CN104788567A - 一种靶向鼠T淋巴细胞CD3和人肿瘤抗原EpCAM的双特异性抗体制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种双特异性抗体、其制备方法及用途。与此同时，还提供了表达人源EpCAM蛋白的鼠肿瘤细胞系及上述细胞系的用途。本申请的双特异性抗体能在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁，激发具有导向性的免疫反应，在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。本发明的肿瘤细胞体内药效实验是在一个具备完整免疫系统的动物模型中开展的，利用免疫系统细胞对肿瘤进行杀伤，并能有效的反映双特异性抗体介导免疫细胞杀伤肿瘤细胞的药效，为靶向免疫细胞和肿瘤细胞的双特异性抗体药物开发提供一个很好药效评估方法。

Description

一种靶向鼠T淋巴细胞CD3和人肿瘤抗原EpCAM的双特异性抗体制备方法及应用

技术领域

本发明涉及免疫学的技术领域。具体地说，涉及双特异性抗体的构建和制备方法，以及设计建立鼠肿瘤模型，并进行双特异性抗体体外、体内药效和机理的研究。为双抗体药物开发过程中药物机理，特别是临床前动物体内药效的研究提供有力的方法和模型。

背景技术

双特异性抗体(bispecific antibody，BiAb)是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体，能在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁，产生导向性的效应功能。BiAb在生物医学中，特别是在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。通过BiAb介导细胞毒作用杀死肿瘤细胞是当前免疫治疗应用研究的热点，其主要特点是BiAb能同时结合肿瘤相关抗原和免疫效应细胞上的靶分子，直接触发免疫效应细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤。然而，在双特异性抗体药物研发过程中，特别是体内药效研究，很难建立一种由完整免疫系统介导的人体肿瘤免疫杀伤的动物模型，因此建立完整的免疫杀伤模型对免疫治疗性双特异性抗体药物研发显得尤为重要。以下是针对所研究的免疫细胞抗原和肿瘤细胞抗原，以及相关技术发展的一些背景技术介绍。

1.CD3

CD3分子由4个亚基组成：δ、ε、γ、ζ，其分子质量分别为18.9k Da、23.1kDa、20.5k Da、18.7k Da，其长度分别有171、207、182、164个氨基酸残基。它们一起组成6条肽链，常与T细胞受体(Tcell receptor，TCR)紧密结合形成含有8条肽链的TCR-CD3复合体，结构示意图见图1。此复合体具有T细胞活化信号转导，稳定TCR结构的功能。CD3胞质段含免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptortyrosine-based activation motif,ITAM)，TCR识别并结合由MHC(majorhisto-compatibility complex)分子提呈的抗原肽，导致CD3的ITAM的保守序列的酪氨酸残基被T细胞内的酪氨酸蛋白激酶p56lck磷酸化，然后可募集其他含有SH2(Scrhomology 2)结构域的酪氨酸蛋白激酶(如ZAP-70)。ITAM的磷酸化和与ZAP-70的结合是T细胞活化信号传导过程早期阶段的重要生化反应之一。因此，CD3分子的功能是转导TCR识别抗原所产生的活化信号。

2.EpCAM

EpCAM(CD326)是I型跨膜糖蛋白，作为上皮细胞的特异性细胞粘附分子。它还涉及到其他一些过程，包括细胞迁移，增殖，分化等。EpCAM是最早应用单克隆抗体技术鉴定出的肿瘤相关抗原之一，它以多聚体的形式广泛表达于上皮组织表面，介导钙非依赖性细胞间同型黏附功能,据此可归入粘附分子家族。EpCAM还具备粘附分子家族的其他特性，参与包括细胞与基质的相互作用、迁移、细胞分化、形态、细胞周期调节、信号传导、代谢等多种过程。同时,EpCAM在多种上皮来源的肿瘤中呈过表达,提示其与肿瘤密切相关。病理情况下，EpCAM不同程度的表达于腺癌中，包括结直肠癌、胃腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、前列腺癌、胰腺癌以及肝细胞癌和视网膜母细胞瘤。多项研究已证实EpCAM的表达与乳腺癌和结肠癌细胞的增殖、周期分布、转移有关(见表1)。单特异性抗EpCAM单克隆抗体(MAB)，例如单抗17-1A(glaxowellcome，Centocor)，是第一个批准德国EpCAM导向治疗结直肠癌的辅助治疗，然而，大量的临床用药数据显示，这种单特异性抗体与化疗相比没有明显的更加有益的效果。目前，一些其他的EpCAM定向治疗，包括双特异性抗体，正在发展为癌症治疗的方向，双特异性抗体MT110和Catumaxomab都是针对肿瘤抗原EpCAM的治疗性双抗体药物，其中Catumaxomab已于2009年由欧盟批准用于治疗恶性癌性腹水，MT110已在临床研究中。显然，EpCAM已成为目前肿瘤治疗研究的热点靶标之一。

表1EpCAM广泛的肿瘤分布

肿瘤	EpCAM阳性率
		卵巢癌	88-100％
胃癌	98％
		结肠癌	99％
胰腺癌	96％
		乳腺癌	90％
子宫内膜癌	91-96％
		肺癌	87％
前列腺癌	98％

3.双特异性抗体技术发展

双特异性抗体，一个抗体分子中的两个抗原结合部位可分别结合两种不同的抗原表位的抗体。

抗体药物是以细胞工程技术和基因工程技术为主体的抗体工程技术制备的生物大分子药物，具有特异性高、性质均一、可针对特定靶点定向制备等优点。单克隆抗体在临床上主要应用于以下三个方面：肿瘤治疗、免疫性疾病治疗以及抗感染治疗。其中肿瘤的治疗是目前单抗应用最为广泛的领域，目前已经进入临床试验和上市的单抗产品中，用于肿瘤治疗的产品数量占比大概为50％。单克隆抗体治疗肿瘤是通过其对病变细胞特异靶点相结合，从而刺激免疫系统来杀伤靶细胞的免疫疗法，为了增强抗体的效应功能，特别是杀伤肿瘤细胞的效果，人们尝试多种方法改造抗体分子，双特异性抗体是改善抗体治疗效果的发展方向之一，现已成为抗体工程研究领域的热点。

用于免疫治疗的双特异性抗体是含有2种特异性抗原结合位点的人工抗体，能在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁，激发具有导向性的免疫反应，在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。

4.双特异性抗体制备

双特异性抗体可通过多种途径获得，其制备方法主要有：化学偶联法、杂交—杂交瘤法和基因工程抗体制备法。化学偶联法是将2个不同的单克隆抗体用化学偶联的方式连接在一起，制备出双特异性单克隆抗体，这是最早的双特异性单克隆抗体概念，这样制备方法的缺点是显而易见的。杂交—杂交瘤法是通过细胞杂交法或者三元杂交瘤的方式产生双特异性单克隆抗体，这些细胞杂交瘤或者三元杂交瘤是通过建成的杂交瘤融合，或者建立的杂交瘤和从小鼠得到的淋巴细胞融合而得到的，只能生产出鼠源的双特异性抗体，它的应用受到了极大的限制。而随着分子生物学技术的迅速发展，出现了基因工程人源化双特异性抗体的多种构建模式，并主要分为双特异性微抗体，双链抗体，单链双价抗体，多价双特异性抗体四类。目前，国际上已有数种基因工程双特异性抗体药物进入临床试验阶段，并显示有较好的应用前景。

5.肿瘤的过继免疫治疗

肿瘤的过继免疫治疗是将自体或异体的免疫活性细胞经过体外扩增后输入患者体内，直接杀伤肿瘤细胞，调节和增强机体的免疫功能，主要包括LAK细胞、TIL细胞、激活的T淋巴细胞和CIK细胞的免疫治疗。而免疫疗法只能清除少量的、零散的肿瘤细胞，对于晚期的实体肿瘤疗效有限。故常将其作为一种辅助疗法与手术、化疗、放疗等常规方法联合应用。先用常规方法清扫大量的肿瘤细胞后，再用免疫疗法清除残存的肿瘤细胞，以提高肿瘤综合治疗的效果。其中，过继免疫治疗作为肿瘤综合治疗中的一个新方法，已经与常规手术治疗、放疗、化疗及其他细胞和分子治疗得到广泛配合，在多种肿瘤的治疗中展示了广泛的应用前景。然而，一种更理想的方式应该是，双特异性抗体一端可以结合培养好的免疫细胞的表面抗原CD3,并随之一起输入体内，而双特异性抗体的另一端能很好地结合肿瘤细胞的表面抗原；这样，双特异性抗体就能在体内架起肿瘤细胞和免疫细胞之间的桥梁，使免疫细胞集中在肿瘤细胞周围，进而对肿瘤细胞进行杀伤。通过这种方法可有效解决肿瘤细胞的转移和扩散，克服了手术、放化疗三大传统治疗方式后的“不彻底、易转移、副作用大”等弊端。

发明内容

术语和缩略语

BiAb:bispecific antibody

TA:肿瘤抗原(tumor antigen)

VH:重链可变区(heavy chain variable region)。

VL:轻链可变区(light chain variable region)。

CDR：是英文Complementarity determining regions(CDRs)的缩写，是指抗体的抗原互补决定区。

ScFv：单链可变区抗体片段(single-chain variable fragment)，又称为单链抗体。

CLD:细胞系开发(cel l line development)

FACS：荧光激活细胞分选(Fluorescence-activated cell sorting)，也称为流式细胞分选术。

本发明针对常规单克隆抗体的不足之处，通过基因工程和抗体工程的方法进行的新分子-双特异性抗体的创制，在传统单克隆抗体主要通过CDC，ADCC和凋亡能力来杀伤肿瘤细胞的基础上，增加了介导T细胞的免疫疗法，大大提高了免疫系统杀伤肿瘤细胞的功效。

具体地，本发明提供了以下的技术方案：

在本发明的一个方面，提供了一种双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体包括连接的A部分和B部分；其中，A部分包括识别效应细胞表面触发分子的片段，所述细胞表面触发分子选自小鼠的CD3、CD16和CD64；以及B部分包括识别靶细胞表面标志分子的片段，靶细胞表面标志分子选自EpCAM、CD20、CD30、EGFR和CD133；优选地，A部分包括抗鼠CD3抗体片段。

在本发明一个优选的方面，A部分包括效应细胞表面标志分子的抗体片段和人IgG1Fc；B部分包括靶细胞表面标志分子的抗体重链和轻链，所述靶细胞表面标志分子的抗体重链和轻链之间通过二硫键连接；并且A部分的效应细胞表面标志分子的抗体片段通过二硫键与B部分连接，A部分的人IgG1Fc通过盐桥和隆突-入-穴结构与B部分的人IgG1Fc连接；优选地，所述双特异性抗体的结构如图2所示。

在本发明另外一个优选的方面，A部分包括针对鼠源CD3的抗体抗-mCD3，B部分包括针对人源EpCAM的抗体抗-EpCAM；优选地，A抗体为ScFv-Fc形式，包括抗-mCD3VH、VL、Fc结构域；并且B抗体为为IgG形式，包括抗-EpCAM重链与轻链；更优选地，所述双特异性抗体以人源EpCAM和鼠源CD3为靶点，被命名为M706，其结构如图3所示；再更优选地，所述抗-EpCAM重链的氨基酸序列为SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，抗-EpCAM的轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，以及所述抗-mCD3ScFv-Fc的氨基酸序列为SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；并且抗-EpCAM重链在223位点上的半胱氨酸与抗-EpCAM的轻链220位点上的半胱氨酸以二硫键的形式连接，所述抗-EpCAM重链在229和232位点上的半胱氨酸与抗-mCD3ScFv-Fc的254和257位点上的半胱氨酸分别以二硫键的形式连接；所述抗-EpCAM重链在395和412位点上与抗-mCD3ScFv-Fc的427和396位点上形成盐桥连接，所述的抗-EpCAM重链在369位点上与抗-mCD3ScFv-Fc的435位点上形成隆突-入-穴连接。

在本发明的另一个方面，提供了制备前文所述双特异性抗体的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：(1)分别将B部分的重、轻链分别构建到第一表达载体上，将A部分构建到第二表达载体上；(2)将第一和第二表达载体一起共转染到细胞中，培养并取上清；(3)将表达上清分离得到纯化后的双特异性抗体；优选地，所述细胞是CHO-S细胞；或者优选地，所述分离步骤包括：蛋白A亲和层析柱从表达上清中捕获所有带Fc结构域的抗体，通过SP阳离子交换层析实现目标双特异性抗体与副产物的分离，再过Q柱，最后浓缩置换缓冲液PBS。

在本发明一个优选的方面，所述第一表达载体是pCHO1.0。

在本发明一个优选的方面，所述第二表达载体是pCDNA3.4。

在本发明一个优选的方面，所述方法的步骤(1)包括：通过正向引物M701-VL F1与反向引物hIgK(PacI)R扩增抗-EpCAM轻链，再通过正向引物Kozak(EcoR V)F与反向引物hIgK(PacI)R PCR扩增，将Kozak序列、前导序列及酶切位点EcoR V与PacI引入轻链；通过正向引物M701-VH F1与反向引物hIgG1(sbfI)R扩增抗-EpCAM重链，再通过正向引物Kozak(Avr II)F与反向引物hIgG1(sbfI)R PCR扩增，将Kozak序列、前导序列及酶切位点AvrII与BstZl7I引入重链；先将扩增好的LC基因片段与用EcoR V与PacI酶切过的pCHO1.0表达载体进行同源重组，获得装入抗-EpCAM轻链的表达载体；然后用AvrII与BstZl7I酶切后再和HC进行同源重组，获得抗-EpCAM的pCHO1.0表达载体，质粒命名为pCHO1.0-抗-EpCAM-HL-KKW；通过正向引物hIgG1-Fc-F与反向引物hIgG1-CH(7His.NheI)-RpCDNA3.4(7His.NheI)-R两轮PCR扩增Fc结构域，通过正向Kozak(AflII)F与反向引物AMC3-1-VL-R1扩增抗-mCD3ScFv结构域，再通过正向引物hIgG1-FC F与反向引物pCDNA3.4(7His.NheI)-R/pCDNA3.4(7His.NheI)-R Overlap PCR扩增将Kozak序列、前导序列及酶切位点AflII与NheI引入ScFv或Fc，将扩增好的2个基因片段与酶切过的pCDNA3.4表达载体进行同源重组，获得装入抗-mCD3ScFv-Fc的pCDNA3.4表达载体，质粒命名为pCDNA3.4-抗-mCD3ScFv-Fc-LDY。

在本发明的另一个方面，还提供了前文所述双特异性抗体或者按照前文所述方法制备的双特异性抗体在制备药物中的用途，所述药物用于筛选治疗EpCAM阳性的相关肿瘤疾病双特异性抗体药物，或者评价治疗EpCAM阳性的相关肿瘤疾病的双特异性抗体药物药效及毒副作用。

更具体地，本发明还提供了以下的技术方案：

本发明提供一种被称为双特异性抗体的新型抗体，并建立一种利用老鼠自身完整的免疫系统进行免疫治疗，开展双特异性抗体药效研究的方法。这种双特异性抗体，作为一种新型抗体并用于药效模型，引入T细胞对EpCAM等肿瘤抗原的特异性细胞毒功效。

本发明提供了一种新方法制备双特异性抗体MSBODY(monomer and ScFvbispecific antibody,如图2所示)，该双特异性抗体包括两组重轻链组合，其中一组特异结合一种抗原，并且在其重链Fc区进行一些改造，使其相对野生型，不易自身形成二聚体；而另一组特异结合另一种抗原，同样在其重链Fc区进行另外一些改造，也不易自身形成二聚体，而这两组重轻链之间很容易形成杂合二聚体。并且其中一组的抗体结构为单聚体抗体，另一组为ScFv-Fc，这样就避免了各自轻链与对方重链错配的可能性，从而形成125KD的双特异性抗体蛋白分子。Fc改造后，单聚体抗体的重链和单链自然异二聚化，同时CL和CH1间自然二聚化，最后形成MSBODY，MSBODY各结构域排列顺序及结构示意图见图2。在MSBODY中，A抗体识别效应细胞表面触发分子为鼠的CD3、CD16或CD64等，B抗体识别靶细胞表面标志为EpCAM、EGFR、CD20、CD30或CD133等。

本发明中利用以上制备双特异性抗体的方法，制备了双特异性抗体。该抗体是以人源EpCAM和鼠源CD3为靶点的双特异性抗体，被命名为M706，如图3，抗-EpCAM这边为IgG形式，包括抗-EpCAM重链与轻链，抗-mCD3这边为ScFv-Fc形式，包括抗-mCD3VH、VL、Fc结构域。以上双特异性抗体通过抗体基因工程方法进行构建，构建了双特异性抗体MSBODY的单聚体抗体重链和单聚体Ab轻链二元表达载体，以及ScFv-Fc表达载体。根据LC，HC，ScFv，Fc基因序列及载体中的多克隆位点设计引物。其中LC，HC，ScFv和Fc分别进行PCR扩增，通过PCR或重叠延伸PCR法获得基因片段，然后通过同源重组法进行克隆。酶切pCHO1.0或pCDNA3.4载体，然后纯化回收PCR产物和酶切后的载体，分2步分别将LC片段，HC片段同源重组克隆到pCHO1.0载体上，ScFv-Fc片段同源重组克隆到pCDNA3.4载体上，并测序。重组蛋白质MSBODY在哺乳动物细胞中的表达、检测，使用转染试剂将分别表达单聚体抗体重链、单聚体抗体轻链和单链(Single chain)的两种质粒共转染至哺乳动物细胞中，再收集上清进行SDS－PAGE和蛋白印迹检测MSBODY的表达情况。将转染表达后的培养液上清离心，过滤，用结合缓冲液稀释，过亲和层析柱，洗脱缓冲液洗脱，SDS－PAGE检测纯化蛋白质。

本发明还提供了一种制备表达人源EpCAM蛋白的鼠肿瘤细胞系及肿瘤模型建立的方法，该方法是通过构建全长人源EpCAM蛋白基因质粒，转染鼠肿瘤细胞系后，加压筛选得到稳定表达人EpCAM的肿瘤细胞系，该细胞系能在含有正常免疫系统的小鼠中形成肿瘤模型。药效模型的建立和药效检测，主要就是利用构建的表达EpCAM的稳定细胞系在含有正常免疫系统的老鼠体内高效地形成肿瘤，并利用构建的双特异性抗体介导，其能同时结合肿瘤细胞、表达CD3的T细胞以及能与Fc结合的免疫佐细胞，在老鼠免疫细胞和肿瘤细胞间搭起一座桥梁，形成一个免疫复合体，免疫细胞发生强烈的免疫反应，分泌多种细胞因子，对肿瘤细胞进行杀伤，从而抑制肿瘤的生长。该模型是一个在完整的免疫系统中开展的，利用免疫系统细胞对肿瘤进行杀伤，并能有效的反应双特异性抗体介导免疫细胞杀伤肿瘤细胞的药效，为靶向免疫细胞和肿瘤细胞的双特异性抗体药物开发提供一个很好药效评估方法。

本发明的技术方案的有益的技术效果有：

1、本发明公开了一种新型双特异性抗体MSBODY介导的免疫细胞杀伤肿瘤细胞的动物模型的建立及其应用。本发明包括双特异性抗体药物研究过程所介导的免疫细胞杀伤，双特异性抗体的制备，表达人源EpCAM蛋白的鼠肿瘤细胞系的开发，以及双特异性抗体药效模型的建立和检测。双特异性抗体MSBODY包括一组重轻链组合，另一组则为ScFv连接Fc组合，其中一组特异结合一种人的肿瘤细胞抗原，包括EpCAM等一系列肿瘤细胞膜表面抗原，并且在其重链Fc区进行一些改造，使其相对野生型，不易自身形成二聚体；而另一组特异结合另一种鼠的T细胞抗原CD3，同样在其重链Fc区进行另外一些改造，也不易自身形成二聚体，而这两组重轻链之间很容易形成杂合二聚体。与此同时，双特异性抗体能在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁，激发具有导向性的免疫反应，在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。

2、表达人源EpCAM蛋白的鼠肿瘤细胞系是通过构建全长人源EpCAM蛋白基因质粒，转染鼠肿瘤细胞系后，加压筛选得到稳定表达人EpCAM的肿瘤细胞系，该细胞系能在含有正常免疫系统的小鼠中形成肿瘤模型。药效模型的建立和药效检测，主要就是利用构建的表达EpCAM的稳定细胞系在含有正常免疫系统的老鼠体内高效地形成肿瘤，并利用构建的双特异性抗体介导，其能同时结合肿瘤细胞、表达CD3的T细胞以及能Fc结合的免疫佐细胞，在老鼠免疫细胞和肿瘤细胞间搭起一座桥梁，形成一个免疫复合体，免疫细胞发生强烈的免疫反应，分泌多种细胞因子，对肿瘤细胞进行杀伤，从而抑制肿瘤的生长。该模型是一个在完整的免疫系统中开展的，利用免疫系统细胞对肿瘤进行杀伤，并能有效的反应双特异性抗体介导免疫细胞杀伤肿瘤细胞的药效，为靶向免疫细胞和肿瘤细胞的双特异性抗体药物开发提供一个很好药效评估方法。

3、本申请提供了一种具有非对称性结构的异二聚体抗体，该抗体包含两个不同的抗原结合多肽单元。该异二聚体与其对应的同二聚体大小和pI均不同，可利用大小上和pI上的区别来促进分离异二聚体和同二聚体。这两个抗原结合多肽单元之一包含类似于野生型抗体的轻链-重链对。在整个本申请中，该单元也称为“单价单元”。其他抗原结合多肽单元包含单链可变片段(ScFv)。这样的ScFv可融合至抗体的恒定片段(Fc)。在本申请全文中此融合肽也被称为“单链单元”。

令人惊奇的是，本申请证明这种非对称的抗体是稳定的并具有高的抗原结合效率。这是令人感到意外的，因为已经证实在生理条件下即使是单链抗体的同二聚体都是不稳定的。例如，Ahmad等的“ScFv Antibody:Principles and Clinical Application,”(Cl inical and Developmental Immunology,2012:980250(2012)),显示基于ScFv的IgG类抗体不稳定，并且需要进一步改造以减少聚集并提高稳定性。

另外，因为具有非对称性，异二聚体具有与由其中任一抗原结合多肽单元组成的同二聚体所不同的分子量。基于异二聚体和同二聚体之间的分子量差异，可以容易地将需要的异二聚体与同二聚体分离。能够容易地将异二聚体与同二聚体分离对于制备双特异性抗体是特别有利的，该双特异性抗体中两个抗原结合多肽分别对于不同的抗原表位具有特异性。这是因为两种类型的同二聚体(即，包含单价单元或单链单元的同二聚体)都不具有所需的双重特异性，而该异二聚体能提供该双重特异性。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：

图1.CD3分子结构示意图。

图2.MSBODY结构示意图。

图3.M706双特异性抗体分子示意图。

图4.PCR产物电泳检测图；4A，M:DL2000标志物；1:抗-Ep-CAM HC；2:抗-Ep-CAM LC；4B，M:DL10000标志物；1:L2K-ScFv；2:hIgG1-Fc；

图5.M706纯化后6％非变性SDS-PAGE电泳和SEC检测纯度结果图；5A，M:蛋白标记物,1:M706双特异性抗体非还原SDS-PAGE,2:还原SDS-PAGE；5B，M706双特异性抗体SEC分析图。

图6.检测M706与细胞表面EpCAM和细胞表面CD3亲和力情况图；6A,(■)M706与HCT116细胞表面的EpCAM的亲和力，(●)Anti-EpCAM与HCT116细胞表面的EpCAM的亲和力；6B,(●)M706与小鼠脾细胞表面的CD3的亲和力。

图7.转染48小时后流式检测转染效率和表达情况图；7A，B16转染EpCAM基因后的检测；7B，CT26转染EpCAM基因后的检测；

图8.筛选EpCAM阳性克隆分别传5，10，15，20代后的稳定性检测结果图；8A，B16-EpCAM；8B，CT26-EpCAM。

图9.取自小鼠脾脏的PBMC细胞对B16-EpCAM和CT26-EpCAM的细胞杀伤结果图；9A，B16-EpCAM；9B，CT26-EpCAM。

图10.B16-EpCAM/C57BL/6J肿瘤模型抑瘤检测结果图，品系:C57BL/6；接种细胞量:1X10⁴(i.p)；治疗方法：0.125mg/kg(i.p)，0-6天,每天给药一次。(●)PBS；(■)MCO106；(▲)Anti-EpCAM单克隆抗体；(◆)M706双抗体。

图11.CT26-EpCAM/BALB/c肿瘤模型抑瘤检测结果，品系:Balb/C；接种细胞量:1X10⁴(i.p)；治疗方法：0.125mg/kg(i.p)，0-6天,每天给药一次。(●)PBS；(■)MCO106；(▲)Anti-EpCAM单克隆抗体；(◆)M706双抗体。

具体实施方式

下面结合具体的实施例，并参照附图进一步详细地描述本发明。应理解，本发明书中的实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例1：双特异性抗体的制备(EpCAM×mCD3,M706)

1.双特异性抗体序列设计

以EpCAM和mCD3为靶点的双特异性抗体被命名为M706，如图3，抗-EpCAM这边为IgG形式，包括抗-EpCAM重链与轻链，抗-mCD3这边为ScFv-Fc形式，包括抗-mCD3VH、VL、Fc结构域。

抗-EpCAM重链(氨基酸序列SEQ ID NO.1)

EVQLLEQSGAELVRPGTSVKISCKASGYAFTNYWLGWVKQRPGHGLEWIGDIFPGSGNIHYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTFEDSAVYFCARLRNWDEPMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

抗-EpCAM轻链(氨基酸序列SEQ ID NO.2)

ELVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPLTFGAGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

抗-mCD3ScFv-Fc(氨基酸序列SEQ ID NO.3)

EVQLVESGGGLVQPGKSLKLSCEASGFTFSGYGMHWVRQAPGRGLESVAYITSSSINIKYADAVKGRFTVSRDNAKNLLFLQMNILKSEDTAMYYCARFDWDKNYWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLPASLGDRVTINCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTNKLADGVPSRFSGSGSGRDSSFTISSLESEDIGSYYCQQYYNYPWTFGPGTKLEIKRGAAAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCRVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLASKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKHHHHHHH

2.双特异性抗体基因克隆

表2中的根据克隆方案设计好后，发送到苏州金唯智生物科技有限公司进行合成。以表1中的引物进行PCR扩增，模板为早期实验中基因合成或亚克隆到pCDNA3.1或pUC57上的基因质粒，PCT/CN2012/084982专利有详细描述，然后抗-EpCAM重、轻链分别构建到pCHO1.0的表达载体上，将抗-mCD3ScFv-Fc构建到pCDNA3.4的表达载体上。

初始PCR扩增模板DNA：35ng的模板DNA，如，目标抗体的轻链和重链；1μl的10μM正向引物和反向引物；2.5μl的10x PCR Buffer缓冲液；1μl的10mM dNTP；1μl的2.5单位/μl Pyrobest DNA聚合酶(Takara，R005A)；和蒸馏水到25μl总体积在PCR管中轻柔混合，并在微量离心机中快速旋转以收集反应混合物到管底。使用GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystem)和以下设置进行PCR反应：95℃，5分钟；以下的25个循环：95℃，每次30秒；56℃，30秒；和72℃，1分钟。

通过正向引物M701-VL F1与反向引物hIgK(PacI)R扩增抗-EpCAM轻链，再通过正向引物Kozak(EcoR V)F与反向引物hIgK(PacI)R PCR扩增，将Kozak序列、前导序列及酶切位点EcoR V与PacI引入轻链(图4A、B)；通过正向引物M701-VH F1与反向引物hIgG1(sbfI)R扩增抗-EpCAM重链，再通过正向引物Kozak(Avr II)F与反向引物hIgG1(sbfI)R PCR扩增，将Kozak序列、前导序列及酶切位点AvrII与BstZl7I引入重链(见图4A、B)。先将扩增好的LC基因片段与用EcoR V与PacI酶切过的pCHO1.0表达载体进行同源重组，分别获得装入抗-EpCAM轻链的表达载体；然后用AvrII与BstZl7I酶切后再和HC进行同源重组，获得抗-EpCAM的pCHO1.0表达载体，质粒分别命名为pCHO1.0-抗-EpCAM-HL-KKW。

通过正向引物hIgG1-Fc-F与反向引物hIgG1-CH(7His.NheI)-RpCDNA3.4(7His.NheI)-R两轮PCR扩增Fc结构域，通过正向Kozak(AflII)F与反向引物AMC3-1-VL-R1扩增抗-mCD3ScFv结构域，再通过正向引物hIgG1-FC F与反向引物pCDNA3.4(7His.NheI)-R/pCDNA3.4(7His.NheI)-R Overlap PCR扩增将Kozak序列、前导序列及酶切位点AflII与NheI引入ScFv或Fc，将扩增好的2个基因片段(图4B)与酶切过的pCDNA3.4表达载体进行同源重组，获得装入抗-mCD3ScFv-Fc的pCDNA3.4表达载体，质粒命名为pCDNA3.4-抗-mCD3ScFv-Fc-LDY。

表2双特异性抗体基因克隆中使用的引物

3.双特异性抗体表达

利用无内毒素大提试剂盒(Qiagen，12391)进行质粒大提，具体操作按照厂商提供的说明书进行。CHO-S细胞培养根据厂商提供的说明书在CD CHO培养基(Invitrogen，10743-029)中，置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中进行培养，准备好细胞后，根据制造商的说明书(Maxcyte)，使用Maxcyte STX电转仪将质粒pCHO1.0-抗-EpCAM-HL-KKW与pCDNA3.4-抗-mCD3ScFv-Fc-LDY一起共转染到CHO-S细胞中，设计共转染这两种质粒以表达对EpCAM和mCD3的双特异性抗体M706。

分别在转染后第2天，培养温度下调到32℃，并每天补加3.5％FeedA(Invitrogen，A10234-01)，培养14天后，2000*g离心收获表达上清。

4.双特异性抗体纯化

表达上清用0.22uM滤膜过滤，利用Mabselect SuRe亲和层析柱(购自GE公司，18-1153-45,17-5438-01)从表达上清中捕获所有带Fc结构域的抗体，用平衡缓冲液(9.5mM NaH₂PO₄+40.5mM Na₂HPO₄，pH7.0)平衡层析柱后，过亲和层析柱，用洗脱缓冲液(50mM柠檬酸+100mM精氨酸，pH3.2)洗脱。通过SP阳离子交换层析，实现目标双特异性抗体与副产物的分离，阳离子交换柱购自GE公司(18-1153-44,17-1087-01)，用平衡缓冲液A(43.8mM NaH₂PO₄+6.2mM Na₂HPO₄，pH 6.0)平衡层析柱后，样品用双纯水稀释电导至3.0-3.5ms之间，过SP柱子结合后，用洗脱缓冲液B(43.8mM NaH₂PO₄+6.2mM Na₂HPO₄+1M NaCl，pH 6.0)20个柱体积线性洗脱；最后浓缩置换缓冲液PBS。。纯化后的双特异性抗体进行SDS-PAGE、SEC检测，纯度在95％以上(见图5)。

5.双特异性抗体亲和力测定(FACS)

利用流式分析法分析双特异性抗体与EpCAM阳性细胞HCT116(购自ATCC，CRL-5822)、mCD3阳性细胞(mPBMC，从Balb/C老鼠脾脏中分离得到)阳性细胞的结合情况。双特异性抗体的浓度从1000nmol开始，5倍倍比稀释，得到12个浓度梯度，备用。

收集细胞，PBS洗两遍，再加PBS重悬，分至96孔板中，每孔2×10⁵个细胞，300g离心4分钟，弃上清，加入50ul双特异性抗体稀释液重悬，室温孵育1小时，PBS洗两遍，再用PE-抗human IgG FC(Biolegend，409304)重悬细胞，室温避光孵育30分钟，PBS洗两遍，再用100ul PBS重悬，上机检测，再用软件GraphPad Prism5.0进行分析(见图6),结果显示，M706具有良好的与细胞表面EpCAM和CD3的结合活性，其亲和力分别为32.56nM和27.51nM。

实施例2：表达人源肿瘤抗原EpCAM的鼠肿瘤细胞系的制备

1.鼠肿瘤细胞准备

B16小鼠黑色素瘤细胞和CT26.WT小鼠结肠癌细胞从中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心细胞库购买。

2.抗原基因的获得及表达载体的构建

分别取培养好的表达人源EpCAM的HCT116细胞，400g离心5min，弃上清。加入离心前培养基同等体积的PBS，重悬沉淀，400g离心2-3分钟，弃上清。采用Invitrogen公司的reagent试剂盒(15596-026)按照说明书操作进行细胞的总RNA提取。

先用Takara公司的5’RACE FULL试剂盒(购自TAKARA，货号为D315)中的随机引物，以总RNA为模板，反转录为第一链cDNA。然后以表2中的引物扩增EpCAM全长基因，PCR扩增的条件为95℃ 5min，按下列参数循环25次：95℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸1min，最后一个循环72℃延伸3min。扩增完成后电泳检测。并通过Afl II/NheI酶切位点克隆到pCDNA3.4载体上，测序验证完全正确后(见SEQ ID NO.4)，EpCAM基因序列详见用无内毒素大提试剂盒(Qiagen，12391)进行质粒大提，具体操作按照厂商提供的说明书进行。

表2从HCT116细胞中克隆人源EpCAM基因的引物列表

人源EpCAM基因(氨基酸序列SEQ ID NO.4)

MAPPQVLAFGLLLAAATATFAAAQEECVCENYKLAVNCFVNNNRQCQCTSVGAQNTVICSKLAAKCLVMKAEMNGSKLGRRAKPEGALQNNDGLYDPDCDESGLFKAKQCNGTSMCWCVNTAGVRRTDKDTEITCSERVRTYWIIIELKHKAREKPYDSKSLRTALQKEITTRYQLDPKFITSILYENNVITIDLVQNSSQKTQNDVDIADVAYYFEKDVKGESLFHSKKMDLTVNGEQLDLDPGQTLIYYVDEKAPEFSMQGLKAGVIAVIVVVVIAVVAGIVVLVISRKKRMAKYEKAEIKEMGEMHRELNA

3.转染表达，检测

3.1B16/CT26表达EpCAM细胞系转染表达及检测

10％FBS 1640培养基培养B16/CT26细胞，转染前0.25％胰酶消化细胞，Vi-Cell细胞计数仪检测细胞数量及活力，活力达90％以上，电转缓冲液调整细胞浓度到2×10⁷即可进行转染实验。取400ul细胞悬液至Ep管中，加入16ug EpCAM-Ag质粒DNA到细胞悬液之中，温和混匀，冰浴静置5-10min，加入到400ulBTX电极杯中以电压175V、脉冲12ms参数在BTX电转仪上电转染，转染完毕细胞转移至10％FBS 1640培养基置于37℃,5％CO₂培养箱中培养，48小时后，加入抗EpCAM单克隆抗体(Biolegend，324201)后，加入PE标记的抗人IgG1Fc二抗，流式检测转染效率(见图7A、7B)，结果显示B16细胞的转染效率为68.4％；CT26细胞的转染效率为21.6％；有了一定的表达EpCAM的阳性细胞，可以进行下一步的加压筛选。

4.稳定细胞系筛选

转染表达为阳性的细胞，显微镜下观察，待细胞铺满瓶底约50％时加入500mM浓度G418抗生素(AMEROSCO,E859-5G)维持培养30天，流式检测加压细胞抗原表达状况，检测方法同3.1，收集细胞在MoFlo流式分选仪上对细胞进行单克隆分选，分选后的单克隆于96孔培养板中，置于37℃,5％CO₂培养箱中培养7天，流式检测，根据流式结果挑选出阳性率高，峰形单一的单克隆扩大培养并进入下一步稳定性检测。

5.稳定性检测

经过流式挑选出来的单克隆阳性细胞株，扩大到T75培养瓶中撤掉G418抗生素，连续代传代培养到第20代，流式检测不同代数细胞对抗原的表达是否稳定，检测方法同3.1，检测结果见图8，结果显示挑选的B16-EpCAM单克隆细胞系C2B6在20代内能稳定的表达EpCAM，CT26-EpCAM的单克隆细胞B3F7在20代内能稳定的表达EpCAM，于是选择这两株稳定细胞系进行下一步的体外/体内药效研究。

实施例3：体外细胞杀伤检测

1鼠脾细胞准备：

钝性分离小鼠脾脏，用注射器向脾脏内反复注入PBS，收集流出的脾细胞悬液，400g离心10min，PBS重悬沉淀，5倍体积的红细胞裂解液(beyotime，C3702)作用5min后400g离心5min，PBS洗涤一次后用10％FBS-1640培养基重悬细胞至1×10⁶个细胞/ml，备用。

2表达人肿瘤抗原的鼠肿瘤细胞准备

B16-EpCAM/CT26-EpCAM细胞在RPMI-1640(GIBCO，C11875)+10％FBS(BI，04-001-1A)培养，培养好后，0.25％胰酶消化细胞20秒，收集细胞离心去上清，重悬至1％FBS-PBS制成单细胞悬液，Vi-Cell细胞计数仪检测细胞数量及活力，以终浓度5uM的CFSE染色，5％CO₂，37℃条件下孵育15min，1％FBS-PBS洗涤染色后的细胞两次，重悬细胞，备用，流式细胞仪检测细胞染色结果。

3体外细胞杀伤

将CFSE染色后的B16-EpCAM/CT26-EpCAM细胞重悬至2×10⁵/ml，按照100ul/孔加入96孔板置于37℃,5％CO₂培养箱中培养16h，按照实验设计做抗体浓度梯度稀释配制，抗体浓度从10ug/ml开始，3倍梯度稀释，在靶细胞板中加入50ul/孔的相应抗体，按50：1效靶比按照50ul/孔加入鼠脾细胞，48h后用胰酶消化20秒，使各孔细胞为单细胞悬液，收集所有细胞，500g离心5min，1％FBS-PBS重悬混匀细胞，加入终浓度为1ug/ml PI，室温作用10-15min后流式上机检测CFSE、PI双阳性细胞占CFSE阳性细胞比例即为靶细胞CT26-EpCAM的死亡率(见图9A,B)，图9A的结果显示M706介导鼠的脾细胞对表达EpCAM的肿瘤细胞B16-EpCAM有很好杀伤作用，其EC50值为98693pg/ml，最高杀伤率为90.21％；图9B的结果显示M706介导鼠的脾细胞对表达EpCAM的肿瘤细胞CT26-EpCAM有良好的杀伤作用，其EC50值为2095pg/ml，最高杀伤率为80.84％。

实施例4：腹水瘤模型建立

1.B16-EpCAM腹水瘤模型建立

7-8周龄C57BL/6J小鼠购自北京华阜康生物科技有限公司，腹腔分别以1×10³、5×10³、1×10⁴、5×10⁴、1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶个/只接种按照实施例2所述方法制备的B16-EpCAM细胞株，每组5只老鼠，接种后小鼠饲养于屏障环境，10-20天左右开始观察小鼠腹水生成和体征状况，随时记录小鼠死亡情况，并统计生存率。

2.CT26-EpCAM腹水瘤模型建立

7-8周龄Balb/c小鼠购自北京华阜康生物科技有限公司，腹腔分别以1×10³、5×10³、1×10⁴、5×10⁴、1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶个/只接种按照实施例2所述方法制备的CT26-EpCAM细胞株，每组5只老鼠，接种后小鼠饲养于屏障环境，10-20天开始观察小鼠腹水生成和体征状况，随时记录小鼠死亡情况，并统计生存率。

实施例5：双特异性抗体介导的免疫系统杀伤肿瘤的药效检测

EpCAM×mCD3杀伤抑制肿瘤试验

1.B16-EpCAM腹水瘤模型及药效学实验

将1×10⁴个按照实施例2的方法制备的B16-EpCAM细胞腹腔接种C57BL/6J小鼠，每组8只老鼠，接种约1h后，按0.125mg/kg剂量对小鼠腹腔给予按照实施例1的方法制备的MSBODY(M706，EpCAM×mCD3)，同时设置对照组PBS、hIgG、Mco106(4420×mCD3)(1.0mg/kg)，3天后同样剂量对小鼠给药一次；每日观察小鼠腹水生成和体征状况，随时观察记录小鼠死亡情况，并统计生存率(见图10)，结果显示，M706双抗体显示了良好的抑制腹水肿瘤生长的效果，并延长实验小鼠的生命，观察到第50天尚未发现小鼠的死亡；其他对照组实验小鼠均发现腹水肿瘤，生存期不超过40天。

2.CT26-EpCAM腹水瘤模型及药效学实验

将1×10⁴个按照实施例2的方法CT26-EpCAM细胞腹腔接种Balb/c小鼠，每组8只老鼠，接种约1h后，按0.125mg/kg剂量对小鼠腹腔给予按照实施例1的方法制备的MSBODY(M706，EpCAM×mCD3)，同时设置对照组PBS、hIgG、Mco106(4420×mCD3)(1.0mg/kg)，3天后同样剂量对小鼠给药一次；每日观察小鼠腹水生成和体征状况，随时观察记录小鼠死亡情况，并统计生存率(见图11)，结果显示，M706双抗体显示了良好的抑制腹水肿瘤生长的效果，并延长实验小鼠的生命，观察到第50天尚未发现小鼠的死亡；其他对照组实验小鼠均发现腹水肿瘤，生存期不超过40天。

Claims (9)

1.一种双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体包括连接的A部分和B部分；

其中，A部分包括识别效应细胞表面触发分子的片段，所述细胞表面触发分子选自小鼠的CD3、CD16和CD64；以及B部分包括识别靶细胞表面标志分子的片段，靶细胞表面标志分子选自EpCAM、CD19、CD20、CD30、EGFR和CD133；

优选地，A部分包括抗鼠CD3抗体片段，B部分包括抗肿瘤细胞表面抗原EpCAM的抗体片段。

2.权利要求1所述双特异性抗体，其特征在于，A部分包括效应细胞表面标志分子的抗体片段和人IgG1 Fc；B部分包括靶细胞表面标志分子的抗体重链和轻链，所述靶细胞表面标志分子的抗体重链和轻链之间通过二硫键连接，靶细胞表面标志分子的抗体重链与人IgG1 Fc共价连接；并且A部分的效应细胞表面标志分子的抗体片段通过二硫键与B部分连接，A部分的人IgG1 Fc通过盐桥和隆突-入-穴结构与B部分的人IgG1 Fc连接；

优选地，所述双特异性抗体的结构如图2所示。

3.权利要求1所述双特异性抗体，其特征在于，A部分包括针对鼠源CD3的抗体抗-mCD3，B部分包括针对人源EpCAM的抗体抗-EpCAM；

优选地，A抗体为ScFv-Fc形式，包括抗-mCD3 VH、VL、Fc结构域；并且B抗体为为IgG形式，包括抗-EpCAM重链与轻链；

更优选地，所述双特异性抗体为M706，其结构如图3所示；

再更优选地，所述抗-EpCAM重链的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，抗 -EpCAM的轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，以及所述抗-mCD3ScFv-Fc的氨基酸序列为SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；并且抗-EpCAM重链在223位点上的半胱氨酸与抗-EpCAM的轻链220位点上的半胱氨酸以二硫键的形式连接，所述抗-EpCAM重链在229和232位点上的半胱氨酸与抗-mCD3ScFv-Fc的254和257位点上的半胱氨酸分别以二硫键的形式连接；所述抗-EpCAM重链在395和412位点上与抗-mCD3ScFv-Fc的427和396位点上形成盐桥连接，所述的抗-EpCAM重链在369位点上与抗-mCD3ScFv-Fc的435位点上形成隆突-入-穴连接。

4.制备权利要求1-3中任一项所述双特异性抗体的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(1)分别将B部分的重、轻链分别构建到第一表达载体上，将A部分构建到第二表达载体上；

(2)将第一和第二表达载体一起共转染到细胞中，培养并取上清；

(3)将表达上清分离得到纯化后的双特异性抗体；

优选地，所述细胞是CHO-S细胞；或者

优选地，所述分离步骤包括：蛋白A亲和层析柱从表达上清中捕获所有带Fc结构域的抗体，通过SP阳离子交换层析实现目标双特异性抗体与副产物的分离，再过Q柱，最后浓缩置换缓冲液PBS。

5.权利要求4所述方法，其特征在于，所述第一表达载体是pCHO1.0。

6.权利要求4或5所述方法，其特征在于，所述第二表达载体是pCDNA3.4。

7.权利要求4所述方法，其特征在于，所述方法的步骤(1)包括：

通过正向引物M701-VL F1与反向引物hIgK(PacI)R扩增抗-EpCAM轻链，再通过正向 引物Kozak(EcoR V)F与反向引物hIgK(PacI)R PCR扩增，将Kozak序列、前导序列及酶切位点EcoR V与PacI引入轻链；

通过正向引物M701-VH F1与反向引物hIgG1(sbfI)R扩增抗-EpCAM重链，再通过正向引物Kozak(Avr II)F与反向引物hIgG1(sbfI)R PCR扩增，将Kozak序列、前导序列及酶切位点AvrII与BstZl7I引入重链；

先将扩增好的LC基因片段与用EcoR V与PacI酶切过的pCHO1.0表达载体进行同源重组，获得装入抗-EpCAM轻链的表达载体；然后用AvrII与BstZl7I酶切后再和HC进行同源重组，获得抗-EpCAM的pCHO1.0表达载体，质粒命名为pCHO1.0-抗-EpCAM-HL-KKW；

通过正向引物hIgG1-Fc-F与反向引物hIgG1-CH(7His.NheI)-R pCDNA3.4(7His.NheI)-R两轮PCR扩增Fc结构域，通过正向Kozak(AflII)F与反向引物AMC3-1-VL-R1扩增抗-mCD3 ScFv结构域，再通过正向引物hIgG1-FC F与反向引物pCDNA3.4(7His.NheI)-R/pCDNA3.4(7His.NheI)-R Overlap PCR扩增将Kozak序列、前导序列及酶切位点AflII与NheI引入ScFv或Fc，将扩增好的2个基因片段与酶切过的pCDNA3.4表达载体进行同源重组，获得装入抗-mCD3ScFv-Fc的pCDNA3.4表达载体，质粒命名为pCDNA3.4-抗-mCD3ScFv-Fc-LDY。

8.权利要求1-3中任一项所述双特异性抗体或者按照权利要求4-8中任一项制备的双特异性抗体的方法制备的双特异性抗体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗EpCAM特异抗原表达所引起的肿瘤或相关疾病，或者用于杀死表达EpCAM细胞。

9.权利要求1-3中任一项所述双特异性抗体或者按照权利要求4-8中任一项制备的双特异性抗体的方法制备的双特异性抗体在制备药物中的用途，所述药物用于在鼠肿瘤细胞系中筛选用于治疗表达EpCAM特异抗原的肿瘤细胞相关疾病的药物或者评价用于治疗表达EpCAM特异抗原的肿瘤细胞相关疾病的药物的药效。