JP6753861B2 - 慢性腎疾患の急速進行のバイオマーカー - Google Patents

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Description

本発明は、患者における慢性腎疾患の進行を予測する方法に関する。より具体的には、本発明は、患者の尿サンプル中の特定のバイオマーカーサインを用いる慢性腎疾患の急速進行の早期予測に関する。
背景
慢性腎疾患（CKD）は、現在、西洋の人口の約１０％が罹患しており、そして、発生数が世界中で増加していると考えられている。低い糸球体濾過率（GFR）は、心血管に起因する死亡リスクの増加に加えて、年齢調整総死亡率にも関連している１、２。この死亡リスクの増加は、患者が末期腎疾患（ESRD）に達する前でさえも生じる１。したがって、CKDは、重大な公衆衛生上の問題である。一部のCKD患者は、急激に末期腎疾患（ESRD）に進行するので、よりリスクが高く、一方、他の患者では、CKDは安定した状態を保つか又は更には改善する場合もある３。進行しやすい患者を同定することが、層別化よりも重要である。アルブミン尿は、CKD進行の優れた予測判断材料である４。しかし、アルブミン尿は、CKDが進行中であるにもかかわらず消失し得る５。
CKDの進行において役割を果たし得る多数のエフェクターが存在し、そして、腎進行のバイオマーカーとして有力な候補であり得る。
形質転換成長因子−β（TGF-β）６経路及びその下流のエフェクターである結合組織成長因子（CTGF）７、８は、マトリクス合成の公知の主な駆動因子であり、そして、線維症発現の潜在因子である。線維症の構成要素である細胞外マトリクス（ECM）の蓄積は、III型コラーゲン等の分子からなるので、本発明者らは、III型プロコラーゲンアミノ末端プロペプチド（PIIINP）９、１０（コラーゲンの量の間接的指標が合成される）に加えて、２つの他の重要なECM分子であるフィブロネクチン１（FN1）１１及びペリオスチン１２について研究した。名称が示す通り、研究のためのECMリモデリングに関与する他の分子は、マトリクスメタロプロテアーゼ９（MMP9）及び組織メタロプロテアーゼ阻害因子１（TIMP1）であり、これらはそれぞれ、ECMを破壊し、そして、この破壊作用を阻害する１３。
炎症プロセスは、最終的な線維症の駆動において重要な役割を果たすと考えられている。炎症の観点から、多数の炎症ケモカイン及びサイトカインが関与している可能性がある：単球走化性タンパク質１（MCP1）１４、オステオポンチン１５、インターロイキン１８（IL18）１６、IL6１７、及び白血球阻害因子（LIF）１８、並びに成長及び分化因子１５（GDF15）１９。上皮成長因子（EGF）受容体（EGFR）のリガンド等の成長因子は、細胞の成長及び増殖において役割を有する。病態生理におけるEGF及び形質転換成長因子アルファ（TGF-α）等のリガンドは、CKDにおいて役割を有し得る２０。好中球ゼラチナーゼ関連リポカリンは、その多くの役割の中でも特に、EGFRの下流で作用し得る２１。血管内皮成長因子Ａ（VEGFA）２２及びＣ（VEGFC）２３は、血管新生及びリンパ脈管新生に関与している成長因子であり、これらのいずれもCKDの進行における役割が同定されている。
他の分子は、腎臓の構造及び機能に対してより特異的であり、そして、腎臓の損傷の程度に依存して様々なレベルで発現する。脂肪酸結合タンパク質１（FABP1）２４〜２６は、主に近位尿細管で発現する。腎傷害分子１（KIM1）は、尿細管でも発現するが、疾患状態においてのみである２７。EGFは、遠位尿細管でも発現する２８。シスタチンＣは、１３．４kDaのシスタチンプロテアーゼ阻害剤であり、糸球体で自由に濾過され、そして、細管で再吸収される２９ので、尿中レベルが高いことは、細管の損傷を示唆し得る。ウロモジュリンは、ヘンレ係蹄で発現し、そして、尿に分泌される３０。
この生理病理学的情報にもかかわらず、急速進行の予測において使用するための信頼できるバイオマーカーサインは存在しない。
合計８３９１人のCKDのステージ３〜５の患者を含むTangriらによる大規模試験では、血漿アルブミン、カルシウム、リン酸塩、重炭酸塩、アルブミン尿等の日常的にルーチンに測定される指標を用い、そして、年齢、性別、及びベースライン推定糸球体濾過率（eGFR）を考慮したCKD進行についての予測モデルが、CKDの腎不全への進行を予測することが示された３３。ここでの主な評価項目は、腎置換療法にとって必要であった。
他のグループは、大部分が、測定糸球体濾過率（mGFR）金標準ではなくより精度の低いeGFRを使用してCKDの進行を予測する他のモデルを考えていた。eGFRは、明らかに測定が容易かつ安価であるが、知見がeGFR推算式を用いて完全には再現されないという事実は驚くべきことではない。mGFRが直面するeGFRの精度の低さは、eGFRの感度が低いためと、既に報告されている４３。２以上のGFRを考慮しなければならない場合、進行を考察するときに誤差が更に増幅される。
しかし、人口統計学的リスク要因と共にアルブミン尿を検出することは、依然として標準的なアプローチである。したがって、信頼できるバイオマーカー、特に、尿中バイオマーカーを追加することによって予測精度を高めることは有用であろう。特に、慢性腎疾患の急速進行のリスクを有する患者をインビトロで早期に検出する方法に対する要求が当技術分野において高まっている。
したがって、本発明は、CKDの進行に関連する尿中バイオマーカーの特定の組み合せを開示し、そして、CKDの進行の新規予測方法及びそのキットを提供することとしてこの要求を満たすものである。
概要
本発明は、被験体における慢性腎疾患の急速進行を予測するためのインビトロ法であって、前記被験体から得られた生物学的サンプル中の１つ以上のバイオマーカーの発現を評価する工程を含み、前記１つ以上のバイオマーカーが、形質転換成長因子アルファ（TGF-α）、上皮成長因子（EGF）、及び単球走化性タンパク質１（MCP1）からなる群から選択される方法に関する。
具体的な実施態様では、本発明の予測方法は、少なくともEGF、MCP1、及びTGF-α、そして、場合により、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（NGAL）の発現を評価することを含む。
前述の実施態様と組み合わせることができる他の具体的な実施態様では、評価工程は、（ａ）前記被験体から得られた生物学的サンプル中の選択されたバイオマーカーのうちの１つ以上の発現を定量して、各定量されたバイオマーカーについての発現値を得る工程と、（ｂ）工程（ａ）において得られた前記発現値を対応する対照値と比較する工程であって、対照値を下回るEGFの発現値、及び／又は対照値を上回るMCP1の発現値、及び／又は対照値を上回るTGFαの発現値、及び／又は対照値を上回るNGALの発現値が、ヒト被験体の急速進行のリスクが高いことを示す工程とを含む。
前述の実施態様と組み合わせることができる他の具体的な実施態様では、成長及び分化因子１５（GDF15）、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（NGAL）、シスタチンＣ、脂肪酸結合タンパク質（FABP）、フィブロネクチン、腎傷害分子１（KIM1）、オステオポンチン、組織メタロプロテアーゼ（Mettaloprotease）阻害因子１（TIMP1）、ウロモジュリン及び血管内皮成長因子Ａ（VEGFA）、インターロイキン−６（IL6）、白血病抑制因子（LIF）、マトリクスメタロペプチダーゼ９（MMP9)からなる群から選択される１つ以上のバイオマーカーの発現を更に評価する。
前述の実施態様と組み合わせることができる他の具体的な実施態様では、本方法で使用するための前記生物学的サンプルは、尿又は血清のサンプルである。
前述の実施態様と組み合わせることができる他の具体的な実施態様では、例えば、イムノアッセイで定量するとき、生物学的サンプル中の各バイオマーカーのタンパク質発現を評価する。
前述の実施態様と組み合わせることができる他の具体的な実施態様では、次いで、急速進行が予測された前記被験体を、慢性腎疾患を処置するための治療剤で処置するために選択する。
本発明は、更に、被験体における慢性腎疾患を処置するための治療剤の効力をモニタリングするインビトロ法であって、前記被験体の生物学的サンプル中のバイオマーカーの発現を評価することを含み、前記バイオマーカーが、EGF、MCP1、及びTGF-αであり、そして、場合によりNGALの発現を評価することを含む方法に関する。
前述の実施態様と組み合わせることができる他の具体的な実施態様では、慢性腎疾患を処置する前に第１の評価工程を実施し、次いで、前記処置工程中又は前記処置工程後に繰り返し、前記バイオマーカーの発現の変化が、前記処置に対する応答を示す。
本発明は、更に、本発明の上記方法のうちのいずれか１つを実施するためのキットであって、少なくとも以下のバイオマーカー：EGF、MCP1、及びTGF-αのタンパク質発現を定量する手段と、場合によりNGALのタンパク質発現を定量する手段とを含むキットに関する。
前述の実施態様と組み合わせることができる他の具体的な実施態様では、前記タンパク質発現を定量する手段は、各バイオマーカーに特異的な非標識抗体と、場合によりイムノアッセイで前記バイオマーカー／非標識抗体を検出するための第２の標識抗体とを含む。
例えば、より具体的な実施態様では、イムノアッセイで使用するための本発明のキットは、
（ｉ） EGFに特異的な抗体；
（ii） MCP1に特異的な抗体；及び
（iii） TGF-αに特異的な抗体；
（iv） 場合により、NGALに特異的な抗体
を含む。
具体的な実施態様では、キットに含まれている前記抗体は、支持体に固定化されている。他の具体的な実施態様では、キットに含まれている前記抗体は、レポーター分子にコンジュゲートしている。
CKDの進行における「急速進行者」ステータスを予測するために尿中バイオマーカーを組み合わせたベストモデル。（ａ）：このモデルにおける上皮成長因子（EGF）、単球走化性タンパク質（MCP1）、形質転換成長因子−α（TGF-α）、及びアルブミン尿のオッズ比OR（９５％信頼区間、CI）を示すフォレストプロット；（ｂ）：３つのBM：上皮成長因子（EGF）、単球走化性タンパク質（MCP1）、形質転換成長因子−α（TGF-α）、及びアルブミン尿を用いたベストモデルの曲線下面積（AUC）と、バイオマーカー（BM）を用いずアルブミン尿を単独で用いたモデルのAUCとを比較する受信者動作特性（ROC）曲線。モデルは、アルブミン尿、募集センター、糖尿病の病歴、及び平均mGFRについて調整した。 測定GFR（mGFR）及び推定GFR＊（eGFR）による１年間当たりの糸球体濾過率（GFR）の変化率。四角は、いずれの方法を用いても進行の速度が一致している患者を表し：黒四角は、急速進行者であり（ｎ＝３８）、そして、白四角は、緩徐進行者である（ｎ＝１３１）。円は、２つの方法において一致していない患者を表し：黒丸は、mGFRでは急速進行者であるが、eGFRでは急速進行者でなく（ｎ＝３０）、そして、白丸は、eGFRでは急速進行者であるが、mGFRでは急速進行者でない（ｎ＝３０）。灰色線は、回帰直線を示す（ピアソン相関係数ｒ＝０．５）。ここでは５つの外れ値は表示しなかった（ベースラインmGFR／年が＞５０％及び＜−５０％変化）。＊eGFRは、腎疾患における食事の修正（MDRD）式を用いて推定した。 サインにおけるバイオマーカーのバイオマーカー三分位数。モデル５における尿中バイオマーカーの各三分位数における急速進行者の百分率（１年間当たりの測定糸球体濾過率（mGFR）が＞１０％減少）。アルブミンの三分位数Ｔ１：＜３．５８；Ｔ２：３．５８〜３３．０２；及びＴ３：≧３３．０２mg/mmol。上皮成長因子（EGF）の三分位数Ｔ１：＜０．４６；Ｔ２：０．４６〜０．８１；及びＴ３：≧０．８１μg/mmol；単球走化性タンパク質（MCP1）の三分位数Ｔ１：＜１７．７；Ｔ２：１７．７〜３５．６；及びＴ３：≧３２．６ng/mmol；好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（NGAL）の三分位数Ｔ１：＜０．２６；Ｔ２：０．２６〜０．７６；及びＴ３：≧０．７６μg/mmol；並びに形質転換成長因子−α（TGF-α）の三分位数Ｔ１：＜０．３０；Ｔ２：０．３０〜０．４７；及びＴ３：≧０．４７ng/mmol。NGALについてはＪ字形分布の三分位数が観察され得る。
詳細な説明
患者における慢性腎疾患の急速進行の可能性を早期予測することができる方法が、本発明によって提供される。
特に、本明細書では、患者におけるCKDの急速進行、ひいては、末期腎疾患に進行するリスクを予測することができる予後診断方法及びキットが提供される。
本発明によれば、慢性腎疾患の急速進行のリスクが高いことを示す信頼性の高い尿中生物学的マーカーのセットが同定される。
したがって、本発明の目的は、被験体における慢性腎疾患の急速進行を予測するためのインビトロ法であって、前記被験体から得られた生物学的サンプル中の１つ以上のバイオマーカーの発現を評価する工程を含み、前記１つ以上のバイオマーカーが、上皮成長因子（EGF）、単球走化性タンパク質１（MCP1）、形質転換成長因子アルファ（TGF-α）、成長及び分化因子１５（GDF15）、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（NGAL）、シスタチンＣ、脂肪酸結合タンパク質（FABP）、フィブロネクチン、腎傷害分子１（KIM1）、オステオポンチン、組織メタロプロテアーゼ阻害因子１（TIMP1）、ウロモジュリンインターロイキン−６（IL6）、白血病抑制因子（LIF）、マトリクスメタロペプチダーゼ９（MMP9)、並びに血管内皮成長因子Ａ（VEGFA）からなる群から選択される方法からなる。
具体的な実施態様では、上に列挙した前記バイオマーカーのうちの２つ、３つ、４つ、又は５つの発現を評価する。
本発明に係る予測方法の前記１つ以上のバイオマーカーは、より具体的には、EGF、MCP1、及びTGF-αからなる群から選択される。
具体的な実施態様では、本発明の予測方法は、少なくともEGF、MCP1、及びTGF-αの発現、例えば、それらのタンパク質発現と、場合によりNGALの発現を評価することを含む。
以下の実施例に示す通り、CKDの緩徐進行者と急速進行者との間で尿サンプル中の候補バイオマーカーの発現値を比較したとき、本発明者らは、緩徐進行者又は健常被験体に対して急速進行者における発現が統計的に異なる特定のバイオマーカー及びその組み合せを同定した。このようなバイオマーカーを以後「予測バイオマーカー」と呼び、そして、以下の表１に列挙する。
特定の定義
本明細書において互換的に用いられる用語「患者」又は「被験体」は、慢性腎疾患を有する若しくは有することが疑われるか、又はCKDの初期であるヒト（例えば、男性又は女性を含む）、あるいはCKDの人口統計学的リスク因子を考慮して慢性腎疾患を発現するリスクのある被験体を指す。
用語「慢性腎疾患」又は「CKD」は、本明細書において互換的に用いられ、３ヶ月間超持続する腎臓の構造又は機能の異常として定義される状態を指し、突然生じ得、そして、回復するか又は慢性になる健康に対する影響を伴う（Clinical Practice Guideline for the Evaluation and Management of Chronic Kidney Disease Guidelines（KDIGO 2012）。CKDは、原因、重篤度、及び進行の速度に部分的に関連する、変わりやすい臨床症状を伴う腎臓の構造及び機能に影響を与える異質性疾患のための一般用語である（Kidney International Supplements (2013) 3, vii）。特に、CKDの定義及び同定は、以下の基準を用いて規定し得る：
１． 進行のリスクの高い個体及び／又は測定が治療の決定に影響を与える場合。
２． GFRは多少の変動が一般的であるので、必ずしも進行を示すものではないことを認識する。
３． 以下のうちの１つ以上に基づいてCKDの進行を定義する（グレードなし）：
ａ． GFRカテゴリの悪化（Ｚ９０［Ｇ１］、６０〜８９［Ｇ２］、４５〜５９［Ｇ３ａ］、３０〜４４［Ｇ３ｂ］、１５〜２９［Ｇ４］、ｏ１５［Ｇ５］mL/分/１．７３ｍ２）。eGFRにおける特定の低下を、ベースラインからeGFRが５０％以上低下、又は末期腎疾患（ESRD、eGFR＜１５mL/分/１．７３ｍ２、腎置換療法、又は死亡、又は上記パラメータの複合を伴うGFRカテゴリの悪化として定義する。
ｂ． 急速進行は、１年間当たり−３．３％超のeGFRの持続的減少と定義される。
ｃ． 進行の評価における信頼度は、血清クレアチニン測定の数及びフォローアップ期間の増加と共に増大する。
用語「生物学的サンプル」は、被験体から単離された生物学的流体及びその単離物を指すことを意図する。それは、血液サンプル、例えば、全血、血漿、及び血清のサンプル、唾液又は尿のサンプルを含んでいてよいが、これらに限定されるわけではない。特定の実施態様では、生物学的サンプルは、尿サンプルである。
用語「予後診断」は、患者のGFRが速い速度で減少するか又は遅い速度で減少するかに関しての患者の転帰の予測を指すために本明細書で使用される。
本明細書で使用するとき、用語「急速進行の予測」は、必ずしも絶対応答からなるものではない。それは、被験体における慢性腎疾患の急速進行の確率（リスク）を求めることができるようにする場合もあり、又はリスクの正確な確率を与えるのではなく、集団におけるCKDの急速進行の平均リスクと比べて被験体における急速進行のリスクが高いことを求めることができるようにする応答からなる場合もある。
言い換えれば、本発明の方法に従って急速進行者であると予測される患者は、急速進行者であるリスクが高い被験体である。特定の実施態様では、予測は、評価された１つ以上のバイオマーカーのそれぞれについて得られた発現値から計算される、Ｐ値を含む統計値として表される。
用語「急速進行」は、特に、本明細書において「急速進行者」とも呼ばれるCKDに罹患している被験体において１年間当たりベースライン測定糸球体濾過率（mGFR）が１０％超減少することによって測定される、CKDの進展を指す。急速進行者は、重大な罹患及び死亡のリスクを伴う末期腎疾患（ESRD）に進行する可能性がより高い。したがって、本発明の方法の具体的な実施態様では、急速進行が予測される被験体は、例えば、初期測定からその約１年間後まで測定したとき、１年間当たりベースライン測定糸球体濾過率（mGFR）が１０％超減少すると予測される被験体である。対照的に、「緩徐進行者」は、１年間当たりベースライン測定糸球体濾過率（mGFR）が１０％未満しか減少しない被験体である。
本明細書で使用するとき、用語「早期予測」とは、例えば、アルブミン尿、タンパク尿、又はクレアチニン濃度の従来の診断法に従ってCKDの初期、例えば、ステージ１若しくは２（GFR＞６０mL/mn/１，７３ｍ２ ３３）、ステージ３の被験体で、又はCKDを有すると未だ診断されていない被験体においてでさえ実施される予測を指す。本発明の予後診断方法は、被験体におけるCKDの急速進行の早期予測に特に適している。
本明細書で使用するとき、用語「生物学的マーカー」又は「バイオマーカー」は、例えば、患者の生物学的サンプル中で検出することができる患者の病理学的状態の指標を指す。バイオマーカーとしては、DNA、RNA、タンパク質、炭水化物、又は糖脂質系分子のマーカーが挙げられるが、これらに限定されない。
用語「タンパク質」は、用語「ポリペプチド」と互換的に用いられ、そして、その最も広い意味では、２つ以上のサブユニットアミノ酸の化合物を指す。サブユニットは、ペプチド結合によって結合し得る。
用語「キット」とは、本明細書で使用するとき、別々に又は単一の容器内に提供され得る前述の構成要素の集合体を指す。容器は、本開示の方法を実行するための指示書も含む。これら指示書は、マニュアルの形態であってもよく、又はコンピュータ若しくはデータ処理装置において実行されたときに本開示の方法において言及する比較を実施し、そして、それに応じて診断を確立することができるコンピュータプログラムコードによって提供されてもよい。コンピュータプログラムコードは、データ記憶媒体若しくは装置、例えば、光学記憶媒体（例えば、コンパクトディスク）に提供してもよく、又はコンピュータ若しくはデータ処理装置に直接提供してもよい。
本発明の方法において使用するための予測バイオマーカー
予測バイオマーカーは、以後、その頭字語、フルネーム、及びUniprotKB/Swissprote命名法、及び配列番号によって記載する。
本発明では、バイオマーカーに言及するとき、特に、前記バイオマーカーのタンパク質及び／又はその翻訳後修飾物を指す。
対応するバイオマーカーのタンパク質配列は、表１又は配列番号１〜１６に示す通り、対応する参照番号に従ってhttp://www.uniprot.orgにおいて見出すことができる。無論、前記タンパク質配列の任意の天然変異も、本発明において使用するための前記バイオマーカーの定義に含まれる。
予測バイオマーカーの発現の定量
本発明の予測方法は、生物学的サンプル中の予測バイオマーカーのうちの１つ以上の発現を評価する工程を含む。
本明細書で使用するとき、用語「評価する」とは、典型的には、（ａ）前記被験体から得られた生物学的サンプル中の選択された予測バイオマーカーのそれぞれの発現を定量して、発現値を得る工程と、（ｂ）得られた前記予測バイオマーカーの発現値を対応する対照値と比較する工程であって、それぞれの対照値と比較した発現値の差が、前記被験体の急速進行のリスクが高いことを示す工程とを含む。
バイオマーカーの発現は、被験体の生物学的サンプル、例えば、血清又は尿のサンプル中の予測バイオマーカーの遺伝子又はタンパク質の発現を求めることによって定量することができる。定量は、（例えば、バイオマーカーの量を公知の量のバイオマーカーを含む対照と比較し、そして、その対照に比べて量が「多い」か又は「少ない」かを検出することによる）相対的なものであってもよく、又は少なくとも公知の対照量に対する特定の量を求めるためにより正確であってもよい。
１つの具体的な実施態様では、バイオマーカーの発現は、被験体の生物学的サンプル、例えば、尿サンプル中の予測バイオマーカーのうちの少なくとも１つ以上のタンパク質発現を調べることによって定量することができる。具体的な実施態様では、少なくともEGF、MCP1、及びTGFαそして、場合によりNGALのタンパク質発現が、被験体の生物学的サンプル、例えば、尿サンプル中で定量される。
様々なイムノアッセイ法を含む、このような生物学的サンプル中のタンパク質発現レベルを検出するための様々な方法が当技術分野において公知である。前記方法は、ラジオイムノアッセイ、ELISA（酵素結合免疫吸着測定法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫放射定量測定法、インサイツイムノアッセイ（例えば、コロイド金、酵素、又は放射性同位元素標識を用いる）、ウェスタンブロット分析、免疫沈降法、免疫蛍光法、フローサイトメトリー、免疫細胞化学、共焦点顕微鏡、酵素アッセイ、表面プラズモン共鳴、及びPAGE-SDSを含むが、これらに限定されない。
タンパク質レベルの決定は、例えば、患者から得られたサンプル中のバイオマーカーのポリペプチドを選択的に認識し、そして、結合する抗体との間で生じる任意の免疫特異的結合の量を測定することを含む。また、これらアッセイは、標的バイオマーカーに標識抗体を直接結合させることを含んでいてよい。
中でもサンドイッチアッセイは、最も有用であり、そして、一般的に用いられているアッセイである。サンドイッチアッセイ技術の変法が多数存在し、そして、全て本発明によって包含されることを意図する。簡潔に述べると、典型的なフォワードアッセイ（forward assay）では、非標識抗体を固体基材に固定化し、そして、試験するサンプルを結合している分子と接触させる。好適なインキュベート時間、抗体−抗原複合体を形成させるのに十分な時間の後、次いで、抗原に対して特異的であるが、検出可能なシグナルを生成することができるレポーター分子で標識されている第２の抗体を添加し、そして、インキュベートし、抗体−抗原−標識抗体の別の複合体を形成するのに十分な時間放置する。任意の未反応物質を洗い流し、そして、レポーター分子によって生成されるシグナルを観察することによって抗原の存在を決定する。結果は、可視シグナルの単なる観察による定性的なものであってもよく、又は公知の量のバイオマーカーを含有する対照サンプルと比較することによって定量してもよい。
フォワードアッセイの変法は、サンプル及び標識抗体の両方を結合している抗体に同時に添加する同時アッセイを含む。容易に明らかになる通り、任意の軽微な変更を含むこれら技術は、当業者に周知である。典型的なフォワードサンドイッチアッセイでは、バイオマーカーに対する特異性を有する第１の抗体は、固体表面に対して共有結合又は受動的結合している。
結合プロセスは、当技術分野において周知であり、そして、一般的に、架橋共有結合又は物理的吸着からなり、ポリマー−抗体複合体は、試験サンプルの調製において洗浄される。次いで、試験するサンプルのアリコートを固相複合体に添加し、そして、抗体中に存在する任意のサブユニットを結合させるのに十分な時間（例えば、２〜４０分間、又はより都合がよければ一晩）、そして、好適な条件下（例えば、室温〜４０℃、例えば２５℃以上３２℃以下）でインキュベートする。インキュベート時間後、抗体サブユニット固相を洗浄し、そして、乾燥させ、そして、バイオマーカーの一部に特異的な第２の抗体と共にインキュベートする。第２の抗体を、第２の抗体の分子マーカーへの結合を示すために用いられるレポーター分子に結合させる。
別の方法は、サンプル中の予測バイオマーカーを固定化し、次いで、固定化されたバイオマーカーを、レポーター分子で標識されていてもいなくてもよい特異的抗体に曝露することを含む。バイオマーカー標的の量及びレポーター分子シグナルの強度に応じて、結合したバイオマーカー標的を抗体で直接標識することによって検出することができる。あるいは、第１の抗体に特異的な第２の標識抗体を標的−第１の抗体複合体に曝露して、標的−第１の抗体−第２の抗体三元複合体を形成する。この複合体を、レポーター分子によって放出されるシグナルによって検出する。
「レポーター分子」とは、本明細書で使用するとき、その化学的性質によって、抗原に結合している抗体の検出を可能にする、分析で同定可能なシグナルを提供する分子を意味する。この種のアッセイにおいて最も一般的に用いられるレポーター分子は、酵素、フルオロフォア、又は放射性核種含有分子（すなわち、放射性同位元素）及び化学発光分子である。
酵素イムノアッセイ又はELISAアッセイの場合、典型的には、一般的にグルタルアルデヒド又は過ヨウ素酸塩を用いて、酵素を第２の抗体にコンジュゲートしてよい。しかし、容易に認識される通り、広範な様々なコンジュゲーション技術が存在し、これらは当業者が容易に利用可能である。一般的に用いられる酵素は、特に、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、−ガラクトシダーゼ、及びアルカリホスファターゼを含む。特異的酵素と共に使用される基質は、一般的に、対応する酵素による加水分解時における検出可能な色の変化の生成によって選択される。好適な酵素の例は、アルカリホスファターゼ及びペルオキシダーゼを含む。また、蛍光性基質を使用することも可能であり、これによって、上述の発色性基質ではなく蛍光生成物が生じる。全ての場合において、酵素標識抗体を第１の抗体−分子マーカー複合体に添加し、結合させ、次いで、過剰の試薬を洗い流す。次いで、適切な基質を含有する溶液を抗体−抗原−抗体の複合体に添加する。基質は、第２の抗体に結合している酵素と反応して、定性的可視シグナルを与える。これを、通常分光光度的に更に定量して、サンプル中に存在していたバイオマーカーの量の指標を与えることができる。
あるいは、フルオレセイン及びローダミン等の蛍光化合物を、抗体の結合能を変化させることなく抗体に化学的に結合させてもよい。特定の波長の光を当てることによって活性化されたとき、蛍光色素で標識された抗体は光エネルギーを吸収し、分子を励起状態に誘導し、次いで、光学顕微鏡で可視的に検出可能な特徴的な色の光を発する。EIAと同様に、蛍光標識抗体を第１の抗体−分子マーカー複合体に結合させる。未結合試薬を洗い流した後、次いで、残存する三元複合体を適切な波長の光に曝露する。観察される蛍光は、対象となる分子マーカーの存在を示す。免疫蛍光及びEIA技術は、いずれも当技術分野において非常によく確立されている。しかし、他のレポーター分子、例えば、放射性同位元素、化学発光分子、又は生物発光分子を使用してもよい。
本発明の予測方法の具体的な実施態様では、このようにして、定量工程によって、比較工程で用いるための生物学的サンプルにおいて試験される各バイオマーカーの「発現値」を得ることができるようになる。
比較工程における使用を容易にするために、前記発現値は、絶対発現レベル値を参照値と比較した後に得られる正規化（相対）値からなっていてよく、前記参照値は、例えば、生物学的サンプル中の参照タンパク質の発現レベル値からなる。
例えば、具体的な実施態様では、発現値を正規化発現値に調整するためにクレアチニンレベルを用いてよい。通常、クレアチニンは、尿中で酵素試験系又は比色試験系によって決定することができる。
各バイオマーカーの発現値と対応する対照値との比較
本発明の方法は、上記の通り、被験体の生物学的サンプル中の１以上の予測バイオマーカーの発現の定量、及び前記バイオマーカーの各発現値と対応する対照値との比較に基づく。
用語「比較」とは、本明細書で使用するとき、対応するパラメータ又は値の比較を指し、例えば、絶対レベル値を絶対対照レベル値と比較し、濃度を対照濃度と比較し、そして、正規化値を対応する対照正規化値と比較する。
本明細書で使用するとき、用語「対照値」は、対照被験体又は対照被験体の群におけるバイオマーカーの発現値を指し、これによって、個体のCKDの急速進行が予測されるかどうかを評価することができるようになる。
幾つかの実施形態によれば、対照値は、急速進行者、緩徐進行者、又は健常被験体として特徴付けられた対照被験体又は対照被験体の群から得られたバイオマーカーの発現に基づいて求められる。
特定の被験体に適用可能な対照値は、年齢、性別、又は亜集団等の様々な生理学的パラメータに加えて、本明細書において言及するバイオマーカーを定量するために用いられる試験フォーマット、サンプル、及びリガンドに依存して変動し得る。これら要因及び対照値を求めるときに前記要因を考慮する方法は、一般的に、当分野において公知である。幾つかの実施形態では、標準的な統計的方法を適用することによってバイオマーカーのアベレージ値又は平均値又は中央値に基づいて、実施例に明記する被験体のコホートの対照値を計算することができる。
したがって、本発明の前述の方法のために用いられる対照値（すなわち、急速進行のリスクが高い個体の同定を可能にする閾値）は、対照被験体の群において定量したときのバイオマーカーのタンパク質発現の平均／中央発現値（又は正規化（相対）平均／中央値）であってよい。
男性及び女性における各予測バイオマーカーについてのこのような正規化中央値の例を、以下の実施例の表３に与える（値は、尿クレアチニン濃度を用いて正規化値に調整されている）。
また、前記対照値は、本発明の方法のために用いられる定量方法及び予測バイオマーカーに応じて、ルーチンな実験によって求めることもできる。
例えば、前記対照値は、患者の緩徐進行者群について観察される発現（場合により正規化される）平均／中央値に対応し、そして、発現（場合により正規化される）値が対照値と統計的に異なっているとき、例えば、対照値と比較して増加しているか又は対照値と比較して減少しているとき、患者は急速進行者であると予測される。
あるいは、前記対照値は、急速進行者患者について観察される発現レベル値に対応し、そして、発現レベル値が対照値と統計的に異なっていないとき、患者は急速進行者であると予測される。
例えば、本発明の具体的な予測方法では、評価工程は、（ａ）前記被験体から得られた生物学的サンプル中の選択されたバイオマーカーのうちの１つ以上の発現を定量して、各バイオマーカーについての発現値を得る工程と、（ｂ）工程（ａ）において得られた各バイオマーカーの前記発現値を対応する対照値と比較する工程であって、対照値を下回るEGFの発現値、及び／又は対照値を上回るMCP1の発現値、及び／又は対照値を上回るTGFαの発現値、及び／又は対照値を上回るNGALの発現値が、被験体のCKDの急速進行のリスクが高いことを示す工程とを含む。
本発明の方法の工程（ｂ）で言及される比較は、手動で又はコンピュータを使用して実施してよい。
コンピュータを使用して比較する場合、発現値を、コンピュータプログラムによってデータベースに保存されている対照値と比較してよい。コンピュータプログラムは、更に、比較の結果を評価することができる、すなわち、好適な出力フォーマットで所望の評価を自動的に提供することができる。
実施例、そして、より具体的には、以下の実施例の表５に示す通り、本発明に係る予測バイオマーカーのうちの２つ、３つ、４つ、又は５つの組み合せは、患者のCKDの急速進行の予測について統計的に関連し得る。
本発明の予測バイオマーカーのうちの２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上の任意の組み合せが、本発明の方法に包含される。
比較工程は、必ずしも、各バイオマーカーの発現値とその対応する対照値とを別々に比較することを含んでいなくてもよい。具体的な実施態様では、発現値又はその正規化された値を一緒に組み合わせることによってマルチバイオマーカースコア値を得、そして、対応するマルチバイオマーカースコア対照値と比較することができる。
特定の実施態様では、患者における少なくとも以下の３つのバイオマーカー：上皮成長因子（EGF）、単球走化性タンパク質１（MCP1）、及び形質転換成長因子アルファ（TGF-α）、そして、場合によりNGALについての発現値を得る。
本発明に係る方法の統計的予測を改善するために、アルブミン尿、タンパク尿、血漿若しくは血清のクレアチニン濃度、及び／又は慢性腎疾患の進行についての人口統計学的リスク因子を更に含むことができる。
本明細書で使用するとき、前記人口統計学的リスク因子は、年齢、ボディーマスインデックス、平均動脈圧、性別、黒人／アフリカ人民族、糖尿病、心血管疾患の病歴、喫煙者、体質（satus）、アンジオテンシン経路遮断薬の非使用、尿路感染症の病歴、血尿、腎疾患の家族歴を含む。
具体的な実施態様では、本発明は、被験体における慢性腎疾患の急速進行を予測する方法であって、少なくともEGF、MCP1、及びTGF−α、そして、場合によりNGALの発現を評価することを含み、アルブミン尿又はタンパク尿を前記被験体から更に決定する方法に関する。アルブミン尿又はタンパク尿は、当技術分野において周知の方法に従って同じ生物学的サンプルから、又は異なる生物学的サンプル中で決定してよい。
具体的な実施態様では、前記予測方法は、少なくとも上皮成長因子（EGF）、単球走化性タンパク質１（MCP1）、及び形質転換成長因子アルファ（TGF-α）、そして、以下のバイオマーカーのうちの少なくとも１つ以上の発現を評価することを含む：GDF15、FABP1、シスタチンＣ、フィブロネクチン、KIM1、NGAL、TIMP1、ウロモジュリン、オステオポンチン、IL6、MMP9、LIF、及びVEGF-A。
具体的な実施態様では、前記予測方法は、EGF、TGF-α、及びMCP1の特定のバイオマーカーの組み合せの尿サンプル中における発現を評価することを含む。
他の具体的な実施態様では、前記予測方法は、EGF、TGF-α、MCP1、及びNGALの特定のバイオマーカーの組み合せの尿サンプル中における発現を評価することを含む。
他の具体的な実施態様では、前記予測方法は、EGF、TGF-α、MCP1、及びNGALの特定のバイオマーカーの組み合せの尿サンプル中における発現を評価することを含む。
他の具体的な実施態様では、前記予測方法は、EGF、TGF-α、MCP1、及びFABP1の特定のバイオマーカーの組み合せの尿サンプル中における発現を評価することを含む。
他の具体的な実施態様では、前記予測方法は、EGF、TGF-α、MCP1、及びシスタチンＣの特定のバイオマーカーの組み合せの尿サンプル中における発現を評価することを含む。
他の具体的な実施態様では、前記予測方法は、EGF、TGF-α、MCP1、及びフィブロネクチンの特定のバイオマーカーの組み合せの尿サンプル中における発現を評価することを含む。
他の具体的な実施態様では、前記予測方法は、EGF、TGF-α、MCP1、及びKIM1の特定のバイオマーカーの組み合せの尿サンプル中における発現を評価することを含む。
他の具体的な実施態様では、前記予測方法は、EGF、TGF-α、及びTIMP1の特定のバイオマーカーの組み合せの尿サンプル中における発現を評価することを含む。
上記具体的な実施態様と組み合わせられる他の具体的な実施形態では、前記予測方法は、他の予測バイオマーカーと共に（同じ生物学的サンプル由来）又は別々に（異なるサンプル由来）尿サンプル中のアルブミンを評価することも含む。
バイオマーカーの発現のアッセイ及びCKDの処置
本発明は、更に、患者の層別化方法に関する。特に、CKDの急速進行のリスクが高いと同定された患者は、CKDの治療的処置のために本発明の方法に従って選択され得る。したがって、本発明は、更に、以下を含む方法を含む：
（ｉ）上に定義した予測方法に従って患者のCKDの急速進行のリスクが高いかどうかを同定する工程と、
（ii）工程（ｉ）で同定された前記急速進行者患者を、CKDを処置するための好適な治療剤で処置する工程。
本明細書で使用するとき、用語「処置する」又は「処置」とは、標的とする病状若しくは障害を予防若しくは減速（緩和）するか、又は前記障害の症状のうちの１つ以上を減速若しくは軽減することを目的とする手段を指す。具体的な実施態様では、治療剤を投与した後に患者が、mGFR、１年間のmGFRの減少率、eGFR、eGFRの減少率のうちの１つ以上において、ベースラインからの観察可能な及び／若しくは測定可能な減少若しくは変化、並びに／又は経時的な（例えば、３ヶ月間［１２週間］、又は６ヶ月間［２４週間］、又は９ヶ月間［３６週間］、又は１２ヶ月間［１年間、５２週間］にわたる）ベースラインからの測定可能な変化率を示す場合、被験体の慢性腎疾患の「処置が成功した」。
上記方法に従って慢性腎疾患の急速進行者を処置するための治療剤は、（ｉ）アンジオテンシン変換酵素阻害剤（ACEi）、例えば、カプトプリル（Capoten）、ゾフェノプリル、エナラプリル（Vasotec／Renitec）、ラミプリル（Altace／Prilace／Ramace／Ramiwin／Triatec／Tritace）、キナプリル（Accupril）、ペリンドプリル（Coversyl／Aceon／Perindo）、リシノプリル（Listril／Lopril／Novatec／Prinivil／Zestril）、ベナゼプリル（Lotensin）、イミダプリル（Tanatril）、トランドラプリル（Mavik／Odrik／Gopten）、シラザプリル（Inhibace)、及びホスホナート含有剤、例えば、ホシノプリル（Fositen／Monopril)、又は（ii）アンジオテンシン受容体遮断薬（ARB）、例えば、ロサルタン（Cozaar）、カンデサルタン（atacand）、バルサルタン（Diovan）、イルベサルタン（Avapro）、テルミサルタン（Micardis）、エプロサルタン（Teveten）、オルメサルタン（Benicar/Olmetes)、及びアジルサルタン（edarbi)を含んでいてよいが、これらに限定されるわけではない。
慢性腎疾患を処置するための好適な治療剤の前記患者への投与は、処置の過程全体を通して１回に、連続的に、又は断続的に行うことができる。
処置の最も有効な手段及び投与の用量を決定する方法は、当業者に周知であり、そして、治療のために用いられる組成物、治療の目的、及び処置される被験体によって変動する。処置する医師によって選択される投与のレベル及びパターンを用いて、単回又は複数回の投与を実施することができる。好適な投与製剤及び剤の投与方法は、経験的に調整してよい。
患者が緩徐進行者であると予測された場合、別の治療が好ましい場合がある。好適な治療剤を投与する前に、前記患者における急速進行のリスクを更に検証するために、更なる診断方法を適用してよい。
本発明の別の態様は、患者における慢性腎疾患を処置するための、処置の効力をモニタリングするインビトロ法であって、上記表１に定義した予測バイオマーカーのうちの１つ以上の発現を評価することを含む方法に関する。
特に、本発明のモニタリング方法において用いることができる前記予測バイオマーカーは、上皮成長因子（EGF）、単球走化性タンパク質１（MCP1）、及び形質転換成長因子アルファ（TGF-α）、そして、場合によりNGALからなる群から選択される。
このようなモニタリング方法では、評価工程は、被験体がCKDの処置を必要としている被験体であり、そして、予測バイオマーカーがここでは代用マーカーとして、すなわち、病期又はmGFRパラメータの予測判断材料として用いられることを除いて、本発明の予測方法について上に記載した工程と本質的に同様に実施される。評価工程は、例えば、処置前、及び処置中又は処置の最後に実施することができ、そして、各バイオマーカーの発現レベルの進展／変化は、処置に対する良好な応答又は応答不良を示す。
このような方法は、例えば、患者における規制当局に承認されているCKDの処置の効力をモニタリングする、及び／又は用量若しくは処置の長さを調整するために用いることができる。あるいは、このような方法は、臨床試験において候補処置の効力をモニタリングするために用いることができる。
本発明のキット
本発明は、更に、本発明の予測又はモニタリングの方法のためのキットに関する。
特に、本発明の１つの目的は、被験体（例えば、生物学的サンプル、より具体的には、被験体の尿サンプル）において慢性腎疾患の急速進行を予測するためのキットであって、少なくとも以下のバイオマーカー：上皮成長因子（EGF）、単球走化性タンパク質１（MCP1）、及び形質転換成長因子アルファ（TGF-α）のタンパク質発現を定量する手段を含むキットからなる。
本発明の別の目的は、慢性腎疾患を処置するための処置の効力をモニタリングするためのキットであって、少なくとも以下の予測バイオマーカー：上皮成長因子（EGF）、単球走化性タンパク質１（MCP1）、及び形質転換成長因子アルファ（TGF-α）のタンパク質発現を定量する手段を含むキットからなる。
前記キットの特定の実施態様では、前記キットは、以下の予測バイオマーカー：EGF、MCP1、TGF-α、及びNGALのうちの２つ、３つ、又は全てを検出及び／又は定量する手段を含む。
したがって、本発明のモニタリング又は予測キットは、複数の試薬を含んでいてよく、前記試薬は、それぞれ、予測バイオマーカーのうちの１つのタンパク質と特異的に結合することができる。タンパク質バイオマーカーと特異的に結合するのに好適な試薬は、抗体を含むが、これらに限定されるわけではない。
本明細書で使用するとき、用語「抗体」は、より広い意味で用いられ、そして、抗体全体、及び任意の抗原結合断片又は誘導体（すなわち、「抗原結合部分」）を含む。前記抗体は、具体的には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異的抗体、これらの単鎖を網羅し得る。また、抗原結合断片は、Fab、Fab’、(Fab’)2、及びVH断片とVL断片との組み合せを含むこれらの誘導体、又はFV抗体（Fvは、完全な抗原認識及び結合部位を含有する最小抗体断片である）も含む。前記抗原結合断片は、更に、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体を含む。
天然に存在する「抗体」は、ジスルフィド結合によって互いに結合している少なくとも２本の重（Ｈ）鎖及び２本の軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではVHと略す）及び重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、CH1、CH2、及びCH3で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではVLと略す）及び軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、CLで構成される。VH及びVL領域は、更に、フレームワーク領域（FR）と呼ばれるより保存された領域が散在している、相補性決定領域（CDR）と呼ばれる超可変性の領域に細分化し得る。各VH及びVLは、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置される３つのCDR及び４つのFRで構成される：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。
「単離抗体」とは、本明細書で使用するとき、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す。更に、単離抗体は、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含まなくてよい。
用語「モノクローナル抗体」及び「モノクローナル抗体組成物」は、本明細書で使用するとき、単一の分子組成の抗体分子の調整物を指す。モノクローナル抗体組成物は、単一の結合特異性及び特定のエピトープに対する親和性を示す。
用語「組み換えヒト抗体」は、本明細書で使用するとき、組み換え手段によって調製、発現、作製、又は単離された全てのヒト抗体、例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子について遺伝子組み換え若しくは染色体組み換えされた動物（例えば、マウス）から単離された抗体、又はそれから調製されたハイブリドーマ、ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから単離された抗体、組み換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離された抗体、及びヒト免疫グロブリン遺伝子の全て又は一部のスプライシングを伴う任意の他の手段によって調製、発現、作製、又は単離された抗体、他のDNA配列に対する配列を含む。このような組み換えヒト抗体は、フレームワーク及びCDRの領域がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかし、特定の実施態様では、このような組み換えヒト抗体をインビトロで変異誘発に供してよく（又はヒトIg配列についてのトランスジェニック動物を用いる場合、インビトロ体細胞変異誘発）、このようにして、組み換え抗体のVH及びVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列VH及びVL配列に由来し、そして、関連するが、インビトロでヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然には存在し得ない配列である。
本明細書で使用するとき、「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によって提供される抗体のクラス（例えば、IgM、IgE、IgG、例えば、IgG1又はIgG4）を指す。
語句「抗原を認識する抗体」及び「抗原に特異的な抗体」及び「抗原と特異的に反応する抗体」は、本明細書では、用語「抗原に特異的に結合する抗体」と互換的に用いられる。
本明細書で使用するとき、「タンパク質バイオマーカーに特異的に結合する」抗体又はタンパク質は、１００nM以下、１０nM以下、１nM以下、１００pM以下、又は１０pM以下のKDで前記タンパク質バイオマーカーに結合する抗体又はタンパク質を指すことを意図する。
用語「Kassoc」又は「Ka」は、本明細書で使用するとき、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度を指すことを意図し、一方、用語「Kdis」又は「Kd」は、本明細書で使用するとき、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を指すことを意図する。
用語「KD」は、本明細書で使用するとき、KdのKaに対する比（すなわち、Kd／Ka）から得られ、そして、モル濃度（Ｍ）として表される解離定数を指すことを意図する。抗体のKD値は、当技術分野において十分に確立されている方法を用いて求めることができる。抗体のKDを求める方法は、表面プラズモン共鳴を用いるか、又はBiacore（登録商標）システム等のバイオセンサシステムを用いることによる。
本発明の予測又はモニタリングキットは、更に、イムノアッセイにおいて捕捉抗体を検出又は定量するための抗体を含んでいてよい。
例えば、本発明の予測又はモニタリングキットは、イムノアッセイにおいてバイオマーカータンパク質／抗体複合体を検出又は定量するための第２の抗体を含んでいてよい。したがって、モニタリング又は予測キットは、
（ｉ）特に上皮成長因子（EGF）、単球走化性タンパク質１（MCP1）、及び形質転換成長因子アルファ（TGF-α）からなる群から選択される１つ以上の予測バイオマーカーにそれぞれ結合する非標識抗体のセット、並びに／又は
（ii）特に上皮成長因子（EGF）、単球走化性タンパク質１（MCP1）、及び形質転換成長因子アルファ（TGF-α）からなる群から選択される１つ以上の予測バイオマーカーにそれぞれ結合する標識抗体のセット
を含む。
あるいは、前記キットは、
（ｉ）特に上皮成長因子（EGF）、単球走化性タンパク質１（MCP1）、及び形質転換成長因子アルファ（TGF-α）からなる群から選択される１つ以上の予測バイオマーカーにそれぞれ結合する非標識抗体の第１のセット、
（ii）前記標識抗体の第１のセットに結合してバイオマーカー／第１の抗体／第２の抗体複合体を形成する標識抗体の第２のセット
を含んでいてよい。
本発明のキットにおいて用いるとき、標識抗体は、典型的には、レポーター分子にコンジュゲートしている抗体を含んでいてよい。上に定義したキットの具体的な実施態様では、標識抗体は、酵素、例えば、ELISAアッセイ用の酵素、特にセイヨウワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、-ガラクトシダーゼ、及びアルカリホスファターゼ等にコンジュゲートしている抗体である。前記キットは、更に、このような酵素に対応する基質を含んでいてよい。
あるいは、標識抗体は、蛍光化合物、例えば、フルオレセイン又はローダミンにコンジュゲートしている抗体である。
上に定義したキットは、更に、NGALに結合する抗体（非標識及び／又は標識）を含んでいてよい。
場合により、本発明の前記モニタリング又は予測キットは、更に、１以上の参照（対照）マーカー、例えば、遍在的に発現するタンパク質に対応するマーカー、又はCKDの他のバイオマーカー、例えば、クレアチニン若しくはアルブミンを検出及び／又は定量する手段を含んでいてよい。
具体的な実施態様では、イムノアッセイで使用するための本発明のキットは、少なくとも以下を含む：
（ｉ）上皮成長因子（EGF）に特異的な抗体；
（ii）単球走化性タンパク質１（MCP1）に特異的な抗体；及び
（iii）形質転換成長因子アルファ（TGF-α）に特異的な抗体。
本発明のキットにおいて用いるための前記抗体は、支持体、例えば、ガラス又はポリマー、より具体的には、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、又はポリプロピレンの中から選択されるポリマーに固定化され得る。固体支持体は、チューブ、ビーズ、ディスクの形態のマイクロプレート、又はイムノアッセイを実施するのに好適な任意の他の表面であってよい。
本発明の予測キット及びモニタリングキットは、場合により、本発明の方法を実施するのに有用な追加の成分を含んでいてよい。例として、前記キットは、抗体をそれが特異的に結合するタンパク質と結合させるのに好適な流体（例えば、バッファ）、１つ以上のサンプルコンパートメント、非特異的結合を除去するための反応物質の洗浄、並びに本発明の予測又はモニタリング方法の性能について説明する指示書等を含んでいてよい。
本発明の別の態様は、本発明の予測又はモニタリング方法の実行に適応した装置であって、
ａ）バイオマーカーに特異的に結合する検出手段（例えば、前記キットにおいて上記した通りの抗体）の組み合せを含む分析ユニットであって、インビトロで被験体由来のサンプルを前記検出剤と接触させるのに適応した分析ユニットと；
ｂ）データベース及び前記データベースにおけるコンピュータで実行されるアルゴリズムを有する計算装置を含む評価ユニットであって、前記コンピュータで実行されるアルゴリズムが、前記計算装置によって実行されたとき、被験体由来のサンプル、例えば、尿サンプル中の予測バイオマーカーのうちの１つ以上の量を求め、そして、求められた前記１つ以上の予測バイオマーカーの量を対応する対照値と比較し、そして、前記１つ以上の予測バイオマーカーの量が対照値と有意に異なる、例えば、有意に多いか又は少ない場合、急速進行の予測を提供する評価ユニットとを含む装置を提供する。
１つの具体的な実施態様では、データベースは、更に、予測バイオマーカーのそれぞれについての対照値を含む。
実施例
方法
NephroTestコホートプロトコル
患者は、２０００年に開始してから今日までに血漿及び／又は尿のサンプルのmGFRを有する１８２５人の患者を含むNephroTestコホートから募集した。NephroTestコホートは、パリの３つの大規模腎臓病センター：Hopital Europeen Georges Pompidou、Hopital Bichat、及びHopital Tenonの患者からなる。コホートへの組み入れ基準は、任意の病期のCKDを有する同意した成人患者であった。除外基準は、任意の形態の腎置換療法を既に受けたことがある患者及び妊娠中の患者であった。プロトコルにおける蓄尿バイオバンクは、２００９年に始まった。本発明者らは、疾患の進行を評価するために、蓄尿が保存されており、そして、経時的に２つ以上の同時mGFRが存在する２２９人の患者から得られたデータを分析した。コホートにおけるこれら患者の中央フォローアップ時間は、最初の蓄尿の時点から２１．６（IQR、１３．６〜２４．７）ヶ月間であり、そして、これら患者のうちの５７人は、最初の蓄尿の時点から最高３つの逐次mGFRを有していた。これら２２９人の患者から得られた最初の蓄尿を分析した。患者から集めた臨床及び生物学的データは、既に記載されている通りである３１。
NephroTestコホート研究は、French Institute of Health and Medical Research（INSERM）によって承認され、そして、後援されている。全ての患者が、研究利用のための凍結生物学的サンプル並びに予め指定された臨床及び生物学的データの長期にわたる取り扱いについて、文書によるインフォームドコンセントを提出した。前記研究は、優良臨床試験基準ガイドラインに従って実施した。
技術的方法（尿中バイオマーカーの測定）
尿を回収し、そして、４℃で最長４時間後、−８０℃で保存した。アンチプロテアーゼ（cOmplete；Protease Inhibitor Cocktail Tablets, Roche applied Science）を含むチューブ内にて１０００ｇで１０分間最初に遠心分離した後、尿上清を保存した。
用いたバイオマーカーELISAキットは、シスタチンＣ、上皮成長因子（EGF）、成長及び分化因子１５（GDF15）、インターロイキン６（IL6）、単球走化性タンパク質１（MCP1）、マトリクスメタロプロテアーゼ９（MMP9）、オステオポンチン、腎傷害分子１（KIM1）、組織メタロプロテアーゼ阻害因子１（TIMP1）、形質転換成長因子アルファ（TGF-α）、並びに血管内皮成長因子Ａ（VEGFA）についてはR&D systems；フィブロネクチン及び白血病抑制因子（LIF）についてはeBioscience；好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（NGAL）についてはBioporto；脂肪酸結合タンパク質１（FABP1）についてはCMIc、並びにウロモジュリンについてはMdBiproductであった。全てのELISAキットは、利用前に厳格な基準に従って正式に検証した［未公開データ］。
尿クレアチニンは、同位体希釈質量分析（IDMS）用に標準化された酵素法を用いてHopital Necker Enfants-Maladesの生化学検査室において測定した。尿タンパク質及びアルブミンは、病院の検査室で標準的な方法で測定した。
CKDの進行の測定及び定義
他の箇所で報告した通り、NephroTestコホートの全ての患者が、クロム−５１で標識されたエチレンジアミン四酢酸（EDTA）のクリアランスによって測定されたGFRを有していた３１。個々の勾配（mL/分/年）は、通常の線形回帰を用いて推定した。次いで、本発明者らは、１年間当たりの相対mGFR勾配（％）を計算し、そして、患者を１年間あたりベースラインmGFRの減少率で≦１０％対＞１０％の２つの群に分類した。腎疾患推算式の変形３２を用いて推定GFR（eGFR）も計算し、次いで、eGFRを対応するmGFR値と直接比較できるようにするために、得られた値を体表面積（BSA）で調整しなかった。
統計解析
臨床及び検査データは、適宜、百分率、平均（±標準偏差、SD）、又は中央値（四分位範囲、IQR）で表す。バイオマーカー、アルブミン尿、及びタンパク尿のクレアチニンに対する比は、傾斜分布を有しているので、続いて、対数的に変換した。NGAL及びシスタチンＣは、正規分布に近づけるために２回の逐次対数変換を必要とした。次いで、Log変換された値を、男女別の平均及びSDを用いて平均０及びSD１に標準化した。すなわち、性別に関連する差を説明するために（測定値−平均）をSDで除した。
本発明者らは、緩徐進行者と急速進行者との間で、ベースライン臨床及び検査データ並びにCKDリスク因子を比較した（１年間当たりmGFRが１０％減少をカットオフとして用いて）。連続変数はウイルコクソン検定を用いて比較し、そして、カテゴリ変数はカイ二乗又はフィッシャーの直接確率検定を用いて比較した。バイオマーカー及びmGFRの勾配に関する性差も同様に試験した。最初の来院時におけるバイオマーカーと同時mGFRの間、及びバイオマーカーとmGFRの変化率（％）との間の関係を、ピアソン相関を用いて最初に評価した。次いで、ロジスティック回帰を用いて、バイオマーカーのそれぞれについて急速進行の生のオッズ比（OR）及び調整されたORを推定した。ORを経時的平均mGFR及びベースライン共変数：年齢、性別、黒人アフリカ人起源、BMI、平均血圧、真性糖尿病、心血管疾患の病歴、喫煙、レニン・アンジオテンシン・アルドステロン系（RAAS）遮断、例えば、アンジオテンシン変換酵素阻害剤（ACEI）又はアンジオテンシン受容体遮断薬（ARB）処置について逐次調整し、そして、最後にアルブミン尿について調整した。「平均値への回帰」３の現象を低減するために、分析における共変数としてベースラインmGFRの代わりに平均mGFRを用いた。
CKDの進行を予測するためのバイオマーカーの最良の組み合せを決定するために、主に病態生理学的仮説から先験的に、バイオマーカーとアルブミン尿とを組み合わせたロジスティック回帰の幾つかのモデルを構築した。このモデルではCKDの進行と個別に関連するバイオマーカーが好ましかったが、本発明者らは、互いに又はアルブミン尿と０．５５超で相関する（ピアソン相関）バイオマーカーを一緒に追加することを避けた。これらモデルを、更に、平均GFR及び他の統計的に関連する因子、例えば、募集センター及び糖尿病について調整して、共変数の数を制限した。このようにして構築した６つのモデルを、アルブミン尿及び同じ調整共変数のみを用いるが、バイオマーカーを用いない枝分かれ最小モデルと比較した。本発明者らは、受信者動作特性（ROC）曲線下面積（AUC）、尤度比検定（LRT）、スケールブライアスコア（SBS）、及び統合識別指数（IDI）を計算して、CKDの進行についてのこれら予測モデルの性能を評価した。これらモデルと最小参照モデルとのAUCを比較することによって、予測値の改善を推定した。
動物データについてSAS 9.2（SAS Institute Inc., Cary, NC USA）、R 2.3（R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria, 2014）、及びprism graphpad 5.0を用いて統計解析を実施した。
結果
患者の特徴付け及びCKDの進行
本発明者らは、繰り返しmGFR及び同時蓄尿を有する２２９人の患者において分析を行った。男性が１５２人（６６．４％）であり、そして、ベースライン（すなわち、最初の蓄尿を実施した時点）における平均年齢は、６０．８±１３．３歳であった。中央ベースラインmGFRは、３８．３（IQR、２６．４〜４９．６）mL/分であった。２１．６（IQR、１３．６〜２４．７）ヶ月間の中央フォローアップ期間後の最後の来院時における中央mGFRは、３４．７（IQR、２４．７〜４７．５）mL/分であった。mGFRの変化は、ベースラインから１年間当たり−４．０（IQR、−１２、２．７）％と等価な−１．４６（IQR、−４．２８、１．０８）mL/分/年であった（負の値は、減少を表す）。６８人（３０％）の患者が、「急速進行者」（１年間当たりmGFRが１０％超減少）と定義された。緩徐及び急速進行者におけるベースライン特性を表２に示す。アルブミン尿は、急速進行者において有意に高く、そして、糖尿病は、より頻度が高かった。患者の大部分（８９％）はACEI又はARB処置を受けていたが、急速進行者ではより高い比率が処置を受けていた（９６％対８６％、ｐ＜０．０４）。フォローアップ中の中央mGFRは、予測通り、緩徐進行者で急速進行者よりも低く（中央IQR：２９．３（２０．０、３７．５）対４０．９（３０．１、５２．３）mL/分、ｐ＜０．０００１）、そして、ベースラインmGFRは、急速進行者でわずかに低かった（ｐ＝０．０６）。重要なことに、進行速度を推測するために用いたmGFR測定の数は、２つの群間で有意には異なっていなかった（２回超来院、４７％対３８％、ｐ＝０．２）。
データは、平均±標準偏差（SD）、中央値（四分位範囲（IQR））、又は百分率％（患者の数（ｎ））として表す。
バイオマーカーの特性及び性別分布
患者の５％未満だけが検出下限（LLD）を下回る値を有していたバイオマーカーTIMP1、VEGFA、KIM1、及びオステオポンチンでは、各患者についてLLDの値の半分を補定した（各症例において５個以下の値を補定した）。患者の５〜１０％が影響を受けたバイオマーカー（タンパク尿、アルブミン尿、及びFABP1）では、０〜１のランダムな値にLLD値を乗じた値を補定した。最後に、患者の２０％超がLLDを下回る値を有していたバイオマーカーMMP9、IL6、及びLIFは、記載したが、後続の分析には含めなかった。
コホートにおけるバイオマーカー分布を表３に詳細に示す。バイオマーカーのうちの５つ（MMP9及びLIFは含まない）の分布は性別によって変動した。本発明者らは、ベースラインにおいて、女性の方がNGAL、TGF-α、及びウロモジュリンのレベルが有意に高いことを見出した。逆に、TIMP1及びVEGFAのレベルは男性でより高いことも観察された。体表面積（BSA）について正規化したベースラインmGFRでは、男性と女性の間に差はなかった（３６．８対３４．６mL/分/１．７３ｍ２、ｐ＝０．３）。「急速進行者」の男性の比率は、「緩徐進行者」の男性と有意には異なっていなかった（６８％対６６％、ｐ＝０．８、表１）。
個々のバイオマーカーのCKD進行との関連
本発明者らはベースラインmGFRと進行の変化率との間に相関はみられなかったことを観察した（ｒ＝−０．０６、ｐ＝０．４）。次いで、本発明者らは、尿中タンパク質レベルと「急速進行者」であるリスクとの間の関連性について研究した。本発明者らは、最初に各バイオマーカーを個々に研究し、次いで、多変量ロジスティック回帰分析において、アルブミン尿を含むCKDの進行についての公知の重要なリスク因子に対して各バイオマーカーを逐次調整した（表４）。「急速進行者」ステータスであるリスクは、予測通り、アルブミン尿及び／又はタンパク尿によって増加した。それはまた、シスタチンＣ、FABP1、フィブロネクチン、GDF15、KIM1、MCP1、NGAL、TIMP1、TGF-α、及びVEGFAのレベルの上昇によっても増加した。しかし、前記リスクは、EGFの増加によって減少した。CKDの進行についての従来のリスク因子を回帰モデルに追加した場合、リスクは弱まり、そして、アルブミン尿について調整することによって更に弱まった（表４）。しかし、フィブロネクチン、MCP1、TIMP1、及びTGF-αは、これら因子全ての役割を考慮した後も依然としてリスクと有意に関連していた。興味深いことに、進行に対するエフェクトサイズは、アルブミン尿（OR１．７２）よりもTGF-α（OR２．３４）の方が高かった。
CKDの進行を予測するための尿中バイオマーカーの組み合せ。
４〜６個のバイオマーカーを組み合わせた６つの異なるモデルを、アルブミン尿を用いた参照モデルに対して比較した（表５）。
モデルは、様々な病態生理学的プロセスを反映するバイオマーカーを有し、そして、各モデル内のバイオマーカー間相関が＜０．５５であることに基づいていた。これらモデルは、平均mGFR及び有意に関連する因子、すなわち、糖尿病及び（NephroTest）募集センターについてのみ調整した。バイオマーカーを用いた全てのモデルが、バイオマーカーを用いない参照モデルよりも優れた性能を有していた（表５、尤度比検定）が、EGF、GDF15、MCP1、NGAL、及びTGF-αを含有するモデル（モデル５）が、使用した全ての性能基準によれば最良のモデルであった。特に、モデル５におけるバイオマーカーは、参照モデル（アルブミンを用い、そして、他のバイオマーカーを用いない）と比べて、受信者動作特性（ROC）曲線の曲線下面積（AUC）が０．７７から０．８５に有意に増加した（ｐ＝０．００６）。これら結果を裏付けるために、本発明者らは、バイオマーカーの機能的役割又はバイオマーカー間相関に関する先験的仮説を用いずに段階的重回帰分析も実施したところ、興味深いことに、正確に同じ組合せのバイオマーカーを得た。
GDF15はモデルにおいて進行との関連がみられなかった（OR０．９９（０．６３〜１．５４））ので、本発明者らは、試験を行い、そして、モデルから除去したときに、この新規モデルの性能基準が影響を受けなかったことを観察した（データは示さない）。驚くべきことに、本発明者らは、本発明者らによるモデルにおいてEGFと同様にNGALが保護効果を与えると考えられることも見出した（表５）。これは、「急速進行者」であるリスクの増加と関連していた疾患の進行に対する個々の効果とは対照的であるように思われた。連続的ではなく三分位数においてNGALを分析することによって、他のバイオマーカーについて調整した後の、NGALの進行との複雑な関係（Ｊ字形パターン）が明らかになった（図３）。これら理由から、モデル５は、GDF15及びNGALを除去することによって単純化することができ、そして、本発明者らは、アルブミン及び他のリスク因子を用いるモデルよりも更に優れた０．８４というｃ統計値を有する、アルブミン尿に加えてEGF、MCP1、及びTGF-αを用いて急速進行を予測する最終モデルを提供する（図１を参照）。
mGFRとeGFRとの比較
本発明者らによる最終モデルにおいてCKDの進行を定義するためにmGFRの代わりにeGFRを用いたところ、異なる結果が得られた。TGF-α及びアルブミンのみが、単純化モデル５において依然として進行と有意に関連していた（OR（９５％CI）は、それぞれ、１．５１（１．０７〜２．１２）及び１．５５（１．０５〜２．２７）である）が、EGFもMCP1も有意には関連していなかった（それぞれ、０．７２（０．４５〜１．１５）及び１．２１（０．８６〜１．６９））。予測通り、eGFRとmGFRとの間の相関は高く（ｒ＝０．８７）、そして、GFRは、金標準と比較した式によって過大評価されていた（中央バイアスIQR２．６０（１．４６、３．７６））。急速進行者（GFRが＞１０％／年低下）の比率は、mGFRを用いてもeGFRを用いても同じ（２９．６９％）ままであった。しかし、本発明者らは、mGFRによって定義されたコホートにおける６８人の「急速進行者」のうちeGFRを用いることによって「急速進行者」であると正確に分類されていたのはわずか３８人（５６％）であり、このことから、eGFRは「急速進行者」の同定についての感度がかなり低いことが分かった（図２）。
考察
本発明者らは、評価項目が異なっていたので、このモデルを用いて本発明者らによるコホートにおける予測可能性の改善を見出せていなかった。しかし、この新規バイオマーカーサインを追加することにより予測を改良することができるかどうかを調べることは、興味深いことであった。
RAAS遮断がCKDの進行を減速させることは認識されている。急速進行者の多くがACEI及びARB薬で処置されていたという本明細書における知見は、「急速進行者」群におけるRAAS遮断の逆効果４２よりもこの群におけるより高いレベルのアルブミン尿に対する臨床医の対応を反映している可能性が最も高い。
これは、疾患の進行の検出におけるeGFRの感度がはるかに低いことを証明した本発明者らが本明細書で示す２つの技術を比較した本発明の結果から特に明らかである。これらの発見観察研究の状況では、厳密mGFRを用いて十分に特徴付けられた患者コホートが非常に有用であった。本明細書において非常に正確なmGFRを有することによって、本発明者らは、その真の進行者ステータスで患者を正確に分類することができるようになり、そして、その結果、比較的小さなコホートにおいてこの精度とバイオマーカーの変動とを相関させることができ、そして、更に、より多くの患者を必要とする精度の低いeGFRでは不可能であった妥当な重要な知見を引き出すことができた。
CKDの進行は多くの経路が関与する複雑な病態生理学的プロセスであるので、正確な予測を行うために（唯一のバイオマーカーとは対照的に）幾つかのバイオマーカーの組み合せが必要とされ得る。このコホートは比較的小さなコホートであり、そして、患者の大部分がフォローアップ期間にわたって２つのmGFRしか有していなかったが、それは幾つかの利点を有する。mGFRの使用については既に論じたが、更に、これは、民族的に多様なコホートでもあり、そして、登録においてCKDの主な原因となる様々な病態の優れた代表者を含んでいた。本発明者らは、冗長度のために本発明者らによる最終モデル中のバイオマーカーの数を絞り込むことができた。
結論として、本発明者らは、CKDの進行の新規分子サインとして、アルブミン及び人口統計学的リスク因子と共にTGF-α、EGF、及びMCP1を疾患プロセスの初期に使用できる可能性を提唱する。


Claims (15)

  1. 被験体における慢性腎疾患の急速進行を予測するためのインビトロ法であって、前記被験体から得られた生物学的サンプル中の１つ以上のバイオマーカーの発現を評価する工程を含み、前記１つ以上のバイオマーカーが、形質転換成長因子アルファ（TGF-α）、上皮成長因子（EGF）、及び単球走化性タンパク質１（MCP1）からなる群から選択される、方法。
  2. 少なくともEGF、MCP1、及びTGF-α、そして、場合により、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（NGAL）の発現を評価することを含む、請求項１記載の方法。
  3. 前記評価工程が、（ａ）前記被験体から得られた生物学的サンプル中の選択されたバイオマーカーのうちの１つ以上の発現を定量して、各定量されたバイオマーカーについての発現値を得る工程と、（ｂ）工程（ａ）において得られた前記発現値を対応する対照値と比較する工程であって、対照値を上回るTGFαの発現値、及び／又は対照値を下回るEGFの発現値、及び／又は対照値を上回るMCP1の発現値、及び／又は対照値を上回るNGALの発現値が、被験体の急速進行のリスクが高いことを示す工程とを含む、請求項１又は２記載の方法。
  4. 成長及び分化因子１５（GDF15）、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（NGAL）、シスタチンＣ、脂肪酸結合タンパク質（FABP）、フィブロネクチン、腎傷害分子１（KIM1）、オステオポンチン、組織メタロプロテアーゼ阻害因子１（TIMP1）、ウロモジュリン、インターロイキン−６（IL6）、白血病抑制因子（LIF）、マトリクスメタロペプチダーゼ９（MMP9)、並びに血管内皮成長因子Ａ（VEGFA）からなる群から選択される１つ以上のバイオマーカーの発現を更に評価する、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
  5. 前記生物学的サンプルが、尿又は血清のサンプルである、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
  6. 前記発現が、例えばイムノアッセイにおいて定量される、タンパク質発現である、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
  7. 急速進行が予測される被験体が、１年間当たりベースライン測定糸球体濾過率（mGFR）が１０％超減少するリスクを有する被験体である、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
  8. 前記急速進行が予測される被験体を、慢性腎疾患を処置するための治療剤で処置するために選択するためのデータを提供する工程をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項記載の方法。
  9. 被験体における慢性腎疾患を処置するための治療剤の効力をモニタリングするインビトロ法であって、前記被験体の生物学的サンプル中のバイオマーカーの発現を評価することを含み、前記バイオマーカーが、TGF-α、EGF、及びMCP1であり、そして、場合によりNGALの発現を評価することを含む方法。
  10. 慢性腎疾患を処置する前に前記バイオマーカーの発現を評価することを行い、前記処置中又は前記処置後に前記バイオマーカーの発現を評価することを繰り返すことを含み、前記バイオマーカーの発現の変化が、前記処置に対する応答を示す、請求項９記載の方法。
  11. 少なくとも以下のバイオマーカー：TGF-α、EGF、及びMCP1のタンパク質発現を定量する手段と、そして、場合によりNGALのタンパク質発現を定量する手段とを含む、請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法を実施するためのキット。
  12. 前記タンパク質発現を定量する手段が、各バイオマーカーに特異的な非標識抗体と、そして、場合によりイムノアッセイで前記バイオマーカー／非標識抗体を検出するための第２の標識抗体とを含む、請求項１１記載のキット。
  13. イムノアッセイにおいて使用するための請求項１２記載のキットであって、
    ・ TGF-αに特異的な抗体、
    ・ EGFに特異的な抗体；及び
    ・ MCP1に特異的な抗体；
    ・ 場合により、NGALに特異的な抗体
    を含むキット。
  14. 前記抗体が、支持体上に固定化されている、請求項１３記載のキット。
  15. 前記抗体が、レポーター分子にコンジュゲートしている、請求項１２、１３、又は１４記載のキット。
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