mehrere Biomarker, die aus der Gruppe gewählt sind, die aus Interleukin-2-Rezeptor alpha (IL-2-Rezeptor alpha), Alpha-1-Antitrypsin (AAT), C-Reaktivem Protein (CRP), YKL-40, Zellulärem Fibronectin (cFib), Krebs-Antigen 72-4 (CA-72-4), Prostasin, Gewebe-Inhibitor von Metalloproteinasen 1 (TIMP-1), IL-8, Matrix-Metalloproteinase-7 (MMP-7), IL-6, Vaskulärem Endothelialien Wachstumsfaktor B (VEGF-B), Calprotectin, Insulin-ählicher-Wachstumsfaktor-Bindungsprotein 2 (IGFBP-2), Lectin-ähnlichem Oxidiertes-LDL-Rezeptor 1 (LOX-1), Neuropilin-1, TNFR2 und MPIF-1 besteht.
  • ”Elutionsmittel” oder ”Waschlösung” bezieht sich auf ein Mittel, typischerweise eine Lösung, die verwendet wird, um die Adsorption eines Analyten an ein Affinitätsreagens zu beeinflussen oder zu modifizieren und/oder ungebundene Materialien von dem Reagenz zu entfernen. Die Elutionscharakteristik eines Elutionsmittels kann zum Beispiel von dem pH-Wert, der Ionenstärke, der Hydrophobie, dem Grad des Chaotropismus, der Detergenzstärke und der Temperatur abhängen.
  • ”Analyt” bezieht sich auf jedwede Komponente einer Probe, deren Nachweis gewünscht wird. Der Ausdruck kann sich auch auf einzelne Komponenten oder eine Mehrzahl von Komponenten in der Probe beziehen.
  • ”Molekulare Bindungspartner” und ”spezifische Bindungspartner” beziehen sich auf Paare von Molekülen, typischerweise Paare von Biomolekülen, die eine spezifische Bindung aufweisen. Zu molekularen Bindungspartnern zählen, ohne Einschränkung, Rezeptor und Ligand, Antikörper und Antigen, Biotin und Avidin sowie Biotin und Streptavidin.
  • ”Überwachen” bezieht sich auf die Aufzeichnung von Veränderungen bei einem sich kontinuierlich ändernden Parameter.
  • ”Marker” bezieht sich, im Kontext der vorliegenden Erfindung, auf ein Polypeptid (von einem bestimmten scheinbaren Molekulargewicht), das differentiell in einer Probe vorhanden ist, die aus Patientinnen mit humanem Krebs entnommen wurde, im Vergleich zu einer vergleichbaren Probe, die aus Kontrollsubjekten entnommen wurde (z. B. einer Person, mit einer negativen Diagnose oder nicht nachweisbarem Krebs, normalen oder gesunden Subjekten). Der Begriff ”Biomarker” wird austauschbar mit dem Begriff ”Marker” verwendet.
  • Der Begriff ”Messen” bedeutet Verfahren, die das Nachweisen des Vorhandenseins oder der Abwesenheit von Marker(n) in der Probe, das Quantifizieren der Menge an Marker(n) in der Probe und/oder das Qualifizieren des Typs des Biomarkers einschließen. Das Messen kann mit im Stand der Technik bekannten Verfahren sowie jenen, die hierin weiter beschrieben sind, erreicht werden, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, SELDI und Immunoassay. Jegliche geeigneten Verfahren können zum Nachweisen und Messen eines oder mehrerer der hier beschrieben Marker angewendet werden. Zu diesen Verfahren zählen, ohne Einschränkung darauf, Massenspektrometrie (z. B. Laser-Desorptions/Ionisations-Massenspektrometrie), Fluoreszenz (z. B. Sandwich-Immunoassay), Oberflächen-Plasmon-Resonanz, Ellipsometrie und die Rasterkraftmikroskopie.
  • Der Ausdruck ”differentiell vorhanden” bezieht sich auf Unterschiede in der Menge und/oder der Häufigkeit eines Markers, der in einer Probe vorkommt, die aus Patienten mit Humankrebs entnommen wurde, im Vergleich zu einem Kontrollsubjekt. Darüber hinaus kann ein Marker ein Polypeptid sein, welches bei einer höheren Häufigkeit oder bei einer niedrigeren Häufigkeit in Proben von humanen Krebspatienten, verglichen mit Proben aus Kontrollsubjekten, nachgewiesen wird. Ein Marker kann in Bezug auf die Menge, Häufigkeit oder beides differentiell vorhanden sein.
  • Ein Polypeptid ist zwischen zwei Proben differentiell vorhanden, wenn die Menge des Polypeptids in einer Probe statistisch signifikant unterschiedlich zu der Menge des Polypeptids in der anderen Probe ist. Zum Beispiel ist ein Polypeptid differentiell zwischen den zwei Proben vorhanden, wenn es um mindestens etwa 120%, mindestens etwa 130%, mindestens etwa 150%, mindestens etwa 180%, mindestens etwa 200%, mindestens etwa 300%, mindestens etwa 500%, mindestens etwa 700%, mindestens etwa 900%, oder mindestens etwa 1000% mehr vorhanden ist als in der anderen Probe, oder wenn es in einer Probe nachweisbar ist und in der anderen nicht nachweisbar ist.
  • Alternativ oder zusätzlich ist ein Polypeptid differentiell zwischen zwei Sätzen von Proben vorhanden, wenn die Häufigkeit des Nachweises des Polypeptids in Proben von den Eierstockkrebs-Patientinnen statistisch signifikant höher oder niedriger ist als in den Kontrollproben. Zum Beispiel ist ein Polypeptid differentiell zwischen den zwei Sätzen von Proben vorhanden, wenn es nachgewiesen ist, dass es um mindestens etwa 120%, mindestens etwa 130%, mindestens etwa 150%, mindestens etwa 180%, mindestens etwa 200%, mindestens etwa 300%, mindestens etwa 500%, mindestens etwa 700%, mindestens etwa 900%, oder mindestens etwa 1000% häufiger oder weniger häufig in einem Satz von Proben als in dem anderen Satz von Proben beobachtet wird.
  • ”Diagnostisch” bedeutet das Identifizieren des Vorhandenseins oder der Natur eines pathologischen Zustands, d. h. Eierstockkrebs. Diagnostische Verfahren unterscheiden sich in ihrer Empfindlichkeit und Spezifität. Die ”Empfindlichkeit” eines diagnostischen Assays ist der Prozentsatz an erkrankten Individuen, die als positiv getestet werden (Prozentsatz an ”echt Positiven”). Erkrankte Individuen, die durch den Assay nicht erkannt werden, sind ”falsche Negative”. Subjekte, die nicht erkrankt sind und die im Assay als negativ befunden werden, werden als ”echte Negative” bezeichnet. Die ”Spezifität” eines diagnostischen Assays ist 1 minus der Falsch-Positiven-Rate, wobei die ”Falsch-Positiven”-Rate definiert ist als der Anteil derjenigen Personen ohne die Erkrankung, welche als positiv befunden werden. Während ein bestimmtes diagnostisches Verfahren nicht eine definitive Diagnose eines Zustands bereitstellen kann, genügt es, wenn das Verfahren eine positive Indikation bereitstellt, die bei der Diagnose hilft.
  • Eine ”Testmenge” eines Markers bezieht sich auf eine Menge eines Markers, die in einer Probe vorhanden ist, welche getestet wird. Eine Testmenge kann entweder in Absolutmenge (z. B. μg/ml) oder einer relativen Menge (z. B. relative Intensität von Signalen) vorliegen.
  • Eine ”diagnostische Menge” eines Markers bezieht sich auf eine Menge eines Markers in einer Probe eines Subjekts, die mit einer Diagnose von Eierstockkrebs konsistent ist. Eine diagnostische Menge kann entweder in Absolutmenge (z. B. μg/ml) oder einer relativen Menge (z. B. relative Intensität von Signalen) vorliegen.
  • Eine ”Kontroll-Menge” eines Markers kann jedwede Menge oder ein Bereich von Mengen sein, die bzw. der gegenüber einer Testmenge von einem Marker verglichen werden soll. Zum Beispiel kann eine Kontroll-Menge eines Markers die Menge eines Markers in einer Person ohne Eierstockkrebs sein. Eine Kontroll-Menge kann entweder in Absolutmenge (z. B. μg/ml) oder einer relativen Menge (z. B. relative Intensität von Signalen) vorliegen.
  • ”Antikörper” bezieht sich auf einen Polypeptid-Liganden, der im Wesentlichen von einem Immunglobulin-Gen oder Immunglobulin-Genen codiert wird, oder Fragmente davon, der spezifisch ein Epitop (z. B. ein Antigen) bindet und erkennt. Zu den anerkannten Immunglobulingenen gehören die Kappa- und Lambda-Leichtkette-Gene der konstanten Region, die Alpha-, Gamma-, Delta-, Epsilon- und mu-Schwerkette-Gene der konstanten Region sowie die unzähligen Immunglobulinvariable-Region-Gene. Antikörper existieren z. B. als intakte Immunglobuline oder als eine Anzahl von gut charakterisierten Fragmenten, die durch Verdau mit verschiedenen Peptidasen erzeugt werden. Hierzu zählen z. B. Fab'- und F(ab)'2-Fragmente. Der Begriff ”Antikörper”, wie hierin verwendet, schließt auch Antikörperfragmente, die entweder durch Modifikation ganzer Antikörper produziert werden, oder diejenigen, die unter Anwendung von rekombinanten DNA-Methodiken de novo synthetisiert werden, ein. Er schließt auch polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper, chimäre Antikörper, humanisierte Antikörper oder Einzelketten-Antikörper ein. ”Fc”-Abschnitt eines Antikörpers bezieht sich auf denjenigen Abschnitt einer Immunglobulin-Schwerkette, der ein oder mehrere Schwerketten-Konstantregion-Domänen, CH1, CH2 und CH3, umfasst, aber nicht die variable Region der Schwerkette einschließt.
  • Wie hierin verwendet, wird mit dem Ausdruck ”Probe” Material gemeint, das spezifisch mit einer Patientin in Beziehung gebracht werden kann, und aus dem spezifische Informationen über die Patientin bestimmt, berechnet oder gefolgert werden kann. Eine Probe kann ganz oder teilweise aus biologischem Material aus der Patientin aufgebaut sein. Eine Probe kann auch Material sein, das mit der Patientin in in einer Weise in Kontakt gebracht worden ist, die ermöglicht, dass Tests an der Probe durchgeführt werden, die Informationen über die Patientin liefern. Eine Probe kann auch Material sein, das anderes Material kontaktiert hat, das nicht von der Patientin stammt, aber ermöglicht, dass das erste Material dann getestet werden kann, um Informationen über die Patientin zu bestimmen. Eine Probe kann Quellen von biologischem Material, und zwar anderen als der Patientin, kontaktieren, vorausgesetzt, dass ein Fachmann auf dem Gebiet nichtsdestoweniger Informationen über die Patienten aus der Probe ermitteln kann. Es versteht sich auch, dass Fremdmaterial oder Information, bei dem es sich nicht um die Probe handelt, verwendet werden könnten, um schlüssig die Patientin mit der Probe in Zusammenhang zu bringen. Als nicht-einschränkendes Beispiel erfordert ein doppelverblindeter Test ein Diagramm oder eine Datenbank, um eine Probe einer Patientin zuzuordnen.
  • Wie hierin verwendet, ist mit dem Begriff ”Körperflüssigkeit” ein Material gemeint, erhalten aus einer Patientin, das im Wesentlichen von flüssiger Konsistenz ist, aber feste oder teilchenförmige Sunstanz mit ihm verbunden aufweisen kann. Eine Körperflüssigkeit kann auch Material und Anteile enthalten, die nicht aus der Patientin stammen. Zum Beispiel kann eine Körperflüssigkeit mit Wasser verdünnt sein oder kann Konservierungsmittel, wie EDTA, enthalten. Nicht einschränkende Beispiele von Körperflüssigkeiten sind Blut, Serum, seröse Flüssigkeiten, Plasma, Lymphe, Urin, Liquor, Speichel, Schleimhautsekrete der sekretorischen Gewebe und Organe, Vaginalsekrete, Muttermilch, Tränen und Aszitesflüssigkeiten, wie jene, die mit nicht-soliden Tumoren assoziiert sind. Zusätzliche Beispiele schließen Fluide der pleuralen, perikardialen, peritonealen, abdominalen und sonstigen Körperhöhlen und dergleichen ein. Biologische Fluide können ferner flüssige Lösungen einschließen, die mit einem Subjekt oder einer biologischen Quelle in Kontakt gebracht wurden, zum Beispiel Zell- und Organkulturmedium, einschließlich Zell- oder Organkonditioniertem Medium, Spülflüssigkeiten und dergleichen.
  • ”Verwalten der Subjekt-Behandlung” bezieht sich auf das Verhalten des Klinikers oder Arztes nach der Bestimmung des Eierstockkrebs-Status. Zum Beispiel, wenn das Ergebnis der Verfahren der vorliegenden Erfindung nicht eindeutig ist oder es Gründe gibt, dass eine Bestätigung des Status notwendig ist, kann der Arzt weitere bzw. mehr Tests anordnen. Alternativ, wenn der Status anzeigt, dass eine chirurgische Operation angemessen ist, kann der Arzt die Patientin für eine Operation einplanen. Ebenso, wenn der Status negativ ist, z. B. Eierstockkrebs im Spätstadium, oder wenn der Status akut ist, kann das Unterlassen weiterer Aktionen verantwortet werden. Darüber hinaus, wenn die Ergebnisse zeigen, dass die Behandlung erfolgreich gewesen war, muss keine weitere Verwaltung erforderlich sein.
  • Der Begriff ”Stufe” oder ”Krebsstadium” soll eine Klassifizierung von Eierstockkrebs bedeuten, die auf der Größe, Invasivität, Progression, Migration usw. von Krebs in einem Subjekt basiert. Die Stufen bzw. Stadien von Eierstockkrebs sind gut definiert. Stufe I bezieht sich auf Eierstockkrebs, wobei der Krebs noch innerhalb des Eierstocks (oder der Eierstöcke) enthalten ist. Insbesondere hat sich Stufe IA-Krebs in einem Eierstock entwickelt, und der Tumor ist auf das Innere des Eierstocks beschränkt. Es gibt keinen Krebs auf der äußeren Oberfläche des Eierstocks. Die Laboruntersuchung von Waschungen aus dem Unterleibs- und Beckenraum ergab keine Krebszellen. Stufe IB-Krebs hat sich innerhalb beider Eierstöcke, ohne jeglichen Tumor an ihren Außenflächen entwickelt. Die Laboruntersuchung von Waschungen aus dem Unterleibs- und Beckenraum ergab keinerlei Krebszellen. Stufe IC-Krebs ist in einem oder beiden Eierstöcken vorhanden und 1 oder mehreres von folgendem liegt vor: Krebs auf der Außenfläche von mindestens einem der Eierstöcke; im Fall von zystischen Tumoren (fluidgefüllte Tumoren) ist die Kapsel (äußere Wand des Tumors) gerissen (Burst); oder die Laboruntersuchung ergab Krebszellen in Flüssigkeit oder Waschungen aus dem Unterleibs- bzw. Bauchraum.
  • Stufe II-Krebs ist in einem oder beidem Eierstöcken vorhanden und hat andere Organe (wie die Gebärmutter, Eileiter, Blase, den Sigmoid-Kolon oder das Rektum) innerhalb des Beckens befallen. Insbesondere hat sich Stufe-IIA-Krebs in die Gebärmutter oder die Eileiter, oder beides, ausgebreitet oder drang tatsächlich in diese ein. Die Laboruntersuchung von Waschungen aus dem Bauchraum ergab keinerlei Krebszellen. Stufe-IIB-Krebs hat sich in andere nahegelegene Beckenorgane, wie die Blase, den Sigmoid-Kolon oder das Rektum, ausgebreitet. Die Laboruntersuchung von Flüssigkeit aus dem Bauchraum ergab keine Krebszellen. Stufe-IIC-Krebs hat sich in Beckenorgane wie in den Stadien IIA oder IIB ausgebreitet, und die Laboruntersuchung der Waschungen aus dem Bauchraum ergab Beweise für Krebszellen.
  • Stufe-III-Krebs betrifft 1 oder beide Eierstöcke, und 1 oder beide der folgenden sind vorhanden: (1) Krebs hat sich über das Becken hinaus zur Auskleidung des Bauchraums ausgebreitet; (2) Krebs hat sich zu den Lymphknoten ausgebreitet. Der Krebs ist Stufe IIIA, wenn der Chirurg während des Einstufungs- bzw. Staging-Verfahrens Krebs, der den Eierstock oder die Eierstöcke befallen hat, feststellen kann, aber im Unterleib grob kein Krebs sichtbar ist (ohne Verwendung eines Mikroskops zu ersehen ist) und der Krebs sich nicht auf die Lymphknoten ausgebreitet hat. Allerdings werden, wenn Biopsien unter einem Mikroskop überprüft werden, winzige Ablagerungen von Krebs in der Auskleidung des Oberbauchs gefunden. Stufe IIIB-Krebs liegt in einem oder beiden Eierstöcke vor, und Ablagerungen von Krebs, die groß genug sind, um für den Chirurgen erkennbar zu sein, aber kleiner als 2 cm (etwa 3/4 Zoll) breit sind, sind im Unterleibs- bzw Bauchraum vorhanden. Der Krebs hat sich nicht auf die Lymphknoten ausgebreitet. Damit ein Krebs von Stadium IIIC ist, liegt der Krebs in einem oder beiden Eierstöcken vor, und eines oder beides der folgenden ist vorhanden: Krebs hat sich auf die Lymphknoten ausgebreitet und/oder größere Ablagerungen von Krebs als 2 cm (etwa 3/4 Zoll) Breite sind im Bauchraum zu sehen.
  • Stufe-IV-Krebs ist das am weitesten fortgeschrittenen Stadium von Eierstockkrebs. Der Krebs liegt in einem oder beiden Eierstöcken vor. Fernmetastasen (Ausbreitung des Krebs in den Innenraum der Leber, der Lungen, oder anderen Organen außerhalb der Bauchhöhle) hat stattgefunden. Das Auffinden von Eierstockkrebszellen in Pleuraflüssigkeit (aus dem Hohlraum, der die Lungen umgibt) ist ebenfalls ein Beleg für Stufe IV-Krankheit.
  • Wie hierin verwendet, soll der Begriff ”rezidivierendes Ovarialkarzinom” bedeuten, dass die Krankheit nach Abschluss der Behandlung zurückgekommen ist (Rückfall).
  • Biomarker
  • Mit ”CA-125” ist ein Polypeptidbiomarker mit mindestens 85% Sequenzidentität zu den NCBI-Zugangsnummern NP_078966.2 oder AAL65133 oder einem Fragment davon gemeint. Eine beispielhafte Sequenz von CA-125 ist:
    Figure DE112012000990T5_0002
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    Figure DE112012000990T5_0014
  • Mit ”HE4” ist ein Polypeptidbiomarker mit mindestens 85% Sequenzidentität zu den NCBI-Zugangsnummern AA052683 oder CAA44869 oder einem Fragment davon gemeint. Eine beispielhafte Sequenz von HE4 ist:
    Figure DE112012000990T5_0015
  • Mit ”IL-2 Rezeptor alpha (IL-2Rα)” ist ein Polypeptidbiomarker mit mindestens 85% Sequenzidentität zu den NCBI-Zugangsnummern CAK26553 oder NP_000408 oder einem Fragment davon gemeint. Eine beispielhafte Sequenz von IL-2Rα ist:
    Figure DE112012000990T5_0016
  • Mit ”Alpha-1-Antitrypsin (AAT)” ist ein Polypeptidbiomarker mit mindestens 85% Sequenzidentität zu den NCBI-Zugangsnummern AAB59495 oder CAJ15161 oder einem Fragment davon gemeint. Eine beispielhafte Sequenz von ATT ist:
    Figure DE112012000990T5_0017
  • Mit ”C-Reaktives Protein (CRP)” ist ein Polypeptidbiomarker mit mindestens 85% Sequenzidentität zu den NCBI-Zugangsnummern CAA39671 oder P02741 oder einem Fragment davon gemeint. Eine beispielhafte Sequenz von CRP ist:
    Figure DE112012000990T5_0018
  • Mit ”YKL-40”, ebenfalls bekannt als ”Chitinase-3-artiges Protein” ist ein Polypeptidbiomarker mit mindestens 85% Sequenzidentität zu den NCBI-Zugangsnummern P36222 oder NP_001267 oder einem Fragment davon gemeint. Eine beispielhafte Sequenz von YKL-40 ist:
    Figure DE112012000990T5_0019
    Figure DE112012000990T5_0020
  • Mit ”Zellulares Fibronectin (cFib)” ist ein Polypeptidbiomarker mit mindestens 85% Sequenzidentität zu den NCBI-Zugangsnummern P02751 oder einem Fragment davon gemeint. Eine beispielhafte Sequenz von cFib ist:
    Figure DE112012000990T5_0021
    Figure DE112012000990T5_0022
    Figure DE112012000990T5_0023
  • Mit ”Krebs-Antigen 72-4 (CA-72-4)”, ebenfalls als ”TAG-72” bezeichnet, ist ein Glykoprotein-Biomarker gemeint, welcher durch den monoklonalen Antikörper B 72.3 erkannt wird.
  • Mit ”Prostasin” ist ein Polypeptidbiomarker mit mindestens 85% Sequenzidentität zu den NCBI-Zugangsnummern AAB19071 oder AAC41759 oder einem Fragment davon gemeint. Eine beispielhafte Sequenz von Prostasin ist:
    Figure DE112012000990T5_0024
  • Mit ”Gewebeinhibitor von Metalloproteinasen 1 (TIMP-1)” ist ein Polypeptidbiomarker mit mindestens 85% Sequenzidentität zu den NCBI-Zugangsnummern NP_003245 oder P01033 oder einem Fragment davon gemeint. Eine beispielhafte Sequenz von TIMP-1 ist:
    Figure DE112012000990T5_0025
  • Mit ”Interleukin 8 (IL-8)” ist ein Polypeptidbiomarker mit mindestens 85% Sequenzidentität zu den NCBI-Zugangsnummern P10145 oder AAH13615 oder einem Fragment davon gemeint. Eine beispielhafte Sequenz von IL-8 ist:
    Figure DE112012000990T5_0026
  • Mit ”Matrix-Metalloproteinase-7 (MMP-7)” ist ein Polypeptidbiomarker mit mindestens 85% Sequenzidentität zu den NCBI-Zugangsnummern P09237 oder NP_002414 oder einem Fragment davon gemeint. Eine beispielhafte Sequenz von MMP-7 ist:
    Figure DE112012000990T5_0027
  • Mit ”Interleukin 6 (IL-6)” ist ein Polypeptidbiomarker mit mindestens 85% Sequenzidentität zu den NCBI-Zugangsnummern P05231, NP_000591, oder AAH15511 oder einem Fragment davon gemeint. Eine beispielhafte Sequenz von IL-6 ist:
    Figure DE112012000990T5_0028
    Figure DE112012000990T5_0029
  • Mit ”Vaskulärer Endothelialer Wachstumsfaktor B (VEGF-B)” ist ein Polypeptidbiomarker mit mindestens 85% Sequenzidentität zu den NCBI-Zugangsnummern P49765, AAC50721 oder AAB06274 oder einem Fragment davon gemeint. Eine beispielhafte Sequenz von VEGF-B ist:
    Figure DE112012000990T5_0030
  • Mit ”Calprotectin” ist ein Polypeptidbiomarker mit mindestens 85% Sequenzidentität zu den NCBI-Zugangsnummern AAB33355, AAB25118 oder P06702 oder einem Fragment davon gemeint. Eine beispielhafte Sequenz von Calprotectin ist:
    Figure DE112012000990T5_0031
  • Mit ”Insulin-ähnlicher-Wachstumsfaktor-Bindungsprotein 2 (IGFBP-2)” ist ein Polypeptidbiomarker mit mindestens 85% Sequenzidentität zu den NCBI-Zugangsnummern AAA03246 oder AAA36048 oder einem Fragment davon gemeint. Eine beispielhafte Sequenz von IGFBP-2 ist:
    Figure DE112012000990T5_0032
    Figure DE112012000990T5_0033
  • Mit ”Lectin-ähnlicher Oxidiertes-LDL-Rezeptor 1 (LOX-1)” ist ein Polypeptidbiomarker mit mindestens 85% Sequenzidentität zu den NCBI-Zugangsnummern P78380 oder NP_002534 oder einem Fragment davon gemeint. Eine beispielhafte Sequenz von LOX-1 ist:
    Figure DE112012000990T5_0034
  • Mit ”Neuropilin-1” ist ein Polypeptidbiomarker mit mindestens 85% Sequenzidentität zu den NCBI-Zugangsnummern AAP80144, AAP78927, AAG41895, oder ABY87548 oder einem Fragment davon gemeint. Eine beispielhafte Sequenz von Neuropilin-1 ist:
    Figure DE112012000990T5_0035
    Figure DE112012000990T5_0036
  • Mit ”TNFR2” ist ein Polypeptidbiomarker mit mindestens 85% Sequenzidentität zu den NCBI-Zugangsnummern P20333 oder NP_001057 oder einem Fragment davon gemeint. Eine beispielhafte Sequenz von TNFR2 ist:
    Figure DE112012000990T5_0037
  • Mit ”MPIF-1” ist ein Polypeptidbiomarker mit mindestens 85% Sequenzidentität zu den NCBI-Zugangsnummern AAB51134 oder P55773 oder einem Fragment davon gemeint. Eine beispielhafte Sequenz von MPIF-1 ist:
    Figure DE112012000990T5_0038
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG:
  • Die Biomarker-Panele und die damit verbundenen Verfahren und Produkte wurden durch die Analyse von Analytspiegeln verschiedener molekularer Spezien in menschlichem Blutserum identifiziert, welche aus Subjekten mit Eierstockkrebs verschiedener Stadien und Subtypen, Subjekten mit nicht-krebsartigen gynäkologischen Erkrankungen und gesunden bzw. normalen Subjekten entnommen wurden. Die nachfolgend beschriebenen Immunoassays wurden freundlicherweise von unseren Kollegen bei Rules-Based Medicine of Austin, TX, unter Verwendung ihrer Multi-Analyt-Profil (MAP) Luminex®-Plattform durchgeführt.
  • Während eine bevorzugte Probe Blutserum ist, wird es in Betracht gezogen, dass eine angemessene Probe aus einer beliebigen biologischen Quelle oder Probe abgeleitet werden kann, wie etwa Geweben, Extrakten, Zellkulturen, einschließlich Zellen (zum Beispiel Tumorzellen), Zelllysaten und physiologischen Fluiden, wie zum Beispiel Vollblut, Plasma, Serum, Speichel, duktaler Lavage-Flüssigkeit, Augenlinsenflüssigkeit, Zerebrospinalflüssigkeit bzw. Liquor, Schweiß, Urin, Milch, Aszitesflüssigkeit, Synovialflüssigkeit, Peritonealflüssigkeit und dergleichen. Die Probe kann aus Tieren, vorzugsweise Säugetieren, stärker bevorzugt Primaten, und am meisten bevorzugt Menschen unter Verwendung Speziesspezifischer Bindungsmittel erhalten werden, die äquivalent zu denjenigen sind, die nachstehend im Zusammenhang mit der Analyse menschlicher Proben erörtert sind. Es wird ferner in Betracht gezogen, dass diese Techniken und Marker-Panels angewendet werden können, um Arzneistofftherapie in Nagern und anderen Tieren, einschließlich transgenen Tieren, die für die Entwicklung von Human- und Tiermedizin-Therapeutika relevant sind, auszuwerten.
  • Die Probe kann vor der Verwendung durch herkömmliche Techniken behandelt werden, wie etwa Herstellen von Plasma aus Blut, Verdünnen viskoser Fluide und dergleichen. Verfahren der Probenbehandlung können Filtration, Destillation, Extraktion, Konzentrieren, Inaktivierung von störenden Komponenten, Zugabe von Chaotropen, die Zugabe von Reagenzien und dergleichen involvieren. Nukleinsäuren (einschließlich Silencern, regulatorischer und interferierender RNA) können isoliert werden und ihre Spiegel der Expression für die nachstehend beschriebenen Analyten können ebenfalls in den Verfahren der Erfindung verwendet werden.
  • Proben und analytische Plattform.
  • Der Satz von Blutserum-Proben, der analysiert wurde, um die meisten der nachstehend erörterten Daten zu erstellen, enthielt 150 Eierstockkrebs-Proben und 150 Nicht-Eierstockkrebs-Proben. Die Eierstockkrebsprobe-Proben umfassten weiterhin die folgenden epithelialen Eierstockkrebs-Subtypen: serös (64), klarzellig (22), endometrioid (35), muzinös (15), und gemischt, was heißt, aus mehr als einem Subtyp bestehend, (14). Die Stadien-Verteilung der Eierstockkrebs-Proben war: Stufe I (41), Stufe II (23), Stufe III (68), Stufe IV (12) und unbekannte Stufe (6).
  • Der Nicht-Eierstockkrebs-Probensatz schließt die folgenden Eierstock-Bedingungen ein: gutartig (104), normaler Eierstock (29) und ”geringes malignes Potential/Borderline (3). Der Probensatz schließt auch Serum aus Patientinnen mit anderen Krebserkrankungen ein: Gebärmutterhalskrebs (7), Endometrium-Krebs (6) und Gebärmutterkrebs (1).
  • Antikörper, die spezifisch für ein Biomarkerantigen-Polypeptid der Erfindung sind, werden leicht als monoklonale Antikörper oder als polyklonale Antiseren erzeugt, oder können als gentechnisch erzeugte Immunglobuline (Ig), die entworfen sind, um gewünschte Eigenschaften aufzuweisen, unter Anwendung von im Stand der Technik allgemein bekannten Verfahren hergestellt werden. Zum Beispiel, nur zur Veranschaulichung und nicht als Einschränkung, können Antikörper rekombinante IgGs, chimäre Fusionsproteine mit Immunglobulin-abgeleiteten Sequenzen oder ”humanisierte” Antikörper einschließen (siehe z. B. US-Patente Nrn. 5 693 762 ; 5 585 089 ; 4 816 567 ; 5 225 539 ; 5 530 101 ; und darin zitierte Literaturstellen), die alle zur Detektion eines menschlichen Biomarker-Polypeptids gemäß der hierin beschriebenen Verfahren verwendet werden können. Solche Antikörper können wie hierin angegeben hergestellt werden, einschließlich durch Immunisierung mit Biomarker-Polypeptiden, wie untenstehend beschrieben. Zum Beispiel, wie hierin vorgesehen, werden Nukleinsäuresequenzen, die Biomarker-Polypeptide codieren, offenbart, so dass Fachleute auf dem Gebiet routinemäßig diese Polypeptide zur Verwendung als Immunogene herstellen können.
  • Der Begriff ”Antikörper” schließt polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper, Fragmente davon, wie F(ab')2- und Fab-Fragmente, sowie jedwede beliebigen natürlich vorkommenden oder rekombinant hergestellten Bindungspartner, die Moleküle sind, die spezifisch an ein Biomarker-Polypeptid binden, ein. Antikörper sind als ”immunspezifisch” oder spezifisch bindend definiert, wenn sie ein HE4a-Polypeptid mit einem Ka von größer als oder gleich etwa 10–4 M, vorzugsweise von größer als oder gleich etwa 10–5 M, stärker bevorzugt von größer als oder gleich etwa 10 und noch stärker bevorzugt von größer als oder gleich etwa 1077 M–1 binden. Affinitäten von Bindungspartnern –6Mor-Antikörpern können leicht unter Anwendung herkömmlicher Techniken bestimmt werden, zum Beispiel denjenigen, die bei Scatchard et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 51: 660 (1949) beschrieben sind. Die Bestimmung von anderen Proteinen als Bindungspartnern eines Biomarker-Polypeptids kann unter Verwendung einer beliebigen einer Anzahl bekannter Verfahren zur Identifizierung und Gewinnung von Proteinen, die spezifisch mit anderen Proteinen oder Polypeptiden interagieren, zum Beispiel, einem Hefe-Zwei-Hybrid-Screening-System, wie es im US-Patent Nr. 5 283 173 und US-Patent Nr. 5 468 614 beschrieben ist, oder dergleichen bzw. dem Äquivalent, durchgeführt werden. Die hierin beschriebenen Verfahren schließen auch die Verwendung eines Biomarker-Polypeptids, und von Peptiden, die auf der Aminosäuresequenz eines Biomarker-Polypeptids basieren, ein, um Bindungspartner und Antikörper herzustellen, die spezifisch an ein Biomarker-Polypeptid binden.
  • Antikörper können im Allgemeinen durch beliebige einer Vielzahl von bekannten Techniken, die dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet bekannt sind (siehe z. B. Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) hergestellt werden. In einer solchen Technik wird anfangs ein Immunogen, umfassend ein Biomarker-Polypeptid, zum Beispiel eine Zelle mit einem Biomarker-Polypeptid auf ihrer Oberfläche oder ein isoliertes Biomarker-Polypeptid, in ein geeignetes Tier injiziert (z. B. Mäuse, Ratten, Kaninchen, Schafen und Ziegen), vorzugsweise gemäß einem vorbestimmten Zeitplan unter Einbeziehung einer oder mehrerer Auffrisch-Impfungen, und den Tieren wird regelmäßig Blut abgenommen. Polyklonale Antikörper, die spezifisch für das Biomarker-Polypeptid sind, können dann aus solchen Antiseren gereinigt werden, zum Beispiel durch Affinitätschromatographie, bei der das Polypeptid gekoppelt an einen geeigneten festen Träger verwendet wird.
  • Monoklonale Antikörper, die für Biomarker-Polypeptide oder Varianten davon spezifisch sind, können zum Beispiel unter Anwenden der Technik von Kohler und Milstein (1976 Eur. J. Immunol. 6: 511–519), und Verbesserungen davon, hergestellt werden. Kurz gesagt umfassen diese Verfahren die Herstellung von unsterblichen Zelllinien, die zum Produzieren von Antikörpern in der Lage sind, welche die gewünschte Spezifität (d. h. Reaktivität mit dem Mesothelin-Polypeptid von Interesse) aufweisen. Solche Zelllinien können zum Beispiel aus Milzzellen, die aus einem wie oben beschrieben immunisierten Tier erhalten wurden, hergestellt werden. Die Milzzellen werden dann beispielsweise durch Fusion mit einem Myelomzellfusionspartner, vorzugsweise einem solchen, der syngeneisch mit dem immunisierten Tier ist, immortalisiert. Zum Beispiel können die Milzzellen und Myelomzellen mit einem die Membranfusion fördernden Mittel, wie Polyethylenglykol oder einem nichtionischen Detergens, einige Minuten lang vereinigt werden, und dann bei geringer Dichte auf einem selektiven Medium ausplattiert werden, welches das Wachstum von Hybridzellen, aber nicht Myelomzellen, unterstützt. Eine bevorzugte Selektionstechnik benutzt HAT(Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin)-Selektion. Nach einer ausreichenden Zeit, in der Regel etwa 1 bis 2 Wochen, werden Kolonien von Hybriden beobachtet. Einzelne Kolonien werden selektiert und auf Bindungsaktivität gegenüber dem Polypeptid getestet. Hybridome mit hoher Reaktivität und Spezifität werden bevorzugt. Hybridome, die monoklonale Antikörper erzeugen, die spezifisch an Biomarker-Polypeptide binden, werden bei den hierin beschriebenen Verfahren in Betracht gezogen.
  • Monoklonale Antikörper können aus den Überständen von wachsenden Hybridom-Kolonien isoliert werden. Darüber hinaus können verschiedene Techniken eingesetzt werden, um die Ausbeute zu steigern, wie etwa Injektion der Hybridom-Zelllinie in die Bauchhöhle eines geeigneten Wirbeltier-Wirts, wie einer Maus oder einem anderen geeigneten Wirt. Monoklonale Antikörper können dann aus der Aszites-Flüssigkeit oder dem Blut geerntet werden. Verunreinigungen können aus den Antikörpern durch herkömmliche Techniken, wie Chromatographie, Gelfiltration, Präzipitation und Extraktion, entfernt werden. Zum Beispiel können Antikörper durch Chromatographie auf immobilisiertem Protein G oder Protein A unter Anwendung von Standardtechniken gereinigt werden.
  • Innerhalb bestimmter Ausführungsformen kann die Verwendung von Antigen-bindenden Fragmenten von Antikörpern bevorzugt werden. Solche Fragmente schließen Fab-Fragmente ein, die unter Anwendung von Standardtechniken (z. B. durch Verdau mit Papain, um Fab- und Fc-Fragmente zu ergeben) hergestellt werden können. Die Fab- und Fc-Fragmente können durch Affinitätschromatographie (z. B. auf immobilisierten Protein-A-Säulen) unter Verwendung von Standardtechniken abgetrennt werden,. Solche Techniken sind im Stand der Technik allgemein bekannt, siehe z. B. Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology, 1986, Blackwell Scientific, Boston.
  • Multifunktionale Fusionsproteine mit spezifischen Bindeaffinitäten für im Voraus gewählte Antigene dank Immunglobulin-V-Region-Domänen, die von DNA-Sequenzen, die im Leseraster an für verschiedene Effektorproteine codierende Sequenzen verknüpft sind, codiert werden, sind im Stand der Technik bekannt, beispielsweise wie in EP-B1-0318554 , U. S.-Pat. Nr. 5 132 405 , U. S. Pat. Nr. 5 091 513 und U. S. Pat. Nr. 5 476 786 offenbart. Solche Effektorproteine schließen Polypeptiddomänen ein, die verwendet werden können, um die Bindung des Fusionsproteins durch eine beliebige einer Vielzahl von Techniken nachzuweisen, mit denen der Fachmann auf dem Gebiet vertraut ist, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, eine Biotin-mimetische Sequenz (siehe z. B. Luo et al., 1998 J. Biotechnol. 65: 225 und darin zitierte Referenzen), direkte kovalente Modifikation mit einer nachweisbaren Markierungseinheit, nicht-kovalente Bindung an ein spezifisches markiertes Reportermolekül, enzymatische Modifikation eines nachweisbaren Substrats oder Immobilisierung (kovalent oder nicht-kovalent) auf einem Festphasen-Träger.
  • Einzelketten-Antikörper zur Verwendung in den hierin beschriebenen Verfahren können auch erzeugt und selektiert werden, durch ein Verfahren, wie Phagen-Display (siehe z. B. US-Patent Nr. 5 223 409 ; Schlebusch et al., 1997 Hybridoma 16: 47; und dort zitierte Literaturstellen). Kurz gesagt werden bei diesem Verfahren DNA-Sequenzen in das Gen-III- oder Gen-VIII-Gen eines filamentösen Phagen, wie M13, eingefügt. Mehrere Vektoren mit Mehrfachklonierungsstellen sind zur Insertion entwickelt (McLafferty et al., Gene 128: 29–36, 1993; Scott und Smith, Science 249: 386–390, 1990; Smith und Scott, Methods Enzymol. 217: 228–257, 1993). Die inserierten DNA-Sequenzen können zufallsmäßig erzeugt werden oder können Varianten einer bekannten Bindungsdomäne für das Binden an ein Biomarker-Polypeptid sein. Einzelkettenantikörper können leicht mithilfe dieser Methode erzeugt werden. Im Allgemeinen kodieren die Inserts 6 bis 20 Aminosäuren. Das Peptid, das durch die inserierte Sequenz kodiert wird, wird auf der Oberfläche des Bakteriophagen präsentiert bzw. ”zum Display gebracht”. Bakteriophagen, die eine Bindungsdomäne für ein Biomarker-Polypeptid exprimieren, werden durch Bindung an ein immobilisiertes Biomarker-Polypeptid, z. B. ein rekombinantes Polypeptid, das unter Verwendung von im Stand der Technik allgemein bekannten Verfahren und Nukleinsäure-kodierenden Sequenzen, wie sie hierin offenbart sind, hergestellt wurde, selektiert. Ungebundene Phagen werden durch einen Waschschritt entfernt, typischerweise mit 10 mM Tris, 1 mM EDTA, und ohne Salz oder mit einer niedrigen Salzkonzentration. Gebundene Phagen werden beispielsweise mit einem Salz enthaltenden Puffer, eluiert. Die NaCl-Konzentration wird in einer stufenweisen Art und Weise erhöht, bis alle Phagen eluiert werden. Typischerweise werden Phagen, die mit höherer Affinität binden, durch höhere Salzkonzentrationen freigesetzt. Die eluierten Phagen werden in dem Bakterienwirt vermehrt. Weitere Runden der Selektion können durchgeführt werden, um für einige wenige Phagen zu selektieren, die mit hoher Affinität binden. Die DNA-Sequenz des Inserts in dem bindenden Phagen wird dann bestimmt. Sobald die vorhergesagte Aminosäuresequenz des bindenden Peptids bekannt ist, kann ausreichend Peptid zur Verwendung hierin als ein für ein Biomarkerpolypeptid spezifischer Antikörper entweder durch rekombinante Methoden oder synthetisch hergestellt werden. Rekombinante Methoden werden angewandt, wenn der Antikörper als ein Fusionsprotein erzeugt wird. Das Peptid kann auch als eine Tandem-Anordnung von zwei oder mehreren gleichartigen oder ungleichen Peptiden erzeugt werden, um die Affinität oder Bindung zu maximieren.
  • Um eine antigene Determinante, die reaktiv mit einem Antikörper ist, der für ein Biomarker-Polypeptid spezifisch ist, zu detektieren, ist das Nachweisreagenz typischerweise ein Antikörper, der wie hierin beschrieben hergestellt werden kann. Es gibt eine Vielzahl von Assay-Formaten, die dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet für die Verwendung eines Antikörpers zum Nachweisen eines Polypeptids in einer Probe bekannt sind, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Enzym-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA), Radioimmunoassay (RIA), Immunfluorimetrie, Immunpräzipitation, Gleichgewichtsdialyse, Immundiffusion und andere Techniken. Siehe z. B. Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology, 1986, Blackwell Scientific, Boston. Beispielsweise kann der Assay in einem Western-Blot-Format durchgeführt werden, wobei eine Protein-Zubereitung aus der biologischen Probe einer Gelelektrophorese unterzogen, auf eine geeignete Membran überfuhrt und mit dem Antikörper reagieren gelassen wird. Die Anwesenheit des Antikörpers auf der Membran kann dann unter Verwendung eines geeigneten Nachweisreagenz detektiert werden, wie dies im Stand der Technik gut bekannt und nachstehend beschrieben ist.
  • In einer anderen Ausführungsform beinhaltet der Assay die Verwendung eines Antikörpers, der auf einem festen Träger immobilisiert ist, um an das Ziel-Biomarker-Polypeptid zu binden und es aus dem Rest der Probe zu entfernen. Das gebundene Biomarker-Polypeptid kann dann unter Verwendung eines zweiten Antikörpers, der mit einer distinkten antigenen Biomarker-Polypeptid-Determinante reaktiv ist, zum Beispiel einem Reagens, das eine nachweisbare Reportereinheit enthält, nachgewiesen werden. Alternativ kann ein kompetitiver Assay verwendet werden, in dem ein Biomarker-Polypeptid mit einer nachweisbaren Reportereinheit markiert wird und an den immobilisierten Biomarker-Polypeptidspezifischen Antikörper, nach Inkubation des immobilisierten Antikörpers mit der Probe, binden gelassen wird. Das Ausmaß, zu dem Komponenten der Probe das Binden des markierten Polypeptids an den Antikörper inhibieren, ist kennzeichnend für die Reaktivität der Probe mit dem immobilisierten Antikörper, und als ein Ergebnis, kennzeichnend für den Spiegel an Biomarker-Polypeptiden in der Probe.
  • Der feste Träger kann jedwedes bekannte Material sein, das dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet bekannt ist, an das der Antikörper gebunden werden kann, wie etwa eine Test-Mulde in einer Mikrotiterplatte, ein Nitrozellulosefilter oder eine andere geeignete Membran. Alternativ kann der Träger ein Kügelchen oder eine Scheibe, wie Glas, Glasfaser, Latex oder ein Kunststoff, wie Polystyrol oder Polyvinylchlorid, sein. Der Antikörper kann auf dem festen Träger mithilfe einer Vielzahl von dem Fachmann bekannten Techniken immobilisiert werden, die ausführlich in der Patent- und Wissenschaftsliteratur beschrieben sind.
  • In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist der Assay zum Nachweis von Biomarker-Antigenpolypeptid in einer Probe ein Zwei-Antikörper-Sandwich-Assay. Dieser Assay kann durchgeführt werden, indem zuerst ein Biomarker-Polypeptid-spezifischer Antikörper, der auf einem festen Träger, allgemein der Mulde einer Mikrotiterplatte, immobilisiert worden ist, mit der biologischen Probe in Kontakt gebracht wird, so dass ein lösliches Molekül, das natürlicherweise in der Probe vorkommt und eine antigene Determinante aufweist, die mit dem Antikörper reaktiv ist, an den immobilisierten Antikörper binden gelassen wird (z. B. ist eine 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur im Allgemeinen ausreichend), so dass ein Antigen-Antikörper-Komplex oder ein Immunkomplex gebildet wird. Ungebundene Bestandteile der Probe werden dann von den immobilisierten Immunkomplexen entfernt. Als nächstes wird ein zweiter Antikörper, der spezifisch für ein Biomarker-Polypeptid ist, zugesetzt, wobei die Antigenbindungsstelle des zweiten Antikörpers nicht kompetitiv die Bindung der Antigenbindungsstelle des immobilisierten ersten Antikörpers an ein Biomarker-Polypeptid inhibiert. Der zweite Antikörper kann nachweisbar markiert sein, wie hierin vorgesehen, so dass er direkt nachgewiesen werden kann. Alternativ kann der zweite Antikörper indirekt durch die Verwendung eines nachweisbar markierten sekundären (oder ”Zweitstufen-”) Anti-Antikörpers, oder unter Verwendung eines spezifischen Nachweisreagenz, wie hierin vorgesehen, detektiert werden. Die hierin beschriebenen Verfahren sind nicht auf eine bestimmte Nachweisverfahrensweise beschränkt, so wie es Fachleute, die mit Immunoassays vertraut sind, richtig einschätzen werden, dass es zahlreiche Reagenzien und Konfigurationen für den immunologischen Nachweis eines bestimmten Antigens (z. B. eines Mesothelin-Polypeptids) in einem Zwei-Antikörper-Sandwich-Immunoassay gibt.
  • In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen der hierin beschriebenen Verfahren unter Verwendung des oben beschriebenen Zwei-Antikörper-Sandwich-Assays, ist der erste, immobilisierte Antikörper, der für ein Biomarker-Antigen-Polypeptid spezifisch ist, ein polyklonaler Antikörper, und der zweite Antikörper, der für ein Biomarker-Antigen-Polypeptid spezifisch ist, ist ein polyklonaler Antikörper. Jedwede Kombination von nicht-kompetitiven Biomarker-Antikörpern könnte bei den hierin beschriebenen Verfahren verwendet werden, einschließlich monoklonalen Antikörpern, polyklonalen Antikörpern und Kombinationen davon. In bestimmten anderen Ausführungsformen der hierin beschriebenen Verfahren ist der erste, immobilisierte Antikörper, der für ein Biomarker-Antigen-Polypeptid spezifisch ist, ein monoklonaler Antikörper, und der zweite Antikörper, der für ein Biomarker-Antigen-Polypeptid spezifisch ist, ist ein polyklonaler Antikörper. In bestimmten anderen Ausführungsformen der hierin beschriebenen Verfahren ist der erste, immobilisierte Antikörper, der für ein Biomarker-Antigen-Polypeptid spezifisch ist, ein polyklonaler Antikörper, und der zweite Antikörper, der für ein Biomarker-Antigen-Polypeptid spezifisch ist, ist ein monoklonaler Antikörper. In bestimmten anderen stark bevorzugten Ausführungsformen der hierin beschriebenen Verfahren ist der erste, immobilisierte Antikörper, der für ein Biomarker-Antigen-Polypeptid spezifisch ist, ein monoklonaler Antikörper, und der zweite Antikörper, der für ein Biomarker-Antigen-Polypeptid spezifisch ist, ist ein monoklonaler Antikörper. In anderen bevorzugten Ausführungsformen der hierin beschriebenen Verfahren können der erste, immobilisierte Antikörper, der für ein Biomarker-Antigen-Polypeptid spezifisch ist, und/oder der zweite Antikörper, der für ein Biomarker-Antigen-Polypeptid spezifisch ist, jedwede der Arten von Antikörpern sein, die im Fachgebiet bekannt sind und hierin angegeben werden, zum Beispiel, zur Veranschaulichung und nicht als Einschränkung, Fab-Fragmente, F(ab')2-Fragmente, Immunglobulin-V-Region-Fusionsproteine oder Einzelketten-Antikörper. Fachleute auf dem Gebiet werden es richtig einschätzen, dass die hierin beschriebenen Verfahren die Verwendung anderer Antikörperformen, Fragmente, Derivate und dergleichen in den hierin offenbarten und beanspruchten Verfahren umfassen.
  • In gewissen besonders bevorzugten Ausführungsformen kann der zweite Antikörper eine nachweisbare Reportergruppe oder eine Markierung, wie ein Enzym, einen Farbstoff, ein Radionuklid, eine lumineszierende Gruppe, eine fluoreszierende Gruppe oder Biotin oder dergleichen, enthalten. Jedwede Reportergruppe oder Markierung könnte mit den hierin beschriebenen Verfahren verwendet werden, solange das Signal von dieser direkt zusammenhängend oder proportional zur Menge an Antikörper ist, die nach dem Waschen auf dem Träger verbleibt. Die Menge des zweiten Antikörpers, der an den festen Träger gebunden verbleibt, wird dann unter Verwendung eines für die spezifische nachweisbare Reportergruppe oder Markierung geeigneten Verfahrens bestimmt. Für radioaktive Gruppen sind im Allgemeinen Szintillationszählung oder autoradiographische Verfahren geeignet. Antikörper-Enzym-Konjugate können unter Anwendung einer Vielzahl von Kopplungstechniken hergestellt werden (für eine Übersicht siehe z. B. Scouten, W. H., Methods in Enzymology 135: 30–65, 1987). Spektroskopische Verfahren können angewendet werden, um Farbstoffe (einschließlich zum Beispiel kolorimetrische Produkte von Enzymreaktionen), lumineszierende Gruppen und fluoreszierende Gruppen zu detektieren. Biotin kann unter Verwendung von Avidin oder Streptavidin, gekoppelt an eine andere Reportergruppe (allgemein eine radioaktive oder fluoreszierende Gruppe oder ein Enzym) detektiert werden. Enzym-Reportergruppen können im Allgemeinen durch die Zugabe von Substrat (im Allgemeinen für einen spezifischen Zeitraum), gefolgt von spektroskopischer, spektrophotometrischer oder sonstiger Analyse der Reaktionsprodukte, nachgewiesen werden. Standards und Standardzusätze können verwendet werden, um den Spiegel an Antigen in einer Probe, unter Verwendung gut bekannter Techniken, zu bestimmen.
  • In einer anderen Ausführungsform beinhalten die hierin beschriebenen Verfahren die Verwendung eines Biomarkerantigen-Polypeptids, wie hierin bereitgestellt, um hinsichtlich des Vorhandenseins eines malignen Zustands durch Detektion von immunspezifisch reaktiven Antikörpern in einer biologischen Probe aus einer biologischen Quelle oder einem Subjekt zu screenen. Gemäß dieser Ausführungsform wird ein Biomarkerantigen-Polypeptid (oder ein Fragment oder eine Variante davon, einschließlich einem verkürzten Biomarkerantigen-Polypeptid, wie hierin vorgesehen) nachweisbar markiert und mit einer biologischen Probe in Kontakt gebracht, um die Bindung eines Antikörpers, der natürlicherweise in löslicher Form in der Probe vorkommt, an das Biomarkerantigen-Polypeptid nachzuweisen. Zum Beispiel kann das Biomarkerantigen-Polypeptid biosynthetisch unter Verwendung der hierin offenbarten Sequenzen gemeinsam mit bekannten Methoden, wie Einbauen einer leicht nachweisbaren (z. B. radioaktiv markierten) Aminosäure während der In-vitro-Translation, oder unter Verwendung anderer nachweisbarer Reportereinheiten, wie den oben beschriebenen, markiert werden. Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, zieht diese Ausführungsform der hierin beschriebenen Verfahren in Betracht, dass bestimmte Biomarkerpolypeptide, wie die hierin offenbarten Biomarker-Fusionspolypeptide, Peptide bereitstellen können, die besonders immunogen sind und somit zur Entstehung von spezifischen und nachweisbaren Antikörpern führen. Beispielsweise können nach dieser Theorie bestimmte Biomarker-Fusionspolypeptide ”Nicht-Selbst”-Antigene repräsentieren, die eine heftige Immunantwort auslösen, während Biomarkerpolypeptide, denen Fusionsdomänen fehlen, durch das Immunsystem als mehr den ”Selbst”-Antigenen ähnelnd angesehen werden könnten, die humorale oder zellvermittelte Immunität nicht ohne Weiteres auslösen.
  • Analytniveaus in den in dieser Beschreibung erörterten Proben wurden unter Verwendung einer Hochdurchsatz-Multi-Analyt-Immunoassay-Plattform gemessen. Eine bevorzugte Plattform ist das Luminex® MAP-System, wie es von Rules-Based Medicine, Inc. in Austin, TX, entwickelt wurde. Es ist auf der Website des Unternehmens und auch zum Beispiel in Publikationen, wie Chandler et al., ”Methods and kits for the diagnosis of acute coronary syndrome, US-Patentanmeldung 2007/0003981, die am 4. Januar 2007 veröffentlicht wurde, und einer verwandten Anmeldung von Spain et al., ”Universal Shotgun Assay,” US-Patentanmeldung 2005/0221363, die am 6. Okt. 2005 veröffentlicht wurde, beschrieben. Diese Plattform ist bereits in Lokshin (2007) beschrieben worden, und generierte Daten, die in anderen Analysen von Eierstockkrebs-Biomarkern verwendet wurden. Es kann jedoch ein(e) beliebige(s) Immunoassay-Plattform oder -System verwendet werden.
  • Kurz gesagt, um ein bevorzugtes Analyten-Messsystem zu beschreiben, enthält die MAP-Plattform Polystyrolmikrokügelchen, die intern mit zwei spektral unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen gefärbt sin. Durch Verwenden von genauen Verhältnissen der Fluorochrome wird eine Anordnung geschaffen, die aus 100 verschiedenen Mikrokügelchen-Sets mit speziellen spektralen Adressen besteht. Jeder Mikrokügelchen-Satz kannen einen unterschiedlichen Oberflächen-Reaktant ausstellen. Da Mikrokügelchen-Sätze durch ihre spektralen Adressen unterschieden werden können, können sie kombiniert werden, was erlaubt, dass bis zu 100 verschiedene Analyten gleichzeitig in einem einzigen Reaktionsgefäß gemessen werden. Ein drittes Fluorochrom, das an ein Reportermolekül gekoppelt ist, quantifiziert die biomolekulare Wechselwirkung, die an der Mikrosphärenoberfläche stattgefunden hat. Mikrokügelchen werden einzeln in einem schnell strömenden Flüssigkeitsstrom abgefragt, während sie an zwei separaten Laser in dem Luminex®-Analysator vorbeifließen. Digitale Hochgeschwindigkeits-Signalverarbeitung klassifiziert die Mikrokügelchen auf der Grundlage ihrer spektralen Adresse und quantifiziert die Reaktion auf der Oberfläche in wenigen Sekunden pro Probe.
  • In einer anderen Ausführungsform kann ein Immunoassay zum Nachweis und zur Analyse von Markern in einer Probe verwendet werden. Dieses Verfahren umfasst: (a) Bereitstellen eines Antikörpers, der spezifisch an einen Marker bindet; (b) Inkontaktbringen einer Probe mit dem Antikörper; und (c) Nachweisen des Vorhandenseins eines Komplexes aus dem Antikörper, der an den Marker in der Probe gebunden ist.
  • Ein Immunoassay ist ein Assay, der einen Antikörper verwendet, um spezifisch an ein Antigen (z. B. einen Marker) zu binden. Der Immunoassay ist durch die Verwendung von spezifischen Bindungseigenschaften eines bestimmten Antikörpers gekennzeichnet, um das Antigen zu isolieren, anzuzielen und/oder zu quantifizieren. Der Ausdruck ”bindet spezifisch (oder selektiv)” an einen Antikörper oder ”ist spezifisch (oder selektiv) immunoreaktiv mit” bei Bezugnahme auf ein Protein oder Peptid bezieht sich auf eine Bindungsreaktion, die aussagefähig hinsichlich der Gegenwart des Proteins in einer heterogenen Population von Proteinen und anderen biologischen Stoffen ist. Somit binden unter vorbestimmten Immunoassay-Bedingungen die spezifizierten Antikörper an ein jeweiliges Protein mindestens zwei mal stärker als der Hintergrund und binden im wesentlichen nicht in einer signifikanten Menge an andere in der Probe vorhandene Proteine. Spezifische Bindung an einen Antikörper unter solchen Bedingungen kann einen Antikörper erfordern, der hinsichtlich seiner Spezifität für ein bestimmtes Protein selektiert wird. Zum Beispiel können polyklonale Antikörper, die gegen einen Marker aus bestimmten Spezies, wie Ratte, Maus oder Mensch erzeugt wurden, selektiert werden, um nur diejenigen polyklonalen Antikörper zu erhalten, die spezifisch mit diesem Marker und nicht mit anderen Proteinen immunreaktiv sind, mit Ausnahme von polymorphen Varianten und Allelen des Markers. Diese Selektion kann durch Heraus-Subtrahieren von Antikörpern, die mit den Markermolekülen aus anderen Spezies kreuzreagieren, erreicht werden.
  • Unter Verwendung der gereinigten Marker oder ihrer Nukleinsäuresequenzen können Antikörper, die spezifisch an einen Marker binden, unter Verwendung jedweder geeigneten, im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden. Siehe z. B. Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (1988); Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2. Ausg. 1986); und Kohler & Milstein, Nature 256: 495–497 (1975). Solche Techniken umfassen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, die Antikörperherstellung durch Selektion von Antikörpern aus Bibliotheken von rekombinanten Antikörpern in Phagen oder ähnlichen Vektoren, sowie die Herstellung von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern durch Immunisierung von Kaninchen oder Mäusen (siehe z. B. Huse et al., Science 246: 1275–1281 (1989); Ward et al., Nature 341: 544–546 (1989)). Typischerweise ist eine spezifische oder selektive Reaktion wenigstens zweimal das Hintergrundsignal oder das Rauschen, und noch typischerweise mehr als das 10- bis 100-Fache des Hintergrunds.
  • Im Allgemeinen kann eine aus einem Subjekt erhaltene Probe mit dem Antikörper, der spezifisch den Marker bindet, kontaktiert werden. Gegebenenfalls kann der Antikörper an einen festen Träger fixiert werden, um das Waschen und anschließende Isolieren des Komplexes vor dem Kontaktieren des Antikörpers mit einer Probe zu erleichtern. Beispiele für feste Träger schließen Glas oder Kunststoff in Form von, z. B. einer Mikrotiterplatte, einem Stäbchen, einem Kügelchen, oder einem Mikrokügelchen ein. Antikörper können auch an ein Sondensubstrat oder eine ProteinChip®-Anordnung, die oben beschrieben sind, angeheftet werden. Die Probe ist vorzugsweise eine aus einem Subjekt entnommene biologische Fluidprobe. Beispiele von biologischen Fluidproben schließen Blut, Serum, Plasma, Brustwarzenaspirat, Urin, Tränen, Speichel etc. ein. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die biologische Flüssigkeit Blutserum. Die Probe kann mit einem geeigneten Elutionsmittel verdünnt werden, bevor das Kontaktieren der Probe mit dem Antikörper erfolgt.
  • Nach dem Inkubieren der Probe mit Antikörpern wird die Mischung gewaschen und der gebildete Antikörper-Marker-Komplex kann nachgewiesen werden. Dies kann durch Inkubation der gewaschenen Mischung mit einem Nachweisreagenz erfolgen. Dieses Nachweisreagenz kann z. B. ein zweiter Antikörper, der mit einer nachweisbaren Markierung markiert ist, sein. Beispielhafte nachweisbare Markierungen schließen magnetische Kügelchen (z. B. DYNABEADSTM), fluoreszierende Farbstoffe, radioaktive Markierungen, Enzyme (z. B. Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase und andere, die üblicherweise in einem ELISA verwendet werden) und kolorimetrische Markierungen, wie kolloidales Gold oder gefärbte Glas- oder Kunststoffkügelchen, ein. Alternativ kann der Marker in der Probe mit Hilfe eines indirekten Assays nachgewiesen werden, wobei, zum Beispiel, ein zweiter markierter Antikörper verwendet wird, um gebundenen Marker-spezifischen Antikörper nachzuweisen, und/oder in einem Kompetitions- oder Inhibitions-Assay, wobei beispielsweise ein monoklonaler Antikörper, der an ein bestimmtes Epitop des Markers bindet, gleichzeitig mit der Mischung inkubiert wird.
  • Zu Verfahren zur Messung der Menge von, oder Anwesenheit von, Antikörper-Marker-Komplex zählen, zum Beispiel, Nachweis von Fluoreszenz, Lumineszenz, Chemolumineszenz, Absorptionsgrad, Reflexion, Transmission, Doppelbrechung oder Brechungsindex (z. B. Oberflächenplasmonresonanz, Ellipsometrie, ein Resonanter-Spiegel-Verfahren, ein Gitter-Koppler-Wellenleiter-Verfahren oder Interferometrie). Zu optischen Verfahren zählen Mikroskopie (sowohl konfokale als auch und nicht-konfokale), bildgebende Verfahren und nicht-bildgebende Verfahren. Elektrochemische Verfahren schließen Voltametrie- und Amperometrie-Methoden ein. Strahlenfrequenz-Methoden schließen multipolare Resonanz-Spektroskopie ein. Verfahren zur Durchführung dieser Tests sind im Stand der Technik gut bekannt. Brauchbare Tests schließen, zum Beispiel, einen Enzym-Immun-Assay (EIA), wie Enzym-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA), einen Radioimmunoassay (RIA), einen Western-Blot-Assay oder einen Slot-Blot-Assay ein. Diese Methoden sind ebenfalls in z. B. Methods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology, Band 37 (Asai, Hrsg. 1993); Basic and Clinical Immunology (Stites & Terr, Hrsg., 7. Ausg., 1991); und Harlow & Lane, supra, beschrieben.
  • Während der gesamten Assays können Inkubations- und/oder Waschschritte nach jeder Kombination von Reagenzien erforderlich sein. Inkubationsschritte können von etwa 5 Sekunden bis mehrere Stunden, vorzugsweise von etwa 5 Minuten bis etwa 24 Stunden variieren. Allerdings wird die Inkubationszeit von dem Assayformat, Marker, Lösungsvolumen, Konzentrationen und dergleichen abhängen. In der Regel werden die Assays bei Umgebungstemperatur durchgeführt, obwohl sie über einen Bereich von Temperaturen, wie 10°C bis 40°C, durchgeführt werden können.
  • Immunassays können verwendet werden, um die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Markers in einer Probe sowie die Menge eines Markers in einer Probe zu bestimmen. Die Menge eines Antikörper-Marker-Komplexes kann durch Vergleichen mit einem Standard bestimmt werden. Ein Standard kann z. B. eine bekannte Verbindung oder ein anderes Protein, das bekanntermaßen in einer Probe vorhanden ist, sein. Wie oben erwähnt, muss die Testmenge an Marker nicht in absoluten Einheiten gemessen werden, so lange die Einheit der Messung mit einer Kontrolle verglichen werden kann.
  • Die Verfahren zum Nachweisen dieser Marker in einer Probe haben viele Anwendungen. Zum Beispiel können ein oder mehrere Marker gemessen werden, um die Human-Krebs-Diagnose oder -Prognose zu unterstützen. In einem anderen Beispiel können die Verfahren zum Nachweis der Marker verwendet werden, um die Ansprechreaktionen in einem Subjekt auf eine Krebsbehandlung zu überwachen. In einem anderen Beispiel können die Verfahren zum Nachweis von Markern zum Assay auf und Identifizieren von Verbindungen verwendet werden, welche die Expression dieser Marker in vivo oder in vitro modulieren. In einem bevorzugten Beispiel werden die Biomarker verwendet, um zwischen den verschiedenen Stufen der Tumorprogression zu differenzieren, wodurch die Feststellung der geeigneten Behandlung und des Ausmaßes der Metastasierung des Tumors unterstützt wird.
  • Ein weiteres Verfahren zur Messung der Biomarker schließt die Verwendung einer auf Kügelchen synthetisierten kombinatorischen Ligandenbibliothek ein, wie beschrieben in der am 28. Juli 2006 eingereichten USSN: 11/495 842, mit dem Titel ”Methods for Reducing the range in Concentrations of Analyte Species in a Sample”; die hiermit durch Bezugnahme in ihrer einbezogen ist Fachleute werden erkennen, dass eine große Vielzahl von analytischen Techniken angewendet werden kann, um die Spiegel von Biomarkern in einer Probe zu bestimmen, wie es in dieser Beschreibung beschrieben und beansprucht wird. Andere Typen von für den Fachmann auf dem Gebiet verfügbaren Bindungsreagenzien können verwendet werden, um die Spiegel der genannten Analyten in einer Probe zu messen. Zum Beispiel kann eine Vielzahl von Bindemitteln oder Bindungsreagentien, die zum Auswerten der Spiegel eines bestimmten Analyten geeignet sind, leicht in der wissenschaftlichen Literatur identifiziert werden. Im Allgemeinen wird ein geeignetes Bindungsmittel spezifisch an einen Analyten binden, in anderen Worten reagiert es bei einem nachweisbaren Niveau mit dem Analyten aber reagiert nicht nachweisbar (oder reagiert mit begrenzter Kreuzreaktivität) mit anderen oder nicht-verwandten Analyten. Es wird in Betracht gezogen, dass geeignete Bindemittel polyklonale und monoklonale Antikörper, Aptamere, RNA-Moleküle und dergleichen einschließen. Spektrometrische Verfahren können ebenfalls angewandt werden, um die Spiegel von Analyten zu messen, einschließlich Immunfluoreszenz, Massenspektrometrie, magnetische Kernresonanz und optische spektrometrische Verfahren. Abhängig von dem zu verwendenden Bindemittel können die Proben, beispielsweise durch Verdünnung, Reinigung, Denaturierung, Verdau, Fragmentierung und dergleichen, vor der Analyse verarbeitet werden, wie dies Fachleuten auf dem Gebiet bekannt ist. Auch die Genexpression, zum Beispiel in einer Tumorzelle oder Lymphozyte, kann ebenfalls bestimmt werden.
  • Es wird auch in Betracht gezogen, dass die identifizierten Biomarker mehrere Epitope für Immunassays und/oder Bindungsstellen für andere Typen von Bindemitteln aufweisen können. Daher wird in Betracht gezogen, dass Peptidfragmente oder andere Epitope der identifzierten Biomarker, Isoformen spezifischer Proteine und sogar Verbindungen stromaufwärts oder stromabwärts in einem biologischen Weg, oder welche posttranslational modifiziert wurden, für die identifizierten Analyten oder Biomarker substituiert werden können, solange die relevanten und relativen Stöchiometrien angemessen berücksichtigt werden. Der Fachmann wird erkennen, dass alternative Antikörper und Bindemittel verwendet werden können, um die Spiegel eines beliebigen jeweiligen Analyten zu ermitteln, solange die verschiedenen Spezifitäten und Bindungsaffinitäten als Faktoren in die Analyse einfließen.
  • Man kann eine Vielzahl von Algorithmen zur Messung oder Bestimmung der Spiegel der Expression der Analyten oder Biomarker, die in den Verfahren und Test-Kits der vorliegenden Erfindung verwendet werden, benutzen. Es wird im Allgemeinen in Betracht gezogen, dass solche Algorithmen zur Messung von Analyt-Spiegeln über die Messung von einfachen Cutoff-Werten hinaus in der Lage sind. So ist es denkbar, dass die Ergebnisse solcher Algorithmen generisch als multivariate Index-Analysen von der U. S. Food and Drug Administration klassifiziert werden. Spezifische Typen von Algorithmen schließen folgende ein: Knowledge Discovery Engine (KDETM), Regressionsanalyse, Diskriminanzanalyse, Klassifikations-Baum-Analyse, Random Forests, ProteomeQuest®, Support-Vektor-Maschine, One R, kNN und heuristische naive Bayes-Analyse, neuronale Netze und Varianten davon.
  • Während es sehr viele ausgefeilte Algorithmen gibt, die die Wahrscheinlichkeit berechnen, dass eine unbekannte Probe ein Krebs ist, arbeitet ein einfaches logistisches Regressionsmodell typischerweise ziemlich gut für den Aufbau eines diagnostischen Modells basierend auf der Messung einiger weniger Marker (vorzugsweise weniger als etwa fünf). Die Theorie dahinter ist Fachleuten auf dem Gebiet allgemein bekannt. Es gibt auch viele Optionen in Bezug darauf, welche Software verwendet werden kann – sowohl kommerzielle als auch freie (und Open-Source) Pakete.
  • Das Training eines logistischen Modells besteht aus der Trennung der Proben in Fälle und Kontrollen, und verwendet dann die gewählte Software, um die Regressionskoeffizienten, einen für jeden Marker, plus einen Vorneigungs- bzw. Bias-Parameter zu optimieren, um so die Wahrscheinlichkeit, dass das logistische Modell auf die Trainingsdaten angewendet wird, zu maximieren.
  • Sobald trainiert, definiert der Satz von Regressionskoeffizienten das logistische Modell. Ein Fachmann auf dem Gebiet kann leicht diesen Typ von diagnostischem Modell benutzen, um die Wahrscheinlichkeit vorherzusagen, dass beliebige neue Proben als ein ”Fall” oder ”Kontrolle” identifiziert werden, indem die Spiegel der Biomarker in die logistische Gleichung eingesetzt werden. Weiterhin kann eine ROC auch durch Berechnen der Empfindlichkeiten und Spezifitäten konstruiert werden, da der Cutoff-Wert der berechneten Wahrscheinlichkeit von 0 bis 1 variiert. Die Verwendung von logistischer Regression zum Berechnen einer Wahrscheinlichkeit, umfasst die folgenden Schritte:
  • 1) Messen der Spiegel der Biomarker:
  • Für jeden Biomarker wird dessen Spiegel gemessen und aufgezeichnet. Als Orientierung für den Praktiker, geht die folgenden Diskussion von der Verwendung von N Biomarker aus, und deren aufgeführte gemessene Spiegel sind x1, x2, ... xn-
  • 2) Berechnen des ’z’-Wertes:
  • Eine zentrale Größe, die in einem logistischen Regressionsmodell zu berechnen ist, ist der ’z’-Parameter. Er ist wie folgt definiert, z = β0 + β1x1 + β2x2 + ... + βnxn. Gl. (1)
  • Der Parameter β0 heißt die Vorneigung bzw. ”Bias” oder Achsenabschnitt, während β1, β2, ... βn als Wichtungen bezeichnet werden. Das Spezifizieren bzw. Festlegen der βs würde ein logistisches Regressionsmodell definieren. Typischerweise bestimmt ein Trainingsprozess die βs, wobei Proben mit einem bekannten Status, entweder ”Krankheitsfall” oder ”Gutartig”, verwendet werden, um eine Wahrscheinlichkeitsfunktion durch Variieren der βs zu optimieren. Sobald der Trainingsprozess abgeschlossen ist, werden die Werte der βs ausgewählt, um die optimale Wahrscheinlichkeit einer korrekten Bestimmung zu ergeben.
  • Für eine unbekannte Probe mit gemessenen Biomarker-Spiegeln: x1, x2, ... xn und einem vorbestimmten Satz von βs kann ein Fachmann den Wert von z nach Gl. (1) berechnen.
  • 3) Berechnen des Werts der Logistik-Funktion:
  • Die Logistik-Funktion, f(z), ist definiert als f(z) = ez/(ez + 1) Gl. (2)
  • Mit dem gegebenen, in 2) berechneten, Wert von z kann man f(z) gemäß Gl. (2) auswerten. In manchen Anwendungen wird der natürliche Logarithmus von z, anstatt bloß dem z, in Gl. (2) verwendet.
  • 4) Vornehmen einer Diagnostischen Zuordnung:
  • Die Logistische Funktion liefert einen Wert zwischen (0,0 und 1,0), für jeden Wert von z. In einer typischen Anwendung wird ein Cutoff von 0,5 verwendet, um zwischen den Kontrollen und den Fällen zu unterscheiden. So wird eine Probe mit einem Punktwert > 0,5 als ein Fall bezeichnet, während eine Probe mit einem Punktwert, der <= 0,5 ist, als eine Kontrolle bezeichnet wird. In einigen Anwendungen des diagnostischen Verfahrens werden andere Cutoff-Werte (zum Beispiel 0,65) verwendet.
  • BEISPIELE
  • BEISPIEL 1
  • Die folgende Erörterung und die Beispiele sind angegeben, um die vorliegende Erfindung zu beschreiben und zu veranschaulichen. Daher sollten sie nicht als den Umfang der Erfindung begrenzend ausgelegt werden. Der Fachmann auf dem Gebiet wird es richtig erkennen, dass viele andere Ausführungsformen ebenfalls innerhalb des Umfangs der Erfindung liegen, wie er in dieser Beschreibung und den Ansprüchen beschrieben ist.
  • Analyse von Daten mit Hilfe der Knowledge-Discovery-Engine.
  • Correlogic hat die Verwendung von evolutionären und Mustererkennungs-Algorithmen bei der Auswertung komplexer Datensätze, einschließlich der Knowledge Discovery Engine (KDETM) und ProteomeQuest®, beschrieben. Siehe zum Beispiel, Hitt et al., U. S.-Patent Nr. 6 925 389 , ”Process for Discriminating Between Biological States Based an Hidden Patterns From Biological Data” (erteilt am 2. August 2005); Hitt, U. S.-Patent Nr. 7 096 206 , ”Heuristic Method of Classification,” (erteilt am 22. August 2006), und Hitt, U. S.-Patent Nr. 7 240 038 , ”Heuristic Method of Classification,” (zu erteilen am 3. Juli 2007). Der Einsatz dieser Technologie, um von Eierstockkrebs-Proben abgeleitete Massenspektraldaten auszuwerten, wird weiter in Hitt et al., ”Multiple high-resolution serum proteomic features for ovarian cancer detection,” veröffentlichte US-Patentanmeldung 2006/0064253, veröffentlicht am 23. März 2006, erklärt.
  • Bei der Analyse des Datensatzes durch Correlogic's Knowledge-Discovery-Engine wurde von den folgenden Fünf-Biomarker-Panels gefunden, Empfindlichkeiten und Spezifitäten für verschiedene Stufen von Eierstockkrebs bereitzustellen, wie in der Tabelle I aufgeführt. Spezifisch gab das KDE-Modell 1 [2_0008_20] eine relativ hohe Genauigkeit für Stufe-I-Eierstockkrebs aus und enthielt diese Marker: Krebs-Antigen 19-9 (CA19-9, Swiss-Prot-Zugangsnummer: Q9BXJ9), C-reaktives Protein (CRP, Swiss-Prot-Zugangsnummer: P02741), Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Basisches-Protein (FGF-basic, Swiss-Prot-Zugangsnummer: P09038) und Myoglobin (Swiss-Prot-Zugangsnummer: P02144). Das KDE-Modell 2 [4_0002-10] gab eine relativ hohe Genauigkeit für Stufe III, IV und ”fortgeschrittenen” Eierstockkrebs und enthielt diese Marker: Hepatitis-C-NS4-Antikörper (Hep C NS4 Ab), Ribosomaler-P-Antikörper und CRP. Das KDE-Modell 3 [4_0009_140] gab eine relativ hohe Genauigkeit für Stufe I aus und enthielt diese Marker: CA 19-9, TGF alpha, EN-RAGE (Swiss-Prot-Zugangsnummer: P80511), Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF, Swiss-Prot-Zugangsnummer Nummer: P01133) und HSP 90 alpha-Antikörper. Das KDE-Modell 4 [4_0026_100] gab eine relativ hohe Genauigkeit für die Stufe II und die Stufen III, IV und ”fortgeschrittene” Eierstockkrebse wieder und enthielt diese Marker: EN-RAGE, EGF, Krebs-Antigen 125 (CA125, Swiss-Prot-Zugangsnummer: Q14596), Fibrinogen (Swiss-Prot-Zugangsnummer: Alpha-Kette P02671; Beta-Kette P02675; Gamma-Kette P02679), Apolipoprotein CIII (ApoCIII, Swiss-Prot-Zugangsnummer: P02656), Choleratoxin und CA 19-9. KDE Modell 5 [4_0027_20] gab auch eine relativ hohe Genauigkeit für Stufe-II und Stufen III, IV und ”fortgeschrittene” Eierstockkrebse wieder und enthielt diese Marker: Proteinase 3(cANCA)-Antikörper, Fibrinogen, CA 125, EGF, CD40 (Swiss-Prot Zugangsnummer: Q6P2H9), Schilddrüsen-stimulierendes Hormon (TSH, Swiss-Prot-Zugangsnummer: Alpha P01215; Beta P01222 P02679, Leptin (Swiss-Prot-Zugangsnummer: P41159), CA 19-9 und Lymphotactin (Swiss-Prot-Zugangsnummer: P47992). Es wird erwogen, dass Fachleute die analytischen KDE-Werkzeuge verwenden könnten, um andere potentiell nützliche Sätze von Biomarkern von prädiktivem oder diagnostischem Wert, basierend auf den Spiegeln ausgewählter Analyten, zu identifizieren. Es ist zu beachten, dass der KDE-Algorithmus verschiedene Marker auf Basis ihrer relativen Häufigkeiten auswählen und nutzen kann; und dass ein gegebener Marker, zum Beispiel der Spiegel von Choleratoxin in Modell IV, Null sein kann, aber in Kombination mit den anderen Marker, die in einer jeweiligen Gruppierung ausgewählt sind, relevant ist.
  • Der Fachmann wird erkennen, dass ein Datensatz begrenzter Größe, wie er in dieser Beschreibung verwendet wurde, zu unterschiedlichen Ergebnissen führen kann, zum Beispiel verschiedenen Panels von Marker und unterschiedlichen Genauigkeiten beim Vergleich des relativen Leistungsvermögens von KDE mit anderen analytischen Techniken. Diese speziellen KDE-Modelle wurden auf einem relativ kleinen Datensatz mithilfe von 40 Stufe I-Eierstockkrebsfällen und 40 normal/gutartigen Befunden aufgebaut und wurden verblindet bezüglich des Gleichgewichts der oben beschriebenen Stufe II, III/IV getestet. Somit spiegelt die Spezifität der Stufe I-Proben die Probensatz-Größe und potentielle Überpassung bzw. ”Querfitting” wieder. Der Rückgang in der Spezifität für das Gleichgewicht der Nicht-Eierstockkrebs-Proben wird auch aufgrund der relativ größeren Größe des Testsatzes relativ zum Trainings-Satz erwartet. Insgesamt stellt das für die Stufe I-Proben entwickelte Biomarker-Panel, angesichts der hohen Empfindlichkeit-Werte, auch potentiell nützliche prädiktive und diagnostische Assays für späteren Stadien von Eierstockkrebs bereit.
  • Jedoch veranschaulichen diese Beispiele von Biomarker-Panels, dass es eine Anzahl von Parameter gibt, die angepasst werden können, um das Modell-Leistungsvermögen zu beeinflussen. Zum Beispiel werden in diesen Fällen eine Vielzahl von unterschiedlichen Zahlen von Merkmalsträgern miteinander kombiniert, eine Vielzahl von Passungs-Werten wird verwendet, eine Vielzahl von verschiedenen Längen der Evolution des genetischen Algorithmus wird verwendet, und Modelle, die sich in der Anzahl der Nodes bzw. Knoten unterscheiden, werden generiert. Durch Routineexperimente, die für einen Fachmann offensichtlich sind, können auch Kombinationen dieser Parameter verwendet werden, um andere Modelle von klinisch relevantem Leistungsvermögen zu erstellen.
  • Tabelle I. Ergebnisse der Analyse unter Verwendung der Knowledge Discovery-Engine, um ein Stufe I-spezifisches Klassifikationsmodell zu entwickeln.
    Figure DE112012000990T5_0039
  • Verfahren und Analyse mithilfe von ”Random Forests”.
  • Eine bevorzugte analytische Technik, die dem Fachmann bekannt ist, ist diejenige aus Breiman, Random Forests. Machine Learning, 2001. 45: 5–32; wie ferner bei Segel, Machine Learning Benchmarks and Random Forest Regression, 2004; und Robnik-Sikonja, Improving Random Forests, in Machine Learning, ECML, 2004 Proceedings, J. F. B. e. al., Herausgeber, 2004, Springer: Berlin, beschrieben. Weitere Varianten von Random Forests sind auch nützlich und für die Verfahren der vorliegenden Erfindung beabsichtigt, zum Beispiel, Regressions-Wälder, Überlebens-Wälder, und gewichtete Population-Zufalls-Wälder bzw. ”weighted population Random Forests”.
  • Da jeder der Analyten-Assays eine unabhängige Messung einer Variablen ist, ist es unter manchen Umständen, wie dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt, angemessen, die Daten zur Anpassung an die unterschiedlichen Varianzen des jeweiligen Assays zu skalieren. In solchen Fällen würden ”biweight”, ”MAD” oder ”äquivalente Skalierung” angemessen sein, obwohl in einigen Fällen von der Skalierung nicht erwartet wird, einen erheblichen Einfluss zu haben. Eine Bootstrap-Schicht auf der Oberseite der Random Forests wurde beim Erhalten der unten erörterten Ergebnisse verwendet.
  • In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind in Betracht gezogene Panels von Biomarkern:
    • a. Krebs-Antigen 125 (CA125, Swiss-Prot Zugangsnummer: Q14596) und Epidermaler-Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGF-R, Swiss-Prot Zugangsnummer: P00533).
    • b. CA125 und C-reaktives Protein (CRP, Swiss-Prot-Zugangsnummer: P02741).
    • c. CA125, CRP und EGF-R.
    • d. Jedes einzelne oder mehrere beliebige von CA125, CRP und EGF-R, plus einem oder mehreren beliebigen aus Ferritin (Swiss-Prot-Zugangsnummer: Schwerkette P02794; Leichtkette P02792), Interleukin-8 (IL-8, Swiss-Prot-Zugangsnummer: P10145) und Gewebe-Inhibitor von Metalloproteinasen 1 (TIMP-1, Swiss-Prot-Zugangsnummer: P01033),
    • e. Jedes einzelne der Biomarker-Panels, die in Tabelle II und Tabelle III dargestellt sind.
    • f. Jedwede der vorangehenden Panels von Biomarkern (a–e) plus einem oder mehreren beliebigen aus den anderen Biomarkern in der folgenden Liste, wenn nicht vorher in den vorangehenden Paneln (a–e) eingeschlossen: Alpha-2 Macroglobulin (A2M, Swiss-Prot-Zugangsnummer: P01023), Apolipoprotein A1-1 (ApoA1, Swiss-Prot-Zugangsnummer: P02647), Apolipoprotein C-III (ApoCIII, Swiss-Prot-Zugangsnummer: P02656), Apolipoprotein H (ApoH, Swiss-Prot-Zugangsnummer: P02749), Beta-2 Microglobulin (B2M, Swiss-Prot-Zugangsnummer: P23560), Betacellulin (Swiss-Prot-Zugangsnummer: P35070), C-reaktives Protein (CRP, Swiss-Prot-Zugangsnummer: P02741). Krebs-Antigen 19-9 (CA19-9, Swiss-Prot-Zugangsnummer: Q9BXJ9), Krebs-Antigen 125 (CA125, Swiss-Prot-Zugangsnummer: Q14596), Collagen-Typ 2-Antikörper, Creatinkinase-MB (CK-MB, Swiss-Prot-Zugangsnummer: Hirn P12277; Muskel P06732), C-reaktives Protein (CRP, Swiss-Prot-Zugangsnummer: P02741), Bindegewebs-Wachstumsfaktor (CTGF, Swiss-Prot-Zugangsnummer: P29279), doppelsträngige DNA-Antikörper (dsDNA Ab), EN-RAGE (Swiss-Prot-Zugangsnummer: P80511), Eotaxin (C-C Motiv Chemokin 11, kleines-induzierbares Cytokin All und Eosinophilen-Chemotaxisprotein, Swiss-Prot-Zugangsnummer: P51671), Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGF-R, Swiss-Prot-Zugangsnummer: P00533), Ferritin (Swiss-Prot-Zugangsnummer: Schwerkette P02794; Leichtkette P02792), Follikel-stimulierendes Hormon (FSH, Follikel-stimulierendes Hormon Beta-Untereinheit, FSH-beta, FSH-B, Follitropin-beta-Kette, Follitropin-Untereinheit beta, Swiss-Prot-Zugangsnummer: P01225), Haptoglobin (Swiss-Prot-Zugangsnummer: P00738), HE4 (Größeres Epididymis-spezifisches Protein E4, Epididymales sekretorisches Protein E4, Putativer Proteaseinhibitor WAP5 und WAP-Vier-Disulfid-Kerndomänen-Protein 2, Swiss-Prot-Zugangsnummer: Q14508), Insulin (Swiss-Prot-Zugangsnummer: P01308), Insulin-like Wachstumsfaktor 1 (IGF-1, Swiss-Prot-Zugangsnummer: P01343), Insulin-like Wachstumsfaktor II (IGF-II, Somatomedin-A, Swiss-Prot-Zugangsnummer: P01344), Insulin-Faktor VII (Swiss-Prot-Zugangsnummer: P08709), Interleukin-6 (IL-6, Swiss-Prot-Zugangsnummer: P05231), Interleukin-8 (IL-8, Swiss-Prot-Zugangsnummer: P10145), Interleukin-10 (IL-10, Swiss-Prot-Zugangsnummer: P22301), Interleukin-18 (IL-18, Swiss-Prot-Zugangsnummer: Q14116), Leptin (Swiss-Prot-Zugangsnummer: P41159), Lymphotactin (Swiss-Prot-Zugangsnummer: P47992), Makrophagen-abgeleitetes Chemokin (MDC, Swiss-Prot-Zugangsnummer: 000626), Makrophagen-Inhibitorischer Faktor (SWISS PROT), Makrophagen-Inflammatorisches Protein 1 alpha (MIP-lalpha, Swiss-Prot-Zugangsnummer: P10147), Makrophagenmigrations-Inhibitorischer Faktor (MIF, Phenylpyruvat-Tautomerase, Glykosylierung-hemmender Faktor, GIF, Swiss-Prot-Zugangsnummer: P14174), Myoglobin (Swiss-Prot-Zugangsnummer: P02144), Ostopontin (Knochen-Sialoprotein 1, Sezerniertes Phosphoprotein 1, SPP-1, Harnweg-Stein-Protein, Nephropontin, Uropontin, Swiss-Prot-Zugangsnummer: P10451), Pankreasinselzellen(GAD)-Antikörper, Prolactin (Swiss-Prot-Zugangsnummer: P01236), Stammzell-Faktor (SCF, Swiss-Prot-Zugangsnummer: P21583), Tenascin C (Swiss-Prot-Zugangsnummer: P24821), Gewebe-Inhibitor von Metalloproteinasen 1 (TIMP-1, Swiss-Prot-Zugangsnummer: P01033), Tumor-Nekrose-Faktor-alpha (TNF-alpha, Swiss-Prot-Zugangsnummer: P01375), Tumor-Nekrose-Faktor-RII (TNF-RII, Swiss-Prot-Zugangsnummer: Q92956), von-Willebrand-Faktor (vWF, Swiss-Prot-Zugangsnummer: P04275) und die anderen Biomarker, die in den in dieser Beschreibung zitierten Literaturstellen als informativ für Krebs identifiziert sind.
  • Unter Verwendung des analytischen Random Forests-Ansatzes wurde ein bevorzugtes Sieben-Biomarker-Panel identifiziert, das einen hohen prädiktiven Wert für Stufe I-Eierstockkrebs hat. Es umfasst: ApoA1, ApoCIII, CA125, CRP, EGF-R, IL-18 und Tenascin. Im Zuge des Aufbaus und des Selektierens der relativ genaueren Modelle für Stufe I-Krebserkrankungen, die durch Random Forests unter Verwendung dieser Biomarkern erzeugt wurden, reichte die Empfindlichkeit für Stufe I-Eierstockkrebs von etwa 80% bis etwa 85%. Die Empfindlichkeit betrug auch etwa 95 für Stufe II und war zu etwa 94% empfindlich für Stufe III/IV. Die Gesamtspezifität betrug etwa 70%.
  • Ebenso wurde ein bevorzugtes Sieben-Biomarker-Panel identifiziert, das einen hohen prädiktiven Wert für Stufe II hat. Es umfasst: B2M, CA125, CK-MB, CRP, Ferritin, IL-8 und TIMP1. Ein bevorzugtes Modell für Stufe II hatte eine Empfindlichkeit von etwa 82% und eine Spezifität von etwa 88%.
  • Für Stufe III, Stufe IV und Fortgeschrittenen Eierstockkrebs wurde das folgende 19-Biomarker-Panel identifiziert: A2M, CA125, CRP, CTGF, EGF-R, EN-RAGE, Ferritin, Haptoglobin, IGF-1, IL-8, IL-10, Insulin, Leptin, Lymphotactin, MDC, TIMP-1, TNF-alpha, TNF-RII, vWF. Ein bevorzugtes Modell für Stufe III/IV hatte eine Empfindlichkeit von etwa 86% und eine Spezifität von etwa 89%.
  • Andere bevorzugte Biomarker- oder Analyt-Panels für die Erfassung, Diagnose und Überwachung von Eierstockkrebs werden in Tabelle II und in Tabelle III gezeigt. Diese Panels beinhalten CA-125, CRP und EGF-R und in den meisten Fällen, CA19-9. In Tabelle II werden 20 solcher Panels von sieben Analyten, die jeweils aus 20 bevorzugten Analyten ausgewählt sind, in den Spalten, nummeriert von 1 bis 20, angezeigt. In der Tabelle III werden weitere 20 solcher Panels von sieben Analyten, die jeweils aus 23 bevorzugten Analyten ausgewählt sind, in den Spalten, nummeriert von 1 bis 20, angezeigt.
  • Figure DE112012000990T5_0040
  • Figure DE112012000990T5_0041
  • Andere bevorzugte Biomarker-Panels (oder Modelle) für alle Stufen von Eierstockkrebs schließen folgende ein: (a) CA-125, CRP, EGF-R, CA-19-9, Apo-AI, Apo-CIII, IL-6, IL-18, MIP-1a, Tenascin C und Myoglobin; (b) CA125, CRP, CA19-9, EGF-R, Myoglobin, IL-18, Apo CIII; und (c) CA125, CRP, EGF-R, CA19-9, Apo CIII, MIP-1a, Myoglobin, IL-18, IL-6, Apo AI, Tenascin C, vWF, Haptoglobin, IL-10. Optional können einer oder mehrere der folgenden Biomarker zu diesen oder beliebigen der anderen Biomarkergruppen hinzugefügt werden, die oben in Text oder Tabellen offenbart sind (in dem Ausmaß, dass jegliche solche Panels nicht bereits spezifisch darin identifiziert sind): vWF, Haptoglobin, IL-10, IGF-I, IGF-II, Prolactin, HE4, ACE, ASP und Resistin.
  • Es wird von den Anmeldern der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen, dass zusätzliche, informative Sätze von Analyten (oder Biomarkern) einen oder mehr beliebige, zwei oder mehr beliebige, drei oder mehr beliebige und vier oder mehrere beliebige der Analyten, die unten in Tabelle IV dargestellt sind, ebenso wie beliebige der Biomarkersätze in den Tabellen I, II oder III, kombiniert mit einem oder mehreren beliebigen der Analyten in Tabelle IV, und einen oder mehrere beliebige der Marker in Tabelle IV, kombiniert mit beliebigen der anderen Biomarkersätze, die in den obigen Absätzen 70–75 erörtert oder anderswo in dieser Patentspezifikation identifiziert sind, einschließen. Zusätzliche Sätze informativer Analyten für den Einsatz in den Test-Kits und Verfahren der vorliegenden Erfindung schließen ein oder mehrere beliebige von CA-125, CRP, ECG-R und HE-4 zusammen mit einem oder mehreren beliebigen der Biomarker in Tabelle IV ein.
  • Somit umfassen vorgesehene Sätze von Biomarkern Kombinationen wie: CA-125, CRP und einen oder mehrere (oder zwei oder mehrere) der Biomarker in Tabelle IV; CA-125, EGF-R und einen oder mehrere beliebige (oder zwei oder mehrere) der Biomarker in Tabelle IV; CA-125, HE-4 und einen oder mehrere beliebige (oder zwei oder mehrere) der Biomarker in Tabelle IV; CRP, EGF-R und einen oder mehrere beliebige (oder zwei oder mehrere) der Biomarker in Tabelle IV; CRP, HE-4 und einen oder mehrere beliebigen (oder zwei oder mehrere) der Biomarker in Tabelle IV; und EGF-R, HE-4 und einen oder mehrere beliebige (oder zwei oder mehrere) der Biomarker in Tabelle IV. Es wird erwogen, dass Marker mit Aussagekraft in den vorstehenden Biomarkersätzen gemäß der vorliegenden Erfindung VCAM-1, IL-6R, IL-18R und Sortillin einschließen.
  • Darüber hinaus umfassen Biomarker-Panels einen oder mehrere beliebige (oder zwei oder mehrere) der Biomarker in Tabelle IV zusammen mit beliebigen zwei oder mehr, drei oder mehr und vier oder mehr von diesen drei Sätzen von Biomarkern: (a) CA125, Transthyretin, ApoA-I, B2-Mikroglobulin und Transferrin; (b) CA125 und Leptin, Prolaktin, Osteopontin und Insulin-like Wachstumsfaktor-II; und (c) OvaPlex: CA125, C-reaktives Protein, Serum-Amyloid A, IL-6 und IL-8.
  • Im allgemeinen werden lösliche Formen dieser Analyten in Betracht gezogen, einschließlich Protein- und Peptidfragmenten und -domänen, die in den Blutkreislauf und die Lymphbahnen abgesondert werden. Diese Analyten können in Blut, Lymphe, Serum, Urin und anderen Körperflüssigkeiten detektiert und analysiert werden. Ebenfalls in den Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen werden Autoantikörper gegen beliebige der offenbarten Biomarker, sowie Nukleotide, die diese Biomarker codieren und die als ein weiterer indirekter Weg detektiert und quantifiziert werden können, um die Spiegel dieser Marker zu beurteilen. Aptamere und andere Verbindungen, die zur Erfassung solcher molekularen Spezies brauchbar sind, sind dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt. Tabelle IV.
    Analyt # Informative Analyten
    1 CA 15-3 (MUC-1)
    2 Her2/Neu (erbB-2)
    3 Kallikrein-5
    4 Makrophagen-Inhibitorischer Factor (MIF)
    5 Osteopontin
    6 TAG-72
    7 Gesamtes IGF-II
    8 HE4
    9 I16-R
    10 I16-R, abgesonderte Form von Volllängen-IL6-R
    11 IL18-R
    12 IL-18BP
    13 VCAM-1
    14 IP-10 (interferon-gamma-induzierbares 10 kD-Protein)
    15 SMRP
    16 TgII (Gewebe-Transglutaminase)
    17 Exotaxin-1
    18 Cyfra 21-1 (Cytokeratin 19-Fragment)
    19 IGF2BP3
    20 TIMP-1
    21 Alpha-1 Antitrypsin
    22 MMP7
    23 TAG-72
    24 IL-8
    25 IL-6
    26 Sortillin
    27 CD40
    28 CA 15-3
    29 Alpha 1-Antichymotrypsin
    30 VEGF
    31 TTR (Prä-Albumin)
    32 Haptoglobin
  • Jedwede zwei oder mehrere der oben beschriebenen bevorzugten Biomarker werden prädiktiven Wert haben; jedoch kann das Hinzufügen eines oder mehrerer der anderen bevorzugten Marker zu einem beliebigen der hierin beschriebenen analytischen Panels den prädiktiven Wert des Panels für klinische Zwecke erhöhen. Zum Beispiel kann das Hinzufügen eines oder mehrerer der verschiedenen, oben aufgelisteten oder anderweitig in den in dieser Beschreibung zitierten Literaturstellen identifizierten Biomarker ebenfalls den prädiktiven Wert des Biomarker-Panels erhöhen und wird daher ausdrücklich mit in Betracht gezogen. Der Fachmann kann leicht den Nutzen solcher zusätzlicher Biomarker beurteilen. Es wird in Betracht gezogen, dass zusätzliche Biomarker, passend für die Hinzufüngung zu den Sätzen (oder Panels) von Biomarkern, die in dieser Patentspezifikation offenbart oder beansprucht sind, nicht zu einer Verringerung entweder der Empfindlichkeit oder der Spezifität, ohne einen entsprechenden Anstieg in entweder Empfindlichkeit oder Spezifität oder ohne einen entsprechenden Anstieg in der Robustheit des Biomarker-Panels insgesamt, führen werden. Eine Empfindlichkeit und/oder Spezifität von mindestens etwa 80% oder höher, stärker bevorzugt mindestens etwa 85% oder höher, und am meisten bevorzugt mindestens etwa 90% oder 95% oder höher, sind bevorzugt.
  • Die Ergebnisse der offenbarten Diagnostik können eine Ausgabe zum Nutzen des Anwenders oder Diagnostikers sein, oder können ansonsten auf einem Medium, wie, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, einem Computer-Bildschirm, einem computerlesbaren Medium, einem Blatt Papier oder einem anderen sichtbaren Medium angezeigt werden.
  • Die vorhergehenden Ausführungsformen und Vorteile dieser Erfindung sind zum Teil in der vorstehenden Beschreibung und Beispielen dargelegt und werden zum Teil für Fachleute auf dem Gebiet aus dieser Beschreibung und den Beispielen offensichtlich, und können weiter aus der Umsetzung der Erfindung, wie hierin offenbart, erkannt werden. Beispielsweise sind die Techniken der vorliegenden Erfindung leicht auf die Überwachung des Verlaufs bzw. der Progression von Eierstockkrebs bei einem Individuum anwendbar, und zwar durch Auswerten einer Probe oder biologischen Probe, wie oben beschrieben, und dann Wiederholen der Auswertung an einem oder mehreren späteren Zeitpunkten, so dass ein Unterschied in der Expression oder Fehlregulation der relevanten Biomarker über den Lauf der Zeit ein Hinweis auf die Progression des Eierstockkrebs in diesem Individuum oder das Ansprechen auf eine Therapie ist. Alle Literaturhinweise, Patente, Zeitschriftenartikel, Webseiten und andere Dokumente, die in dieser Patentanmeldung identifiziert sind, werden hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen.
  • BEISPIEL 2
  • Seren stammen aus einer prospektiven Sammlung, die speziell zur Entwicklung und Validierung des Leistungsvermögens eines Eierstockkrebs-Tests durchgeführt wurde. Alle Proben wurden nach einem einheitlichen Protokoll aus 11 verschiedenen Standorten, die bezüglich der Einhaltung überwacht wurden, gesammelt. Die Western Institutional Review Board (Olympia, WA) und die Ethikkommissionen bzw. IRBs der einzelnen Standorte genehmigten die Studien unter der ”FDA Investigational Device Exemption” (IDE) Nummer G050132. Die Sammelstellen (und IRBs) waren: Cedars-Sinai Medical Center, Los Angeles, CA (Cedars-Sinai Institutional Review Board; Florida Gynecologic Oncology, Fort Meyers, FL (Lee Memorial Health System Institutional Review Committee); Florida Hospital Cancer Institute, Orlando, FL (Florida Hospital Institutional Review Board; The Harry and Jeanette Weinberg Cancer Institute am Franklin Square Hospital, Baltimore, MD (MedStar Research Institute Georgetown Oncology Institutional Review Board; Holy Cross Hospital, Silver Spring, MD (Holy Cross Institutional Review Board; North Shore – Long Island Jewish Health System, Manhasset, NY (Institutional Review Board North Shore-Long Island Jewish Health System); SUNY in Stony Brook, NY, Stony Brook, NY (Ausschuss für Forschung am Menschen SUNY Stony Brook); Universität Alabama in Birmingham, Birmingham, AL (The University of Alabama at Birmingham Institutional Review Board for Human Use); University of Southern California, Norris Cancer Center, Los Angeles, CA und Women's and Children's Hospital, Los Angeles, CA (University of Southern California Health Sciences Campus Institutional Review Board; Wake Forest University Health Sciences, Winston-Salern, NC (Institutional Review Board Wake Forest University School of Medicine); und das Women and Infants Hospital of Rhode Island, Providence, RI (Institutional Review Board Women and Infants' Hospital of Rhode Island). Die Studien-Einschlusskriterien waren Frauen, die mindestens 18 Jahre alt sind, welche symptomatisch für Eierstockkrebs gemäß den ”National Comprehensive Cancer Network (NCCN) Ovarian Cancer Treatment Guidelines for Patients” (Eierstockkrebs-Behandlungsrichtlinien für Patienten) sind, was Frauen mit oder ohne einer pelvinen Geschwulst einschließt. Die Teilnehmerinnen mussten für eine gynäkologische Chirurgie basierend auf der Sorge, dass sie Eierstockkrebs hätten, eingeplant worden sein, und eine postoperative pathologische Untersuchung der Eierstöcke und herausgeschnittenen Geweben war erforderlich, um die klinische Gewissheit des Krankheits-Status zu etablieren. Ausschlusskriterien waren Frauen, die die Einschlusskriterien nicht erfüllten, keine Einwilligung geben konnten, schwanger waren, oder schon früher wegen Eierstockkrebs behandelt worden waren. Eine schriftliche Einverständniserklärung wurde für jede Teilnehmerin in der Studie erhalten. Alle Daten wurden anonymisiert, und es wurden den Ärzten oder Patientinnen keine Ergebnisse zurückgemeldet.
  • 149 Proben wurden aus den Patientinnen mit Pathologie-bestätigtem Eierstockkrebs verwendet, und 350 Proben aus den Patientinnen mit Pathologie-bestätigten gutartigen Befunden (1). Die Eierstockkrebs-Proben schloßen alle Stufen und üblichen Subtypen der Erkrankung ein. Die gutartigen Proben schloßen die gängigen Typen von gutartigen Befunden ein, die in der gesamten Studienpopulation zu beobachten waren. Komplette Klinikopathologie-Berichte, erhalten nach Operation, zusammen mit Alter, Rasse, Staging, Subtyp der Patientin und codiertem Entnahme-Standort begleiteten jede Probe.
  • Vor jedwedem Eingreifen wurden Blutproben (10 ml) in Rotdeckel-Glas-Vacutainer-Röhrchen abgesammelt. Das Blut wurde mindestens 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerinnen gelassen, bei 3500 g für 10 Minuten zentrifugiert, und das erhaltene Serum wurde in vormarkierte Cryotubes abgeführt und sofort bei –80°C gelagert. Die Verarbeitung von Blutentnahme bis zum Einfrieren wurde innerhalb von 2 Stunden beendet. Alle Proben wurden auf Trockeneis zu einem einzelnen bestimmten Standort zur Aufbewahrung transportiert. Zum Aliquotieren wurden alle Proben in einer Aufschlämmung von Wasser und Eis aufgetaut, dann in Probenröhrchen, die mit codierten Kennungen markiert waren, übertragen, die alle nachfolgenden Experimentatoren hinsichtlich Proben-Krankheits-Status verblindeten.
  • Multiplex-Immunoassays
  • Zweihundertundneunundfünfzig Serum-Biomarker wurden unter Verwendung eines eigens entwickelten Multiplex-Immunoassays (Human DiscoveryMAP® v1.0 und Human OncologyMAP® v1.0; (2) gemessen. Jeder Assay wurde mithilfe einer 8-Punkt-Standardkurve, durchgeführt in zweichfacher Ausfertigung, kalibriert. Messungen der Median-Fluoreszenzintensität (MFI) wurden in endgültige Protein-Konzentrationen mithilfe von Kurvenanpassungs-Software interpoliert. Das Leistungsvermögen des Assays wurde mithilfe von Qualitätskontrolle(QC)-Proben bei niedrigen, mittleren und hohen Spiegeln für jeden Analyten in zweifacher Ausfertigung verifiziert. Alle Standard- und QC-Proben lagen in einer auf komplexem Serum basierenden Matrix vor, um der Probenhintergrund-Matrix zu entsprechen. Da Seren bei einer zuvor optimierten Verdünnung analysiert wurden, wurde jeglicher Ablesung über der maximalen Konzentration der Eichkurve die Konzentration des höchsten Standards zugeordnet, wohingegen allen unterhalb der minimalen Konzentration der Wert 0 zugeordnet wurde. Für die Analyse wurde die Proben-Laufreihenfolge randomisiert, um jedwede sequentielle Vorbeeinflussung aufgrund des Vorhandenseins oder der Abwesenheit von Krankheit, Subtyp oder Stadium der Erkrankung, Alter der Patientin, oder Alter der Serumprobe zu vermeiden.
  • Datenanalyse
  • Deskriptive Statistik, Receiver-Operating-Charakteristik(ROC)-Kurven und grafische Darstellungen (Dot-Plots) für Serum-Analyt-Konzentrationen wurden unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Software-Paketen ausgeführt. Statistische Unterschiede wurden mithilfe des nicht-parametrischen Kruskal-Wallis-Tests (ANOVA), gefolgt von einem Dunn's-Mehrfachvergleich Post-Test bestimmt. Für alle statistischen Vergleiche wurde ein P-Wert < 0,05 als statistisch signifikant ausgelegt. Eine Pearson-Korrelations-Matrix wurde unter Verwendung einer Multispektralanalyse-Anwendung erstellt.
  • Unter Verwendung von Multiplex-Immunoassays wurden die Spiegel von 259 Molekülen gleichzeitig in Seren aus 149 Patientinnen mit Pathologie-bestätigtem epithelialen Eierstockkrebs und 350 Personen mit gutartigen Eierstock-Befunden gemessen (1). Um die Bestimmung der Fähigkeit von Biomarkern, zwischen symptomatisch ähnlichem Krebs und gutartigen gynäkologischen Zuständen zu unterscheiden, zu erleichtern, wurden alle Proben aus der gleichen klinischen Population erhalten – Frauen, die der Chirurgie in erster Linie aufgrund des Vorhandenseins einer adnexalen Geschwulst präsentiert wurden. Alle Proben wurden vor jedwedem Eingriff, und bevor der Krankheits-Status bekannt war, abgesammelt. Der Krankheits-Status wurde anschließend durch Pathologie-Prüfungen des entnommenen Gewebes identifiziert. Seren wurden unter Verwendung eines einzigen Probenahme-Protokolls abgesammelt, dessen Einhaltung überwacht wurde. Die Studie wurde prospektiv an 11 Standorten, die ebenfalls hinsichtlich der Einhaltung des Protokolls überwacht wurden, durchgeführt. Dies sicherte die Probenqualität und beseitigte die Möglichkeit jedweder Entnahme-, Verarbeitungs- oder biologischen Verzerrungen in dem Probesatz, was bei vielen anderen Studien ein Bedenken ist. Es wurden keine normalen gesunden Proben in dieser Studie verwendet, da sie typischerweise einfacher als die gutartigen Befunde zu klassifizieren sind und Störfaktoren, wie geringere Stress-Spiegel im Vergleich zu Patienten, die vor einer Operation stehen, einführen. Wie erwartet, war das mediane Alter der Patientinnen bei Personen mit Eierstockkrebs höher (61 Jahre) als bei denjenigen mit gutartigen Erkrankungen (51 Jahre) und stieg mit dem vorhandenen Stadium der Erkrankung an (1). Die Verteilung der Eierstockkrebs-Subtypen war ähnlich zur Verteilung, die für alle Eierstockkrebs-Fälle in der US-Bevölkerung als Ganzem beobachtet wurde, mit einem größeren Anteil an serösem Karzinom (55%) als an anderen Subtypen (1). Die gutartigen Kontrollen in der Studie waren vertretend für häufige gutartige Eierstock-Zustände, einschließlich Cystadenom, Cystadenofibrom und Fibrom.
  • Um die Konsistenz und Unterstützung bei Biomarker-Vergleichen zu gewährleisten, wurden alle 259 Marker und 499 Proben auf einer einzigen Plattform an einem einzigen Ort mithilfe einer Auswahl von rigorous qualifizierten, Hochdurchsatz-Multipleximmunassays gemessen. Diese Untersuchung baute auf unserer bisherigen Profilierung von 104 Serum-Biomarkern auf. Der Großteil der zusätzlichen 155 Serumbiomarker in der vorliegenden Studie wurde im Rahmen von zwei NCI-finanzierten ”Small Business Innovative Research”(SBIR)-Zuschüssen entwickelt, die speziell auf Marker zielten, die angemessene Unterstützung in der Literatur hatten, um auf eine bedeutende Rolle als Krebs-Biomarker schließen zu lassen. Die ausgewählten Biomarker deckten ein breites Spektrum an biologischen Funktionen ab, die vor allem mit Krebs in Verbindung gebracht werden, einschließlich Krebs-Antigenen, Hormonen, Gerinnungsfaktoren, Gewebe-Modellierungsfaktoren, Lipoprotein-Bestandteilen, Proteasen und Protease-Inhibitoren, Marker des kardiovaskulären Risikos, Wachstumsfaktoren, Cytokin/Chemokinen, löslichen Formen von Zell-Signalisierungs-Rezeptoren und entzündlichen und Akute-Phase-Reaktanten (2). Die vorliegende Studie ist die umfangreichste und konsequenteste Einzelstudie der Immunoassay-Profilierung von Molekülen unter Verwendung vollständig charakterisierter, qualitätskontrollierter Proben.
  • Für jeden Biomarker wurde eine ROC-Kurve erstellt, und ihr Fläche-unterder-Kurve(AUC)-Wert wurde mit jenem eines uninformativen Markers (AUC = 0,500) verglichen. Insgesamt 175 Biomarker waren in den Eierstockkrebs-Proben fehlreguliert (P-Werte > 0,05), relativ zu den gutartigen gynäkologischen Befunden. Davon waren 136 Biomarker hochreguliert und 39 herunterreguliert (3 und 4). Die Biomarker mit den größten AUC-Werten waren bei Eierstockkrebs überwiegend hochreguliert (3, 4 und 5) mit Werten im Bereich von 0,599 bis 0,933. Die am meisten hochregulierten Marker waren HE4 und CA-125 mit AUC-Werten von 0,933 bzw. 0,907, jeweils gefolgt von Interleukin-2-Rezeptor-α (IL-2-Rezeptor-α), α1-Antitrypsin, C-reaktives Protein, YKL-40, zellulärem Fibronectin, Krebs-Antigen 72-4 (CA-72-4) und Prostasin mit AUC-Werten zwischen 0,829 und 0,800 (3). Die restlichen 127 hochregulierten Biomarker wiesen ein Kontinuum von AUC-Werten von 0,797 bis 0,556 auf (4). Vierunddreißig der verbleibenden 127 Marker hatten AUC-Werte über 0,700. Für herunterregulierte Biomarker lagen die AUC-Werte im Bereich von 0,556 bis 0,745 (4). Die zwei informativsten davon erwiesen sich als Transthyretin (0,745) und Apolipoprotein A-IV (0,713), während die übrigen Biomarker AUC-Werte unter 0,700 hatten.
  • Dies ist das erste Mal, dass dreizehn der zwanzig Biomarker mit den höchsten AUC-Werten, nämlich HE4, IL-2-Rezeptor-α, YKL-40, zelluläres Fibronektin, CA 72-4, Prostasin, MMP-7, VEGF-B, Calprotectin, IGFBP-2, LOX-1, Neuropilin-1 und MPIF-1, zusammen genau quantifiziert wurden, auf einem kohärenten Satz von Proben, unter einheitlich kontrollierten analytischen Bedingungen, um ihr Nachweisvermögen für Eierstockkrebs zu bestimmen. Dieser Ansatz verbessert Biomarker-Vergleiche und sollte bei der Auswahl von Biomarkern in der Entwicklung von Multi-Biomarker-Panels unterstützen.
  • Als ein Vergleich zwischen den zwei informativsten Biomarkern in dieser Studie wurde die Empfindlichkeit für HE4 und CA-125 über einen Bereich von Spezifitätswerten ermittelt. Darüber hinaus wurde der optimale Cut-off-Wert, definiert als jener, der die größte Summe von Spezifität und Empfindlichkeit ergibt, für jeden Biomarker berechnet. Die Empfindlichkeit für HE4 allein verringerte sich von 89,0% auf 57,1%, während die Spezifität von 80% auf 99,6% stieg, während für CA-125 allein die Empfindlichkeit sich von 85,2% auf 30,2% verringerte. Der optimale Cutoff für HE4 und CA-125 betrug 54,8 pM bzw. 52,5 U/ml, was Empfindlichkeitswerte von 86,6% bzw. 74,5%, und Spezifitätswerte von 89,4% bzw. 93,7% ergab. Wie aus den ROC-Kurven erwartet, gibt es Kompromisse, wenn kein einzelner Biomarker hohe Spezifität bei einem vorbestimmten hohen Empfindlichkeitswert aufzeigt. Zum Beispiel waren bei 100% Empfindlichkeit, sowohl HE4 als auch CA-125 zu 0% spezifisch. Bei 98% Empfindlichkeit, hatte HE4 30,6% Spezifität und CA-125 hatte 35,4% Spezifität. Um jedoch relativ gute Spezifitätswerte zu bekommen, mussten die Empfindlichkeiten auf ungefähr 95% gesenkt werden. Bei 95% Empfindlichkeit hatte HE4 50,9% Spezifität, und CA-125 hatte 45,4% Spezifität. Diese Werte, zusammen mit den AUC-Werten, wiesen darauf hin, dass, auf dieser Population, HE4 ein etwas besseres Leistungsvermögen zeigte als CA-125. Darüber hinaus zeigen diese Ergebnisse, dass keiner der Biomarker in dieser Studie ausreichend informativ als Standalone-Eierstockkrebs-Biomarker für breit gefasste Anwendungen ist, und dass Biomarker-Panels benötigt werden, um das Leistungsvermögen auf klinisch akzeptable Niveaus zu verbessern.
  • Um festzustellen, ob manche Biomarker ein größeres Unterscheidungsvermögen für verschiedene Stadien von Krebs, vor allem frühe Stadien, aufweisen könnten, wurden die neun Biomarker mit AUC-Werten über 0,800 auf FIGO-Stadium I- und II-Proben verglichen, wo der größte Bedarf an Marker-basierter Erkennung besteht (6). Für FIGO-Stadium-I-Proben waren sowohl HE4 als auch CA-125 in hohem Maße unterscheidend (P-Werte < 0,001), gefolgt in absteigender Reihenfolge von C-reaktivem Protein und CA 72-4 (P-Werte von 0,001–0,01), dann α1-Antitrypsin, YKL-40 und Prostasin (P-Werte von 0,01–0,05). Für IL2-Rezeptor-α und zelluläres Fibronektin gab es keine statistischen Unterschiede zwischen Stufe-I-Krebs und gutartigen Erkrankungen (P-Werte > 0,05). Für FIGO-Stufe-II-Proben waren wiederum sowohl HE4 als auch CA-125 in hohem Maße zur Unterscheidung dienlich (P-Werte < 0,001), gefolgt von IL2-Rezeptor-α, α1-Antitrypsin, YKL-40 und CA 72-4 (P-Werte von 0,001–0,01), und dann C-reaktivem Protein und zellulärem Fibronektin (P-Werte von 0,01–0,05). Für Prostasin gab es keinen statistischen Unterschied (P-Wert > 0,05).
  • Die gleichen neun Biomarker wurden ausgewertet, um festzustellen, ob es statistisch signifikante Unterschiede zwischen Proben von Frauen mit gutartigen Erkrankungen und Frauen mit jedem einzelnen Subtyp von Eierstockkrebs gab (7). Für klarzellige Karzinome waren α1-Antitrypsin und C-reaktives Protein in hohem Maße zur Unterscheidung dienlich (P-Werte < 0,001), gefolgt in absteigender Reihenfolge von HE4, CA-125 und IL2-Rezeptor α (P-Werte von 0,01–0,05). Für YKL-40, zelluläres Fibronektin, CA 72-4 und Prostasin gab es keine statistischen Unterschiede (P-Wert > 0,05). Für endometrioide Karzinome gab es hochsignifikante Unterschiede für HE4 und CA-125 (P-Werte < 0,001) und signifikante Unterschiede für C-reaktives Protein, zelluläres Fibronektin, CA 72-4 (P-Werte 0,01–0,05). Für α1-Antitrypsin, IL2-Rezeptor α, YKL-40 und Prostasin gab es keine statistischen Unterschiede (P-Werte > 0,05). Für muzinöse Karzinome wies nur CA 72-4 einen signifikanten Unterschied auf (P-Wert 0,01–0,05). Für seröse und gemischte Karzinome wiesen alle neun Biomarker hochsignifikante Unterschiede auf (P-Wert < 0,001). Daher, mit Ausnahme der muzinösen Karzinome, sind die neun Biomarker informativ für alle gängigen Eierstockkrebs-Subtypen, wobei jedoch ihre verschiedenen Unterscheidungsleistungen darauf hinweisen, dass verschiedene Kombinationen von Markern für verschiedene Subtypen nützlich sein können. Wenngleich es bevorzugt gewesen wäre, informativere Biomarker für den muzinösen Subtyp zu finden, kommt dieser relativ selten vor. Tatsächlich waren nur 6,0% der Krebserkrankungen in der Studie vom muzinösen Subtyp (1).
  • Aus Gründen der Einfachheit und Wirtschaftlichkeit ist die Verwendung eines einzelnen Biomarkers gegenüber mehreren Biomarker bevorzugt. Es ist jedoch klar, dass einzelne Biomarker nicht in der Lage sein mögen, die inhärente Vielfalt von komplexen Krankheiten, wie Eierstockkrebs, zu erfassen. Ein informativer Test strebt danach, mehrere Biomarker in einer solchen Weise zu kombinieren, dass jeder Marker einen anderen Typ von Unterscheidungsvermögen beisteuert, entweder für die gesamte Patientinnenpopulation oder die Populations-Unterteilungen, die von den anderen Marker vorgenommen wurden. Einfach ausgedrückt, haben Marker mit schlechter Korrelation zueinander eine größere Chance, individuell einen Beitrag zu einem Panel zu leisten, als Marker mit einer starken Korrelation zueinander. Daher wurde eine Korrelationsanalyse anhand der stärksten Eierstockkrebs-Marker – den 124 Biomarker mit größeren AUC-Werten als 0,600 – durchgeführt. Die co-variierenden Moleküle wurden agglomerativ mit hierarchischer Clustering unter Verwendung von Pearson-Korrelationskoeffizienten als dem Distanzmaß sortiert. Die paarweisen Ergebnisse wurden zu einer 124×124-Matrix zusammengefügt (nummeriert von 0–123) und mithilfe einer Wärme-Karte angezeigt, wobei eine intensive rote Farbe eine starke positive Korrelation bedeutet und Blau eine negative Korrelation bedeutet (8). Es gab vier Haupt-Cluster (Cluster A bis D, 8–13), wobei jeder Cluster Marker repräsentiert, die stark miteinander korreliert sind. Jeder dieser Cluster enthielt Marker, die starke Eierstockkrebs-Marker sind. Der Cluster A (Marker 1–10) enthielt zwei starke Eierstockkrebs-Marker, CA 72-4 und MPIF-1 (9 und 10). TNFR2 wurde in Cluster B gefunden (Marker 58–67; Figuren XXX (Tabellen S3 und S5). Der Cluster C (Marker 79–87) enthielt die zwei stärksten Eierstockkrebs-Marker (HE4, CA-125) sowie Prostasin und VEGF-B (9 und 12). Die stärksten Korrelationen mit CA-125 waren Mesothelin (Pearson-Korrelationskoeffizient = 0,600), Maspin (0,599), VEGF-D (0,568), Prostasin (0,551), Kallikrein-7 (0,507) und VEGF-B (0,505). Maspin (0,517) korrelierte am stärksten mit HE4, gefolgt von TIMP-1 (0,470), Prostasin (0,463), IL-2-Rezeptor-α (0,424), VEGF-B (0,413) und VEGF-D (0,409). Schließlich war der größte Cluster (Cluster D; Biomarker 32–55) aus lose korrelierten Marker zusammengesetzt, die mehrere gute Eierstockkrebs-Marker enthielten, einschließlich Calprotectin, LOX-1, IL-6, YKL-40, zelluläres Fibronektin, Neuropilin-1, α1-Antitrypsin, TIMP-1, C-reaktives Protein und IL-2-Rezeptor-α (9 und 13). Diese Korrelationsdaten können dabei helfen, die Entwicklung von Biomarker-Panels voranzutreiben und können Einblicke in die Signalwege geben, die bei Eierstockkrebs gestört sind.
  • Das kombinierte Leistungsvermögen der neun Marker mit größeren AUC-Werten als 0,800 wurde ausgewertet, um den prädiktiven Wert eines einfachen Multi-Marker-Szenarios zu bestimmen. Die neun Marker wurden unter Verwendung von logistischer Regression kombiniert, die eine AUC von 0,950 ergab. (Standardfehler: 0,01213, 95%-CI: 0,926–0,974; P-Wert: < 0,0001). Als Nächstes wurde dieses Leistungsvermögen gegen die fünf Marker in dem FDA-zugelassenen OVA1-Test verglichen. Die Proben in dieser Studie wurden von gynäkologischen Onkologen gesammelt. Eine ähnliche Studienpopulation wurde in der OVA1 510(k)-Zusammenfassung mit 100% Empfindlichkeit (nur invasiver Eierstockkrebs) und 32,9% Spezifität berichtet. Die fünf Marker wurden kombiniert und ein logistisches Regressionsmodell aufgebaut. Konsistent bzw. in Einklang mit der OVA1-510(k)-Zusammenfassung mit diesem Probensatz, bei 32,9% Spezifität, ergaben die OVA1-Biomarker eine Empfindlichkeit von 98,0%. Interessanterweise hatte, mit diesen Proben, bei einer Spezifität von 32,9%, CA-125 allein eine Empfindlichkeit von 98,0%. Dies zeigte, dass die zusätzlichen OVA1-Marker wenig, wenn überhaupt, zur Gesamtklassifikation beitrugen. Tatsächlich war der AUC-Wert für die fünf OVA1-Biomarker 0,912 (Standardfehler: 0,0157; 95%-CI: 0,881–0,943; P-Wert: < 0,0001), kaum höher als CA-125 alleine, das einen AUC von 0,907 hatte (Standardfehler: 0,01571; 95%-CI: 0,877–0,938; P-Wert: < 0,0001). Die zwei Modelle wurden durch Bestimmen der Empfindlichkeit von Modellen bei festen Spezifitätswerten und der Spezifität von Modellen bei festen Empfindlichkeitswerten (14 und 15) weiter verglichen. Im Allgemeinen, übertraf das auf den Top-9-Markern aufgebaute logistische Regressionsmodell das Modell, das auf OVA1-Markern aufbaute, an allen Punkten der ROC-Kurve. Bei festgelegten Spezifitätswerten zwischen 80 und 95%, war das Top-9-Modell um 8 bis 10% empfindlicher als das auf den OVA1-Marker aufgebaute Modell. Bei höherer Spezifität (99%), war das Top-9-Modell um rund 19% empfindlicher. Bei fester Empfindlichkeit zwischen 80 und 99%, war das Top-9-Modell zwischen 8 und 25% spezifischer als das Modell, das auf den OVA1-Markern aufgebaut war.
  • Da sowohl die Top-Neun- als auch die OVA1-Panels Marker enthielten, die sich für prä- und postmenopausale Frauen anders verhalten können, wurde das Leistungsvermögen der zwei Panels gemäß dem Menopausen-Status verglichen. Für das Top-Neun-Panel war der AUC-Wert für Frauen vor der Menopause niedriger (0,937) als bei postmenopausalen Frauen (0,953). Dies steht im Einklang mit der Einzelmarker-Analyse, die zeigte, dass die besten drei einzelnen Marker (HE4, CA-125 und IL2-Rα) alle bessere Leistung für Frauen nach der Menopause (0,927, 0,927 bzw. 0,824) erbrachten (16) als für Frauen vor der Menopause (0,912, 0,907 bzw. 0,812). Für das OVA1-Panel war der AUC-Wert für Frauen vor der Menopause etwas niedriger (0,920) als für postmenopausale Frauen (0,924). Dies ist wiederum konsistent mit der Einzel-Marker-Analyse, die zeigte, dass CA-125, der Marker, der das Leistungsvermögen des OVA1-Panels anzutreiben scheint, ein schlechteres Leistungsvermögen für die Gruppe der Frauen vor der Menopause (0,907) als für postmenopausale Frauen (0,927) aufwies.
  • Es sind neue Biomarker identifiziert worden, die in der Lage sind, zwischen aus Frauen mit gutartigen Eierstock-Bedingungen entnommenen Proben, und denjenigen aus Frauen mit Eierstockkrebs zu unterscheiden. Eine vorläufige multivariate Analyse unter Verwendung eines logistischen Regressionsmodells an den neun informativsten Biomarkern schien das Leistungsvermögen gegenüber den OVA1-Biomarkern deutlich verbessert zu haben. Diese Analyse zeigt, dass unsere Daten das Potential aufweisen, OVA1 und andere Tests zu verbessern.
  • Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims (16)

  1. Verfahren zum Vorhersagen des Eierstockkrebs-Status eines Subjekts, das die folgenden Schritte umfasst: Messen des Spiegels von CA-125 und HE4 und Messen des Spiegels von einem oder mehreren Biomarkern, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus IL-2-Rezeptor-alpha (IL-2Rα), Alpha-1-Antitrypsin (AAT), C-Reaktivem Protein (CRP), YKL-40, Cellulärem Fibronectin (cFib), Prostasin, Gewebe-Inhibitor von Metalloproteinasen 1 (TIMP-1), IL-8, IL-6, Vaskulärem Endothelialien Wachstumsfaktor B (VEGF-B), Matrix-Metalloproteinase-7 (MMP-7), Calprotectin, Insulin-ähnlicher-Wachstumsfaktor-Bindungsprotein 2 (IGFBP-2), Lectin-ähnlichem Oxidiertes-LDL-Rezeptor 1 (LOX-1), Neuropilin-1, TNFR2 und MPIF-1 besteht, in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit, die aus dem Subjekt erhalten wurde; und Korrelieren der Messungen mit dem Eierstockkrebs-Status.
  2. Verfahren von Anspruch 1, das ferner das Messen des Spiegels von Krebs-Antigen 72-4 (CA-72-4) umfasst.
  3. Verfahren von Anspruch 1, wobei der Eierstockkrebs-Status die Anwesenheit von Eierstockkrebs ist.
  4. Verfahren von Anspruch 1, das ferner Folgendes umfasst: Verwalten der Behandlung des Subjekts auf Basis des Status.
  5. Verfahren von Anspruch 4, wobei das Verwalten bzw. Managen der Behandlung des Subjekts aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus dem Anordnen von weiteren Tests, dem Durchführen einer chirurgischen Operation und dem Unterlassen weiterer Aktionen besteht.
  6. Verfahren von Anspruch 4, das ferner Folgendes umfasst: Messen des Spiegels von CA-125 und HE4 und das Messen des Spiegels von einem oder mehren Biomarkern, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Interleukin-2-Rezeptor-alpha (IL-2-Rezeptor-alpha), Alpha-1-Antitrypsin (AAT), C-reaktivem Protein (CRP), YKL-40, Cellulärem Fibronectin (cFib), Krebs-Antigen 72-4 (CA-72-4), Prostasin, Gewebe-Inhibitor von Metalloproteinasen 1 (TIMP-1), IL-8, Matrix-Metalloproteinase-7 (MMP-7), IL-6, Vaskulärem Endothelialien Wachstumsfaktor B (VEGF-B), Calprotectin, Insulin-ähnlicher-Wachstumsfaktor-Bindungsprotein 2 (IGFBP-2), Lectin-ähnlichem Oxidiertes-LDL-Rezeptor 1 (LOX-1), Neuropilin-1, TNFR2 und MPIF-1 besteht, in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit, die aus dem Subjekt nach dem Verwalten des Subjekts erhalten wurde; Korrelieren der Messungen mit dem Eierstockkrebs-Status; und Bestimmen, ob das Verwalten des Subjekts zu einer Änderung beim Eierstockkrebs-Status führte.
  7. Verfahren von Anspruch 1, wobei das Messen aus dem Erfassen der Anwesenheit oder Abwesenheit der Biomarker, dem Quantifizieren der Menge an Biomarkern und dem Qualifizieren des Typs des Biomarkers ausgewählt wird.
  8. Verfahren von beliebigen der Ansprüche 1–7, wobei die Biomarker durch einen Immunassay gemessen werden.
  9. Verfahren von beliebigen der Ansprüche 1–7, wobei das Korrelieren durch einen Software-Klassifikations-Algorithmus durchgeführt wird.
  10. Verfahren von beliebigen der Ansprüche 1–7, wobei die Probe aus Blut, Serum und Plasma ausgewählt ist.
  11. Kit, das Folgendes umfasst: a) eine Palette bzw. Auswahl von Affinitätsreagenzien, die jeweils selektiv an CA-125 und HE4 bindet, und einen oder mehrere Biomarker, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Interleukin-2-Rezeptor-alpha (IL-2-Rezeptor alpha), Alpha-1-Antitrypsin (AAT), C-reaktivem Protein (CRP), YKL-40, Cellulärem Fibronectin (cFib), Krebs-Antigen 72-4 (CA-72-4), Prostasin, Gewebe-Inhibitor von Metalloproteinasen 1 (TIMP-1), IL-8, Matrix-Metalloproteinase-7 (MMP-7), IL-6, Vaskulärem Endothelialien Wachstumsfaktor B (VEGF-B), Calprotectin, Insulin-ähnlicher-Wachstumsfaktor-Bindungsprotein 2 (IGFBP-2), Lectin-ähnlichem Oxidiertes-LDL-Rezeptor 1 (LOX-1), Neuropilin-1, TNFR2 und MPIF-1 besteht; und b) eine Palette von Behältern, jeweils umfassend CA-125 und HE4, und einen oder mehrere Biomarker, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Interleukin-2-Rezeptor-alpha (IL-2-Rezeptor alpha), Alpha-1-Antitrypsin (AAT), C-reaktivem Protein (CRP), YKL-40, Cellulärem Fibronectin (cFib), Krebs-Antigen 72-4 (CA-72-4), Prostasin, Gewebe-Inhibitor von Metalloproteinasen 1 (TIMP-1), IL-8, Matrix-Metalloproteinase-7 (MMP-7), IL-6, Vaskulärem Endothelialien Wachstumsfaktor B (VEGF-B), Calprotectin, Insulin-ähnlicher-Wachstumsfaktor-Bindungsprotein 2 (IGFBP-2), Lectin-ähnlichem Oxidiertes-LDL-Rezeptor 1 (LOX-1), Neuropilin-1, TNFR2 und MPIF-1 besteht.
  12. Kit von Anspruch 11, wobei das Affinitätsreagenz ein Antikörper ist.
  13. Kit von Anspruch 11, das weiterhin schriftliche Anweisungen für die Verwendung des Affinitätsreagens zum Messen der Spiegel der Biomarker in einer Probe aus einem Subjekt einschließt.
  14. Kit von Anspruch 11, das weiterhin schriftliche Anweisungen für die Verwendung des Kits zum Bestimmen des Eierstockkrebs-Status eines Subjekts umfasst.
  15. Eine Palette von gereinigten Peptiden, umfassend CA-125 und HE4 und einen oder mehrere Biomarker, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Interleukin-2-Rezeptor-alpha (IL-2-Rezeptor alpha), Alpha-1-Antitrypsin (AAT), C-Reaktivem Protein (CRP), YKL-40, Cellulärem Fibronectin (cFib), Krebs-Antigen 72-4 (CA-72-4), Prostasin, Gewebe-Inhibitor von Metalloproteinasen 1 (TIMP-1), IL-8, Matrix-Metalloproteinase-7 (MMP-7), IL-6, Vaskulärem Endothelialien Wachstumsfaktor B (VEGF-B), Calprotectin, Insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor-Bindungsprotein 2 (IGFBP-2), Lectin-ähnlichem Oxidiertes-LDL Rezeptor 1 (LOX-1), Neuropilin-1, TNFR2 und MPIF-1 besteht.
  16. Die Peptide von Anspruch 15, wobei eines oder mehrere der Peptide eine nachweisbare Markierung umfassen.
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