CN114286942A - 检测癌症的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用包含至少一种细胞因子分子和至少一种无细胞染色质片段的组合生物标志物组检测癌症的体液试验方法。

Description

检测癌症的方法
技术领域
本发明涉及使用包含至少一种细胞因子分子和至少一种无细胞染色质片段的组合生物标志物组检测癌症的体液试验方法。
背景技术
癌症是具有高死亡率的常见疾病。该疾病的生物学被理解为涉及从癌前状态到I、II、III期和最终IV期癌症的进展。对于大多数癌症疾病,死亡率变化很大,这取决于疾病是在早期局部阶段检测到(当可得到有效治疗选项时),还是当疾病可能已经在感染器官内或超出感染器官扩散的晚期阶段时检测到(当治疗更困难时)。晚期癌症症状是不同的,包括粪便中可见血迹、尿血、咳嗽排出血液、阴道排出血液、不明原因的体重减轻、持续性不明原因的肿块(例如在乳腺中)、消化不良、吞咽困难、疣或痣的变化以及许多其它取决于癌症类型的可能的症状。然而,由于这些症状而诊断的大多数癌症将已经处于晚期并且难以治疗。大多数癌症在早期是无症状的或存在无助于诊断的非特异性症状。因此,理想地应使用癌症试验及早检测癌症。
发达国家死亡率最高的癌症是肺癌。对于当疾病仍然局限于肺内时检测到的病例,肺癌的五年存活率>50%,但是当疾病已经扩散到其它器官时仅为5%。不幸的是,大多数肺癌病例在已经转移时被诊断(57%),而只有16%在早期被诊断。对于在I期检测到疾病的患者,乳腺癌的5年存活率为约85%,但对于在IV期检测到转移性疾病的患者仅约10%。类似地,当在I期检测到时,结直肠癌(CRC)的5年存活率>90%,但对于在IV期检测到转移性疾病的患者仅约10%。许多其它癌症疾病遵循类似的模式,并且由于这个原因,许多国家有鉴定具有癌性或癌前病况的个体的筛查程序。最常筛查的癌症是通过乳房摄影术扫描的乳腺癌、通过HPV的宫颈刮片样品检查和/或异常宫颈细胞检查的宫颈癌、通过粪便免疫化学检查(FIT)和/或结肠镜检查的结直肠癌(CRC),以及最近通过低剂量计算机断层扫描(LDCT)扫描的肺癌。前列腺特异性抗原(PSA)的血液测量,尽管没有被FDA批准作为前列腺癌的筛查试验,也常常对健康男性进行。
一些癌症病例(例如乳腺癌或睾丸癌)可通过触诊身体的不适当肿块、结节或包块(mass)来检测。任何这样的肿块在性质上可以是或不是癌性的,且可能需要进一步的研究以确定肿块在性质上是恶性的还是良性的。然而,触诊内部器官(例如肺、结肠或胰腺)是不可能的,而需要其它癌症试验。大多数癌症试验可大致分类为(i)扫描以可视化体内的结节、包块或肿块,(ii)活组织检查以寻找靶器官中的异常细胞或(iii)对由癌症或相关或周围组织释放的物质的体液试验。所有目前的癌症筛查方法都有缺点。扫描允许肿块或结节的可视化检测,但是像触诊一样,通常不能区分恶性结节和惰性或非恶性(例如纤维性)肿块,导致特异性差和/或诊断过度。活组织检查涉及大多数组织(例如肺、肝、肾、前列腺)的高创伤性手术或穿刺活组织检查。甚至相对易接近的组织(例如宫颈组织)也需要创伤性和侵入性活组织检查过程。血液和其它体液试验成本低而无创,但少见。
宫颈刮片检查是长期确立的癌症筛查方法。已经证明它在预防个体女性的疾病和降低一般人群的疾病流行方面是有效的,因为(i)它检测癌前的宫颈组织,其可在发展成癌症之前去除,和(ii)宫颈癌影响较年轻的女性,所以预防可为个体维持许多年优质生活。宫颈刮片检查涉及从宫颈表面取细胞刮片样品,检查是否存在任何异常的癌细胞或癌前细胞。刮片可通过细胞的细胞学检查或通过检查细胞掺入人乳头瘤病毒(HPV)DNA来检查。样品的细胞学检查对于70%-80%的被试女性给出了正确的结果,而样品的HPV检查对于90%-95%的被试女性给出了正确的结果。然而,宫颈刮片取样是创伤性和侵入性的,其影响患者对检查的接受程度。顺应性随女性年龄变化,但总体约为80%。目前尚无常用的宫颈癌血液试验。
在美国采用的CRC的主要筛查方法是结肠镜检查。该检查对于CRC检测是准确的,并且还鉴定了大多数结直肠息肉或腺瘤,它们是可能发展成CRC的潜在癌前期。去除癌前结直肠息肉导致患者的有利预后。然而,结肠镜检查在美国是昂贵的并且花费>1000美元。该检查也是创伤性和侵入性的,需要手术入院,并且可能偶尔引起损伤(例如由于肠撕裂)。该程序通常在麻醉下进行,并且需要患者预先做好不愉快的准备,其中肠被彻底冲洗。此外,由于CRC的发病率低,仅在约0.5%的筛查结肠镜检查中检测到该疾病,因此绝大多数被筛查的人经受手术程序而几乎没有益处。所有这些缺点都影响对检查的接受程度,且在美国对通过结肠镜检查的CRC筛查的顺应性差,约筛查年龄人群的60%。由于其缺点,结肠镜检查在世界大多数国家中不用作前线CRC检测或筛查方法。
一些医疗保健提供者采用称为乙状结肠镜检查的相关方法,其中较短的镜仅用于检查降结肠。尽管该方法错过了三分之二的结肠,但它确实检查了最常观察到癌症的区域。乙状结肠镜检查的缺点类似于结肠镜检查的缺点,并且由于类似的原因,它通常不用作前线检查。还使用虚拟结肠镜检查或计算机断层扫描(CT)结肠成像。该程序使用X射线和计算机技术的组合来创建直肠和结肠的图像以检测结直肠肿瘤和腺瘤。
最常用的CRC检测和筛查方法涉及两段程序,其中首先用非创伤性前线粪便试验筛选筛查年龄的群体以鉴定其中存在较高风险CRC的筛查群体的亚组。在粪便试验中检测为阳性的人被转诊进行随后结肠镜检查,并且通常发现这些人中约5%患有CRC。大多数人的粪便筛查的结果是阴性,因此两段法防止了对大多数没有病变的人进行不必要的结肠镜检查。
目前对CRC的粪便试验的基本原理是检测结肠或直肠出血。例如,当结肠或直肠被侵入的癌性或癌前生长部分阻塞时,粪便经过阻塞物的移动可能导致损伤和出血。通过试验粪便样品中血红蛋白的存在来检测这种出血。由于出血程度可能每天变化很大,试验可能需要在不同的日子里进行若干次。
所有目前的粪便CRC试验均设计用于检测粪便血红蛋白。愈创木脂粪便隐血试验(FOBT或gFOBT)是血红蛋白的化学试验方法,其中患者或操作者通常将少量粪便涂抹到α-愈创木脂酸涂布纸或其它基材上。如果粪便中存在血液,将过氧化氢加到纸上,在由血红素(血红蛋白的组分)催化的反应中,通过将α-愈创木脂酸氧化成蓝色醌,将产生快速的颜色变化。肉(和因此的血红素)以及一些蔬菜(含有在检查中表现如血红素一样的其它催化剂分子)的消耗可导致假阳性结果。类似地,一些物质(包括维生素C)可导致假阴性结果,因此在检查前通常建议限制饮食。愈创木脂FOBT检查可具有高的临床特异性,这取决于所使用的截止值,并且对于CRC的检测具有60-70%的敏感度。癌前腺瘤的检测较差。化学FOBT法是过去选择的方法,且尽管仍然被广泛使用,但正被FIT法取代。
FIT法(也称为iFOBT或FOBTi)本质上是对粪便样品中的人血红蛋白的免疫测定试验。FIT法不易受到由饮食因素干扰导致的假阳性和假阴性结果的影响,并且可以检测粪便中较少量的血液。这些试验以95%的特异性检测出约72%的CRC病例,且因此检测出的临床相关癌症病变比具有相似特异性的gFOBT稍多。腺瘤的检测很差。FIT和gFOBT试验是非创伤性和低成本的,但是需要由患者操作粪便,这执行起来是不愉快的且导致低顺应性。在有国家筛查方案的最顺应的欧洲国家,患者对FIT和FOBT法的顺应性为60%-70%,但在许多国家低至10%-20%。此外,试验并不完全可靠。FIT错过约30%的CRC病例,并且此外,大多数FIT阳性受试者不患有癌症,而因此经历很少或没有益处的随后创伤性结肠镜检查。由Exact Sciences产生的CRC的Cologuard粪便试验,除了粪便血红蛋白测量之外,还采用若干个粪便DNA测量,将试验的准确度提高到87%的特异性下92%的敏感度。临床上不使用CRC检测的血液试验,主要是因为它们缺乏准确度。例如,目前FDA批准用于CRC的唯一血液试验是Epi Procolon试验,其以80%的特异性检测到68%的CRC病例(Potter等人,2014)。
当治疗方案具有更好的结果时,通常通过乳房摄影术进行乳腺癌筛查,用于疾病的早期检测。乳房摄影术使用低剂量X射线以在乳腺中的任何肿块可被感觉到之前使其可视化,或以显示称为微钙化的微小钙簇。通过活组织检查对癌症进行组织学确认是必要的,因为肿块或斑点可能是由其它病况例如脂肪细胞或囊肿引起的,并且高达50%的阳性发现是假阳性结果。此外,一些真正的阳性结果导致过度诊断,其中小肿块在性质上是惰性的,并且不会发展成危及生命的疾病。假阳性和过度诊断可导致不必要的创伤性程序和暴露于进一步的X射线。这些缺点和X射线暴露的固有危险导致降低的患者顺应性。乳腺癌检测目前的血液试验对于常规临床使用不够准确。例如,CA15-3(乳腺癌最常用的肿瘤标志物)以95%的特异性检测到19%的乳腺癌病例(Wojtacki等人,1994)。
最近推荐使用LDCT进行肺癌筛查,作为高风险受试者(例如长期重度吸烟者)中疾病早期检测的筛查试验。LDCT使用低剂量X射线使肺中的早期小肿块或结节可视化。然而,与其它扫描方法一样,观察到的任何肿块在性质上可能是或可能不是癌性的,并且有必要通过活组织检查对癌症进行组织学确认。LDCT上高达40%的阳性结果是假阳性结果,其中检测到的病变不是癌性的。此外,发现了许多病因未知的结节,其中所述结节性质上可能是或可能不是恶性的,但太小而不能活组织检查。假阳性结果可导致不必要的创伤性程序,而未知病因的结节可导致反复的后续扫描以通过反复暴露于进一步X射线而监测肿块。临床上不使用肺癌检测的血液试验,主要是因为它们缺乏准确度。例如,已经提出了以76%的特异性检测到21%的肺癌病例的miRNA试验作为前线筛查试验,而以87%的特异性检测到41%的肺癌病例的早期CDT-肺试验作为初步筛查试验进行评价(Midthun,2016)。
目前的筛查方法的一个重要的失败是患者顺应性低,因为未能进行筛查可导致患者的早期死亡,并对于医疗保健提供者增加了昂贵的晚期癌症治疗的负担。在美国对CRC筛查的结肠镜检查的顺应性较差,对于超过50岁的人顺应性为约60%。其余未筛查者明显处于增加的CRC风险中。对CRC的欧洲FIT筛查方案的顺应性同样差,为60%-70%。乳房摄影术和LDCT检查涉及暴露于破坏性X射线,且频繁或反复检查有可能导致癌症。在撰写时,LDCT是最近的筛查发展,但早期经验表明顺应性差,可能低至20%。其原因可能包括需要每3-6个月对发现的未知病因的结节进行反复扫描,将受试者暴露于反复的X射线剂量,可能加速癌症发展,其中也可能以其它方式减缓正在生长的结节。美国预防服务工作组(USPSTF)已确定需要生物标志物来准确区分LDCT扫描上鉴定的良性和恶性结节(Moyer,2014)。所有目前的癌症筛查方法都受制于准确度差、诊断过度、成本高、创伤性高、暴露于X射线和患者顺应性差的组合。
大多数通常发生的癌症未被筛查,包括例如淋巴瘤、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、子宫癌、骨髓瘤、甲状腺癌、卵巢癌或肝癌。这反映出这些疾病缺乏良好的癌症血液试验。前列腺癌是一个例外情况,尽管没有批准或推荐的筛查试验,但常常对健康男性进行PSA试验,并且阳性结果将导致对可疑前列腺癌进行后续试验。PSA试验的主要优点不是源于其准确度,而是源于其作为血液试验的性质。这是一种低成本、非创伤性的试验,可以包括在常规健康检查中,其消除了大多数顺应性问题,因为不需要医院就诊,患者不需要特殊准备,并且所需的少量血液(<100 µL)意味着不需要专门的血液抽取,因此该试验可由医师要求作为常规健康检查的一部分,与其它常规试验(例如胆固醇、血糖和肝酶)一起包括在项目单中。
为了解决对简单的常规癌症血液试验的需要,已经研究了许多血液携带的生物标志物作为潜在的癌症试验,包括CRC的癌胚抗原(CEA)、肝癌的甲胎蛋白(AFP)、卵巢癌的CA125、胰腺癌的CA19-9、乳腺癌的CA 15-3和前列腺癌的PSA。然而,它们的临床准确度对常规诊断用途而言太低,并且它们被认为用于患者监测更好。
最近,已经研究了特定基因序列的高甲基化用作血液中癌症的诊断生物标志物。例如,已经通过将胞嘧啶而不是5-甲基胞嘧啶的选择性亚硫酸氢盐脱氨成尿嘧啶导致可通过测序或其它手段检测到的一级DNA序列变化,来研究特定基因或基因座的DNA甲基化状态(Yang等人,2004)。对于SEPTIN-9基因的高甲基化的一种这样的试验是目前由美国食品和药品管理局(FDA)批准用于CRC检测的唯一血液试验。发现该试验以80%的特异性检测到68%的CRC病例。类似地,对使用循环肿瘤DNA(ctDNA)作为血液试验中癌症检测的基础也有很大的兴趣。然而,虽然ctDNA试验鉴定晚期癌症,但它们不检测早期癌症。此外,ctDNA试验昂贵且需要大量血液。这些缺点意味着它不太可能用作常规的癌症筛查方法。
本领域的工作人员还研究了用于检测癌症的许多其它生物标志物,包括循环无细胞核小体本身(Holdenrieder等人,2001)和炎性分子例如TNFα、白介素-6(IL-6)和白介素-8(IL-8)(Chadha等人,2014)。
尽管众所周知,无细胞核小体本身的循环水平在多种癌症病况中可能升高,但无细胞核小体测量尚未在临床上用于检测癌症或用于任何其它临床目的(Holdenrieder等人,2001)。在临床应用中测定无细胞核小体本身的主要缺点是,升高的水平是细胞死亡的非特异性指示,并且对于多种病况已经报道了升高的水平,包括妇科疾病、自身免疫性疾病、炎性疾病、中风、心脏病、脓毒症、移植物抗宿主疾病和烧伤、手术或运动后的创伤(Holdenrieder等人,2005和Holdenrieder和Stieber,2009)。因此,测量到核小体本身水平升高被认为是疾病的非特异性指示,不能用于肿瘤学。
还研究了含有特定表观遗传信号(包括特定翻译后修饰、组蛋白同种型、经修饰的核苷酸和非组蛋白染色质蛋白)的循环无细胞核小体作为癌症标志物(如WO2005019826、WO2013030577、WO2013030579和WO2013084002中所引用的)。
还报道了细胞因子炎性分子(包括许多白介素蛋白)的循环水平在癌症中变化。人类基因组中有多于50种编码的白介素和相关蛋白。这些称为白介素1 (IL-1)、白介素2(IL-2)等。已经报道了在癌症中升高水平的许多细胞因子,包括例如但不限于IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-11、IL-12、TNF-α和CRP (Lipitz和Harris, 2016和Allin等人,2011)。例如,已经在广泛的人类癌症中研究了IL-6在肿瘤发生中的作用,所述癌症包括CRC以及淋巴癌、胶质瘤、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、肾癌和胰腺癌(Wang和Sun, 2014)。升高的循环IL-6水平与许多癌症的肿瘤发生、疾病进展和不良预后有关,所述癌症包括结直肠癌、前列腺癌、皮肤癌、乳腺癌、肺癌、食管癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、妇科癌、肾癌、膀胱癌和血液癌(Taniguchi和Karin, 2014)。类似地,循环IL-8水平在许多癌症中增加,包括结直肠癌、胃癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和乳腺癌。
然而,细胞因子标志物通常不用作癌症的试验。这些标志物的主要缺点是它们是非特异性标志物,涉及大范围的病况,包括肥胖、糖尿病、自身免疫性疾病、炎性疾病和感染。
尽管有最近的进展,但是通常没有血液试验方法用于癌症筛查,可能的例外是使用PSA用于前列腺癌检测(尽管有反对它的建议)。需要开发用于各种癌症以及用于一般癌症诊断的非创伤性血液试验,以用作一般癌症筛查,或作为对有症状患者的潜在诊断或作为其它癌症检测方法的辅助手段来确定癌症或排除癌症。
发明内容
根据本发明的第一方面,提供了体液样品中的生物标志物组用于诊断和/或监测癌症的用途,其中所述生物标志物包含至少一种无细胞染色质片段和至少一种细胞因子分子。
根据本发明的另一方面,提供了诊断患者的癌症的方法,其包括:
检测或测量获自患者的体液样品中的至少一种细胞因子分子和至少一种无细胞染色质片段;以及
使用体液样品中检测到的细胞因子分子和无细胞染色质片段的水平或浓度来确定患者是否患有癌症。
根据本发明的另一方面,提供了一种评估患者对于癌症研究的适合性的方法,其包括:
检测或测量获自患者的体液样品中的至少一种细胞因子分子和至少一种无细胞染色质片段;以及
使用体液样品中检测到的细胞因子分子和无细胞染色质片段的水平或浓度来确定患者是否需要进一步的癌症研究。
根据本发明的另一方面,提供了治疗患者的癌症的方法,其包括:
(i) 检测或测量获自患者的体液样品中的至少一种细胞因子分子和至少一种无细胞染色质片段;
(ii) 使用体液样品中检测到的细胞因子分子和无细胞染色质片段的水平或浓度来确定患者是否患有癌症;以及
(iii) 如果在步骤(ii)中确定患者患有癌症,则对患者施加治疗。
根据本发明的另一方面,提供了包含检测体液样品中至少一种细胞因子分子和至少一种无细胞染色质片段的试剂的组。
附图说明
图1:包含含有组蛋白H3.1的核小体和IL-6的双测定组的箱形图和受试者操作特性(ROC)曲线,所述双测定组经训练以优化144名受试者肺癌群组中肺癌患者与正常供体相比之间的区别。箱形图表示为通过逻辑回归分析计算的任何给定受试者的癌症概率。
图2:包含核小体本身、含有组蛋白同种型H3.1的核小体和IL-6的测量的三测定组的箱形图和ROC曲线,所述三测定组经训练以优化100名受试者CRC群组中结直肠癌(CRC)患者与具有症状但在结肠镜检查中无发现的患者相比之间的区别。箱形图表示为通过逻辑回归分析计算的任何给定受试者的癌症概率。
图3:包含核小体本身、含有组蛋白同种型H3.1的核小体和IL-6的测量的三测定组的箱形图和ROC曲线,所述三测定组经训练以优化100名受试者CRC群组中CRC患者与在结肠镜检查中无发现的受试者和患有非恶性良性结肠或肠疾病的患者相比之间的区别。箱形图表示为通过逻辑回归分析计算的任何给定受试者的癌症概率。
图4:包含含有组蛋白同种型H3.1的核小体和IL-6的双测定组模型(肺/CRC组合模型)的箱形图和ROC曲线,所述模型经训练以优化患有CRC或肺癌的患者与正常供体和在结肠镜检查中无发现的受试者相比之间的区分,应用于70名受试者验证群组,包括30名肺癌患者、30名正常供体受试者和10名患有慢性阻塞性肺病(COPD)的患者。箱形图表示为通过逻辑回归分析计算的每个受试者的模型/算法输出。
图5:包含含有组蛋白同种型H3.1的核小体和IL-6的双测定组模型(肺/CRC组合模型)的箱形图和ROC曲线,所述模型经训练以优化CRC患者或肺癌患者与正常供体和在结肠镜检查中无发现的受试者相比之间的区别,应用于63名受试者验证群组,包括30名患有各种癌症疾病的患者和33名正常供体受试者。箱形图表示为通过逻辑回归分析计算的每个受试者的模型/算法输出。上部和下部虚线分别表示90%特异性和80%特异性时的截止值。
图6:包含含有组蛋白同种型H3.1的核小体和IL-6的双测定组的箱形图和ROC曲线,所述双测定组在100名受试者CRC群组上训练以优化患有CRC的患者与具有症状但在结肠镜检查中无发现的患者相比之间的区分,应用于63名受试者验证群组,包括30名患有各种癌症疾病的患者和33名正常供体受试者。箱形图表示为通过逻辑回归分析计算的每个受试者的模型/算法输出。上部和下部虚线分别表示90%特异性和80%特异性时的截止值。
图7:包含核小体本身、含有组蛋白同种型H3.1的核小体和IL-6的三测定组的箱形图和ROC曲线,所述三测定组在100名受试者CRC群组上训练以优化CRC患者与具有症状但在结肠镜检查中无发现的患者相比之间的区分,应用于63名受试者验证群组,包括30名患有各种癌症疾病的患者和33名正常供体受试者。箱形图表示为通过逻辑回归分析计算的每个受试者的模型/算法输出。上部和下部虚线分别表示90%特异性和80%特异性时的截止值。
具体实施方式
根据本发明的第一方面,提供了体液样品中的生物标志物组用于诊断和/或监测癌症的用途,其中所述生物标志物包含至少一种无细胞染色质片段和至少一种细胞因子分子。
在本文提供的实施例中,我们已经展示了癌症患者中若干种白介素的血液水平比未患癌症的人中观察到的水平增加。我们已经对于多种癌症疾病展示了这一点。我们还展示了,癌症患者中核小体本身的循环水平比未患癌症的人中观察到的水平增加。我们还展示了,在癌症患者中含有特定组蛋白同种型的核小体的循环水平比未患癌症的人中观察到的水平增加。我们还展示了,在癌症患者的比例和可检测的癌症疾病类型的广度方面,作为组合生物标志物组的白介素分子和核小体部分的测量对于癌症疾病的检测是高度准确的。
本领域技术人员将清楚,本发明的方法将检测试验的所有或大多数癌症类型和所有常见的癌症类型。如实施例中所示,例示的2-测定组和3-测定组实施方案检测大多数癌症病例和所有或大多数类型的癌症。本领域技术人员还将清楚的是,可将进一步的核小体和/或细胞因子测定加入这些组中以进一步提高检测的敏感度和检测的癌症的广度中的任一个或两者。在其它实施方案中,可将其它非核小体或非细胞因子测定加入这些组中以提高它们的性能。例如但不限于,可加入CA19-9以提高胰腺癌的表现、对于CRC可加入CEA、对于肝癌可加入AFP、对于卵巢癌可加入CA125、对于前列腺癌可加入PSA等。
我们已经展示了,在癌症检测的准确度方面和在所检测的癌症疾病的多样性方面,包括细胞因子测定和核小体测定的测定组合产生了用于将癌症患者与正常(健康)受试者区分开的改进结果。我们还展示了,当核小体测定是针对核小体本身或针对含有组蛋白同种型或变体的核小体时,这类测定组是有效的。我们现在报道了预测受试者中癌症存在的非创伤性血液试验的开发。
本发明包含无细胞染色质片段作为生物标志物。所述染色质片段可被检测为体液样品(例如血液、血清或血浆样品)中的循环核小体,即它们是无细胞核小体。在一个实施方案中,无细胞染色质片段是无细胞核小体或其组分。因此,提供了至少一种细胞因子部分和至少一种核小体部分作为体液样品中的生物标志物用于诊断和/或监测和/或评估癌症的用途。
如本文所用的术语“染色质片段”是指蛋白和核酸的复合物,其来源位于细胞的染色体中。染色质的片段可含有核小体和/或相关DNA和/或多蛋白-核酸复合物中多种非组蛋白染色质相关蛋白中的任一种。非组蛋白染色质相关蛋白(即蛋白加合物)的一些实例包括转录因子、辅因子、共激活物、共阻遏物、RNA聚合酶部分、延长因子、染色质重塑因子、介质、STAT部分、上游结合因子(UBF)等。
核小体是染色质结构的基本单位且由八个高度保守的核心组蛋白的蛋白复合物(包含组蛋白H2A、H2B、H3和H4中每个的一对)组成。在该复合物周围缠绕着大约146个碱基对的DNA。另一种组蛋白(H1或H5)作为接头并参与染色质致密化。DNA以常常据说类似“串珠”的结构缠绕在连续的核小体周围,而这形成开放或常染色质的基本结构。在致密的或异染色质中,该串被卷曲和超卷曲成闭合和复杂的结构(Herranz和Esteller(2007))。
当在体液样品中检测时,提及“核小体”可指“无细胞核小体”。应当理解,本文献通篇使用的术语“无细胞核小体”旨在包括含有一个或多个核小体的任何无细胞染色质片段。如本文提及的无细胞核小体的表观遗传信号结构/特征可包括但不限于一种或多种组蛋白翻译后修饰、组蛋白同种型/变体、经修饰的核苷酸和/或作为核小体-蛋白加合物与核小体结合的蛋白。
如本文所用的术语“其组分”是指核小体的一部分,即不需要检测整个核小体。在一个实施方案中,无细胞核小体的组分选自:组蛋白蛋白质(即组蛋白H1、H2A、H2B、H3或H4)、组蛋白翻译后修饰、组蛋白变体或同种型、与核小体结合的蛋白(即核小体-蛋白加合物)、与核小体相关的DNA片段和/或与核小体相关的经修饰的核苷酸。例如,在一个实施方案中,其组分是组蛋白(同种型)H3.1或组蛋白H1。因此,在一个实施方案中,用途包括含有组蛋白H3.1的核小体和/或含有组蛋白H1的核小体作为生物标志物。
在一个实施方案中,无细胞核小体作为核小体本身的测定而测量。提及“核小体本身”是指样品中存在的总的核小体水平或浓度,而不管核小体可能包括或不包括的任何表观遗传特征。这种类型的测定常常也称为总核小体测定,并且通常涉及检测所有核小体共有的组蛋白,例如组蛋白H4或组蛋白H3。因此,在一个实施方案中,通过检测核心组蛋白例如组蛋白H3来测量核小体本身。如本文所述,组蛋白形成称为核小体的结构单元,所述核小体在真核细胞中用于包装DNA。在一个实施方案中,组蛋白是核心组蛋白,例如H2A、H2B、H3或H4。如先前在WO 2016067029(通过引用并入本文)中报道的,特定的组蛋白变体(例如组蛋白H3.1、H3.2或H3t)可用于分离源自肿瘤细胞的无细胞核小体。因此,可检测肿瘤来源的无细胞核小体的水平。
总的无细胞核小体或核小体本身也可通过量化它们的DNA片段含量来测量。血液中的循环无细胞DNA(ccfDNA)包含长度<200个碱基对的DNA片段,其以染色质片段特别是核小体的形式循环。已经显示,使用PicoGreen核酸染色法进行的ccfDNA的血液测量与无细胞核小体的ELISA测量具有95%相关性(Bjorkman等人; 2003)。因此,ccfDNA测量可被认为等同于或替代总核小体或总染色质片段水平的测量。作为核小体的替代测量的ccfDNA量化的典型方法包括但不限于使用核酸染料(例如PicoGreen、SYBR绿、SYBER金、噁唑黄和噻唑橙)或通过用于扩增和测量单拷贝基因序列的重复DNA序列的聚合酶链式反应(PCR)法或其它方法来量化。因此,在一个实施方案中,通过检测ccfDNA测量(或量化)无细胞染色质片段。在另一个实施方案中,使用核酸染料测量ccfDNA。在另一个实施方案中,通过PCR测量ccfDNA。此外,根据本发明的另一方面,提供了体液样品中的生物标志物组用于诊断和/或监测癌症的用途,其中所述生物标志物包括至少一种细胞因子分子和ccfDNA的测量。
成人中的正常细胞更新涉及通过细胞分裂每天产生约1011个细胞和类似数目的死亡,主要是通过细胞凋亡。在细胞凋亡过程中,染色质被分解成从细胞释放的单核小体和寡核小体。据报道,正常条件下,在健康受试者中发现的循环核小体的水平是低的。在患有多种病况(包括许多癌症、自身免疫性疾病、炎性病况、中风和心肌梗塞)的受试者中发现升高的水平(Holdenrieder和Stieber,2009)。
可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)检测单核小体和寡核小体,并且已经报道了若干种方法(Salgame等人, 1997; Holdenrieder等人, 2001; van Nieuwenhuijze等人,2003; WO2005019826; WO2013030577; WO2013030579;和WO2013084002,其全部通过引用并入本文)。这些测定通常使用抗组蛋白抗体(例如抗H2B、抗H3或抗H1、H2A、H2B、H3和H4)作为捕获抗体和检测抗体(其根据待检测的部分而变化),或抗组蛋白抗体作为捕获抗体而抗DNA抗体作为检测抗体。在一个实施方案中,抗组蛋白抗体包括抗H3抗体或抗H1抗体。
循环核小体不是蛋白-核酸复合物的同质群。相反,它们是源自细胞死亡时染色质的消化的染色质片段的异质群,并且包括种类极多的表观遗传结构,包括特定的组蛋白同种型(或变体)、翻译后组蛋白修饰、核苷酸或经修饰的核苷酸,以及蛋白加合物。本领域技术人员将清楚,核小体水平的升高将与含有特定表观遗传信号的一些循环核小体亚群的升高有关,包括含有特定组蛋白同种型(或变体)、含有特定翻译后组蛋白修饰、含有特定核苷酸或经修饰的核苷酸和含有特定蛋白加合物的核小体。这些类型的染色质片段的测定是本领域已知的(例如,参见WO2005019826、WO2013030579、WO2013030578、WO2013084002,其通过引用并入本文)。
因此,在一个备选的实施方案中,无细胞核小体含有表观遗传特征。在另一个实施方案中,表观遗传特征选自组蛋白翻译后修饰、组蛋白同种型、经修饰的核苷酸和/或与核小体结合的蛋白(即作为核小体-蛋白加合物)。应当理解,术语“表观遗传信号结构”和“表观遗传特征”在本文可互换使用。它们是指可被检测到的核小体的特定特征。
在一个实施方案中,无细胞核小体包含组蛋白同种型。作为生物标志物组的一部分测量的核小体部分可为含有一种或多种特定或指定组蛋白同种型的循环无细胞核小体。许多组蛋白同种型是本领域已知的。大量组蛋白同种型的核苷酸序列可公开获得,例如在国家人类基因组研究院NHGRI组蛋白数据库(Mariño-Ramírez, L., Levine, K.M.,Morales, M., Zhang, S., Moreland, R.T., Baxevanis, A.D.和Landsman, D. TheHistone Database: an integrated resource for histones and histone fold-containing proteins. Database Vol.2011)、GenBank (NIH基因序列)数据库、EMBL核苷酸序列数据库和日本DNA数据库(DDBJ)中。在一个优选的实施方案中,无细胞核小体包含组蛋白H3的组蛋白同种型,例如选自H3.1、H3.2和H3t的组蛋白同种型。
在另一个实施方案中,无细胞核小体包含一种或多种特定或指定的翻译后组蛋白修饰。核小体的结构可以根据组蛋白的翻译后修饰(PTM)而改变。组蛋白的PTM通常发生在核心组蛋白的尾部,并且常见的修饰包括赖氨酸残基的乙酰化、甲基化或泛素化以及精氨酸残基的甲基化和丝氨酸残基的磷酸化以及许多其它修饰。许多组蛋白修饰是本领域已知的,并且随着新修饰的鉴定,数量正在增加(Zhao和Garcia,2015)。
在一个实施方案中,检测一组或一类相关组蛋白(翻译后)修饰(而不是单一修饰)。该实施方案的典型实例涉及但不限于2-位点免疫测定法,其使用一种抗体或其它定向结合核小体的选择性结合剂和一种抗体或其它定向结合所述一组组蛋白修饰的选择性结合剂。定向结合一组组蛋白修饰的此类抗体的实例包括(用于说明目的,但不限于此)抗泛乙酰化抗体(例如泛乙酰基H4抗体)、抗瓜氨酸化抗体或抗泛素抗体。
在一个实施方案中,无细胞核小体包含一种或多种DNA修饰(即经修饰的核苷酸)。除了由核小体组蛋白同种型和组蛋白翻译后修饰组合物介导的表观遗传信号外,核小体在它们的核苷酸和经修饰的核苷酸组合物中也不同。整体DNA低甲基化是癌细胞的标志,且一些核小体可包含比其它核小体更多的5-甲基胞嘧啶残基(或5-羟甲基胞嘧啶残基或其它核苷酸或经修饰的核苷酸)。例如,可在基因组的CpG岛检测5-羟甲基化。在一个实施方案中,DNA修饰选自5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。
在另一个实施方案中,无细胞核小体包含蛋白加合物,即核小体和与核小体或染色质片段加合的另一种非组蛋白蛋白质。这样的加合物可包括含有或包含DNA结合结构域或核小体结合结构域或组蛋白结合结构域的任何蛋白。实例包括转录因子、结构染色质蛋白、CpG甲基-CpG结合结构域蛋白、高迁移率族盒蛋白(high mobility group boxprotein)(例如HMGB1)、表观遗传酶(例如组蛋白乙酰基转移酶、组蛋白甲基转移酶、组蛋白脱乙酰基酶、DNA甲基转移酶)、PARP(聚ADP核糖聚合酶)结合剂和许多其它蛋白。
在一个实施方案中,与核小体加合的蛋白(并且因此可用作生物标志物)选自:转录因子、高迁移率族蛋白或染色质修饰酶。提及“转录因子”是指结合DNA并通过促进(即激活物)或阻遏(即阻遏物)转录而调节基因表达的蛋白。转录因子含有一个或多个DNA结合结构域(DBD),其附着于与其调节的基因相邻的DNA的特定序列。本文所述的所有循环核小体和核小体部分、类型或亚群都可用于本发明。
在一个实施方案中,细胞因子分子是白介素分子。白介素(IL)是一组细胞因子,通常由白细胞分泌,其充当信号分子。它们在刺激免疫应答和炎症中具有关键作用。它们在二十世纪七十年代首次被鉴定,并且随着更多的白介素类型被发现,它们被用数字标明。白介素的实例包括但不限于:IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14和IL-15。
在一个实施方案中,白介素分子包括白介素-6。白介素-6(IL-6)是具有各种各样的生物学功能的细胞因子。它是发热和急性期反应的有效诱导物。人IL-6的序列是本领域已知的,并且以UniProt登录号P05231描述。
在一个实施方案中,用途包括白介素-8作为生物标志物。白介素-8(IL-8,也称为CXCL8)是吸引免疫细胞例如嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和T细胞的趋化因子。它响应炎症刺激从若干种细胞类型中释放。人IL-8的序列是本领域已知的,并且以UniProt登录号P10145描述。
在一个实施方案中,用途包括白介素-10作为生物标志物。白介素-10(IL-10)是具有各种各样的生物学功能的抗炎细胞因子。人IL-10的序列是本领域已知的,并且以UniProt登录号P22301描述。
在本发明的一个优选实施方案中,生物标志物包含IL-6、IL-8、IL-10或其组合。在另一个实施方案中,所述至少一种细胞因子分子是IL-6。
在一个实施方案中,所述至少一种无细胞染色质片段包含组蛋白同种型H3.1和IL-6。在另一个实施方案中,生物标志物包含组蛋白同种型H3.1、核小体本身(即样品中无细胞核小体的总水平)和IL-6。在一个备选的实施方案中,生物标志物由组蛋白同种型H3.1、IL-6和任选地核小体本身组成。如上文所述,有多种检测核小体本身水平的方法,例如通过使用试剂检测核心组蛋白蛋白质(例如组蛋白H3)。
本领域技术人员将清楚,另外的生物标志物(除核小体部分和细胞因子部分之外)可用于生物标志物组以检测癌症和/或鉴定受疾病影响的器官。在一个实施方案中,用途另外包括一种或多种选自以下的生物标志物:铁蛋白、癌胚抗原(CEA)、CYFRA 21-1(细胞角蛋白19片段)、癌抗原125(CA 125)、糖类抗原19-9(CA 19-9)、糖类抗原15-3(CA 15-3)、甲胎蛋白(AFP)、催乳素、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、前列腺特异性抗原(PSA)和C-反应蛋白(CRP)。
样品可为取自受试者的任何生物流体(或体液)样品,包括但不限于脑脊液(CSF)、全血、血清、血浆、月经血、子宫内膜液、尿、唾液或其它体液(粪便、泪液、滑液、痰)、呼吸(例如作为浓缩呼吸),或其提取物或纯化物,或其稀释液。生物样品还包括来自活体受试者或死后采集的样本。可以例如在适当稀释或浓缩的情况下制备样品,并以常规方式储存。应当理解,本发明的方法和用途特别用于获自患者的血液、血清或血浆样品。在一个实施方案中,样品是血液或血浆样品。在另一个实施方案中,样品是血清样品。在另一个实施方案中,血清和血浆样品二者都用于测量测定组的不同成员。
在一个实施方案中,生物标志物用于诊断癌症的阶段。癌症可分为I期、II期、III期和IV期。阶段定义随不同的癌症疾病而变化并且是本领域已知的。通常,当癌症小并且局部限制于起源组织时被分类为I期。当癌症生长得更大并超出其起源进入器官内的附近组织或到达附近淋巴结时分类为II期。当癌症已经生长到超出起源器官的附近组织中,但是没有扩散到身体的其它更远部分时分类为III期。当癌症已经扩散到身体的一个或多个远处部分(例如肝或肺)时分类为IV期。
在一个实施方案中,癌症是I期(例如IA期或IB期)、II期(例如IIA期或IIB期)、III期(例如IIIA期、IIIB期或IIIC期)或IV期(例如IVA期或IVB期)癌症。本发明可用于检测早期癌症,特别是I期和II期癌症。因此,在一个实施方案中,癌症是I期、II期或III期。在另一个实施方案中,癌症是I期或II期。在一个备选的实施方案中,癌症是II期或III期。本发明还可用于检测晚期癌症,特别是III期和IV期癌症。因此,在一个实施方案中,癌症是III期或IV期。在另一个实施方案中,癌症是IV期。
在一个实施方案中,所述癌症选自:肺癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、肾癌、皮肤癌、前列腺癌、宫颈癌、乳腺癌、咽癌、喉癌、卵巢癌、食管癌、口腔癌、胰腺癌和膀胱癌。在另一个实施方案中,癌症选自肺癌、结直肠癌,卵巢癌和前列腺癌,特别是肺癌和结直肠癌。在又一实施方案中,癌症是肺癌(例如非小细胞肺癌或小细胞肺癌)。
根据本发明的另一方面,提供了无细胞染色质片段结合剂和细胞因子分子结合剂在制造用于在体液样品中诊断和/或监测癌症的试剂盒中的用途。
诊断方法
根据本发明的另一方面,提供了诊断患者的癌症的方法,其包括:
检测或测量获自患者的体液样品中的至少一种细胞因子分子和至少一种无细胞染色质片段;以及
使用细胞因子分子和无细胞染色质片段的水平或浓度来确定患者是否患有癌症。
在一个实施方案中,所测量的细胞因子分子是白介素分子。在一个优选的实施方案中,所测量的细胞因子分子是IL-6、IL-8和IL-10中的任一种或全部,包括其组合。在另一个实施方案中,白介素分子是IL-6。
在另一个实施方案中,实施本发明的方法以鉴定处于患癌高风险并因此需要进一步检查(即进一步的癌症研究)的受试者,特别是鉴定癌症的器官位置。进一步的检查可涉及一种或多种内窥镜或扫描法,包括例如全身扫描、MRI扫描、超声扫描、LDCT、乳房摄影术、计算机断层(CT)结肠镜检查或其它扫描法。
因此,根据本发明的另一方面,提供了用于检测癌症和研究受癌症影响的器官的方法,其包括:
检测或测量获自患者的体液样品中至少一种细胞因子分子和至少一种无细胞染色质片段的水平;
使用测量的细胞因子和无细胞染色质片段水平作为体内癌症存在的指示;以及
通过内窥镜或扫描法检测所述癌症(或肿瘤)在体内的位置。
除了它们作为独立试验的用途之外,癌症确定或排除血液试验可用作其它筛查模式的辅助方法,包括例如在LDCT阳性、乳房摄影术阳性、PSA阳性或FIT阳性的人中。所有这些试验都是非特异性的,因此当与本文所述的方法结合使用时可能增强。LDCT阳性患者在其肺中具有肿块或结节,但结节可能不是恶性的,并且LDCT具有约60%的特异性。类似地,乳房摄影术阳性患者在其乳腺中具有肿块或结节,但结节也可能不是恶性的。PSA试验的特异性也低,约60-70%。在由FIT筛查无症状受试者的情况下,仅有约5%的在筛查时发现粪便血红蛋白阳性的人在后续结肠镜检查时发现实际上有CRC。因此,所进行的许多筛查结肠镜检查是后见之明,是不需要的。
除筛查结肠镜检查外,还对先前已诊断为CRC或癌前腺瘤(可能已治疗或手术切除)的患者进行大量监测或监控结肠镜检查,以监测任何疾病复发或进展。FIT试验也可用于监测或监控以选择结肠镜检查的受试者。还进行结肠镜检查以研究表现出与可能的CRC一致的症状的患者。同样,FIT试验可用于选择结肠镜检查的受试者。在所有这些情况下,进行的大部分结肠镜检查未发现癌症,并且对患者和医疗保健提供者具有许多有害后果,包括:(i)对无结肠病变的人进行大量不必要的创伤性医疗结肠镜检查程序,(ii)昂贵和不必要的结肠镜检查的大量保健支出,(iii)由于结肠镜检查基础设施的历史投资不足,医疗保健提供者(特别是在欧洲CRC筛查方案中)的结肠镜检查能力目前不足以满足医疗需求,导致未进行结肠镜检查的积压增加和FIT阳性的人的结肠镜检查等待时间增加,和(iv)这种等待时间增加已经导致对于的确患有CRC的那些患者,CRC治疗开始的潜在致命延迟。通过鉴定结直肠出血最可能是由于癌症引起的那些FIT阳性的人,以对最需要紧急转诊进行结肠镜检查的那些FIT阳性的人进行分类,确定或排除血液试验将克服这些问题中的大多数。类似地,通过LDCT或乳房摄影术鉴定的具有潜在癌性结节或肺或乳腺的其它病变的受试者可以使用确定或排除血液试验来试验,以对病变在性质上最可能是恶性的那些患者进行分类。这将避免不必要的活组织检查和潜在危险的反复暴露于X射线辐射。具有升高的PSA水平的男性可使用确定或排除血液试验来试验,以对PSA水平升高的原因在性质上最可能是恶性的那些患者进行分类。同样,这可以避免对处于前列腺疾病主动监控下的男性进行一些不必要的反复活组织检查。因此,在一个实施方案中,使用本发明的方法试验的患者是FIT阳性、LDCT阳性、乳房摄影术阳性或PSA阳性。
我们已经表明,使用循环核小体水平和/或细胞因子水平连同数字FIT评分可用于鉴定在结肠镜检查中未发现病变的FIT阳性受试者(即真阴性)。因此,本发明可用于确定粪便血红蛋白检测为阳性的患者是否未患恶性结直肠病变(即患者未患癌症)。因此,本发明可用于评估患者对结肠镜检查的适合性。
根据本发明的另一方面,提供了一种用于评估患者对结肠镜检查的适合性的方法,其包括:
(i) 检测或测量获自患者的粪便样品中的粪便血红蛋白水平;
(ii) 检测或测量获自患者的体液样品中至少一种细胞因子分子的水平,任选地包括至少一种无细胞染色质片段的水平;以及
(iii) 使用测量的粪便血红蛋白和细胞因子水平,任选地与无细胞染色质片段水平组合,作为患者对结肠镜检查的适合性的指示。
粪便血红蛋白试验是本领域众所周知的。应当理解,本发明的这个方面可与粪便血红蛋白试验阳性的患者联合使用,即已经测量了粪便血红蛋白的水平。因此,在一个实施方案中,步骤(i)可指:鉴定粪便血红蛋白试验阳性的患者。在一个实施方案中,如果患者的粪便血红蛋白水平大于约20 µg血红蛋白/g粪便(相当于OC-传感器FIT试验中使用的稀释样品中的100 ng/ml),则认为患者的粪便血红蛋白试验为阳性。
在一个实施方案中,细胞因子分子选自IL-6和/或IL-8。在另一个实施方案中,无细胞染色质片段是组蛋白同种型H3.1。
在一个实施方案中,所述方法另外包括测量获自患者的体液样品中的CRP水平(即CRP的循环水平)。在一个实施方案中,粪便血红蛋白水平和循环CRP水平,且还任选地一种或多种核小体部分和/或一种或多种白介素水平,用作体内不存在癌症的指示。
在一个实施方案中,所述方法另外包括测量一种或多种肿瘤标志物以研究癌症的器官位置。这样的肿瘤标志物包括CEA(提示CRC或肺癌或胰腺癌)、CYFRA 21-1(提示CRC)、CA 125(提示卵巢癌)、CA 19-9(提示胰腺癌)、CA 15-3(提示乳腺癌)、AFP(提示肝癌)、催乳素(提示垂体肿瘤)、HCG(提示卵巢癌)、PSA(提示前列腺癌)。
因此,根据本发明的另一方面,提供了用于检测癌症和研究受癌症影响的器官的方法,其包括:
检测或测量获自患者的体液样品中至少一种细胞因子分子和至少一种无细胞染色质片段的水平;
使用测量的细胞因子和无细胞染色质片段水平作为体内癌症存在的指示;以及
检测或测量一种或多种肿瘤标志物的水平以确定癌症的位置。
应当理解,仅在首先确定/指示患者患有癌症(即在检测本文所述的生物标志物组之后)时才需要检测或测量肿瘤标志物的水平。
在另一个实施方案中,除肿瘤标志物测量之外或代替肿瘤标志物测量进行循环肿瘤(ctDNA)或无细胞DNA (cfDNA)测量。ctDNA或cfDNA的分析可告知肿瘤位点,例如通过甲基化DNA测序或分析、突变测序或分析、或核小体占据模式测序或分析。因此,在一个实施方案中,该方法包括分析与无细胞染色质片段相关的cfDNA或ctDNA以确定癌症的位置。
因此,根据本发明的另一方面,提供了用于检测癌症和研究受癌症影响的器官的方法,其包括:
检测或测量获自患者的体液样品中至少一种细胞因子分子和至少一种无细胞染色质片段的水平;
使用测量的细胞因子和无细胞染色质片段水平作为体内癌症存在的指示;以及
分析体液样品中的cfDNA或ctDNA以检测癌症的位置。
此外,应当理解的是,仅在首先确定/指示患者患有癌症(即在检测本文所述的生物标志物组之后)时才需要分析cfDNA或ctDNA。
在一个实施方案中,所述方法另外包括确定患者的至少一个临床参数。该参数可用于结果的解释。临床参数可包括任何相关的临床信息,例如但不限于性别、体重、体重指数(BMI)、吸烟状况和饮食习惯。因此,在一个实施方案中,临床参数选自:年龄、性别和体重指数(BMI)。在一个实施方案中,该方法仅用于大于年龄依赖性截止值的患者,例如大于50岁的患者。
在一个实施方案中,与对照相比,较高水平的细胞因子分子和/或较高水平的无细胞染色质片段指示癌症的存在和/或进展。
通过本发明的方法获得的数据可以使用适当的算法分析,例如表1中列出的那些算法。
表1. 用于解释测定组结果的示例模型或算法
组评分 = a[IL-6] + b[H3.1-核小体]
组评分 = a[IL-6] + b[核小体本身]
组评分 = a[IL-6] + b[核小体本身] + c[H3.1-核小体]
在一个实施方案中,测量步骤包括使用表1中列出的算法。用于获得例如表1中的模型或算法的方法在本领域中是众所周知的,且合适的软件包是可用的。用于此目的的典型软件工具包括SPSS(社会科学的统计软件包)和“R”。这些软件包提供临床数据的线性和非线性数据建模。
分析结果的其它方法也可用于本发明的方法。在一个实施方案中,使用人工智能模型。在一个实施方案中,使用单独的测定截止水平,并且如果单独的组测定结果高于(或低于,如果适用的话)所有或最小数量的组测定的测定截止水平(例如,两个中的一个、两个中的两个、三个中的两个等),则认为患者在组试验中是阳性的。在本发明的一个实施方案中,采用决策树模型或算法来分析结果。
本领域技术人员将清楚,本文公开的生物标志物的任何组合都可用于检测癌症的组和算法中,且可将另外的标志物添加到包含这些标志物的组中。
本领域技术人员将清楚,通过核小体测定和细胞因子测定作为试验癌症的更大(血液)测定组的一部分,可进一步改善对患有癌症或前癌症的患者的试验敏感性。
在一个优选的实施方案中,该组检测IL-6的水平或浓度和含有组蛋白同种型H3.1的核小体的水平或浓度。
根据本发明的另一方面,提供了两种或更多种结合剂在制造用于在体液样品中诊断癌症的方法的试剂盒中的用途,其中所述结合剂之一对至少一种细胞因子分子具有特异性,并且所述结合剂对至少一种无细胞染色质片段具有特异性。该方法包括检测或测量获自患者的体液样品中细胞因子分子和无细胞染色质片段的浓度或水平;以及使用在体液样本中检测到的细胞因子分子和无细胞染色质片段的水平或浓度来确定患者是否患有癌症。
根据本发明的另一方面,提供了两种或更多种结合剂在制造用于评估患者对癌症研究的适合性的方法的试剂盒中的用途,其中所述结合剂之一对至少一种细胞因子分子具有特异性,并且所述结合剂对至少一种无细胞染色质片段具有特异性。该方法包括检测或测量获自患者的体液样品中细胞因子分子和无细胞染色质片段的浓度或水平;以及使用在体液样品中检测的细胞因子分子和无细胞染色质片段的水平或浓度来确定患者是否需要进一步的癌症研究。
鉴别诊断方法
本发明的生物标志物的另一个优点是它们可用于鉴别诊断方法。因此,根据本发明的另一方面,提供了一种对疑似癌症患者进行鉴别诊断的方法,其包括:
(i) 检测或测量获自患者的体液样品中至少一种细胞因子分子和至少一种无细胞染色质片段的水平;和
(ii) 将步骤(i)中获得的水平与获自非癌性疾病患者的体液样品中的至少一种细胞因子分子和至少一种无细胞染色质片段的水平进行比较,
其中步骤(ii)中比较的水平差异指示患者患有癌症。
提及“非癌性疾病”是指非癌性的,例如不导致恶性肿瘤发展的疾病。它们有时可被称为“良性”疾病。本发明发现了在鉴别诊断方法中的特别用途,其中疑似癌症和与之比较的非癌性疾病位于相同的器官中和/或存在类似的症状。例如,疑似肺癌与非癌性肺病相比的鉴别诊断。非癌性肺病包括但不限于:哮喘、支气管炎、慢性咳嗽、慢性阻塞性肺病(COPD)、隐球菌病、肺炎、结节病和结核病。本发明在诊断疑似肺癌患者(例如由于肺中肿块的症状和/或鉴定)中有特别用途,因为该试验区分了肺癌和其它非癌性肺病患者。因此,在一个实施方案中,非癌性肺病是具有与肺癌类似的体征和/或症状的疾病,例如COPD。
如本文呈现的实施例所示,本发明的生物标志物组能够区分肺癌患者(小细胞和非小细胞肺癌)和COPD患者和健康患者(参见图1和4)。
作为另一个实例,可与非癌性结肠或肠疾病相比对疑似结直肠癌患者进行鉴别诊断。非癌性结肠和肠疾病包括但不限于:息肉、克罗恩病、结肠炎、炎性肠病、溃疡性结肠炎和憩室病。本发明在诊断疑似结直肠癌患者(例如由于粪便出血的症状和/或鉴定)中有特别用途,因为该试验区分了患CRC和其它非癌性疾病的患者。因此,在一个实施方案中,非癌性结肠或肠疾病是具有与结直肠癌类似的体征和/或症状的疾病,例如憩室病。
如本文呈现的实施例所示,本发明的生物标志物组能够区分结直肠癌患者和患有各种非癌性结肠和肠疾病的患者以及健康患者(参见图2和3)。例如,使用包括核小体本身、含有组蛋白同种型H3.1的核小体和IL-6的测量的三测定组,用优化的模型和截止值区分CRC患者与结肠镜检查无发现的受试者和具有非恶性良性结肠或肠疾病的患者,本发明的方法能够在具有清楚的疾病阶段依赖性的所有其它患者(患病和未患病)中以90%特异性鉴定出50%的CRC病例,如图3所示。因此,本发明的该实施方案可用于检查具有结直肠疾病症状的人,以从具有其它非恶性病况或无病的那些人中鉴定CRC患者。
作为另一个实例,可与非癌性疾病相比对疑似卵巢癌患者进行鉴别诊断。女性可能患有病因不明的盆腔包块。这种包块可能是恶性的,但由于各种其它原因也可能在性质上是囊肿或纤维瘤。卵巢的非癌性疾病包括但不限于:子宫内膜异位症、卵巢囊肿和多囊卵巢综合征。本发明可用于诊断疑似卵巢癌患者(例如由于症状),因为该试验可区分患有卵巢癌和其它非癌症疾病的患者。因此,在一个实施方案中,非癌性疾病是盆腔包块或具有与卵巢癌相似的体征和/或症状的卵巢的非癌性疾病。
作为另一个实例,可与非癌性前列腺疾病相比对疑似前列腺癌患者进行鉴别诊断。前列腺的非癌性疾病包括但不限于:前列腺肥大或前列腺炎。本发明可用于诊断疑似前列腺癌患者(例如由于症状),因为该试验可区分患有前列腺癌和其它非癌症疾病的患者。因此,在一个实施方案中,非癌性前列腺疾病是具有与前列腺癌相似的体征和/或症状的疾病。
治疗方法
根据本发明的另一方面,提供了治疗患者的癌症的方法,其包括:
(i) 检测或测量获自患者的体液样品中的至少一种细胞因子分子和至少一种无细胞染色质片段;
(ii )使用在体液样本中检测到的所述细胞因子分子和所述无细胞染色质片段的水平或浓度来确定患者是否患有癌症;以及
(iii )如果在步骤(ii)中确定患者患有癌症,则对患者施加治疗。
在一个实施方案中,所述方法另外包括测量一种或多种肿瘤标志物的水平以检测癌症的位置(例如在步骤(iii)之前)。
在一个实施方案中,所述方法另外包括内窥镜检查程序以检测癌症的位置(例如在步骤(iii)之前)
在一个实施方案中,所述方法另外包括分析与无细胞染色质片段相关的DNA(例如在步骤(iii)之前)。该实施方案可包括分析受试者的循环肿瘤DNA(ctDNA)或无细胞DNA(cfDNA)以检测癌症的位置(例如在步骤(iii)之前)。
在本发明的这一方面,有许多可单独或组合使用的备选ctDNA或cfDNA分析,包括例如DNA序列突变分析、甲基化DNA序列分析(例如如先前关于SEPTIN-9基因所述)和如由Snyder等人,2016(通过引用并入本文)所述的核小体定位或“片段组学”分析。
在一个实施方案中,所述方法另外包括对受试者进行一种或多种扫描方法(例如在步骤(iii)之前)。扫描方法可用于检测癌症的位置。
在本发明的这个方面中,有许多可单独或组合使用的备选的扫描方法,包括例如全身扫描、MRI扫描、超声扫描、LDCT、乳房摄影术、计算机断层(CT)结肠镜检查或其它扫描法。
可用的癌症治疗包括手术(包括活组织检查)、放射疗法(包括近距离放射疗法)、激素疗法、免疫疗法以及用于化学疗法的多种药物治疗。在一个实施方案中,施用的一种或多种治疗选自:手术、放射疗法、激素疗法、免疫疗法和/或化学疗法。
根据本发明的另一个方面,提供了治疗癌症的方法,包括使用本发明的组试验鉴定需要治疗癌症的患者并提供所述治疗,其中所述组试验包含检测获自患者的体液样品中至少一种细胞因子分子和至少一种无细胞染色质片段的试剂。在一个实施方案中,如果患者与对照相比具有升高的细胞因子和/或无细胞染色质片段水平,则患者处于癌症的高风险中。
在一个实施方案中,对照包括健康受试者、无病受试者和/或无癌症的受试者。在一个实施方案中,所述方法包括将获自受试者的体液样品中存在的生物标志物的量与获自正常受试者的体液样品中存在的生物标志物的量进行比较。应当理解,“正常”受试者是指健康/无病受试者。
在一个实施方案中,对照包括患有非癌性疾病的受试者。本发明的方法能够区分患癌的受试者和患非癌性疾病例如COPD(当与肺癌比较时)和结肠炎或憩室病(当与CRC比较时)的受试者,如本文提供的鉴别诊断部分的方法中所述。因此,一方面,诊断包括从非癌性疾病中鉴别诊断癌症。
患者评估的方法
本发明在评估患者是否需要对癌症进行进一步研究中有特别用途(例如用于诊断和/或识别器官位置)。这些程序,包括结肠镜检查、其它内窥镜检查方法、乳房摄影术、X-射线、LDCT扫描、其它扫描和活组织检查是创伤性的或潜在危险的,并且对医疗保健提供者来说相对昂贵。因此,需要减少送去不必要的研究的患者数量。例如,本发明的这个方面可用于评估需要结肠镜检查或活组织检查的FIT或LDCT阳性的人。因此,根据本发明的另一方面,提供了一种用于评估患者对癌症研究的适合性(即确定患者是否需要进一步的癌症研究试验)的方法,其包括:
检测或测量获自患者的体液样品中的至少一种细胞因子分子和至少一种无细胞染色质片段;以及
使用检测的细胞因子分子和无细胞染色质片段的水平或浓度来确定患者是否需要进一步的癌症研究。
如本文提供的实施例所示,本发明具有作为CRC血液试验的应用,用于在无症状受试者中、在不顺从FIT的患者中检测CRC,或除了FIT之外还检测CRC,以得到较低的组合假阳性率。本发明试验中的阳性结果像FIT一样指示需要转诊结肠镜检查。
根据本发明的另一方面,提供了一种鉴定需要结肠镜检查的患者的方法,该方法包括将获自患者的体液样本应用于如本文所定义的组试验,并使用从组试验获得的结果来鉴定患者是否需要结肠镜检查。
根据本发明的另一方面,提供了一种鉴定需要LDCT、乳房摄影术或其它扫描的患者的方法,该方法包括将获自患者的体液样本应用于如本文所定义的组试验,并使用从组试验获得的结果来鉴定患者是否需要扫描。
在一个实施方案中,在多个时机重复本文所述的方法。该实施方案提供了允许在一段时间内监测检测结果的优点。这样的安排将提供监测或评估疾病状态的治疗功效的益处。本发明的这种监测方法可用于监测发作、进展、稳定、改善、复发和/或缓解。
因此,本发明还提供了监测对疑似患有这种疾病的受试者的疾病状态的疗法功效的方法,包括检测和/或量化来自所述受试者的生物样品中存在的生物标志物(例如本文所述的生物标志物组)。在监测方法中,可以在两个或更多个时机采集试验样品。该方法可进一步包括将存在于试验样品中的生物标志物的水平与一个或多个对照和/或与早先取自相同试验受试者(例如在疗法开始之前)和/或在疗法早先阶段取自相同试验受试者的一个或多个先前试验样品进行比较。该方法可包括检测在不同时机取得的试验样品中生物标志物的性质或量的变化。
因此,根据本发明的另一个方面,提供了一种用于监测人类或动物受试者中的疾病状态的疗法功效的方法,其包括:
(a) 量化如本文所定义的组生物标志物;以及
(b) 将试验样品中的组结果与一个或多个对照和/或在较早时间从相同试验受试者取得的一个或多个先前试验样品的组结果进行比较。
试验样品中的生物标志物结果相对于早先从相同试验受试者取得的先前试验样品中的水平的变化可指示所述疗法对病症或疑似病症的有益作用,例如稳定或改善。此外,一旦治疗完成,本发明的方法可周期性地重复以监测疾病的复发。
监测疗法功效的方法可用于监测人类受试者和非人类动物(例如动物模型)中现有疗法和新疗法的治疗有效性。这些监测方法可以结合到新药物物质和物质组合的筛选中。
在另一个实施方案中,由于速效疗法引起的更快速变化的监测可在数小时或数天的更短时间间隔内进行。
组试验
本文所述的标志物的组合可用于制备组试验,特别是用于诊断癌症和/或监测癌症或疑似癌症的患者。
因此,根据本发明的另一方面,提供了一种包含检测至少一种细胞因子分子和至少一种无细胞染色质片段的试剂的组测定。本文所述的组测定可用于诊断癌症,例如肺癌、结直肠癌、卵巢癌和/或前列腺癌。
在一个实施方案中,所述至少一种细胞因子分子选自IL-6、IL-8和/或IL-10。在一个实施方案中,所述至少一种无细胞染色质片段选自无细胞核小体和组蛋白同种型H3.1。因此,根据本发明的另一方面,提供了包含检测IL-6、组蛋白H3.1和任选地一种或多种生物标志物的试剂的组,所述生物标志物选自:IL-8、IL-10、核小体或其组分,以及核小体的表观遗传特征。
根据本发明的另一方面,提供了包含检测IL-6、总核小体水平和任选地一种或多种生物标志物的试剂的组,所述生物标志物选自:IL-8、IL-10和核小体的表观遗传特征(例如组蛋白H3.1)。
在一个优选的实施方案中,组试验包含(尤其任选地)检测IL-6和组蛋白H3.1的试剂。在其它实施方案中,组可包含检测总核小体水平和/或H1-核小体水平的试剂和/或可包含其它核小体测量。因此,在另一个实施方案中,组试验包含(尤其任选地)检测样品中IL-6、组蛋白H3.1和无细胞核小体(总)水平的试剂。在一个备选的实施方案中,组试验包含检测样品中IL-6和无细胞核小体(即核小体本身)的(总)水平的试剂。
在一个实施方案中,组试验另外包含检测一种或多种生物标志物的试剂,所述生物标志选自:IL-8、IL-10、核小体或其组分,以及核小体的表观遗传特征。在一个实施方案中,组试验用于获自患者的体液样品。
如本文提供的实施例中所示,包括测量含有组蛋白同种型H3.1的核小体和IL-6的组测定能够从正常供体中检测出77%的肺癌病例,如表2中所示,且还能从患有COPD的那些患者中检测出肺癌病例,如图1中所示。因此,这些组测定具有高敏感度和特异性,并且用作高风险群体(例如长期重度吸烟者)的肺癌试验,或用于不顺从低剂量计算机断层扫描(LDCT)的患者,或代替重复的LDCT扫描用于监测具有未知病因的结节的患者,以避免反复的危险的X射线暴露,或用作LDCT的辅助试验以帮助研究由于低特异性而由LDCT筛查产生的假阳性结果。使用包括测量核小体本身、含有组蛋白同种型H3.1的核小体和IL-6的组能够以89%的特异性鉴定80%的CRC病例,如图2所示。该准确度与FIT CRC筛查试验的准确度相当,其敏感度为约72%,特异性为95%,并可应用于检测CRC。
在一个实施方案中,组试验另外包含测量粪便血红蛋白水平的试剂。如实施例中所述,本发明可与粪便血红蛋白水平结合使用以增加FIT试验的特异性。
在一个实施方案中,组试验包含(尤其任选地)检测IL-10和组蛋白H3.1的试剂。在其它实施方案中,组可包含检测总核小体水平和/或H1-核小体水平的试剂和/或可包括其它核小体测量。因此,在一个备选的实施方案中,组试验包含检测样品中IL-10和无细胞核小体的(总)水平(即核小体本身)的试剂。
根据本发明的另一方面,提供了如本文所定义的组试验用于鉴定需要癌症治疗的患者的用途。
根据本发明的另一方面,提供了如本文所定义的组试验用于监测患者的癌症进展(例如,肿瘤的进一步生长或发展至癌症的不同阶段)的用途。该方面的实施方案包括在观察等待、主动监控和监测手术或其它治疗后复发中检测疾病进展的用途。
根据本发明的另一方面,提供了如本文所定义的组试验用于评价患者中癌症治疗的有效性的用途。
根据本发明的另一方面,提供了如本文所定义的组试验用于为癌症患者选择治疗的用途。
在其它实施方案中,组可包含检测总核小体水平和/或H1-核小体水平的试剂和/或可包括其它核小体测量,例如核小体的表观遗传特征(例如组蛋白H3.1水平)。一些另外的实施方案在表1中以示例算法形式列出,但不限于此。
测量方法
在一个实施方案中,将检测到的细胞因子分子和无细胞染色质片段的水平或浓度与对照进行比较。本领域技术人员将清楚的是,对照受试者可在多种基础上选择,所述基础可包括例如已知没有疾病的受试者或可为患有不同疾病的受试者(例如用于鉴别诊断的研究)。“对照”可包括健康受试者、无病受试者和/或无癌症的受试者。对照也可为处于不同癌症阶段的受试者,例如I期、II期、III期或IV期癌症。与对照的比较在诊断领域中是众所周知的。
应当理解,不需要在每个时机为了比较目的测量健康/无病对照,因为一旦建立了“正常范围”,就可以将其用作所有后续试验的基准。可以通过从多个未患癌症的对照受试者获得样品并试验生物标志物的水平来建立正常范围。然后可以检查疑似患有癌症的受试者的结果(即生物标志物水平)以查看它们是落在各自的正常范围之内或之外。使用“正常范围”是检测疾病的标准做法。
如果确定受试者不患癌症,则本发明仍可用于监测疾病进展的目的。例如,如果用途包括来自确定不患癌症的受试者的血液、血清或血浆样品,则可在另一时间点重复生物标志物水平测量以确定生物标志物水平是否已改变。
对“受试者”或“患者”的提及在本文中互换使用。在一个实施方案中,患者是人类患者。在一个实施方案中,患者是(非人)动物。本文所述的用途、组和方法可在体外、体内或离体进行。
在一个实施方案中,细胞因子和无细胞染色质片段部分的检测或测量包括免疫测定法、免疫化学法、质谱法、色谱法、染色质免疫沉淀法或生物传感器法。
在一个实施方案中,检测或测量包括免疫测定。在本发明的一个优选实施方案中,提供了细胞因子和/或核小体部分的2-位点免疫测定法。特别地,这种方法优选用于原位测量核小体或掺入表观遗传特征的核小体,使用两种抗核小体结合剂或抗核小体结合剂与抗组蛋白修饰或抗组蛋白变体或抗DNA修饰或抗加合物蛋白检测结合剂的组合。在本发明的另一个实施方案中,提供了使用标记的抗核小体检测结合剂与固定的抗组蛋白修饰或抗组蛋白变体或抗DNA修饰或抗加合物蛋白结合剂组合的2-位点免疫测定法。
检测或测量生物标志物的水平可使用一种或多种试剂(例如合适的结合剂)进行。在一个实施方案中,所述一种或多种结合剂包含对所需生物标志物(例如IL-8、IL-6、IL-10、核小体或其组分部分,核小体的表观遗传特征或核小体或其组分部分的结构/形状模拟物)具有特异性的配体或结合剂。本文定义的术语“生物标志物”包括生物标志组中的任何单个生物标志物部分或单独的生物标志物部分的组合。
本领域技术人员将清楚,关于本发明的任何方面的术语“抗体”、“结合剂”或“配体”不是限制性的,而是旨在包括能够结合特定分子或实体的任何结合剂,并且任何合适的结合剂都可用于本发明的方法中。还将清楚的是,术语“核小体”旨在包括单核小体和寡核小体以及可以在流体介质中分析的任何蛋白-DNA染色质片段。
检测生物标志物的方法是本领域已知的。在一个实施方案中,试剂包含一种或多种配体或结合剂。在一个实施方案中,本发明的配体或结合剂包含能够与所需靶标特异性结合的天然存在的或化学合成的化合物。配体或结合剂可包含能够与所需靶标特异性结合的肽、抗体或其片段,或合成配体例如塑料抗体,或适体或寡核苷酸。抗体可以是单克隆抗体或其片段。应理解,如果使用抗体片段,则其保留结合生物标志物的能力,使得生物标志物可被检测(根据本发明)。配体/结合剂可用可检测的标志物标记,例如发光标志物、荧光标志物、酶标志物或放射性标志物;备选地或另外地,根据本发明的配体可用亲和标签标记,例如生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或His(例如hexa-His)标签。或者,配体结合可使用无标记技术确定,例如ForteBio Inc的技术。
提供诊断或监试验剂盒(或组)用于进行本发明的方法。这样的试剂盒将适当地包含一种或多种用于检测和/或量化根据本发明的生物标志物的配体,和/或生物传感器,和/或如本文所述的阵列,任选地连同试剂盒的使用说明书。
本发明的另一方面是用于检测疾病状态存在的试剂盒,其包含能够检测和/或量化一种或多种如本文定义的生物标志物的生物传感器。如本文所用,术语“生物传感器”是指能够检测生物标志物的存在的任何物质。本文描述了生物传感器的实例。生物传感器可包括能够特异性结合生物标志物的如本文所述的配体结合剂或配体。这种生物传感器可用于检测和/或量化本发明的生物标志物。
合适地,用于检测本发明的一种或多种生物标志物的生物传感器将生物分子识别与合适的手段组合,以将样品中生物标志物的存在的检测或定量转化为信号。生物传感器可适用于“备用点”诊断试验,例如在病房、门诊部、外科手术、家中、野外和工作场所中。检测本发明的一种或多种生物标志物的生物传感器包括声学传感器、等离子体共振传感器、全息传感器、生物层干涉测量(BLI)传感器和微工程传感器。印迹识别元件、薄膜晶体管技术、磁声共振器装置和其它新型声电系统可用于生物传感器中以检测本发明的一种或多种生物标志物。
用于检测疾病存在的生物标志物是发现延缓或停止病症进展的新靶标和药物分子的基本靶标。由于生物标志物或生物标志物组的结果指示病症和药物反应,生物标志物可用于在体外和/或体内测定中鉴定新的治疗化合物。本发明的生物标志物和生物标志物组可用于筛查调节生物标志物活性的化合物的方法中。
因此,在本发明的另一方面,提供了如所述的结合剂或配体的用途,其可以是针对根据本发明的生物标志物的肽、抗体或其片段或适体或寡核苷酸;或根据本发明的生物传感器或阵列或试剂盒用于鉴定能够促进和/或抑制生物标志物产生的物质的用途。
术语“生物标志物”是指过程、事件或病况的独特的生物学或生物学衍生的指示物。生物标志物可用于诊断(例如临床筛查)和预后评估方法和可用于监测疗法结果,可用于鉴定最可能对特定治疗性治疗有反应的受试者,可用于药物筛选和开发。生物标志物及其用途对于鉴定新的药物治疗和发现药物治疗的新靶标是有价值的。
如本文所用的术语“检测”或“诊断”涵盖疾病状态的鉴定、确认和/或表征。根据本发明的检测、监测和诊断方法可用于确认疾病的存在,通过评估疾病的发作和进展来监测疾病的发展,或评估疾病的改善或消退。检测、监测和诊断方法也可用于评估临床筛查、预后、疗法选择、评价治疗益处(即用于药物筛选和药物开发)的方法。
鉴定和/或量化可通过适于鉴定来自受试者的生物样品或生物样品的纯化物或提取物或其稀释物中特定蛋白的存在和/或量的任何方法进行。在本发明的方法中,可通过测量一个或多个样品中靶标的浓度来进行量化。可在本发明的方法中试验的生物样品包括如上文所定义的那些。可以例如在适当稀释或浓缩的情况下制备样品,并以常规方式储存。
生物标志物的鉴定和/或量化可通过检测生物标志物或其片段(例如具有C-末端截短或具有N-末端截短的片段)来进行。片段在长度上合适地大于4个氨基酸,例如长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。特别值得注意的是,与组蛋白尾部序列相同或相关的肽是特别有用的组蛋白片段。
例如,检测和/或量化可以使用免疫学方法例如免疫测定进行。免疫测定包括使用定向结合本文定义的生物标志物的一种或多种抗体或其它特定结合剂的任何方法。免疫测定包括采用酶检测法的2-位点免疫测定或免疫量度测定(例如ELISA)、荧光标记的免疫测定、时间分辨荧光标记的免疫测定、化学发光免疫测定、免疫比浊测定、微粒标记的免疫测定和免疫放射测定以及单位点免疫测定、试剂限制的免疫测定、竞争性免疫测定法(包含标记的抗原和标记的抗体)和具有多种标记类型(包括放射性、酶、荧光、时间分辨荧光和微粒标记)的单抗体免疫测定法。所有所述免疫测定法都是本领域众所周知的,包括用于细胞因子和用于核小体。
在另一个实例中,检测和/或量化可以通过选自以下的一种或多种方法进行:SELDI (-TOF)、MALDI (-TOF)、基于1-D凝胶的分析、基于2-D凝胶的分析、质谱(MS)、反相(RP) LC、尺寸渗透(凝胶过滤)、离子交换、亲和力、HPLC、UPLC和其它基于LC或LC-MS的技术。合适的LC MS技术包括ICAT® (Applied Biosystems, CA, USA)或iTRAQ® (AppliedBiosystems, CA, USA)。也可以使用液相色谱(例如高压液相色谱(HPLC)或低压液相色谱(LPLC))、薄层色谱、NMR(核磁共振)光谱。
涉及鉴定和/或量化本发明的一种或多种生物标志的方法可以在台式仪器上进行,或者可以结合到一次性的、诊断或监测平台上,所述平台可以在非实验室环境中使用,例如在医师办公室或在受试者的床边。用于进行本发明的方法的合适的生物传感器包括具有光学或声学读取器的“信用”卡。生物传感器可以被配置为允许收集到的数据经电子传输给医师进行解释,并且因此可以形成电子医疗的基础。
用于疾病状态的生物标志物的鉴定允许诊断程序和治疗方案的整合。本发明的生物标志物的检测可用于在受试者参与临床试验之前筛选受试者。生物标志物提供指示治疗反应、反应失败、不利的副作用特征、药物顺应性程度和达到足够的血清药物水平的手段。生物标志物可用于提供药物不良反应的警告。生物标志物可用于开发个性化疗法,因为反应的评估可用于微调剂量、最小化处方药物的数量、减少获得有效疗法的延迟和避免不良药物反应。因此,通过监测本发明的生物标志物,可以精确地定制受试者护理以匹配由受试者的病症和药物基因组图谱确定的需求,因此生物标志可以用于滴定最佳剂量,预测阳性治疗反应和鉴定处于严重副作用的高风险的那些受试者。
基于生物标志物的试验提供了对“新”受试者的一线评估,并提供了准确和快速诊断的客观量度,使用当前量度无法实现。
生物标志物监测方法、生物传感器和试剂盒作为受试者监测工具也是至关重要的,以使医师能够确定复发是否是由于病症的恶化。如果药理学治疗被评估为不充分的,则可以恢复或增加疗法;如果合适,可以改变疗法。由于生物标志物对病症状态敏感,它们提供药物疗法影响的指示。
应当理解,本文描述的实施方案可应用于本发明的所有方面,即针对用途描述的实施方案可等同地应用于所要求保护的方法等。
现在将参考以下非限制性实施例说明本发明。
实施例
实施例1
血液(血浆)样品取自144人,包括47名肺癌(小细胞肺癌和非小细胞肺癌)患者,43名年龄相似的正常供体和54名慢性阻塞性肺病(COPD)患者。通过ELISA测量含有组蛋白同种型H3.1的核小体和IL-10。简言之,如下进行含有组蛋白同种型H3.1的核小体的测量:将80 µl测定缓冲液和20 µl血浆样品或标准核小体制剂加入到涂覆有定向结合组蛋白H3.1的抗体的微量滴定孔中。盖上微量滴定板,并在室温下轻微震荡孵育2.5小时。弃去微量滴定孔的内容物。将孔用200 µl洗涤溶液洗涤三次并加入100 µl生物素化的抗核小体抗体。再次盖上微量滴定板,并在室温下轻微震荡孵育1.5小时。弃去微量滴定孔的内容物。将孔用200 µl洗涤溶液洗涤三次并加入100 µl链霉抗生物素蛋白-HRP溶液。再次盖上微量滴定板,并在室温下轻微震荡孵育0.5小时。弃去微量滴定孔的内容物。将孔用200 µl洗涤溶液洗涤三次并加入100 µl HRP (辣根过氧化酶)底物溶液。盖上微量滴定板,并在室温下在黑暗中轻微震荡孵育20分钟。在405nm处测量孔的吸光度(OD)。直接使用OD水平或从标准曲线内插含有组蛋白H3.1的核小体的血浆水平。使用商购ELISA方法测量血浆IL-10水平。
我们通过逻辑回归分析对测定结果建模,以训练具有最高AUC的模型或算法,用于比较肺癌患者与正常供体。结果显示IL-10结果可以与含有组蛋白H3.1的核小体的结果组合,作为具有用于癌症检测的相关算法的有效测定组。该算法能够以93%的特异性从正常供体中区分68%的肺癌患者,如表2所示。
实施例2
使用可商购的ELISA方法,测定取自与实施例1中所述相同的144人的血浆样品中如实施例1中所述的含有组蛋白同种型H3.1的核小体和IL-6和IL-8。我们通过逻辑回归分析对测定结果建模,以训练具有最高AUC的模型或算法,用于比较肺癌患者与正常供体。结果显示IL-6结果可以与含有组蛋白H3.1的核小体的结果组合,作为具有用于肺癌检测的相关算法的有效测定组。该算法能够以90%的特异性从正常供体中检测出77%的肺癌病例,如表2所示,并且还能够从患有COPD的那些人中检测出肺癌病例,如图1所示。
表2. 各个生物标志物和组生物标志物的肺癌检测的准确度结果(肺癌患者相对 于正常供体)
Figure DEST_PATH_IMAGE001
实施例3
血液(血浆)样品取自100人,包括20名结直肠癌(CRC)患者、62名患有各种非恶性结肠疾病(包括结肠炎、克罗恩病和憩室病)的患者和18名具有胃肠症状但结肠镜检查无发现的患者。我们使用可商购的ELISA方法测量了如实施例1所述的含有组蛋白同种型H3.1的核小体和IL-6、IL-8和IL-10。我们还使用与上述用于含有组蛋白H3.1的核小体类似的方法,但使用涂覆在微量滴定孔上的抗H3抗体来测量核小体本身。我们通过逻辑回归分析对测定结果建模,以训练具有最高AUC的模型或算法,用于比较CRC患者与结肠镜检查无发现的患者。结果显示,IL-6结果可以与核小体本身和含有组蛋白H3.1的核小体的结果组合,作为具有用于癌症检测的相关算法的有效测定组。如表3和图2所示,该算法能够以89%的特异性从无发现的患者中检测出80%的CRC癌症病例,具有明显的疾病阶段依赖性。
表3. 用于CRC检测的准确度的各自生物标志物和组生物标志物结果(CRC相对于 结肠镜检查无发现的症状性受试者)
Figure 112728DEST_PATH_IMAGE002
实施例4
我们对与实施例3中所述相同的100名患者使用如实施例3中所述的包含核小体本身、含有组蛋白同种型H3.1的核小体和IL-6的相同的三次测量的三测定组,但我们通过逻辑回归分析对测定结果建模以训练具有最高AUC的模型或算法,用于比较CRC患者与结肠镜检查无发现的患者和具有非恶性良性结肠或肠疾病的患者。如图3所示,本发明的方法能够在具有明确疾病阶段依赖性的所有其它患者(患病和未患病)中以90%特异性鉴定出50%的CRC病例。本文实施例4中描述的本发明的实施方案可用于检查具有结直肠疾病症状的人,以从具有其它非恶性病况或无病的那些患者中鉴定CRC患者。
实施例3和4的结果显示,本发明的方法的敏感度和特异性方面的准确度可被定制以最大化用于无症状受试者的试验的敏感度,或最大化用于有症状患者的试验的特异性,以避免通过替代模型训练技术在患有良性疾病的患者中的假阳性癌症诊断。该便利性允许定制用于有症状或无症状患者或其它应用的方法。
实施例5
我们假设,包括细胞因子白介素分子和核小体部分两者的水平的组血液试验不仅可用作单独的肺癌或结直肠癌的标志物,而且可用作一般癌症的标志物。为了试验该假设,我们在实施例1和3中描述的244人(包括肺癌的144人群组和CRC的100人群组的组合)中如上所述通过ELISA测量含有组蛋白同种型H3.1的核小体和IL-6。然后我们使用来自两个群组的组合数据通过逻辑回归分析对测定结果建模,以训练具有最高AUC的模型或算法,用于比较肺癌或CRC患者与结肠镜检查无发现的患者和正常供体。该训练产生了相关的回归模型,其给出了在特异性为90%时75%的敏感度或在特异性为80%时81%的敏感度的用于检测肺癌或结直肠癌的组合准确度。
我们还试验了本发明的这种方法在两个单独的CRC和肺癌(训练)群组的每一个中分开检测CRC和肺癌的功效。在肺癌群组中,检测肺癌的单独结果是在特异性为90%时77%的敏感度,或在特异性为80%时83%的敏感度(参见表2)。在CRC群组中,检测CRC的单独结果是在特异性为90%时45%的敏感度,或在特异性为80%时80%的敏感度(参见表3)。因此,对CRC和肺癌组合训练的本发明的方法与对各个疾病各自训练的方法对于分开检测任一疾病同样有效。
实施例6
为了进一步试验以下假设:包括细胞因子白介素分子和核小体部分两者的水平的组血液试验通常可用作检测癌症的血液试验,我们将在两个训练群组中开发的组合模型应用于在一个不同国家独立于训练群组收集的两个另外的验证患者群组。首先,我们在另一独立收集的70人的肺癌验证群组(包括30名肺癌患者(小细胞和非小细胞肺癌)、30名正常供体受试者和10名COPD患者)中通过ELISA测量含有组蛋白同种型H3.1的核小体和IL-6。然后我们使用实施例5中组合的244人肺癌和CRC训练群组开发的算法,计算这70人的算法得分。如图4所示,70人的算法评分表明,2-测定组合组能够在正常供体中以93%的特异性检测到93%的肺癌,并在验证群组中以80%的特异性检测到100%的肺癌。令人惊讶的是,在验证群组中观察到的本发明的方法的准确度高于在训练集中观察到的准确度。这可能与癌症阶段和两个群组中小细胞和非小细胞疾病患者的混合有关。结果证明了本发明的方法的有效性和实用性。
实施例7
我们在独立收集的63人的多种癌症验证群组中通过ELISA测量了含有组蛋白同种型H3.1的核小体和IL-6,所述验证群组包括30名患各种癌症(包括肺癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、咽癌、喉癌、卵巢癌、食管癌和膀胱癌)的患者以及33名正常供体受试者。这样做是为了确定2-测定组组合模型是否可以检测除CRC和肺癌之外的各种不同的癌症疾病。然后我们使用实施例5中对肺癌和CRC训练群组组合的244人开发的算法,计算这63人的算法得分。63人的算法评分显示2-测定组合组总体上能够以90%的特异性检测到47%的癌症,包括肾癌(2个病例中的1个或1/2)、喉癌(2/3)、肺癌(1/5)、食管癌(1/1)、卵巢癌(6/8)、前列腺癌(2/4)和直肠癌(1/2)。在80%的特异性下,2-测定组合组总体上能够检测到67%的癌症和除了胃癌以外的每种被试验的癌症类型,包括膀胱癌(1/1)、乳腺癌(1/1)、肾癌(1/2)、喉癌(2/3)、肺癌(2/5)、食管癌(1/1)、卵巢癌(7/8)、咽癌(1/2)、前列腺癌(3/4)、直肠癌(1/2)和胃癌(0/1)。群组中仅纳入了一名胃癌患者,因此预计纳入其它胃癌患者会导致检测率增加。结果显示在图5中,并且证明了本发明的方法检测多种癌症类型的效用的广度,其具有作为癌症本身的试验的效用。
实施例8
我们在实施例3中描述的100人CRC群组中测量了核小体本身和IL-6,所述群组包括20名CRC患者、62名患有多种非恶性结肠疾病(包括结肠炎、克罗恩病和憩室病)的患者,以及18名具有胃肠症状但结肠镜检查无发现的患者。我们通过逻辑回归分析对测定结果建模,以训练具有最高AUC的模型或算法,用于比较CRC患者和结肠镜检查无发现的患者。本发明的方法能够在结肠镜检查无发现的患者中以90%的特异性鉴定出45%的CRC病例。本发明的这个实施方案对于从没有疾病的人中检查出患CRC的人是有用的。
以类似于实施例7中描述的实验的方式,然后将该模型应用于包括患有多种癌症疾病的患者的验证群组。包括IL-6和核小体本身的该2-测定组能够以90%特异性检测出60%的癌症,包括肾癌(1/2)、喉癌(2/3)、肺癌(1/5)、食管癌(1/1)、卵巢癌(8/8)、咽癌(1/2)、前列腺癌(3/4)、直肠癌(1/2)。在80%的特异性下,该2-测定组检测到73%的所有各种癌症病例和除胃癌以外的每种试验的癌症类型,包括膀胱癌(1/1)、乳腺癌(1/1)、肾癌(1/2)、喉癌(2/3)、肺癌(2/5)、食管癌(1/1)、卵巢癌(8/8)、咽癌(1/2)、前列腺癌(4/4)、直肠癌(1/2)和胃癌(0/1)。结果显示在图6中,并且证明了本发明的方法检测多种癌症类型的效用的广度,其具有作为癌症本身的试验的效用。
实施例9
为了进一步证明本发明的方法,我们对实施例3和8中描述的CRC训练群组的结果训练了另一个三测定组模型,包括核小体本身、含有组蛋白同种型H3.1的核小体和IL-6的测量。该模型对于CRC检测具有89%特异性下的80%敏感度或80%特异性下的80%敏感度的准确度(表3)。以类似于实施例7中描述的实验的方式,然后将该模型应用于包括患有多种癌症疾病的患者的验证群组。该3-测定组能够以90%的特异性检测到37%的癌症,包括肾癌(1/2)、肺癌(2/5)、卵巢癌(5/8)、前列腺癌(1/4)、直肠癌(1/2)和胃癌(1/1)。在80%的特异性下,3-测定组检测到57%的所有各种癌症病例和除乳腺癌以外的每种试验的癌症类型,包括膀胱癌(1/1)、肾癌(2/2)、喉癌(1/3)、肺癌(3/5)、食管癌(1/1)、卵巢癌(6/8)、咽癌(2/2)、前列腺癌(2/4)、直肠癌(1/2)和胃癌(1/1)。结果显示在图7中,并证明了本发明的方法检测多种癌症类型的效用的广度,其具有作为癌症本身的试验的效用。
实施例10
为了使用简单的截止值证明本发明的方法,而不是基于结果的回归分析的模型或算法,我们使用包括IL-6和含有组蛋白同种型H3.1的核小体的2-测定组的简单的正负截止值,重新分析了来自包括实施例1中描述的47名肺癌患者的144人,加上包括实施例3中描述的20名结直肠癌(CRC)患者的100人,加上包括实施例6中描述的30名肺癌患者的70人(总共314名受试者,包括97名癌症患者)的联合数据。IL-6的截止值设定为≥4 pg/ml,而含有组蛋白同种型H3.1的核小体的截止值设定为光密度为≥1.2 OD单位(相当于约≥±200ng/ml)的测定响应。发现具有至少一个阳性结果(高于各自的阈值截止值)的任何样品被认为是阳性的。该分析以93%的特异性检测到71%的癌症病例。这非常接近FIT试验的准确度,FIT试验广泛用作(结直肠)癌的一线筛查试验。
在组试验中使用简单截止值的优点包括临床医生能够容易地理解试验,并在解释试验结果时消除了对软件或其它帮助的任何需要。
实施例11
从135名患者中收集血浆样品,所述患者在使用OC传感器FIT试验(粪便血红蛋白水平≥100 ng/ml)检查为FIT阳性后转诊结肠镜检查。患者包括无症状筛查患者、有症状患者和处于监控CRC复发或疾病进展的患者。在135名患者中,发现41名患者在结肠镜检查时无病变,37名患者有一个或多个非晚期腺瘤,35名患者有一个或多个晚期腺瘤,而22名患者有CRC,其中5名诊断为I期疾病,2名诊断为II期,8名诊断为III期,6名诊断为IV期,1名诊断为未知阶段疾病。
我们试验了血浆样品中含有组蛋白同种型H3.1的核小体、IL-6、IL-8、IL-10、CRP和HMGB1的水平。使用CRC相对于结肠镜检查中无发现的人的ROC分析来分析数值FIT水平(ng/ml)和血浆结果,以确定敏感度达到100%时的测定或模型的特异性(即在结肠镜检查中没有发现CRC或腺瘤的人中正确鉴定为阴性,同时正确鉴定所有22名CRC患者为阳性的人的比例)。这提供了结肠镜检查中的潜在减少的数字,其可在通过本发明的分类血液试验将所有患有癌症的患者优先进行结肠镜检查的同时实现。进行的所有单独测定都具有正的AUC且都能够正确地鉴定不具有结直肠病变的一些患者且CRC假阴性率为零。表4显示在100%敏感度下生物标志物对CRC的特异性。这是在结肠镜检查中无发现的患者被正确预测未患有CRC且没有遗漏癌症病例的比例(%)的量度。
表4. 分类FIT阳性受试者的单独测定的表现
测定 AUC (%) 100%敏感度下的特异性(%)
FIT 86 32
H3.1-核小体 68 5
IL-6 59 5
1L-8 66 3
IL-10 53 3
CRP 71 12
HMGB1 53 8
然后将血液测定结果与FIT结果组合,以通过回归分析产生算法,用于鉴定未患有CRC的人,同时保持CRC的假阴性率为零。所开发的一些结果模型或算法如表5所示。
表5. 分类FIT阳性受试者的FIT/血液组合测定模型的表现
Figure DEST_PATH_IMAGE003
单独使用FIT试验的数值鉴定出32%的患者,他们的粪便中有血液但结肠镜检查中未发现病变。然而,使用本发明的方法能够将其增加至高达58%。当将衍生模型应用于试验的有症状和无症状受试者(没有监控受试者)时,无结直肠病变的人被正确鉴定为阴性的比例进一步上升至高达68%。
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Claims (25)

1.体液样品中的生物标志物组用于诊断和/或监测癌症的用途,其中所述生物标志物包含至少一种无细胞染色质片段和至少一种细胞因子分子。
2.根据权利要求1所述的用途,其中所述无细胞染色质片段是无细胞核小体。
3.根据权利要求2所述的用途,其中所述无细胞核小体含有表观遗传特征。
4.根据权利要求3所述的用途,其中所述无细胞核小体的所述表观遗传特征选自翻译后组蛋白修饰、组蛋白同种型、与无细胞核小体相关的特定核苷酸和与无细胞核小体相关的蛋白加合物。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的用途,其中所述细胞因子分子是白介素分子。
6.根据权利要求5所述的用途,其中所述白介素分子选自白介素-6、白介素-8和白介素-10。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的用途,其中所述体液样品是血液、血清或血浆样品。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的用途,其中所述无细胞染色质片段和所述细胞因子分子由免疫测定或质谱法测量。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的用途,其中所述无细胞染色质片段通过检测循环无细胞DNA测量。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的用途,其中所述癌症选自:肺癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、咽癌、喉癌、卵巢癌、食管癌和膀胱癌。
11.一种诊断患者的癌症的方法,其包括:
在获自所述患者的体液样品中检测或测量至少一种细胞因子分子和至少一种无细胞染色质片段;且
使用所述体液样品中检测到的所述细胞因子分子和所述无细胞染色质片段的水平或浓度以确定所述患者是否患有癌症。
12.一种评估患者对于癌症研究的适合性的方法,其包括:
在获自所述患者的体液样品中检测或测量至少一种细胞因子分子和至少一种无细胞染色质片段;且
使用所述体液样品中检测到的所述细胞因子分子和所述无细胞染色质片段的水平或浓度以确定所述患者是否需要进一步的癌症研究。
13.根据权利要求11或权利要求12所述的方法,其另外包括确定所述患者的至少一个临床参数。
14.根据权利要求13所述的方法,其中所述临床参数选自:年龄、性别和体重指数(BMI)。
15.根据权利要求11至14中任一项所述的方法,其中所述无细胞染色质片段是任选地含有表观遗传特征的无细胞核小体。
16.根据权利要求11至15中任一项所述的方法,其中所述细胞因子分子是白介素分子,例如白介素-6、白介素-8和白介素-10。
17.根据权利要求11至16中任一项所述的方法,其中将检测到的所述细胞因子分子和所述无细胞染色质片段的水平或浓度与对照进行比较。
18.根据权利要求11至17中任一项所述的方法,其中所述体液样品是血液、血清或血浆样品。
19.根据权利要求11至18中任一项所述的方法,其中使用免疫测定或质谱法进行所述检测或测量。
20.根据权利要求11至19中任一项所述的方法,其另外包括分离与所述体液样品中检测到的所述无细胞染色质片段相关的DNA,并任选地对所述DNA测序。
21.一种治疗患者的癌症的方法,其包括:
(i) 在获自所述患者的体液样品中检测或测量至少一种细胞因子分子和至少一种无细胞染色质片段;
(ii) 使用所述体液样品中检测到的所述细胞因子分子和所述无细胞染色质片段的水平或浓度以确定所述患者是否患有癌症;且
(iii) 如果在步骤(ii)中确定所述患者患有癌症,则对所述患者施加治疗。
22.根据权利要求21所述的方法,其另外包括在步骤(iii)之前测量一种或多种肿瘤标志物的水平以检测所述癌症的位置,和/或分析与所述无细胞染色质片段相关的DNA。
23.包括检测体液样品中至少一种细胞因子分子和至少一种无细胞染色质片段的试剂的组。
24.根据权利要求23所述的组,其用于检测癌症。
25.一种用于评估患者对结肠镜检查的适合性的方法,其包括:
(i) 检测或测量获自所述患者的粪便样品中的粪便血红蛋白水平;
(ii) 在获自所述患者的体液样品中检测或测量至少一种细胞因子分子的水平,任选地包括至少一种无细胞染色质片段的水平;且
(iii) 使用所述测量的粪便血红蛋白和细胞因子水平,任选地与所述无细胞染色质片段水平组合,作为所述患者对结肠镜检查的适合性的指示。
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