CN110540588B - 一种基于肿瘤干细胞标志物EpCAM的抗原表位多肽及其应用 - Google Patents
一种基于肿瘤干细胞标志物EpCAM的抗原表位多肽及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110540588B CN110540588B CN201810523660.6A CN201810523660A CN110540588B CN 110540588 B CN110540588 B CN 110540588B CN 201810523660 A CN201810523660 A CN 201810523660A CN 110540588 B CN110540588 B CN 110540588B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lys
- epcam
- epitope polypeptide
- stem cell
- tumor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 56
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 52
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 50
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 50
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 title claims abstract description 37
- 102000018651 Epithelial Cell Adhesion Molecule Human genes 0.000 title claims abstract description 37
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 32
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 title claims abstract description 13
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 11
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 11
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 9
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 abstract description 18
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 abstract description 10
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 abstract description 5
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 abstract description 4
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 abstract description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 34
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 17
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 17
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 16
- 210000004405 cytokine-induced killer cell Anatomy 0.000 description 13
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 10
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 9
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 3
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 102100031940 Epithelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 2
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000025850 HLA-A2 Antigen Human genes 0.000 description 2
- 108010074032 HLA-A2 Antigen Proteins 0.000 description 2
- 101000920667 Homo sapiens Epithelial cell adhesion molecule Proteins 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 2
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical group [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000002699 Digestive System Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102100023935 Transmembrane glycoprotein NMB Human genes 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011398 antitumor immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N calcein am Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(C)=O)=C(OC(C)=O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(=O)C)C(OC(C)=O)=C1 BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004807 desolvation Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 102000045551 human EPCAM Human genes 0.000 description 1
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000008076 immune mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000011242 molecular targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 210000001090 spherocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 108091007466 transmembrane glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004383 yellowing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明提供基于肿瘤干细胞标志物EpCAM的抗原表位多肽及其应用,其氨基酸序列为:Lys‑His‑Lys‑Ala‑Arg‑Glu‑Lys‑Pro‑Tyr‑Asp‑Ser‑Lys;或,Gln‑Asn‑Ser‑Ser‑Gln‑Lys‑Thr‑Gln‑Asn‑Asp‑Val‑Asp;或Arg‑Lys‑Lys‑Arg‑Met‑Ala‑Lys‑Tyr‑Glu‑Lys‑Ala。通过生物信息学手段设计并合成了EpCAM的抗原表位多肽,特异性激活细胞毒性T淋巴细胞、具有良好的杀伤效果,可以用于研制靶向肿瘤干细胞的的治疗性肽疫苗,为恶性肿瘤精准免疫治疗提供新的技术方案,并能够特异性靶向肿瘤干细胞从根本上减少肿瘤复发。
Description
技术领域
本发明涉及抗原表位多肽,尤其涉及一种基于肿瘤干细胞标志物EpCAM的抗原表位多肽及其应用。
背景技术
目前肿瘤发病率、死亡率呈逐年上升趋势,已经成为严重威胁人类健康的头号杀手。尽管肿瘤的手术治疗、化疗、放射治疗及分子靶向治疗不断取得新进展,但肿瘤的有效治疗仍是亟待解决的关键问题。
近年来,随着人们对肿瘤的分子机理和免疫机制的不断揭示,肿瘤特异的免疫治疗日益受到重视,而获得理想肿瘤抗原是肿瘤免疫治疗的关键。随着免疫学理论方法和分子生物学方法的飞速发展,大量可以诱导机体免疫应答的肿瘤抗原的发现,为肿瘤免疫治疗开辟了新纪元。
“肿瘤干细胞”学说认为在肿瘤组织中存在一群具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞群的细胞,其与肿瘤的增殖、转移、复发和对放化疗不敏感关系密切,肿瘤特异性免疫治疗的理想靶点。近年来,以EpCAMhigh/CD44+为表型的结直肠癌干细胞被发现以后,它具有干细胞功能的特征已在多个方面得到证实,在消化系统肿瘤研究较多,特别是肝癌、直结肠癌、胃癌、前列腺癌等。
EpCAM是Epithelial Cell Adhesion Molecule的简写形式,中文名是上皮细胞粘附分子,又称TACSTD1(tumor-associated calcium signal transducer1),CD326(clusterof differentiation),17-A,ESA,EGP40等。EpCAM由定位于人类染色体2p21的GA-733-2基因编码的分子量为40kDa的I型跨膜糖蛋,广泛参与细胞增殖、分化、迁移等多种生物学功能,与肿瘤的发生、发展、转移密切相关。EpCAM作为一种肿瘤组织广泛高表达的糖蛋白,具有非常强效的抗原表位,在肿瘤免疫治疗中的作用备受关注。
近年来,随着对免疫应答分子机制研究的深入,现已逐渐认识到机体的免疫细胞并不是对应于各种各样的病原体或天然抗原的整体分子,而是针对各种各样抗原分子的抗原表位,即蛋白质抗原是通过其表位来体现其免疫特异性。研究表明,CD8+T细胞所识别的肿瘤抗原需先经抗原提呈细胞处理,之后以“抗原肽-MHC-I类分子”复合物的形式呈现在抗原提呈细胞或靶细胞表面,相应的与MHC-I类分子结合的抗原肽即为CTL表位。现有的抗肿瘤治疗技术特异性低、杀伤效果有限,而且容易肿瘤复发。
发明内容
本发明为了解决现有技术中的问题,提供一种基于肿瘤干细胞标志物EpCAM的抗原表位多肽及其应用。
为了解决上述问题,本发明采用的技术方案如下所述:
一种基于肿瘤干细胞标志物EpCAM的抗原表位多肽,其氨基酸序列为:Lys-His-Lys-Ala-Arg-Glu-Lys-Pro-Tyr-Asp-Ser-Lys。
本发明还提供一种基于肿瘤干细胞标志物EpCAM的抗原表位多肽,其氨基酸序列为:Gln-Asn-Ser-Ser-Gln-Lys-Thr-Gln-Asn-Asp-Val-Asp。
本发明又提供一种基于肿瘤干细胞标志物EpCAM的抗原表位多肽,其氨基酸序列为:Arg-Lys-Lys-Arg-Met-Ala-Lys-Tyr-Glu-Lys-Ala。
本发明还提供编码如前所述的抗原表位多肽的核苷酸序列。
在本发明的一种实施例中,基于肿瘤干细胞标志物EpCAM的抗原表位多肽是通过原核细胞或真核细胞表达纯化获得或人工合成。
本发明还提供如前所述的基于肿瘤干细胞标志物EpCAM的抗原表位多肽在制备预防或治疗肿瘤药物中的用途;用途包括对人前列腺癌细胞DU145-多细胞球的作用,还包括对人前列腺癌细胞LNCaP-多细胞球的作用。
本发明的有益效果为:提供一种基于肿瘤干细胞标志物EpCAM的抗原表位多肽及其应用,通过生物信息学手段设计并合成了基于肿瘤干细胞表面标记物EpCAM的抗原表位多肽,特异性激活细胞毒性T淋巴细胞、具有良好的杀伤效果,可以用于研制靶向肿瘤干细胞的的治疗性肽疫苗,为恶性肿瘤精准免疫治疗提供新的技术方案,并能够特异性靶向肿瘤干细胞从根本上减少肿瘤复发。
附图说明
图1是本发明实施例1中EpCAM蛋白抗原表位分析的示意图。
图2是本发明实施例1中抗原表位多肽EpCAM-P1的质谱分析图。
图3是本发明实施例1中抗原表位多肽EpCAM-P2的质谱分析图。
图4是本发明实施例1中抗原表位多肽EpCAM-P3的质谱分析图。
图5是本发明实施例1中抗原表位多肽EpCAM-P1的高效液相色谱分析分析图。
图6是本发明实施例1中抗原表位多肽EpCAM-P2的高效液相色谱分析分析图。
图7是本发明实施例1中抗原表位多肽EpCAM-P3的高效液相色谱分析分析图。
图8(a)是本发明实施例2中第0天时流式细胞仪分析结果示意图。
图8(b)是本发明实施例2中第14天时流式细胞仪分析结果示意图。
图9(a)是本发明实施例2中抗原表位多肽EpCAM-P1、EpCAM-P2和EpCAM-P3作用于DU145-多细胞球的结果示意图。
图9(b)是本发明实施例2中抗原表位多肽EpCAM-P1、EpCAM-P2和EpCAM-P3作用于DU145-多细胞球的杀伤效果示意图。
图10(a)是本发明实施例3中第0天时流式细胞仪分析结果示意图。
图10(b)是本发明实施例3中第14天时流式细胞仪分析结果示意图。
图11(a)是本发明实施例3中抗原表位多肽EpCAM-P1、EpCAM-P2和EpCAM-P3作用于LNCaP-多细胞球的结果示意图。
图11(b)是本发明实施例3中抗原表位多肽EpCAM-P1、EpCAM-P2和EpCAM-P3作用于LNCaP-多细胞球的杀伤效果示意图。
具体实施方式
下面结合附图通过具体实施例对本发明进行详细的介绍,以使更好的理解本发明,但下述实施例并不限制本发明范围。另外,需要说明的是,下述实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本发明的基本构思,附图中仅显示与本发明中有关的组件而非按照实际实施时的组件数目、形状及尺寸绘制,其实际实施时各组件的形状、数量及比例可为一种随意的改变,且其组件布局形态也可能更为复杂。
实施例1
EpCAM抗原表位短肽的设计与合成
1.从国际开放共享基因库NCBI Genbank中查找人EpCAM蛋白的全氨基酸序列(NP_002345.2)共314个氨基酸。其氨基酸序列如下:
MAPPQVLAFGLLLAAATATFAAAQEECVCENYKLAVNCFVNNNRQCQCTSVGAQNTVICSKLAAKCLVMKAEMNGSKLGRRAKPEGALQNNDGLYDPDCDESGLFKAKQCNGTSMCWCVNTAGVRRTDKDTEITCSERVRTYWIIIELKHKAREKPYDSKSLRTALQKEITTRYQLDPKFITSILYENNVITIDLVQNSSQKTQNDVDIADVAYYFEKDVKGESLFHSKKMDLTVNGEQLDLDPGQTLIYYVDEKAPEFSMQGLKAGVIAVIVVVVIAVVAGIVVLVISRKKRMAKYEKAEIKEMGEMHRELNA
2.氨基酸缩写对照表如表1所示。
表1氨基酸缩写对照表
3.本发明通过DNA Star(Protean)软件根据氨基酸序列的亲水性、抗原指数以及表面可及性综合分析预测其抗原短肽的位置。
4.如图1所示,结合Immune Epitope Database(IEDB,http://www.iedb.org/)数据库设计了包含EpCAM蛋白抗原表位的三条抗原表位多肽分别为EpCAM-P1、EpCAM-P2和EpCAM-P3。
如图2-图7所示,分别为抗原表位多肽EpCAM-P1、EpCAM-P2和EpCAM-P3的质谱分析图以及高效液相色谱分析图。
如图2所示,抗原表位多肽EpCAM-P1的分子量为:1486.71,脱溶剂温度为:350℃,脱溶剂其流速350L/h。
如图3所示,抗原表位多肽EpCAM-P2的分子量为:1363.37,脱溶剂温度为:350℃,脱溶剂其流速350L/h。
如图4所示,抗原表位多肽EpCAM-P3的分子量为:1408.74,脱溶剂温度为:350℃,脱溶剂其流速350L/h。
如图5所示,抗原表位多肽EpCAM-P1的高效液相色谱分析流速为:1.0ml/min,波长:220nm,上样量:10μl,具体结果如表2所示:
表2抗原表位多肽EpCAM-P1的高效液相色谱分析结果
顺序 | 时间 | 样品量(%) | 峰面积 | 峰高 |
1 | 16.458 | 0.9087 | 7358 | 1143 |
2 | 16.647 | 98.3935 | 796682 | 84054 |
3 | 16.913 | 0.6978 | 5650 | 1442 |
总计 | NA | 100 | 809690 | 86639 |
如图6所示,抗原表位多肽EpCAM-P2的高效液相色谱分析流速为:1.0ml/min,波长:220nm,上样量:10μl,具体结果如表3所示:
表3抗原表位多肽EpCAM-P2的高效液相色谱分析结果
顺序 | 时间 | 样品量 | 峰面积 | 峰高 |
1 | 7.130 | 0.4733 | 6784 | 976 |
2 | 8.323 | 0.7362 | 10552 | 1216 |
3 | 8.595 | 0.4544 | 6512 | 642 |
4 | 8.918 | 98.0952 | 1405996 | 158425 |
5 | 9.158 | 0.2409 | 3453 | 1767 |
总计 | NA | 100 | 1433297 | 163026 |
如图7所示,抗原表位多肽EpCAM-P3的高效液相色谱分析流速为:1.0ml/min,波长:220nm,上样量:10μl,具体结果如表4所示:
表4抗原表位多肽EpCAM-P3的高效液相色谱分析结果
顺序 | 时间 | 样品量 | 峰面积 | 峰高 |
1 | 10.040 | 1.1157 | 63168 | 4559 |
2 | 10.563 | 98.1523 | 5556881 | 395390 |
3 | 10.855 | 0.7320 | 41441 | 14656 |
总计 | NA | 100 | 5661490 | 414605 |
实施例2
采用本发明的EpCAM蛋白抗原表位的三条抗原表位多肽EpCAM-P1、EpCAM-P2和EpCAM-P3研究EpCAM诱导的效应T细胞对人前列腺癌细胞DU145-多细胞球的杀伤效应。具体包括如下步骤:
1.外周血单个核细胞的分离制备:将采集的HLA-A2阳性健康志愿者外周血10ml收集到2支离心管中,2000r/min离心5min,弃上清液,将沉淀细胞混合,加生理盐水至25mL,使沉淀细胞充分悬浮,形成血细胞悬液。另取1支离心管,加入淋巴细胞分离液20mL,用滴管将血细胞悬液缓慢转移至淋巴细胞分离液的表面,使二者之间形成清晰的界面。
2.将上述的形成清晰的界面的离心管用2000r/min离心20min后,从管底到液面分为4层,依次为红细胞和粒细胞层、淋巴细胞分离液层、外周血单个核细胞层即PBMC层、血浆层;用吸管将外周血单个核细胞层吸出,转移至另一支离心管中,备用。
3.向装有外周血单个核细胞层的离心管中加生理盐水至40mL,1500r/min离心5min,结束后弃上清液,加入生理盐水至40mL将沉淀细胞悬浮,充分混匀后,1500r/min离心5min;共离心洗涤3次。
4.最后一次离心结束后,弃上清液,将沉淀细胞均分为3份,分别转移到3个培养瓶中,各加入40mL的AIM-V培养液培养,并分别标记为A1、A2、A3。
5.培养2h后取出培养的细胞,分别将A1、A2和A3中悬浮的淋巴细胞转移至另3个培养瓶中,分别标记为B1、B2、B3。
3个含有淋巴细胞的B瓶中各加入IFN-γ、IL1α以及抗CD3和抗CD28单抗,并在第二天加入IL-2,诱导培养CIK细胞;3个含有贴壁细胞的A瓶中各加入40mL的AIM-V培养液和IL4,并分别在第三天加入TNFβ,第五天加入、GM-CSF因子,诱导培养DC细胞。
6.DC细胞培养过程中,如有发黄,则换液,补加IL-4、TNFβ和GM-CSF因子。
7.CIK细胞培养过程中,如发现培养液发黄,则换液,换液后补加IL-2。如发现有细胞团块结为不良絮状,则用离心管收集后静置沉降5min左右,待絮状物沉淀后,小心将上清细胞悬液倒回培养瓶中。
8.DC细胞培养至第7天时分别向A1、A2、A3的培养瓶中加入EpCAM抗原表位多肽EpCAM-P1、EpCAM-P2和EpCAM-P3,第8天时铲下DC细胞收集后与相应的B1、B2、B3中的CIK细胞混合共培养,并将DC细胞培养瓶弃去。
在本发明的一种实施例中,如果总的细胞量过于庞大,也可将DC细胞和CIK细胞混合后均分到A和B瓶中继续培养。将T细胞诱导成细胞毒性T细胞(CTL),即效应T细胞。
9.共培养的DC-CIK细胞于第14天做流式细胞仪分析CD3、CD56、CD4和CD8阳性细胞比例并进行细胞杀伤实验。
10.靶细胞的制备:复苏前列腺癌细胞DU145正常培养、传代。通过胰酶消化后磷酸盐缓冲液清洗、重悬;以10mM的浓度的Calcein-AM标记靶细胞,清洗重悬后按照效应细胞与肿瘤干细胞5:1、10:1的效靶比例,37℃共培养4h;收集培养液,l000rpm离心5min,取100μL上清液测定平均荧光强度,以单纯靶细胞作为自发释放量,以单纯靶细胞加去垢剂作为最大释放量。
如图8(a)和图8(b)所示,通过流式细胞仪对比分析,结果显示通过EpCAM抗原表位多肽激活后的CIK细胞比例显著升高;在第0天时(图8(a)),流式细胞仪分析结果表明淋巴细胞比例为8.63%,CD3阳性T细胞比例为52.3%,CD4阳性T细胞比例为53.7%,CD8阳性T细胞比例为46.3%,CIK细胞(CD3/CD56双阳性)比例为4.02%;在第14天时(图8(b)),流式细胞仪分析结果表明淋巴细胞比例为68.6%,CD3阳性T细胞比例为86.3%,CD4阳性细胞比例为27.1%,CD8阳性细胞比例为72.9%,CIK细胞比例为13.7%。
如图9(a)和图9(b)所示,通过EpCAM抗原表位多肽前列腺癌干细胞杀伤效果分析,结果显示EpCAM抗原表位多肽激活的CIK细胞具有显著的前列腺癌干细胞杀伤效应。EpCAM抗原表位多肽EpCAM-P1、EpCAM-P2和EpCAM-P3能够特异性诱导细胞杀伤的效应,杀伤细胞比例由4.02%提升至13.70%;并且对人前列腺癌细胞干细胞富集的DU145-肿瘤多细胞球具有显著杀伤作用,杀伤效果由本底的8.00%提升至29.00%,其中杀伤作用以杀伤率(%)表示。
实施例3
采用本发明的EpCAM蛋白抗原表位的三条抗原表位多肽EpCAM-P1、EpCAM-P2和EpCAM-P3研究EpCAM诱导的效应T细胞对人前列腺癌细胞LNCaP-多细胞球的杀伤效应。
1.外周血单个核细胞的分离制备方法同实施例2。
2.DC-CIK细胞的培养方法同实施例2。
3.靶细胞LNCaP-多细胞球细胞的准备以及杀伤效果检测方法同实施例2。
如图10(a)和图10(b)所示,通过流式细胞仪对比分析,结果显示通过EpCAM抗原表位多肽激活后的CIK细胞比例显著升高;在第0天时(图10(a)),流式细胞仪分析结果表明淋巴细胞比例为9.02%,CD3阳性T细胞比例为37.0%,CD4阳性T细胞比例为39.1%,CD8阳性T细胞比例为60.9%,CIK细胞(CD3/CD56双阳性)比例为4.20%;在第14天时(图10(b)),流式细胞仪分析结果表明淋巴细胞比例为45.4%,CD3阳性T细胞比例为90.4%,CD4阳性细胞比例为27.2%,CD8阳性细胞比例为72.8%,CIK细胞比例为35.7%。EpCAM抗原表位多肽EpCAM-P1、EpCAM-P2和EpCAM-P3能够特异性诱导细胞杀伤的效应,杀伤细胞比例由4.20%提升至35.70%;如图11(a)图11(b)所示,经过EpCAM表位肽诱导后的CIK细胞对人前列腺癌细胞干细胞富集的DU145-肿瘤多细胞球具有显著杀伤作用,杀伤效果由本底的10.00%提升至38.00%。
本发明专利技术涉及肿瘤的免疫治疗领域,尤其涉及一种基于肿瘤干细胞标志物EpCAM的抗原表位多肽及其在肿瘤免疫治疗中应用。特别涉及通过肿瘤肽疫苗特异性诱导、刺激活化生物体肿瘤干细胞特异性CIK细胞,激发、增强生物体抗肿瘤干细胞免疫功能及其在特异性抗肿瘤免疫治疗中的应用,具体为所提供的HLA-A2限制性免疫靶向EpCAM的抗原肽可用于研制靶向肿瘤干细胞的的治疗性肽疫苗,为恶性肿瘤精准免疫治疗提供新的技术方案。
本发明通过生物信息学手段设计并合成了新的基于肿瘤干细胞表面标记物EpCAM的抗原肽,特异性激活细胞毒性T淋巴细胞、具有良好的杀伤效果,并能够特异性靶向肿瘤干细胞从根本上减少肿瘤复发。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明,不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干等同替代或明显变型,而且性能或用途相同,都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种基于肿瘤干细胞标志物EpCAM的抗原表位多肽,其特征在于,其氨基酸序列为:Lys-His-Lys-Ala-Arg-Glu-Lys-Pro-Tyr-Asp-Ser-Lys;
或,其氨基酸序列为:Gln-Asn-Ser-Ser-Gln-Lys-Thr-Gln-Asn-Asp-Val-Asp;
或,其氨基酸序列为:Arg-Lys-Lys-Arg-Met-Ala-Lys-Tyr-Glu-Lys-Ala。
2.编码如权利要求1任一所述的抗原表位多肽的核酸。
3.如权利要求1任一所述的基于肿瘤干细胞标志物EpCAM的抗原表位多肽在制备预防或治疗人前列腺癌药物中的用途。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810523660.6A CN110540588B (zh) | 2018-05-28 | 2018-05-28 | 一种基于肿瘤干细胞标志物EpCAM的抗原表位多肽及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810523660.6A CN110540588B (zh) | 2018-05-28 | 2018-05-28 | 一种基于肿瘤干细胞标志物EpCAM的抗原表位多肽及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN110540588A CN110540588A (zh) | 2019-12-06 |
CN110540588B true CN110540588B (zh) | 2022-08-23 |
Family
ID=68701008
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201810523660.6A Active CN110540588B (zh) | 2018-05-28 | 2018-05-28 | 一种基于肿瘤干细胞标志物EpCAM的抗原表位多肽及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN110540588B (zh) |
Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1252076A (zh) * | 1997-04-14 | 2000-05-03 | 麦可麦脱生物药学研究有限公司 | 抗人抗原受体的新的生产方法及其用途 |
JP2003250556A (ja) * | 2001-12-28 | 2003-09-09 | Sumitomo Pharmaceut Co Ltd | 糖代謝異常疾患マーカーおよびその利用 |
CN103800897A (zh) * | 2014-03-12 | 2014-05-21 | 甘肃中科生物科技有限公司 | 一种肿瘤特异抗原表位多肽负载的树突状细胞疫苗制备方法及其试剂盒 |
WO2015014869A1 (en) * | 2013-07-30 | 2015-02-05 | Biontech Ag | Tumor antigens for determining cancer therapy |
CN104788567A (zh) * | 2015-01-21 | 2015-07-22 | 武汉友芝友生物制药有限公司 | 一种靶向鼠T淋巴细胞CD3和人肿瘤抗原EpCAM的双特异性抗体制备方法及应用 |
WO2016047715A1 (ja) * | 2014-09-24 | 2016-03-31 | 北海道公立大学法人札幌医科大学 | 腫瘍抗原ペプチド |
CN105755112A (zh) * | 2010-07-14 | 2016-07-13 | 联邦科学与工业研究组织 | 结肠直肠癌的诊断 |
CN106892974A (zh) * | 2017-03-07 | 2017-06-27 | 中国医科大学 | 一种基于肿瘤抗原ecm1的长肽ere1及其在肿瘤免疫治疗中的应用 |
-
2018
- 2018-05-28 CN CN201810523660.6A patent/CN110540588B/zh active Active
Patent Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1252076A (zh) * | 1997-04-14 | 2000-05-03 | 麦可麦脱生物药学研究有限公司 | 抗人抗原受体的新的生产方法及其用途 |
JP2003250556A (ja) * | 2001-12-28 | 2003-09-09 | Sumitomo Pharmaceut Co Ltd | 糖代謝異常疾患マーカーおよびその利用 |
CN105755112A (zh) * | 2010-07-14 | 2016-07-13 | 联邦科学与工业研究组织 | 结肠直肠癌的诊断 |
WO2015014869A1 (en) * | 2013-07-30 | 2015-02-05 | Biontech Ag | Tumor antigens for determining cancer therapy |
CN103800897A (zh) * | 2014-03-12 | 2014-05-21 | 甘肃中科生物科技有限公司 | 一种肿瘤特异抗原表位多肽负载的树突状细胞疫苗制备方法及其试剂盒 |
WO2016047715A1 (ja) * | 2014-09-24 | 2016-03-31 | 北海道公立大学法人札幌医科大学 | 腫瘍抗原ペプチド |
CN104788567A (zh) * | 2015-01-21 | 2015-07-22 | 武汉友芝友生物制药有限公司 | 一种靶向鼠T淋巴细胞CD3和人肿瘤抗原EpCAM的双特异性抗体制备方法及应用 |
CN106892974A (zh) * | 2017-03-07 | 2017-06-27 | 中国医科大学 | 一种基于肿瘤抗原ecm1的长肽ere1及其在肿瘤免疫治疗中的应用 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
肿瘤抗原细胞毒性T淋巴细胞表位鉴定和多肽疫苗的研究进展;吴亚红等;《郑州大学学报(医学版)》;20110920(第05期);全文 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN110540588A (zh) | 2019-12-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN105296433A (zh) | 一种ctla4抗体、其药物组合物及其用途 | |
CN103570818B (zh) | 肿瘤抗原性多肽及其作为肿瘤疫苗的用途 | |
WO2016034094A1 (zh) | 制备dc-ctl的试剂盒及其应用 | |
CA2777821A1 (en) | Tumor-associated peptides that bind to mhc-molecules | |
CN112552404B (zh) | 一种靶向c-Met的单链抗体、嵌合抗原受体、重组载体、CAR-T细胞及应用 | |
CN103865874A (zh) | Cik细胞及其制备方法和应用 | |
CN105861531B (zh) | 一种嵌合抗原受体t细胞及其制备方法 | |
WO2012137538A1 (ja) | 細胞傷害性t細胞誘導用組成物 | |
CN114853880B (zh) | Wt1抗原特异性t细胞受体及其抗肿瘤用途 | |
Zhang et al. | Characterization of the tumour microenvironment phenotypes in malignant tissues and pleural effusion from advanced osteoblastic osteosarcoma patients | |
CN116144599A (zh) | 一种逃逸异体nk细胞杀伤的免疫细胞及其应用 | |
Mason et al. | RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma | |
Pörtner et al. | Landscape of manufacturing process of ATMP cell therapy products for unmet clinical needs | |
CN110540588B (zh) | 一种基于肿瘤干细胞标志物EpCAM的抗原表位多肽及其应用 | |
CN104001185A (zh) | 一种cea阳性肿瘤特异性树突状细胞疫苗的制备方法 | |
Fesnak et al. | Considerations in T cell therapy product development for B cell Leukemia and lymphoma immunotherapy | |
CN109371005B (zh) | 一种hla-0201限制性padi4表位多肽及其应用 | |
CN109593125A (zh) | 基于前列腺癌干细胞标志物cd44的抗原表位多肽cd44-p1及其应用 | |
CN103570821A (zh) | 粘蛋白-1抗原性多肽及其作为肿瘤疫苗的用途 | |
CN109608537B (zh) | 基于前列腺癌干细胞标志物cd44的抗原表位多肽cd44-p2及其应用 | |
CN109608536B (zh) | 基于前列腺癌干细胞标志物cd44的抗原表位多肽cd44-p3及其应用 | |
RU2429005C1 (ru) | Способ стимуляции противоопухолевой активности цитотоксических эффекторов иммунной системы | |
CN111171136A (zh) | 肿瘤相关基因PDGFRα突变相关抗原短肽及其应用 | |
Tokhanbigli et al. | Antigenic Potency of LY6E in Stimulating Dendritic Cells to Elicit Tumor-Specific Responses Against Human Colorectal and Gastric Cancer Cell Lines | |
CN113423724A (zh) | Ebv表位高亲和力t细胞受体 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |