KR20150023115A - 프리온 질환에 대한 신규 바이오마커 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 프리온 질환에 대한 신규 바이오마커 및 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 마커를 이용하면 신속/정확하게 프리온 질환의 진단 및 예후 분석을 할 수 있다.

Description

프리온 질환에 대한 신규 바이오마커 및 그의 용도{Novel Biomarker Indicative of Prion Diseases and Their Use}

본 발명은 프리온 질환에 대한 신규 바이오마커 및 그의 용도에 관한 것이다.

프리온은 핵산이 결여된 감염성 입자이다. 프리온 질환으로는 광우병(Bovine Spongiform Encephalopathy, BSE), 양의 스크래피(scrapie), 사슴과 동물(사슴, 엘크 및 무스)에서의 만성소모성질환(chronic wasting disease, CWD) 및 인간의 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease, CJD) 등이 알려져 있다. 프리온은 PrP^Sc라 불리는 프리온 단백질의 변형된 아형(isoform) 만으로 구성된 것으로 나타난다. 정상적인 세포의 PrP(PrP^C라 불림)는 전사-후 공정(post-transcriptional process)을 통해 감염성 PrP^Sc로 전환된다. 이러한 공정 중에 PrP^C의 구조가 변경되고 이는 PrP의 생리화학적 특성의 변화를 수반한다. 프리온은 형태적으로 변형된 단백질(PrP^Sc)의 능력을 통해 본래의 세포 단백질(PrP^C)을 병원성 형태로 리폴딩(refolding)을 유도하여 질병을 유발하는 것으로 알려져 있다. 상기 단백질 변형 반응이 확산되어 궁극적으로 감염된 개체의 뇌에 형성되는 특징적인 스펀지형 플라그(plaque)를 형성하는 결과를 가져온다.

펜트락신(Pentraxins)은 패턴 인식 분자(pattern recognition molecules)의 하나의 단백질 패밀리로서 선천성 면역과 관련된다. 상기 단백질은 보체 활성화(complement activation)와 연관되나, 다양한 리간드와의 상호작용을 통해 염증, 자가면역 및 조직 리모델링의 조절 작용에서 역할을 한다(Doni A, et al. Journal of leukocyte biology. 79(4):797-802(2006); Deban L, et al. BioFactors (Oxford, England). 35(2):138-45(2009); Cieslik P, et al. Autoimmunity. 45(2):119-28(2012)). 펜트락신은 그 길이에 따라 짧은 펜트락신과 긴 펜트락신으로 구분되는데, C-reactive protein(CRP)과 serum amyloid P(SAP)는 짧은 펜트락신에 속하며, 펜트락신 3(pentraxin 3, PTX3)은 가장 대표적인 긴 펜트락신이다(Deban L, et al. Cell and tissue research. 343(1):237-49(2011)).

PTX3의 증가는 패혈증, 결핵 및 댕기열과 같은 질환에 감염되었을 때, 환자의 혈액에서 증가하는 것으로 보고된바 있으며, 류마티스 관절염, 전신성강피증(systemic scleroderma), 건선과 같은 자가면역질환의 환자에서도 증가함이 보고된 바 있다. 따라서, PTX3의 혈액 내 수준 변화는 염증반응과 연관된 경로(pathway)가 활성화되는 것을 암시한다(Presta M, et al. Journal of cellular and molecular medicine. 11(4):723-38(2007); Bevelacqua V, et al. International journal of molecular medicine. 18(3):415-23(2006); Kravitz MS, et al. Rheumatology. 2(9):481-90(2006)).

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 프리온 질환을 신속하고 정확하게 분자진단 할 수 있는 신규한 바이오마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 바이오마커로서 펜트락신 3(pentraxin 3, PTX3)을 검출하는 것으로 프리온 질환의 조기 진단이 가능함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 프리온 질환의 진단용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 프리온 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 프리온 질환 마커를 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 PTX3 (pentraxin 3)에 대한 항체 또는 앱타머를 포함하는 프리온 질환(prion disease) 진단용 키트를 제공한다.

본 발명자들은 프리온 질환을 신속하고 정확하게 분자진단 할 수 있는 신규한 바이오마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 바이오마커로서 펜트락신 3(pentraxin 3, PTX3)을 검출하는 것으로 프리온 질환의 조기 진단이 가능함을 확인하였다.

본 명세서에서 표현 "프리온 질환 진단용 키트"는 프리온 질환 진단용 조성물이 포함된 키트를 의미한다. 따라서, 상기 표현 "프리온 질환 진단용 키트"는 "프리온 질환 진단용 조성물"과 서로 교차 또는 혼용하여 사용이 가능하다.

본 명세서에서 용어, "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 프리온 질환의 치료에 대한 신경 기능의 회복 가능성 예측)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)를 포함한다.

본 명세서에서 용어, "프리온 질환"은 프리온 단백질(cellular prion protein, PrP^C)이 어떠한 이유에 의해 프리온 단백질 구조의 알파-나선(alpha-helix) 구조가 베타-시트(beta-pleated sheet) 구조로 변성되면서 전염성을 지닌 프리온 단백질(scrapie prion protein, PrP^Sc)로 전환되어 야기되는 퇴행성 신경질환을 의미한다. 전염성을 지닌 단백질은 혈액을 통해 전염 가능하며 PrP^Sc가 PrP^C를 PrP^Sc로 전환되면서 전파된다. 이런 단백질들은 뇌에서 축적되어 프리온 질환인 전염성 해면상뇌병증(transmissible spongiform encephalopathy, TSE)을 야기한다. TSE는 다양한 척추동물에서 일어나는데, 대표적으로 인간에서의 크로이펠츠-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease, CJD), 변형 크로이펠츠-야콥병(Variant Creutzfeldt-Jakob disease, vCJD) 및 쿠루(kuru); 소에서의 소 해면상뇌병증(bovine spongiform encephalopathy, BSE); 양에서의 스크래피(scrapie)가 있다.

본 발명자들은 본 발명의 마커를 사용하면, 개체로부터 채취한 시료로부터 프리온 질환의 발병 여부를 신속하고 정확하게 진단할 수 있음을 확인하였다. 프리온 질환의 특징으로는 뇌 침범, 수년간의 잠복기, 해면양(spongeform) 변화 및 전염성을 가지면서도 염증반응과 면역반응이 일어나지 않는 점을 들 수 있다. 이와 같이 프리온 질환은 염증반응과 면역반응이 일어나지 않는다고 알려져 있었으나, 본 발명자들은 프리온에 감염되었을 시 오히려 염증반응과 면역반응과 관련된 것으로 알려진 PTX3의 발현이 증가하는 것을 확인하였다.

본 명세서에서 용어, "진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)"란 프리온 질환을 진단할 수 있는 물질로, 정상개체에 비하여 프리온에 감염된 개체에서 증가 양상을 보이는 단백질과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 상기 프리온 질환 진단 마커는 PTX3이다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 프리온 질환은 크로이펠츠-야콥병(CJD), 변형 크로이펠츠-야콥병(vCJD), 쿠루(kuru), 소 해면뇌병증(BSE), 만성소모성질환(CWD) 및 스크래피로 구성된 군으로부터 선택되는 감염성 프리온 단백질(PrP^Sc)에 의하여 야기되는 퇴행성 신경질환을 포함한다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명은 면역분석 방식, 즉 항원-항체 반응 방식으로 실시될 수 있다. 이 경우, PTX3의 발현수준의 측정(확인)은 PTX3에 대한 항체 또는 앱타머를 이용하여 실시된다.

본 발명에서 용어, "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커 또는 상기 마커 의 구성 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 또한, 본 발명에서는 PTX3에 특이적으로 결합하는 두 종 이상의 항체를 조합하여 사용할 수도 있다.

상기한 바와 같이 새로운 프리온 질환의 마커가 규명되었으므로, PTX3 단백질(이들을 "마커 단백질 항원"이라 함)을 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.

상기 다클론 항체는 상기한 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.

상기 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein, European Jounral of Immunology 6:511-519, 1976 참조) 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al. Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al. J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다.

상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전지영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

본 발명의 방법을 항체 또는 앱타머를 이용하여 실시하는 경우, 본 발명은 통상적인 면역분석 방법에 따라 실시하여 프리온 질환을 진단하는데 이용될 수 있다.

이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 방법에 따라 실시하여 프리온 질환을 진단하는데 이용될 수 있다. 상기 면역분석 포맷은 웨스턴 블랏, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 캡처-엘라이자, 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 상기 예에 의해 본 발명의 분석방법이 제한되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzymelinked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³² 및 S³⁵)로 레이블링된 항체가 본 발명의 마커 분자를 검출하는 데 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 분석하고자 하는 미지의 시료(예컨대, 뇌 균질액, 혈액, 혈장 또는 혈청)를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 일차항체로서의 마커에 대한 항체와 상기 세포 분해물을 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다.

상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-ASB1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.

상기 ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널이 검출은 본 발명의 마커의 정성적 또는 정량적 분석을 가능하게 한다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.

본 발명의 다른 변형예에 따르면, 항체 대신에 PTX3에 특이적으로 결합하는 앱타머를 이용할 수 있다. 앱타머는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 Bock LC et al. Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R . "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24):142727(1998)에 상세하게 개시되어 있다.

상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석함으로써 프리온 질환을 진단할 수 있다. 즉, 시료에서 본 발명의 마커에 대한 시그널이 정상 시료 보다 강하게 나오는 경우에는 프리온 질환으로 진단가능하다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 키트는 면역분석(immunoassay)용 키트이다. 하나의 특정예에서 상기 면역분석용 키트는 루미넥스 분석 키트, 단백질 마이크로어레이 키트 또는 ELISA 키트이다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 추가적으로 포함할 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질 항원에 대한 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 항체는 마커 단백질 항원에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨쥬게이트 됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 일구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 PTX3를 포함하는 복합 마커를 동시에 분석하기 위하여 단백질 마이크로어레이를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 추가적으로 포함할 수 있다. 마이크로어레이 키트는 고체상에 결합된 마커 단백질 항원에 대한 항체를 포함할 수 있다. 그 외 단백질 마이크로어레이 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단, 효소(예: 항체와 융합됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 단백질 마이크로어레이를 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화 시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 양을 확인하여 프리온 질환의 진단에 필요한 정보를 제공할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일구현예에 따르면, 본 발명의 루미넥스(Luminex) 어세이를 수행할 수 있는 루미넥스 키트는 마커 단백질 항원에 대한 항체를 포함할 수 있다. 그 외 루미넥스 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단, 효소(예: 항체와 접합됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 상기 항체는 미소입자(micro particle)와 접합된 항체(conjugated antibody)일 수 있으며, 또한 상기 미소입자는 착색된 라텍스(colored latex) 또는 콜로이드성 금 입자(colloidal gold particle)일 수 있다. 루미넥스 어세이(Luminex Assay)는 소량(10-20 ㎕)의 환자 시료를 전 처리하지 않은 상태에서 최대 100종류의 어낼라이트(analyte)를 동시에 측정할 수 있는 고용량(high-throughput) 정량분석방법으로서 감도가 좋고(pg 단위), 빠른 시간 내에 정량이 가능하여(3-4시간), 기존의 엘라이자(ELISA)나 엘리스팟(ELISPOT)을 대체할 수 있는 분석방법이다.

본 발명의 키트는 상기한 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 생물학적 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 뇌균질액 및 뇨를 포함한다. 하나의 특정예에서 상기 생물학적 시료는 뇌균질액, 혈액, 혈장 또는 혈청이다.

본 발명의 다른 하나의 양태에 따르면, 본 발명은 프리온 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 개체로부터 분리된 생물학적 시료에 있는 PTX3 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 통하여 프리온 질환 마커를 검출하는 방법을 제공한다.

상기 프리온 질환 마커를 검출하는 방법과 상기 프리온 질환 분석용 키트는 동일한 마커를 사용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 회피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명은 프리온 질환을 의사의 소견에 의한 판단이 아니라, 분자 진단 방법으로 판단한다. 본 발명의 마커는 프리온 질환에서 고농도로 존재하는 생체 분자이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "고농도"는 조사 대상의 시료에서의 대상이 되는 마커의 양이 정상 시료와 비교하여 많은 경우를 의미한다. 예를 들어, 상술한 분석 방법에 따라 분석한 결과, 본 발명의 마커가 정상 대조군과 비교하여 2-4배 정도 많은 양이 검출되는 경우, 본 발명에서의 "고농도"로 판정하고 프리온 질환으로 판정가능하다. 이를 통하여, 프리온 질환의 발병 여부를 확인할 수 있다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 개체는 프리온 질환의 발병가능성이 있는 인간을 포함한 동물을 의미하며, 이의 예로는 인간, 소, 양, 염소, 사슴 및 마우스를 포함한다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 뇌 균질액, 혈액, 혈장 및 혈청으로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 항원-항체 반응 방식으로 실시할 수 있다.

본 발명에 따르면, 간편하면서도 신속하게 프리온 질환의 발병 여부를 용이하게 결정할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 나온 데이터를 근거로 하여 프리온 질환 관련 약물을 프리온 질환으로 진단받은 개체에게 처리할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(i) 본 발명은 프리온 질환에 대한 신규한 분자 마커를 제공한다.

(ii) 프리온 질환은 염증반응과 면역반응이 일어나지 않는 것을 병리학적 특징을 하고 있으나, 본 발명은 프리온 질환의 진단용 바이오마커로서 염증반응과 면역반응과 관련된 것으로 알려진 PTX3를 제공한다.

(iii) 본 발명의 마커를 이용하면 신속/정확하게 프리온 질환의 진단 및 예후 분석을 할 수 있다.

도 1 내지 3은 프리온 질환 모델 및 대조군의 혈액 내 PTX3의 수준을 보여준다. RML: PrP^Sc 감염된 뇌 균질액(10%) 접종군,
Ctrl: 정상 뇌 균질액(10%) 접종군.
도 4는 프리온 질환 모델 및 대조군의 뇌 조직을 이용하여 실시한 면역조직화학 결과를 보여준다. 화살표가 가리키는 바는 PTX3가 축적되었음을 의미한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1. 혈액 내 Pentraxin 3 수준 측정

마우스(ICR, 오리엔트바이오, 총 20마리, 4-5주령)에 프리온(Chandler/RML strain, NIH of Japan)을 감염시킨 후(Chandler/RML에 감염된 쥐의 뇌균질액 10%를 뇌 좌반구의 해마부분에 약 20 ㎕ 주입, Transcalvarial injection), 접종 후 1일(1 dpi)부터 7일까지 기간 동안 혈액을 채취하여 혈장 내 PTX3의 수준을 측정하였다. 마우스 혈장은 항응고제(EDTA, 50 mM, pH 8.0)를 이용하여 쥐 심장에서 혈장을 채취한 다음 2000 x g, 20분 동안 원심분리하여 400 ㎕ 정도의 혈장을 얻었다.

혈장 내 PTX3의 수준은 Mouse Pentraxin 3/TSG-14 DuoSet(R&D systems)를 사용하여 측정하였다. 포획항체를 4 ㎍/㎖ 농도로 96-웰 플레이트에 100 ㎕씩 코팅하고, 코팅된 웰에 100 ㎕의 샘플 및 스탠다드 처리 후 상온에서 2시간 동안 인큐베이션 하였다. 2번 세척 후, 검출항체를 100 ng/㎖ 농도로 100 ㎕씩 각 웰에 처리한 다음 상온에서 2시간 동안 인큐베이션 하였다. 2번 세척하고, 200배 희석된 100 ㎕의 스트렙트아비딘-HRP를 처리한 다음 20분 동안 인큐베이션 하고, 2번 세척하였다. 100 ㎕의 기질 용액을 처리하고 20분 동안 인큐베이션한 다음, 50 ㎕의 스탑 용액을 처리하고 Victor5 장치(Perkin Elmer)를 이용하여 450 nm, 0.1ch 조건에서 확인하였다.

각각의 마우스 혈장 샘플에서 얻은 날짜에 따른 PTX3 농도 데이터를 이용하여 두 표본 t-검정(two sample T-test)을 진행하였다. 계산을 통해 비교그룹 간 P값을 구할 수 있었으며, 이를 이용해 혈장 내의 PTX3 농도의 유의성 있는 변화(p<0.05)를 확인하였다. 실험결과는 도 1 내지 3에 나타내었다.

도 1 내지 3에 나타난 바와 같이, 혈장 내 Pentraxin 3의 발현수준은 정상 대조군에 비해 프리온 질환 동물 모델에서 증가되어 있었다.

실시예 2. 면역조직화학(Immunohistochemistry)

실시예 1과 동일한 방법으로 마우스에 프리온을 감염시킨 다음, 접종 후 1일(1 dpi)부터 7일까지 기간 동안 마우스 뇌 조직을 채취한 후 면역조직화학을 실시하였다. 날짜별로 희생시킨 마우스에서 추출한 뇌 좌반구를 뇌 조직 고정용 카셋트에 넣고, 3% 파라포름알데하이드에 넣어 보관하였다. 약 24시간 저장 후, PBS에 0.1% 아지드화나트륨이 있는 버퍼로 교환한 다음, 자동 조직 가공기(제조사: Leica)를 이용하여 파라핀 포매를 실시하였다. 포매를 위한 장치의 온도는 60-65℃로 설정하였다. 제조된 샘플 파라핀 블록을 절편화한 후에 슬라이드 글라스에 부착시킨 후 건조하였다. 실험할 샘플슬라이드를 60℃ 핫플레이트 위에 올려놓고 1시간 동안 건조시킨 후, 식힌 뒤 재수화를 실시하였다. 수돗물로 5분간 세척을 두 번 진행하고, 시트르산염 버퍼(10 mM, pH 6.1)로 항원 리트라이빙(antigen retrieving)을 하였다. 수돗물로 5분간 세척한 후, 내인성 페록시다아제 억제제(0.3-3% H₂O₂ in methanol)로 1시간 동안 인큐베이션하고, 다시 수돗물로 5분간 세척한 다음, PBST로 5분간 인큐베이션하였다. 블록킹용 10% 혈청을 약 1시간에서 2시간 사이로 처리하고, 아비딘 30 ㎕ 처리 후 상온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. PBST로 5분간 세 번 세척하고, 비오틴 30 ㎕ 처리 후 상온에서 15분간 인큐베이션하고, PBST로 5분간 세 번 세척하였다. 1차 항체(Rat α-mPTX3, 2 ㎍/㎖) 처리 후 1시간 동안 인큐베이션하고, PBST로 10분 동안 세 번 세척하였다. 이차 항체(Biotinylated Rabbit α-Rat IgG) 처리 후 1시간 동안 인큐베이션하고, PBST로 10분 동안 세 번 세척하였다. ABC 키트(Avidin: 20 ㎕, Biotin-HRP: 20 ㎕, PBS: 1000 ㎕)를 미리 섞어서 30분 미리 인큐베이션한 후에 샘플에 처리하고, 상온에서 30분간 놓아두었다. PBST로 10분간 세 번 세척하고, 5-8분간 DAB 염색하고 다시 수돗물로 세척하였다. 헤마톡시린을 5분간 처리하고, 세척한 다음 건조하였다. 슬라이드 글라스로 밑에서부터 천천히 덮은 다음 현미경으로 관찰하였다. 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 실험군과 대조군 마우스의 뇌를 PTX3 항체와 DAB 염색약을 처리하여 IHC를 진행한 결과, 해마 부분의 염색 정도에 차이가 있었다. 특히, 실험군은 접종 이후 PTX3가 증가하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (7)

1. PTX3 (pentraxin 3)에 대한 항체 또는 앱타머를 포함하는 프리온 질환(prion disease) 진단용 키트.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 키트는 면역분석(immunoassay)용 키트인 것을 특징으로 하는 프리온 질환 진단용 키트.
   
3. 제 2 항에 있어서, 상기 면역분석용 키트는 루미넥스 분석 키트, 단백질 마이크로어레이 키트 또는 ELISA 키트인 것을 특징으로 하는 프리온 질환 진단용 키트.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 프리온 질환은 크로이펠츠-야콥병(CJD), 변형 크로이펠츠-야콥병(vCJD), 쿠루(kuru), 소 해면뇌병증(BSE), 만성소모성질환(CWD) 및 스크래피로 구성된 군으로부터 선택되는 감염성 프리온 단백질(PrP^Sc)에 의하여 야기되는 퇴행성 신경질환인 것을 특징으로 하는 프리온 질환 진단용 키트.
5. 프리온 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 개체로부터 분리된 생물학적 시료에 있는 PTX3 (pentraxin 3) 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 통하여 프리온 질환 마커를 검출하는 방법.
   
6. 제 5 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 뇌 균질액, 혈액, 혈장 및 혈청으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
   
7. 제 5 항에 있어서, 상기 개체는 인간, 소, 양 또는 마우스인 것을 특징으로 하는 방법.

Images