TW202115400A - 檢測癌症之方法 - Google Patents

Abstract

本發明係關於使用包括至少一細胞激素分子及至少一游離染色質片段的結合生物標記套組以檢測癌症的體液測試方法。

Description

檢測癌症之方法

本發明係關於一種使用包括至少一細胞激素分子及至少一游離染色質片段的結合生物標記套組以檢測癌症的體液測試方法。

癌症是高死亡率的常見疾病。疾病的生物學被理解為涉及從罹癌前狀態發展到第I期、第II期、第III期及最終第IV期癌症的進程。對於多數癌症疾病，死亡率的變化很大，取決於是在可以找到有效的治療方案的早期局部階段時發現疾病，或者是疾病可能在受影響的器官內擴散或擴散到較難治療之處的晚期階段才發現。晚期階段的癌症症狀多變，取決於癌症種類包括可視的血便、血尿、咳出血液、陰道出血、無法解釋的體重減輕、持續的無法解釋的腫塊（例如，在乳房內）、消化不良、吞嚥困難、疣或痣的變化以及許多其他可能的症狀。然而，由於這些症狀而診斷出的多數癌症已處於晚期階段而難以治療。多數癌症在早期階段為無症狀或伴隨出現非特異性症狀因而不利於診斷。因此，理想情況下應使用癌症測試及早檢測癌症。

已開發國家中死亡率最高的癌症為肺癌。當疾病仍位於肺部內時所檢測到的病例其肺癌的五年存活率大於50%，但當疾病擴散到其他器官時僅有5%。不幸的是，多數肺癌病例是在已經轉移（57%）的情況下被診斷出來的，而僅有16%在早期階段就被診斷出來。在第I期被檢測到的乳癌的五年存活率約為85%，但對於在第IV期轉移性疾病被檢測到的病例的五年存活率僅為10%。同樣地，在第I期被檢測到的大腸直腸癌（CRC）的五年存活率大於90%，但對於在第IV期轉移性疾病被檢測到的病例的五年存活率僅有約10%。許多其他癌症疾病循著類似的模式，因此，許多國家都有篩檢計畫以識別患有癌症或癌前疾病的個體。最常篩檢的癌症是透過乳房攝影掃描的乳癌、透過HPV子宮頸抹片測試及/或子宮頸細胞異常檢查的子宮頸癌、透過糞便免疫化學測試（FIT）及/或結腸鏡檢查的大腸直腸癌（CRC）及最近透過低劑量電腦斷層（LDCT）掃描的肺癌。前列腺特異抗原（PSA）的血液測量儘管未獲得FDA批准用於前列腺癌的篩檢測試，但也經常在健康男性上進行。

透過觸診身體是否有不適當的腫塊、結節或團塊可檢測到某些癌症病例，例如乳癌或睪丸癌。任何這樣的腫塊本質上都可能是或不是癌性的，可能需要進一步研究以確定腫塊本質上是惡性還是良性的。然而，觸診諸如肺、結腸或胰腺的內臟是不可能的，而需要其他癌症測試。多數癌症測試可大致分為以下幾類：（i）掃描以可視化體內的結節、團塊或腫塊、（ii）組織切片檢查以尋找標靶器官中的異常細胞、或（iii）用於由癌症或相關組織或周圍組織釋放的物質的體液測試。所有目前的癌症篩檢方法都具有缺點。掃描雖允許可視化腫塊或結節的檢測，但像觸診一樣，通常無法區分惡性結節及無痛或非惡性（例如，纖維性）腫塊，從而導致特異性差及/或過度診斷。組織切片檢查涉及對於多數組織（例如，肺、肝、腎、前列腺）的高侵入性手術或穿刺檢查。即使是相對可及的組織（例如，子宮頸組織）也需要侵入性及侵入的切片檢查程序。血液及其他體液測試為成本低廉及非侵入性的，但卻很罕見。

子宮頸抹片測試是一種長期建立的癌症篩檢方法。其已被證明可以有效地預防女性個體的疾病，並降低整個群體的疾病罹患率，因為：（i）其檢測到的癌前子宮頸組織可在發展為癌症之前切除；以及（ii）子宮頸癌影響年輕女性，因此預防可以為個體保留更多有生活品質的時光。子宮頸抹片測試涉及從子宮頸表面取得細胞抹片樣品，檢查該樣品是否存在任何異常癌細胞或癌前細胞。可以透過細胞的細胞學檢查或透過測試細胞是否摻入人類乳突病毒（HPV）DNA的摻入來檢查抹片。樣品的細胞學檢查可為70%-80%的受測女性提供正確的檢測結果，而樣品的HPV測試則可為90%-95%的受測女性提供正確的檢測結果。然而，子宮頸抹片採樣是具侵入性及侵入的，其將影響患者使用測試。依從性隨女性年齡而有所不同，但總體約有80%。常用血液測試沒有用於子宮頸癌的。

CRC在美國的主要篩檢方法是結腸鏡檢查。此測試對於CRC的檢測是準確的，並還可識別可能發展為CRC的潛在初癌的多數結直腸息肉或腺瘤。癌前結直腸息肉的切除使患者的預後良好。然而，結腸鏡檢查很昂貴且在美國的費用超過1000美元。該測試也是侵入性及侵入的，需要手術入院且有時會造成傷害（例如，由於腸管撕裂）。該過程通常在麻醉下進行，並且需要事先由患者進行徹底沖洗腸道的不愉快準備。此外，由於CRC的罹病率低，僅在約0.5%的結腸鏡檢查中檢測到該疾病，因此絕大多數的人們是在接受外科手術中接受篩檢，而效益甚微。所有這些的缺點都會影響測試的使用，且在美國透過結腸鏡檢查對CRC進行篩檢的依從性很差，大約佔篩檢年齡人口的60%。由於其缺點，在世界上多數國家，結腸鏡檢查並未被用作前線CRC檢測或篩檢的方法。

一些醫療照護提供者採用了一種稱為乙狀結腸鏡檢查的相關方法，在該方法中僅檢查降結腸的較短範圍。儘管此方法省略了三分之二的結腸，但其確實檢查了最常觀察到癌症的區域。乙狀結腸鏡檢查的缺點與結腸鏡檢查相似，並且出於相似的原因不常被用作前線測試。也可以使用虛擬結腸鏡檢查或電腦斷層結腸造影。此程序結合了X射線及電腦技術來創建直腸及結腸的圖像，以檢測結腸腫瘤及腺瘤。

最常用的CRC檢測及篩檢方法涉及兩階段的程序，其中首先透過非侵入性前線糞便測試篩選篩檢年齡的族群，以識別篩檢族群中CRC風險較高的亞組。在糞便測試中呈陽性的人們將被轉介做結腸鏡檢查，而這些人們中通常約有5%會被發現患有CRC。糞便篩檢的結果對多數人來說是陰性的，因此該兩階段方法可防止多數無病灶的人接受不必要的結腸鏡檢查。

當前用於CRC的糞便測試的原理是檢測結腸或直腸出血。例如，當結腸或直腸被侵入性癌性或癌前生長部分阻塞時，糞便經過阻塞處的運動可能會導致受傷及出血。透過測試糞便樣品中是否存在血紅蛋白來檢測出血情況。由於每天的出血程度可能會有很大變化，因此可能需要在不同日進行多次測試。

所有目前的糞便CRC測試均設計以檢測糞便血紅蛋白。癒創木脂糞便潛血檢查（FOBT或gFOBT）是一種針對血紅蛋白的化學測試方法，其中患者或操作者通常將少量糞便塗在α-癒創木酸塗層紙或其他基材上。如果糞便中存在血液，則在由血紅素（血紅蛋白的一種成分）催化的反應中，透過將α-癒創木酸氧化為藍色的醌（quinone），向紙中添加的過氧化氫產生快速的顏色變化。食用肉類（因為血紅素）以及一些蔬菜（其中含有其他在測試中表現得像血紅素的催化劑分子）會導致偽陽性結果。同樣地，某些物質（包含維他命C）可能導致偽陰性結果，因此通常建議在測試前限制飲食。取決於所使用的臨界值，癒創木脂FOBT檢查可具有很高的臨床特異性，並對CRC檢測的靈敏度為60-70%。對癌前腺瘤的檢測則很差。化學FOBT方法為過去選擇的方法，儘管仍被廣泛使用，但已被FIT方法取代。

FIT方法（也稱為iFOBT或FOBTi）基本上是糞便樣品中人血紅蛋白的免疫測定測試。由於飲食因素的干擾，FIT方法不太容易出現偽陽性及偽陰性結果，並可以檢測到糞便中的較少量的血液。這些測試以95%的特異性檢測到約72%的CRC病例，因此與具有相似特異性的gFOBT相比，檢測到與臨床相關的癌症病灶略多一些。對腺瘤的檢測則很差。FIT及gFOBT測試為非侵入性且成本低廉，但需要患者對糞便進行操作，這不便於執行且導致低依從性。在執行國家篩檢計畫的歐洲依從性最高的國家中，患者對FIT及FOBT方法的依從性為60%-70%，但在許多國家中，患者的依從性低至10%-20%。此外，測試並不完全可靠。FIT遺漏約30%的CRC病例，此外，多數FIT陽性受試者沒有癌症，並因而接受後續的侵入性結腸鏡檢查，而效益甚微或沒有效益。除了進行糞便血紅蛋白測量外，由精密科學公司（Exact Sciences）所生產用於CRC的Cologuard糞便測試還採用了多種糞便DNA測量，以87%的特異性將測試準確性提高到92%的靈敏度。CRC檢測的血液測試主要由於其缺乏準確性而沒有在臨床上使用。例如，FDA目前唯一批准用於CRC的血液檢測為Epi Procolon測試，其可以以80%的特異性檢測到68%的CRC病例（Potter等，2014）。

當治療方案具有更好的結果時，通常透過乳房攝影進行乳癌篩檢以早期檢測到疾病。乳房攝影使用低劑量X射線以在可被感覺到之前將乳房的任何小腫塊可視化，或顯示稱為微鈣化的微小鈣團簇。必須透過活檢組織學確認癌症，因為腫塊或斑點可能是由於其他像是脂肪細胞或囊腫的疾病所引起，且多達50%的陽性結果為偽陽性結果。此外，某些真正的陽性結果會導致過度診斷，因為小腫塊本質上是無痛的，且不會進展為威脅生命的疾病。偽陽性及過度診斷可能導致不必要的侵入性程序，並進一步暴露於X射線。這些缺點及X射線暴露的固有危險導致患者依從性降低。目前用於乳癌檢測的血液測試對於例行性臨床使用而言還不夠準確。例如，CA15-3是最常用的乳癌腫瘤標記物，以95%的特異性檢測出19%的乳癌病例（Wojtacki等，1994）。

最近推薦透過LDCT進行肺癌篩檢作為用於在高風險主體（例如，長期重度吸菸者）中及早發現該疾病的篩檢測試。LDCT使用低劑量X射線來可視化肺中早期的小腫塊或結節。然而，與其他掃描方法一樣，觀察到的任何腫塊本質上可能是也可能不是癌性的，因此必須透過活檢組織學確認癌症。LDCT陽性結果中多達40%為偽陽性結果，其中所檢測到的病灶不是癌性的。此外，發現了許多病因不明的結節，這些結節本質上可能是也可能不是惡性的，但對於活檢而言太小。偽陽性結果可能導致不必要的侵入性程序，而病因不明的結節可能導致反覆的追蹤掃描以監測腫塊，而進一步反覆暴露於X射線。臨床上並未使用血液測試來檢測肺癌主要是由於缺乏準確性。例如，已經提出了以76%的特異性檢測出21%的肺癌病例的miRNA測試以作為前線篩檢測試，且正在評估以87%的特異性檢測41%的肺癌病例的早期CDT-肺（EarlyCDT-Lung）測試作為主要篩檢測試（Midthun，2016）。

目前篩檢方法的一個重要失敗點是患者依從性低，因為未能進行篩檢可能導致患者早逝，並增加醫療機構昂貴的晚期癌症治療負擔。在美國的50歲以上的人們對結腸鏡檢查的依從性差，約有60%。其餘未接受篩檢的人們罹患CRC的風險明顯增加。歐洲針對CRC的FIT篩檢計畫同樣依從性差，為60%-70%。乳房攝影及LDCT測試涉及暴露於有害的X射線，且頻繁或反覆的測試有可能致癌。於撰寫本文時，LDCT是近期的篩檢發展，但早期經驗指出依從性差，可能低至20%。對此的原因可能包含需要每3-6個月對病因不明的結節進行重複掃描，使受試者暴露於重複的X射線劑量下，有可能在原本緩慢成長的結節中加速癌症的發展。美國預防服務工作小組（USPSTF）已確定需要生物標記以準確地辨別在LDCT掃描中識別的良性及惡性結節（Moyer，2014）。所有目前的癌症篩檢方法均具有結合準確性差、過度診斷、成本高昂、高度侵入性、暴露於X射線及患者依從性低的缺點。

多數常見的癌症無法進行篩檢，包含例如淋巴瘤、腎臟癌、膀胱癌、胰腺癌、子宮癌、骨髓瘤、甲狀腺癌、卵巢癌或肝癌。這反映出對於這些疾病缺乏良好的癌症血液測試。前列腺癌是獨特的案例，因為儘管沒有核准或推薦的篩檢測試，但通常對健康男性進行PSA測試，且陽性結果將導致對疑似前列腺癌進行後續測試。PSA測試的主要優點不在於其準確性，而在於其如血液測試的性質。這是一種可以包含在例行性健康檢查中的低成本、非侵入性測試，由於不需要到醫院就診、不需要患者進行特殊準備，且所需要的血液量很小（>100µL），意味著不需要專門抽血，因此可消除多數依從性問題，所以測試可以與醫師要求的其他例行性測試（例如，膽固醇、血糖及肝酶）一起包括在清單中以作為例行性健康檢查的一部分。

為了滿足對簡單例行性癌症血液測試的需求，已對許多血液輸送的生物標記進行研究以作為潛在癌症測試方法，包含適用於CRC的癌胚抗原（carcinoembryonic antigen, CEA）、適用於肝癌的α-胎兒蛋白（alpha-fetoprotein, AFP）、適用於卵巢癌的CA125、適用於胰腺癌的CA19-9、適用於乳癌的CA 15-3及適用於前列腺癌的PSA。然而，它們的臨床準確性對於例行性診斷使用而言太低，並被認為更適合用於監測患者。

最近，已經研究特定基因序列的過度甲基化（hypermethylation）以用作血液中用於癌症的診斷生物標記。例如，已經透過胞嘧啶的選擇性亞硫酸氫鹽脫氨成尿嘧啶而不是對5-甲基胞嘧啶脫氨來研究特定基因或基因座的DNA甲基化狀態，從而導致可以透過測序或其他手段檢測到主要DNA序列變化（Yang等，2004）。一種用於SEPTIN-9基因的過度甲基化的此種測試方法是美國食品及藥品管理局（FDA）目前核准用於CRC檢測的唯一血液測試方法。此測試方法被發現可以以80%的特異性檢測到68%的CRC病例。同樣地，使用循環腫瘤DNA（ctDNA）作為血液檢測中癌症檢測的基礎引起了極大的興趣。然而，ctDNA測試識別晚期癌症，而不能檢測早期癌症。此外，ctDNA測試昂貴且需要大量血液。這些缺點意味著其不太可能用作例行性癌症篩檢方法。

此領域的工作人員還研究了許多其他用於癌症檢測的生物標記，包含循環游離核小體自身（Holdenrieder等，2001）及諸如TNFα、白介素-6（IL-6）及白介素-8（IL-8）的發炎性分子（Chadha等，2014）。

儘管眾所皆知，在多種癌症疾病下，游離核小體自身的循環量可能會升高，但游離核小體的測量尚未在臨床上用於檢測癌症或用於任何其他臨床目的（Holdenrieder等，2001）。在臨床用途中游離核小體自身的測量的主要缺點在於升高量為細胞死亡的非特異性指標，並據報導存在包含婦科疾病、自體免疫性疾病、發炎性疾病、中風、心臟病、敗血症、移植物抗宿主疾病的創傷及燒傷後的關係（graft vs host disease trauma and following burns）、手術或運動後的多種疾病（Holdenrieder等，2015以及Holdenrieder及Stieber，2009）。因此，核小體自身的升高量的測量被認為是非特異性的疾病指標，而無法在腫瘤學中使用。

還已研究包含特定表觀遺傳訊號的循環游離核小體以作為癌症的標記，該特定表觀遺傳訊號包含特定的轉譯後修飾、組織蛋白異形體、修飾核苷酸及非組織蛋白染色質蛋白（在WO2005019826、WO2013030577、WO2013030579及WO2013084002中引用）。

據報導，包含許多白介素蛋白在內的細胞激素發炎性分子的循環量在癌症中也發生改變。人類基因組中編碼的白介素及相關蛋白有超過50種。這些分別表示為白介素1（IL-1）、白介素2（IL-2）等。據報導癌症中許多細胞激素的升高量，例如包含但不限於IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-11、IL-12、TNF-α及CRP（Lipitz及Harris，2016以及Allin等，2011）。例如，已在包含CRC以及淋巴瘤、神經膠質瘤、黑色素瘤、乳癌、卵巢癌、腎臟癌及胰腺癌的大範圍人類癌症中研究了IL-6在腫瘤形成中的作用（Wang及Sun，2014）。在包含大腸直腸癌、前列腺癌、皮膚癌、乳癌、肺癌、食道癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、婦科疾病、腎臟癌、膀胱癌及血液癌的許多癌症中，循環IL-6量的升高與腫瘤形成、疾病進程及預後不良有關（Taniguchi及Karin，2014）。同樣地，在包括大腸直腸癌、胃癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌及乳癌的許多癌症中，循環IL-8量也會升高。

然而，細胞激素標記通常不用作癌症測試。這些標記的主要缺點在於它們是涉及包含肥胖症、糖尿病、自體免疫性疾病、發炎性疾病及感染在內的大範圍疾病的非特異性標記。

儘管有最新發展，儘管有反對這樣做的建議，但可能除了使用PSA進行前列腺癌檢測外，仍沒有常規使用用於癌症篩檢的血液測試方法。有必要開發用於個別癌症的非侵入性血液測試以及通常用於一般癌症篩檢的癌症診斷、或將癌症包括或排除以作為有症狀患者的潛在診斷或作為其他癌症檢測方法的輔助手段。

依據本發明的第一態樣，提供一種生物標記套組用於在一體液樣品中診斷及/或監測一癌症的用途，其中該生物標記包括至少一游離染色質片段及至少一細胞激素分子。

依據本發明的再一態樣，提供一種診斷一患者癌症的方法，包括： 檢測或測量從該患者取得的一體液樣品中的至少一細胞激素分子及至少一游離染色質片段；以及 使用該體液樣品中檢測到的該細胞激素分子及該游離染色質片段的量或濃度以判斷該患者是否罹患癌症。

依據本發明的再一態樣，提供一種評估一患者是否適合進行癌症研究的方法，包括： 檢測或測量從該患者取得的一體液樣品中的至少一細胞激素分子及至少一游離染色質片段；以及 使用該體液樣品中檢測到的該細胞激素分子及該游離染色質片段的量或濃度以判斷該患者是否需要進一步的癌症研究。

依據本發明的再一態樣，提供一種治療一患者癌症的方法，包括： （i） 檢測或測量從該患者取得的一體液樣品中的至少一細胞激素分子及至少一游離染色質片段； （ii） 使用該體液樣品中檢測到的該細胞激素分子及該游離染色質片段的量或濃度以判斷該患者是否罹患癌症；以及 （iii） 如果在步驟（ii）中判斷該患者罹患癌症，則給予該患者一治療。

依據本發明的再一態樣，提供一種套組，包括檢測一體液樣品中至少一細胞激素分子及至少一游離染色質片段的試劑。

依據本發明的第一態樣，提供一種生物標記套組用於在一體液樣品中診斷及/或監測一癌症的用途，其中該生物標記包括至少一游離染色質片段及至少一細胞激素分子。

在本文提供的實例中，我們已指出癌症患者中幾種白介素的血液量比沒有癌症的人中的觀察到的量增加。我們已針對多種癌症疾病指出了這一點。我們也已指出癌症患者中的核小體自身的循環量比沒有癌症的人中觀察到的量增加。我們也已指出癌症患者中含有特定組織蛋白異形體的核小體的循環量比沒有癌症的人中觀察到的量增加。我們還指出白介素分子及核小體部分兩者的測量作為組合生物標記套組對於癌症疾病的檢測是高度準確的，無論是癌症患者的比例，還是可檢測到的癌症疾病類型的廣度。

對於本領域技術人員而言，本發明的方法將檢測所有或測試的多數癌症類型及所有常見的癌症類型是顯而易見的。如實例中所示，示例性的2-測定法及3-測定法的實施例檢測到了多數癌症病例及所有或多數類型的癌症。對於本領域技術人員而言，可進一步將核小體及/或細胞激素測定法添加至此種套組中以進一步提升檢測的靈敏度及所檢測的癌症的廣度中的任一者或兩者是顯而易見的。於其他實施例中，可將其他非核小體或非細胞激素測定法添加至此種套組中以提升它們的性能。例如，而非限定，可添加CA19-9以提升用於胰腺癌的性能、用於CRC的CEA、用於肝癌的AFP、用於卵巢癌的CA125及用於前列腺癌的PSA等。

我們已指出，包含細胞激素測定法及核小體測定法的測定法組合在癌症檢測的準確性及所檢測到的多種癌症疾病方面對於癌症患者與正常（健康）主體的區別產生了改善結果。我們也已指出，當核小體測定法是用於核小體自身或用於含有組織蛋白異形體或變異體的核小體時，此種測定法套組是有效的。現在我們報導預測主體中癌症存在的非侵入性血液測試的發展。

本發明包括作為生物標記的游離染色質片段。該染色質片段可被檢測為體液樣品（諸如血液、血清或血漿樣品）中的循環核小體，即它們是游離核小體。於一實施例中，游離染色質片段為游離核小體或其組分。因此，提供了至少一細胞激素部分及至少一核小體部分以作為體液樣品中的生物標記用於診斷及/或監測及/或評估癌症的用途。

如本文所用，術語「染色質片段」是指蛋白質及核酸的複合物，其起源於細胞的染色體。染色質片段可以在多蛋白-核酸複合物中含有核小體及/或相關的DNA及/或多種非組織蛋白染色質相關的蛋白中的任一種。非組織蛋白染色質相關的蛋白質（即蛋白質加成物）的一些實例包括轉錄因子、輔因子、輔活化劑、輔抑制體、RNA聚合酶部分、延長因子、染色質重塑因子、媒介物、STAT部分、上游結合因子（UBF）及其他。

核小體是染色質結構的基本單位，由八個高度守恆的核心組織蛋白（包括各一對的組織蛋白H2A、H2B、H3及H4）的蛋白質複合物所組成。此複合物周圍包裹大約146個鹼基對的DNA。另一個組織蛋白H1或H2充當連接子，並參與染色質的壓實。DNA以通常被稱為類似於「串珠」的結構纏繞在連續的核小體上，而此舉形成開放或真染色質的基本結構。在壓實或異染色質中，此串線被纏繞及超級纏繞成封閉且複雜的結構（Herranz及Esteller（2007））。

在檢測體液樣品時提及到的「核小體」可能是指「游離核小體」。將意識的是，貫穿本文使用的術語「游離核小體」旨在包含任何游離染色質片段，其包含一或以上個核小體。本文所指的游離核小體的表觀遺傳訊號結構/特徵可包括但不限於一或以上種組織蛋白轉譯後修飾、組織蛋白異形體/變異體、修飾的核苷酸及/或與核小體結合的蛋白質以作為核小體-蛋白質加成物。

如本文所用，術語「其組分」是指核小體的一部分，即不需要檢測整個核小體。於一實施例中，游離核小體的組分是選自由組織蛋白（即組織蛋白H1、H2A、H2B、H3或H4）、組織蛋白轉譯後修飾、組織蛋白變異體或異形體、與核小體結合的蛋白質（即核小體-蛋白質加成物）、與核小體相關的DNA片段及/或與核小體相關的修飾核苷酸所組成之群組。例如，於一實施例中，其組分為組織蛋白（異形體）H3.1或組織蛋白H1。因此，於一實施例中，該用途包括含有組織蛋白H3.1的核小體及/或含有組織蛋白H1的核小體以作為生物標記。

於一實施例中，游離核小體被測量作為核小體自身的測定法。提及到的「核小體自身」是指樣品中存在的總核小體量或濃度，與核小體可能包含或不包含的任何表觀遺傳特徵無關。此種類型的測定法也通常是指總核小體測定法且通常涉及檢測所有核小體共有的組織蛋白，諸如組織蛋白H4或組織蛋白H3。因此，於一實施例中，透過檢測核心組織蛋白（諸如組織蛋白H3）以測量核小體自身。如本文所述，組織蛋白形成稱為核小體的結構單元，其用於將DNA包裝在真核細胞中。於一實施例中，組織蛋白為核心組織蛋白，諸如H2A、H2B、H3或H4。如先前報導的WO2016067029（透過引用併入本文），特定組織蛋白變異體，諸如組織蛋白H3.1、H3.2或H3t，可用於分離源自腫瘤細胞的游離核小體。因此，可檢測到腫瘤起因的游離核小體的量。

總游離核小體或核小體自身也可透過定量其DNA片段含量來測量。血液中的循環游離DNA（ccfDNA）包括長度小於200個鹼基對的DNA片段，其以染色質片段且特別是核小體的形式循環。已顯示使用PicoGreen核苷酸染色法對ccfDNA進行的血液測量與游離核小體的ELISA測量有95%的相關性（Bjorkman等，2003）。因此，可以將ccfDNA的測量視為等同於或替代了總核小體或總染色質片段的量的測量。用於ccfDNA的定量以作為核小體的替代測量的典型方法包含但不限於使用核苷酸染色（例如，PicoGreen、SYBR Green、SYBER Gold、噁唑黃及噻唑橙）的定量或透過聚合酶鏈反應（PCR）方法用於放大且測量單一複製基因序列的重複DNA序列或其他方法。因此，於一實施例中，游離染色質片段透過檢測ccfDNA測量（或定量）。於再一實施例中，使用核酸染色測量ccfDNA。於再一實施例中，ccfDNA透過PCR測量。此外，依據本發明的再一態樣，提供一種生物標記套組用於在體液樣品中診斷及/或監測癌症的用途，其中生物標記包括至少一細胞激素分子及ccfDNA的測量。

成年人的正常細胞更新涉及每天透過細胞分裂產生10¹¹ 個細胞及相似數量的死亡，主要是透過細胞凋亡。在細胞凋亡過程中，染色質分解為單核小體及寡核小體，其從細胞中釋放出來。據報導，在正常情況下，健康主體中發現的循環核小體的量較低。在患有包含許多癌症、自身免疫疾病、發炎性疾病、中風及心肌梗塞的多種疾病的主體中發現升高的量（Holdenrieder及Stieber，2009）。

可透過酵素免疫測定法（ELISA）檢測單核小體及寡核小體，並且已報導了幾種方法（Salgame等，1997；Holdenrieder等，2001；van Nieuwenhuijze等，2003；WO2005019826；WO2013030577；WO2013030579；及WO2013084002，所有這些都透過引用併入本文）。這些測定法通常使用作為捕獲抗體及檢測抗體（依據要檢測的部分而有所不同）的抗組織蛋白抗體（例如，抗H2B、抗H3或抗H1、H2A、H2B、H3及H4）或作為捕獲抗體的抗組織蛋白抗體及作為檢測抗體的抗DNA抗體。於一實施例中，抗組織蛋白抗體包括抗H3抗體或抗H1抗體。

循環核小體不是蛋白質核苷酸複合物的均質群。相反地，它們是染色質片段的異質群，該染色質片段起源於細胞死亡時對染色質的消化並包含大量表觀遺傳結構，表觀遺傳結構包含特定組織蛋白異形體（或變異體）、轉譯後組織蛋白修飾、核苷酸或修飾核苷酸及蛋白質加成物。對本領域技術人員而言，核小體的量的升高將與某些循環的核小體子群的升高相關，這些子群含有特定表觀遺傳訊號，其包含包括特定組織蛋白異形體（或變異體）、包括特定轉譯後組織蛋白修飾、包括特定的核苷酸或修飾核苷酸以及包括特定蛋白質加成物的核小體。這些類型的染色質片段的測定法為本領域眾所皆知的（例如，參見WO2005019826、WO2013030579、WO2013030578、WO2013084002，其透過引用併入本文）。

因此，於一替代實施例中，游離核小體含有表觀遺傳特徵。於再一實施例中，表觀遺傳特徵是選自組織蛋白轉譯後修飾、組織蛋白異形體、修飾核苷酸及/或與核小體結合的蛋白質（即作為核小體-蛋白質加成物）。應當理解的是，術語「表觀遺傳訊號結構」及「表觀遺傳特徵」在本文中可互換使用，是指可以檢測到的核小體的特定特徵。

於一實施例中，游離核小體包括組織蛋白異形體。作為生物標記套組的一部份所測量的核小體的部分可以是含有一或以上種特定或指定組織蛋白異形體的循環游離核小體。許多組織蛋白異形體是本領域眾所皆知的。大量的組織蛋白異形體的核苷酸序列可在例如國家人類基因組研究所NHGRI組織蛋白數據庫（Mariño-Ramírez, L.、Levine, K.M.、Morales, M.、Zhang, S.、Moreland, R.T.、Baxevanis, A.D.、以及Landsman, D. 組織蛋白資料庫：組織蛋白及組織蛋白折疊蛋白質 資料庫 Vol.2011）、GenBank（NIH遺傳序列）資料庫、EMBL核苷酸序列資料庫及日本的DNA資料銀行（DDBJ）中為公開可用的。於一較佳實施例中，游離核小體包括組織蛋白H3的組織蛋白異形體，例如選自H3.1、H3.2及H3t的組織蛋白異形體。

於另一實施例中，游離核小體包括一或以上種特定或指定轉譯後組織蛋白修飾。核小體的結構可透過組織蛋白的轉譯後修飾（PTM）來改變。組織蛋白的PTM通常發生在核心組織蛋白的尾部，而常見的修飾包含離胺酸殘基的乙醯化、甲基化或泛蛋白化以及精胺酸殘基的甲基化及絲胺酸殘基的磷酸化等。許多組織蛋白修飾是本領域眾所皆知的，且數量隨著識別出新的修飾而增加（Zhao及Garcia，2015）。

於一實施例中，檢測到一組或一類相關的組織蛋白（轉譯後）修飾（而非單一修飾）。此實施例的典型實例，但不限於，將涉及使用一種抗體或其他選擇性結合劑直接與核小體結合以及一種抗體或其他選擇性結合劑直接與有問題的組織蛋白修飾組結合的2位點免疫測定法。出於說明性目的，此些抗體的實例直接與組織蛋白修飾組結合將包含但不限於，抗泛乙醯化（anti-pan-acetylation）抗體（例如，泛乙醯H4抗體）、抗瓜胺酸化（anti-citrullination）抗體或抗泛蛋白化（anti-ubiquitin）抗體。

於一實施例中，游離核小體包括一或以上種DNA修飾（即修飾核苷酸）。除了透過核小體組織蛋白異形體及組織蛋白轉譯後修飾組成物介導的表觀遺傳訊號外，核小體的核苷酸及修飾核苷酸組成物也不同。總體DNA低甲基化是癌細胞的標誌，而某些核小體可能比其他核小體包括更多的5-甲基胞嘧啶殘基（或5-羥甲基胞嘧啶殘基或其他核苷酸或修飾核苷酸）。例如，可以在基因組中的CpG島上檢測到5-羥甲基化。於一實施例中，DNA的修飾選自5-甲基胞嘧啶或5-羥甲基胞嘧啶。

於另一實施例中，游離核小體包括蛋白質加成物，即核小體及與核小體或染色質片段加成的另一非組織蛋白。這樣的加成物可以包含任何含有或包含DNA結合結構域或核小體結合域或組織蛋白結合域的蛋白質。實例包含轉錄因子、結構染色質蛋白、CpG 甲基-CpG結合域蛋白、高遷移率族蛋白（例如，HMGB1）、諸如組織蛋白乙醯基轉移酶、組織蛋白甲基轉移酶、組織蛋白脫乙醯基酶、DNA甲基轉移酶、PARP（聚ADP核糖聚合酶）結合劑等的表觀遺傳酶。

於一實施例中，加成至核小體上的蛋白質（因此可用作生物標記）是選自轉錄因子、高遷移率族蛋白質或染色質修飾酶。提及到的「轉錄因子」是指結合DNA並透過促進（即活化物）或抑制（抑制物）轉錄來調控基因表達的蛋白質。轉錄因子含有一或以上種DNA結合域（DBDs），其附著在與他們調控的基因相鄰的特定DNA序列上。

本文所述的所有循環核小體及核小體部分、類型或亞組均可用於本發明。

於一實施例中，細胞激素分子是白介素分子。白介素（ILs）是一組通常由白血球分泌的細胞激素，以充當訊號分子。它們在刺激免疫反應及發炎中扮演關鍵角色。它們是在1970年代首次發現的，由於已發現更多的白介素類型，因此數字已被指定。白介素的實例包含但不限於：IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14及IL-15。

於一實施例中，白介素分子包括白介素-6。白介素-6（IL-6）是一種具有各種生物學功能的細胞激素。它是發燒及急性期反應的有效誘導物。人類IL-6的序列是本領域眾所皆知的，並在UniProt登錄號P05231中描述。

於一實施例中，該用途包括作為生物標記的白介素-8。白介素-8（IL-8，也稱為CXCL8）是一種趨化因子，可吸引諸如嗜中性白血球（neutrophils）、嗜鹼性白血球（basophils）及T細胞的免疫細胞。它從幾種細胞類型中釋放出來以回應發炎刺激。人類IL-8的序列是本領域眾所皆知的，並在UniProt登錄號P10145中描述。

於一實施例中，該用途包括作為生物標記的白介素-10。白介素-10（IL-10）是一種具有各種生物學功能的細胞激素。人類IL-10的序列是本領域眾所皆知的，並在UniProt登錄號P22301中描述。

於本發明的一較佳實施例中，生物標記包括IL-6、IL-8、IL-10或其組合。於另一實施例中，至少一細胞激素分子是IL-6。

於一實施例中，至少一游離染色質片段包括組織蛋白異形體H3.1及IL-6。於再一實施例中，生物標記包括組織蛋白異形體H3.1、核小體自身（即樣品中游離核小體的總量）及IL-6。於一替代實施例中，生物標記由組織蛋白異形體H3.1、IL-6及可選的核小體自身所組成。如前所述，有多種檢測核小體自身的量的方法，例如透過使用一種試劑以檢測諸如組織蛋白H3的核心組織蛋白。

在本領域技術人員中是眾所皆知的，可以在生物標記套組中使用額外的生物標記（除了核小體部分及細胞激素部分之外）以檢測癌症及/或識別受疾病影響的器官。於一實施例中，該用途還包括一或以上種選自鐵蛋白、癌胚抗原（CEA）、CYFRA 21-1（細胞角蛋白19片段）、癌症抗原 125（CA 125）、碳水化合物抗原 19-9（CA 19-9）、碳水化合物抗原 15-3（CA 15-3）、甲型胎兒蛋白（AFP）、催乳素、人絨毛膜促性腺激素（HCG）、前列腺特異性抗原（PSA）及C反應蛋白（CRP）的生物標記。

樣品可為取自主體的任何生物流體（或體液）樣品，包含但不限於，腦脊髓液（CSF）、全血、血清、血漿、經血、子宮內膜液、尿液、唾液、或其他體液（糞便、淚液、滑液、痰）、呼吸（例如，凝結的呼吸）、或其萃取物或純化物或其稀釋物。生物樣品還包含來自活體或驗屍的標本。樣品可例如在適當稀釋或濃縮的情況下製備，並以常規方式儲存。應當理解的是，本發明的方法及用途在從患者獲得的血液、血清或血漿樣品中發現特定用途。於一實施例中，樣品為血液或血漿樣品。於再一實施例中，樣品為血清樣品。於再一實施例中，血清及血漿樣品均用於測定法套組的不同部分的測量。

於一實施例中，生物標記用於診斷癌症的階段。癌症可分為第I期、第II期、第III期及第IV期。各期的定義隨不同癌症疾病而變化，並且是本領域眾所皆知的。通常，將第I期歸類為癌症較小且局限於起源組織內。第II期被歸類為癌症已長大且超出其起源處而進入器官內的周圍組織或附近的淋巴結。第III期被歸類為癌症已經生長到超過起源器官以外的附近組織，但尚未擴散到身體其他較遠的部分。第IV期被歸類為癌症已擴散到一或以上個身體的遠處，諸如肝臟或肺部。

於一實施例中，癌症為第I期（例如，第IA期或第IB期）、第II期（例如，第IIA期或第IIB期）、第III期（例如，第IIIA期或第IIIB期）或第IV期（例如，第IVA期或第IVB期）癌症。本發明可用於檢測早期癌症，特別是第I期及第II期。因此，於一實施例中，癌症為第I期、第II期、或第III期。於再一實施例中，癌症為第I期或第II期。於一替代實施例中，癌症為第II期或第III期。本發明還可用於檢測晚期癌症，特別是第III期及第IV期。因此，於一實施例中，癌症為第III期或第IV期。於再一實施例中，癌症為第IV期。

於一實施例中，癌症是選自：肺癌、結腸癌、直腸癌、胃癌、腎癌、皮膚癌、前列腺癌、子宮頸癌、乳癌、咽癌、喉癌、卵巢癌、食道癌、口腔癌、胰腺癌及膀胱癌。於再一實施例中，癌症是選自肺癌、大腸直腸癌、卵巢癌及前列腺癌，特別是肺癌及大腸直腸癌。於又一實施例中，癌症是肺癌（諸如非小細胞肺癌或小細胞肺癌）。

依據本發明的再一態樣，提供了游離染色質片段結合劑及細胞激素分子結合劑在製造用於診斷及/或監測體液樣品中的癌症的試劑盒中的用途。

診斷方法

依據本發明的再一態樣，提供一種診斷患者癌症的方法，包括： 檢測或測量從該患者取得的一體液樣品中的至少一細胞激素分子及至少一游離染色質片段；以及 使用該細胞激素分子及該游離染色質片段的量或濃度以判斷該患者是否罹患癌症。

於一實施例中，所測量的細胞激素分子是白介素分子。於一較佳實施例中，所測量的細胞激素分子是IL-6、IL-8及IL-10的任何或全部，包含其組合。於再一實施例中，白介素分子是IL-6。

於另一實施例中，進行本發明的方法以識別患有癌症的高風險的主體，並因此需要進一步測試（即進一步的癌症研究），特別是識別癌症的器官位置。進一步的測試可能涉及一或以上種內視鏡或掃描方法，例如包含全身掃描、MRI掃描、超音波掃描、LDCT、乳房攝影、電腦斷層（CT）結腸鏡造影或其他掃描方法。

因此，依據本發明的再一實施例中，提供了一種用於檢測癌症並調查受癌症影響的器官的方法，包括： 檢測或測量從該患者取得的一體液樣品中的至少一細胞激素分子的量及至少一游離染色質片段的量； 使用測得的細胞激素及游離染色質片段的量作為體內癌症存在的指標；以及 透過內視鏡或掃描方法檢測該癌症（或腫瘤）在體內的位置。

除了作為獨立檢測的用途之外，包括或排除癌症的血液測試可能還可以作為其他篩檢方式的輔助方法，例如包含LDCT陽性、乳房攝影陽性、PSA陽性或FIT陽性的人們。所有這些測試都是非特異性的，因此當與本文所述的方法結合使用時可以得到提升。LDCT陽性患者的肺中有腫塊或結節，但結節可能不是惡性的，且LDCT的特異性約為60%。同樣地，乳房攝影陽性患者的乳房中有腫塊或結節，但結節也可能不是惡性的。PSA測試的特異性也很低，約為60-70%。在透過FIT篩檢無症狀主體的情況下，篩檢發現糞便血紅蛋白呈陽性的人們中只有約5%在後續結腸鏡檢查中被發現患有CRC。因此，事後看來，許多篩檢進行的結腸鏡檢查是不必要的。

除了篩檢結腸鏡檢查之外，還對先前被診斷患有CRC或癌前腺瘤（可能已經治療或透過手術切除）的患者進行大量監測或監視結腸鏡檢查，以監測任何疾病的復發或進程。FIT測試也可以用於監測或監視，以選擇結腸鏡檢查的主體。還進行結腸鏡檢查以調查表現出與可能的CRC症狀相符的患者。再者，FIT測試可用於選擇結腸鏡檢查的主體。在所有這些情況下，進行的大多數結腸鏡檢查都未發現癌症，並且對患者及醫療照護提供者有諸多不利影響，包含：（i）對沒有結腸病變的人們進行了大量不必要的侵入性醫學結腸鏡檢查程序；（ii）昂貴且不必要的結腸鏡檢查花費了大量醫療保健費用；（iii）由於長年對結腸鏡檢查基礎設施的投資不足，醫療照護提供者的結腸鏡檢查能力（特別是在歐洲CRC篩檢計畫中）目前不足以滿足醫療需求，導致未完成的結腸鏡檢查待處理件增加及FIT陽性患者結腸鏡檢查的等待時間增加，以及（iv）這樣等待時間的增加已導致那些患有CRC的患者潛在的致命的CRC開始治療延遲。包括或排除血液測試可以透過識別那些大腸出血最可能是由於癌症而導致的FIT陽性患者來對最需要緊急轉診進行結腸鏡檢查的那些FIT陽性患者進行分類，從而克服大多數此類問題。同樣地，透過LDCT或乳房攝影識別具有潛在癌性結節或其他肺部或乳房病灶的主體，可以使用包括或排除血液測試對那些病灶本質上最可能是惡性的患者進行分類。此舉可避免不必要的活檢及反覆暴露於X射線輻射的潛在危險。PSA量升高的男性可以使用包括或排除血液檢查來對那些PSA量升高的原因最可能是惡性的患者進行分類。再者，此舉可避免在積極監測前列腺疾病的男性中進行不必要的重複活檢。因此，於一實施例中，使用本發明的方法測試的患者是FIT陽性、LDCT陽性、乳房攝影陽性或PSA陽性。

我們已指出，將循環核小體量及/或細胞激素量與FIT數值評分一起使用以用於識別在結腸鏡檢查中未發現病灶的FIT陽性主體（即實為陰性）。因此，本發明可用於確定對糞便血紅蛋白測試呈陽性的患者是否不患有惡性大腸直腸病灶（即該患者沒有癌症）。因此，本發明可用於評估患者對於結腸鏡檢查的適合性。

依據本發明的再一態樣，提供一種評估一患者是否適合結腸鏡檢查的方法，包括： （i）  檢測或測量從該患者取得的一糞便樣品中的一糞便血紅蛋白的量； （ii） 檢測或測量從該患者取得的一體液樣品中的至少一細胞激素分子的量，可選地包含至少一游離染色質片段的量；以及 （iii） 使用測量到的該糞便血紅蛋白及該細胞激素的量，可選地與該游離染色質片段的量結合，以作為該患者是否適合進行結腸鏡檢查的指標。

糞便血紅蛋白測試是本領域眾所皆知的。應當理解的是，本發明的此一態樣可以與對糞便血紅蛋白測試已呈陽性（即已經測量到糞便血紅蛋白量）的患者合併使用。因此，於一實施例中，步驟（i）可以是指：識別糞便血紅蛋白已呈陽性的患者。於一實施例中，如果患者的糞便血紅蛋白量大於約20μg血紅蛋白/g糞便（在OC感應器FIT測試中使用的稀釋樣品相當於100 ng/ml）。則認為該患者的糞便血紅蛋白測試呈陽性。

於一實施例中，細胞激素分子是選自IL-6及/或IL-8。於再一實施例中，游離染色質片段為組織蛋白異形體H3.1。

於一實施例中，該方法另外包括測量從患者取得的體液樣品中的CRP量（即CRP的循環量）。於一實施例中，糞便血紅蛋白的量及循環CRP的量以及可選地一或以上種核小體部分及/或一或以上種白介素量被用作體內不存在癌症的指標。

於一實施例中，該方法另外包括一或以上種腫瘤標記的測量以研究癌症的器官位置。 此種腫瘤標記包含CEA（建議CRC或肺癌或胰腺癌）、CYFRA 21-1（建議CRC）、CA 125（建議卵巢癌）、CA 19-9（建議胰腺癌）、CA 15-3 （建議乳腺癌）、AFP（建議肝癌）、催乳素（建議垂體瘤）、HCG（建議卵巢癌）、PSA（建議前列腺癌）。

因此，依據本發明的再一態樣，提供了一種用於檢測癌症並調查受癌症影響的器官的方法，包括： 檢測或測量從該患者取得的一體液樣品中的至少一細胞激素分子的量及至少一游離染色質片段的量； 使用測得的細胞激素及游離染色質片段的量作為體內癌症存在的指標；以及 檢測或測量一或以上種腫瘤標記的量，以識別癌症的位置。

應當理解的是，僅在首次確定/指示患者患有癌症時（即在檢測到本文所述的生物標記套組之後）才需要檢測或測量腫瘤標記的量。

於再一實施例中，除了或代替腫瘤標記測量，進行循環腫瘤（ctDNA）或游離DNA（cfDNA）測量。ctDNA或cfDNA的分析可例如透過甲基化DNA測序或分析、突變測序或分析、或核小體佔用模式測序或分析來告知腫瘤部位。因此，於一實施例中，該方法包括分析與游離染色質片段相關的cfDNA或ctDNA，以確定癌症的位置。

因此，依據本發明的再一態樣，提供了一種用於檢測癌症並調查受癌症影響的器官的方法，包括： 檢測或測量從該患者取得的一體液樣品中的至少一細胞激素分子的量及至少一游離染色質片段的量； 使用測得的細胞激素及游離染色質片段的量作為體內癌症存在的指標；以及 分析體液樣品中的cfDNA或ctDNA，以檢測癌症的位置。

再者，應當理解的是，僅在首次確定/指示患者患有癌症時（即在檢測到本文所述的生物標記套組後）才需要分析cfDNA或ctDNA。

於一實施例中，該方法還包括確定患者的至少一臨床參數。此參數可用於結果的解釋。臨床參數可包含任何相關的臨床資訊，例如但不限於，性別、體重、體重指數（BMI）、吸菸狀態及飲食習慣。因此，於一實施例中，臨床參數是選自由：年齡、性別及體重指數（BMI）所組成之群組。於一實施例中，該方法僅適用於大於年齡依賴性臨界值的患者，諸如大於50歲的患者。

於一實施例中，與控制組相比，較高量的細胞激素分子及/或較高量的游離染色質片段指示癌症的存在及/或進程。

可使用適當的算法（例如表1中列出的算法）分析透過本發明的方法取得的數據。

表 1 用於解釋測定法套組的結果的實例模型或算法

套組評分 = a[IL-6] + b[H3.1-核小體]

套組評分 = a[IL-6] + b[核小體自身]

套組評分 = a[IL-6] + b[核小體自身]+ c[H3.1-核小體]

於一實施例中，測量步驟包括使用表1中列出的算法。用於推導諸如表1中的模型或算法的方法是本領域中眾所皆知的，並且提供適合的軟體包。用於此目的的典型軟體工具包含SPSS（社會科學統計軟體包）及「R」。這些軟體包提供了臨床數據的線性及非線性數據建模。

其他分析結果的方法也可以用於本發明的方法。於一實施例中，使用人工智慧模型。於一實施例中，使用個體測定法臨界值量，且如果個體套組測定法結果高於（或低於，如果適用的話）所有或最小數量的套組測定法（例如兩個之一、兩個中的兩個、三個中的兩個等）的測定法臨界值量，則該患者在該套組測試中被認為是陽性的。於本發明一實施例中，採用決策樹模型或算法來分析結果。

本領域技術人員將清楚的是，本文所揭示的生物標記的任何組合可以用於檢測癌症的套組及算法中，並且可以將再一標記添加到包含這些標記的套組中。

本領域技術人員將清楚的是，可進一步透過作為用於癌症的較大（血液）測定套組的一部份的核小體測定法及細胞激素測定法以改善對癌症或癌前患者的測試靈敏度。

於一較佳實施例中，該套組檢測IL-6的量或濃度及含有組織蛋白異形體H3.1的核小體的量或濃度。

依據本發明的再一態樣，提供了兩種或多種結合劑在製造於體液樣品中診斷癌症的方法的試劑盒的用途，其中該結合劑中之一者對至少一細胞激素分子及對至少一游離染色質片段具有特異性。該方法包括檢測或測量從患者取得的體液樣品中的細胞激素分子及游離染色質片段的量或濃度；並使用在體液樣品中檢測到的細胞激素分子及游離染色質片段的量或濃度以確定患者是否患有癌症。

依據本發明的再一態樣，提供了兩種或更多種結合劑在製造於體液樣品中評估患者對癌症研究的適應性的方法的試劑盒的用途，其中該結合劑中之一者對至少一細胞激素分子及對至少一游離染色質片段具有特異性。該方法包括檢測或測量從患者取得的體液樣品中的細胞激素分子及游離染色質片段的量或濃度；並使用在體液樣品中檢測到的細胞激素分子及游離染色質片段的量或濃度以確定患者是否需要進一步的癌症研究。

鑑別診斷方法

本發明的生物標記的另一優點是其可以用於鑑別診斷的方法。因此，依據本發明的再一態樣，提供了一種對疑似癌症患者進行鑑別診斷的方法，包括： （i）檢測或測量從患者取得的體液樣品中的至少一細胞激素分子及至少一游離染色質片段的量；以及 （ii）將步驟（i）取得的量與從患有非癌性疾病的患者取得的體液樣品中的至少一細胞激素分子及至少一游離染色質片段的量進行比較， 其中在步驟（ii）中比較的量的差異表明該患者患有癌症。

提及到的「非癌性疾病」是指疾病為非癌性的，例如不會導致惡性腫瘤的發展。它們有時可能被稱為「良性」疾病。本發明在鑑別診斷方法中特別有用，在該方法中，與之相比的疑似癌症及非癌性疾病是位於同一器官及/或具有相似症狀。例如，與非癌性肺部疾病相比，疑似肺癌的鑑別診斷。非癌性肺部疾病包含但不限於：哮喘、支氣管炎、慢性咳嗽、慢性阻塞性肺臟疾病（COPD）、隱球菌病、肺炎、結節病及結核病。本發明特別用於診斷疑似的肺癌患者（例如由於症狀及/或肺部腫塊的鑑定），因為該測試區分了肺癌患者及其他非癌性肺部疾病。因此，於一實施例中，非癌性肺部疾病是一種具有與肺癌相似的徵象及/或症狀的疾病，諸如COPD。

如本文呈現的實例所示，本發明的生物標記能夠區別肺癌患者（小細胞及非小細胞肺癌）及COPD患者及健康患者（參見圖1及圖4）。

作為再一實例，與非癌性結腸或腸疾病相比，可以對疑似患有大腸直腸癌的患者進行鑑別診斷。非癌性結腸及腸疾病包含但不限於：息肉、克羅恩疾病、結腸炎、發炎性腸疾病、潰瘍性結腸炎及憩室病。本發明特別用於診斷疑似患有大腸直腸癌的患者（例如由於症狀及/或糞便中出血的鑑定），因為該測試區分了CRC患者及其他非癌性疾病。因此，於一實施例中，非癌性結腸或腸疾病是一種具有與大腸直腸癌相似的徵象及/或症狀的疾病，諸如憩室病。

如本文呈現的實例中所示，本發明的生物標記套組能夠區別患有大腸直腸癌的患者及患有各種非癌性結腸或腸疾病的患者及健康患者（參見圖2及圖3）。例如，使用包括測量核小體自身、含有組織蛋白異形體H3.1及IL-6的核小體的三測定法套組，並優化模型及臨界值以辨別CRC患者及從結腸鏡檢查中未發現的主體及患有非惡性的良性結腸或腸疾病的患者，如圖3所示，本發明的方法能夠在所有其他患者（罹病及未罹病）中以90%的特異性識別50%的CRC病例，這些患者具有明確的疾病階段依賴性。因此，本發明的此實施例可用於測試患有大腸直腸疾病症狀的人，以識別CRC的患者與患有其他非惡性疾病或未罹病的患者。

作為另一實例，與非癌性疾病相比，可以對疑似患有卵巢癌的患者進行鑑別診斷。婦女可能有不明病因的骨盆腔腫塊。這樣的腫塊可能是惡性的，但由於各種其他原因，其性質也可能是囊腫或肌瘤。卵巢的非癌性疾病包含但不限於：子宮內膜異位症、卵巢囊腫及多囊性卵巢症。本發明可用於診斷疑似患有卵巢癌（例如由於症狀）的患者，因為該測試可以區分患有卵巢癌及其他非癌性疾病的患者。因此，於一實施例中，非癌性疾病是具有與卵巢癌相似的徵象及/或症狀的卵巢的骨盆腔腫塊或非癌性疾病。

作為另一實例，與非癌性前列腺疾病相比，可以對疑似患有前列腺癌的患者進行鑑別診斷。前列腺的非癌性疾病包含但不限於：前列腺腫大或前列腺炎。本發明可用於診斷疑似患有前列腺癌（例如由於症狀）的患者，因為該測試可以區分患有前列腺癌及其他非癌性疾病的患者。因此，於一實施例中，非癌性疾病是具有與前列腺癌相似的徵象及/或症狀的疾病。

治療方法

依據本發明的再一態樣，提供了一種治療患者癌症的方法，包括： （i）  檢測或測量從該患者取得的一體液樣品中的至少一細胞激素分子及至少一游離染色質片段； （ii） 使用該體液樣品中檢測到的該細胞激素分子及該游離染色質片段的量或濃度以確定該患者是否罹患癌症；以及 （iii） 如果在步驟（ii）中確定該患者罹患癌症，則給予該患者一治療。

於一實施例中，該方法另外包括測量一或以上種腫瘤標記的量，以檢測癌症的位置（例如在步驟（iii）之前）。

於一實施例中，該方法另外包括內視鏡檢查程序，以檢測癌症的位置（例如在步驟（iii）之前）。

於一實施例中，該方法另外包括分析與游離染色質片段相關的DNA（例如在步驟（iii）之前）。此實施例可以包括分析主體的循環腫瘤DNA（ctDNA）或游離DNA（cfDNA），以檢測癌症的位置（例如在步驟（iii）之前）。

於本發明的此一態樣，可以單獨或結合使用許多替代的ctDNA或cfDNA分析，例如包含DNA序列突變分析、甲基化DNA序列分析（例如，如先前針對SEPTIN-9基因所述的）及核小體的位置或「片段組學」分析（如Snyder等，2016年所述）（在此引入作為參考）。

於一實施例中，該方法另外包括對主體進行一或以上種掃描方法（例如在步驟（iii）之前）。掃描方法可用於檢測癌症的位置。

於本發明的此一態樣，可以單獨或結合使用許多替代的掃描方法，例如包含全身掃描、MRI掃描、超音波掃描、LDCT、乳房攝影、電腦斷層（CT）結腸造影或其他掃描方法。

癌症可用的治療方法包含手術（包含活檢）、放射療法（包含近程放射治療）、激素療法、免疫療法以及用於化學療法的多種藥物治療。於一實施例中，所施用的治療是選自：手術、放射療法、激素療法、免疫療法及/或化學療法。

依據本發明的另一態樣，提供了一種治療癌症的方法，包括使用本發明的套組測試來識別需要治療癌症的患者，並提供該治療，其中該套組測試包括從患者取得的體液樣品中檢測至少細胞激素分子及至少一游離染色質片段的試劑。於一實施例中，如果患者與控制組相比具有升高的細胞激素及/或游離染色質片段量，則患者處於罹癌的高風險中。

於一實施例中，控制組包括健康主體、未罹病的主體及/或沒有癌症的主體。於一實施例中，該方法包括將從主體取得的體液樣品中存在的生物標記的量與從正常主體取得的體液樣品中存在的生物標記的量進行比較。應當理解的是，「正常」主體是指健康/未罹病的主體。

於一實施例中，控制組包括患有非癌性疾病的主體。如本文提供的鑑別診斷方法部分所述，本發明的方法能夠區別患有癌症的主體及患有非癌性疾病的主體，諸如COPD（當與肺癌相比）及結腸炎或憩室病（當與CRC相比）。因此，於一態樣中，該診斷包括對來自非癌性疾病的癌症進行鑑別診斷。

評估患者的方法

本發明在評估患者是否需要進一步研究癌症（例如，用於診斷及/或鑑定器官的位置）中具有特殊用途。包含結腸鏡檢查、其他內視鏡檢查方法、乳房攝影、X射線、LDCT掃描、其他掃描及活檢在內的此種程序是具有侵入性或潛在危險的，且對於醫療照護提供者而言相對昂貴。因此，有必要減少送去進行不必要檢查的患者的數量。例如，本發明的此一態樣將用於評估需要結腸鏡檢查或活檢的FIT或LDCT陽性的人們。因此，依據本發明的再一態樣，提供了一種用於評估患者是否適合進行癌症研究（即確定患者是否需要進一步的癌症研究測試）的方法，包括： 檢測或測量從患者取得的體液樣品中的至少一細胞激素分子及至少一游離染色質片段；以及 使用檢測到的細胞激素分子及游離染色質片段的量或濃度以確定患者是否進一步的癌症研究。

如本文提供的實例所示，本發明具有作為CRC血液測試使用的應用，以檢測無症狀主體、不符合FIT的患者，或除去FIT以外的患者的CRC，以降低結合的偽陽性率。與FIT一樣，本發明測試的陽性結果指出需要進行結腸鏡檢查。

依據本發明的再一態樣，提供了一種識別需要進行結腸鏡檢查的患者的方法，包括將從患者取得的體液樣品應用於如本文所定義的套組測試，並將從套組取得的結果用於識別患者是否需要結腸鏡檢查。

依據本發明的再一態樣，提供了一種識別需要LDCT、乳房攝影或其他掃描的患者的方法，包括從患者取得的體液樣品應用於如本文所定義的套組測試，並將從套組取得的結果用於識別患者是否需要掃描。

於一實施例中，本文所描述的方法在多種情況下重複進行。此實施例提供了允許在一段時間內監測檢測結果的優點。這樣的佈置將提供監測或評估疾病狀態的治療功效的益處。本發明的此類監測方法可用於監測發作、進程、穩定、改善、復發及/或緩解。

因此，本發明還提供了一種監測疑似患有這種疾病的受試者的疾病狀態的治療功效的方法，包括檢測及/或定量存在於來自該主體的生物樣品中的生物標記（例如，本文所述的生物標記套組）。於監測方法中，可兩次或多次採集樣品。該方法可進一步包括將測試樣品中存在的生物標記的量與一或多對照組進行比較，及/或與較早(例如，在開始治療之前)從相同測試主體取得的一或多個先前的測試樣本進行比較，及/或與在較早治療階段從相同測試主體採集的一或多個先前的測試樣本進行比較。該方法可以包括檢測在不同情況下採集的測試樣品中生物標記的性質或量的變化。

因此，依據本發明的再一態樣，提供了一種用於監測針對人或動物主體的疾病狀態的治療功效的方法，包括： （a） 定量本文所定義的生物標記套組；以及 （b） 將測試樣品中的套組結果與一或以上種控制組及/或一或以上種早些時間前從相同測試主體採集的先前的測試樣品的結果進行比較。

相對於較早取自相同測試主體的先前測試樣品中的量，測試樣品中生物標記結果的改變可以指出該療法對疾病或疑似疾病的有益效果（例如，穩定或改善）。此外，一旦治療完成，就可以週期性地重複本發明的方法，以監測疾病的復發。

監測治療功效的方法可用於監測現有療法及新療法在人類主體及非人類動物（例如在動物模型中）的療效。這些監測方法可以納入新藥物質及物質組合的篩選之中。

於再一實施例中，由快速作用療法而引起的更快速變化的監測可以以小時或天的較短間隔進行。

套組測試

本文所述的標記可用於製備套組測試，特別是用於癌症的診斷及/或監測患有癌症或疑似癌症的患者。

因此，依據本發明的再一態樣，提供了一種包括檢測至少一細胞激素分子及至少一游離染色質片段的試劑的套組測定法。本文所述的套組測定法可用於診斷癌症，諸如肺癌、大腸直腸癌、卵巢癌及/或前列腺癌。

於一實施例中，至少一細胞激素分子是選自IL-6、IL-8及/或IL-10。於一實施例中，至少一游離染色質片段是選自游離核小體及組織蛋白異形體H3.1。因此，依據本發明的再一態樣，提供了一種包括檢測IL-6、組織蛋白H3.1及可選地一或以上種生物標記的試劑的套組，該生物標記是選自由IL-8、IL-10、核小體或其組分以及核小體的表觀遺傳特徵所組成的清單所組成的清單。

依據本發明的再一態樣，提供了一種包括檢測IL-6、總核小體量及可選地一或以上種生物標記的試劑的套組，該生物標記是選自由IL-8、IL-10及核小體的表觀遺傳特徵(例如組織蛋白H3.1)所組成的清單。

於一較佳實施例中，套組測試包括（可選地除此之外）檢測IL-6及組織蛋白H3.1的試劑的套組測試。於一實施例中，該套組可包含檢測總核小體量及/或H1-核小體量的試劑及/或可包含其他核小體測量值。因此，於再一實施例中，該套組測試包括（可選地除此之外）檢測樣品中IL-6、組織蛋白H3.1及游離核小體的（總）量的試劑。於一替代實施例中，該套組測試包括檢測樣品中IL-6及游離核小體（即核小體自身）的（總）量的的試劑。

於一實施例中，該套組測試另外包括檢測一或以上種生物標記的試劑，該生物標記是選自由IL-8、IL-10、核小體或其組分及核小體的表觀遺傳特徵所組成之群組。於一實施例中，該套組測試是用於從患者取得的體液樣品。

如本文提供的實例中所示，包括測量含有組織蛋白異形體H3.1及IL-6的核小體的套組測定法能夠從如表2所示的正常供者及從如表1所示的COPD患者中檢測出77%的肺癌病例。因此，這些套組測定法具有很高的靈敏度及特異性，並可以用作高危險族群的肺癌檢測方法，例如長期重度吸菸者、或不符合低劑量電腦斷層（LDCT）的患者、或代替重複的LDCT掃描來監測不明病因的結節患者，以避免重複暴露於危險X射線，或作為LDCT的輔助測試，以幫助調查由於低特異性而導致LDCT篩檢產生的偽陽性的結果。如圖2所示，使用包括測量核小體自身、含有組織蛋白異形體H3.1及IL-6的核小體的套組能夠以89%特異性識別80%的CRC病例。此準確性與FIT CRC篩檢測試的準確性相當，在95%特異性下靈敏度約為72%，而可用於CRC的檢測。

於一實施例中，該套組測試另外包括測量糞便血紅蛋白的量的試劑。如實例中所述，本發明可以與糞便血紅蛋白量結合使用以增加FIT測試的特異性。

於一實施例中，該套組測試包括（可選地除此之外）檢測IL-10及組織蛋白H3.1的試劑。於其他實施例中，該套組可包含檢測總核小體量及/或H1-核小體量的試劑及/或可以包含其他核小體測量值。因此，於一替代實施例中，該套組測試包括檢測樣品中IL-10及游離核小體（即核小體自身）的（總）量的試劑。

依據本發明的再一態樣，提供了如本文所定義的套組測試在識別需要治療癌症的患者中的用途。

依據本發明的再一態樣，提供了如本文所定義的套組測試在監測患者的癌症進程（例如，腫瘤的進一步生長、或進展至癌症的不同階段）中的用途。此態樣的實施例包含在觀察等待、主動監測及監測手術後或其他復發治療中檢測疾病進程的用途。

依據本發明的再一態樣，提供了如本文所定義的套組測試在評估患者的癌症治療的有效性中的用途。

依據本發明的再一態樣，提供了如本文所定義的套組測試在選擇患有癌症的患者的治療中的用途。

於其他實施例中，該套組可包含檢測總核小體量及/或H1-核小體量的試劑及/或可以包含其他核小體測量值，諸如核小體的表觀遺傳特徵（例如，組織蛋白H3.1的量）。在表1中列出了一些其他實施例作為實例算法形式，但不限於此。

測量方法

於一實施例中，將檢測到的細胞激素分子及游離染色質片段的量或濃度與控制組相比。對於本領域技術人員將清楚的是，可以在多種基礎上選擇控制組主體，其可以包含例如已知沒有疾病的主體或可以是患有不同疾病的主體（例如鑑別診斷調查）。「控制組」可包括健康主體、未罹病主體及/或沒有癌症的主體。控制組也可以是患有不同癌症階段的主體，例如第I期、第II期、第III期或第IV期癌症。與控制組的比較在診斷領域是眾所皆知的。

應當理解的是沒有必要為了比較目的在任何場合測量健康/未罹病的控制組，因為一旦建立了「正常範圍」，就可以將其用作所有後續測試的基準。可以透過從多個沒有癌症的控制組主體取得樣品並測試生物標記的量來建立正常範圍。然後可以檢查疑似患有癌症的主體的結果（即生物標記量），以查看是否落在各自的正常範圍之內或之外。使用「正常範圍」是檢測疾病的標準做法。

如果判斷主體沒有癌症，則本發明仍可以用於監測疾病進程的目的。例如，如果用途包括來自被確定未罹患癌症的主體的血液、血清或血漿樣品，則可以在另一時間點重複進行生物標記量的測量，以確定生物標記量是否已經改變。

提及到的「主體」或「患者」在本文中可互換地使用。於一實施例中，患者是人類患者。於一實施例中，患者是（非人類）動物。本文所述的用途、套組及方法可以在體外、體內或離體進行。

於一實施例中，細胞激素及游離染色質片段部分的檢測或測量包括免疫測定法、免疫化學、質譜、色譜、染色質免疫沉澱或生物感測器方法。

於一實施例中，檢測或測量包括免疫測定法。於本發明的一較佳實施例中，提供了針對細胞激素及/或核小體部分的2位點免疫測定法。特別是，此種方法對於將抗組織蛋白修飾或抗組織蛋白變異體或抗DNA修飾或抗加成蛋白檢測結合劑結合使用兩種抗核小體結合劑或抗核小體結合劑用於原位測量核小體或摻入核小體的表觀遺傳特徵是較佳的。於本發明的另一實施例中，提供了一種使用標記的抗核小體檢測結合劑與固化的抗組織蛋白修飾或抗組織蛋白變異體或抗DNA修飾或抗加成蛋白結合劑結合的2位點免疫測定法。

可以使用一或以上種試劑（諸如適合的結合劑）來檢測或測量生物標記的量。於一實施例中，該一或以上種結合劑包括對所需的生物標記具有特異性的配體或結合劑，例如IL-8、IL-6、IL-10、核小體或其組分部分、核小體的表觀遺傳特徵、或核小體或其組分部分的結構/形狀模擬。如本文所定義的術語「生物標記」包含生物標記套組中的任何單個生物標記部分或單個生物標記部分的組合。

對於本領域技術人員將清楚的是，就本發明的任何態樣而言，術語「抗體」、「結合劑」或「配體」不限於但旨在包含能夠與特定分子或實體結合的任何結合劑，並可以在本發明的方法中使用任何適合的結合劑。還將清楚的是，術語「核小體」旨在包含單核小體及寡核小體及任何可以在流體介質中分析的任何蛋白質-DNA染色質片段。

檢測生物標記的方法是本領域眾所皆知的。於一實施例中，該試劑包括一或以上種配體或結合劑。於一實施例中，本發明的配體或結合劑包含天然存在或化學合成的化合物，其能夠與所需的標靶特異性結合。配體或結合劑可以包括能夠與所需標靶特異性結合的肽、抗體或其片段、或合成的配體（諸如，塑性抗體、或適體或寡核苷酸）。該抗體可以是單株抗體或其片段。應當理解的是，如果使用抗體片段，則其保留結合生物標記的能力，使得可以檢測生物標記（依據本發明）。配體/結合劑可以用可檢測到的標記進行標記，諸如發光、螢光、酶、放射性標記。或者是或另外地，依據本發明的配體可以親和性標籤進行標記，例如生物素、抗生物素蛋白、鏈親和素或組氨酸（hexa-His）標籤。或者是，可以使用無標記技術（例如ForteBio公司）以判斷配體結合。

提供診斷或監測試劑盒（或套組）以進行本發明的方法。這樣的試劑盒將適當地包括一或以上種用於檢測及/或定量依據本發明的生物標記的配體、及/或生物感測器、及/或如本文所述陣列、可選地連同該試劑盒的使用說明。

本發明的再一態樣是用於檢測疾病狀態的存在的試劑盒，其包括能夠檢測及/或定量一或以上種如本文所定義的生物標記的生物感測器。如本文所用，術語「生物感測器」是指能夠檢測生物標記的存在的任何物質。本文描述了生物感測器的實例。生物感測器可以包括如本文所述能夠與生物標記特異性結合的配體結合劑或配體。此種生物感測器可用於檢測及/或定量本發明的生物標記。

適當地，用於檢測本發明的一或以上種生物標記的生物感測器將生物分子辨識與適當的手段相結合，以將樣品中生物標記的存在或定量的檢測轉換為訊號。生物感測器可以適用於「替代場所」診斷測試，例如在病房裡、門診部、手術室、家庭、田野及工作場所。用於檢測本發明的一或以上種生物標記的生物感測器包含聲學、電漿共振、全像攝影、生物層干涉法（BLI）及微工程感測器。印記辨識元件、薄膜電晶體技術、磁聲諧振器裝置及其他新穎的聲電系統可用於生物感測器中，以檢測本發明的一或以上種生物標記。

用於檢測疾病的存在的生物標記是發現新型標靶及延緩或阻止疾病進程的藥物分子的基本目標。由於生物標記或生物標記套組的結果是指示疾病及藥物反應，因此該生物標記可用於體外及/或體內測定法中鑑定新型治療化合物。本發明的生物標記及生物標記套組可用於篩選調節生物標記活性的化合物的方法。

因此，於本發明的另一態樣，提供了如前所述的結合劑或配體的用途，該結合劑或配體可以是針對依據本發明的生物標記的肽、抗體或其片段或適體或寡核苷酸；或依據本發明的生物感測器、陣列或試劑盒的用途，以識別能夠促進及/或抑制生物標記產生的物質。

術語「生物標記」是指過程、事件、或情況的特殊生物學或生物的衍生指標。生物標記可用於診斷方法，例如臨床篩檢、預後評估及監測治療結果，鑑定最有可能對特定治療方法、藥物篩選及開發產生反應的主體。生物標記及其用途對於新藥治療的鑑定及新標靶的發現是有價值的。

如本文所用的術語「檢測」或「診斷」涵蓋疾病狀態的鑑定、確認及/或表徵。依據本發明的檢測、監測及診斷的方法可用於確認疾病的存在、透過評估發作及進程來監測疾病的發展、或評估疾病的改善或復原。檢測、監測及診斷的方法也可用於評估臨床篩檢、預後、治療的選擇、評估治療效益的方法，即用於藥物篩選及藥物開發。

識別及/或定量可以透過適合於識別來自主體的生物樣品中或生物樣品的純化物或萃取物或其稀釋液中特定蛋白質的存在及/或量的任何方法來進行。於本發明的方法中，可以透過測量一個或多個樣品中標靶的濃度來進行定量。可以用本發明的方法測試的生物樣品包含上文所定義的那些。樣品可以例如在適當稀釋或濃縮的情況下製備，並以常規方式存儲。

生物標記的鑑定及/或定量可以透過生物標記或其片段（例如，具有C端截短或N端截短的片段）的檢測來進行。片段的長度適當地大於4個胺基酸，例如長度為5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸。應注意的是，與組織蛋白尾部相同或相關序列的肽是組織蛋白特別有用的片段。

例如，可以使用諸如免疫測定法的免疫學方法來進行檢測及/或定量。免疫測定法包含採用一或以上種抗體或其他特異性結合劑直接與本文所定義的生物標記結合的任何方法。免疫測定法包含2位點免疫測定法或採用酶檢測方法的免疫測定法（例如，ELISA）、螢光標記免疫測定法、時間分辨螢光標記免疫測定法、化學發光免疫測定法、免疫比濁測定法、微粒標記免疫測定法及免疫放射測定法以及單位點免疫測定法、試劑有限免疫測定法、競爭性免疫測定方法，該競爭性免疫測定方法包含標記抗原及標記抗體單抗體免疫測定方法，其具有多種標記類型，包含放射性標記、酶標記、螢光標記、時間分辨螢光標記及微粒標記。所有該免疫測定方法都是本領域眾所皆知的，包含細胞激素及核小體。

於另一實例中，可以透過選自由SELDI（-TOF）、MALDI（-TOF）、1-D凝膠基分析、2-D凝膠基分析、質譜（MS）、反相（RP）LC、尺寸滲透（凝膠過濾）、離子交換、親和力、HPLC、UPLC及其他LC或LC MS基的技術所組成之群組的一或以上種方法進行檢測及/或定量。適當的LC MS技術包含ICAT®（美國加利福尼亞州的應用生物系統公司（Applied Biosystems））、或iTRAQ®（美國加利福尼亞州的應用生物系統公司（Applied Biosystems））。也可以使用液相層析法（例如，高壓液相層析法（HPLC）或低壓液相層析法（LPLC））、薄層層析法、NMR（核磁共振）光譜法。

涉及本發明的一或以上種生物標記的鑑定及/或定量的方法可以在實驗臺儀器上進行，或可以結合到可在非實驗室環境中使用的一次性、診斷或監測平台（例如，在醫師的辦公室或主體床邊）上。用於進行本發明的方法的適合的生物感測器包含具有光學或聲學讀取器的「信用」卡。生物感測器可以被配置為允許將收集到的數據以電子方式傳輸給醫師以進行解釋，並因此可以形成電子醫學的基礎。

用於疾病狀態的生物標記的鑑定允許診斷程序及治療方案的整合。本發明的生物標記的檢測可用於在主體參加臨床試驗之前對其進行篩檢。生物標記提供了指示治療反應、無反應、不良反應、藥物依從性及達到足夠血清藥物量的手段。生物標記可用於提供藥物不良反應的警告。生物標記可用於個人化療法的開發，因為對反應的評估可用於微調劑量、減少處方藥的數量、減少獲得有效治療的延遲並避免藥物不良反應。因此，透過監測本發明的生物標記，可以精確地調整主體照護以匹配由疾病和對象的藥物基因組學特徵所決定的需求，因此該生物標記可以用於滴定最佳劑量、預測陽性治療反應並識別那些有嚴重副作用的高風險主體。

基於生物標記的測試提供了對「新」主體的第一線評估，並提供了準確及快速診斷的客觀措施，而這是使用當前措施無法實現的。

生物標記監測方法、生物感測器及試劑盒作為主體監測工具也至關重要，以使醫師能夠判斷復發是否是由於疾病惡化而引起的。如果藥理學治療被評估為不適當，則可以恢復治療或增加治療；如果適當的話，可以改變治療方法。由於生物標記對疾病狀態是敏感的，因此它們提供了藥物治療效果的指示。

應當理解的是，本文所描述的實施例可以應用於本發明的所有態樣，即描述的用途的實施例可以等同地應用於所要求保護的方法等。

本發明現在將參考以下的非限制性實施例進行說明。

實例

實例 1

血液（血漿）樣品取自144人，包含47名肺癌（小細胞肺癌及非小細胞肺癌）患者、43名年齡相近的正常供者及54名慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者。透過ELISA測量含有組織蛋白異形體H3.1及IL-10的核小體。簡而言之，如下測量含有組織蛋白異形體H3.1的核小體：將80μl測定緩衝液及20μl血漿樣品或標準核小體製劑加入塗覆有直接與組織蛋白H3.1結合的抗體的微量孔中。蓋上微量孔盤，並在室溫輕輕搖動下培養2.5小時。丟棄微量孔盤的內容物。用200μl洗滌溶液洗滌孔3次，並加入100μl生物素化的抗核小體抗體。再次蓋上微量孔盤，並在室溫輕輕搖動下培養1.5小時。丟棄微量孔盤的內容物。用200μl洗滌溶液洗滌孔3次，並加入100μl鏈親和素-HRP溶液。再次蓋上微量孔盤，並在室溫輕輕搖動下培養0.5小時。丟棄微量孔盤的內容物。用200μl洗滌溶液洗滌孔3次，並加入100μlHRP（辣根過氧化物酶）底物溶液。蓋上微量孔盤，在黑暗中於室溫輕輕搖動下培養20分鐘。在405nm處測量孔的吸光度（OD）。 OD量不是直接使用，就是從標準曲線內插含有組織蛋白H3.1的核小體的血漿量。使用市售的ELISA方法測量血漿IL-10量。

我們透過邏輯迴歸分析對測定結果建模，以訓練具有最高AUC的模型或算法來比較肺癌患者與正常供體的患者。結果顯示IL-10結果可以與含有組織蛋白H3.1的核小體的結果結合起來，作為有效的測定套組以及相關的癌症檢測算法。如表2所示，該算法能夠以93%的特異性將68%的肺癌患者與正常供者區別開。

實例 2

使用市售的ELISA方法對與實例1中所述的相同144人採集的血漿樣品進行了如實例1中所述的含有組織蛋白異形體H3.1的核小體的測定以及IL-6及IL-8的測定。我們透過邏輯迴歸分析對測定結果建模，以訓練具有最高AUC的模型或算法來比較肺癌患者與正常供體的患者。結果顯示IL-6結果可以與含有組織蛋白H3.1的核小體的結果結合起來，作為有效的測定套組以及相關的肺癌檢測算法。如表2所示，該算法能夠以90%的特異性從正常供體中檢測出77%的肺癌病例，如圖1所示還從患有COPD的患者中檢測出肺癌。

表 2 單個生物標記及生物標記套組的結果對於肺癌檢測的準確性（肺癌與正常供體）

	AUC (%)	90%特異性的靈敏度 (%)	80%特異性的靈敏度 (%)
H3.1-核小體 (H3.1-nucs)	79	45	66
IL-6	79	53	64
IL-8	66	40	55
IL-10	78	45	68
套組: IL-10、H3.1-核小體	88	68	77
僅接受肺癌訓練的套組: IL-6、H3.1-核小體	86	77	77
肺/CRC組合模型訓練的套組: IL-6、H3.1-核小體	86	77	83

實例 3

血液（血漿）樣品取自100人，包含20名大腸直腸癌（CRC）患者、62名患有結腸炎、克羅恩氏疾病及憩室病的各種非惡性疾病的患者及18名胃腸道症狀但結腸鏡檢查無發現的患者。如實例1所述，我們使用市售的ELISA方法對含有組織蛋白異形體H3.1的核小體及IL-6、IL-8及IL-10進行了測量。我們還使用與上述針對含有組織蛋白H3.1的核小體相似的方法，但使用塗覆在微量孔盤上的抗H3抗體，對核小體自身進行了測量。我們透過邏輯迴歸分析對測定結果進行建模，以訓練具有最高AUC的模型或算法來比較CRC患者與未在結腸鏡檢查中發現的患者。結果顯示IL-6結果可與核小體自身及含有組織蛋白H3.1的核小體的結果結合起來，作為有效的測定套組以及相關的癌症檢測算法。如表3和圖2所示，該算法能夠以89%的特異性檢測出80%的未發現大腸直腸癌的CRC癌症病例。

表 3 單個生物標記及生物標記套組結果對於 CRC 檢測的準確性（ CRC 與結腸鏡檢查中未發現的有症狀主體）

	AUC (%)	90%特異性的靈敏度(%)	80%特異性的靈敏度(%)
核小體自身 (nucsper se)	71	40	45
H3.1-核小體 (H3.1-nucs)	72	45	65
IL-6	83	40	75
IL-8	66	20	45
IL-10	74	15	45
癌症與未發現訓練的套組: IL-6, 核小體自身, H3.1-核小體	84	80 (89%特異性)	80
癌症與未發現訓練的套組+ 良性: IL-6, 核小體自身, H3.1-核小體	74	50	60
套組: IL-6, 核小體自身	85	45	80
僅CRC訓練的套組: IL-6, H3.1-核小體	84	45	80
肺癌/CRC組合模型訓練的套組: IL-6, H3.1-核小體	84	45	80

實例 4

我們使用三測定法套組，包括對實例3中所述的相同100名患者進行如實例3所述的核小體自身、含有組織蛋白異形體H3.1及IL-6的三個相同測量，但我們透過邏輯迴歸分析對測定結果進行建模，以訓練具有最高AUC的模型或算法來比較CRC患者及在結腸鏡檢查中未發現的患者及非惡性的良性結腸或腸疾病患者。如圖3所示，本發明的方法能夠在所有具有明確的疾病階段依賴性的其他患者（罹病及未罹病）中以90%的特異性識別出50%的CRC病例。

結果顯示IL-6結果可與核小體自身及含有組織蛋白H3.1的核小體的結果結合起來，作為有效的測定套組以及相關的癌症檢測算法。如表3和圖2所示，該算法能夠以89%的特異性檢測出80%的未發現大腸直腸癌的CRC癌症病例。此處在實例4中描述的本發明的實施例可用於測試患有結腸疾病的症狀的人們，以識別患有CRC的患者與患有其他非惡性疾病或未罹病的患者。

實例3及實例4的結果顯示，可以調整本發明的方法的與準確性相關的靈敏度及特異性，以使對無症狀主體使用的測試的靈敏度最大化，或對有症狀的測試使用的特異性最大化，以透過模型訓練技術避免在良性疾病患者中誤診癌症。此功能允許定制方法以用於有症狀或無症狀患者或其他應用。

實例 5

我們假設包含細胞激素白介素分子及核小體部分的量在內的套組血液檢查不僅對肺癌或大腸直腸癌具有標記作用，而且對一般癌症的診斷也有用。為了測試此假說，我們在如實例1及實例3所述的結合包含肺癌隊列的144人及CRC隊列的100人的244人按照上述方法透過ELISA測量了含有組織蛋白異形體H3.1及IL-6的核小體。然後，我們使用來自兩個隊列的結合數據透過邏輯迴歸分析對測定結果進行建模，以訓練具有最高AUC的模型或算法來比較肺癌或CRC患者與在結腸鏡檢查未發現的患者及正常供體。此訓練產生了相關的迴歸模型，該模型給出90%特異性的75%靈敏度或80%特異性的81%靈敏度的檢測肺癌或大腸直腸癌的結合準確性。

我們還測試了本發明的該方法在兩個單獨的CRC及肺癌（訓練）隊列中的每一個中分別檢測CRC及肺癌的功效。於肺癌隊列中，單獨的結果是90%特異性下的肺癌檢測靈敏度為77%，或80%特異性的靈敏度為83%（參見表2）。於CRC隊列中，單獨的結果是90%特異性下的CRC檢測靈敏度為45%，或80%特異性下的檢測靈敏度為80%（參見表3）。因此，結合CRC及肺癌訓練的本發明的方法與分別針對各個疾病訓練的方法一樣，對於分別檢測任一種疾病同樣有效。

實例 6

為了進一步測試該假說，包含細胞激素白介素分子及核小體部分量的套組血液測試可用作為一般癌症檢測的血液測試，我們將兩個訓練隊列中開發的組合模型應用於另外兩個驗證患者隊列，其獨立收集於不同國家的訓練隊列。首先，我們透過ELISA在另一個獨立收集的肺癌驗證隊列的70名肺癌患者（包含30名肺癌患者（小細胞及非小細胞肺癌）、30名正常供體主體及10名患有COPD的患者）中測量了含有組織蛋白異形體H3.1及IL-6的核小體。然後，我們使用實例5中結合244人的肺癌及CRC訓練隊列開發的算法為這70人計算了算法分數。如圖4所示，70人的算法分數顯示，採用2測定組合套組能夠在正常供體中以93%的特異性檢測出93%的肺癌，並在驗證隊列中以80%特異性檢測出100%的肺癌。令人驚訝的是，本發明的方法在驗證隊列中觀察到的準確性比在訓練組的更高。這可能與癌症階段及在兩個隊列中小細胞及非小細胞疾病的患者的混合有關。結果證明了本發明的方法的有效性及實用性。

實例 7

我們透過ELISA在獨立收集的63人的多種癌症驗證隊列中測量了含有組織蛋白異形體H3.1及IL-6的核小體，其中包含30名患有多種癌症（包含肺癌、結腸癌、直腸癌、胃癌、腎癌、前列腺癌、乳癌、咽癌、喉癌、卵巢癌、食道癌及膀胱癌）的患者以及33名正常供體主體。此舉是為了確定2測定法套組組合模型是否可以檢測CRC及肺癌以外的其他各種癌症。然後，我們使用實例5中結合244人的肺癌及CRC訓練隊列開發的算法，為這63人計算了算法分數。對63人的算法分數顯示，採用2測定法組合套組能夠以90%的特異性檢測出整體47%的癌症，包含腎臟癌（2例中的1例或1/2）、喉癌（2/3）、肺癌（1/5）、食道癌（1/1）、卵巢癌（6/8）、前列腺癌（2/4）及直腸癌（1/2）。2測定法組合套組能夠以80%的特異性檢測出整體67%的癌症以及除了胃癌以外任何種類的癌症，包含膀胱癌（1/1）、乳癌（1/1）、腎臟癌（1/2）、喉癌（2/3）、肺癌（2/5）、食道癌（1/1）、卵巢癌（7/8）、咽癌（1/2）、前列腺癌（3/4）、直腸癌（1/2）及胃癌（0/1）。該隊列僅包含一名胃癌患者，因此包含更多的胃癌患者有望提高檢出率。結果顯示在圖5中，並且證明了本發明的方法在檢測多種癌症種類方面的實用性廣度，並且可以用作癌症本身的測試。

實例 8

我們在實例3中描述的100人CRC隊列中測量了核小體自身及IL-6，其中包含20名CRC患者、62名患有多種結腸的非惡性疾病（包含結腸癌、克羅恩疾病及憩室病）的患者及18名有胃腸疾病症狀但在結腸鏡檢查中未發現的患者。我們透過邏輯迴歸分析對測定結果進行建模，以訓練具有最高AUC的模型或算法來比較CRC患者與在結腸鏡檢查未發現的患者。本發明的方法能夠在結腸鏡檢查未發現的患者中以90%的特異性識別45%的CRC病例。本發明的此實施例可用於從那些未罹病的人中測試患有CRC的人。

與實例7中所述的實驗相似，此模型隨後應用於包含多種癌症疾病的驗證隊列。這個包含IL-6及核小體自身的2-測定法套組能夠以90%的特異性檢測出60%的癌症，包含腎臟癌（1/2）、喉癌（2/3）、肺癌（1/5）、食道癌（1/1）、卵巢癌（8/8）、咽癌（1/2）、前列腺癌（3/4）、直腸癌（1/2）。特異性為80%時，這個2測定法套組可以檢測出73%的所有癌症病例及除了胃癌之外的每種類型的癌症，包含膀胱癌（1/1）、乳癌（1/1）、腎臟癌（1/2）、喉癌（2/3）、肺癌（2/5）、食道癌（1/1）、卵巢癌（8/8）、咽癌（1/2）、前列腺癌（4/4）、直腸癌（1/2）及胃癌（0/1）。結果顯示於圖6中，並證明了本發明的方法在檢測多種癌症類型方面的實用性的廣度，並可以用做癌症本身的測試。

實例 9

為了進一步證明本發明的方法，我們在實例3及實例8中所述的CRC訓練隊列的結果上訓練了另一種3測定法套組模型，該模型包含核小體自身、含有組織蛋白異形體H3.1及IL-6的核小體的測量。對於CRC檢測（表3），這個模型在89%特異性下的靈敏度為80%，或在80%特異性下的靈敏度為80%。與實例7中所述的實驗相似，此模型隨後應用於包含多種癌症患者的驗證隊列。這個3測定法套組能夠以90%的特異性檢測出37%的癌症，包含腎癌（1/2）、肺癌（2/5）、卵巢癌（5/8）、前列腺癌（1/4）、直腸癌（1/2）及胃（1/1）。特異性為80%時，該3測定法套組可以檢測出57%的所有癌症病例及除了乳癌之外的每種類型的癌症，包含膀胱癌（1/1）、腎癌（2/2）、喉癌（1/3）、肺（3/5）、食道癌（1/1）、卵巢癌（6/8）、咽癌（2/2）、前列腺癌（2/4）、直腸癌（1/2）及胃癌（1/1 ）。結果顯示在圖7中，且證明了本發明的方法在檢測多種癌症類型方面的實用性的廣度，並且可以用作癌症本身的測試。

3種測定的特異性為80％，在所有各種癌症病例和所有測試的癌症類型中，除乳腺癌外，包括膀胱癌（1/1），腎癌（2/2），喉癌（1 / 3），肺（3/5），食道（1/1），卵巢（6/8），咽（2/2），前列腺（2/4），直腸（1/2）和胃（1/1 ）。結果顯示在圖7中，並且證明了本發明的方法在檢測多種癌症類型方面的實用性廣度，並且可以用作癌症本身的測試。

實例 10

為了使用簡單的臨界值而不是基於迴歸分析的結果的模型或算法來證明本發明的方法，我們重新分析了來自144人的聯合數據，包含實例1中所述的47名肺癌患者，以及實例3中所述的100人（包含20名大腸直腸癌（CRC）患者）以及實例6中所述的70人（包含30名肺癌患者）（總共314名主體，包含97名癌症患者）使用簡單正負臨界值的2-測定法套組（包含IL-6及含有組織蛋白異形體H3.1的核小體）。IL-6的臨界值設置為≥4 pg/ml，且含有組織蛋白異形體H3.1的核小體的臨界值設置為光密度≥1.2 OD單位（相當於大約≥200 ng/ml）的測定響應。任何發現至少有一個陽性結果（高於各自的閾值臨界值）的樣品都被視為陽性。此分析以93%的特異性檢測出71%的癌症病例。這與FIT測試的準確性非常接近，後者被廣泛用作（大腸直腸）癌症的前線篩檢測試。

在套組測試中使用簡單的臨界值的優點包含臨床醫生能夠輕鬆地理解測試，並且無需任何軟體或其他輔助手段即可解釋測試結果。

實例 11

使用OC-感測器FIT測試（糞便血紅蛋白量≥100 ng/ml）FIT測試呈陽性後，從135名接受結腸鏡檢查的患者中收集血漿樣品。這些患者包含無症狀篩檢患者、有症狀患者及CRC復發或疾病進程受監測的患者。在135名患者中，有41名在結腸鏡檢查中未發現病灶、37名患有一或以上種非晚期腺瘤、35名患有一或以上種晚期腺瘤及22名患有CRC的患者，其中5名被診斷為第I期疾病、2名為第II期、8名為第III期、6名為第IV期及1名未知階段的疾病。

我們測試了血漿樣品中含有組織蛋白異形體H3.1、IL-6、IL-8、IL-10、CRP及HMGB1的核小體量。使用CRC與在結腸鏡檢查中未發現的人的ROC分析，分析了FIT的數值量（ng/ml）及血漿結果，以確定靈敏度達到100%時（即在結腸鏡檢查中未正確發現CRC或腺瘤的人群所佔的比例，同時正確地將所有22例CRC的患者識別為陽性）測定法或模型的特異性。這提供了在透過本發明的分流血液測試對所有癌症患者優先進行結腸鏡檢查的同時可以實現的結腸鏡檢查的潛在減少的數字。進行的所有單個測定均具有陽性AUC，並且能夠正確識別出一些無結直腸病灶且CRC偽陰性率為零的患者。表4顯示了在100%靈敏度下該生物標記對CRC的特異性。這是對在結腸鏡檢查中未發現正確預測無CRC而遺漏零癌症病例的患者比例（%）的測量。

表 4 對 FIT 陽性主體進行分類的單獨測定法的性能

測定法	AUC (%)	100%靈敏度的特異性(%)
FIT	86	32
H3.1-核小體	68	5
IL-6	59	5
1L-8	66	3
IL-10	53	3
CRP	71	12
HMGB1	53	8

然後，將血液測定結果與FIT結果結合起來，透過迴歸分析產生算法，以鑑定沒有CRC的人，同時保持CRC的偽陰性率為零。表5列出了一些開發出的模型或算法。

表 5 對 FIT 陽性主體進行分類的 FIT/ 血液組合測定法的性能

模型	AUC (%)	100%靈敏度的特異性(%) 所有主體               未監視主體
FIT + H3.1-核小體	84	18	49
FIT + IL-6	86	44	68
FIT + IL-8	85	53	55
FIT + H3.1-核小體 + IL-6	85	17	56
FIT + IL-6 + IL-8	87	55	61
FIT + H3.1-核小體 + IL-6 + IL-8	88	58	61

僅使用FIT測試的數值即可識別32%的患者其大便中有血液，但在結腸鏡檢查中未發現病灶。然而，使用本發明的方法能夠將其提升至高達58%。當將衍生模型應用於有症狀及無症狀主體（未受監視的主體）時，沒有結直腸病灶的人被正確識別為陰性的比例進一步上升至68%。

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圖1：包括含有組織蛋白H3.1及IL-6訓練過的核小體的兩測定法套組的箱型圖及接收器操作特徵（ROC）曲線，以優化144個主體肺癌隊列中患有肺癌的患者與正常供體之間的區別。箱型圖表示為透過邏輯迴歸分析計算的任何給定主體罹癌的機率。 圖2：包括核小體自身、含有組織蛋白異形體H3.1及IL-6訓練過的核小體的測量的三測定法套組的箱型圖及ROC曲線，以優化100個主體CRC隊列中患有大腸直腸癌（CRC）的患者與有症狀但結腸鏡檢查未發現的患者之間的區別。箱型圖表示為透過邏輯迴歸分析計算的任何給定主體罹癌的機率。 圖3：包括核小體自身、含有組織蛋白異形體H3.1及IL-6訓練過的核小體的測量的三測定法套組的廂型圖及ROC圖，以優化100個主體CRC隊列中患有CRC的患者與在結腸鏡檢查未發現的主體及患有非惡性的良性結腸或腸病患者之間的區別。箱型圖表示為透過邏輯迴歸分析計算的任何給定主體罹癌的機率。 圖4：包括含有組織蛋白異形體H3.1及IL-6訓練過的核小體的兩測定法套組模型（肺/CRC結合模型）的箱型圖及ROC曲線，以優化患有CRC或肺癌的患者與均應用於70名主體驗證隊列的正常供體及在結腸鏡檢查未發現的主體之間的區別，該70名主體驗證隊列包含30名肺癌患者、30名正常供體主體及10名慢性阻塞性肺臟疾病（COPD）。箱型圖表示為透過邏輯迴歸分析計算的每一主體的模型/演算輸出。 圖5：包括含有組織蛋白異形體H3.1及IL-6訓練過的核小體的兩測定法套組模型（肺/CRC結合模型）的箱型圖及ROC曲線，以優化患有CRC或肺癌的患者與均應用於63名主體驗證隊列的正常供體及在結腸鏡檢查未發現的主體之間的區別，該63名主體驗證隊列包含30名患有多種癌症疾病的患者及33名正常供體主體。箱型圖表示為透過邏輯迴歸分析計算的每一主體的模型/演算輸出。上虛線及下虛線分別表示90%特異性及80%特異性的臨界值。 圖6：包括在100名主體CRC隊列中訓練的含有組織蛋白異形體H3.1及IL-6的核小體的兩測定法套組的箱型圖及ROC曲線，以優化患有CRC的患者與有症狀但在結腸鏡檢查未發現的患者之間的區別，將其應用於包含30名患有多種癌症疾病的患者及33名正常供體主體的63名主體驗證隊列。箱型圖表示為透過邏輯迴歸分析計算的每一主體的模型/演算輸出。上虛線及下虛線分別表示90%特異性及80%特異性的臨界值。 圖7：包括在100名主體CRC隊列中訓練的含有組織蛋白異形體H3.1及IL-6的核小體的三測定法套組的箱型圖及ROC曲線，以優化患有CRC的患者與有症狀但結腸鏡檢查未發現的患者之間的區別，將其應用於包含30名患有多種癌症疾病的患者及33名正常供體主體的63名主體驗證隊列。箱型圖表示為透過邏輯迴歸分析計算的每一主體的模型/演算輸出。上虛線及下虛線分別表示90%特異性及80%特異性的臨界值。

Claims (25)

1. 一種生物標記套組用於在一體液樣品中診斷及/或監測一癌症的用途，其中該生物標記包括至少一游離染色質片段及至少一細胞激素分子。
2. 如請求項1所述的用途，其中該游離染色質片段為一游離核小體。
3. 如請求項2所述的用途，其中該游離核小體包括一表觀遺傳特徵。
4. 如請求項3所述的用途，其中該游離核小體的該表觀遺傳特徵是選自由一轉譯後組織蛋白修飾、一組織蛋白異形體、與一游離核小體相關的一特定核苷酸及與一游離核小體相關的一蛋白質加成物。
5. 如請求項1至4中任一項所述的用途，其中該細胞激素分子為一白介素分子。
6. 如請求項5所述的用途，其中該白介素分子是選自由白介素-6、白介素-8及白介素-10。
7. 如請求項1至6中任一項所述的用途，其中該體液樣品為一血液樣品、一血清樣品或一血漿樣品。
8. 如請求項1至7中任一項所述的用途，其中該游離染色質片段及該細胞激素分子是由免疫分析法或質譜儀所測量。
9. 如請求項1至8中任一項所述的用途，其中該游離染色質片段是由檢測循環游離DNA所測量。
10. 如請求項1至9中任一項所述的用途，其中該癌症是選自由：肺癌、結腸癌、直腸癌、胃癌、腎臟癌、前列腺癌、乳癌、咽癌、喉癌、卵巢癌、食道癌及膀胱癌。
11. 一種診斷一患者癌症的方法，包括： 檢測或測量從該患者取得的一體液樣品中的至少一細胞激素分子及至少一游離染色質片段；以及 使用該體液樣品中檢測到的該細胞激素分子及該游離染色質片段的量或濃度以判斷該患者是否罹患癌症。
12. 一種評估一患者是否適合進行癌症研究的方法，包括： 檢測或測量從該患者取得的一體液樣品中的至少一細胞激素分子及至少一游離染色質片段；以及 使用該體液樣品中檢測到的該細胞激素分子及該游離染色質片段的量或濃度以判斷該患者是否需要進一步的癌症研究。
13. 如請求項11或12所述的方法，更包括判斷該患者的至少一臨床參數。
14. 如請求項13所述的方法，其中該臨床參數是選自由：年齡、性別及身體質量指數（BMI）。
15. 如請求項11至14中任一項所述的方法，其中該游離染色質片段為一游離核小體，該游離核小體可選地包括一表觀遺傳特徵。
16. 如請求項11至15中任一項所述的方法，其中該細胞激素分子為諸如白介素-6、白介素-8及白介素-10的一白介素分子。
17. 如請求項11至16中任一項所述的方法，其中將檢測到的該細胞激素分子及該游離染色質片段的量或濃度與一控制組進行比較。
18. 如請求項11至17中任一項所述的方法，其中該體液樣品為一血液樣品、一血清樣品或一血漿樣品。
19. 如請求項11至18中任一項所述的方法，其中檢測或測量是使用免疫分析法或質譜儀進行。
20. 如請求項11至19中任一項所述的方法，更包括將該體液樣品中檢測到之與該游離染色質片段相關的DNA分離，並可選地為該DNA定序。
21. 一種治療一患者癌症的方法，包括： （i）   檢測或測量從該患者取得的一體液樣品中的至少一細胞激素分子及至少一游離染色質片段； （ii） 使用該體液樣品中檢測到的該細胞激素分子及該游離染色質片段的量或濃度以判斷該患者是否罹患癌症；以及 （iii）       如果在步驟（ii）中判斷該患者罹患癌症，則給予該患者一治療。
22. 如請求項21所述的方法，更包括在步驟（iii）之前測量一或以上種腫瘤標記的量以檢測癌症的位置，及/或分析與該游離染色質片段相關的DNA。
23. 一種套組，包括檢測一體液樣品中至少一細胞激素分子及至少一游離染色質片段的試劑。
24. 如請求項23所述的套組，該套組是用於檢測癌症。
25. 一種評估一患者是否適合結腸鏡檢查的方法，包括： （i）   檢測或測量從該患者取得的一糞便樣品中的一糞便血紅蛋白的量； （ii） 檢測或測量從該患者取得的一體液樣品中的至少一細胞激素分子的量，可選地包括至少一游離染色質片段的量；以及 （iii）       使用測量到的該糞便血紅蛋白及該細胞激素的量，可選地與該游離染色質片段的量結合，以作為該患者是否適合進行結腸鏡檢查的指標。

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