CN107003320B - 慢性肾脏疾病的快速进展的生物标志物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于预测患者中的慢性肾脏疾病的进展的方法。更具体地，本发明涉及使用患者尿样品中的特异性生物标志物标记对慢性肾脏疾病的快速进展进行早期预测。

Description

慢性肾脏疾病的快速进展的生物标志物

本发明涉及用于预测患者中的慢性肾脏疾病的进展的方法。更具体地，本发明涉及使用患者尿样品中的特异性生物标志物标记对慢性肾脏疾病的快速进展进行早期预测。

背景技术

慢性肾脏疾病(Chronic Kidney Disease，CKD)目前影响约10％的西方人群，且认为发病率在世界上逐渐增加。低肾小球滤过率(GFR)与增加的心血管病死亡风险以及年龄标准化的所有原因死亡有关^1，2。这种增加的死亡风险甚至发生在患者达到终末期肾病(ESRD)之前¹。因而CKD是一个显著的公共卫生问题。有些具有CKD的患者将快速地进展至终末期肾病(end stage renal disease，ESRD)且因此处于较高的风险中，而在其它患者中，CKD可能保持稳定或甚至改善³。鉴别可能进展的那些患者是分级的首要。白蛋白尿是CKD进展的一种良好预测指标⁴。但是，尽管有进行中的CKD，白蛋白尿可以退化⁵。

存在许多可以在CKD进展中起作用且可以成为肾进展生物标志物的潜在候选物的效应物。

转化生长因子-β(Ttransforming growth factor-β，TGF-β)⁶途径和它的下游效应物结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)^7，8是基质合成的已知重要驱动因子和纤维化发展的潜在因子。细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)积聚物(它是纤维化的结构单元)由分子(诸如胶原III)组成，所以我们研究了前胶原III氨基端前肽(Procollagen III amino terminal propeptide，PIIINP)^9，10(合成的胶原的量的间接指标)以及纤连蛋白1(fibronectin 1，FN1)¹¹和骨膜蛋白¹²-两种其它的重要ECM分子。如它们的名称暗示的，供研究的参与ECM重塑的其它分子是基质金属蛋白酶9(matrixmetalloprotease 9，MMP9)和组织金属蛋白酶抑制剂1(inhibitor of metalloprotease1，TIMP1)，它们分别分解ECM和抑制该分解作用¹³。

认为炎症过程在驱动最终的纤维化中起重要作用。从炎症观点看，可能涉及许多炎症性的趋化因子和细胞因子：单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein1，MCP1)¹⁴、骨桥蛋白¹⁵、白介素18(IL18)¹⁶、IL6¹⁷和白细胞抑制因子(LIF)¹⁸以及生长和分化因子15(GDF15)¹⁹。生长因子(诸如表皮生长因子(EGF)受体(EGFR)的配体)在细胞生长和增殖中起作用。配体诸如EGF和转化生长因子α(TGF-α)在病理生理学中可能在CKD中起作用²⁰。除了它的许多其它作用以外，嗜中性粒细胞明胶酶相关的脂质运载蛋白可以在EGFR的下游起作用²¹。血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factors A，VEGFA)²²和C(VEGFC)²³是在血管生成和淋巴管生成中涉及的生长因子，它们二者还在CKD进展中具有经鉴别的作用。

其它分子对肾结构和功能是更特异性的，且根据肾损伤程度以不同水平表达。脂肪酸结合蛋白1(Fatty Acid Binding Protein 1，FABP1)^24-26主要在近端小管中表达。肾损伤分子1(Kidney injury molecule 1，KIM1)也在肾小管上表达，但是仅在疾病状态²⁷。EGF也在远端小管中表达²⁸。半胱氨酸蛋白酶抑制剂C是一种13.4kDa半胱氨酸蛋白酶抑制剂，在肾小球中自由滤过并重新吸收进肾小管中²⁹，且因而升高的尿水平可能提示小管损伤。尿调制蛋白在享勒袢中表达且分泌进尿中³⁰。

尽管存在该生理病理学信息，但是不存在用于预测快速进展的可靠生物标志物标记。

在Tangri等人的大研究(涉及共8391位处于3-5期CKD的患者)中，证实了使用常规地测量的指标(诸如血浆白蛋白、钙、磷酸盐、碳酸氢盐、白蛋白尿)并考虑年龄、性别和基线估计的肾小球滤过率(estimated glomerular filgration rate，eGFR)的CKD进展预测模型会预测向肾衰竭进展的CKD³³。这里的主要结果量度是对肾替代疗法的要求。

其它研究组已经寻找通常采用不如测量的肾小球滤过率(measured glomerularfiltration rate，mGFR)黄金标准准确的eGFR的其它模型来预测CKD进展。eGFR显然是更容易的和更廉价的测量，但是不足令人惊奇的事实是，使用eGFR方程式不会完全再现发现。由于eGFR的灵敏度的缺乏，已经报道了eGFR在mGFR面前的不准确性⁴³。当寻找其中必须考虑两种或更多种GFR的进展时，所述误差会被进一步放大。

但是，白蛋白尿(albuminuria)的检测以及人口统计风险因素仍然是标准方案。通过加入可靠生物标志物(特别是尿生物标志物)来增加预测准确度因而将是有用的。具体地，本领域中越来越需要处于慢性肾脏疾病的快速进展风险中的患者的体外早期检测方法。

因此，本发明满足了该需要，公开了与CKD进展有关的尿生物标志物的特殊组合并提供了CKD进展的新预测方法和它们的试剂盒。

发明内容

本发明涉及用于预测受试者中的慢性肾脏疾病的快速进展的体外方法，所述方法包括下述步骤：评价得自所述受试者的生物样品中的一种或多种生物标志物的表达，其中所述一种或多种生物标志物选自转化生长因子α(transforming growth factor alpha，TGF-α)、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)和单核细胞趋化蛋白1(monocytechemoattractant protein 1，MCP1)。

在具体实施方案中，本发明的预测方法包括：至少评价EGF、MCP1和TGF-α的表达，和任选地，评价嗜中性粒细胞明胶酶-相关的脂质运载蛋白(Neutrophil Gelatinase-associated Lipocalin，NGAL)的表达。

在可以与前述实施方案组合的其它具体实施方案中，所述评价步骤包括(a)定量得自所述受试者的生物样品中的一种或多种选定生物标志物的表达以得到每种定量生物标志物的表达值，和(b)将在步骤(a)处得到的所述表达值与对应对照值进行对比，其中低于对照值的EGF的表达值和/或高于在对照值的MCP1的表达值和/或高于在对照值的TGFα的表达值和/或高于在对照值的NGAL的表达值指示，所述人受试者处于增加的快速进展风险中。

在可以与前述实施方案组合的其它具体实施方案中，进一步评价选自生长和分化因子15(Growth and Differentiation Factor 15，GDF15)、嗜中性粒细胞明胶酶-相关的脂质运载蛋白(NGAL)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、脂肪酸结合蛋白(Fatty Acid BindingProtein，FABP)、纤连蛋白、肾损伤分子1(KIM1)、骨桥蛋白、组织金属蛋白酶抑制剂1(TIMP1)、尿调制蛋白和血管内皮生长因子A(VEGFA)、白介素-6(IL6)、白血病抑制因子(LIF)、基质金属肽酶9(MMP9)的一种或多种生物标志物的表达。

在可以与前述实施方案组合的其它具体实施方案中，用在所述方法中的所述生物样品是尿或血清样品。

在可以与前述实施方案组合的其它具体实施方案中，在生物样品中评价每种生物标志物的蛋白表达，例如如在免疫测定中所定量的。

在可以与前述实施方案组合的其它具体实施方案中，然后选择所述被预测为快速进展的受试者用治疗慢性肾脏疾病的治疗剂进行治疗。

本发明还涉及用于监测治疗慢性肾脏疾病的治疗剂在受试者中的效力的体外方法，所述方法包括评价所述受试者的生物样品中的生物标志物的表达，其中所述生物标志物是EGF、MCP1和TGF-α，和任选地，评价NGAL的表达。

在可以与前述实施方案组合的其它具体实施方案中，进行在治疗慢性肾脏疾病之前的第一个评价步骤，并然后在所述治疗步骤过程中或之后重复，其中所述生物标志物的表达的变化指示对所述治疗的应答。

本发明还涉及用于实现本发明的以上方法中的任一种的试剂盒，所述试剂盒包含用于定量至少下述生物标志物的蛋白表达的装置：EGF、MCP1和TGF-α，和任选地，用于定量NGAL的蛋白表达的装置。

在可以与前述实施方案组合的其它具体实施方案中，所述用于定量蛋白表达的装置包括每种生物标志物的特异性的未标记抗体，和任选地，用于在免疫测定中检测所述生物标志物/未标记抗体的第二标记抗体。

例如，在一个更具体的实施方案中，用在免疫测定中的本发明的试剂盒包含：

(i)EGF的特异性抗体；

(ii)MCP1的特异性抗体；和，

(iii)TGF-α的特异性抗体，

(iv)任选的NGAL的特异性抗体。

在具体实施方案中，在所述试剂盒中包含的所述抗体被固定在支持物上。在其它具体实施方案中，在所述试剂盒中包含的所述抗体缀合至报告分子。

附图说明

图1：组合尿生物标志物以预测CKD进展中的‘快速进展者’状态的最佳模型.(a)：显示模型中表皮生长因子(EGF)、单核细胞趋化蛋白(MCP1)、转化生长因子-α(TGF-α)和白蛋白尿的比值比OR(95％置信区间，CI)的森林图；(b)：将三种BM表皮生长因子(EGF)、单核细胞趋化蛋白(MCP1)、转化生长因子-α(TGF-α)和白蛋白尿的最佳模型的曲线下面积(AUC)与没有生物标志物(BM)、但是仅有白蛋白尿的模型的AUC进行对比的受试者操作特征(ROC)曲线。针对白蛋白尿、募集中心、糖尿病历史和平均mGFR来调节模型。

图2：根据测量的GFR(mGFR)和估计的GFR*(eGFR)每年的肾小球滤过率(GFR)的变化百分比.

正方形代表使用任一种方法其中存在进展速率的一致性的患者：实心正方形是快速进展者(n＝38)，且空心正方形是缓慢进展者(n＝131)。圆圈代表其中在两种方法之间存在差异的患者：实心圆圈是通过mGFR、但是没有通过eGFR鉴别的快速进展者(n＝30)，且空心圆圈是通过eGFR、但是没有通过mGFR鉴别的快速进展者(n＝30)。灰色线显示了回归线(皮尔森氏相关系数r＝0.5)。这里没有表示5个离群值(每年>50％和＜-50％的基线mGFR变化)。*使用肾病饮食改进(MDRD)方程式估计eGFR。

图3：标记中的生物标志物的生物标志物三分位数.

在模型5中在尿生物标志物的每个三分位数的快速进展者(>10％的每年测量的肾小球滤过率(mGFR)的减小)的百分比.

白蛋白三分位数T1：＜3.58；T2：3.58-33.02；和T3：≥33.02mg/mmol。表皮生长因子(EGF)三分位数T1：＜0.46；T2：0.46-0.81；和T3：≥0.81μg/mmol；单核细胞趋化蛋白(MCP1)三分位数T1：＜17.7；T2：17.7-35.6；和T3：≥32.6ng/mmol；嗜中性粒细胞明胶酶相关的脂质运载蛋白(NGAL)三分位数T1：＜0.26；T2：0.26-0.76；和T3：≥0.76μg/mmol；和转化生长因子-α(TGF-α)三分位数T1：＜0.30；T2：0.30-0.47；和T3：≥0.47ng/mmol。对于NGAL可以观察到三分位数的J-形分布。

具体实施方式

本发明提供了允许在患者中早期预测慢性肾脏疾病的快速进展的可能性的方法。

具体地，本文中提供了预后方法和试剂盒，其允许预测患者中CKD的快速进展并从而预测向终末期肾病的进展的风险。

根据本发明，已经鉴别出非常可靠的尿生物学标志物集合，其指示增加的慢性肾脏疾病的快速进展的风险。

因而，本发明的一个目的由用于预测受试者中的慢性肾脏疾病的快速进展的体外方法组成，所述方法包括下述步骤：评价得自所述受试者的生物样品中的一种或多种生物标志物的表达，其中所述一种或多种生物标志物选自表皮生长因子(EGF)、单核细胞趋化蛋白1(MCP1)、转化生长因子α(TGF-α)、生长和分化因子15(GDF15)、嗜中性粒细胞明胶酶-相关的脂质运载蛋白(NGAL)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、脂肪酸结合蛋白(FABP)、纤连蛋白、肾损伤分子1(KIM1)、骨桥蛋白、组织金属蛋白酶抑制剂1(TIMP1)、尿调制蛋白白介素-6(IL6)、白血病抑制因子(LIF)、基质金属肽酶9(MMP9)和血管内皮生长因子A(VEGFA)。

在具体实施方案中，评价了上面列出的所述生物标志物中的2、3、4或5种的表达。

根据本发明的预测方法中的所述一种或多种生物标志物更具体地选自EGF、MCP1和TGF-α。

在具体实施方案中，本发明的预测方法包括至少评价EGF、MCP1和TGF-α的表达，例如，它们的蛋白表达，和任选地，评价NGAL的表达。

如在下面的实施例中证实的，当在CKD的缓慢进展者和快速进展者之间对比尿样品中的候选生物标志物的表达值时，发明人已经鉴别出相对于缓慢进展者或健康受试者在快速进展者中具有统计上不同的表达的特异性生物标志物和它们的组合，这样的生物标志物在下文中被称作“预测性生物标志物”并列出在下面的表1中。

某些定义

在本文中可互换地使用的术语“患者”或”受试者”表示人类，包括例如具有或疑似具有慢性肾脏疾病或处于CKD的早期阶段的男性或女性，或处于发展慢性肾脏疾病的风险中的受试者(考虑CKD的人口统计风险因素)。

术语“慢性肾脏疾病”或“CKD”在本文中互换地用于表示被定义为肾结构或功能的异常的病症，其存在超过3个月，这暗示着对于健康人而言其可以突然发生，且消退或变成慢性的(关于慢性肾脏疾病指南的评价和管理的临床实践指南(Clinical PracticeGuideline for the评价ion and Management of Chronic Kidney Disease Guidelines，KDIGO 2012)。CKD是具有可变临床表现的、影响肾结构和功能的异质障碍的一般术语，部分地与原因、严重程度和进展速率有关(Kidney International Supplements(2013)3，vii)。具体地，可以用下述标准限定CKD的定义和鉴别：

1.对于处于较高进展风险中的个体，和/或在测量会影响治疗决策的情况下，

2.认识到GFR的小波动是常见的且不一定指示进展。

3.基于以下的一项或多项(未分级)限定CKD进展：

a.GFR种类(Z90[G1]、60-89[G2]、45-59[G3a]、30-44[G3b]、15-29[G4]、o15[G5]ml/min/1.73m2)的下降。eGFR的某种下降被定义为GFR种类的下降，伴有eGFR从基线或终末期肾病(ESRD，eGFR＜15ml/min/1.73m2，肾替代疗法(Renal Replacement Therapy)或死亡或以上参数的复合体)的50％或更大下降。

b.快速进展被定义为每年超过-3.3％的eGFR的持续下降。

c.评估进展的置信度随着血清肌酸酐测量结果数目和随访持续时间增加而增加

术语“生物样品”意图表示从受试者分离的生物流体及其分离物。它可以包括但不限于，血液样品，例如，全血、血浆和血清样品、唾液或尿样品。在一个特定实施方案中，生物样品是尿样品。

术语“预后”在本文中用于表示患者的结果的预测，所述结果是关于他们的GFR是否以快速或缓慢的速率下降。

本文中使用的术语“快速进展的预测”不一定由绝对应答组成。它可以允许确定受试者中的慢性肾脏疾病的快速进展的概率(风险)，或者，它可以由这样的应答组成：所述应答允许确定受试者中增加的快速进展风险(与人群中CKD的快速进展的平均风险相比)，而不是给出风险的精确概率。

换而言之，根据本发明的方法被预测为快速进展者的患者是处于增加的快速进展者风险中的受试者。在某些实施方案中，所述预测被表达为统计值，包括P值，如从关于已经评价的一种或多种生物标志物中的每一种得到的表达值所计算出的。

术语“快速进展”特别地表示CKD的演化，如通过在遭受CKD的受试者(在本文中也称为“快速进展者”)中每年超过10％的基线测量肾小球滤过率(mGFR)的减小所测量的。快速进展者更可能进展至终末期肾病(ESRD)，该阶段与显著的发病率和死亡率风险有关。因此，在本发明的方法的一个具体实施方案中，被预测为快速进展的受试者是被预测每年减小超过10％的基线测量肾小球滤过率(mGFR)的受试者，例如如从初步测量结果所测得的(直到随后约一年以后的时间)。相反，“缓慢进展者”是每年减小小于10％的基线测量肾小球滤过率(mGFR)的受试者。

本文中使用的术语“早期预测”表示在CKD的早期阶段在受试者中进行的预测，例如在阶段1或2(具有GFR>60ml/mn/1，73m^{2 33})、阶段3，或甚至其尚未被诊断为具有CKD，例如根据白蛋白尿、蛋白尿或肌酸酐浓度常规诊断方法。本发明的预后方法对于受试者中CKD的快速进展的早期预测而言是特别适当的。

本文中使用的术语“生物学标志物”或“生物标志物”表示例如患者的病理学状态的指示剂，其可以在患者的生物样品中检测到。生物标志物包括、但不限于基于DNA、RNA、蛋白、碳水化合物或糖脂的分子标志物。

术语“蛋白”与术语“多肽”互换使用，且以它的最宽含义表示两个或更多个亚基氨基酸的化合物。所述亚基可以通过肽键连接。

本文中使用的术语“试剂盒”表示可以单独地或在单个容器内提供的前述组分的集合。所述容器还包含用于实现本公开内容的方法的说明书。这些说明书可以呈手册的形式，或可以由计算机程序代码提供，所述计算机程序代码当在计算机或数据处理装置上执行时能够进行在本公开内容的方法中提及的对比并相应地建立诊断。所述计算机程序代码可以提供在数据存储介质或装置诸如光存储介质(例如，光盘)上或直接提供在计算机或数据处理装置上。

用在本发明的方法中的预测性生物标志物

在下文中通过它们的首字母简略词、全名和UniprotKB/Swissprote命名法和SEQID NO来描述预测性生物标志物。

表1：预测性生物标志物的列表

¹http://www.uniprot.org/

在本发明中，当提及生物标志物时，它特别表示所述生物标志物的蛋白和/或它的翻译后修饰。

根据如在表1中所示的对应参考或SEQ ID NO 1-16，可以在http:// www.uniprot.org找到对应生物标志物的蛋白序列。当然，在用于本发明中的所述生物标志物的定义中包括所述蛋白序列的任何天然变异。

定量预测性生物标志物的表达

本发明的预测方法包括评价生物样品中的一种或多种预测性生物标志物的表达的步骤。

本文中使用的术语“评价”通常包括以下步骤：(a)定量得自所述受试者的生物样品中的每种选定预测性生物标志物的表达以得到表达值，和(b)将所述预测性生物标志物的得到的表达值与对应对照值进行对比，其中所述表达值相对于各个对照值的差异指示所述受试者处于增加的快速进展风险中。

通过确定受试者的生物样品(例如血清或尿样品)中的预测性生物标志物的基因或蛋白表达，可以定量生物标志物的表达。所述定量可以是相对的(通过将生物标志物的量与例如含有已知量的生物标志物的对照进行对比，并检测相对于该对照而言“更高”或“更低”的量)或更精确的，至少确定相对于已知对照量的比例量。

在一个具体实施方案中，通过检查受试者的生物样品(例如尿样品)中的至少一种或多种预测性生物标志物的蛋白表达，可以定量生物标志物的表达。在具体实施方案中，在受试者的生物样品(例如尿样品)中定量至少EGF、MCP1和TGFα的蛋白表达，和任选地，NGAL的蛋白表达。

多种用于检测这样的生物样品中的蛋白表达水平的方法是本领域已知的，包括多种免疫测定方法。它们包括、但不限于：放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫测定、免疫放射测定、原位免疫测定(使用例如胶体金、酶或放射性同位素标记)、蛋白质印迹分析、免疫沉淀测定、免疫荧光测定、流式细胞计量术、免疫组织化学、共焦显微术、酶测定、表面等离子体共振和PAGE-SDS。

确定蛋白水平涉及例如测量在抗体和得自患者的样品中的生物标志物的多肽之间发生的任何免疫特异性结合的量，所述抗体选择性地识别和结合所述多肽。这些测定还可以包括标记的抗体与靶生物标志物的直接结合。

夹心测定属于最有用的且常用的测定。存在夹心测定技术的许多变化，且都意图被本发明包括。简而言之，在一种典型的正向测定中，将未标记的抗体固定在固体基底上，并使要试验的样品与结合的分子接触。合适的温育时段以后，对于足以允许形成抗体-抗原复合物的时间段，然后加入第二抗体(其对抗原是特异性的，但是用能够产生可检测信号的报告分子标记)并温育，从而允许足以形成抗体-抗原-经标记的抗体的另一种复合物的时间。将任何未反应的材料洗掉，并通过观察由报告分子产生的信号来确定抗原的存在。结果可以是定性的(通过可视信号的简单观察)，或者可以通过与含有已知量的生物标志物的对照样品对比来定量。

对正向测定的变化包括同时测定，其中将样品和经标记的抗体同时加给结合的抗体。这些技术是本领域技术人员众所周知的，包括将容易明白的任何微小变化。在一种典型的正向夹心测定中，将对生物标志物具有特异性的第一抗体共价地或被动地结合至固体表面。

所述结合过程是本领域众所周知的，且一般由交联、共价结合或物理吸附组成，在试验样品的制品中洗涤聚合物-抗体复合物。然后向固相复合物添加要试验的样品的等分试样，并在合适的条件(例如从室温到40℃，诸如在25℃和32℃之间，包含端点)下温育足够的时间段(例如2-40分钟或者如果更方便的话，过夜)，所述条件和时间段允许存在于抗体中的任何亚基的结合。在该温育时段以后，将抗体亚基固相洗涤并干燥，并与对生物标志物的一部分特异性的第二抗体一起温育。所述第二抗体与报告分子连接，所述报告分子用于指示第二抗体与分子标志物的结合。

一种替代方法涉及固定样品中的预测性生物标志物，并然后将固定的生物标志物暴露于特异性抗体，所述特异性抗体可能用或未用报告分子标记。取决于生物标志物靶标的量和报告分子信号的强度，结合的生物标志物靶标可以通过用抗体直接标记来检测。可替换地，将对第一抗体特异性的第二标记抗体暴露于靶标-第一抗体复合物以形成靶标-第一抗体-第二抗体三元复合物。通过报告分子发射的信号来检测复合物。

在本说明书中使用的“报告分子”是指这样的分子，其通过它的化学性质提供分析上可鉴别的信号，所述信号允许检测抗原结合的抗体。在这类测定中最常用的报告分子是酶、荧光团或含有放射性核素的分子(即放射性同位素)和化学发光分子。

在酶免疫测定或ELISA测定的情况下，酶通常可以缀合至第二抗体，通常借助于戊二醛或高碘酸盐。但是，如容易明白的，存在多种不同的缀合技术，它们是技术人员容易得到的。常用的酶尤其包括辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶。通常选择要与特异性酶一起使用的底物，用于通过对应酶水解后产生可检测的颜色变化。合适的酶的例子包括碱性磷酸酶和过氧化物酶。也可能采用发荧光的底物(其产生荧光产物)而不是上述的生色底物。在所有情况下，将酶-标记的抗体加给第一抗体-分子标志物复合物，允许结合，然后将多余的试剂洗掉。然后将含有适当底物的溶液加给抗体-抗原-抗体的复合物。所述底物将与连接至第二抗体的酶反应，从而产生定性的可视信号，其可以进一步定量(经常通过分光光度计法)以给出存在于样品中的生物标志物的量的指示。

可替代地，可以将荧光化合物(诸如荧光素和罗丹明)与抗体化学偶联而不改变它们的结合能力。当通过用特定波长的光照射来活化时，荧光染料-标记的抗体会吸收光能，诱导分子中的状态至兴奋性，随后在用光学显微镜可视地检测的特征性颜色发射光。如在EIA中一样，允许荧光标记的抗体结合第一抗体-分子标志物复合物。洗掉未结合的试剂以后，然后将剩余的三元复合物暴露于适当波长的光，观察到的荧光指示目标分子标志物的存在。免疫荧光和EIA技术都在本领域中非常好地确立。但是，也可以采用其它报告分子，诸如放射性同位素、化学发光的或生物发光的分子。

在本发明的预测方法的具体实施方案中，所述定量步骤因而允许得到在生物样品中试验的每种生物标志物的“表达值”用于用在对比步骤中。

为了容易用在对比步骤中，所述表达值可以由将绝对表达水平值与参考值对比以后得到的标准化(相对)值组成，所述参考值由例如生物样品中的参考蛋白的表达水平值组成。

例如，在一个具体实施方案中，可以使用肌酸酐水平将表达值调节至标准化的表达值。经常可以通过尿中的酶促或比色试验系统来确定肌酸酐。

将每种生物标志物的表达值与对应对照值进行对比

本发明的方法是基于：定量受试者的生物样品中的一种或多种预测性生物标志物的表达，如上所述，和将所述生物标志物的每个表达值与对应对照值进行对比。

本文中使用的术语“对比”表示对应参数或值的对比，例如将绝对水平值与绝对对照水平值进行对比，其中将浓度与对照浓度进行对比，并将标准化的值与对应的对照标准化的值进行对比。

本文中使用的术语“对照值”表示对照受试者或对照受试者集合中的生物标志物的表达值，其允许评估个体是否被预测出CKD快速进展。

根据一些实施方案，基于来自对照受试者或对照受试者集合的生物标志物表达来确定对照值，所述对照受试者已经被表征为快速进展者、缓慢进展者或健康受试者。

适用于特定受试者的对照值可以随多种生理学参数(诸如年龄、性别或亚群)、以及用于定量本文中提及的生物标志物的试验形式、样品和配体而变化。这些因素和在确定对照值时考虑它们的方式通常是本领域中已知的。在某些实施方案中，通过应用标准统计方法，基于生物标志物的平均值(average或mean)或中位值，可以为受试者组群(如在实施例中说明的)计算对照值。

相应地，要用于本发明的前述方法的对照值(即允许鉴别处于较高快速进展风险中的个体的阈值)可以是如在对照受试者组中定量的生物标志物蛋白表达的平均/中位表达值(或标准化的(相对)平均/中位值)。

在男性和女性中的每种预测性生物标志物的这样的标准化的中位值的例子在下面实施例中给出在表3中(所述值已经用尿肌酸酐浓度调节至标准化值)。

取决于将用于本发明的方法的定量方法和预测性生物标志物，还可以通过例行实验确定所述对照值。

例如，所述对照值对应于针对患者的缓慢进展者组观察到的表达(任选地标准化的)平均/中位值，且当表达(任选地标准化的)值在统计上不同于对照值(例如相对于对照值增加，或相对于对照值下降)时，预测患者是快速进展者。

可替换地，所述对照值对应于针对快速进展者患者观察到的表达水平值，且当表达水平值在统计上没有不同于对照值时，预测患者是快速进展者。

例如，在本发明的一个具体预测方法中，所述评价步骤包括(a)定量得自所述受试者的生物样品中的一种或多种选定生物标志物的表达以得到每种生物标志物的表达值，和(b)将在步骤(a)处得到的所述每种生物标志物的表达值与对应对照值进行对比，其中低于对照值的EGF的表达值和/或高于在对照值的MCP1的表达值和/或高于在对照值的TGFα的表达值和/或高于在对照值的NGAL的表达值指示，所述受试者处于增加的CKD的快速进展风险中。

在本发明的方法的步骤(b)中提及的对比可以手工地或在计算机辅助下进行。

对于计算机辅助的对比，可以通过计算机程序将表达值与存储在数据库中的对照值进行对比。所述计算机程序可以进一步评价对比的结果，即自动地以合适的输出形式提供期望的评估。

如在实施例中和更具体地在下面实施例的表5中所示，对于预测患者的CKD的快速进展，根据本发明的2、3、4或5种预测性生物标志物的组合可以是统计上相关的。

本发明的方法包括本发明的2、3、4、5种或更多种预测性生物标志物的任意组合。

所述对比步骤可以不一定包括每种生物标志物的表达值与它们的对应对照值的单独对比。在具体实施方案中，可以如下得到多生物标志物评分值：将表达值或它们的标准化值组合在一起，和与对应的多生物标志物评分对照值进行对比。

在一个特定实施方案中，至少为患者中的三种下述生物标志物得到表达值：表皮生长因子(EGF)、单核细胞趋化蛋白1(MCP1)和转化生长因子α(TGF-α)，和任选地，得到NGAL的表达值。

为了改善根据本发明的方法的统计预测，对于慢性肾疾病进展，人们还可以包括白蛋白尿、蛋白尿、血浆或血清肌酸酐浓度和/或人口统计风险因素。

如本文中使用的，所述人口统计风险因素包括年龄、身体质量指数、平均动脉压、性别、黑人/非洲人种族划分、糖尿病、心血管疾病史、吸烟者、状态、血管紧张素途径阻断的未使用、泌尿系感染史、血尿、肾脏疾病的家族史。

在一个具体实施方案中，本发明涉及一种用于预测受试者中的慢性肾脏疾病的快速进展的方法，所述方法包括至少评价EGF、MCP1和TGF-α的表达，和任选地评价NGAL的表达，且其中从所述受试者进一步确定白蛋白尿或蛋白尿。根据本领域中众所周知的方法，可以从相同生物样品或在不同的生物样品中确定白蛋白尿或蛋白尿。

在具体实施方案中，所述预测方法包括评价至少表皮生长因子(EGF)、单核细胞趋化蛋白1(MCP1)和转化生长因子α(TGF-α)和至少一种或多种下述生物标志物的表达：GDF15、FABP1、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、纤连蛋白、KIM1、NGAL、TIMP1、尿调制蛋白、骨桥蛋白、IL6、MMP9、LIF和VEGF-A。

在具体实施方案中，所述预测方法包括评价尿样品中EGF、TGF-α和MCP1的特定生物标志物组合的表达。

在其它具体实施方案中，所述预测方法包括评价尿样品中EGF、TGF-α、MCP1和NGAL的特定生物标志物组合的表达。

在其它具体实施方案中，所述预测方法包括评价尿样品中EGF、TGF-α、MCP1和NGAL的特定生物标志物组合的表达。

在其它具体实施方案中，所述预测方法包括评价尿样品中EGF、TGF-α、MCP1和FABP1的特定生物标志物组合的表达。

在其它具体实施方案中，所述预测方法包括评价尿样品中EGF、TGF-α、MCP1和半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的特定生物标志物组合的表达。

在其它具体实施方案中，所述预测方法包括评价尿样品中EGF、TGF-α、MCP1和纤连蛋白的特定生物标志物组合的表达。

在其它具体实施方案中，所述预测方法包括评价尿样品中EGF、TGF-α、MCP1和KIM1的特定生物标志物组合的表达。

在其它具体实施方案中，所述预测方法包括评价尿样品中EGF、TGF-α和TIMP1的特定生物标志物组合的表达。

在与以上具体实施方案组合的其它具体实施方案中，所述预测方法还包括评价尿样品中的白蛋白，无论是与其它预测性生物标志物(来自相同生物样品)一起还是单独地(来自不同样品)。

测定生物标志物表达和CKD的治疗

本发明还涉及患者分级方法。具体地，根据本发明的方法可以选择在增加的CKD的快速进展的风险下鉴别出的患者用于CKD的治疗性处理。因此，本发明还包括包含以下步骤的方法：

(i)根据上面定义的预测方法鉴别患者是否处于增加的CKD的快速进展风险中，和，

(ii)用适合用于治疗CKD的治疗剂治疗在步骤(i)中鉴别出的所述快速进展者患者。

本文中使用的术语“治疗”或表示措施，其中目的是阻止或减慢(减轻)靶向的病理性病症或障碍、或减慢或解除所述障碍的一种或多种征状。在一个具体实施方案中，如果在接受治疗剂以后，患者显示出以下一种或多种的可观察的和/或可测量的从基线的下降或变化和/或可测量的随时间从基线的变化速率(例如经历3个月[12周]或6个月[24周]或9个月[36周]或12个月[1年、52周]，那么受试者被“成功地治疗”慢性肾脏疾病：mGFR，在1年中mGFR的减小百分比，eGFR，eGFR的减小百分比。

根据以上方法用于治疗慢性肾脏疾病的快速进展者的治疗剂可以包括、但不限于(i)血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEi)例如，卡托普利(Capoten)、佐芬普利、依那普利(Vasotec/Renitec)、雷米普利(Altace/Prilace/Ramace/Ramiwin/Triatec/Tritace)、喹那普利(Accupril)、培哚普利(Coversyl/Aceon/Perindo)、赖诺普利(Listril/Lopril/Novatec/Prinivil/Zestril)、贝那普利(Lotensin)、咪达普利(Tanatril)、群多普利(Mavik/Odrik/Gopten)、西拉普利(Inhibace)和含有膦酸酯的药剂诸如福辛普利(Fositen/Monopril)或(ii)血管紧张素受体阻滞剂(ARB)诸如氯沙坦(Cozaar)、坎地沙坦(atacand)、缬沙坦(Diovan)、厄贝沙坦(Avapro)、替米沙坦(Micardis)、依普罗沙坦(Teveten)、奥美沙坦(Benicar/Olmetes)和阿齐沙坦(edarbi)。

用于治疗慢性肾脏疾病的合适治疗剂向所述患者的施用可以在疗程中连续地或间歇地在一个剂量中实现。

确定治疗的最有效施用方式和剂量的方法是本领域技术人员众所周知的，且将随用于治疗的组合物、治疗的目的和正在治疗的受试者而变化。可以进行单次或多次施用，剂量水平和模式由治疗医师选择。可以根据经验调整合适的剂量制剂和施用所述药剂的方法。

如果患者被预测为缓慢进展者，替代疗法可以是优选的。在施用合适的治疗剂之前，可以应用其它诊断方法来进一步验证所述患者中的快速进展的风险。

本发明的另一个方面涉及监测用于治疗慢性肾脏疾病的治疗在患者中的效力的体外方法，所述方法包括评价在上面表1中定义的一种或多种预测性生物标志物的表达。

具体地，可以用在本发明的监测方法中的所述预测性生物标志物选自表皮生长因子(EGF)、单核细胞趋化蛋白1(MCP1)和转化生长因子α(TGF-α)，和任选地，NGAL。

在这样的监测方法中，所述评价步骤基本上与上面关于本发明的预测方法所述相同地进行，但是所述受试者是需要治疗CKD的受试者，且所述预测性生物标志物现在用作替代标志物，即用作疾病阶段或mGFR参数的预测剂。所述评价步骤可以例如在治疗之前、和在治疗过程中或结束时执行，且每种生物标志物的表达水平的演化/变化指示对所述治疗的好或差应答。

这样的方法可以用于例如监测管理机构批准的CKD治疗在患者中的效力，和/或调整治疗的剂量或长度。可替换地，这样的方法可以用于监测候选治疗在临床研究中的效力。

本发明的试剂盒

本发明还涉及用于本发明的预测或监测方法的试剂盒。

具体地，本发明的一个目的由用于预测受试者中(例如在生物样品中，更具体地在受试者的尿样品中)的慢性肾脏疾病的快速进展的试剂盒组成，所述试剂盒包含用于定量至少下述生物标志物的蛋白表达的装置：表皮生长因子(EGF)、单核细胞趋化蛋白1(MCP1)和转化生长因子α(TGF-α)。

本发明的另一个目的由用于监测治疗慢性肾脏疾病的治疗的效力的试剂盒组成，所述监测试剂盒包含用于定量至少下述预测性生物标志物的蛋白表达的装置：表皮生长因子(EGF)、单核细胞趋化蛋白1(MCP1)和转化生长因子α(TGF-α)。

在所述试剂盒的某些实施方案中，它们包含用于检测和/或定量下述预测性生物标志物中的2种、3种或全部的装置：EGF、MCP1、TGF-α和NGAL。

本发明的监测或预测试剂盒因而可以包括多种试剂，其中每一种能够特异性地结合预测性生物标志物之一的蛋白。用于与蛋白生物标志物特异性地结合的合适试剂包括、但不限于抗体。

本文中使用的术语“抗体”以较宽含义使用，且包括完整抗体和任何抗原结合片段或衍生物(即，“抗原结合部分”)。它可以具体地涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体、它们的单链。抗原结合片段也包括Fab、Fab’、(Fab’)2和它们的衍生物，包括VH和VL片段的组合或Fv抗体，Fv是含有完全抗原识别和结合部位的最小抗体片段。它还包括嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。

天然存在的“抗体”是至少包含通过二硫键互联的两个重(H)链和两个轻(L)链的糖蛋白。每个重链包含重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区。所述重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。每个轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区。所述轻链恒定区包含一个结构域CL。所述VH和VL区域可以进一步细分成被称作互补性决定区(CDR)的高变异性区域，其散布有被称作框架区(FR)的更保守的区域。每个VH和VL由按照以下顺序从氨基端至羧基端排列的三个CDR和四个FR组成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。

本文中使用的“分离的抗体”表示基本上不含有具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体。此外，分离的抗体可以基本上不含有其它细胞物质和/或化学物质。

本文中使用的术语“单克隆抗体”和“单克隆抗体组合物”表示单一分子组成的抗体分子的制品。单克隆抗体组合物表现出对特定表位的单一结合特异性和亲和力。

本文中使用的术语“重组人抗体”包括通过重组方式制备、表达、建立或分离的所有人抗体，诸如从转基因的或转染色体的(对于人免疫球蛋白基因而言)动物(例如，小鼠)或从其制备的杂交瘤分离的抗体，从被转化成表达人抗体的宿主细胞(例如，从转染瘤)分离的抗体，从重组的组合人抗体文库分离的抗体，和通过涉及将人免疫球蛋白基因序列的全部或部分剪接至其它DNA序列的任意其它方式制备、表达、建立或分离的抗体。这样的重组人抗体具有可变区，其中框架和CDR区域源自人种系免疫球蛋白序列。但是，在某些实施方案中，可以对这样的重组人抗体进行体外诱变(或当使用人Ig序列的转基因动物时，体内体细胞诱变)，且因而重组抗体的VH和VL区域的氨基酸序列是这样的序列：其尽管源自人种系VH和VL序列和与人种系VH和VL序列有关，但是不可能天然存在于体内人抗体种系谱系内。

本文中使用的“同种型”表示由重链恒定区基因提供的抗体类别(例如，IgM、IgE、IgG诸如IgG1或IgG4)。

短语“识别抗原的抗体”和“对抗原特异性的抗体”和“与抗原特异性地反应的抗体”在本文中与术语“特异性地结合抗原的抗体”可互换地使用。

本文中使用的“特异性地结合蛋白生物标志物”的抗体或蛋白意图表示以100nM或更小、10nM或更小、1nM或更小、100pM或更小或10pM或更小的K_D结合所述蛋白生物标志物的抗体或蛋白。

本文中使用的术语“Kassoc”或“Ka”意图表示特定抗体-抗原相互作用的结合速率，而本文中使用的术语“Kdis”或“Kd”意图表示特定抗体-抗原相互作用的解离速率。

本文中使用的术语“K_D”意图表示解离常数，其得自Kd与Ka的比率(即Kd/Ka)，且表达为摩尔浓度(M)。使用本领域中充分确立的方法可以确定抗体的K_D值。一种用于确定抗体的K_D的方法是通过使用表面等离子体共振或使用生物传感器系统诸如

系统。

本发明的预测或监测试剂盒还可以包括用于在免疫测定中检测或定量捕获抗体的抗体。

例如，本发明的监测或预测试剂盒可以包括用于在免疫测定中检测或定量生物标志物蛋白/抗体复合物的第二抗体。因此，所述监测或预测试剂盒包含

(i)一组未标记的抗体，其各自结合一种或多种具体地选自表皮生长因子(EGF)、单核细胞趋化蛋白1(MCP1)和转化生长因子α(TGF-α)的预测性生物标志物，和/或

(ii)一组标记的抗体，其各自结合一种或多种具体地选自表皮生长因子(EGF)、单核细胞趋化蛋白1(MCP1)和转化生长因子α(TGF-α)的预测性生物标志物，

可替换地，所述试剂盒可以包含：

(i)第一组未标记的抗体，其各自结合一种或多种具体地选自表皮生长因子(EGF)、单核细胞趋化蛋白1(MCP1)和转化生长因子α(TGF-α)的预测性生物标志物，

(ii)第二组标记的抗体，其结合所述第一组标记的抗体以形成生物标志物/第一抗体/第二抗体复合物。

在本发明的试剂盒中使用的标记的抗体通常可以包含与报告分子缀合的抗体。在如上定义的试剂盒的具体实施方案中，所述标记的抗体是与酶缀合的抗体，所述酶是例如用于ELISA测定的酶，诸如尤其是辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶。所述试剂盒还可以包括这样的酶的对应底物。

可替换地，所述标记的抗体是与荧光化合物(例如，氟化荧光素或罗丹明)缀合的抗体。

如上定义的试剂盒还可以包括结合NGAL的抗体(未标记的和/或标记的)。

任选地，本发明的所述监测或预测试剂盒还可以包含用于检测和/或定量一种或多种参考(对照)标志物的装置，所述参考(对照)标志物是例如与无所不在地表达的蛋白对应的标志物或CKD的其它生物标志物(诸如肌酸酐或白蛋白)。

在一个具体实施方案中，用在免疫测定中的本发明的试剂盒至少包含：

(i)对表皮生长因子(EGF)特异性的抗体；

(ii)对单核细胞趋化蛋白1(MCP1)特异性的抗体；和，

(iii)对转化生长因子α(TGF-α)特异性的抗体。

用在本发明的试剂盒中的所述抗体可以固定在支持物上，所述支持物是例如玻璃或聚合物，更具体地是选自纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯的聚合物。所述固体支持物可以呈试管、珠子、微量培养板的圆盘或适合用于进行免疫测定的任意其它表面的形式。

本发明的预测试剂盒和监测试剂盒可以任选地包含可用于执行本发明的方法的另外组分。作为例子，所述试剂盒可以包含适合于抗体与蛋白(所述抗体与它特性地结合)的结合的流体(例如缓冲液)、一个或多个样品隔室、洗涤反应物以除去非特异性结合和描述本发明的预测或监测方法的性能的指导材料等。

本发明的另一个方面提供了适合用于进行本发明的预测或监测方法的装置，所述装置包含：

a)分析单元，其包含特异性地结合生物标志物(例如如上面在试剂盒中描述的抗体)的检测装置的组合，所述分析单元适合用于在体外使来自受试者的样品与检测剂接触；

b)评价单元，其包括计算装置，所述计算装置具有数据库和在所述数据库上的计算机执行的算法，所述计算机执行的算法当由所述计算装置执行时确定来自受试者的样品(例如，尿样品)中的一种或多种预测性生物标志物的量，并将确定的所述一种或多种预测性生物标志物的量与对应对照值进行对比，并且如果所述一种或多种预测性生物标志物的量显著不同于(例如显著大于或低于)对照值，则提供快速进展的预测。

在一个具体实施方案中，所述数据库还包括每种预测性生物标志物的对照值。

实施例

方法

NephroTest组群方案

从NephroTest组群募集患者，所述NephroTest组群自它在2000年开始以来迄今为止包括1825位用血浆和/或尿样品测量mGFR的患者。所述NephroTest组群由来自巴黎的三个大肾脏病学中心

Européen Georges Pompidou、

Bichat和

Tenon的患者组成。所述组群的包括标准是具有任何阶段的CKD的同意成年患者。排除标准是已经处于任何形式的肾替代疗法的患者和怀孕患者。所述方案中的尿收集生物库开始于2009年。我们分析了来自229位患者的数据，在他们中存在储存的尿r收集和2次或更多次随时间的并行mGFR以便评估疾病进展。组群中的这些患者从第一次尿收集的时间开始的中值随访时间是21.6(IQR，13.6-24.7)个月，且这些患者中的57位从第一次尿收集时间具有至多3次连续mGFR。分析了来自这229位患者的第一次尿收集。从患者收集的临床和生物学数据如前面所述³¹。

NephroTest组群研究得到法国健康和医学研究协会(French Institute ofHealth and Medical Research，INSERM)批准和资助。所有患者提供关于冷冻生物样品的长期处理和用于研究使用的预先规定的临床和生物学数据的书面知情同意书。根据良好临床试验规范指南进行研究。

技术方法(尿生物标志物测量)

收集尿并在4℃的最多4小时时段以后在-80℃储存。在含有抗蛋白酶(cOmplete；Protease Inhibitor Cocktail Tablets，Roche applied Science)的试管中在1000g初步离心10分钟以后储存尿上清液。

使用的生物标志物ELISA试剂盒是：R&D系统，其针对半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、表皮生长因子(EGF)、生长和分化因子15(GDF15)、白介素6(IL6)、单核细胞趋化蛋白1(MCP1)、基质金属蛋白酶9(MMP9)、骨桥蛋白、肾损伤分子1(KIM1)、组织金属蛋白酶抑制剂1(TIMP1)、转化生长因子α(TGF-α)和血管内皮生长因子A(VEGFA)；eBioscience，其针对纤连蛋白和白血病抑制因子(LIF)；Bioporto，其针对嗜中性粒细胞明胶酶相关的脂质运载蛋白(NGAL)；CMIc，其针对脂肪酸结合蛋白1(FABP1)；和MdBiproduct，其针对尿调制蛋白。在使用之前按照严格标准正式地验证所有ELISA试剂盒[未发表的资料]。

使用针对同位素稀释质谱法(IDMS)标准化的酶促方法，在

NeckerEnfants-Malades在生物化学实验室中测量尿肌酸酐。在医院实验室中通过标准方法测量尿蛋白和白蛋白。

CKD进展的测量和定义

如在别处报道的，NephroTest组群中的所有患者具有通过铬-51标记的乙二胺四乙酸(EDTA)清除率测量的GFR³¹。使用平常的线性回归估计以mL/min/年为单位的各个斜率。我们然后计算相对mGFR斜率(以每年的百分比为单位)并将患者分类成两组基线mGFR的下降速率：每年≤10％相对于>10％。还使用肾病公式的改进³²计算估计的GFR(eGFR)，并然后针对体表面积(BSA)未调节得到的值以允许eGFR与对应的mGFR值的直接对比。

统计分析

在适当时，将临床和实验室数据表达为百分比、平均值(±标准差，SD)或中值(四分位距，IQR)。生物标志物、白蛋白尿和蛋白尿与肌酸酐比率具有不对称的分布，且因而随后进行对数转换。NGAL和半胱氨酸蛋白酶抑制剂C需要两次连续对数变换才能达到正态分布。然后使用性别特异性的平均值和SD将对数转换的值标准化至0的平均值和1的SD，即(测量值-平均值)/SD，以解释性别相关的差异。

我们在缓慢和快速进展者之间对比了基线临床和实验室数据和CKD风险因素(使用mGFR的每年下降的10％的截止)。将连续变量与Wilcoxon检验进行对比，并将类别变量与卡方或Fisher氏精确检验进行对比。类似地试验了关于生物标志物和mGFR斜率的性别差异。首先使用Pearsons关联评估了在第一次就诊时在生物标志物和并行mGFR之间以及在生物标志物和mGFR的变化百分比之间的关联。然后使用逻辑回归估计每种生物标志物的快速进展的原始的和经调节的比值比(OR)。针对随时间的平均mGFR和基线协变量依次调节OR：年龄、性别、非洲黑人起源、BMI、平均血压、糖尿病、心血管疾病史、吸烟、肾素血管紧张素醛固酮系统(RAAS)阻断诸如血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)或血管紧张素受体阻滞剂(ARB)治疗，和最后的白蛋白尿。将平均mGFR(而不是基线mGFR)用作分析中的协变量以减轻‘向平均值回归’的现象³。

为了确定生物标志物的最佳组合以预测CKD进展，基本上从病理生理学假设推测地构建了几个组合生物标志物和白蛋白尿的逻辑回归模型。与CKD进展单个地相关的生物标志物在所述模型中是有利的，但是我们避免了一起加入以超过0.55(Pearson关联)彼此相关或与白蛋白尿相关的生物标志物。另外针对平均GFR和其它显著相关的因素(诸如募集中心和糖尿病)调节这些模型以限制协变量的数目。将6个如此构建的模型与仅含有白蛋白尿和相同调节协变量、但是不含生物标志物的嵌套最低模型进行对比。我们计算了受试者操作特征(ROC)曲线下面积(AUC)、似然比检验(LRT)、比例尺brier评分(SBS)和积分鉴别指数(IDI)以评估这些预测模型用于CKD进展的性能。通过将这些模型的AUC与最小参考模型进行对比，估计预测值的改善。

用SAS 9.2(SAS Institute Inc.，Cary，NC USA)、R2.3(R Foundation forStatistical Computing，Vienna，奥地利，2014)和prism graphpad 5.0执行动物数据的统计分析。

结果

患者表征和CKD进展

我们用重复的mGFR和并行尿收集在229位患者中进行了分析。存在152位(66.4％)男性，且在基线时(即在执行第一次尿收集时)的平均年龄是60.8±13.3岁。中值基线mGFR是38.3(IQR，26.4-49.6)ml/min。在21.6(IQR，13.6-24.7)个月的中值随访时间以后在最后一次就诊时的中值mGFR是34.7(IQR，24.7-47.5)ml/min。mGFR的变化是-1.46(IQR，-4.28，1.08)ml/min/年，相当于从基线每年-4.0(IQR，-12，2.7)％(负值代表减少)。68位(30％)患者被定义为‘快速进展者’(每年它们的mGFR减少大于10％)。缓慢和快速进展者的基线特征显示在表2中。白蛋白尿在快速进展者中显著更高，且糖尿病更频繁。尽管大多数患者(89％)接受ACEI或ARB治疗，较高比例的快速进展者接受治疗(96％相对于86％，p＜0.04)。如预期的，在随访过程中快速进展者的中值mGFR低于缓慢进展者(中值IQR：29.3(20.0，37.5)相对于40.9(30.1，52.3)ml/min，p＜0.0001)，且基线mGFR在快速进展者中明显更低(p＝0.06)。重要的是，用于估计进展速率的mGFR测量的数目在两个组之间没有显著不同(超过2次就诊，47％相对于38％，p＝0.2)。

表2：NephroTest患者的基线特征.

ACEI：血管紧张素转换酶抑制剂；ARB：血管紧张素受体阻滞剂；mGFR：通过铬标记的EDTA测量的肾小球滤过率；PKD：多囊性肾病。

将数据表达为平均值±标准差(SD)、中值(四分位距(IQR))或百分比(患者的数目(n))。

生物标志物表征和性别分布

在生物标志物TIMP1、VEGFA、KIM1和骨桥蛋白中，其中仅小于5％的患者具有落在检测下限(LLD)以下的值，为每位患者输入LLD的值的一半(在每种情况下输入不超过5个值)。在生物标志物(蛋白尿、白蛋白尿和FABP1)中，5-10％的患者受到影响，输入0-1之间的随机值乘以LLD值。最后，描述了生物标志物MMP9、IL6和LIF，其中超过20％的患者具有低于LLD的值，但是没有被包括在我们的随后分析中。

组群中的生物标志物分布详述在表3中。五种生物标志物的分布被性别改变(没有包括MMP9和LIF)。我们在基线处在女性中发现了显著更高的NGAL、TGF-α和尿调制蛋白的水平。相反，我们还在男性中观察到较高的TIMP1和VEGFA水平。在男性和女性之间不存在关于体表面积(BSA)标准化的基线mGFR的差异(36.8相对于34.6ml/min/1.73m²，p＝0.3)。‘快速进展者’男性的比例没有显著不同于‘缓慢进展者’男性(68％相对于66％，p＝0.8，表1)。

表3.通过性别的尿生物标志物分布

给出的值针对尿肌酸酐浓度进行了调节。

N，患者的数目；IQR，四分位距；min：记录的最小值；max：记录的最大值；EGF，表皮生长因子；FABP1，脂肪酸结合蛋白1；GDF15，生长分化因子15；IL6，白介素6；KIM1，肾损伤分子1；LIF，白血病抑制因子；MMP9，基质金属蛋白酶9；MCP1，单核细胞趋化蛋白1；NGAL，嗜中性粒细胞明胶酶相关的脂质运载蛋白；TIMP1，组织金属蛋白酶抑制剂1；TGF-α，转化生长因子α；VEGFA血管内皮生长因子A。

与CKD进展有关的单一生物标志物

我们没有观察到基线mGFR和进展的变化百分比之间的关联(r＝-0.06，p＝0.4)。我们然后研究了尿蛋白水平和成为‘快速进展者’的风险之间的关联。我们最初单个地研究了每种生物标志物，并然后随后针对CKD进展的已知重要风险因素依次调节每种生物标志物，包括在多变量逻辑回归分析中的白蛋白尿(表4)。如预期的，处于‘快速进展者’状态的风险被白蛋白尿和/或蛋白尿增加。它也被半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、FABP1、纤连蛋白、GDF15、KIM1、MCP1、NGAL、TIMP1、TGF-α和VEGFA的水平的升高增加。但是，所述风险被EGF的增加降低。当将CKD进展的传统风险因素加入回归模型时，所述风险减弱，且通过针对白蛋白尿进行调节会进一步减弱(表4)。但是，在考虑所有这些因素的作用以后，纤连蛋白、MCP1、TIMP1和TGF-α保持与所述风险显著相关。令人感兴趣的是，TGF-α(OR2.34)对进展影响大小高于白蛋白尿(OR1.72)。

表4：生物标志物与‘快速进展者’(每年>10％的mGFR下降)状态的风险的关联.

缩写：mGFR，测量的肾小球滤过率；OR，比值比；CI，置信区间；EGF，表皮生长因子；FABP1，脂肪酸结合蛋白；GDF15，生长和分化因子15；KIM1，肾损伤分子1；MCP1，单核细胞趋化蛋白1；NGAL，嗜中性粒细胞明胶酶相关的脂质运载蛋白；TIMP1，组织金属蛋白酶抑制剂1，TGF-α，转化生长因子α，VEGFA，血管内皮生长因子A。

呈现的OR是按照性别-特异性的标准差(SD)单位增加(对数转换以后)。*协变量：年龄、身体质量指数、平均动脉压、性别、非洲黑人种族划分、糖尿病、心血管疾病史、吸烟者、血管紧张素转换酶抑制剂或血管紧张素受体阻滞剂和募集中心。

组合尿生物标志物以预测CKD进展

将6个组合4-6种生物标志物的不同模型与使用白蛋白尿的参考模型进行了对比(表5)。

表5：给出与快速进展风险有关的6种不同模型的生物标志物组合：*‘快速进展者’状态的比值比(95％CI)(每年>10％的mGFR下降).

缩写：CI，置信区间；SD，标准差；EGF，表皮生长因子；GDF15，生长和分化因子15；TGF-α，转化生长因子α；MCP1，单核细胞趋化蛋白1；FABP1，脂肪酸结合蛋白；KIM1，肾损伤分子1；NGAL，嗜中性粒细胞明胶酶相关的脂质运载蛋白；TIMP1，组织金属蛋白酶抑制剂1；LRT，似然比检验；df，自由度；Ref，参考模型；AUC，曲线下面积；SBS，比例尺Brier评分；IDI，积分的鉴别指数；rIDI，相对IDI。*呈现的比值比是按照性别-特异性的SD单位增加(对数转换以后)。针对就诊、糖尿病和募集中心之间的平均mGFR调节模型。

模型是基于具有反映每个模型内＜0.55的不同病理生理学过程和生物标志物间关联的生物标志物。仅针对平均mGFR和针对显著相关的因子即糖尿病和(NephroTest)募集中心调节这些模型。所有使用生物标志物的模型比没有生物标志物的参考模型更好地执行(表5，似然比检验)，但是根据所有采用的性能标准，含有EGF、GDF15、MCP1、NGAL和TGF-α的模型(模型5)是最佳模型。具体地，模型5中的生物标志物使受试者操作特征(ROC)曲线的曲线下面积(AUC)从0.77显著增加至来自参考模型(含有白蛋白且没有其它生物标志物)的0.85(p＝0.006)。支持这些结果的是，我们还进行了逐步回归分析，没有关于生物标志物的功能作用或生物标志物间关联的推测假设，并且有趣地刚好得到相同的生物标志物组合。

因为没有发现GDF15与模型中的进展相关(OR 0.99(0.63-1.54))，我们试验了并观察到，当从模型除去时，该新模型的性能标准未受影响(数据未显示)。令人惊奇的是，我们还观察到在我们的模型中与EGF类似的NGAL似乎会赋予保护作用(表5)。这似乎与它对疾病进展的单独作用相反，在后者中它与增加的成为‘快速进展者’的风险有关。针对其它生物标志物调节以后以三分位数(而不是连续地)分析NGAL会揭示它与进展的复杂关联(J-形模式)(图3)。因为这些原因，通过除去GDF15和NGAL可以简化模型5，并且我们提供了预测快速进展的最终模型，其除了白蛋白尿以外还含有EGF、MCPl和TGF-α，具有0.84的c-统计值，仍然优于白蛋白和其它风险因素的c-统计值(参见图1)。

对比mGFR和eGFR

在我们的最终模型中使用eGFR替代mGFR来定义CKD进展会给我们提供不同的结果。仅TGF-α和白蛋白在简化的模型5中保持与进展显著相关，分别具有1.51(1.07-2.12)和1.55(1.05-2.27))的OR(95％CI)，但是EGF和MCP1都没有保持相关，分别具有0.72(0.45-1.15)和1.21(0.86-1.69)。如预期的，eGFR和mGFR之间的关联较高(r＝0.87)，且用所述式与黄金标准相比高估了GFR(中值偏差IQR 2.60(1.46，3.76))。使用mGFR或eGFR，快速进展者(每年>10％的GFR下降)的比例保持相同(29.69％)。但是，我们观察到，在由mGFR定义的组群的68位‘快速进展者’中，使用eGFR仅将38位(56％)正确地分类为‘快速进展者’，从而给出eGFR关于鉴别‘快速进展者’的非常低的灵敏度(图2)。

讨论

我们使用该模型在我们的组群中没有发现预测性的改善，因为我们的结果量度是不同的。但是，有趣的是，观察该新生物标志物标记的添加是否会改善预测。

应当承认，RAAS阻断会减慢CKD进展。这里观察到更多的快速进展者是在接受ACEI和ARB药物，这最可能反映临床医师对‘快速速进展者’组中的更高白蛋白尿水平(与该组中RAAS阻断的相反效应相比)的应答⁴²。

这从我们的对比两种技术的结果特别容易看出，因为我们在这里证实了eGFR在检测疾病进展中的降低许多的灵敏度。在发现(观察性研究诸如这个)的上下文中，具有严格mGFR的充分表征的患者组群已经是非常有用的。具有非常准确的mGFR在这里使我们能够将我们的患者以他们的真实进展者状态正确地分类，且作为后果，我们可以将此与相对小组群中的生物标志物的变化准确地关联，并且仍然导致有效重大发现，其尚不可能使用不太准确的eGFR，其中需要更大的患者数目。

因为CKD的进展是一个涉及许多途径的复杂病理生理学过程，可能需要几种生物标志物(而不是一种独特生物标志物)的组合来做出准确的预测。尽管该组群是相对小的组群并且大多数患者在随访阶段中仅具有两种mGFR，它具有几个优点。已经讨论了mGFR的应用，但是另外这也是人种上不同的组群且含有不同病理学的良好表现，这解释了在登记中的CKD。由于冗余度，我们设法减少我们的最终模型中的生物标志物的数目。

综上所述，我们提议将TGF-α、EGF和MCP1与白蛋白和人口统计风险因素一起作为要在疾病过程的早期潜在地使用的、CKD进展的新分子标记。

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序列表

<110> 豪夫迈·罗氏有限公司/法国国家健康医学研究院

<120> 慢性肾脏疾病的快速进展的生物标志物

<130> ROCHE 001

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1207

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

Met Leu Leu Thr Leu Ile Ile Leu Leu Pro Val Val Ser Lys Phe Ser

1 5 10 15

Phe Val Ser Leu Ser Ala Pro Gln His Trp Ser Cys Pro Glu Gly Thr

20 25 30

Leu Ala Gly Asn Gly Asn Ser Thr Cys Val Gly Pro Ala Pro Phe Leu

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Ile Phe Ser His Gly Asn Ser Ile Phe Arg Ile Asp Thr Glu Gly Thr

50 55 60

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65 70 75 80

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Leu Leu Gln Arg Val Phe Leu Asn Gly Ser Arg Gln Glu Arg Val Cys

100 105 110

Asn Ile Glu Lys Asn Val Ser Gly Met Ala Ile Asn Trp Ile Asn Glu

115 120 125

Glu Val Ile Trp Ser Asn Gln Gln Glu Gly Ile Ile Thr Val Thr Asp

130 135 140

Met Lys Gly Asn Asn Ser His Ile Leu Leu Ser Ala Leu Lys Tyr Pro

145 150 155 160

Ala Asn Val Ala Val Asp Pro Val Glu Arg Phe Ile Phe Trp Ser Ser

165 170 175

Glu Val Ala Gly Ser Leu Tyr Arg Ala Asp Leu Asp Gly Val Gly Val

180 185 190

Lys Ala Leu Leu Glu Thr Ser Glu Lys Ile Thr Ala Val Ser Leu Asp

195 200 205

Val Leu Asp Lys Arg Leu Phe Trp Ile Gln Tyr Asn Arg Glu Gly Ser

210 215 220

Asn Ser Leu Ile Cys Ser Cys Asp Tyr Asp Gly Gly Ser Val His Ile

225 230 235 240

Ser Lys His Pro Thr Gln His Asn Leu Phe Ala Met Ser Leu Phe Gly

245 250 255

Asp Arg Ile Phe Tyr Ser Thr Trp Lys Met Lys Thr Ile Trp Ile Ala

260 265 270

Asn Lys His Thr Gly Lys Asp Met Val Arg Ile Asn Leu His Ser Ser

275 280 285

Phe Val Pro Leu Gly Glu Leu Lys Val Val His Pro Leu Ala Gln Pro

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Lys Ala Glu Asp Asp Thr Trp Glu Pro Glu Gln Lys Leu Cys Lys Leu

305 310 315 320

Arg Lys Gly Asn Cys Ser Ser Thr Val Cys Gly Gln Asp Leu Gln Ser

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His Leu Cys Met Cys Ala Glu Gly Tyr Ala Leu Ser Arg Asp Arg Lys

340 345 350

Tyr Cys Glu Asp Val Asn Glu Cys Ala Phe Trp Asn His Gly Cys Thr

355 360 365

Leu Gly Cys Lys Asn Thr Pro Gly Ser Tyr Tyr Cys Thr Cys Pro Val

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Gly Phe Val Leu Leu Pro Asp Gly Lys Arg Cys His Gln Leu Val Ser

385 390 395 400

Cys Pro Arg Asn Val Ser Glu Cys Ser His Asp Cys Val Leu Thr Ser

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Gly Lys Thr Cys Ser Gly Cys Ser Ser Pro Asp Asn Gly Gly Cys Ser

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Gln Leu Cys Val Pro Leu Ser Pro Val Ser Trp Glu Cys Asp Cys Phe

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Pro Gly Tyr Asp Leu Gln Leu Asp Glu Lys Ser Cys Ala Ala Ser Gly

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Pro Gln Pro Phe Leu Leu Phe Ala Asn Ser Gln Asp Ile Arg His Met

485 490 495

His Phe Asp Gly Thr Asp Tyr Gly Thr Leu Leu Ser Gln Gln Met Gly

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Met Val Tyr Ala Leu Asp His Asp Pro Val Glu Asn Lys Ile Tyr Phe

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Gln Arg Glu Arg Leu Ile Glu Glu Gly Val Asp Val Pro Glu Gly Leu

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Gly Lys Leu Cys Ser Asp Ile Asp Glu Cys Glu Met Gly Val Pro Val

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<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 2

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Val Leu Leu Val Leu Ser Trp Leu Pro His Gly Gly Ala Leu Ser Leu

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Ala Glu Ala Ser Arg Ala Ser Phe Pro Gly Pro Ser Glu Leu His Ser

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Glu Asp Ser Arg Phe Arg Glu Leu Arg Lys Arg Tyr Glu Asp Leu Leu

50 55 60

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Ser Gly Gly His Leu His Leu Arg Ile Ser Arg Ala Ala Leu Pro Glu

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Pro Pro Pro Ser Gln Ser Asp Gln Leu Leu Ala Glu Ser Ser Ser Ala

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Arg Pro Gln Leu Glu Leu His Leu Arg Pro Gln Ala Ala Arg Gly Arg

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<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

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Leu Ala Ala Cys Gln Ala Leu Glu Asn Ser Thr Ser Pro Leu Ser Ala

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<210> 4

<211> 99

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 4

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1 5 10 15

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<213> 智人（Homo sapiens）

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1 5 10 15

Val Ala Leu Ala Val Ser Pro Ala Ala Gly Ser Ser Pro Gly Lys Pro

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Lys Cys Lys Pro Thr Cys Ser Gly Thr Arg Phe Arg Ser Gly Ser Val

580 585 590

Ile Asp Gln Ser Arg Val Leu Asn Leu Gly Pro Ile Thr Arg Lys Gly

595 600 605

Val Gln Ala Thr Val Ser Arg Ala Phe Ser Ser Leu Gly Leu Leu Lys

610 615 620

Val Trp Leu Pro Leu Leu Leu Ser Ala Thr Leu Thr Leu Thr Phe Gln

625 630 635 640

<210> 12

<211> 232

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 12

Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly

20 25 30

Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln

35 40 45

Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu

50 55 60

Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu

65 70 75 80

Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro

85 90 95

Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His

100 105 110

Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys

115 120 125

Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Lys Ser Val

130 135 140

Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Tyr

145 150 155 160

Lys Ser Trp Ser Val Tyr Val Gly Ala Arg Cys Cys Leu Met Pro Trp

165 170 175

Ser Leu Pro Gly Pro His Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys

180 185 190

His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn

195 200 205

Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr

210 215 220

Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg

225 230

<210> 13

<211> 314

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 13

Met Arg Ile Ala Val Ile Cys Phe Cys Leu Leu Gly Ile Thr Cys Ala

1 5 10 15

Ile Pro Val Lys Gln Ala Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu Lys Gln Leu

20 25 30

Tyr Asn Lys Tyr Pro Asp Ala Val Ala Thr Trp Leu Asn Pro Asp Pro

35 40 45

Ser Gln Lys Gln Asn Leu Leu Ala Pro Gln Asn Ala Val Ser Ser Glu

50 55 60

Glu Thr Asn Asp Phe Lys Gln Glu Thr Leu Pro Ser Lys Ser Asn Glu

65 70 75 80

Ser His Asp His Met Asp Asp Met Asp Asp Glu Asp Asp Asp Asp His

85 90 95

Val Asp Ser Gln Asp Ser Ile Asp Ser Asn Asp Ser Asp Asp Val Asp

100 105 110

Asp Thr Asp Asp Ser His Gln Ser Asp Glu Ser His His Ser Asp Glu

115 120 125

Ser Asp Glu Leu Val Thr Asp Phe Pro Thr Asp Leu Pro Ala Thr Glu

130 135 140

Val Phe Thr Pro Val Val Pro Thr Val Asp Thr Tyr Asp Gly Arg Gly

145 150 155 160

Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg Ser Lys Ser Lys Lys Phe Arg Arg

165 170 175

Pro Asp Ile Gln Tyr Pro Asp Ala Thr Asp Glu Asp Ile Thr Ser His

180 185 190

Met Glu Ser Glu Glu Leu Asn Gly Ala Tyr Lys Ala Ile Pro Val Ala

195 200 205

Gln Asp Leu Asn Ala Pro Ser Asp Trp Asp Ser Arg Gly Lys Asp Ser

210 215 220

Tyr Glu Thr Ser Gln Leu Asp Asp Gln Ser Ala Glu Thr His Ser His

225 230 235 240

Lys Gln Ser Arg Leu Tyr Lys Arg Lys Ala Asn Asp Glu Ser Asn Glu

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Phe His Ser His Glu Phe His Ser His Glu Asp Met Leu Val Val Asp

275 280 285

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290 295 300

Glu Leu Asp Ser Ala Ser Ser Glu Val Asn

305 310

<210> 14

<211> 212

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 14

Met Asn Ser Phe Ser Thr Ser Ala Phe Gly Pro Val Ala Phe Ser Leu

1 5 10 15

Gly Leu Leu Leu Val Leu Pro Ala Ala Phe Pro Ala Pro Val Pro Pro

20 25 30

Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala Pro His Arg Gln Pro Leu Thr

35 40 45

Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr Ile Leu Asp Gly Ile

50 55 60

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65 70 75 80

Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala

85 90 95

Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu

100 105 110

Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr

115 120 125

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180 185 190

Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser Ser Leu Arg Ala

195 200 205

Leu Arg Gln Met

210

<210> 15

<211> 202

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 15

Met Lys Val Leu Ala Ala Gly Val Val Pro Leu Leu Leu Val Leu His

1 5 10 15

Trp Lys His Gly Ala Gly Ser Pro Leu Pro Ile Thr Pro Val Asn Ala

20 25 30

Thr Cys Ala Ile Arg His Pro Cys His Asn Asn Leu Met Asn Gln Ile

35 40 45

Arg Ser Gln Leu Ala Gln Leu Asn Gly Ser Ala Asn Ala Leu Phe Ile

50 55 60

Leu Tyr Tyr Thr Ala Gln Gly Glu Pro Phe Pro Asn Asn Leu Asp Lys

65 70 75 80

Leu Cys Gly Pro Asn Val Thr Asp Phe Pro Pro Phe His Ala Asn Gly

85 90 95

Thr Glu Lys Ala Lys Leu Val Glu Leu Tyr Arg Ile Val Val Tyr Leu

100 105 110

Gly Thr Ser Leu Gly Asn Ile Thr Arg Asp Gln Lys Ile Leu Asn Pro

115 120 125

Ser Ala Leu Ser Leu His Ser Lys Leu Asn Ala Thr Ala Asp Ile Leu

130 135 140

Arg Gly Leu Leu Ser Asn Val Leu Cys Arg Leu Cys Ser Lys Tyr His

145 150 155 160

Val Gly His Val Asp Val Thr Tyr Gly Pro Asp Thr Ser Gly Lys Asp

165 170 175

Val Phe Gln Lys Lys Lys Leu Gly Cys Gln Leu Leu Gly Lys Tyr Lys

180 185 190

Gln Ile Ile Ala Val Leu Ala Gln Ala Phe

195 200

<210> 16

<211> 707

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 16

Met Ser Leu Trp Gln Pro Leu Val Leu Val Leu Leu Val Leu Gly Cys

1 5 10 15

Cys Phe Ala Ala Pro Arg Gln Arg Gln Ser Thr Leu Val Leu Phe Pro

20 25 30

Gly Asp Leu Arg Thr Asn Leu Thr Asp Arg Gln Leu Ala Glu Glu Tyr

35 40 45

Leu Tyr Arg Tyr Gly Tyr Thr Arg Val Ala Glu Met Arg Gly Glu Ser

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Lys Ser Leu Gly Pro Ala Leu Leu Leu Leu Gln Lys Gln Leu Ser Leu

65 70 75 80

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100 105 110

Asp Leu Lys Trp His His His Asn Ile Thr Tyr Trp Ile Gln Asn Tyr

115 120 125

Ser Glu Asp Leu Pro Arg Ala Val Ile Asp Asp Ala Phe Ala Arg Ala

130 135 140

Phe Ala Leu Trp Ser Ala Val Thr Pro Leu Thr Phe Thr Arg Val Tyr

145 150 155 160

Ser Arg Asp Ala Asp Ile Val Ile Gln Phe Gly Val Ala Glu His Gly

165 170 175

Asp Gly Tyr Pro Phe Asp Gly Lys Asp Gly Leu Leu Ala His Ala Phe

180 185 190

Pro Pro Gly Pro Gly Ile Gln Gly Asp Ala His Phe Asp Asp Asp Glu

195 200 205

Leu Trp Ser Leu Gly Lys Gly Val Val Val Pro Thr Arg Phe Gly Asn

210 215 220

Ala Asp Gly Ala Ala Cys His Phe Pro Phe Ile Phe Glu Gly Arg Ser

225 230 235 240

Tyr Ser Ala Cys Thr Thr Asp Gly Arg Ser Asp Gly Leu Pro Trp Cys

245 250 255

Ser Thr Thr Ala Asn Tyr Asp Thr Asp Asp Arg Phe Gly Phe Cys Pro

260 265 270

Ser Glu Arg Leu Tyr Thr Gln Asp Gly Asn Ala Asp Gly Lys Pro Cys

275 280 285

Gln Phe Pro Phe Ile Phe Gln Gly Gln Ser Tyr Ser Ala Cys Thr Thr

290 295 300

Asp Gly Arg Ser Asp Gly Tyr Arg Trp Cys Ala Thr Thr Ala Asn Tyr

305 310 315 320

Asp Arg Asp Lys Leu Phe Gly Phe Cys Pro Thr Arg Ala Asp Ser Thr

325 330 335

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Pro Thr Ala Gly Pro Thr Gly Pro Pro Ser Ala Gly Pro Thr Gly Pro

485 490 495

Pro Thr Ala Gly Pro Ser Thr Ala Thr Thr Val Pro Leu Ser Pro Val

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515 520 525

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530 535 540

Gly Arg Gly Ser Arg Pro Gln Gly Pro Phe Leu Ile Ala Asp Lys Trp

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Pro Ala Leu Pro Arg Lys Leu Asp Ser Val Phe Glu Glu Arg Leu Ser

565 570 575

Lys Lys Leu Phe Phe Phe Ser Gly Arg Gln Val Trp Val Tyr Thr Gly

580 585 590

Ala Ser Val Leu Gly Pro Arg Arg Leu Asp Lys Leu Gly Leu Gly Ala

595 600 605

Asp Val Ala Gln Val Thr Gly Ala Leu Arg Ser Gly Arg Gly Lys Met

610 615 620

Leu Leu Phe Ser Gly Arg Arg Leu Trp Arg Phe Asp Val Lys Ala Gln

625 630 635 640

Met Val Asp Pro Arg Ser Ala Ser Glu Val Asp Arg Met Phe Pro Gly

645 650 655

Val Pro Leu Asp Thr His Asp Val Phe Gln Tyr Arg Glu Lys Ala Tyr

660 665 670

Phe Cys Gln Asp Arg Phe Tyr Trp Arg Val Ser Ser Arg Ser Glu Leu

675 680 685

Asn Gln Val Asp Gln Val Gly Tyr Val Thr Tyr Asp Ile Leu Gln Cys

690 695 700

Pro Glu Asp

705

Claims (5)

1.用于评估获自受试者的生物样品中的生物标志物的表达的试剂在制备用于预测受试者中的慢性肾脏疾病的快速进展的试剂盒中的应用，其中所述生物标志物是转化生长因子α(TGF-α)、表皮生长因子(EGF)和单核细胞趋化蛋白1(MCP1)，和嗜中性粒细胞明胶酶-相关的脂质运载蛋白(NGAL)，其中所述生物样品是尿样品，和所述表达是蛋白表达，其中所述受试者的生物样品中的一种或多种选定生物标志物的表达被定量以得到每种定量生物标志物的表达值，和用于与对应对照值进行对比，其中高于在对照值的TGFα的表达值和低于对照值的EGF的表达值和高于在对照值的MCP1的表达值和高于在对照值的NGAL的表达值指示所述受试者处于增加的快速进展风险中。

2.根据权利要求1所述的应用，其中所述试剂盒进一步包含用于评价选自由下述组成的组的一种或多种生物标志物的表达的试剂：生长和分化因子15(GDF15)、嗜中性粒细胞明胶酶-相关的脂质运载蛋白(NGAL)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、脂肪酸结合蛋白(FABP)、纤连蛋白、肾损伤分子1(KIM1)、骨桥蛋白、组织金属蛋白酶抑制剂1(TIMP1)、尿调制蛋白、白介素-6(IL6)、白血病抑制因子(LIF)、基质金属肽酶9(MMP9)和血管内皮生长因子A(VEGFA)。

3.根据权利要求1所述的应用，其中所述表达是蛋白表达，如在免疫测定中所定量的。

4.根据权利要求1所述的应用，其中被预测为快速进展的受试者是处于每年减小超过10％的基线测量肾小球滤过率(mGFR)的风险的受试者。

5.根据权利要求1所述的应用，其中然后选择所述被预测为快速进展的受试者用治疗慢性肾脏疾病的治疗剂进行治疗。

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