KR20210054506A - 마커 검출용 키트 및 방법 - Google Patents

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KR20210054506A
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polypeptide
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colorectal cancer
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KR1020217003295A
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허버트 에이 프리트쉐
제이슨 엘 리게트
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이디피 바이오테크 코퍼레이션
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Abstract

본 개시는 미공지 상태의 피험자로부터의 샘플에서 마커를 검출하고 대장암과 같은, 암의 존재 또는 부재의 위험 평가를 생성하기 위한 키트 및 방법을 제공한다. 구체예에서, 키트는 적어도 4개의 시약을 포함하고, 각각은 상기 피험자의 샘플에서 적어도 4개의 폴리펩티드 중 하나에 특이적으로 결합한다. 상기 폴리펩티드는 GDF15, 케라틴 1-10, 및 헵신, IL-8, CEA, L1CAM, MCP-1, 및 OPG 중 2 이상을 포함한다. 상기 키트는 폴리펩티드 중 적어도 하나의 공지된 양을 포함하는 적어도 하나의 표준을 포함한다. 상기 키트는 또한 기계 학습 알고리즘을 사용하여 상기 적어도 4개의 폴리펩티드의 검출된 양을 분석하여 피험자가 대장암의 존재의 증가된 위험을 가지는지 여부를 결정하는 지침을 포함하는 컴퓨터 판독 가능한 매체를 포함한다.

Description

마커 검출용 키트 및 방법
기술 분야
본 개시는 피험자의 샘플에서 마커를 검출하고 대장암과 같은, 암의 존재 또는 존재의 위험을 결정하기 위한 키트 및 방법을 제공한다.
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 PCT 국제 특허 출원으로서, 2019년 7월 3일에 출원되고 2018년 7월 5일에 출원된, 마커 검출용 키트 및 방법이라는 제목의, 미국 일련번호 62/694,390에 대해, 적절한 범위 내에,서 우선권의 이익을 주장하며, 그 개시 내용은 그 전체가 여기에 참조로 포함된다.
배경
대장암(CRC)은 미국에서 암-관련 사망의 두 번째 주요 원인이다. CRC로 진단된 환자의 생존율은 언제 발견되는지에 따라 크게 달라진다. CRC는 일반적으로 선종 폴립에서 I기, II기, III기, 및 IV기로의 단계로 진행된다. 선종 폴립은 크기, 수, 고 등급 이형성증, 및 융모 특징에 따라 저위험 또는 고위험 폴립으로 분류될 수 있다. I 및 II기는 국소 단계로, 비정상적인 세포 성장이 결장 또는 직장에 국한된다. III기는 국소 단계로, 암이 주변 조직으로 퍼졌지만 국소적으로 남아있음을 의미한다. IV기는 말기이며 암이 신체의 다른 기관, 가장 일반적으로 암 또는 폐에 퍼졌다는 것을 나타낸다. 5년 생존율은 IV기 진단의 경우 13%인 것과 비교할 때, I기 CRC로 진단된 환자에서 90% 이상인 것으로 추정된다. 대장암은 초기 단계에서 전이성 질환으로의 전형적으로 느린 진행을 감안할 때 예방 및 치료가 가능한 암 중 하나이지만 예방이 가장 적은 암 중 하나이다. 이는 적어도 부분적으로는 현재 선별 검사의 침습적이거나 불쾌한 특성으로 인해 환자가 이용할 수 있는 선별에 잘 따르지 않기 때문이다.
대장암 진단을 위해 널리 사용되는 현재의 선별 분석은 대변 잠혈 분석 (FOBT), 태아 면역화학 검사 (FIT), 신충성 결장 내시경 및 대장 내시경이다. FOBT는 상대적으로 낮은 특이성을 가져 높은 위양성율을 보인다. 따라서 모든 양성 FOBT는 대장 내시경 검사를 받아야 한다. 샘플링은 집에서 개인이 수행하며 충분한 민감도를 얻기 위해 최소 2개의 연속 대변 샘플을 분석할 것이 요구된다. FOBT의 일부 버전은 또한 샘플링 전에 식이 제한이 필요하다. FOBT는 또한 장으로 출혈하지 않는 초기 단계의 암성 병변에 대한 민감도가 부족하다. 이는 치료가 가장 성공적인 병변이다.
암 배아 항원 ("CEA"), 탄수화물 항원 19-9, 및 지질-관련 시알산과 같은, 수많은 혈청 마커가, 대장암에서 조사되었다. 그러나, 이들의 낮은 감도는 이들 마커가 선별 시험에 적절하지 않다는 권고를 받게 하였다. 따라서 더 높은 수준의 민감도를 갖는 마커를 검출하기 위한 키트 및 방법을 제공할 필요가 남아있다.
요약
기술된 방법 및 키트는 미공지 상태의 피험자로부터의 샘플에서 하나 이상의 마커의 검출을 포함한다. 구체예에서, 마커 조합의 검출은 암의 존재 또는 존재의 위험을 평가하고, 암에 대한 결장 추가 검사를 수행해야 하는지 여부를 결정하고, 및/또는 치료를 투여 또는 모니터링하는 데 유용하다. 구체예에서, 상기 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 땀, 소변, 또는 대변을 포함한다. 구체예에서, 상기 샘플은 순환 종양 세포, 엑소좀, 및/또는 메틸화된 DNA를 포함한다. 상기 샘플은 검진 중, 암의 존재가 의심되는 경우, 치료 중, 치료 완료 시, 및/또는 암의 차도 후 주기적인 후속 조치로 일상적인 선별의 일부로 얻어질 수 있다. 구체예에서, 상기 암은 대장암이다.
구체예에서, 미공지 상태의 피험자로부터의 샘플에서 적어도 4개의 상이한 마커를 검출하는 방법은 상기 샘플을 적어도 4개의 상이한 시약과 접촉시켜 상기 샘플에서 적어도 4개의 상이한 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 검출하는 단계로서, 각 시약은 적어도 4개의 상이한 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 중 하나의 상기 존재 및/또는 양을 특이적으로 검출하며, 상기 적어도 4개의 폴리펩티드는 GDF15, 케라틴 1-10, 및 헵신, IL-8, 및 CEA, L1CAM, MCP-1, 및 OPG 중 2 이상을 포함하는 단계; 및 상기 적어도 4개의 상이한 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 각각의 상기 존재 및/또는 검출된 양의 조합이 대장암의 존재 또는 존재의 증가된 위험을 나타내는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 구체예에서, 대장암의 상기 존재 또는 존재의 증가된 위험은 저위험 선종 폴립, 고위험 선종 폴립, I기, II기, III기, 또는 IV기로 계층화될 수 있다.
구체예에서, 혈액 샘플은 상기 피험자로부터 얻어지고 적어도 4개의 상이한 마커의 양이 검출된다. 구체예에서, 상기 샘플은 혈청 샘플, 혈액 샘플, 혈장 샘플, 소변 샘플, 조직 샘플, 대변 샘플, 또는 타액 샘플이다. 구체예에서, 상기 샘플은 순환 종양 세포, 엑소좀, 종양 핵산, 메틸화된 DNA, 및 이들의 조합을 포함한다.
구체예에서, AFP, 페리틴, CATD, CD44, ALDH1A1, EPCAM, FAP, 갈렉틴 3, IL-6, 칼리크레인 6, CEA, 케라틴 6, L1CAM, MIA, 미드카인 (MDK), TWEAK, NSE, ON (SPARC), TGM2, VEGFA, YKL40, 및 이들의 조합을 포함하는 하나 이상의 추가 마커가 검출되나, 이에 제한되지 않는다. 구체예에서, MCP-1 및 OPG를 포함하는 추가 마커가 검출된다.
구체예에서, 상기 복수의 폴리펩티드는 GDF15, 케라틴 1-10, 헵신, 및 IL-8을 포함한다. 구체예에서, 상기 복수의 폴리펩티드는 GDF15, 케라틴 1-10, CEA, L1CAM, MCP-1, 및 OPG를 포함한다. 구체예에서, 상기 복수의 폴리펩티드는 GDF15, 케라틴 1-10, CEA, L1CAM, 헵신, IL-8, MCP-1, 및 OPG를 포함한다.
구체예에서, 상기 적어도 4개의 상이한 시약은 하나 이상의 1차 항체 또는 이의 항체 결합 단편을 포함하고, 각 1차 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 GDF15, 케라틴 1-10, 및 헵신, IL-8, CEA, L1CAM, MCP-1, 및 OPG 중 2 이상을 포함하는 상기 복수의 폴리펩티드 중 하나에 특이적으로 결합한다. 구체예에서, 상기 적어도 4개의 상이한 1차 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 고체 표면에 부착된다. 일부 구체예에서, 상기 적어도 4개의 상이한 1차 항체 또는 이의 항원 결합 단편 각각은 상이한 고체 표면에 부착된다. 일부 구체예에서, 상기 상이한 고체 표면 각각은 상이한 내부 마커를 가진다. 구체예에서, 상기 상이한 고체 표면 각각은 동일한 고체 표면 유형이지만 내부 마커의 유형만 다르다. 일부 구체예에서, 고체 표면은 비드, 자기 비드, 웰, 슬라이드, 또는 튜브를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 내부 마커는 형광 염료, 양자점, 단백질 태그, RFID 태그, 또는 이들의 조합을 포함한다.
구체예에서, 상기 적어도 4개의 상이한 시약 각각은 각각 별도의 용기 또는 고체 표면의 위치에 있을 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 적어도 4개의 상이한 시약은 단일 용기 또는 고체 표면의 단일 위치에 있을 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 적어도 4개의 상이한 시약 중 적어도 2개는 단일 용기 또는 고체 표면의 단일 위치에 있을 수 있다.
구체예에서, 방법은 상기 샘플을 적어도 4개의 검출 가능하게 표지된 2차 시약과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하고, 검출 가능하게 표지된 2차 시약 각각은 상기 적어도 4개의 폴리펩티드 중 하나를 특이적으로 검출하고 결합하고; 및 상기 적어도 4개의 검출 가능하게 표지된 2차 시약 각각은 상이한 검출 표지를 가진다. 구체예에서, 상기 검출 가능한 표지는 형광 염료, 방사성 표지, 단백질 또는 펩티드 태그, 효소, 또는 발광 반응물을 포함한다. 구체예에서, 상기 2차 시약의 상기 표지는 상기 고체 표면의 내부 표지와 상이하다. 일부 구체예에서, 상기 적어도 4개의 검출 가능하게 표지된 2차 시약은 2차 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고; 2차 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 적어도 4개의 폴리펩티드 중 하나에 특이적으로 결합한다. 구체예에서, 상기 2차 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 동일한 폴리펩티드에 특이적인 1차 항체와 상이한 에피토프에 결합한다.
구체예에서, 방법은 상기 적어도 4개의 상이한 시약을 상기 4개의 상이한 폴리펩티드 중 적어도 하나의 공지된 양을 포함하는 표준과 접촉시키는 단계 및 상기 표준에서 상기 적어도 하나의 폴리펩티드의 양을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 구체예에서, 표준은 상기 적어도 4개의 폴리펩티드 모두를 포함한다.
구체예에서, 표준은 저농도 품질 대조군 샘플, 및/또는 고농도 품질 대조군 표준일 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 저 품질 대조군 표준에서 폴리펩티드의 농도는 상기 폴리펩티드에 따라 .001 내지 500 ng/ml 범위이다. 예를 들어, GDF15에 대한 저농도 품질 대조군 표준은 약 .01 내지 약 .5 ng/ml이고, 헵신에 대한 저농도 품질 대조군 표준은 약 2 내지 약 10 ng/ml이고, IL-8에 대한 저농도 품질 대조군 표준은 약 .1 내지 약 .5 ng/ml이고, 케라틴 1-10에 대한 저농도 품질 대조군 표준은 약 100 내지 약 500 ng/ml이다.
일부 구체예에서, 상기 고 품질 대조군 표준에서 폴리펩티드의 농도는 상기 폴리펩티드에 따라 .05 내지 5000 ng/ml 범위이다. 예를 들어, GDF15에 대한 고농도 품질 대조군 표준은 약 1 내지 약 5 ng/ml이고, 헵신에 대한 고농도 품질 대조군 표준은 약 20 내지 약 50 ng/ml이고, IL-8에 대한 고농도 품질 대조군 표준은 약 .1 내지 약 1 ng/ml이고, 케라틴 1-10에 대한 고농도 품질 대조군 표준은 약 1000 내지 약 5000 ng/ml이다.
구체예에서, 방법은 상기 폴리펩티드 각각에 대한 상기 표준의 검출된 양을 기초로 상기 폴리펩티드 각각에 대한 변이의 백분율 계수를 결정함으로써 상기 폴리펩티드 각각의 상기 검출된 양의 측정의 정확도를 결정하는 단계를 추가로 포함한다.
구체예에서, 상기 샘플에서 상기 적어도 4개의 폴리펩티드의 상기 검출된 양의 조합이 대장암의 존재 또는 존재의 증가된 위험을 나타내는지 여부를 결정하는 것은 지도 기계 학습 알고리즘을 사용하여 결정된다. 구체예에서, 모델 1은 최근접 이웃을 식별하기 위해 거리 측정을 활용하는 K-Nearest Neighbors 분류의 변형인 Universal Process Classification 알고리즘을 사용한다. 구체예에서, 모델 2는 식별 중에 방사형 기저 함수 커널과 지원 벡터 분류기를 사용한다. 구체예에서, 모델 3은 다수의 무작위로-초기화된 2진 결정 트리의 결과를 평균화하여 예측하는 알고리즘 분류인, 랜덤 포레스트 분류기이다.
특정 구체예에서, 상기 샘플에서 상기 적어도 4개의 폴리펩티드의 상기 검출된 양의 조합이 대장암의 존재 또는 존재의 증가된 위험을 보여주는지 여부를 결정하는 단계는: 컴퓨팅 장치에서 상기 폴리펩티드 각각의 상기 검출된 양을 수신하는 단계; 상기 컴퓨팅 장치에서 상기 폴리펩티드 각각의 상기 검출된 양의 각각에 대한 계수를 데이터베이스로부터 검색하는 단계; 상기 컴퓨팅 장치에서 상기 검출된 양 각각에 상응하는 계수를 곱하여 상기 폴리펩티드 각각에 대한 가중 수준을 생성하는 단계; 상기 컴퓨팅 장치에서 각 폴리펩티드의 가중 수준의 조합을 모델로 분석하여 미공지 상태의 상기 피험자로부터의 샘플에서 검출된 상기 폴리펩티드 각각에 대한 가중 수준의 조합에서 정상 피험자에 대한 상기 폴리펩티드의 미리 결정된 가중 수치의 조합으로의 변화 또는 이의 결여를 기초로 상기 피험자가 대장암 또는 대장암의 존재의 증가된 위험을 가지는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 구체예에서, 방법은 상기 피험자에서 대장암의 존재 또는 존재의 증가된 위험을 나타내는 컴퓨팅 장치의 출력을 생성하는 단계를 추가로 포함한다.
구체예에서, 본원에서 기술된 방법에서, 상기 출력은 상기 피험자의 현재 상태 또는 상기 피험자의 현재 상태의 위험 평가를 제공한다. 구체예에서, 상기 현재 상태는 존재하거나 존재하지 않는 대장암이다. 다른 구체예에서, 상기 출력은 저위험 선종 폴립, 고위험 선종 폴립, I기, II기, III기, 또는 IV기 대장암의 존재 또는 존재의 위험의 계층화를 제공한다.
구체예에서, 상기 피험자로부터의 상기 샘플이 대장암의 존재 또는 존재의 위험을 나타낸다면, 상기 피험자는 대장 내시경, 결장 내시경, 생검, CAT 스캔, 또는 MRI와 같은 암에 대한 결장 검사를 받을 수 있다. 구체예에서, 상기 피험자로부터의 상기 샘플이 대장암의 존재 또는 대장암의 증가된 위험을 나타낸다면, 추가 검사에 의해 확인되었는지에 관계 없이, 상기 피험자는 대장암 치료로 치료될 수 있다. 구체예에서, 치료 요법은 상기 피험자에 대한 샘플이 상기 피험자가 선종 폴립 또는 I기 대장암 대 III 또는 IV기 대장암을 갖는지를 나타내는지 여부에 따라 선택될 수 있다. III 또는 IV기 대장암을 갖는 피험자는 보다 공격적인 치료 요법을 받을 수 있다.
구체예에서, 키트는 적어도 4개의 상이한 시약을 포함하고; 각 시약은 상기 피험자로부터의 샘플 내의 적어도 4개의 상이한 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 중 하나에 특이적으로 결합하고,; 및 상기 적어도 4개의 상이한 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 중 적어도 하나의 공지된 양을 포함하는 적어도 하나의 표준을 포함한다. 구체예에서, 상기 적어도 4개의 상이한 시약 각각은 상기 적어도 4개의 상이한 폴리펩티드 중 하나에 특이적으로 결합하는 1차 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
구체예에서, 키트는 대장암을 가지거나 가지지 않는 것으로 상기 피험자의 현재 상태의 위험 평가를 생성하기 위해 미공지 상태의 피험자로부터의 상기 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 각각의 상기 검출된 양의 조합을 수학적 모델로 분석하는 지침을 포함하는 컴퓨터 판독 가능 매체를 포함한다. 구체예에서, 사용된 상기 수학적 모델은 지도 기계 학습 알고리즘이다. 구체예에서, 모델 1은 최근접 이웃을 식별하기 위해 거리 측정을 활용하는 K-Nearest Neighbors 분류의 변형인 Universal Process Classification 알고리즘을 사용한다. 구체예에서, 모델 2는 식별 중에 방사형 기저 함수 커널과 함께 지원 벡터 분류기를 사용한다. 구체예에서, 모델 3은 다수의 무작위로-초기화된 2진 결정 트리의 결과를 평균화하여 예측하는 알고리즘 분류인, 랜덤 포레스트 분류기이다. 구체예에서, 모델 4는 또한 랜덤 포레스트 분류기이다.
구체예에서, 상기 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 각각의 상기 검출된 양의 조합의 분석은 인터넷 접근 가능한 지도 기계 학습 알고리즘을 사용하여 수행된다.
구체예에서, 하나 이상의 비-일시적 컴퓨터-판독 가능한 매체는, 하나 이상의 컴퓨팅 장치에 의해 실행될 때, 상기 컴퓨팅 장치가: 상기 폴리펩티드를 코딩하는 상기 폴리펩티드 각각의 검출된 양을 수신하는 단계; 상기 폴리펩티드 각각의 상기 검출된 양의 각각에 대한 계수를 데이터베이스로부터 검색하는 단계; 상기 폴리펩티드의 상기 검출된 양 각각에 상응하는 계수를 곱하여 상기 폴리펩티드 각각에 대한 가중 수준을 생성하는 단계; 각 폴리펩티드에 대한 가중 수준의 조합을 모델로 분석하여 정상 피험자에 대한 상기 폴리펩티드의 미리 결정된 가중 수치의 조합으로부터의 변화 또는 이의 결여를 기초로 상기 피험자가 대장암을 가질 또는 정상일 가능성을 결정하는 단계를 수행하게 하는, 컴퓨터-실행 가능 지침 구현을 가진다.
다른 구체예에서, 키트는 I기 대장암, II기 대장암, III기 대장암, IV기 대장암, 고위험 선종 폴립, 저위험 선종 폴립을 가지는 피험자, 및/또는 정상 피험자로부터 상기 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 각각의 상기 검출된 양의 조합의 프로필의 데이터에 접근하고; 미공지 상태의 상기 피험자로부터의 프로필이 공지된 상태의 피험자로부터의 프로필 중 임의와 유사한지를 결정하여 미공지 상태의 상기 피험자가 I기 대장암, II기 대장암, III기 대장암, IV기 대장암, 고위험 선종 폴립, 저위험 선종 폴립을 가지는지, 또는 정상인지 여부를 식별하기 위한 지침을 포함하는 컴퓨터 컴퓨터 판독 가능한 매체를 포함한다.
구체예에서, 상기 적어도 4개의 상이한 시약 각각은 별도의 용기 또는 고체 표면의 별도의 위치에 있을 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 적어도 4개의 상이한 시약은 단일 용기 또는 고체 표면의 단일 위치에 있을 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 적어도 4개의 상이한 시약의 적어도 2개는 단일 용기 또는 고체 표면의 단일 위치에 있을 수 있다.
구체예에서, 키트는 적어도 4개의 검출 가능하게 표지된 2차 시약을 포함하고, 검출 가능하게 표지된 2차 시약 각각은 상기 적어도 4개의 폴리펩티드 중 하나에 특이적으로 결합하고; 상기 적어도 4개의 검출 가능하게 표지된 2차 시약 각각은 상이한 검출 가능한 표지를 가진다. 구체예에서, 상기 검출 가능한 표지는 형광 염료, 방사성 표지, 단백질 또는 펩티드 태그, 효소, 또는 발광 반응물을 포함한다. 구체예에서, 상기 2차 시약의 표지는 상기 고체 표면의 상기 내부 표지와 상이하다. 일부 구체예에서, 상기 적어도 4개의 검출 가능하게 표지된 2차 시약은 2차 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고; 2차 항체 또는 이의 항원 결합 단편 각각은 상기 폴리펩티드 중 하나에 특이적으로 결합한다. 구체예에서, 상기 2차 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 동일한 폴리펩티드에 대한 1차 항체와 상이한 에피토프에 결합한다.
구체예에서, 상기 적어도 4개의 시약은 고체 표면에 부착된다. 일부 구체예에서, 상기 고체 표면은 비드, 자기 비드, 웰, 슬라이드, 튜브, 또는 이들의 조합을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 적어도 4개의 시약 각각은 상이한 고체 표면에 부착되고; 상기 상이한 고체 표면 각각은 상이한 내부 마커를 가진다. 구체예에서, 상기 상이한 내부 마커는 형광 염료, 양자점, 단백질 태그, RFID 태그, 또는 이들의 조합을 포함한다. 구체예에서, 상기 고체 표면의 상기 내부 마커는 상기 검출 가능하게 표지된 2차 시약의 검출 가능한 표지 각각과 상이하다.
구체예에서, 키트는 상기 4개의 폴리펩티드 중 적어도 하나의 공지된 양을 포함하는 표준을 포함한다. 구체예에서, 표준은 상기 적어도 4개의 폴리펩티드 각각의 공지된 양을 포함한다. 구체예에서, 표준은 상기 적어도 4개의 폴리펩티드 모두를 포함한다.
구체예에서, 표준은 저농도 품질 대조군 샘플, 및/또는 고농도 품질 대조군 표준일 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 저 품질 대조군 표준에서 폴리펩티드의 농도는 상기 폴리펩티드에 따라 .001 내지 500 ng/ml 범위이다. 예를 들어, GDF15에 대한 저농도 품질 대조군 표준은 약 .01 내지 약 .5 ng/ml이고, 헵신에 대한 저농도 품질 대조군 표준은 약 2 내지 약 10 ng/ml이고, IL-8에 대한 저농도 품질 대조군 표준은 약 .1 내지 약 .5 ng/ml이고, 케라틴 1-10에 대한 저농도 품질 대조군 표준은 약 100 내지 약 500 ng/ml이다.
일부 구체예에서, 상기 고 품질 대조군 표준에서 폴리펩티드의 농도는 상기 폴리펩티드에 따라 .05 내지 5000 ng/ml 범위이다. 예를 들어, GDF15에 대한 고농도 품질 대조군 표준은 약 1 내지 약 5 ng/ml이고, 헵신에 대한 고농도 품질 대조군 표준은 약 20 내지 약 50 ng/ml이고, IL-8에 대한 고농도 품질 대조군 표준은 약 .1 내지 약 1 ng/ml이고, 케라틴 1-10에 대한 고농도 품질 대조군 표준은 약 1000 내지 약 5000 ng/ml이다.
일부 구체예에서, 키트는 검증 대조군을 추가로 포함한다. 구체예에서, 검증 대조군은 저위험 선종 폴립, 고위험 선종 폴립, I기, II기, III기, 또는 IV기 대장암을 가진 것으로 알려진 피험자로부터의 샘플을 포함한다. 구체예에서, 저위험 선종 폴립, 고위험 선종 폴립, I기, II기, III기, 또는 IV기 대장암 각각에 대한 검증 대조군은 상기 키트에 포함된다.
도면의 간단한 설명
도 1은 미공지 상태의 피험자로부터의 샘플에서 폴리펩티드 검출용 키트의 개략도를 도시한다.
도 2는 도 1의 컴퓨팅 장치의 물리적 구성요소의 예시를 나타내는 블록도이다.
도 3은 도 1의 키트를 사용하여 미공지 상태의 피험자로부터의 샘플에서 적어도 4개의 상이한 폴리펩티드를 검출하는 예시적인 방법을 도시하는 흐름도이다.
상세한 설명
정의
본 발명은 본원에서 기술된 특정 방법론, 프로토콜, 및 시약 등에 제한되지 않으며, 그 자체로 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 본원에서 사용되는 용어는 단지 특정 구체예를 설명하기 위한 목적이며, 청구범위에서만 정의되는, 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다.
본원에서 및 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "하나(a)", "하나(an)", 및 "상기 (the)"는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 언급을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 항체에 대한 언급은 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 등가물을 포함하는, 하나 이상의 이러한 항체에 대한 언급이다. 작동 실시예를 제외하고, 또는 달리 지시된 경우, 본원에 사용된 성분의 양 또는 반응 조건을 표현하는 모든 숫자는 모든 경우에 용어 "약"에 의해 수정된 것으로 이해되어야 한다. 수치와 관련하여 사용되는 용어 "약"은 ±20%를 의미하고 백분율과 함께 사용되면 ±1%를 의미한다.
확인된 모든 특허 및 기타 간행물은 예를 들어, 본 발명과 관련되어 사용될 수 있는 이러한 간행물에 기술된 방법론을, 설명하고 공개할 목적으로 본원에서 참조로서 명시적으로 포함된다. 이러한 간행물은 본 출원의 출원일 전에 공개를 위해서만 제공된다. 이와 관련하여 어떠한 것도 발명자들이 선행 발명 또는 다른 이유에 의해 그러한 공개를 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 이 문서의 내용에 대한 날짜 또는 표현에 대한 모든 진술은 출원인이 사용할 수 있는 정보를 기반으로 하며 이러한 문서의 날짜 또는 내용의 정확성에 대한 인정을 구성하지 않는다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 출원의 목적을 위해 다음의 용어들은 다음과 같은 의미를 가져야 한다:
본원에서 사용된, "항원"은 항체에 의해 결합될 수 있는 분자 또는 분자의 일부이다. 항원은 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다. 항원은 다른 항원에 의해 유발될 수 있는 다수의 다른 항체 뿐만 아니라 그에 상응하는 항체와 매우 선택적인 방식으로 결합할 것이다.
본원에서 사용된, "항체"는 온전한 면역글로불린 분자뿐만 아니라, 예를 들어, Fab, Fab′, F(ab′)2, Fv, scFv, CDR 영역, 또는 항원 또는 에피토프에 결합할 수 있는 항체의 일부 또는 펩티드 서열과 같은, 이의 부분, 단편, 펩티드 및 유도체를 포함한다. 항체는 상기 분자와 특이적으로 반응하여 상기 분자를 상기 항체에 결합시킬 수 있다면 "결합 가능한" 분자라고 할 수 있다.
항체는 또한 키메라 항체, 가용성 또는 결합 형태로 표지될 수 있는 항체에 대한 항-이디오타입 (항-Id) 항체, 뿐만 아니라 예를 들어, 효소 절단, 펩티드 합성, 파지 디스플레이, 또는 재조합 기술과 같으나, 이에 제한되지 않는, 임의의 공지 기술에 의해 제공되는, 이의 단편, 부분, 영역, 펩티드 또는 유도체를 포함한다. 항체 단편 또는 부분은 온전한 항체의 Fc 단편이 결여될 수 있고, 순환으로부터 더 빠를수록, 온전한 항체보다 비-특이적 조직 결합이 더 적을 수 있다. 항체의 예시는 기술 분야에서 잘 알려진 방법을 사용하여, 예를 들어 (Fab 단편을 생성하기 위해) 파파인 또는 (F(ab')2 단편을 생성하기 위해) 펩신과 같은 효소를 사용한 단백질 분해 절단에 의해 온전한 항체로부터 생성될 수 있다. 예를 들어, Wahl et al., 24 J. Nucl. Med. 316-25 (1983)를 참고. 항체의 부분은 상기 방법 중 임의의 방법으로 만들 수 있거나, 재조합 분자의 일부를 발현하여 만들 수 있다. 예를 들어, 재조합 항체의 CDR 영역을 분리하여 적절한 발현 벡터로 서브클로닝할 수 있다. 예를 들어, U.S. Pat. No. 6,680,053를 참고.
본원에서 사용된, "단일클론 항체"는 단일 항원 결정기, 또는 에피토프의 고도로 특이적인 인식 및 결합에 관여하는 동종 항체 집단을 의미한다. 이는 전형적으로 상이한 항원 결정자에 대한 상이한 항체를 포함하는 다클론 항체와 대조된다. 용어 "단일클론 항체"는 온전한 및 전장 단일클론 항체뿐만 아니라 (Fab, Fab', F (ab') 2, Fv)와 같은 항체 단편, 단일 사슬 (scFv) 돌연변이체, 항체 일부를 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 면역글로불린 분자를 모두 포함한다. 또한, "단일클론 항체"는 하이브리도마, 파지 선택, 재조합 발현, 및 유전자 이식 동물을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 수의 방식으로 제조된 이러한 항체를 지칭한다.
본원에서 사용된, "알파-1-항키모트립신", 또는 "ACT"는 세린 프로테아제 억제 활성을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. ACT는 또한 SERPINA3, AACT, 성장 억제 ㄷ단백질 24 (GIG24), 성장 억제 단백질 25 (GIG25), 세포 성장 억제 유전자 24/25 단백질, 및 세린 프로테이나제 억제 클레이드 A, 구성원 3으로도 알려져 있다. ACT의 대표적인 아미노산 서열은 NP_001076/gI 50659080이다.
본원에서 사용된, “AFP”는 태아 발달 동안 난황강 및 간에서 생성되는 혈장 단백질인, 알파-태아 단백질을 지칭한다. AFP의 대표적인 아미노산 및 핵산 서열은 각각 NP_001125, 및 NM_001134이다.
본원에서 사용된, “CATD”는 단백질 전환, 및 호르몬 및 성장 인자의 활성화에 역할을 하는 펩신 유사 펩티다제인, 카텝신 D를 지칭한다. 카텝신 D는 CTSD로도 알려져 있다. CATD의 대표적인 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 각각 NP_001900, 및 NM_001909이다.
본원에서 사용된, “CD44”는 히알루론산에 대한 수용체이고 오스테오폰틴, 콜라겐, 및 매트릭스 메탈로프로테이나제와 상호작용하는 세포 표면 당단백질인, 클러스터 분화 항원을 지칭한다. 이 단백질의 기능적으로 구별 가능한 많은 이소형이 있다. 구체예에서, 이소형은 동형 단백질은 인간 CD44에 대한 UniProt 기록 P16070에 나타난 아미노산 145-186을 포함한다. CD44 변이체 6에 대한 대표적인 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 각각 NP 001189484, 및 NM 001202555이다.
본원에서 사용된, “CEA”는 암 배아 항원을 지칭한다. CEA는 L-셀렉틴 및 E-셀렉틴에 대한 리간드 역할을 하는 글리코실 포스파티딜 이노시톨 세포 표면 고정 단백질이다. CD66 분자로도 확인되는 많은 다양한 형태가 있다. 임의의 글리코실화가 없는, CEACAM5는, NP_004354;gI 98986445; Uniprot P06731-1에서 발견된 예시적인 아미노산 서열을 가진다.
본원에서 사용된, "결장암(colon cancer)", "대장암(bowel cancer)" 또는 "직장암(rectal cancer)"으로도 알려진 용어 "대장암(colorectal cancer)"은, 대장 및/또는 직장에서 막을 형성하는 상피세포로부터 유래한 암의 모든 형태를 의미한다.
본원에서 사용된, “DKK-1”는 단백질-단백질 상호작용을 매개하는 2개의 시스테인 풍부 도메인을 특징으로 하는 분비 단백질인, 딕콥프(dickkopf) 관련 단백질 1을 지칭한다. 대표적인 아미노산 서열은 NP_036374에서 발견된다. 대표적인 뉴클레오티드 서열은 NM_012242에서 발견된다.
본원에서 사용된, “EPCAM”은 정상 상피세포 및 위장 암종에서 발견되는 동형 칼슘 독립 부착 단백질인, 상피세포 부착 분자를 지칭한다. EPCAM의 대표적인 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 각각 NP_002345, 및 NM_002345이다.
본원에서 사용된, “FAP”은 동형이량체 통합 막 젤라티나제인 섬유아세포 활성 단백질을 지칭한다. 이 단백질은 세프라제로도 알려져 있다. FAP의 대표적인 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 각각 XP_011509098, 및 XM_011510796이다.
본원에서 사용된, “페리틴”은 세포 내 철 저장 단백질을 지칭한다. 페리틴 경쇄의 대표적인 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 각각 NP_000137, 및 NM_000146이다. 페리틴 중쇄에 대한 대표적인 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 각각 NP_002023, 및 NM_002032이다.
본원에서 사용된, “갈렉틴-3”은 탄수화물 결합 단백질의 구성원, 특히 베타 갈락토시다제를 지칭한다. 이 단백질의 많은 이소형이 있다. 갈렉틴 3의 대표적인 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 각각 NP_001344607, 및 NM_001357678이다.
본원에서 사용된, “GDF15”는 TGF 베타 계열 단백질의 분비 리간드인, 성장 분화 인자 15를 지칭하며 사이토카인 활성을 가진다. GDF15의 대표적인 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 각각 NP_004855, 및 NM_004864이다.
본원에서 사용된, “헵신”은 2형 막 세린 프로테아제를 지칭한다. 이 단백질의 다수의 이소형이 있다. 헵신의 대표적인 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 각각 NP_002142, 및 NM_002151이다.
본원에서 사용된, “IL-8”은 화학주성 및 혈관 신생 인자인, 인터루킨 8을 지칭한다. 이 단백질은 CXC 케모카인, CXCL8로도 알려져 있다. Il-8의 대표적인 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 각각 NP_000575, 및 NM_000584이다.
본원에서 사용된, “케라틴 6”은 상피 조직에서 발견된 2형 사이토케라틴을 지칭한다. 케라틴 6A 및 케라틴 6B을 포함하는 케라틴 6의 다수의 형태가 있다. 케라틴 6A의 대표적인 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 각각 NP_005545, 및 NM_005554이다. 케라틴 6B의 대표적인 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 각각 NP_0055465 및 NM_005554이다.
본원에서 사용된, “케라틴 1-10”은 상피 조직에서 발견되는 2형 사이토케라틴을 지칭하고 1형 산성 사이토케라틴 패밀리인, 패밀리 구성원 케라틴 10과 함께 이량체로 표현된다. 케라틴 1의 대표적인 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 각각 NP_006112, 및 NM_006121이다. 케라틴 10의 대표적인 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 각각 NP_000412 및 NM_000421이다.
본원에서 사용된, “MCP-1”은 단핵구 및 호염기구에 대한 화학-유인제인, 단핵구 화학 유인 단백질 1을 지칭한다. 이 단백질은 CCL2, C-C 케모카인 리간드 2로도 알려져 있다. MCP-1의 대표적인 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 각각 NP_002973 및 NM_002982이다.
본원에서 사용된, “MPO”는 호중구의 아주르 친화성 과립의 주요 성분인 gpa 단백질인, 미엘로페록시다제를 지칭한다. MPO의 대표적인 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 각각 NP_000241 및 NM_000250이다.
본원에서 사용된, “OPG”는 뼈 재흡수의 음성 조절자로서 작용하는 골아세포 유인 수용체인, 오스테오프로테게린을 지칭한다. 이 단백질은 TNF 수용체 슈퍼패밀리 구성원 11B (TNFRS11B)로도 알려져 있다. OPG의 대표적인 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 각각 NP_002537 및 NM_002546이다.
본원에서 사용된, “TIM3”는 대식세포 활성을 조절하고 면역학적 내성을 촉진하는 T 세포 표면 단백질인, T-세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인 포함-3을 지칭한다. 이 단백질은 A형 간염 바이러스 세포 수용체 2 (HAVCR2)로도 알려져 있다. TIM3의 대표적인 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 각각 NP_116171 및 NM_032782이다.
본원에서 사용된, “ALDH1A1”은 알코올 대사 경로의 효소인, 알데히드 탈수소효소 1 패밀리 구성원 A1을 지칭한다. ALDH1A1의 대표적인 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 각각 NP_000680 및 NM_000689이다.
본원에서 사용된, “IL-6”은 염증을 매개하는 케모카인인, 인터루킨 6을 지칭한다. Il-6의 대표적인 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 각각 NP_000591 및 NM_000600이다.
본원에서 사용된, “KLK6”은 세린 프로테아제인, 칼리크레인 6을 지칭한다. KLK-6의 대표적인 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 각각 NP_000416 및 NM_001012964이다.
본원에서 사용된, “L1CAM”은 신경 시스템 발달에 중요한 세포 부착 분자인, L1 세포 부착 분자를 지칭한다. L1CAM의 대표적인 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 각각 NP_001012982 및 NM_000425이다.
본원에서 사용된, “MIA”는 흑색종 유래 성장 조절 단백질인, 흑색종 억제 활성을 지칭한다. MIA의 대표적인 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 각각 NP_001189482 및 NM_001202553이다.
본원에서 사용된, “MDK”는 혈관 신생에 중요한 분비 성장 인자인, 미드카인을 지칭한다. 이 단백질의 다수의 이소형을 가진다. MDK의 대표적인 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 각각 NP_001012333 및 NM_001012333이다.
본원에서 사용된, “NSE”는 뉴런 세포에서 발견되는 동종 효소인, 에놀라제를 지칭한다. 이 단백질은 ENO2로도 알려져 있다. NSE의 대표적인 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 각각 NP_001966 및 NM_001975이다.
본원에서 사용된, “ON (SPARC)”은 기질 관련 단백질인, 분비된 단백질 산성 및 시스테인 풍부를 지칭한다. SPARC의 대표적인 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 각각 NP_003109 및 NM_003118이다.
본원에서 사용된, “TGM2”는 아폽토시스에 관여하는 가교 단백질인, 트랜스글루타미나제를 지칭한다. 이 단백질의 다수의 이소형이 있다. TGM2의 대표적인 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 각각 NP_001310245 및 NM_001323326이다.
본원에서 사용된, “TWEAK”는 TWEAK 수용체에 대한 리간드인 사이토카인인, TNF 슈퍼패밀리 구성원 12를 지칭한다. 이 단백질은 TNFSF12로도 알려져 있다. TWEAK의 대표적인 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 각각 NP_003800 및 NM_003809이다.
본원에서 사용된, “VEGF-A”는 혈관 신생에 관여하는 성장 인자인, 혈관 내피 성장 인자 A를 지칭한다. 이 단백질의 많은 이소형이 있다. VEGF-A의 대표적인 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 각각 NP_001020537 및 NM_001025366이다.
본원에서 사용된, “YKL40”는 키티나제 활성을 가지지 않는 글리콜 가수분해 효소인, 키티나제 3 유사 단백질을 지칭한다. YKL40의 대표적인 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 각각 NP_001267 및 NM_001276이다.
본원에서 사용된, 용어 "실질적으로 결합하지 않는다"는 샘플에서 성분에 대한 항체의 결합으로부터 검출 가능한 신호가 소 혈청 알부민과 같은 관련 없는 폴리펩티드 대조군의 존재로 인해 생성된 신호의 1 또는 2 표준 편차 내에 있는 것을 의미한다.
본원에서 사용된, "특이적 결합"은 관련 없는 단백질을 포함하는, 대체 물질보다 에피토프 또는 단백질에 대해 더 자주, 더 빠르게, 더 긴 기간으로, 더 큰 친화도로, 또는 상기의 일부 조합으로 반응하거나 결합하는 항체를 지칭한다. 특정 구체예에서, "특이적으로 결합한다"는, 예를 들어, 항체가 때로는 약 0.1 mM 이하, 보다 일반적으로 약 1μM 미만의 KD로 단백질에 결합하는 것을 의미한다. 특정 구체예에서, "특이적으로 결합한다"는 항체가 때로는 적어도 약 0.1 μM 이하, 및 다른 경우에 적어도 약 0.01μM 미만의 KD로 단백질에 결합하는 것을 의미한다. 제1 표적에 특이적으로 결합하는 항체 또는 결합 모이어티는 제2 표적에 특이적으로 결합하거나 결합하지 않을 수 있는 것으로 이해된다. 따라서, "특이적 결합"은 배타적 결합, 즉 단일 표적에 대한 결합을 (포함할 수 있으나) 반드시 필요로 하는 것은 아니다. 따라서, 항체는, 특정 구체예에서, 하나 이상의 표적에 특이적으로 결합할 수 있다. 특정 대체 구체예에서, 항체는 이중 특이적일 수 있고 상이한 특이성을 갖는 적어도 2개의 항원-결합 부위를 포함할 수 있다.
용어 "포함하는"은 포괄적인 조성물, 화합물, 제형, 또는 방법을 지칭하고 추가 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다.
용어 "구성되는"은 임의의 추가적 성분 또는 방법 단계의 존재를 배제하는 화합물, 조성물, 제형, 또는 방법을 지칭한다.
용어 "필수적으로 구성되는"은 조성물, 화합물, 제형, 또는 방법의 특징(들)에 실질적으로 영향을 끼치지 않는 추가적인 요소 또는 방법 단계를 포함하는 조성물, 화합물, 제형 또는 방법을 지칭한다.
용어 "분리된"은 혼합물에서 적어도 하나의 다른 물질로부터 또는 물질과 자연적으로 연관된 물질로부터 물질의 분리를 지칭한다.
본원에서 사용된, "마커"는 정상 또는 건강한 피험자로부터 대장암을 가지는 피험자를 구별하는 데 유용한 피험자에 의해 생성된 유전자, 유전자 전사체 (예를 들어 mRNA), 폴리펩티드 또는 단백질 또는 이의 단편과 같은, 임의의 분자를 지칭한다.
용어 "환자" 또는 "피험자"는 상호 교환적으로 사용되며 동물계의 임의의 구성원을 지칭한다. 바람직하게는 피험자는 인간, 가축화된 포유동물 또는 가축 포유동물과 같은, 포유 동물이다.
구 "약학적으로 허용 가능한"은 타당한 의학적 판단 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 기타 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기 적합하고, 합리적인 이익/위험 비율에 상응하는, 화합물, 물질, 조성물, 및/또는 투여 형태를 지칭한다.
구 "약학적으로-허용 가능한 담체"는 화합물 또는 유사체 또는 유도체를 신체의 한 기관, 또는 부분에서, 신체의 또다른 기관, 또는 부분으로 운반 또는 수송하는 데 관여하는, 약학적으로-허용 가능한 물질, 조성물 또는 비히클, 예를 들어 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질을 지칭한다. 각 담체는 제형의 다른 성분과 양립할 수 있고 환자에게 해를 끼치지 않는다는 의미에서 "허용 가능"해야 한다. 약학적으로- 허용 가능한 담체로 작용할 수 있는 물질의 일부 예시는: (1) 락토스, 글루코스 및 수크로스와 같은, 당; (2) 옥수수 전분 및 감자 전분과 같은, 전분; (3) 셀룰로스, 및 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트와 같은, 이의 유도체; (4) 분말화된 트라가칸트; (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 탈크; (8) 코코아 버터 및 좌약 왁스와 같은, 부형제; (9) 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 대두유와 같은, 오일; (10) 프로필렌 글리콜과 같은, 글리콜; (11) 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은, 폴리올; (12) 에틸 올레이트 및 에틸 라우레이트와 같은, 에스테르; (13) 한천; (14) 마그네슘 히드록시드 및 알루미늄 히드록시와 같은, 완충제; (15) 알긴산; (16) 발열원-없는 물; (17) 등장성 식염수; (18) Ringer의 용액; (19) 에틸 알코올; (20) 인산염 완충액; 및 (21) 약학적 제형에 사용되는 기타 무독성 양립성 물질을 포함한다.
용어 "정제된" 또는 "정제하는" 또는 "실질적으로 정제된"은 조성물로부터 조성물의 10% 이하 (예를 들어, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 그 이하)가 활성 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 담체가 아닌 정도로 불활성 또는 억제적 성분 (예를 들어, 오염물)의 제거를 지칭한다.
본원에서 사용된, 용어 "존재의 위험" (예를 들어, 암 등에 대한, 위험)은 현재 상태가 피험자가 질병 상태 또는 대장암과 같은 질병 상태의 존재의 증가된 위험을 가지는 피험자 (예를 들어, 인간)을 지칭한다.
"샘플"은 임의의 적합한 유형일 수 있고, 예를 들어, 마커의 존재 또는 수준이 검출될 수 있는 물질을 지칭할 수 있다. 바람직하게는, 상기 샘플은 마커의 존재 및/또는 수준의 검출이 시험관 내에서 수행될 수 있도록 피험자로부터 얻어진다. 대체적으로, 마커의 상기 존재 및/또는 수준은 생체 내에서 검출될 수 있다. 상기 샘플은 출처로부터 직접적으로 얻거나 적어도 하나의 (부분) 정제 단계 후에 사용될 수 있다. 전형적으로, 상기 샘플은 수용액, 생물학적 유체, 세포 또는 조직이다. 바람직하게는, 상기 샘플은 혈액, 혈장, 땀, 혈청, 소변 또는 대변이다.
본원에서 사용된, "민감도"는 분석에 의해 양성으로 정확하게 식별되는 샘플 세트에서 공지된 양성 비율을 측정하는 분류 기능을 지칭한다. 예를 들어, 분석에서 질병을 갖는 것으로 확인된 아픈 사람의 백분율이다.
본원에서 사용된, "특이도"는 분석에 의해 조건을 가지지 않는 것으로 정확하게 식별된 샘플 세트에서 공지된 음성 비율을 측정하는 분류 기능을 지칭한다. 예를 들어, 분석에서 질병을 가지지 않는 것으로 정확하게 확인된 건강한 사람의 백분율이다.
본원에서 사용된 용어 "치료하기", "치료하다" 또는 "치료"는 대장암의 발병 또는 진행을 감소시키거나, 대장암의 적어도 하나의 증상을 감소 또는 제거하기에 충분한 화합물의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함한다.
샘플에서 마커의 존재 검출용 방법 및 키트
기술된 방법 및 키트는 미공지 상태의 피험자로부터의 샘플에서 하나 이상의 마커의 검출을 포함한다. 구체예에서, 마커의 조합의 상기 검출은 암의 존재 또는 존재의 위험을 평가하고, 암에 대한 결장 검사를 수행하고, 및/또는 치료를 투여하거나 모니터링하는 데 유용하다. 구체예에서, 상기 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 땀, 소변, 또는 대변을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 샘플은 일상적인 혈액 채취로부터 취한 혈액이다. 상기 샘플은 검진 중, 암의 존재가 의심되는 경우, 치료 중, 치료 완료 시, 및/또는 암의 차도 후 주기적인 후속 조치로 일상적인 선별의 일부로 얻어질 수 있다. 구체예에서, 상기 암은 대장암이다.
구체예에서, 방법은 상기 샘플을 적어도 4개의 시약과 접촉시켜 상기 샘플에서 적어도 4개의 상이한 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 검출하는 단계로, 각 시약은 상기 적어도 4개의 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 중 하나의 존재 및/또는 양을 특이적으로 검출하고, 상기 적어도 4개의 폴리펩티드는 GDF15, 케라틴 1-10, 및 헵신, IL-8, CEA, L1CAM, MCP-1, 및 OPG 중 2 이상을 포함하는 단계; 및 상기 적어도 4개의 상이한 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 각각의 상기 존재 또는 검출된 양의 조합이 대장암의 존재 또는 존재의 증가된 위험을 보여주는 것인지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 구체예에서, 혈액 샘플은 상기 피험자로부터 얻어지고 상기 적어도 4개의 상이한 마커의 양은 검출된다. 구체예에서, 상기 적어도 4개의 상이한 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 각각의 양은 예측 모델로 분석되고 상기 피험자가 대장암을 가지는 존재 또는 위험이 평가된다. 구체예에서, 선종 폴립, I기, II기, III기, 또는 IV기 대장암의 존재 또는 존재의 위험은 결정될 수 있다.
구체예에서, AFP, CATD, 페리틴, CD44, ALDH1A1, EPCAM, FAP, 갈렉틴 3, IL-6, 칼리크레인 6, 케라틴 6, MIA, 미드카인, TWEAK, NSE, ON (SPARC), TGM2, VEGFA, YKL40, 및 이들의 조합을 포함하는 하나 이상의 추가 마커가 분석되나, 이에 제한되지 않는다.
상기 피험자로부터의 샘플이 고위험 선종 폴립 또는 대장암의 존재 또는 존재의 위험을 나타낸다면, 상기 피험자는 대장 내시경, 결장 내시경, 생검, CAT 스캔, 또는 MRI와 같은 암에 대한 결장 검사를 받을 수 있다. 구체예에서, 상기 피험자로부터의 샘플이 대장암의 존재 또는 존재의 위험을 나타낸다면, 추가 검사에 의해 확인되었는지에 관계 없이, 상기 피험자는 대장암 치료로 치료될 수 있다. 구체예에서, 치료 요법은 상기 피험자에 대한 샘플이 상기 피험자가 선종 폴립 또는 I기 대장암 대 III 또는 IV기 대장암을 갖는지를 나타내는지 여부에 따라 선택될 수 있다. III 또는 IV기 대장암을 갖는 피험자는 보다 공격적인 치료 요법을 받을 수 있다.
구체예에서, 키트는 적어도 4개의 시약을 포함하고; 각 시약은 미공지 상태의 피험자로부터의 샘플에서 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 특이적으로 검출하고; 및 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 중 적어도 하나의 공지된 양을 포함하는 적어도 하나의 표준을 포함한다.
구체예에서, 키트는 상기 피험자의 대장암을 가지거나 가지지 않는 위험 평가를 생성하기 위해 미공지 상태의 피험자로부터 상기 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 각각의 상기 검출된 양의 조합을 수학적 모델로 분석하는 지침을 포함하는 컴퓨터 판독 가능 매체를 포함한다. 구체예에서, 상기 수학적 모델은 지도 기계 학습 방법을 사용하여 생성된다.
다른 구체예에서, 키트는 I기 대장암, II기 대장암, III기 대장암, IV기 대장암, 고위험 선종 폴립, 저위험 선종 폴립을 가지는 피험자, 및/또는 정상 피험자로부터 상기 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 각각의 상기 검출된 양의 조합의 프로필의 데이터베이스에 접근하고; 미공지 상태의 상기 피험자로부터의 프로필이 공지된 상태의 피험자로부터의 프로필 중 임의와 유사한지를 결정하여 미공지 상태의 피험자가 I기 대장암, II기 대장암, III기 대장암, IV기 대장암, 고위험 선종 폴립, 저위험 선종 폴립을 가지는지, 또는 정상인지 여부를 식별하기 위한 지침을 포함하는 컴퓨터 판독 가능한 매체를 포함한다.
도 1은 미공지 상태의 피험자로부터의 샘플 S에서 적어도 4개의 상이한 폴리펩티드를 검출하기 위한 키트(100)의 개략도를 도시한다. 상기 샘플 S는 상기 샘플 S에서 복수의 폴리펩티드 중 하나에 특이적으로 결합하는 부착된 적어도 4개의 새약을 가지는 고체 표면(104)에 적용된다. 상기 복수의 폴리펩티드는 GDF15, 케라틴 1-10 및 헵신, IL-8, CEA, L1CAM, MCP-1, 및 OPG 중 2 이상을 포함한다. 상기 적어도 4개의 상이한 폴리펩티드를 구별하기 위해 상이한 표지를 가지는 적어도 4개의 검출 가능하게 표지된 2차 시약이 포함된다.
시약 및 폴리펩티드를 포함하는 고체 표면(104)은 상기 샘플 S에서 각 폴리펩티드의 양을 측정하기 위해 분석 판독기(106)으로 판독된다. 상기 양은 상기 폴리펩티드 각각의 상기 검출된 양 각각에 대한 계수와 함께 컴퓨팅 시스템(108)에 전달된다. 상기 계수는 계수 데이터베이스(110)로부터 검색된다. 상기 폴리펩티드의 상기 검출된 양 각각에 그에 상응하는 계수를 곱하여 상기 폴리펩티드 각각의 가중 수준을 생성한다. 그런 다음 각 폴리펩티드에 대한 가중 수준의 조합은 기계 학습 모델(112)를 사용하여 분석되어 정상 피험자에 대한 상기 폴리펩티드의 상기 가중 수치로부터의 변화 또는 이의 결여를 기초로 대장암을 가지는 피험자에 대한 위험 평가를 결정한다.
도 2는 컴퓨팅 장치(108)의 물리적 구성 요소의 예시를 도시한 블록도이다. 도 2에 나타난 예시에서, 상기 컴퓨팅 장치(108)은 적어도 하나의 중앙 처리 장치 ("CPU")(202), 시스템 메모리(208), 및 상기 시스템 메모리(208)를 CPU(202)에 연결하는 시스템 버스(222)를 포함한다. 상기 시스템 메모리(208)는 무작위 접근 메모리 ("RAM")(210) 및 읽기-전용 메모리 ("ROM")(212)를 포함한다. 예를 들어 스타트업 동안, 상기 컴퓨팅 장치(108) 내에서 요소들 사이에 정보를 전송하는 데 도움이 되는 기본 루틴을 포함하는 기본 입력/출력 시스템이 ROM (212)에 저장된다. 상기 컴퓨팅 장치(108)는 대용량 저장 장치(214)를 추가로 포함한다. 상기 대용량 저장 장치(214)는 기계 학습 모델과 같은 소프트웨어 지침 및 데이터를 저장할 수 있다.
상기 대용량 장치(214)는 상기 시스템 버스(222)에 연결된 대용량 저장 제어기 (도시되지 않음)을 통해 상기 CPU(202)에 연결된다. 상기 대용량 저장 장치(214) 및 그와 관련된 컴퓨터-판독 가능한 저장 매체는 상기 컴퓨팅 장치(108)에 대해 비휘발성, 비일시적인 데이터 저장을 제공한다. 본원에서 포함된 컴퓨터-판독 가능한 저장 매체의 설명이 하드 디스크 또는 솔리드 스테이트 디스크와 같은, 대용량 저장 장치를 지칭하지만, 기술 분야에서 통상적인 지식을 가진 자에 의해 컴퓨터-판독 가능한 데이터 저장 매체는 상기 CPU(202)가 데이터 및/또는 명령을 판독할 수 있는 임의의 이용 가능한 유형의, 물리적 장치 또는 제조 물품을 포함할 수 있는 것으로 인식되어야 한다. 특정 구체예에서, 상기 컴퓨터-판독 가능한 저장 매체는 전체적으로 비일시적 매체를 포함한다.
컴퓨터-판독 가능한 매체는 컴퓨터-판독 가능한 소프트웨어 명령, 데이터 구조, 프로그램 모듈 또는 기타 데이터와 같은 정보의 저장을 위한 임의의 방법 또는 기술로 구현된 휘발성 및 비휘발성, 제거 가능 및 제거 불가능 매체를 포함한다. 컴퓨터-판독 가능한 데이터 저장 매체의 예시적 유형은, RAM, ROM, EPROM, EEPROM, 플래쉬 메모리 또는 기타 솔리드 스테이트 메모리 기술, CD-ROM, 디지털 다용도 ㄷ디스크 (“DVD”), 기타 광학 저장 매체, 자기 카세트, 자기 테이프, 자기 디스크 장치 또는 기타 자기 저장 장치, 또는 원하는 정보를 저장할 수 있고 상기 컴퓨팅 장치(108)에 의해 액세스될 수 있는 임의의 기타 매체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
다양한 구체예에 따르면, 상기 컴퓨팅 장치(108)는 무선 네트워크, 인터넷, 또는 다른 유형의 네트워크과 같은, 네트워크(200)를 통해 원격 네트워크 장치에 대한 논리적 연결을 사용하여 네트워크 환경에서 작동할 수 있다. 상기 컴퓨팅 장치(108)는 상기 시스템 버스(222)에 연결된 네트워크 인터페이스 유닛(204)를 통해 상기 네트워크(200)에 연결할 수 있다. 상기 네트워크 인터페이스 유닛(204)은 네트워크의 다른 유형 및 원격 컴퓨팅 시스템에 연결하는 데 활용될 수 있다는 것이 인식되어야 한다. 상기 컴퓨팅 장치(108)는 또한, 터치 사용자 인터페이스 디스플레이 스크린, 또는 다른 유형의 입력 장치를 포함하는 다수의 다른 장치로부터 입력을 받아들이고 처리하는 입력/출력 제어기(206)를 포함한다. 유사하게, 상기 입력/출력 제어기(206)는 터치 사용자 디스플레이 스크린 또는 다른 유형의 출력 장치에 출력을 제공할 수 있다.
위에서 간력히 언급한 바와 같이, 상기 컴퓨팅 장치(108)의 대용량 저장 장치(214) 및 RAM(210)은 소프트웨어 명령 및 데이터를 저장할 수 있다. 상기 소프트웨어 명령은 상기 컴퓨팅 장치(108)의 작동을 제어하는 데 적합한 운영 체제(218)을 포함한다. 상기 대용량 저장 장치(214) 및/또는 RAM(210)은 또한, CPU(202)에 의해 실행될 때, 상기 컴퓨팅 장치(108)가 이 문서에서 논의된 기능을 제공하게 하는 소프트웨어 명령을 저장한다. 예를 들어, 상기 대용량 저장 장치(214) 및/또는 RAM(210)은, CPU(202)에 의해 실행될 때, 상기 컴퓨팅 장치(108)가 CRC를 갖는 피험자의 위험을 평가하도록 하는 소프트웨어 명령을 저장할 수 있다.
도 3은 미공지 상태의 피험자로부터의 샘플에서 적어도 4개의 상이한 폴리펩티드를 검출하는 예시적인 방법(300)을 도시하는 흐름도이다. 일부 구체예에서, 상기 방법(300)은 도 1 및 2의 컴퓨팅 장치(108)에 의해 수행된다.
동작 302에서, 각 폴리펩티드의 검출된 양은 상기 컴퓨팅 장치(108)에서 수신된다. 일부 구체예에서, 상기 검출된 양은 MAGPIX와 같은 분석 판독기(106)로부터 수신된다.
동작 304에서, 각 폴리펩티드의 상기 검출된 양 각각의 계수가 검색된다. 일부 구체예에서, 상기 게수는 상기 컴퓨팅 장치(108)에 의해 계수 데이터베이스(110)로부터 수신된다.
동작 306에서, 상기 폴리펩티드의 상기 검출된 양 각각에 상응하는 계수를 곱하여 상기 폴리펩티드 각각에 대한 가중 수준을 생성한다. 일부 구체예에서, 상기 컴퓨팅 장치(108)는 상기 분석 판독기(106) 및 계수 데이터베이스(110)로부터 수신된 정보를 사용하여 이 계산을 수행한다.
동작 308에서, 가중 수준의 상기 조합은 기계 학습 모델을 사용하여 각 폴리펩티드에 대해 분석된다. 이 분석은 가중 수준을 정상 피험자와 비교하는 것에 기초하여 피험자가 대장암을 가질 가능성을 결정한다. 일부 구체예에서, 상기 컴퓨팅 장치(108)는 이 분석을 수행하고 피험자에 대한 위험 평가를 출력한다.
방법
본 개시는 조합된 적어도 4개의 상이한 마커의 양 또는 존재를 검출하고 상기 적어도 4개의 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 상기 검출된 양 또는 존재의 상기 조합이 대장암의 존재 또는 존재의 증가된 위험을 나타내는지 여부를 결정하는 방법을 기술한다. 구체예에서, 미공지 상태의 피험자로부터의 샘플에서 적어도 4개의 마커를 검출하는 방법은: 상기 샘플을 적어도 4개의 시약에 접촉시켜 상기 샘플에서 적어도 4개의 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 존재 및/또는 양을 검출하는 단계로, 각 시약은 상기 적어도 4개의 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 중 하나에 특이적으로 결합하고, 상기 적어도 4개의 폴리펩티드는 GDF15, 케라틴 1-10, 및 헵신, IL-8, CEA, L1CAM, MCP-1, 및 OPG 중 2 이상을 포함하는 단계; 및 상기 적어도 4개의 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 각각의 존재 및/또는 검출된 양의 조합이 상기 피험자에서 대장암의 존재 또는 존재의 증가된 위험을 나타내는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 구체예에서, 상기 방법은 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개의 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 검출하는 단계를 포함한다.
다른 구체예에서, 피험자에서 대장암에 대한 결장 검사를 수행하는 방법은: 상기 샘플을 적어도 4개의 시약과 접촉시켜 상기 샘플에서 적어도 4개의 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 존재 또는 양을 검출하는 단계로, 각 시약은 상기 적어도 4개의 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 중 하나에 특이적으로 결합하고, 상기 적어도 4개의 폴리펩티드는 GDF15, 케라틴 1-10, 및 헵신, IL-8, CEA, L1CAM, MCP-1, 및 OPG 중 2 이상을 포함하는 단계; 상기 적어도 4개의 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 존재 및/또는 검출된 양의 조합이 상기 피험자에서 대장암의 존재 또는 존재의 증가된 위험을 나타내는지 여부를 결정하는 단계; 및 상기 피험자가 대장암의 존재 또는 존재의 증가된 위험을 가진다면, 결장 검사를 수행하는 단계를 포함한다. 구체예에서, 상기 결장은 대장 내시경, 가상 대장 내시경, 결장 내시경, 생검, CAT 스캔, MIR, 또는 이들의 조합을 포함하는 방법에 의해 검사된다.
다른 구체예에서, 피험자에서 대장암을 치료하는 방법은: 상기 샘플을 적어도 4개의 시약과 접촉시켜 상기 샘플에서 적어도 4개의 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 존재 및/또는 양을 검출하는 단계로, 각 시약은 상기 적어도 4개의 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 중 하나에 특이적으로 결합하고, 상기 적어도 4개의 폴리펩티드는 GDF15, 케라틴 1-10, 및 헵신, IL-8, CEA, L1CAM, MCP-1, 및 OPG 중 2 이상을 포함하는 단계; 상기 적어도 4개의 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 각각의 존재 및/또는 검출된 양의 상기 조합이 상기 피험자에서 대장암의 존재 또는 존재의 증가된 위험을 나타내는지 여부를 결정하는 단계; 및 상기 피험자가 대장암의 존재 또는 존재의 증가된 위험을 가진다면, 상기 피험자를 대장암 치료에 효과적인 치료로 치료하는 단계로서, 상기 대장암에 효과적인 치료는 수술, 화학요법, 및 이들의 조합을 포함하는 단계를 포함한다. 화학요법제는 5-플루오로우라실, 폴린산, 옥사플라틴, 이리노테칸, 카페시타빈, VEGF 억제제, 트립신 키나제 억제제, EGFR 억제제, 항-VEGF 항체, 인간 VEGF 수용체 융합 단백질, 항-VEGF 수용체 항체, 항-EGFR 항체, 체크포인트 억제제, 항-PD-1 항체, 및 항-PD-L1 항체, 또는 이들의 조합을 포함한다. 구체예에서, 미공지 상태의 피험자가 III 또는 IV기 대장암을 가는 것으로 확인되는지 여부에 따라 치료 요법이 더 공격적이도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 선종 폴립, 또는 I기 대장암이 있는 피험자는 종양 또는 결장의 일부를 제거하기 위한 수술로 치료될 수 있다. II기 및 III기 대장암의 경우, 5-플로오로우라실, 폴린산, 옥사플라틴, 이리노테칸, 카페시타빈, 또는 이들의 조합와 같은 화학요법제를 사용한 수술. IV기 대장암의 경우, 화학요법은 수술 전 및 후에 투여되고 VEGF 억제제와 같은 표적제제 및 5-플루오로우라실, 폴린산, 옥사플라틴, 이리노테칸, 카페시타빈 중 하나 이상을 모두 포함한다.
구체예에서, 상기 적어도 4개의 폴리펩티드는 GDF15, MCP-1, IL-8 및 케라틴 1-10을 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 적어도 4개의 폴리펩티드는 GDF15, MPO, IL-8 및 케라틴 1-10을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 적어도 4개의 폴리펩티드는 GDF15, CATD, IL-8 및 케라틴 1-10을 포함한다. 추가 구체예에서, 상기 적어도 4개의 폴리펩티드는 GDF15, 페리틴, IL-8 및 케라틴 1-10을 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 적어도 4개의 폴리펩티드는 GDF15, 헵신, IL-8, 및 케라틴 1-10을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 적어도 4개의 폴리펩티드는 GDF15, 케라틴 1-10, CEA, L1CAM, MCP-1, 및 OPG를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 적어도 4개의 폴리펩티드는 GDF15, 케라틴 1-10, CEA, L1CAM, MCP-1, OPG, 헵신, 및 IL-8을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 적어도 4개의 폴리펩티드는 GDF15, 케라틴 1-10, CEA, L1CAM, 헵신, IL-8, AFP, CATD, CD44, 페리틴, MIA, MDK, NSE, ON (SPARC), TWEAK, 및 YKL40을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 적어도 4개의 폴리펩티드는 GDF15, 케라틴 1-10, CEA, L1CAM, MCP-1, OPG, 헵신, IL-8, AFP, CATD, CD44, 페리틴, MIA, MDK, NSE, ON (SPARC), TWEAK, 및 YKL40을 포함한다.
구체예에서, 상기 방법은 미공지 상태를 가진 피험자인, 피험자로부터의 상기 샘플을 얻는 단계를 추가로 포함한다. 구체예에서, 상기 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 땀, 타액, 소변, 조직, 또는 대변을 포함한다. 구체예에서, 상기 샘플은 채혈에서 회수된다. 구체예에서, 상기 샘플은 순환 종양 세포, 순환 종양 핵산, 엑소좀, 메틸화된 DNA, 또는 이들의 조합을 포함한다. 상기 샘플은 암의 존재가 의심되는 경우, 치료 중, 치료 완료 시, 및 암의 차도 후 주기적인 후속 조치로 건강 검진의 일상적인 선별의 일부로 얻어질 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 샘플은 세포, 입자상 물질, 및/또는 기타 오염물을 제거하기 위해 처리된다. 구체예에서, 상기 샘플은 폴리펩티드 성분을 농축하기 위해 처리될 수 있다.
구체예에서, 본원에서 기술된 방법은 또한 하나 이상의 추가 폴리펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 존재 또는 양을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 하나 이상의 추가 폴리펩티드는 AFP, 페리틴, CATD, CD44, ALDH1A1, EPCAM, FAP, 갈렉틴 3, IL-6, 칼리크레인 6, CEA, 케라틴 6, L1CAM, MIA, 미드카인, TWEAK, NSE, ON (SPARC), TGM2, VEGFA, YKL40, 또는 이들의 조합을 포함한다.
구체예에서, 본원에서 기술된 방법은 상기 샘플을 적어도 8개의 시약과 접촉시켜 상기 샘플에서 적어도 8개의 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 존재 및/또는 양을 검출하는 단계로, 각 시약은 상기 적어도 8개의 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 중 하나에 특이적으로 결합하고, 상기 적어도 8개의 폴리펩티드는 AFP, 페리틴, CATD, CD44, GDF15, 헵신, IL-8, 및 케라틴 1-10을 포함하는 단계; 및 상기 적어도 8개의 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 각각의 존재 및/또는 검출된 양의 상기 조합이 상기 피험자에서 대장암의 존재 또는 존재의 증가된 위험을 나타내는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 구체예에서, 상기 방법은 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 개의 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 검출하는 단계를 포함한다.
구체예에서, 본원에서 기술된 방법은 상기 샘플을 적어도 16개의 시약과 접촉시켜 상기 샘플에서 적어도 16개의 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 존재 및/또는 양을 검출하는 단계로, 각 시약은 상기 적어도 16개의 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 중 하나에 특이적으로 결합하고, 상기 적어도 16개의 폴리펩티드는 AFP, 페리틴, CATD, CD44, GDF15, 헵신, IL-8, 케라틴 1-10, L1CAM, MIA, MDK, NSE, ON (SPARC), TWEAK,YKL40, 및 CEA를 포함하는 단계; 및 상기 적어도 16개의 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 각각의 존재 및/또는 검출된 양의 상기 조합이 상기 피험자에서 대장암의 존재 또는 존재의 증가된 위험을 나타내는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 구체예에서, 상기 방법은 적어도 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 개의 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 검출하는 단계를 포함한다.
구체예에서, 상기 적어도 4개의 시약의 하나 이상의 1차 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하고, 각 1차 항체 또는 항원 결합 단편은 상기 폴리펩티드 중 하나에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 적어도 4개의 시약 각각은 1차 항체 또는 항원 결합 단편이고, 각 시약은 상기 확인된 폴리펩티드 중 상이한 하나에 특이적으로 결합한다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 AFP, 페리틴, CATD, CD44, ALDH1A1, EPCAM, FAP, 갈렉틴 3, IL-6, 칼리크레인 6, CEA, 케라틴 6, L1CAM, MIA, MDK, TWEAK, NSE, ON (SPARC), TGM2, VEGFA, 또는 YKL40를 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 추가 1차 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 추가 시약 각각은 1차 항체 또는 항원 결합 단편이고, 각 시약은 상기 확인된 추가 폴리펩티드 중 상이한 하나에 결합한다.
표준 기술을 사용하여 항체 또는 항체 결합 단편을 제조할 수 있다. 본원에서 기술된 상기 폴리펩티드 각각의 서열은 본원에서 확인된 바와 같이 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스에 기재되어 있다. 일부 경우에, 상기 폴리펩티드는 다중 이소형을 가진다. 구체예에서, 모든 이소형에 결합하는 항체가 선택된다. 다른 구체예에서, 단일 이소형에 특이적으로 결합하고 다른 이소형에 실질적으로 결합하지 않는 항체가 선택된다. 예를 들어, CD44의 모든 이소형에 특이적으로 결합하는 항체는 CD44의 에피토프 1에 결합한다. 다른 구체예에서, 이소형 CD44 변이체 6에 결합하는 항체가 선택된다.
구체예에서, 상기 확인된 폴리펩티드 또는 추가 폴리펩티드 중 하나에 특이적으로 결합하고, 상기 확인된 폴리펩티드 또는 추가 폴리펩티드 중 임의의 다른 것에 실질적으로 결합하지 않는 항체가 선택된다. 구체예에서, 항체는 10-7 내지 10-12 KD의 상기 폴리펩티드에 대한 친화도를 갖는 것이 바람직하다. 다른 구체예에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 폴리펩티드의 농도 범위를 검출할 수 있고, 바람직하게는 적어도 .01 피코그램/ml을 검출할 수 있는 것이 바람직하다. 구체예에서, 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 각 항체 또는 항원 결합 단편은, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 이하의 변이 계수 백분율로 폴리펩티드에 결합한다.
일부 구체예에서, 상기 적어도 4개의 시약은 상기 적어도 4개의 폴리펩티드 중 하나를 코딩하는 핵산에 특이적으로 결합하는 시약을 포함하고, 상기 적어도 4개의 폴리펩티드는 GDF15, 케라틴 1-10 및 헵신, IL-8, CEA, L1CAM, MCP-1, 및 OPG중 2 이상을 포함한다. 구체예에서, 상기 시약은 프라이머 세트, 프로브, 압타머, 및 이들의 조합을 포함한다.
구체예에서, 상기 적어도 4개의 시약 각각은 고체 표면에 부착된다. 구체예에서, 상기 시약 각각은 상이한 고체 표면 또는 고체 표면의 상이한 위치에 부착된다. 구체예에서, 상기 고체 표면은 비드, 자기 비드, 및 슬라이드, 멀티웰 플레이트의 웰, 칩, 미세유체 채널 또는 이들의 조합을 포함한다. 구체예에서, 각 시약은 상이한 고체 표면에 부착되고, 상기 상이한 고체 표면 각각은 상이한 내부 마커를 가진다. 일부 구체예에서, 상기 상이한 고체 표면 각각은 동일한 고체 표면 유형이고 상이한 내부 마커에 기초하여 서로 상이하다. 구체예에서, 상기 상이한 내부 마커는 방사성 동위원소 태그, 양자점, 단백질 또는 펩티드 태그, RFID 태그, 또는 형광 염료를 포함한다. 구체예에서 각 시약은 고유하고 상이한 내부 마커를 가진 비드에 부착되어 상기 시약에 의해 검출된 폴리펩티드 각각의 존재 또는 양이 상기 내부 마커의 존재에 의해 개별적으로 식별될 수 있도록 한다.
구체예에서, 상기 샘플은 적어도 4개의 시약과 접촉된다. 각 시약은 별도의 용기에서 상기 샘플과 접촉되거나 시약의 다양한 조합이 하나 이상의 용기에서 결합될 수 있다. 구체예에서, 상기 샘플 및 상기 적어도 4개의 시약은 단일 용기에서 접촉된다. 구체예에서, 상기 용기는 멀티웰 플레이트의 웰, 튜브, 미세 유체 채널, 슬라이드, 또는 샘플 포트를 포함한다. 일부 구체예에서, 각 시약은 다른 시약과 유사한 농도로 혼합물에 존재한다.
구체예에서, 상기 샘플이 적어도 4개의 시약과 접촉되면, 샘플에 존재하는 경우 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 각각은 특정 시약과 복합체를 형성한다. 복합체는 세척된 다음 검출 가능하게 표지된 2차 항체를 사용하여 검출된다. 구체예에서, 상기 방법은 상기 샘플을 적어도 4개의 검출 가능하게 표지된 2차 시약과 접촉하는 단계로, 각 검출 가능하게 표지된 2차 시약은 상기 적어도 4개의 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 중 하나에 특이적으로 결합하고 검출하는 단계를 포함하고;; 및 상기 적어도 4개의 검출 가능하게 표지된 2차 시약은 상이한 검출 가능한 시약을 가진다. 구체예에서, 상기 검출 가능하게 표지된 2차 시약 각각은 다른 검출 가능하게 표지된 2차 시약과 상이한 검출 가능한 표지를 가진다. 구체예에서, 상기 2차 시약은 형광 염료, 방사성 표지, 단백질 또는 펩티드 태그, 효소, 또는 발광 반응물로 표지된다. 구체예에서, 상기 2차 시약의 표지는 상기 고체 표면의 내부 표지와 상이하다. 구체예에서, 하나 이상의 2차 검출 가능하게 표지된 시약은, 첨가될 수 있으며, 상기 검출 가능하게 표지된 2차 시약 각각은 추가 폴리펩티드 및/또는 상기 추가 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 중 하나에 결합하고 검출하며, 상기 추가 폴리펩티드는 AFP, 페리틴, MCP-1, OPG, CATD, CD44, ALDH1A1, EPCAM, FAP, 갈렉틴 3, IL-6, 칼리크레인 6, CEA, 케라틴 6, L1CAM, MIA, MDK, TWEAK, NSE, ON (SPARC), TGM2, VEGFA, 또는 YKL40을 포함한다.
구체예에서, 상기 검출 가능하게 표지된 2차 시약은, GDF15, 헵신, IL-8, 및 케라틴 1-10을 포함하는 적어도 4개의 폴리펩티드 중 하나에 특이적으로 결합하는 2차 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 구체예에서, 추가 2차 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 추가 폴리펩티드 중 하나에 특이적으로 결합하고, 상기 추가 폴리펩티드는 AFP, 페리틴, MCP-1, OPG, CATD, CD44, ALDH1A1, EPCAM, FAP, 갈렉틴 3, IL-6, 칼리크레인 6, CEA, 케라틴 6, L1CAM, MIA, 미드카인, TWEAK, NSE, ON (SPARC), TGM2, VEGFA, 또는 YKL40을 포함한다. 구체예에서, 상기 검출 가능하게 표지된 2차 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 동일한 폴리펩티드에 결합하는 상기 1차 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 상기 폴리펩티드에서 상이한 에피토프에 결합한다. 구체예에서, 상기 적어도 4개의 검출 가능하게 표지된 2차 시약 각각은, 항체 또는 항원 결합 단편이고, 각 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 적어도 4개의 폴리펩티드 중 하나에 특이적으로 결합한다.
구체예에서, 상기 샘플은 그 후 적어도 4개의 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 각각의 존재 및/또는 양을 검출하기 위해 분석된다. 일부 구체예에서, 상기 고체 표면의 상기 내부 마커는 형광 활성화 세포 분류를 사용, 내부 마커에 따라 상이한 파장에서의 흡수 프로필을 사용, 상이한 양자점을 검출, 특이적 단백질 또는 펩티드 태그에 결합하는 것을 사용, 및/또는 상이한 방사성 동위원소를 측정하여 검출된다. 구체예에서, 상기 내부 마커를 검출하는 것은 상기 적어도 4개의 폴리펩티드 또는 상기 적어도 4개의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 중 하나가 검출되고 있는지를 확인하는 것이다. 그런 다음 상기 2차 표지된 시약의 표지는 형광 활성화 세포 분류를 사용, 내부 마커에 따라 상이한 파장에서의 흡수 프로필을 사용, 특이적 단백질 또는 펩티드 태그에 결합하는 것을 사용, 효소 활성을 측정, 발광 활성을 측정, 및/또는 상이한 방사성 동위원소를 측정하여 검출된다. 구체예에서, 상기 고체 표면의 내부 마커 및 2차 표지된 시약은 서로 상이하다.
폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 각각의 양은 표준 곡선을 사용하여 결정될 수 있다. 구체예에서, 적어도 하나의 표준은 상기 적어도 4개의 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 각각의 하나 이상의 공지된 양을 포함한다. 일부 구체예에서, 각 표준은 상기 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 상이한 농도를 포함한다. 구체예에서, 상기 표준은 분석에서 검출되는 모든 폴리펩티드를 포함한다. 구체예에서, 상기 표준은 동결 건조된 형태로 제공되고 적절한 희석을 위한 지침이 제공된다. 구체예에서, 표준 세트는 0.01 피코그램에서 1 ng까지의 농도 범위를 포함한다.
구체예에서, 표준 대조군은 상기 적어도 4개의 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 각각에 대한 저농도 품질 대조군 표준이다. 구체예에서, 표준 대조군은 상기 적어도 4개의 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 각각에 대한 고농도 품질 대조군 표준이다.
구체예에서, 표준은 저농도 품질 대조군 샘플, 및/또는 고농도 품질 대조군 표준일 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 저 품질 대조군 표준에서 폴리펩티드의 농도는 상기 폴리펩티드에 따라 .001 내지 500 ng/ml 범위이다. 예를 들어, GDF15에 대한 저농도 품질 대조군 표준은 약 .01 내지 약 .5 ng/ml이고, 헵신에 대한 저농도 품질 대조군 표준은 약 2 내지 약 10 ng/ml이고, IL-8에 대한 저농도 품질 대조군 표준은 약 .1 내지 약 .5 ng/ml이고, 케라틴 1-10에 대한 저농도 품질 대조군 표준은 약 100 내지 약 500 ng/ml이다.
일부 구체예에서, 상기 고 품질 대조군 표준에서 폴리펩티드의 농도는 상기 폴리펩티드에 따라 .05 내지 5000 ng/ml 범위이다. 예를 들어, GDF15에 대한 고농도 품질 대조군 표준은 약 1 내지 약 5 ng/ml이고, 헵신에 대한 고농도 품질 대조군 표준은 약 20 내지 약 50 ng/ml이고, IL-8에 대한 고농도 품질 대조군 표준은 약 .1 내지 약 1 ng/ml이고, 케라틴 1-10에 대한 고농도 품질 대조군 표준은 약 1000 내지 약 5000 ng/ml이다.
구체예에서, 대조군 샘플은 피험자로부터의 샘플과 유사한 방식으로 분석된다. 대조군 샘플은 I기 대장암을 가지는 것으로 알려진 피험자의 샘플 또는 풀링된 샘플, II기 대장암을 가지는 것으로 알려진 피험자의 샘플, III기 대장암을 가지는 것으로 알려진 피험자의 샘플, IV기 대장암을 가지는 것으로 알려진 피험자의 샘플, 대장암을 가지지 않는 것으로 알려진 피험자의 샘플, 저위험 선종 폴립을 가지는 피험자의 샘플, 고위험 선종 폴립을 가지는 피험자의 샘플, 및 이들의 조합을 포함한다.
특정 구체예에서, 혈청 샘플은 분석 버퍼에서 희석되고 표준 및 대조군은 혈청 매트릭스에서 희석된다. 샘플, 표준 (블랭크 및 표준의 7 희석), 및 대조군 (저 및 고)는 1차 항체로 코팅된 색으로-코딩된 고체 표면 (예를 들어, 마이크로스피어)의 혼합물과 결합되며, 각 1차 항체는 이중 웰의 96 웰 또는 384 웰 플레이트에서 상이한 색깔의 내부 마커로 고체 표면에 코팅된다. 각 분석 웰은 각 마커에 대해 약 100-300개의 마이크로스피어를 포함하고, 상기 혼합물은 18-20 시간동안 배양된다. 상기 마이크로스피어는 세척된다. 모든 마커를 표적으로 하는 비오틴화된 2차 항체의 혼합물을 각 웰에 첨가하고, 1 시간 동안 배양한다. 다음으로, 스트렙타비딘-피코데리스린을 2차 검출 항체를 따르지 않고 각 웰에 첨가하고, 30 분 동안 배양한다. 상기 마이크로스피어를 세척하고 세척 버퍼로 재현탁하고 xPONENT® 소프트웨어로 Luminex® 200TM, HTS, FLEXMAP 3D® 또는 MAGPIX®에서 실행한다. 원시 데이터는 정량화 및 점수화를 위해 분석 소프트웨어로 (자동적으로 또는 수동으로) 내보내진다. 샘플의 정량 분석 및 품질 대조군은 각 마커에 대해 공지된 농도의 표준 곡선에 기초하여 계산된다. 분석 성능은 각 마커에 대한 특정 로트에 대해 예상 범위 내에 속하는 저 및 고 품질 대조군 농도에 의해 검증된다. 각 마커에 대한 분석에서 검출된 평균 혈청 범위에 기초하여 저 및 고 품질 대조군 값이 선택된다. 각 샘플에 대해 계산된 마커 농도는 질병의 존재 가능성을 결정하기 위해 기계 학습 알고리즘에 의해 추가로 분석된다.
구체예에서, 상기 샘플에서 상기 적어도 4개의 폴리펩티드의 존재 및/또는 검출된 양이 얻어지면, 상기 적어도 4개의 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 각각의 존재 및/또는 검출된 양의 상기 조합이 상기 피험자에서 대장암의 존재 또는 존재의 증가된 위험을 나타내는지 여부가 결정된다.
구체예에서, 방법은 상기 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 각각에 대한 표준의 측정에 기초하여 상기 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 각각에 대한 변이의 백분율 계수 (%CV)를 결정함으로써 상기 폴리펩티드 및/또는 핵산 각각의 검출된 양의 측정의 정확도를 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 구체예에서, 상기 측정의 %CV는 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 그 이하이다.
구체예에서, 암을 가지거나 가지지 않는 것으로 피험자의 상태를 결정하는 것은 미공지 상태의 피험자로부터의 샘플에서 상기 적어도 4개의 폴리펩티드의 상기 검출된 양의 조합의 프로필을 저위험 선종 폴립, 고위험 선종 폴립, I기, II기, III기, IV기 대장암을 가지는 것으로 알려진 피험자, 및 대장암을 가지지 않는 것으로 알려진 피험자로부터의 상기 적어도 4개의 폴리펩티드의 상기 검출된 양의 상기 조합의 프로필의 데이터베이스로 분석하여 수행될 수 있다. 미공지 프로필의 피험자로부터의 상기 프로필이 대장암을 가진 것으로 알려진 자의 프로필과 더 유사한지 여부의 결정은 미공지 상태의 피험자의 대장암의 존재를 나타낸다.
대체적으로, 상기 샘플에서 상기 적어도 4개의 폴리펩티드의 존재 및/또는 검출된 양은 수학적 모델을 사용하여 분석되어 미공지 상태의 피험자가 대장암을 가지는 위험을 결정할 수 있다. 구체예에서, 상기 수학적 모델은 지도 기계 학습 방법에 의해 생성된다. 일부 구체예에서, 키; 몸무게; BMI, 체질량 지수 = (킬로그램 단위의 체중/미터 단위의 키)/ 미터 단위의 키; 성별; 흡연 상태 (비흡연자, 흡연자, 또는 전-흡연자); 주당 알코올 섭취량 (0, 1-7, 8-14, 15-21, >21); 및 이전 암 병력 (유 또는 무)와 같은 생체 마커가 포함된다.
구체예에서, 개인의 질병 상태에 대한 예측은 지도 기계 학습 (SML) 알고리즘을 사용하여 이루어진다. SML 모델은 측정된 기능 세트를 지정된 표지에 매핑하려고 한다. 특정 구체예에서, 혈청 내 바이오마커 농도는 예측에 사용되는 특징으로 작용한다. 각 피험자에서 암에 대한 질병 상태는 상기 알고리즘에 의해 예측되는 표지이다. 다른 구체예에서, 각 피험자는 SML 알고리즘에 의해 분석될 관찰자의 역할을 한다. 또 다른 구체예에서, 비지도 기계 학습이 사용될 수 있다. 비지도 ML은 예측할 사전-측정된 표지가 없다는 점에서 SML과 상이하다.
구체예에서, 단계 1 에서, 바이오마커 농도는 각 피험자에 대해 측정되고 외부에서 검증된 표지, 즉 상기 피험자의 CRC 진단과 연관된다. 단계 2는 SML 알고리즘에 의해 훈련 또는 시험에 사용될 서브세트에 피험자 데이터를 무작위적으로 할당하는 것으로 구성된다. 선택적으로, 피험자 데이터의 제3 서브세트는 검증을 위해 알고리즘에 제공될 수 있다. 단계 3에서, 훈련 세트로부터의 피험자 데이터가 정리되고 알고리즘 효율성을 개선하기 위해 변환된다. 일반적인 데이터 변환은 확장, 정규화, 비닝, 및 특징 비율 형성을 포함한다. 또한, 비지도 ML 알고리즘은 상기 피험자의 CRC 상태를 예측할 때 SML에 공급될 수 있는 저차원 특징 또는 관찰 클러스트를 생성하는 데 사용될 수 있다.
구체예에서, 단계 4에서, 특징 엔지니어링 후, 변환된 바이오마커 데이터가 훈련을 위해 SML 알고리즘에 공급된다. 이 과정에서, 표지 예측의 품질은 비용 함수를 사용하여 정량화된다. 훈련은 예측력을 향상시키기 위해 상기 비용 함수의 매개 변수를 최적화하는 것을 포함한다. 로지스틱 회귀 및 지원 벡터 기계 (SVM)와 같은, SML에 기초한 모델의 경우, 최적화된 매개 변수는 종종 숫자로 나타낸 가중의 형태를 취한다. 이 SML 하위 클래스에 대한 일반적인 비용 함수는 로그 손실 함수이다. 사례-기반 학습의 경우, 분류 규칙은 일반적으로 최적화된 매개 변수 역할을 한다. 최적화된 규칙의 예시는 k-최근접 이웃에서 사용된 최근접 이웃의 수 또는 2진 결정 트리/랜덤 포레스트 분류기에서 CRC-음성 환자로부터 CRC-양성을 구분하는 바이오마커를 포함한다. 2진 결정 트리/랜덤 포레스트 분류기에서 사용된 로그 손실 함수에 대한 대체 비용 함수는 지니-인덱스이다. 단계 5에서, 매개 변수 최적화 후, 각 훈련된 SML 알고리즘의 수행은 훈련 세트 외부의 데이터에서 평가되어야 한다. 대체 SML 알고리즘을 비교하기 위해, 외부 검증 데이터 또는 적절한 리샘플링 방법이 정확도, 정밀도, 재현율/민감도, 특이도 등과 같은 값을 계산하는 데 사용된다. 훈련이 충분한 예측력을 가진 알고리즘을 생성하는 데 실패하면, 상기 과정은 추가 특징 엔지니어링 및 재훈련을 위한 단계 3으로 돌아간다. 사용할 훈련된 알고리즘을 선택하면, 외부 시험 데이터를 사용하여 모델 성능을 평가한다 (단계 6). 시험 데이터는 SML 알고리즘 훈련 또는 검증에서 사용되지 않았던 피험자 바이오마커 농도 및 암 질병 상태로 구성된다. 단계 6에서 측정된 예측력이 충분하다면, 확인된 진단을 가진 환자의 혈청으로부터의 바이오마커 농도를 사용하여 CRC 질병 상태를 추정할 수 있다 (단계 7).
구체예에서, 상이한 수학적 모델이 사용될 수 있다. 구체예에서, 모델 1은 최근접 이웃을 식별하기 위해 거리 측정을 활용하는 K-Nearest Neighbors 분류의 변형인, Universal Process Classification 알고리즘을 사용한다. 구체예에서, 모델 2는 식별 중에 방사형 기저 함수 커널과 함께 지원 벡터 분류기를 사용한다. 구체예에서, 모델 3은 다수의 무작위로-초기화된 2진 결정 트리의 결과를 평균화하여 예측하는 알고리즘 분류인, 랜덤 포레스트 분류기이다. 구체예에서, 모델 4는 또한 랜덤 포레스트 분류기이다.
구체예에서, K-최근접 이웃 분류기는 피험자가 그의 k-최근접 이웃의 대다수와 동일한 표지를 가지고 있다고 예측하며, 여기서 k는 양의 정수이다. 이웃은 ML의 특징 엔지니어링 단계 동안 생성된 특징들 간의 거리를 측정하여 결정된다 (단계 3). 가장 짧은 거리를 갖는 k-관측치는 이웃으로 선택된다. 일반적인 거리 측정이 Euclidian, Manhattan, 및 코사인 거리를 포함하지만, 삼각형 부등식을 충족하는 임의의 측정이 사용될 수 있다. 엔지니어링된 특징, 최근접 이웃의 수 (k), 및 측정된 거리를 다양화함으로써, k-최근접 이웃은 분류 중에 다양한 형태를 취할 수 있다. 로그 손실 함수는 이 분류기의 공통 비용 함수이다.
구체예에서, 지원 벡터 분류기 (SVC)는 그들의 표지에 기초하여 관찰을 분리하는 특징 공간에서 선형 결정 경계를 제공한다. 선의 한쪽에 있는 관측치는 양수일 것으로 예측되는 반면 선의 다른 쪽에 있는 관측치는 음수이다. 예측 능력을 향상시키기 위해, SVC는 특징 엔지니어링을 사용하여 특징을 변환하고 결합하여 더 고차원의 특징 공간을 생성한다. 이의 예시는 측정된 바이오마커의 농도를 제곱하는 것이다. 예를 들어, 원래의 8개의 바이오마커를 결합하면, 총 16개의 특징이 있다. 이것은 특징 공간의 차원을 8에서 16으로 증가시키고 잠재적으로 관찰된 데이터 포인트 사이의 거리를 증가시킨다. 이것은 선형 결정 경계의 향상된 배치를 이끌 수 있다. SVC는 일반적으로 결정 경계와 관찰된 데이터 사이의 경계를 증가시키는 역할을 하는 용어를 추가하여 로그 손실 함수를 사용한다.
구체예에서, 랜덤 포레스트 분류기는 다중 2진 결정 트리에 의해 만들어진 예측을 평균화하는 앙상블 알고리즘이다. 2진 결정 트리는 측정된 표지 값을 기초로 관측치를 점점 더 동질적인 하위 그룹으로 분리하는 규칙을 학습함으로써 예측한다. 우리의 경우에, 규칙은 특징 임계값을 포함한다. 상기 임계값을 초과하는 특징을 가진 피험자는 하나의 하위 그룹으로 분할되고 아래의 피험자는 별도의 하위 그룹으로 분할된다. 계층적 규칙 세트를 사용하여, 표지 예측을 위해 비선형 관계가 사용될 수 있다. 2진 결정 트리/랜덤 포레스트에서 사용된 일반적인 비용 함수는 교차-엔트로피 함수 및 지니-인덱스를 포함한다.
특정 구체예에서, 상기 미공지 샘플에서 상기 적어도 4개의 상이한 폴리펩티드 각각의 존재 및/또는 양이 대장암의 존재의 증가된 위험을 나타내는지 여부는 컴퓨텨 구현 방법으로 분석된다. 컴퓨터 구현 방법은: 상기 컴퓨팅 장치에서 상기 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 각각의 상기 검출된 양을 수신하는 단계; 상기 컴퓨팅 장치에서 데이터베이스로부터 상기 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 각각의 검출된 양 각각에 대한 계수를 검색하는 단계; 상기 컴퓨팅 장치에서 상기 검출된 양 각각에 상응하는 계수를 곱하여 상기 폴리펩티드 각각에 대한 가중 수준을 생성하는 단계; 상기 컴퓨팅 장치에서 각 폴리펩티드에 대한 가중 수준의 상기 조합을 모델로 분석하여 미공지 상태의 상기 피험자로부터의 상기 샘플에서 검출된 상기 폴리펩티드 각각에 대한 가중 수준의 조합에서 정상 피험자에 대한 상기 폴리펩티드의 미리 결정된 가중 수준의 조합으로의 변화 또는 이의 결여를 기초로 상기 피험자가 대장암의 증가된 위험을 가지는 지를 결정하는 단계를 포함한다.
구체예에서, 본원에서 기술된 방법은 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 또는 그 이상의 민감도를 가진다. 구체예에서, 본원에서 기술된 방법은, 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 그 이상의 특이도를 가진다. 일부 구체예에서, 본원에서 기술된 바와 같은 방법은 최소 90% 이상의 초기 암에 대한 민감도; 최소 50% 이상의 건강한 정상인에 대한 특이도; 및 최소 80% 이상의 곡선 아래 면적 (AUC)을 가진다. 구체예에서, 피험자에서 대장암에 대한 결장 검사를 수행하는 방법에서, 상기 피험자의 샘플이 고위험 선종 폴립 또는 대장암의 존재 또는 존재의 위험을 나타낸다면 결장 검사가 수행된다. 구체예에서, 결장 검사는 대장 내시경, 가상 대장 내시경, 결장 내시경, 생검, CAT 스캔, MIR, 또는 이들의 조합으로 수행된다. 구체예에서, 상기 피험자로부터의 샘플이 대장암의 존재 또는 존재의 위험을 나타낸다면, 추가 시험에 의해 확인되었는지 여부에 관계없이, 상기 피험자는 대장암을 치료하는 치료 요법으로 치료될 수 있다. 치료 요법은 화학요법을 사용하거나 사용하지 않는 수술을 포함할 수 있다.
대장암 치료용 치료제는 5-플로오로우라실, 폴린산, 옥사플라틴, 이리노테칸, 카페시타빈, VEGF 억제제, 트립신 키나제 억제제, EGFR 억제제, 항-VEGF 항체, 인간 VEGF 수용체 융합 단백질, 항-VEGF 수용체 항체, 항-EGFR 항체, 체크포인트 억제제, 항-PD-1 항체, 및 항-PD-L1 항체를 포함한다. 치료 효능은 본원에서 기술된 방법 및 키트를 사용하여 모니터링될 수 있다. 구체예에서, 치료 요법은 미공지 상태의 피험자가 III 또는 IV기 대장암을 가진 것으로 확인되는지 여부에 따라 더 공격적이도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 선종 폴립, 또는 I기 대장암의 피험자는 종양 또는 결장의 일부를 제거하기 위한 수술로 치료될 수 있다. II기 및 III기 대장암의 경우, 피험자는 5-플루오로우라실, 폴린산, 옥사플라틴, 이리노테칸, 카페시타빈, 또는 이들의 조합과 같은 b 화학 요법제에 이어 수술로 치료될 수 있다. IV기 대장암의 경우, 화학 요법은 수술 준 및 후에 투여되고 VEGF 억제제와 같은 표적 제제 및 5-플루오로우라실, 폴린산, 옥사플라틴, 이리노테칸, 카페시타빈 중 하나 이상을 모두 포함한다.
키트
본 개시의 또 다른 측면은 미공지 상태의 피험자로부터의 샘플에서 하나 이상의 마커 검출용 키트를 포함한다. 상기 키트는 대장암과 같은 암의 존재 또는 존재의 증가된 위험을 결정하는 데 유용하다. 구체예에서, 다수의 상이한 마커는 상기 피험자의 샘플에서 검출되고 검출된 마커의 조합은 대장암의 존재 또는 존재의 위험을 예측한다. 구체예에서 마커의 조합의 감출은 대장암에 대한 결장 검사 및/또는 대장암 치료 방법에 유용하다. 구체예에서, 키트는 적어도 4개의 시약을 포함하고; 각 시약은 상기 피험자로부터의 샘플에서 적어도 하나의 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 특이적으로 검출 또는 결합하며, 상기 폴리펩티드는 GDF15, 케라틴 1-10, 및 헵신, IL-8, CEA, L1CAM, MCP-1, 및 OPG 중 2 이상을 포함하고; 적어도 하나의 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 종기된 양을 포함하는 적어도 하나의 표준을 포함한다,.
다른 구체예에서, 키트는 상기 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 각각의 상기 검출된 양의 조합을 수학적 모델로 분석하여 대장암을 가지거나 가지지 않는 상기 피험자의 위험 평가를 생성하기 위한 지침을 포함하는 컴퓨터 판독 가능한 매체를 추가로 포함한다. 구체예에서, 상기 수학적 모델은 지도 기계 학습 알고리즘을 사용하여 얻어진다. 특정 구체예에서, 상기 지도 기계 학습 알고리즘은 랜덤 포레스트 분류기, 지원 벡터 분류기 (SVC), 및 k-최근접 이웃 분류기의 개작이다.
구체예에서, 미공지 상태의 피험자로부터의 상기 샘플로부터의 폴리펩티드 미/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 검출된 양의 수학적 모델의 결과는 고위험 선종 폴립, 저위험 선종 폴립, I기 대장암, II기 대장암, III기 대장암, IV기 대장암을 가지는 것으로 알려진 피험자 및 대장암 또는 폴립을 가지지 않는 것으로 알려진 피험자로부터의 샘플로부터의 저장된 대표적인 수학적 모델과 유사한 정도에 대해 분석된다. 일부 구체예에서, 상기 비공지 상태의 피험자로부터의 수학적 모델이 상기 저장된 수학적 모델 각각과 얼마나 유사한지를 결정함으로써 위험 평가가 이루어진다.
본원에서 기술된 임의의 방법에서, 상기 피험자는 고위험 선종 폴립, 저위험 선종 폴립, I기 대장암, II기 대장암, III기 대장암, IV기 대장암 중 하나의 위험을 가지거나, 대장암 또는 폴립을 가지지 않는 것으로 계층화될 수 있다.
구체예에서, 다수의 상이한 수학적 모델의 유형이 사용될 수 있다. 구체예에서, 모델 1은 최근접 이웃을 식별하기 위해 거리 측정을 활용하는 K-Nearest Neighbors 분류의 변형인, Universal Process Classification 알고리즘을 사용한다. 구체예에서, 모델 2는 식별 중에 방사형 기저 함수 커널과 함께 지원 벡터 분류기를 사용한다. 구체예에서, 모델 3은 다수의 무작위로-초기화된 2진 결정 트리의 결과를 평균화하여 예측하는 알고리즘 분류인, 랜덤 포레스트 분류기이다. 구체예에서, 모델 4는 또한 랜덤 포레스트 분류기이다. 일부 구체예에서, 생체 데이터가 상기 수학적 모델에 포함된다. 생체 데이터는 키; 몸무게; BMI, 체질량 지수 = (킬로그램 단위의 체중/미터 단위의 키)/ 미터 단위의 키; 성별; 흡연 상태 (비흡연자, 흡연자, 또는 전-흡연자); 주당 알코올 섭취량 (0, 1-7, 8-14, 15-21, >21); 및/또는 이전 암 병력 (유 또는 무)을 포함한다.
일부 구체예에서, 컴퓨팅 장치에서 실행될 때 상기 지침은: 상기 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 각각의 검출된 양을 수신하는 단계; 데이터베이스로부터 상기 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 각각의 상기 검출된 양의 각각에 대한 계수를 검색하는 단계; 상기 검출된 양 각각에 상응하는 계수를 곱하여 상기 폴리펩티드 각각에 대한 가중 수준을 생성하는 단계; 각 폴리펩티드에 대한 가중 수준의 조합을 모델로 분석하여 정상 피험자에 대한 상기 폴리펩티드의 미리 결정된 가중 수치의 조합으로부터의 변화 또는 이의 결여를 기초로 상기 피험자가 대장암을 가질 또는 정상일 가능성을 결정하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 저위험 선종 폴립, 고위험 선종 폴립, I기 대장암, II기 대장암, III기 대장암, IV기 대장암을 가지는 것으로 알려진 피험자로부터의, 및 대장암을 가지지 않는 것으로 알려진 피험자로부터의 샘플 각각에 대한 상기 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 각각에 대한 검출된 양의 프로필의 데이터 베이스 및/또는 저장된 수학적 모델에의 접근은 웹 기반 애플리케이션에서 이용 가능하다. 구체예에서, 미공지 상태의 상기 피험자로부터의 샘플에서 상기 적어도 4개의 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 상기 검출된 양의 프로필은 저위험 선종 폴립, 고위험 선종 폴립, I기 대장암, II기 대장암, III기 대장암, IV기 대장암을 가진 것으로 알려진 피험자로부터의, 및 대장암을 가지지 않는 것으로 알려지 피험자로부터의 프로필과 비교된다. 구체예에서, 미공지 상태의 상기 피험자로부터의 샘플에서 상기 적어도 4개의 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 상기 검출된 양은 하나 이상의 수학적 모델로 분석되어 위험 평가를 생성한다.
구체예서, 상기 적어도 4개의 시약 각각은 고체 표면에 부착된다. 구체예에서, 상기 시약 각각은 상이한 고체 표면 또는 고체 표면의 상이한 위치에 부착된다. 구체예에서, 상기 고체 표면은 비드, 자기 비드, 및 슬라이ㄷ, 멀티웰 플레이트의 웰, 칩, 미세 유체 채널 또는 이들의 조합을 포함한다. 구체예에서, 각 시약은 고체 표면에 부착되고, 상기 고체 표면 각각은 상이한 내부 마커를 가진다. 구체예에서, 상기 상이한 내부 마커는 방사성 동위원소 태그, 양자점, 단백질 또는 펩티드 태그, RFID 태그, 또는 형광 염료를 포함한다. 구체예에서, 각 시약은 고유하고 상이한 내부 마커를 가지는 비드에 부착되어 상기 시약에 의해 검출된 폴리펩티드 각각의 존재 또는 양이 상기 내부 마커의 존재에 의해 개별적으로 식별될 수 있다.
구체예에서, 상기 적어도 4개의 시약 각각은 GDF15, 케라틴 1-10, 및 헵신, IL-8, CEA, L1CAM, MCP-1, 및 OPG 중 2 이상을 포함하는 적어도 4개의 폴리펩티드 중 하나에 특이적인 1차 항체 또는 항원 결합 단편이다. 일부 구체예에서, 상기 적어도 4개의 폴리펩티드는 GDF15, 케라틴 1-10, CEA, L1CAM, 헵신, IL-8, AFP, CATD, CD44, 페리틴, MIA, MDK, NSE, ON (SPARC), TWEAK, 및 YKL40를 포함하는 적어도 16개의 폴리펩티드를 포함한다.
다른 구체예에서 키트는 적어도 4개의 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 특이적으로 결합하거나 검출하는 적어도 4개의 시약을 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 4개의 시약 각각은 상기 폴리펩티드 중 하나를 코딩하는 핵산을 특이적으로 검출하는 시약이다. 구체예에서, 상기 시약은 프로브, 프라이머 세트, 프라이머, 또는 압타머를 포함한다.
구체예에서, 상기 키트는 추가 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 검출하기 위한 추가 시약을 추가적으로 포함한다. 구체예에서, 각 추가 시약은 MCP-1, OPG, AFP, 페리틴, CATD, CD44, ALDH1A1, EPCAM, FAP, 갈렉틴 3, IL-6, 칼리크레인 6, CEA, 케라틴 6, L1CAM, MIA, MDK, TWEAK, NSE, ON (SPARC), TGM2, VEGFA, 또는 YKL40을 포함하는 추가 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 중 하나에 특이적으로 결합한다.
구체예에서, 상기 키트는 적어도 4개의 검출 가능하게 표지된 2차 시약을 포함한다. 각 검출 가능하게 표지된 2차 시약은 적어도 4개의 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 중 하나를 특이적으로 검출하고; 상기 적어도 4개의 검출 가능하게 표지된 2차 시약 각각은 상이한 검출 가능한 표지를 가진다. 일부 구체예에서, 2차 시약에서 검출 가능한 표지는 방사성 동위원소, 형광 염료, 효소, 양자점, 효소, 발광 반응물, 또는 이들의 조합을 포함한다. 구체예에서, 상기 검출 가능하게 표지된 2차 시약의 표지는 고체 표면의 내부 마커의 것과 상이하다.
구체예에서, 상기 적어도 4개의 검출 가능하게 표지된 2차 시약 각각은 2차 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 각 검출 가능하게 표지된 2차 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 적어도 4개의 폴리펩티드 중 하나에 특이적으로 결합하고; 상기 적어도 4개의 검출 가능하게 표지된 2차 항체 또는 이의 항원 결합 단편 각각은 상이한 검출 가능한 표지를 가진다. 구체예에서, 상기 검출 가능하게 2차 표지된 항체 또는 항원 결합 단편 각각은 동일한 폴리펩티드에 결합하는 1차 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 상이한 에피토프에 결합한다.
구체예에서, 키트는 각각 별도의 용기에 있는, 상기 적어도 4개의 시약, 단일 용기에 있는 상기 적어도 4개의 상이한 시약 중 적어도 2개의 시약, 또는 단일 용기에 있는 상기 적어도 4개의 상이한 시약 모두를 포함할 수 있다.
구체예에서, 키트는 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 중 적어도 하나의 공지된 양을 포함하는 적어도 하나의 표준을 포함한다. 일부 구체예에서, 적어도 4개의 상이한 표준은 상기 키트에 포함되고, 각 표준은 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 중 하나의 공지된 양을 가진다. 구체예에서, 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 각각에 대한 표준은 희석되어 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 각각의 상이한 공지된 양을 갖는 여러 샘플을 생성할 수 있다. 다른 구체예에서, 분석되는 모든 폴리펩티드의 공지된 양은 단일 용기에 있다. 구체예에서, 상기 표준은 동결 건조되고 재구성 및/또는 희석을 위한 지침이 포함될 수 있다.
다른 구체예에서, 표준은 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 각각에 대한 저농도 품질 대조군 표준을 포함한다. 다른 구체예에서, 표준은 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 각각에 대한 고농도 품질 대조군 표준을 포함한다.
구체예에서, 표준은 저농도 품질 대조군 샘플, 및/또는 고농도 품질 대조군 표준일 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 저 품질 대조군 표준에서 폴리펩티드의 농도는 상기 폴리펩티드에 따라 .001 내지 500 ng/ml 범위이다. 예를 들어, GDF15에 대한 저농도 품질 대조군 표준은 약 .01 내지 약 .5 ng/ml이고, 헵신에 대한 저농도 품질 대조군 표준은 약 2 내지 약 10 ng/ml이고, IL-8에 대한 저농도 품질 대조군 표준은 약 .1 내지 약 .5 ng/ml이고, 케라틴 1-10에 대한 저농도 품질 대조군 표준은 약 100 내지 약 500 ng/ml이다.
일부 구체예에서, 상기 고 품질 대조군 표준에서 폴리펩티드의 농도는 상기 폴리펩티드에 따라 .05 내지 5000 ng/ml 범위이다. 예를 들어, GDF15에 대한 고농도 품질 대조군 표준은 약 1 내지 약 5 ng/ml이고, 헵신에 대한 고농도 품질 대조군 표준은 약 20 내지 약 50 ng/ml이고, IL-8에 대한 고농도 품질 대조군 표준은 약 .1 내지 약 1 ng/ml이고, 케라틴 1-10에 대한 고농도 품질 대조군 표준은 약 1000 내지 약 5000 ng/ml이다.
구체예에서, 상기 키트는 하나 이상의 대조군 샘플을 추가로 포함한다. 구체예에서, 상기 대조군 샘플은 저위험 폴립으로 알려진 피험자로부터의 샘플, 고위험 폴립을 가지는 것으로 알려진 피험자로부터의 샘플, I기 대장암을 가지는 것으로 알려진 피험자로부터의 샘플, II기 대장암을 가지는 것으로 알려진 피험자로부터의 샘플, III기 대장암을 가지는 것으로 알려진 피험자로부터의 샘플, IV기 대장암을 가지는 것으로 알려진 피험자로부터의 샘플, 폴립 또는 대장암을 가지지 않는 것으로 알려진 피험자로부터의 샘플, 또는 이들의 조합을 포함한다. 구체예에서, 이러한 대조군 샘플은 폴리펩티드 각각의 검출 방법을 검증하기 위해 사용될 수 있다.
구체예에서, 상기 표준 및/또는 대조군 샘플은 미공지 상태를 가지는 피험자로부터의 샘플과 동일하게 처리된다.
구체예에서, 상기 적어도 4개의 시약 및 상기 검출 가능하게 표지된 2차 시약이 상기 샘플과 접촉되면, 상기 2차 시약의 표지의 양을 검출함으로써 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 양이 검출된다. 구체예에서, 상기 2차 시약의 표지는 형광 활성화 세포 분류, 특정 파장에서의 흡광도, 방사성 동의원소의 양 검출, 기타 표지 검출 방법을 사용하여 검출된다. 일부 구체예에서, 상기 적어도 4개의 시약이 상이한 고체 표면에 부착될 때, 상기 적어도 4개의 시약은 상기 4개 시약 각각에 대한 각 내부 마커를 검출함으로써 서로 별개로 분석될 수 있다. 상기 적어도 4개의 시약 각각에 대한 상기 검출 가능하게 표지된 2차 시약의 양은 상기 특정 폴리펩티드에 대한 표준에 기초하여 표준 곡선을 사용하여 상기 적어도 4개의 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 각각의 양을 제공하도록 결정될 수 있다.
그런 다음 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 각각의 존재 또는 검출된 양의 결정이 본원에서 기술된 바와 같은 통계적 방법론 및/또는 수학적 모델링을 사용하여 분석된다. 폴리펩티드 및/또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 각각의 검출된 양은 폴립 또는 대장암을 가지는 것으로 알려지지 않은 피험자로부터의 대조군과 비교하여 증가 또는 감소될 수 있다.
실시예
실시예 1
시스템은 정상으로 분류되었던, 저위험 선종 폴립을 가지고, 고위험 선종성 폴립을 가지며, I기, 또는 II기 대장암을 가진 피험자의 혈청 내 다중 마커들의 존재를 시험하는 것을 고려한다. 대장암 위험에 대한 높은 수준의 민감도를 제공하는 마커들의 조합을 확인하기 위해 많은 수의 다양한 마커들을 시험하고 통계 분석을 사용하였다.
재료
피험자 샘플
대장 내시경 검사로-확인된 표본은 병원 수집 장소에서 얻었다. 모든 샘플은 승인된 프로토콜 하에서 수집되었다. 이 연구의 분석은 399 명의 대장 내시경 검사로-확인된 피험자가 포함되었다. 샘플은 -80℃에서 보관되었고 시험 직전에 해동되고 분석된 각 분석물에 대해 적절한 작업 범위로 희석되었다.
비드 분석 키트 및 시약
모든 희석 버퍼 및 판독 버퍼는 Millipore Sigma® 또는 Ray Biotech®에서 왔다. 각 마커에 특이적인 항체는 또한 Millipore Sigma® 또는 Ray Biotech®에서 얻었다. 포획 항체는 XMAP® 자기 비드와 같은 자기 비드에 부착되었다. 자기 비드는 내부적으로 코딩된 다른 형광 비드 세트를 포함한다. 다른 형광 태그를 가진 리포터 분자는 Millipore Sigma®에서 얻었다. 분석 판독기는 LUMINEX®의 MAGPIX™이다.
다중화된 교정기 세트는 각 패널에 대해 준비되었다. 각 표준 곡선은 분석 블랭크를 포함하여, 분석의 전체 범위에 걸쳐 있는 8개의 포인트로 구성되었다. 표준은 희석된 환자 샘플에서 희석제/혈청 조성을 반영하기 위해 희석된 샘플에 존재하는 동등한 혈청 농도를 포함하는 적절한 샘플 희석제에 스파이크된 항체로 준비되었다. 사전 희석된 표준은 -80℃에 보관되었다.
방법
리간드 결합 분석
1-9개의 상이한 바이오마커에 대한 분석은 Luminex® MAGPIX 다중 기기를 사용하여 수행되었다. 맞춤형 분석 키트는 이 연구를 위해 선택된 암-관련 마커들을 포함하기 위해 Millipore Sigma®에 의해 준비되었다. 평가된 마커는: GDF 15, DKK1, NSE, ON (SPARC), 페리오스틴, TRAP5, OPG, YKL40, TWEAK, AFP, 렙틴, TNFa, OPN, VEGF, 코르티솔, 케라틴 6, 케라틴 1-10, IL-6, IL-8, MCP-1, L1CAM, 메소텔린, MDK, 헵신, 칼리크레인 6, TGM2, ALDH1A1, EpCAM, CD44, TIM3, 갈렉틴-3, CATD, FAP (세프라제), MIA, MPO, SHBG, 페리틴, 및 ACT을 포함했다. 각 마커에 특이적인 항체는 Millipore®에 의해 특정 색상의 코딩된 자기 비드 세트에 부착되었다. 희석된 피험자 샘플, 작업 표준, 품질 대조군 샘플, 및 자기 비드 마스터 믹스는 제조업체의 설명서에 따라 희석되었다. 피험자 샘플, 표준, 대조군 샘플 및 비드를 96-웰 플레이트(Millipore Sigma®)에 첨가하고 4℃에서 밤새도록 배양했다.
배양 후, 플레이트를 실온으로 가온한 다음 분석 버퍼로 세척하였다. 플레이트가 세척되면, 검출 항체의 미리 희석된 블렌드 25uL을 650rpm에서 연속적으로 흔들면서 60분 동안 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 세척 버퍼에서 3회 세척하고, 판독 버퍼를 각 웰에 로딩하였다. 플레이트는 Luminex® MAGPIX 다중 기기에서 즉시 판독되었다.
통계 분석
데이터는 최적 표준 곡선을 그래프로 작성하고 곡선에서 혈청 샘플 값을 일치시킴으로써 분석되었다. Milliplex® 분석 소프트웨어를 사용하여 중복 분석의 CV%를 계산하고, 희석된 임의의 혈청 샘플에 올바른 희석 계수를 적용하였다. 데이터는 최소 90% 이상의 초기 암에 대한 민감도; 최소 50% 이상의 건강한 정상에 대한 특이도; 및 최소 80% 이상의 곡선 아래 면적(AUC)을 갖도록 설계된 모델을 사용하여 추가로 분석되었다. 다양한 조합의 마커를 사용하여 여러 다른 모델을 분석하였다.
결과
399개 샘플 각각에서 발견된 각 마커의 양은 정상 샘플, 저위험 선종 폴립, 고위험 선종 폴립, I기 샘플, 및 II기 샘플에 대한 중앙값 피코그램 또는 ml 당 나노그램으로 보고되었다. 결과는 표 1에 나타낸다.
표 1
Figure pct00001
마커 양의 증가 또는 감소 여부에 관계없이, 정상 및 I기 또는 II기 대장암 간에 가장 큰 차이를 보이는 마커는 다음을 포함한다: AFP, 렙틴, 페리틴, 항-키모트립신 (ACT), TIM3, OPN, 칼리크레인 6, EPCAM, 및 MCP-1.
이 데이터는 3가지 다른 수학적 모델을 사용하고 생체 데이터 (모델 1에서) 뿐만 아니라 마커의 다른 조합을 사용하여 추가로 분석되었다. 모델 1은 최근접 이웃을 식별하기 위해 거리 측정을 활용하는 K-Nearest Neighbors 분류의 변형인 Universal Process Classification 알고리즘을 사용한다. 모델 2는 식별 중에 방사형 기저 함수 커널과 함께 잘-확립된 지원 벡터 분류기를 사용한다. 모델 3은 다수의 무작위로-초기화된 2진 결정 트리의 결과를 평균화하여 예측하는 알고리즘 분류인, 랜덤 포레스트 분류기이다. 모델 4는 또한 랜덤 포레스트 분류기이다. 모델 1에서, 사용된 생체 데이터는 키 (참고, 키와 몸무게 또는 BMI가, 모두 사용되지 않았음); 몸무게 (참고, 키와 몸무게 또는 BMI가, 모두 사용되지 않았음); BMI, 체질량 지수 = (킬로그램 단위의 체중/미터 단위의 키); 성별; 흡연 상태 (비흡연자, 흡연자, 또는 전-흡연자); 주당 알코올 섭취량 (0, 1-7, 8-14, 15-21, >21); 및 이전 암 병력 (유 또는 무)을 포함하였다. 결과는 표 2에 나타낸다.
모델 4는 또한 랜덤 포레스트 분류기이다. 이는 다음의 15 마커를 사용한다: AFP, CATD, CD44, 페리틴, GDF15, 헵신, IL-8, 케라틴 1-10, L1CAM, MIA, MDK, NSE, ON (SPARC), TWEAK, YKL40.
표 2
Figure pct00002
모델 1은 99% 민감도, 56% 특이도, 및 83% AUC를 제공했다. 모델 2는 97% 민감도, 23% 특이도, 및 74% AUC를 제공했다. 모델 3은 99% 민감도, 50% 특이도, 및 80% AUC를 제공했다. 모델 4는 91% 민감도, 48% 특이도, 및 82% AUC를 제공했으며, F1 점수는 0.88이다.
4개의 모델 모두: AFP, 카스D, CD44, 페리틴, GDF15, 헵신, 및 Il-8을 포함하는 동일한 마커 중 일부를 포함했다. 모델 1, 2, 및 3은 또한 ACT, DKK1, MCP-1, MPO, 및 OPG를 포함했다. 모델 2, 3, 및 4는 또한 케라틴 1-10을 포함했다. 모델 1 및 2는 케라틴 6 및 TIM3을 추가로 포함했다. 모델 2 및 4는 L1CAM, MIA, MDK, NSE, ON (SPARC), TWEAK, 및 YKL40을 추가로 포함했다. 모델 1은 또한 EpCAM, FAP, 및 갈렉틴 3을 포함했다. 모델 1은 생체 매개변수를 포함했다. 모델 2는 또한 마커 IL-6, 칼리크레인 6, 및 VEGF-A를 포함했다. 모델 3은 마커 ALDH1A1을 추가로 포함했다.
결론
4개의 상이한 모델을 사용하여 저위험 선종 폴립, 고위험 선종 폴립, I기 또는 II기 암을 갖는 피험자로부터 정상 혈청 샘플을 구별하는 데 유용한 마커 패널이 확인되었다. 두 모델은 최소 90%의 민감도, 최소 50%의 특이도, 및 최소 80%의 AUC를 제공했다. 12개의 마커 세트는 3개 모델 모두에서 공유되었다. 이러한 마커 및 기타 마커는 대장암을 갖는 위험에 대한 피험자를 선별하기 위한 시험에 활용될 수 있다.

Claims (42)

  1. 4개 시약 각각이 피험자로부터의 샘플에서 복수의 폴리펩티드 중 하나에 특이적으로 결합하고, 상기 복수의 폴리펩티드는 GDF15, 케라틴 1-10, 및 헵신, IL-8, CEA, L1CAM, MCP-1, 및 OPG 중 2 이상을 포함하는 적어도 4개의 시약; 및
    상기 폴리펩티드 중 하나의 공지된 양을 포함하는 적어도 하나의 표준
    : 을 포함하는 미공지 상태의 피험자에서의 하나 이상의 마커 검출용 키트.
  2. 제1항에 있어서, 하나 이상의 컴퓨팅 장치에 의해 실행될 때, 상기 컴퓨팅 장치가 지도 기계 학습 알고리즘에 의해 상기 폴리펩티드 각각의 검출된 양을 분석하여 대장암을 가지거나 가지지 않은 상기 피험자의 위험 평가를 생성하게 하도록 구현된 컴퓨터-실행 가능 지침을 가지는 하나 이상의 비-일시적 컴퓨터-판독 가능 매체를 더 포함하는, 키트.
  3. 제2항에 있어서, 상기 위험 평가는:
    상기 폴리펩티드 각각의 상기 검출된 양을 수신하는 단계;
    상기 폴리펩티드 각각의 상기 검출된 양의 각각에 대한 계수를 데이터베이스로부터 검색하는 단계;
    상기 폴리펩티드의 상기 검출된 양 각각에 상응하는 계수를 곱하여 상기 폴리펩티드 각각에 대한 가중 수준을 생성하는 단계;
    각 폴리펩티드에 대한 가중 수준의 상기 조합을 기계 학습 모델로 분석하여 정상 피험자에 대한 상기 폴리펩티드의 미리 결정된 가중 수치들의 조합으로부터의 변화 또는 이의 결여를 기초로 상기 피험자가 대장암을 가질 가능성을 결정하는 단계에 의해 생성되는 키트.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 4개의 검출 가능하게 표지된 2차 시약을 추가로 포함하고, 각 검출 가능하게 표지된 2차 시약은 상기 폴리펩티드 중 하나에 특이적으로 결합하고, 상기 적어도 4개의 검출 가능하게 표지된 2차 시약 각각은 상이한 검출 가능한 표지를 갖는, 키트.
  5. 제4항에 있어서, 상기 검출 가능한 표지는 방사성 동위원소, 형광 염료, 효소, 양자점, 발광 반응물, 또는 이들의 조합을 포함하는, 키트.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 폴리펩티드는 GDF15, 케라틴 1-10, 헵신, 및 IL-8을 포함하는, 키트.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 폴리펩티드는 GDF15, 케라틴 1-10, CEA, L1CAM, MCP-1, 및 OPG를 포함하는, 키트.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 폴리펩티드는 GDF15, 케라틴 1-10, CEA, L1CAM, MCP-1, OPG, 헵신, 및 IL-8을 포함하는, 키트.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 추가 폴리펩티드 검출용 시약을 추가로 포함하고, 상기 추가 폴리펩티드는 AFP, 페리틴, CATD, CD44, MIA, MDK, NSE, ON (SPARC), TWEAK, 및 YKL40을 포함하는, 키트.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 폴리펩티드는 GDF15, 케라틴 1-10, CEA, L1CAM, MCP-1, OPG, 헵신, IL-8, AFP, CATD, CD44, 페리틴, MIA, MDK, NSE, ON (SPARC), TWEAK, 및 YKL40을 포함하는, 키트.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 폴리펩티드는 GDF15, 케라틴 1-10, CEA, L1CAM, MCP-1, OPG, 헵신, IL-8, AFP, CATD, CD44, 페리틴, MIA, MDK, NSE, ON (SPARC), TWEAK, YKL40, MCP-1, 및 OPG을 포함하는, 키트.
  12. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 4개의 시약은 적어도 4개의 1차 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 각 1차 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 복수의 폴리펩티드 중 하나에 특이적으로 결합하고, 상기 복수의 폴리펩티드는 GDF15, 케라틴 1-10, 및 헵신, IL-8, CEA, L1CAM, MCP-1, 및 OPG 중 2 이상을 포함하는, 키트.
  13. 제12항에 있어서, 상기 적어도 4개의 검출 가능하게 표지된 2차 시약은 적어도 4개의 2차 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고; 각각의 검출 가능하게 표지된 2차 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 복수의 폴리펩티드 중 하나에 특이적으로 결합하고; 및 상기 적어도 4개의 검출 가능하게 표지된 항체 또는 이의 항원 결합 단편 각각은 상이한 검출 가능한 표지를 갖는, 키트.
  14. 제13항에 있어서, 상기 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 상기 1차 항체 또는 이의 항원 결합 단편 각각은 동일한 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 상기 검출 가능하게 표지된 2차 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 상이한 에피토프에서 결합하는, 키트.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 4개의 시약 각각은 고체 표면에 부착되는, 키트.
  16. 제15항에 있어서, 상기 고체 표면은 비드, 자기 비드, 웰, 슬라이드, 튜브, 또는 이들의 조합을 포함하는, 키트.
  17. 제16항에 있어서, 상기 적어도 4개의 시약 각각은 상이한 고체 표면에 부착되는, 키트.
  18. 제17항에 있어서, 상기 상이한 고체 표면은 상이한 내부 마커를 갖는 자기 비드를 포함하는, 키트.
  19. 제18항에 있어서, 상기 상이한 내부 마커는 형광 염료, 양자점, 단백질 태그, RFID 태그, 또는 이들의 조합을 포함하는, 키트.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 고체 표면의 상기 내부 마커는 상기 고체 표면에 부착된 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 특이적인 상기 검출 가능하게 표지된 2차 시약의 상기 검출 가능한 표지와 상이한, 키트.
  21. 샘플을 적어도 4개의 시약과 접촉시켜 상기 샘플에서 적어도 4개의 폴리펩티드의 존재 또는 양을 검출하는 단계로서, 각 시약은 GDF1, 케라틴 1-10, 및 헵신, IL-8, CEA, L1CAM, MCP-1, 및 OPG 중 2 이상을 포함하는 복수의 폴리펩티드 중 하나의 존재 및/또는 양을 특이적으로 검출하는 단계; 및
    상기 적어도 4개의 폴리펩티드 각각의 존재 및/또는 검출된 양의 조합이 상기 피험자의 대장암의 존재 또는 존재의 증가된 위험을 나타내는 것인지 여부를 결정하는 단계
    : 를 포함하는 미공지 상태의 피험자로부터의 샘플에서 적어도 4개의 상이한 폴리펩티드 검출 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 샘플은 혈청 샘플, 혈액 샘플, 혈장 샘플, 소변 샘플, 조직 샘플, 대변 샘플, 또는 타액 샘플인, 방법.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 피험자로부터 샘플을 얻는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 4개의 시약은 1차 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 1차 항체 또는 이의 항원 결합 단편 각각은 상기 복수의 폴리펩티드 중 하나에 특이적으로 결합하는, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 폴리펩티드 중 하나에 특이적으로 결합하는 1차 항체 또는 이의 항원 결합 단편 각각은 고체 표면에 부착되는, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 폴리펩티드 중 하나에 특이적으로 결합하는 1차 항체 또는 이의 항원 결합 단편 각각은 상이한 고체 표면에 부착되는, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 상이한 고체 표면 각각은 상이한 내부 마커를 갖는, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 내부 마커는 형광 염료, 양자점, 단백질 태그, RFID 태그, 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  29. 제21항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 4개의 시약은 단일 용기에 존재하는, 방법.
  30. 제21항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 4개의 시약 각각은 상기 샘플에 존재한다면 상기 적어도 4개의 폴리펩티드 중 하나의 특이적 폴리펩티드와 복합체를 형성하는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 샘플을 적어도 4개의 검출 가능하게 표지된 2차 시약과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하고, 검출 가능하게 표지된 2차 시약 각각은 포함하는 상기 복수의 폴리펩티드 중 하나에 특이적으로 결합하고; 및 상기 적어도 4개의 검출 가능하게 표지된 2차 시약 각각은 상이한 검출 가능한 표지를 갖는, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 적어도 4개의 검출 가능하게 표지된 2차 시약은 2차 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 2차 항체 또는 이의 항원 결합 단편 각각은 상기 복수의 폴리펩티드 중 하나에 특이적으로 결합하는, 방법.
  33. 제21항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 4개의 시약을 상기 폴리펩티드 중 적어도 하나의 공지된 양을 포함하는 표준과 접촉시키는 단계; 및 상기 표준에서 상기 적어도 하나의 폴리펩티드의 양을 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  34. 제21항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표준의 상기 폴리펩티드의 상기 검출된 양을 기초로 상기 폴리펩티드 각각에 대한 변이의 백분율 계수를 결정함으로써 상기 폴리펩티드 각각의 상기 검출된 양의 측정의 정확도를 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  35. 제21항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플에서 상기 폴리펩티드의 상기 검출된 양의 상기 조합이 대장암의 존재 또는 존재의 증가된 위험을 나타내는지 여부를 결정하는 단계는:
    컴퓨팅 장치에서 상기 폴리펩티드 각각의 상기 검출된 양을 수신하는 단계;
    상기 컴퓨팅 장치에서 상기 폴리펩티드 각각의 상기 검출된 양 각각에 대한 계수를 데이터베이스로부터 검색하는 단계;
    상기 컴퓨팅 장치에서 상기 검출된 양 각각에 상응하는 계수를 곱하여 상기 폴리펩티드 각각에 대한 가중 수준을 생성하는 단계;
    상기 컴퓨팅 장치에서 각 폴리펩티드에 대한 가중 수준의 조합을 모델로 분석하여 상기 피험자부터의 상기 샘플에서 검출된 상기 폴리펩티드 각각에 대한 가중 수준들의 조합에서 정상 피험자에 대한 상기 폴리펩티드의 미리 결정된 가중 수치의 조합에 대한 변화 또는 이의 결여를 기초로 상기 피험자가 대장암의 증가된 위험을 갖는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 피험자에서 대장암의 존재의 위험을 나타내는 상기 컴퓨팅 장치의 출력을 생성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  37. 제21항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 출력이 대장암의 존재의 증가된 위험을 보여준다면 대장암에 대한 결장 검사를 수행하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  38. 제21항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 출력이 대장암의 존재의 증가된 위험을 보여준다면 상기 대장암 피험자를 치료하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  39. 제21항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 폴리펩티드는 GDF15, 케라틴 1-10, 헵신, 및 IL-8을 포함하는, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 복수의 폴리펩티드는 CEA, L1CAM, MCP-1, 및 OPG를 추가로 포함하는, 방법.
  41. 제21항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 폴리펩티드는 GDF15, 케라틴 1-10, CEA, L1CAM, MCP-1, OPG, 헵신, IL-8, AFP, CATD, CD44, 페리틴, MIA, MDK, NSE, ON (SPARC), TWEAK, 및 YKL40을 포함하는, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 복수의 폴리펩티드는 MCP-1 및 OPG를 추가로 포함하는, 방법.
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