CN108218993A

CN108218993A - 一种以robo1为靶点的双特异性抗体及其制备和应用

Info

Publication number: CN108218993A
Application number: CN201810011046.1A
Authority: CN
Inventors: 李华顺; 任宝永; 刘鹏
Original assignee: 李华顺
Current assignee: Sichuan asikeli Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2018-01-05
Filing date: 2018-01-05
Publication date: 2018-06-29
Anticipated expiration: 2038-01-05
Also published as: CN108218993B

Abstract

本发明公开了一种双特异性抗体，其包含特异性结合肿瘤细胞表面抗原分子的抗原结合结构域(简称R结构域)和特异性结合免疫细胞(例如T细胞、NKT细胞和/或CIK细胞)的抗原结合结构域(简称I结构域)，所述I结构域与R结构域直接连接或通过连接肽连接。本发明提供份以ROBO1为靶点的双特异性抗体双特异性抗体，其能够同时结合T细胞表面的CD3分子和肿瘤细胞表面ROBO1分子，从而拉近肿瘤细胞和T细胞间的距离，能够快速激活静止的T细胞，快速有效的杀伤肿瘤细胞，为抗肿瘤(高表达ROBO1分子)的药物的开发提供了一种新的途径。

Description

一种以ROBO1为靶点的双特异性抗体及其制备和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种以ROBO1为靶点的双特异性抗体及其制备和应用。

背景技术

双特异性抗体(bispecific monoclonal antibody，BsAb)能够双重识别肿瘤靶细胞和免疫效应细胞，因此兼有抗体特异性和介导效应细胞的细胞毒作用，经过合适设计的双特异性抗体能够结合和聚集效应细胞于肿瘤部位，激活效应细胞的活性，诱导肿瘤细胞的溶解。自然状态下不存在，只能通过人工方法制备。

双特异性抗体可通过以下途径得到：

①杂交瘤法：杂交瘤细胞是由B细胞和骨髓瘤细胞融合形成的可以产生特异性单克隆抗体的永生化细胞系。两种杂交瘤细胞进一步杂交形成的杂交瘤细胞可以在同一细胞内产生两种不同的轻重链。在同一个细胞内两种轻重链可以随机组装，产生双特异性分子和一系列无功能的单特异性分子。其组装成双特异性分子的概率仅有1/10。因此，要得到单纯的双特异性分子，需要精细的纯化步骤。

②化学交联法：化学交联法是将两种抗体或抗体片段进行交联生产双特异性抗体。最初使用氧化重组方法进行化学交联，现在主要使用异型或同型双功能交联剂。异型双功能交联剂对两种不同的活性集团进行交联。例如氨基和巯基基团。但使用异型双功能交联剂的过程中，会导致一个抗体分子或抗体片段拥有大量的氨基或羧基基团，进而导致教练抗体的不均一性。同型双功能交联剂可以避免这种状况。

以上两种方法中，虽然杂交瘤法生产的双特异性抗体来源可靠，但是由于轻链、重链随机配对组装可产生多种抗体分子形式，使得双特异性抗体的生产和纯化都变得非常困难。而化学交联法交联生产的双特异性抗体成分较均一，但是费时费力且产量很低。基因工程抗体技术的发展为双特异性抗体的研制奠定了基础。

发明内容

CD3分子由4个亚基组成：δ、ε、γ、ζ，其分子质量分别为18.9kDa、23.1kDa、20.5kDa、18.7kDa，其长度分别由171、207、182、164个氨基酸残基组成。它们一起组成6条肽链，常与T细胞受体(Tcell receptor，TCR)紧密结合形成含有8条肽链的TCR-CD3复合体，结构示意图见图1所示。此复合体具有T细胞活化信号转导，稳定TCR结构的功能。CD3胞质段含有免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activationmotif,ITAM)，TCR识别并结合由MHC(major histo-compatibility complex)分子提呈的抗原肽，导致CD3的ITAM的保守序列的酪氨酸残基被T细胞内的酪氨酸蛋白激酶p56lck磷酸化，然后可募集其他含有SH2(Scr homology 2)结构域的酪氨酸蛋白激酶(如ZAP-70等)。ITAM的磷酸化、以及与ZAP-70的结合是T细胞活化信号传导过程早期阶段的重要生化反应之一。因此，CD3分子的功能是转导TCR识别抗原所产生的活化信号。

Robo是一次跨膜的受体蛋白,在哺乳动物中，已经克隆到4个Robo基因。从物种进化的角度看，Robo1,2,3的胞外部分非常的保守，从果蝇到人类都是由5个Ig样功能区和3个Fibronectin III型重复序列组成。Robos有很短的跨膜区域和一个较长的胞内区；按照序列的保守性，胞内区被划分为4个更小的区域，分别命名为：CC0，CC1，CC2，CC3。Robo4的结构与其它三个家族成员有很大的不同，它的胞外只有2个Ig样功能区和3个Fibronectin III型重复序列；胞内也只有CC0和CC2两个区域。Robos胞外的IgG domains被认为是与配体Slit结合所必需的，较长的胞内区域则和一些重要的信号分子相互作用，参与Slit/Robo下游的信号转导，从而完成刺激信号由细胞外部到内部骨架的传递。目前，已完成slit2与Robo相互作用区域蛋白质的机构解析，发现slit2的第二个结构域D2与Robo1的Ig1结合，进而启动信号传导。目前，针对高表达ROBO1分子的肿瘤细胞或慢性疾病并没有一种有效的治疗方法或药物。

基于此，本发明利用基因工程方法提供一种以ROBO1为靶点的双特异性抗体及其制备和应用。其可作为高表达ROBO1分子的肿瘤或慢性疾病药物的开发。

本发明第一方面提供一种双特异性抗体，其包含特异性结合肿瘤细胞表面抗原分子的抗原结合结构域(简称R结构域)和特异性结合免疫细胞(例如T细胞、NKT细胞和/或CIK细胞)的抗原结合结构域(简称I结构域)，所述I结构域与R结构域直接连接或通过连接肽连接。

优选地，所述R结构域能够特异性识别肿瘤特异性抗原ROBO1。

示例性地，所述R结构域能够特异性识别肿瘤特异性抗原ROBO1的Ig1、Ig2、Ig3、Ig4、Ig5、FN1、FN2和FN3结构域中的一种或多种。

示例性地，所述I结构域能够特异性结合T细胞、NKT细胞和/或CIK细胞等免疫细胞表面的相关抗原分子。例如：CD3、T细胞受体(TCR)、CD28、CD16、NKG2D、Ox40、4-1BB、CD2、CD5、CD95等。

在本发明的一个具体实施例中，所述能够特异性识别肿瘤特异性抗原ROBO1的R结构域为slit2D2蛋白。

在本发明的一个具体实施例中，所述I结构域能够特异性结合免疫细胞表面抗原CD3。

示例性地，所述双特异性抗体包括slit2D2、Anti CD3VH结构域和Anti CD3VL结构域。

示例性地，所述R结构域包括slit2D2。

示例性地，所述I结构域包括Anti CD3VH结构域和Anti CD3VL结构域。

在本发明的一个具体实施例中，所述Slit2D2的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的序列或其同源序列。

在本发明的一个具体实施例中，所述Anti CD3VH的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的序列或其同源序列。

在本发明的一个具体实施例中，所述Anti CD3VL的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的序列或其同源序列。所述双特异性抗体的结构为：

在本发明的一个具体实施例中，所述Slit2D2、Anti CD3VH、Anti CD3VL之间或直接连接或通过连接肽连接。

在本发明的一个具体实施例中，所述双特异性抗体为单链或双链或三链或四链；所述单链为一条轻链或一条重链；所述双链为两条重链，或两条轻链，或由一条重链和一条轻链组成；所述三链为由一条重链和两条轻链组成；或由两条重链和一条轻链组成；所述四链为由两条轻链和两条轻链组成。

其中，所述重链也可为组成抗体重链的一部分，例如VH，或VH-CH，或VH-CH-FC等；所述轻链也可为组成抗体轻链的一部分，例如VL，或VL-CL，或VL-CL-FC等；当双特异性抗体包括两条重链或两条轻链时，所述两条重链可相同或不同。

示例性地，所述双特异性抗体的结构包括：

Slit2D2–Anti CD3 VH，和/或

Anti CD3VH–Slit2D2，和/或

Slit2D2-Anti CD3 VL，和/或

Anti CD3VL-Slit2D2。

在本发明的一个具体实施例中，所述双特异性抗体还包括FC端。

示例性地，所述FC端为FC(knob)片段和/或FC(hole)片段。

示例性地，所述FC(knob)片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示的序列或其同源序列。

示例性地，所述FC(hole)片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的序列或其同源序列。

在本发明的一个具体实施例中，所述双特异性抗体还包括Anti CD3 CH结构域和/或Anti CD3 CL结构域。

示例性地，所述Anti CD3CH结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的序列或其同源序列。

示例性地，所述Anti CD3VL的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示的序列或其同源序列。

示例性地，所述双特异性抗体的结构包括：

Slit2D2–Anti CD3VH-Anti CD3CH，和/或

Anti CD3VH–Anti CD3CH-Slit2D2，和/或

Slit2D2-Anti CD3VL-Anti CD3CL，和/或

Anti CD3VL-Anti CD3CL-Slit2D2。

在本发明的一个具体实施例中，所述双特异性抗体包括Slit2D2、Anti CD3 VH、Anti CD3 VL、Anti CD3 CH、Anti CD3 CL和FC端。

在本发明的一个具体实施例中，所述双特异性抗体包括一条重链和一条轻链，所述重链结构为：

Slit2D2–Anti CD3 CH-Anti CD3 VH–FC；

所述轻链结构为Anti CD3VL-Anti CD3 CL。

在本发明的一个具体实施例中，所述双特异性抗体包括一条重链和一条轻链，所述重链结构为：Anti CD3 VH-Anti CD3 CH–Slit2D2–FC；

所述轻链结构为Anti CD3VL-Anti CD3 CL。

在本发明的一个具体实施例中，所述双特异性抗体包括一条重链和一条轻链，所述重链结构为：Anti CD3VH-Anti CD3 CH–FC；

所述轻链结构为Slit2D2–Anti CD3VL-Anti CD3 CL。

在本发明的一个具体实施例中，所述双特异性抗体包括一条重链和一条轻链，所述重链结构为：Anti CD3 VH-Anti CD3 CH–FC；

所述轻链结构为：Anti CD3 VL-Anti CD3 CL–Slit2D2。

在本发明的另一个具体实施例中，所述双特异性抗体包括两条重链和两条轻链，所述两条重链相同，所述两条轻链相同，所述重链的结构为：

Slit2D2–Anti CD3 VH-Anti CD3 CH–FC；

所述轻链结构为Anti CD3 VL-Anti CD3 CL。

在本发明的另一个具体实施例中，所述双特异性抗体包括两条重链和两条轻链，所述两条重链相同，所述两条轻链相同，所述重链的结构为：Anti CD3 VH-Anti CD3 CH–Slit2D2–FC；

所述轻链结构为Anti CD3 VL-Anti CD3 CL。

在本发明的另一个具体实施例中，所述双特异性抗体包括两条重链和两条轻链，所述两条重链相同，所述两条轻链相同，所述重链的结构为：Anti CD3 VH-Anti CD3 CH–FC；

所述轻链结构为Slit2D2–Anti CD3VL-Anti CD3 CL。

所述轻链结构为Anti CD3 VL-Anti CD3 CL–Slit2D2。

在本发明的另一个具体实施例中，所述双特异性抗体包括重链A、重链B和一条轻链，其中重链A的结构为：

Slit2D2–Anti CD3 CH-Anti CD3 VH–FC；

重链B的结构为：Slit2D2–FC；

所述轻链结构为Anti CD3 VL-Anti CD3 CL。

Anti CD3 VH-Anti CD3 CH–Slit2D2–FC；

重链B的结构为：Slit2D2–FC；

所述轻链结构为Anti CD3 VL-Anti CD3 CL。

示例性地，所述重链A的结构为：Slit2D2–Anti CD3 CH-Anti CD3 VH–FC(hole)；

所述重链B的结构为：Slit2D2–FC(knob)。

示例性地，所述重链A的结构为Slit2D2–Anti CD3 CH-Anti CD3 VH–FC(knob)；

所述重链B的结构为：Slit2D2–FC(hole)。

示例性地，所述重链A的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示的序列或其同源序列；所述重链B的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示的序列或其同源序列；所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示的序列或其同源序列。

示例性地，编码所述重链A的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示的序列或其简并序列；编码所述重链B的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示的序列或其简并序列；编码所述轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示的序列或其简并序列。

本发明第二方面提供一种核酸分子，其编码上述双特异性抗体。

本发明第三方面提供一种上述双特异性抗体的制备方法，所述方法包括：

将上述双特异性抗体的基因克隆到表达载体上；以及任选地，将表达载体转入宿主细胞中筛选，将构建成功的载体转染EXPI CHO细胞。

示例性地，所述表达载体选自质粒、细菌和病毒中的一种或多种，优选地，所述表达载体为pCDNA3.4载体。

在本发明提供的一个具体实施方式中，上述双特异性抗体的制备方法具体包括：

(1)将双特异性抗体的基因克隆到pCDNA3.4表达载体上；

(2)将表达载体转入到宿主细胞中，培养并取上清。优选地，所述宿主细胞为TOP10菌株。

在本发明提供的一个具体实施方式中，通过ProteinA柱从表达上清中捕获带FC片段的融合蛋白，通过透析纯化双特异性抗体。

本发明第四方面提供一种药物组合物，其包含选自：本发明上述的双特异性抗体、核酸分子、含有双特异性性抗体的表达载体和含有双特异性抗体的宿主细胞中的一项或多项。

在本发明的一个实施例中，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。

在本发明的一个实施例中，所述药物组合物中，所述辅料选自：缓冲液、碳水化合物、抗氧化剂、螯合剂和防腐剂中的一种或多种。

本发明第五方面提供一种本发明上述的双特异性抗体、核酸分子、含有双特异性性抗体的表达载体、含有双特异性抗体的宿主细胞中和药物组合物中的一项或多项在制备治疗和/或预防癌症和/或其他慢性病和/或ROBO1抗原阳性细胞的药物中的应用。

在本发明的一个实施例中，所述的应用中，所述的癌症为高表达Robo1的肿瘤及相关疾病，此处所述的高表达指肿瘤细胞中Robo1的表达水平高于正常细胞中其表达水平。

在本发明的一个实施例中，所述癌症为肝癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、前列腺癌、神经胶质瘤、肺癌或其他。

在本发明的一个优选实施例中，所述癌症为肝癌。

本发明至少具有以下优势之一：

本发明提供一种以ROBO1为靶点的双特异性抗体，其能够同时结合T细胞表面的CD3分子和肿瘤细胞表面ROBO1分子，从而拉近肿瘤细胞和T细胞间的距离，能够有效地激活静止的T细胞，快速杀伤肿瘤细胞，为抗肿瘤(高表达ROBO1分子)药物的开发提供了一种新的途径。

附图说明

图1所示为本发明实施例提供的ZD037分子示意图。

图2所示为本发明实施例提供的利用凝胶电泳检测收集的ZD037蛋白的实验结果图。

图3a-b所示为本发明实施例提供的MHCC97-H肿瘤细胞表达的ROBO1分子的流式检测结果图，其中图3a为未加抗体的对照组；图3b为加入抗体的实验组。

图4所示为本发明实施例提供的利用IncuCyte Zoom检测ZD037药物对肿瘤细胞的杀伤结果图，其中，▽表示A组；▲表示B组；○表示C组；X表示D组。

图5所示为本发明实施例提供的T细胞表面CD25分子表达检测结果图，其中A、B为对照组，C、D为实验组。

具体实施方式

除非另有定义，本发明中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所述技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

本发明中，术语“抗体”指的是与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子。抗体可为源于自然源或源于重组源的完整的免疫球蛋白，并可为完整免疫球蛋白的免疫反应部分。抗体通常为免疫球蛋白分子的四聚物。本发明中的抗体可以以多种形式存在，包括例如，多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)₂，以及单链抗体和人源化抗体等(Harlow等，1999,In:Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Harlow等，1989,In:Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston等，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird等，1988,Science 242:423-426)。

术语“抗体片段”指的是完整抗体的一部分，并指的是完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的例子包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')₂和Fv片段，由抗体片段形成的线性抗体、scFv抗体和多特异性抗体。

术语“编码”指的是多核苷酸诸如基因、cDNA或mRNA中核苷酸的特异性序列用作模板合成在生物学过程中的其他多聚体和大分子的固有性质，所述多聚体和大分子具有核苷酸(即，rRNA、tRNA和mRNA)的限定序列或氨基酸的限定序列中的任一个和由其产生的生物学性质。因此，如果相应于那个基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物学系统中产生蛋白质，则基因编码蛋白质。核苷酸序列等同mRNA序列并通常提供在序列表中的编码链，和用作转录基因或cDNA的模板的非编码链两者，都可被称为编码那个基因或cDNA的蛋白质或其他产物。

除非另有规定，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括为彼此简并版本并编码相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可包括内含子。

术语“特异性结合”指识别特异性抗原但基本上不识别或结合样本中的其他分子。

术语“载体”为物质组合物，其包括分离的核酸，并且其可用于传递分离的核酸至细胞内部。很多载体在本领域中是已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两性分子化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语也应被解释为包括便于将核酸转移入细胞的非质粒和非病毒化合物，诸如例如聚赖氨酸化合物、脂质体等等。

术语“癌症”被定义为以畸变细胞的快速和失控生长为特征的疾病。癌症细胞可局部蔓延或通过血流和淋巴系统蔓延至身体的其他部分。各种癌症的例子包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等等。

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下实施例以能够特异性结合ROBO1分子和CD3分子的双特异性抗体ZD037为例进行说明。

实施例1双特异性抗体ZD037的制备

材料：

细胞株ExpiCHO-S cells(Gibco Catalog No.A29127)；

转染试剂盒ExpiFectamine CHO Transfection Kit(Gibco CatalogNo.A29129)；

OptiPRO SFM(Gibco Catalog No.12309-050)；

培养基ExpiCHO Expression Medium(Gibco Catalog No.A29100-01)；

培养条件：37℃，8％CO2培养箱，摇床培养；

pCDNA3.4质粒载体；

1.1ZD037蛋白表达

ZD037分子设计形式如图1所示。本实施例中以含有两条重链(重链A和重链B)和一条轻链的ZD037分子为例进行说明。其中，重链A的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，其基因序列如SEQ ID NO：11所示；重链B的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，其基因序列如SEQ IDNO：13所示；轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，其基因序列如SEQ ID NO：12所示。

通过全基因合成上述重链A、重链B和轻链的基因片段，并以此为模板，分别通过PCR扩增得到PCR产物，分别为重链A、重链B和轻链，用胶回收试剂盒纯化上述产物，利用T-A克隆原理，将上述PCR产物分别克隆至pCDNA3.4载体上，之后分别转化至TOP10菌株，氨苄青霉素筛选并挑取阳性克隆，通过测序确认含有重链A、重链B和轻链的载体构建成功。用无内毒素DNA提取试剂盒提取分别含有重链A、重链B和轻链的质粒DNA，用于转染ExpiCHO-S_TM细胞使用。

培养ExpiCHO-S_TM细胞，当密度达到2.5x10⁶细胞/毫升时转染。将分别含有重链A、重链B和轻链的质粒DNA按照1:1:1的比例转染ExpiCHO-S_TM细胞。14天后收集上清。高速离心ExpiCHO-S_TM培养液取上清，过滤，用于后续纯化。

1.2ZD037蛋白纯化

材料：

Binding Buffer：PBS缓冲液，pH为7.2-7.4。

Elution Buffer：0.1M Glycine,pH 2.7。

Neutralization Solution：1M Tris-HCl，pH 9.0。

实验流程：

启动AKTA设备，将protein A柱与AKTA连接。

使用3-5个柱体积的去离子水清洗protein A柱。

使用10个柱体积的Binding Buffer平衡protein A柱。

取出过滤的细胞上清液，依次流过protein A柱。

使用Binding Buffer清洗杂蛋白，直至UV280处吸光值趋近于0。

使用Elution Buffer洗脱目的蛋白，当UV280>100的时候开始收集洗脱液。

蛋白收集结束后，使用10个柱体积的Binding Buffer冲洗protein A柱。

透析袋透析去除盐离子，置换为PBS溶液保存ZD037蛋白。

利用凝胶电泳检测收集的ZD037蛋白，其结果如图2所示。

由图2可知，利用本实施例提供的制备方法成功表达制备并纯化获得ZD037目的蛋白，将其用于后续试验。

实施例2肿瘤细胞ROBO1表达分析鉴定

本实施例选择高表达ROBO1抗原的肝癌细胞MHCC97-H细胞作为靶细胞。为了确认MHCC97-H细胞为ROBO1分子高表达，进行流式染色，具体方法如下：

取5*10⁵MHCC97-H细胞用于染色。将MHCC97-H细胞与一抗共孵育45min，取50ul共孵育物置于冰上，流式染色buffer洗脱一次；将MHCC97-H细胞与二抗共孵育30min；再利用流式染色buffer洗脱一次，之后重悬于120ul FACS试剂中，流式细胞仪器检测分析。其实验结果如图3a和图3b所示。

由图3a和图3b可知，MHCC97-H细胞高表达ROBO1分子。

实施例3肿瘤杀伤实验检测药物活性

利用IncuCyte Zoom长时间动态细胞成像分析系统实时观察细胞的状态。将肿瘤细胞MHCC97-H和免疫细胞PBMC加入孔板放在该分析系统下观察，记录免疫细胞的整个杀伤过程。利用NucView488Caspase-3检测杀伤效果。

NucView488Caspase-3是一种死细胞染料，当肿瘤细胞被杀伤后，该染料可结合在DNA上，激光激发后呈现绿色，绿色荧光信号可以被IncuCyte Zoom设备捕捉记录。通过分析不同实验孔绿色荧光强度信号，可判断各实验组杀伤效果的强弱,荧光强度越强,杀伤效果越好。

试剂与材料：

细胞：MHCC97-H，PBMC；

药物：ZD037；

培养基：DMEM(10％FBS，5％双抗)(Gibco)，T细胞培养基(Gibco)；

试剂准备：NucView488Caspase-3底物(Biotium，#30067)；

设备：IncuCyte Zoom长时间动态细胞成像分析系统；

实验流程：

靶细胞MHCC97-H按100μl/4×10³/孔加入96孔板，37℃培养过夜(18-24小时)。

将免疫细胞PBMC以100K cells/well加入96孔板中。

ZD037药物分别按不同浓度加入实验孔，将已加入细胞的96孔板置于IncuCyteZoom设备中，打开绿光通道观察，设备放入37℃、体积分数5％CO₂培养箱中培养过夜。实验分组如下表1。

表1实验分组

组别	测试药物	肝素钠	免疫细胞	肿瘤细胞
					A	/	100ng/ul	PBMC(100K cells/well)	MHCC97-H(10K cells/well)
B	/	/	PBMC(100K cells/well)	MHCC97-H(10K cells/well)
					C	ZD037(0.25ug/ml)	100ng/ul	PBMC(100K cells/well)	MHCC97-H(10K cells/well)
D	ZD037(2.5ug/ml)	100ng/ul	PBMC(100K cells/well)	MHCC97-H(10K cells/well)

杀伤活性计算公式：

利用IncuCyte Zoom设备自带的荧光分析软件绘制荧光强度曲线图(肿瘤细胞杀伤效果图)分析上述各个组别中肿瘤细胞的杀伤状况。其实验结果如图4所示。

从图4中可以看出，与对照组(A/B组，不加ZD037)相比，ZD037药物(C/D组)可有效激活T细胞，启动杀伤肿瘤MHCC97-H细胞；与A组的肝素钠相比，ZD037药物也能够有效地激活T细胞，启动杀伤肿瘤MHCC97-H细胞。

实施例4T细胞活性分析

CD25分子是IL-2R的α链，单独构成低亲和力受体，其不能传导信号，但对形成高亲和力受体有重要意义。IL-2R的另外两条链是β、γ链。三条连构成的三聚体受体具有高亲和力，βγ链构成的中等亲和力受体负责传递IL-2信号。T细胞被激活后，CD25分子表达会显著上调，为了进一步确认T细胞是否被激活，利用CD25抗体对杀伤实验结束后的T细胞进行染色，染色方法为常规流式染色(如实施例2所述)，其实验结果如图5所示。

由图5可以看出，实验组T细胞CD25分子表达上调，进一步证明ZD037药物可激活T细胞。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 李华顺

<120> 一种以ROBO1为靶点的双特异性抗体及其制备和应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 209

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Slit2D2

<400> 1

Leu His Cys Pro Ala Ala Cys Thr Cys Ser Asn Asn Ile Val Asp Cys

1 5 10 15

Arg Gly Lys Gly Leu Thr Glu Ile Pro Thr Asn Leu Pro Glu Thr Ile

20 25 30

Thr Glu Ile Arg Leu Glu Gln Asn Thr Ile Lys Val Ile Pro Pro Gly

35 40 45

Ala Phe Ser Pro Tyr Lys Lys Leu Arg Arg Ile Asp Leu Ser Asn Asn

50 55 60

Gln Ile Ser Glu Leu Ala Pro Asp Ala Phe Gln Gly Leu Arg Ser Leu

65 70 75 80

Asn Ser Leu Val Leu Tyr Gly Asn Lys Ile Thr Glu Leu Pro Lys Ser

85 90 95

Leu Phe Glu Gly Leu Phe Ser Leu Gln Leu Leu Leu Leu Asn Ala Asn

100 105 110

Lys Ile Asn Ser Leu Arg Val Asp Ala Phe Gln Asp Leu His Asn Leu

115 120 125

Asn Leu Leu Ser Leu Tyr Asp Asn Lys Leu Gln Thr Ile Ala Lys Gly

130 135 140

Thr Phe Ser Pro Leu Arg Ala Ile Gln Thr Met His Leu Ala Gln Asn

145 150 155 160

Pro Phe Ile Cys Asp Cys His Leu Lys Trp Leu Ala Asp Tyr Leu His

165 170 175

Thr Asn Pro Ile Glu Thr Ser Gly Ala Arg Cys Thr Ser Pro Arg Arg

180 185 190

Leu Ala Asn Lys Arg Ile Gly Gln Ile Lys Ser Lys Lys Phe Arg Cys

195 200 205

Ser

<210> 2

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Anti CD3 VH

<400> 2

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 3

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Anti CD3 VL

<400> 3

Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly

20 25 30

Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn

85 90 95

Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 4

<211> 98

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Anti CD3 CH

<400> 4

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val

<210> 5

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Anti CD3 CL

<400> 5

Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

1 5 10 15

Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp

20 25 30

Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro

35 40 45

Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

50 55 60

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys

65 70 75 80

Ser His Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val

85 90 95

Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

100 105

<210> 6

<211> 232

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> FC（knob）

<400> 6

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 7

<211> 232

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> FC( hole )

<400> 7

Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 8

<211> 669

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Slit2D2 –Anti CD3 VH –Anti CD3 CH- FC（knob）

<400> 8

Leu His Cys Pro Ala Ala Cys Thr Cys Ser Asn Asn Ile Val Asp Cys

1 5 10 15

Arg Gly Lys Gly Leu Thr Glu Ile Pro Thr Asn Leu Pro Glu Thr Ile

20 25 30

Thr Glu Ile Arg Leu Glu Gln Asn Thr Ile Lys Val Ile Pro Pro Gly

35 40 45

Ala Phe Ser Pro Tyr Lys Lys Leu Arg Arg Ile Asp Leu Ser Asn Asn

50 55 60

Gln Ile Ser Glu Leu Ala Pro Asp Ala Phe Gln Gly Leu Arg Ser Leu

65 70 75 80

Asn Ser Leu Val Leu Tyr Gly Asn Lys Ile Thr Glu Leu Pro Lys Ser

85 90 95

Leu Phe Glu Gly Leu Phe Ser Leu Gln Leu Leu Leu Leu Asn Ala Asn

100 105 110

Lys Ile Asn Ser Leu Arg Val Asp Ala Phe Gln Asp Leu His Asn Leu

115 120 125

Asn Leu Leu Ser Leu Tyr Asp Asn Lys Leu Gln Thr Ile Ala Lys Gly

130 135 140

Thr Phe Ser Pro Leu Arg Ala Ile Gln Thr Met His Leu Ala Gln Asn

145 150 155 160

Pro Phe Ile Cys Asp Cys His Leu Lys Trp Leu Ala Asp Tyr Leu His

165 170 175

Thr Asn Pro Ile Glu Thr Ser Gly Ala Arg Cys Thr Ser Pro Arg Arg

180 185 190

Leu Ala Asn Lys Arg Ile Gly Gln Ile Lys Ser Lys Lys Phe Arg Cys

195 200 205

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

210 215 220

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

225 230 235 240

Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

245 250 255

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr

260 265 270

Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg

275 280 285

Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr

290 295 300

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn

305 310 315 320

Ser Tyr Ile Ser Tyr Trp Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

325 330 335

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

340 345 350

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val

355 360 365

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

370 375 380

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

385 390 395 400

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

405 410 415

Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

420 425 430

Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys

435 440 445

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

450 455 460

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

465 470 475 480

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

485 490 495

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

500 505 510

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

515 520 525

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

530 535 540

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

545 550 555 560

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys

565 570 575

Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys

580 585 590

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

595 600 605

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

610 615 620

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

625 630 635 640

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

645 650 655

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

660 665

<210> 9

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Anti CD3 CL- Anti CD3 VL

<400> 9

Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly

20 25 30

Asn Tyr Pro Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Lys Phe Leu Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn

85 90 95

Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro

100 105 110

Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu

115 120 125

Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro

130 135 140

Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala

145 150 155 160

Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala

165 170 175

Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Lys

180 185 190

Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr

195 200 205

Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 10

<211> 456

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Slit2D2 –FC( hole )

<400> 10

Leu His Cys Pro Ala Ala Cys Thr Cys Ser Asn Asn Ile Val Asp Cys

1 5 10 15

Arg Gly Lys Gly Leu Thr Glu Ile Pro Thr Asn Leu Pro Glu Thr Ile

20 25 30

Thr Glu Ile Arg Leu Glu Gln Asn Thr Ile Lys Val Ile Pro Pro Gly

35 40 45

Ala Phe Ser Pro Tyr Lys Lys Leu Arg Arg Ile Asp Leu Ser Asn Asn

50 55 60

Gln Ile Ser Glu Leu Ala Pro Asp Ala Phe Gln Gly Leu Arg Ser Leu

65 70 75 80

Asn Ser Leu Val Leu Tyr Gly Asn Lys Ile Thr Glu Leu Pro Lys Ser

85 90 95

Leu Phe Glu Gly Leu Phe Ser Leu Gln Leu Leu Leu Leu Asn Ala Asn

100 105 110

Lys Ile Asn Ser Leu Arg Val Asp Ala Phe Gln Asp Leu His Asn Leu

115 120 125

Asn Leu Leu Ser Leu Tyr Asp Asn Lys Leu Gln Thr Ile Ala Lys Gly

130 135 140

Thr Phe Ser Pro Leu Arg Ala Ile Gln Thr Met His Leu Ala Gln Asn

145 150 155 160

Pro Phe Ile Cys Asp Cys His Leu Lys Trp Leu Ala Asp Tyr Leu His

165 170 175

Thr Asn Pro Ile Glu Thr Ser Gly Ala Arg Cys Thr Ser Pro Arg Arg

180 185 190

Leu Ala Asn Lys Arg Ile Gly Gln Ile Lys Ser Lys Lys Phe Arg Cys

195 200 205

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

210 215 220

Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

225 230 235 240

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

245 250 255

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

260 265 270

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

275 280 285

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

290 295 300

Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

305 310 315 320

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

325 330 335

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

340 345 350

Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

355 360 365

Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

370 375 380

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

385 390 395 400

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val

405 410 415

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

420 425 430

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

435 440 445

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450 455

<210> 11

<211> 2070

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Slit2D2 –Anti CD3 VH –Anti CD3 CH3- FC（knob）

<400> 11

atggagaccg acacactgct cctgtgggtc ctgctcctct gggtgccagg aagtacagga 60

ctgcattgcc cagccgcttg cacttgtagc aacaacatcg tggattgcag gggcaagggc 120

ctgacagaga tccctaccaa cctgcccgag accatcaccg agatccggct ggagcagaac 180

accatcaagg tcatccctcc cggcgccttt agcccttaca agaagctgcg gcggatcgac 240

ctgagcaaca accagatcag cgagctggcc ccagacgcct ttcagggact gagaagcctg 300

aacagcctgg tgctgtacgg caacaagatc accgagctgc ctaagagcct gttcgaggga 360

ctgttcagcc tgcagctgct gctgctgaac gccaacaaga tcaacagcct gcgggtggac 420

gccttccagg acctgcacaa cctgaacctg ctgagcctgt acgacaacaa gctgcagacc 480

atcgccaagg gcacctttag ccccctgaga gccatccaga caatgcacct ggcccagaac 540

cccttcatct gcgattgcca cctcaagtgg ctggccgatt acctgcacac caaccccatc 600

gagacaagcg gagctaggtg taccagccct agaagactgg ccaacaagcg gatcggccag 660

atcaagagca agaagttccg ctgtagcggg ggaggaggat cagaagtgca gctggtggag 720

tcaggaggag gactggtgca gccaggagga tctctgaagc tgtcttgcgc cgctagcgga 780

ttcaccttca acaagtacgc catgaattgg gtgagacagg ccccaggaaa aggactggag 840

tgggtggcca ggatccggag caagtacaac aactacgcca cctactacgc cgacagcgtg 900

aaggaccggt tcaccatcag cagggacgac agcaagaaca ccgcctacct gcagatgaac 960

aacctgaaga ccgaggacac cgccgtgtac tattgcgtgc gccacggcaa cttcggcaac 1020

agctacatca gctactgggc ctattggggc cagggaacac tggtgacagt gtctagcgcc 1080

agcaccaaag gccctagcgt gtttcccctg gccccttcta gcaagtctac aagcggcgga 1140

acagccgctc tgggttgcct ggtgaaagac tacttccccg agccagtgac cgtgtcttgg 1200

aatagcggag ccctgaccag cggagtgcat acctttccag ccgtgctgca gagctcagga 1260

ctgtacagcc tgtccagcgt ggtgacagtg ccttctagca gcctgggcac acagacctac 1320

atctgcaacg tgaaccacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagggt ggagcccaag 1380

tcttgcgaca agacccacac ctgtccccct tgtccagctc cagaactgct gggaggacca 1440

agcgtgttcc tgttccctcc caagcccaag gacaccctga tgatcagcag gacccccgaa 1500

gtgacttgcg tggtggtgga cgtgtctcac gaggaccccg aggtcaagtt caattggtac 1560

gtggacggag tggaagtgca caacgccaag accaagccca gagaggagca gtacgcctct 1620

acctacaggg tggtgtccgt gctgacagtg ctgcaccagg attggctgaa cggcaaggag 1680

tacaagtgca aggtgtccaa caaggctctg ccagccccca tcgagaagac catcagcaag 1740

gctaagggcc agcctagaga acctcaggtg tacaccctgc ccccttgtag agacgagctg 1800

accaagaacc aggtctccct ctggtgcctc gtgaagggct tctaccctag cgacatcgcc 1860

gtggagtggg aatctaacgg ccagccagag aacaactaca agaccacccc cccagtgctg 1920

gacagcgacg gcagcttctt cctgtacagc aagctgaccg tggacaaaag ccgctggcag 1980

cagggcaacg tgttctcttg cagcgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 2040

aagagcctga gcctgagccc aggaaagtga 2070

<210> 12

<211> 708

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Anti CD3 CL- Anti CD3 VL

<400> 12

atggagaccg acacactgct cctgtgggtc ctgctcctct gggtgccagg aagtacagga 60

cagaccgtgg tgacccagga accttctctg accgtgtctc caggaggcac agtgacactg 120

acatgcggca gctctacagg agccgtgaca agcggcaact accccaattg ggtgcagcag 180

aagccaggac aggcccctag aggcctgatt ggcggaacaa agtttctggc cccaggcaca 240

ccagccagat tctccggatc tctgctggga ggaaaggccg ctctgacact gtcaggagtg 300

cagccagagg acgaggccga gtactattgc gtcctctggt acagcaaccg ctgggtgttc 360

ggaggaggca caaagctgac agtgctggga cagcctaaag ccgctcctag cgtgacactg 420

tttcctccta gcagcgagga gctgcaggct aataaggcca ccctcgtctg cctgatcagc 480

gacttctacc caggcgccgt gaccgtggct tggaaagccg atagcagccc agtgaaggcc 540

ggagtggaga caaccacccc tagcaagcag agcaacaaca agtacgccgc cagcagctac 600

ctgtctctga cacccgagca gtggaagagc cacaagagct actcttgcca ggtcacccac 660

gagggaagca cagtggagaa gacagtggcc cctacagagt gctcctga 708

<210> 13

<211> 1431

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Slit2D2 –FC( hole )

<400> 13

atggagaccg acacactgct cctgtgggtc ctgctcctct gggtgccagg aagtacagga 60

ctgcattgcc cagccgcttg cacttgtagc aacaacatcg tggattgcag gggcaagggc 120

ctgacagaga tccctaccaa cctgcccgag accatcaccg agatccggct ggagcagaac 180

accatcaagg tcatccctcc cggcgccttt agcccttaca agaagctgcg gcggatcgac 240

ctgagcaaca accagatcag cgagctggcc ccagacgcct ttcagggact gagaagcctg 300

aacagcctgg tgctgtacgg caacaagatc accgagctgc ctaagagcct gttcgaggga 360

ctgttcagcc tgcagctgct gctgctgaac gccaacaaga tcaacagcct gcgggtggac 420

gccttccagg acctgcacaa cctgaacctg ctgagcctgt acgacaacaa gctgcagacc 480

atcgccaagg gcacctttag ccccctgaga gccatccaga caatgcacct ggcccagaac 540

cccttcatct gcgattgcca cctcaagtgg ctggccgatt acctgcacac caaccccatc 600

gagacaagcg gagctaggtg taccagccct agaagactgg ccaacaagcg gatcggccag 660

atcaagagca agaagttccg ctgtagcgga ggaggaggaa gcggaggagg aggaagcgga 720

ggaggaggca gcgagcctaa aagcagcgat aagacccaca cttgccctcc ttgtccagcc 780

ccagaactgc tgggaggccc aagcgtgttt ctgttccctc ccaagcccaa ggataccctg 840

atgatcagcc ggacccccga agtgacttgc gtggtggtgg acgtgtctca cgaggatcca 900

gaggtcaagt tcaattggta cgtggacggc gtggaagtgc acaacgccaa gaccaagccc 960

agagaggagc agtacgcctc tacctaccgg gtggtgtcag tgctgacagt gctgcaccag 1020

gattggctga acggcaagga gtacaagtgc aaggtgtcca acaaagccct gccagcccct 1080

atcgagaaga ccatcagcaa ggccaaggga cagcccagag agccacaggt ctgtacactc 1140

cctcctagca gggacgagct gaccaagaac caggtgtccc tgtcttgcgc cgtgaaagga 1200

ttctacccca gcgacatcgc agtcgagtgg gaaagcaacg gccagcccga gaacaactac 1260

aagaccaccc ctccagtgct ggatagcgac ggcagcttct tcctggtgtc caagctgacc 1320

gtggacaaaa gccgctggca gcagggaaac gtgttctctt gcagcgtgat gcacgaggcc 1380

ctgcacaacc actacaccca gaagagcctg agcctgagcc caggaaagtg a 1431

Claims

1.双特异性抗体，其特征在于，其包含特异性结合肿瘤细胞表面抗原分子的抗原结合结构域(简称R结构域)和特异性结合免疫细胞(例如T细胞、NKT细胞和/或CIK细胞)的抗原结合结构域(简称I结构域)，所述I结构域与R结构域直接连接或通过连接肽连接。

2.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述R结构域包括Slit2D2蛋白；和/或所述I结构域包括Anti CD3 VH结构域和/或Anti CD3 VL结构域。

3.如权利要求2所述的双特异性抗体，其特征在于，所述Slit2D2的氨基酸序列如SEQID NO：1所示的序列或其同源序列；和/或所述Anti CD3 VH的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的序列或其同源序列；和/或所述Anti CD3VL的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的序列或其同源序列。

4.如权利要求1-3中任一项所述的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体的结构包括：

Slit2D2–Anti CD3 VH，和/或

Anti CD3 VH–Slit2D2，和/或

Slit2D2-Anti CD3 VL，和/或

Anti CD3 VL-Slit2D2。

5.如权利要求1-3中任一项所述的双特异性抗体，其特征在于，还包括FC端；优选地，所述FC端为FC(knob)片段和/或FC(hole)片段，更优选地，所述FC(knob)片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示的序列或其同源序列；和/或FC(hole)片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的序列或其同源序列。

6.如权利要求1-3中任一项所述的双特异性抗体，其特征在于，还包括Anti CD3 CH结构域和/或Anti CD3 CL结构域；优选地，所述Anti CD3 CH结构域的氨基酸序列如SEQ IDNO：4所示的序列或其同源序列；和/或所述Anti CD3CL的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示的序列或其同源序列。

7.如权利要求6所述的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体的结构包括：

Slit2D2–Anti CD3 VH-Anti CD3 CH，和/或

Anti CD3 VH–Anti CD3 CH-Slit2D2，和/或

Slit2D2-Anti CD3 VL-Anti CD3CL，和/或

Anti CD3 VL-Anti CD3CL-Slit2D2。

8.如权利要求6或7所述的双特异性抗体，其特征在于，还包括FC端；优选地，所述FC端为FC(knob)片段和/或FC(hole)片段，更优选地，所述FC(knob)片段的氨基酸序列如SEQ IDNO：6所示的序列或其同源序列；和/或FC(hole)片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的序列或其同源序列。

9.如权利要求8所述的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体包括一条重链和一条轻链，其中，

(1)所述重链结构为：

Slit2D2–Anti CD3 VH-Anti CD3 CH–FC或Anti CD3 VH-Anti CD3 CH–Slit2D2–FC；

所述轻链结构为Anti CD3VL-Anti CD3 CL；

或(2)所述重链结构为：Anti CD3 VH-Anti CD3 CH–FC；

所述轻链结构为Slit2D2–Anti CD3VL-Anti CD3 CL；或Anti CD3 VL-Anti CD3 CL–Slit2D2。

10.如权利要求8所述的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体包括两条重链和两条轻链，所述两条重链相同，所述两条轻链相同，其中，

(1)所述重链的结构为：

Slit2D2–Anti CD3 VH-Anti CD3 CH–FC；或Anti CD3 VH-Anti CD3 CH–Slit2D2–FC；

所述轻链结构为Anti CD3 VL-Anti CD3 CL；

或(2)所述重链结构为：Anti CD3 VH-Anti CD3 CH–FC；

所述轻链结构为Slit2D2–Anti CD3 VL-Anti CD3 CL；或Anti CD3 VL-Anti CD3 CL–Slit2D2。

11.如权利要求8所述的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体包括重链A、重链B和一条轻链，其中重链A的结构为：

Slit2D2–Anti CD3 VH-Anti CD3 CH–FC；或Anti CD3 VH-Anti CD3CH–Slit2D2–FC；

重链B的结构为：Slit2D2–FC；

所述轻链结构为Anti CD3 VL-Anti CD3 CL。

12.如权利要求11所示的双特异性抗体，其特征在于，所述重链A的结构为：Slit2D2–Anti CD3 CH-Anti CD3 VH–FC(hole)；所述重链B的结构为：Slit2D2–FC(knob)。

13.如权利要求11所示的双特异性抗体，其特征在于，所述重链A的结构为Slit2D2–Anti CD3 CH-Anti CD3 VH–FC(knob)所述重链B的结构为：Slit2D2–FC(hole)。

14.如权利要求13所示的双特异性抗体，其特征在于，所述重链A的氨基酸序列如SEQID NO：8所示的序列或其同源序列；所述重链B的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示的序列或其同源序列；所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示的序列或其同源序列。

15.如权利要求13或14所示的双特异性抗体，其特征在于，编码所述重链A的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示的序列或其简并序列；编码所述重链B的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示的序列或其简并序列；编码所述轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示的序列或其简并序列。

16.权利要求1-15中任一项所述双特异性抗体的制备方法，其包括：将双特异性抗体的基因克隆到表达载体上；以及任选地，将表达载体转入宿主细胞中表达。

17.如权利要求16所述的制备方法，其特征在于，所述表达载体选自质粒、细菌和病毒中的一种或多种，优选地，所述表达载体为pCDNA3.4载体。

18.一种药物组合物，其特征在于，其包含选自：权利要求1-15中任一项所述的双特异性抗体，或权利要求16或17所制备的双特异性抗体中的一项或多项。

19.如权利要求18所述的药物组合物，其还包括药学上可接受的辅料。

20.一种权利要求1-15任一项所述的双特异性抗体、权利要求16或17所制备的双特异性抗体中的一项或多项在制备治疗和/或预防癌症的药物中的应用；优选的，所述的癌症为高表达Robo1的肿瘤及相关疾病。