CN110461881A - 嵌合抗原受体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种嵌合抗原受体，其包括目标抗原结合区域、膜贯通区域、T细胞活化信号传递区域，其中，所述目标抗原是神经节苷脂GM2。

Description

嵌合抗原受体
技术领域
本发明涉及一种嵌合抗原受体、表达嵌合抗原受体的细胞、以及包含编码嵌合抗原受体的碱基序列的载体等。
本申请基于2017年3月27日在日本申请的日本特愿2017-061461号主张优先权，在此引用其内容。
背景技术
嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor：以下也称为”CAR”)是使识别癌细胞的细胞表面抗原的单链抗体和诱导T细胞的活化的信号传递区域融合而成的人工嵌合蛋白质。例如，通过向不具有肿瘤反应性的通常的末梢血T细胞(末梢血T淋巴球)导入编码CAR的基因，能够大量制作能够表达CAR的CAR表达T细胞(以下也称为“CAR-T细胞”)。该CAR-T细胞具有肿瘤反应性，能够在不依赖与主要组织相容性复合体(MHC)的相互作用的情况下导入对癌细胞的伤害。
利用CAR-T细胞投与的癌症免疫疗法，更具体而言，从患者采集T细胞，向该T细胞导入编码CAR的基因并进行扩增，再次移入患者的疗法在当前世界中正进行临床试验，得到了在白血病或淋巴瘤等的造血器官恶性肿瘤等中显示出有效性的结果。
然而，现状是，在利用CAR-T细胞的癌症免疫疗法中得到了有效结果的仅是针对造血器官恶性肿瘤，对于实体肿瘤还未获得显示有效性的结果。为了开发对实体肿瘤有效的CAR，目标抗原的选择是重要的，需要探索能够适用于实体肿瘤的目标抗原。
另一方面，作为CAR-T细胞疗法对实体肿瘤没有效果的主要原因，可以考虑CAR-T细胞在生物体内的生存率低、对肿瘤局部的聚集低、肿瘤细胞分泌的免疫抑制因子等引起的活性抑制等。作为解决这样的问题的方法，报道了将编码CAR的核酸和编码T细胞的免疫功能促进因子的核酸导入T细胞的方法(专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2016/056228号。
发明内容
发明要解决的问题
在专利文献1中，由于没有确认到以在人实体肿瘤中表达的抗原为目标的CAR-T细胞的效果，因此需要对于这样的抗原显示有效性的CAR-T细胞。
因此，本发明的目的是提供一种以实体肿瘤抗原为目标抗原的新CAR以及对实体肿瘤有效的CAR-T细胞。
解决问题的手段
本发明包括以下的方式。
(1)一种嵌合抗原受体，包括目标抗原结合区域、膜贯通区域、T细胞活化信号传递区域，其中，所述目标抗原是神经节苷脂GM2。
(2)如(1)所述的嵌合抗原受体，其中，所述目标抗原结合区域包括抗神经节苷脂GM2抗体的重链可变区域和轻链可变区域。
(3)如(2)所述的嵌合抗原受体，其中，所述抗神经节苷脂GM2抗体是从由以下(a)-(c)组成的组中选择的抗体：
(a)包括重链可变区域和轻链可变区域，并且具有对神经节苷脂GM2的结合能力的抗体，其中，所述重链可变区域包含序列号2记载的氨基酸序列构成的重链可变区域的CDR1、CDR2和CDR3，所述轻链可变区域包含序列号4记载的氨基酸序列构成的轻链可变区域的CDR1、CDR2和CDR3；
(b)包括重链可变区域和轻链可变区域，并且具有对神经节苷脂GM2的结合能力的抗体，其中，所述重链可变区域由序列号2记载的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸变异而成的氨基酸序列构成，所述轻链可变区域由序列号4记载的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸变异而成的氨基酸序列构成；以及
(c)包括重链可变区域和轻链可变区域，并且具有对神经节苷脂GM2的结合能力的抗体，其中，所述重链可变区域由与序列号2记载的氨基酸序列具有70％以上的序列同一性的氨基酸序列构成，所述轻链可变区域由与序列号4记载的氨基酸序列具有70％以上的序列同一性的氨基酸序列构成。
(4)如(3)所述的嵌合抗原受体，其中，所述重链可变区域包括序列号2记载的氨基酸序列，所述轻链可变区域包括序列号4记载的氨基酸序列。
(5)如(2)-(4)中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述抗神经节苷脂GM2抗体是单链抗体(scFv)。
(6)如(5)所述的嵌合抗原受体，其中，所述scFv是从以下(a)-(c)组成的组中选择的多肽：
(a)包括从序列号10、12、14和16组成的组选择的氨基酸序列的多肽；
(b)由与序列号10、12、14和16组成的组选择的氨基酸序列具有70％以上的序列同一性的氨基酸序列构成并且具有相对于神经节苷脂GM2的结合能力的多肽；以及
(c)由序列号10、12、14和16组成的组选择的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸变异而成的氨基酸序列构成并且具有相对于神经节苷脂GM2的结合能力的多肽。
(7)如(1)-(6)中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述膜贯通区域是CD8的膜贯通区域。
(8)如(7)所述的嵌合抗原受体，其中，所述CD8的膜贯通区域包括从以下(a)-(c)组成的组选择的多肽：
(a)包括序列号20记载的氨基酸序列的多肽；
(b)由与序列号20记载的氨基酸序列具有70％以上的序列同一性的氨基酸序列构成并且具有膜贯通能力的多肽；以及
(c)由序列号20记载的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸变异而成的氨基酸序列构成并且具有膜贯通能力的多肽。
(9)如(1)-(8)中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，T细胞活化信号传递区域是CD3ζ的T细胞活化信号传递区域。
(10)如(9)所述的嵌合抗原受体，其中，所述CD3ζ的T细胞活化信号传递区域包括从以下(a)-(c)组成的组选择的多肽：
(a)包括序列号28记载的氨基酸序列的多肽；
(b)由与序列号28记载的氨基酸序列具有70％以上的序列同一性(相同性)的氨基酸序列构成并且具有T细胞活化信号传递能力的多肽；以及
(c)由序列号28记载的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸变异而成的氨基酸序列构成并且具有T细胞活化信号传递区域能力的多肽。
(11)如(9)或(10)所述的嵌合抗原受体，其中，所述T细胞活化信号传递区域还包括CD28的T细胞活化信号传递区域和4-1BB的T细胞活化信号传递区域中的至少一种。
(12)如(11)所述的嵌合抗原受体，其中，所述CD28的T细胞活化信号传递区域包括从以下(a)-(c)组成的组选择的多肽：
(a)包括序列号24记载的氨基酸序列的多肽；
(b)由与序列号24记载的氨基酸序列具有70％以上的序列同一性(相同性)的氨基酸序列构成并且具有T细胞活化信号传递能力的多肽；以及
(c)由序列号24记载的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸变异而成的氨基酸序列构成并且具有T细胞活化信号传递区域能力的多肽。
(13)如(11)所述的嵌合抗原受体，其中，所述4-1BB的T细胞活化信号传递区域包括从以下(a)-(c)组成的组选择的多肽：
(a)包括序列号26记载的氨基酸序列的多肽；
(b)由与序列号26记载的氨基酸序列具有70％以上的序列同一性(相同性)的氨基酸序列构成并且具有T细胞活化信号传递能力的多肽；以及
(c)由序列号26记载的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸变异而成的氨基酸序列构成并且具有T细胞活化信号传递区域能力的多肽。
(14)如(11)-(13)中任一项所述的嵌合抗原受体，其中，所述T细胞活化信号传递区域包括CD28、4-1BB以及CD3ζ的T细胞活化信号传递区域，从N末端侧按照CD28、4-1BB以及CD3ζ的顺序配置。
(15)一种细胞，表达(1)-(14)中任一项所述的嵌合抗原受体。
(16)如(15)所述的细胞，其中，所述细胞还表达IL-7和CCL19中的至少一种。
(17)如(16)所述的细胞，其中，所述细胞表达IL-7和CCL19两者。
(18)如(16)或(17)所述的细胞，其中，所述IL-7包括从以下(a)-(c)组成的组选择的多肽：
(a)包括序列号59记载的氨基酸序列的多肽；
(b)由与序列号59记载的氨基酸序列具有70％以上的序列同一性的氨基酸序列构成并且具有T细胞的免疫功能促进功能的多肽；以及
(c)由序列号59记载的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸变异而成的氨基酸序列构成并且具有T细胞的免疫功能促进功能的多肽。
(19)如(16)-(18)任一项所述的细胞，其中，所述CCL19包括从以下(a)-(c)组成的组选择的多肽：
(a)包括序列号61记载的氨基酸序列的多肽；
(b)由与序列号61记载的氨基酸序列具有70％以上的序列同一性的氨基酸序列构成并且具有T细胞的免疫功能促进功能的多肽；以及
(c)由序列号61记载的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸变异而成的氨基酸序列构成并且具有T细胞的免疫功能促进功能的多肽。
(20)如(15)-(19)中任一项所述的细胞，其中，所述细胞是免疫细胞。
(21)如(20)所述的细胞，其中，所述免疫细胞是T细胞。
(22)一种多核苷酸，包括编码(1)-(14)中任一项所述的嵌合抗原受体的碱基序列。
(23)如(22)所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸还包括编码IL-7的碱基序列和编码CCL19的碱基序列中的至少一种。
(24)如(23)所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸包括编码IL-7的碱基序列和编码CCL19的碱基序列两者。
(25)一种载体，包括编码(1)-(14)任一项所述的嵌合抗原受体的碱基序列。
(26)如(25)所述的载体，其中，所述载体还包括编码IL-7的碱基序列和编码CCL19的碱基序列中的至少一种。
(27)如(26)所述的载体，其中，所述载体包括编码IL-7的碱基序列和编码CCL19的碱基序列两者。
(28)一种表达嵌合抗原受体的细胞的制造方法，包括将多核苷酸或载体导入细胞，所述多核苷酸或载体包括编码(1)-(14)中任一项所述的嵌合抗原受体的碱基序列。
(29)如(28)所述的表达嵌合抗原受体的细胞的制造方法，其中，还包括将包括编码IL-7的碱基序列和编码CCL19的碱基序列中的至少一种的多核苷酸或载体导入细胞。
(30)如(29)所述的表达嵌合抗原受体的细胞的制造方法，其中，还包括将包括编码IL-7的碱基序列和编码CCL19的碱基序列两者的多核苷酸或载体导入细胞。
(31)一种药物组合物，包括(15)-(20)中任一项所述的细胞。
(32)如(31)所述的药物组合物，其中，所述药物组合物用于治疗或预防肿瘤。
发明效果
根据本发明，提供了一种以实体肿瘤抗原为目标抗原的新CAR以及对实体肿瘤有效的CAR-T细胞。
附图说明
图1A是示出抗GM2 CAR构建体的示意图。
图1B是示出IL-7/CCL19表达-抗GM2 CAR载体、以及导入了所述载体的抗GM2CAR-IL-7/CCL19表达T细胞的示意图。
图2是显示用流式细胞仪确认抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞中的CAR的表达水平的结果的图。左图为非基因导入T细胞的结果，右图为抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞的结果。
图3是显示通过ELISA测定抗GM2 CAR表达T细胞的培养上清中的IL-7和CCL19的浓度的结果的图。图中，“GM2 CAR”表示抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞，“non infection”表示非基因导入T细胞(以后的图中相同)。
图4是表示使用了抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞的肿瘤细胞伤害性试验及共培养试验的试验时间表的图。
图5A是表示使用了四种抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞的铬释放试验的结果的图。图5A是将恶性间皮肿瘤细胞株(Y-meso8A、MSTO211H)作为靶细胞的试验的结果。图中，“VL15VH”、“VL25VH”、“VH15VL”及“VH25VL”分别表示包含该序列作为抗GM2CAR的scFv序列的抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞的结果(以后的图中相同)。
图5B是表示使用了四种抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞的铬释放试验的结果的图。图5B是将骨髓瘤细胞株(KMS-11、KMS-28PE)作为靶细胞的试验的结果。
图6A是表示抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞与对照组CAR-T细胞的铬释放试验结果比较的图。图6A是将恶性间皮肿瘤细胞株(Y-meso8A)作为靶细胞的试验的结果。图中，“FITC CAR-T”表示用作阴性对照组的抗FITC CAR-T细胞(以后的图中相同)。
图6B是表示抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞与对照组CAR-T细胞的铬释放试验结果比较的图。图6B是将骨髓瘤细胞株(KMS11)作为靶细胞的试验的结果。
图6C是表示抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞与对照组CAR-T细胞的铬释放试验结果比较的图。图6C是将大肠癌细胞株(SW480)作为靶细胞的试验的结果。
图7是表示GM2阳性的恶性间皮肿瘤细胞株(Y-meso8A)和抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞或对照组细胞的共培养试验的结果的图。图中，“tumor only”是仅培养肿瘤细胞(以后的图中相同)。
图8是表示GM2阳性的恶性间皮肿瘤细胞株(MSTO221H)和抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞或对照组细胞的共培养试验的结果的图。
图9是显示GM2阴性的大肠癌细胞株(SW480)和抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞或对照组细胞的共培养试验的结果的图。
图10是表示以ELISA测定各肿瘤细胞株与抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞或对照组细胞的共培养试验的培养上清中的IFN-γ的结果的图。
图11A是表示对在胸腔内投与了表达Luciferase的MSTO211H的免疫缺陷小鼠投与抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞或非基因导入T细胞时的肿瘤增殖推移的图。
图11B是表示对在腹腔内投与了表达Luciferase的MSTO211H的免疫缺陷小鼠投与抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞或非基因导入T细胞时的肿瘤增殖推移的图。
图12是表示对在胸腔内投与了表达Luciferase的MSTO211H的免疫缺陷小鼠投与抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞或非基因导入T细胞时的肿瘤增殖推移进行解析的结果的图。
图13是表示对在胸腔内投与了表达Luciferase的MSTO211H的免疫缺陷小鼠投与抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞、抗GM2 CAR表达T细胞或非基因导入T细胞时的肿瘤增殖推移进行解析的结果的图。图中，“×”表示小鼠死亡。
图14是表示对在胸腔内投与了表达Luciferase的MSTO211H的免疫缺陷小鼠投与抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞、抗GM2 CAR表达T细胞或非基因导入T细胞时的肿瘤增殖推移的效果进行解析的结果的图。
图15是表示对在胸腔内投与了表达Luciferase的MSTO211H的免疫缺陷小鼠投与抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞、抗GM2 CAR表达T细胞或非基因导入T细胞时的小鼠生存率的效果进行解析的结果的图。
具体实施方式
本发明提供的多肽、多核苷酸、载体和细胞可以是分离的状态。即，本说明书中记载的多肽、多核苷酸、载体及细胞可以是分离的多肽、分离的多核苷酸、分离的载体、以及分离的细胞。
[嵌合抗原受体(抗GM2 CAR)]
在一个实施方式中，本发明提供一种嵌合抗原受体，其包含目标抗原结合区域、膜贯通区域、T细胞活化信号传递区域，所述目标抗原是神经节苷脂GM2。
在本说明书中，“嵌合抗原受体(CAR)”是指包含目标抗原结合区域、膜贯通区域和T细胞活化信号传递区域的嵌合蛋白质。需要说明的是，嵌合蛋白质是指包含源自两种以上异种蛋白质的序列的蛋白质。CAR不限于仅包含上述3个区域，也可包含其他区域。
<目标抗原结合区域>
本实施方式的CAR包含目标抗原为神经节苷脂GM2(以下，也称为“GM2”)的目标抗原结合区域。
“目标抗原结合区域”是指在以T细胞表达CAR时，在细胞外与目标抗原结合的细胞外区域。在CAR-T细胞中表达的CAR转移至细胞膜，位于细胞外的目标抗原结合区域和位于细胞内的T细胞活化信号传递区域经由贯通细胞膜的膜贯通区域而成为连结的状态。当CAR-T细胞与具有目标抗原作为膜抗原的细胞接触时，目标抗原结合区域与该目标抗原结合，由此T细胞活化信号从T细胞活化信号传递区域传递到T细胞内，T细胞被活化。
在本实施方式的CAR中，目标抗原结合区域结合的目标抗原为GM2。
GM2是具有唾液酸的糖脂质的神经节苷脂的一种。神经节苷脂构成动物的细胞膜，是由作为亲水性侧链的糖链和作为疏水性侧链的神经鞘氨醇和脂肪酸构成的分子。神经节苷脂根据唾液酸的结合型、结合数、以及与非还原末端结合的N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)及半乳糖(Gal)的结合的有无而被分类。GM2是具有GalNAcβ1-4(SAα2-3)Galβ1–4Glcβ1-1神经酰胺的糖链结构的神经节苷脂的一种。
神经节苷脂的种类和表达量根据细胞种类、脏器种类、动物种类等而不同，已知在细胞癌化的过程中，神经节苷脂的表达发生量和质的变化(Cancer Res 45：2405-14(1985))。报告了GM2在正常细胞中几乎没有表达，但报告在肺癌、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、黑素瘤、恶性间皮瘤、骨髓瘤等肿瘤中表达(Cancer Res45：2405-14(1985)；CancerRes50：7444-9(1990)；Cancer Sci vol.102no.12：2157-2163；Cancer Sci vol.106no.1：102-107(2015))。
目标抗原结合区域只要能够与GM2特异性结合就没有特别限定，优选包含能够与GM2特异性结合的单克隆抗体(以下，也称为“抗GM2抗体”)的抗原结合区域。抗体的“抗原结合区域”是指在抗体中与抗原结合有关的区域，具体而言，是指包含互补性决定区域(Complementarity Determining Region：CDR)的区域。抗体的抗原结合区域包含该抗体的至少一个CDR。在优选的方式中，抗体的抗原结合区域包含该抗体的全部6个CDR。另外，CDR能够通过作为CDR的定义已知的任意的定义来决定，例如能够使用Kabat、Chothia、AbM、cotact等的定义。优选的是，可举出由Kabat定义的CDR。
能够在目标抗原结合区域中使用的抗GM2抗体没有特别限定，可以是公知的抗体，也可以是新制作的抗体。新制作抗GM2抗体的情况下，抗GM2抗体的制作用公知的方法进行即可。例如，可以使用用GM2免疫动物而得到杂交瘤的方法、噬菌体显示法等。
抗GM2抗体所来源的生物没有特别限定，优选为人抗体。作为人抗GM2抗体的例子，可举出具有序列号2中记载的氨基酸序列作为重链可变(VH)区域、具有序列号4中记载的氨基酸序列作为轻链可变(VL)区域的抗体等。将由序列号2中记载的氨基酸序列构成的VH区域的Kabat定义的CDR1～3的氨基酸序列分别示于序列号63～65。另外，将由序列号4中记载的氨基酸序列构成的VL区域的Kabat定义的CDR1～3的氨基酸序列分别示于序列号66～68。
在优选的方式中，目标抗原结合区域可以包含抗GM2抗体的VH区域和VL区域。例如，包含抗GM2抗体的VH区域和VL区域的单链抗体(scFv)的多肽是目标抗原结合区域的优选例。scFv是用肽连接子将抗体的VH区域和VL区域连结而成的多肽，一般用作CAR的目标抗原结合区域。
在使用scFv的情况下，连结VH区域和VL区域的肽连接子没有特别限定，可以使用scFv中通常使用的肽。作为肽连接子的例子，例如可举出连接子15(序列号6)、连接子25(序列号8)等，但并不限定于这些。
scFv中使用的VH区域和VL区域可以使用抗GM2抗体的VH区域和VL区域。抗GM2抗体的优选的例子如上所述。另外，scFv所使用的VH区域和VL区域只要维持对GM2的结合能力，也可以改变一部分的序列。例如，作为scFv，可以优选使用以下所述的。
(1a)一种scFv，其包括包含由序列号2所记载的氨基酸序列构成的VH区域的CDR1～3的VH区域、和包含由序列号4所记载的氨基酸序列构成的VL区域的CDR1～3的VL区域，具有对GM2的结合能力。
(1b)一种scFv，其包括由序列号2所记载的氨基酸序列构成的VH区域、和由序列号4所记载的氨基酸序列构成的VL区域，具有对GM2的结合能力。
(1c)一种scFv，其包含由序列号2所记载的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸变异而成的氨基酸序列构成的VH区域、和由序列号4所记载的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸变异而成的氨基酸序列构成的VL区域，具有对GM2的结合能力。
(1d)一种scFv，其包含与序列号2所记载的氨基酸序列具有70％以上的序列同一性(相同性)的氨基酸序列构成的VH区域、与序列号4所记载的氨基酸序列具有70％以上的序列同一性(相同性)的氨基酸序列构成的VL区域，具有对GM2的结合能力。
在上述(1a)中，CDR以外的序列(框架序列)优选使用已知的人抗体的框架序列。例如，可以由从GenBank等公知的序列数据库中登录的人抗体的氨基酸序列的框架序列、来源于人抗体的各亚组的共同序列(Human Most Homologous Consensus Sequence；Kabat，E.A.等Sequences of Proteins of Immunological Interest，US Dept.Health andHuman Services,1991)中选择的氨基酸序列等进行选择。
在上述(1c)中，“多个”例如可以为2～30个，优选为2～20个，更优选为2～10个，进一步优选为2～5个。另外，“变异”可以是缺失、替换、附加以及插入中的任一种，也可以是它们的组合。另外，变异的位置优选为CDR1～3以外的区域(即，框架区域)。
在上述(1d)中，只要序列同一性为70％以上，就没有特别限定，优选为80％以上，更优选为85％以上，进一步优选为90％以上，进一步更优选为95％以上，特别优选为6％以上、97％以上、98％以上或99％以上。需要说明的是，氨基酸序列彼此的序列同一性(相同性)是将2个氨基酸序列以对应的氨基酸最多一致的方式，在与插入和缺失相当的部分加入间隙并排设置，相对于除去所得到的比对中的间隙以外的氨基酸序列整体一致的氨基酸的比例而求出。氨基酸序列之间的序列同一性可以使用该技术领域中公知的各种相同性检索软件求出。例如，氨基酸序列的序列同一性的值可以通过以公知的相同性检索软件BLASTP得到的比对为基础计算而得到。
作为scFv的具体例，例如可举出：包含从由序列号10、12、14及16组成的组选择的氨基酸序列的多肽；从由序列号10、12、14和16组成的组选择的氨基酸序列构成的多肽；从由序列号10、12、14及16组成的组选择的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸变异而成的氨基酸序列构成，且具有对GM2的结合能力的多肽；由与序列号10、12、14及16组成的组中选择的氨基酸序列具有70％以上的序列同一性(相同性)的氨基酸序列构成、且具有对GM2的结合能力的多肽等。另外，关于“多个”及“变异”，与上述相同。另外，关于“序列同一性”，也与上述相同。
<膜贯通区域>
“膜贯通区域”是指在以T细胞表达CAR时，贯通细胞膜而存在、将细胞外区域与细胞内区域连结的区域。膜贯通区域只要是具有贯通细胞膜的功能的多肽就没有特别限定。膜贯通区域可以来自天然蛋白质，也可以是人为设计的。来自天然蛋白质的膜贯通区域可以从任意的膜结合蛋白质或膜贯通蛋白质取得。在优选的方式中，膜贯通区域能够与目标抗原相对于目标抗原结合区域的结合相对应地向T细胞活化信号传递区域传递活化信号。
作为膜贯通区域，例如可举出T细胞受体的α链及β链、CD3ζ、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154、GITR等膜贯通区域。作为优选的例子，可以举出CD8的膜贯通区域。这些蛋白质来自的生物没有特别限定，优选为人。这些蛋白质的氨基酸序列可从GenBank等公知的序列数据库获得。例如，作为人CD8的氨基酸序列的例子，可举出作为GenBank号NM_001768.6登录者等，作为膜贯通区域的氨基酸序列，可举出序列号20中记载的氨基酸序列。
另外，膜贯通区域也可以是上述那样的源自天然蛋白质的膜贯通区域的变异体。作为来自天然蛋白质的膜贯通区域的变异体的例子，例如可举出以下的变异体。
(2a)由与来自天然蛋白质的膜贯通区域的氨基酸序列(例如序列号20)具有70％以上的序列同一性(相同性)的氨基酸序列构成，且具有膜贯通能力的多肽。
(2b)由源自天然蛋白质的膜贯通区域的氨基酸序列(例如序列号20)中一个或多个氨基酸变异而成的氨基酸序列构成，并且具有膜贯通能力的多肽。
在上述(2a)中，只要序列同一性为70％以上，就没有特别限定，优选为80％以上，更优选为85％以上，进一步优选为90％以上，特别优选为95％以上。
在上述(2b)中，“多个”例如可以为2～10个，优选为2～5个，更优选为2～4个，进一步优选为2或3个。另外，“变异”可以是缺失、替换、附加以及插入中的任一种，也可以是它们的组合。
<T细胞活化信号传递区域>
“T细胞活化信号传递区域”是指在以T细胞表达CAR时位于细胞内、向T细胞内传递T细胞活化信号的区域。T细胞中，当MHC-肽复合体与T细胞受体(T cell Receptor：TCR)结合时，T细胞活化信号通过TCR·CD3复合体传递到细胞中，并且引起各种磷酸化信号(一次信号传递)。另外，已知在T细胞的细胞表面上表达的共刺激分子通过与表达在抗原呈递细胞的细胞表面上的各共刺激分子特异性的配体结合而向细胞内传递共刺激信号，辅助T细胞的活化(二次信号传递)。
在本说明书中，“T细胞活化信号传递”包括前述一次信号传递和二次信号传递两者。另外，“T细胞活化信号传递区域”是指参与上述一次信号传递以及二次信号传递的蛋白质的、参与该信号传递的细胞内区域。
T细胞活化信号传递区域只要是参与T细胞活化信号传递的蛋白质的T细胞活化信号传递区域，就没有特别限定。例如，已知免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptortyrosine-based activation motif：ITAM)参与一次信号传递。因此，作为T细胞活化信号传递区域的例子，可以举出具有ITAM的蛋白质的T细胞活化信号传递区域。作为具有ITAM的蛋白质的例子，例如可列举出：CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ，CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d等。包含这些蛋白质的ITAM的T细胞活化信号传递区域是用于CAR的T细胞活化信号传递区域的优选例。作为更优选的例子，可列举出CD3ζ等T细胞活化信号传递区域。
此外，如上所述，共刺激分子参与二次信号传递。因此，作为T细胞活化信号传递区域的例子，也可以举出共刺激分子的信号传递区域。作为共刺激分子的例子，例如有CD2、CD4、CD5、CD8、CD27、CD28，OXO40(CD134)、4-1BB(CD137)、ICOS，CD154、HVEM、GITR、FcReceptor-associatedγchain等。这些蛋白质的T细胞活化信号传递区域也是用于CAR的T细胞活化信号传递区域的优选例。作为更优选的例子，可以举出CD28、4-1BB等T细胞活化信号传递区域。
上述蛋白质所来源的生物没有特别限定，优选为人。另外，这些蛋白质的氨基酸序列可从GenBank等公知的序列数据库获得。例如，作为人CD3ζ的氨基酸序列的例子，可举出作为GenBank号NM_000734.3登录者等，作为T细胞活化信号传递区域的氨基酸序列，可举出序列号28中记载的氨基酸序列。另外，作为人CD28的氨基酸序列的例子，可举出作为GenBank号NM_006139.2而登录者等，作为T细胞活化信号传递区域的氨基酸序列，可举出序列号24中记载的氨基酸序列。另外，作为人4-1BB的氨基酸序列的例子，可举出作为GenBank号NM_001561.5而登录者等，作为T细胞活化信号传递区域的氨基酸序列，可以举出序列号26中记载的氨基酸序列。
另外，T细胞活化信号传递区域也可以是上述那样的来自天然蛋白质的T细胞活化信号传递区域的变异体。作为来自天然蛋白质的活化信号传递区域的变异体的例子，例如可举出以下的变异体。
(3a)由与来自天然蛋白质的T细胞活化信号传递区域的氨基酸序列(例如序列号24、26、28)具有70％以上的序列同一性(相同性)的氨基酸序列构成、且具有T细胞活化信号传递能力的多肽。
(3b)来自天然蛋白质的T细胞活化信号传递区域的氨基酸序列(例如序列号24、26、28)中一个或多个氨基酸变异而成的氨基酸序列构成、并且具有T细胞活化信号传递能力的多肽。
在上述(3a)中，只要序列同一性为70％以上，就没有特别限定，优选为80％以上，更优选为85％以上，进一步优选为90％以上，特别优选为95％以上。
在上述(3b)中，“多个”例如在使用与一次信号传递有关的蛋白质的情况下，可以为2～30个，优选为2～20个，更优选为2～10个，进一步优选为2～5个。另外，例如，在使用共刺激分子的情况下，“多个”可以为2～15个，优选为2～10个，更优选为2～5个，进一步优选为2或3个。另外，“变异”可以是缺失、替换、附加以及插入中的任一种，也可以是它们的组合。
本实施方式的CAR所包含的T细胞活化信号传递区域的数量不限定于1个，也可以包含多个T细胞活化信号传递区域。在该情况下，多个T细胞活化信号传递区域既可以是相同的，也可以是不同的。在优选的方式中，CAR包含2个以上T细胞活化信号传递区域。在此情况下，CAR包含的T细胞活化信号传递区域优选为参与一次信号传递的T细胞活化信号传递区域与参与二次信号传递的T细胞活化信号传递区域的组合。作为具体例，可列举出CD3ζ与CD28的T细胞活化信号传递区域的组合、CD3ζ与4-1BB的T细胞活化信号传递区域的组合、CD3ζ与CD28与4-1BB的T细胞活化信号传递区域的组合等。
需要说明的是，在将参与一次信号传递的T细胞活化信号传递区域和参与二次信号传递的T细胞活化信号传递区域组合的情况下，优选将参与一次信号传递的T细胞活化信号传递区域配置在C末端侧。在上述的具体例中，优选将CD3ζ的T细胞活化信号传递区域配置在比CD28或4-1BB的T细胞活化信号传递区域更靠C末端侧。在同时使用CD28和4-1BB的情况下，可以是任意的配置顺序，但可以举出从N末端侧起按照CD28、4-1BB的顺序配置的例子。
在仅使用一个T细胞活化信号传递区域的情况下，优选使用参与一次信号传递的T细胞活化信号传递区域，更优选使用CD3ζ的T细胞活化信号传递区域。
<其它区域>
本实施方式的CAR除了上述的区域以外，还可以包含其他区域。作为其他区域的例子，可举出细胞外铰链区域、细胞质区域、间隔区域、信号肽等。
(细胞外铰链区域)
“细胞外铰链区域”是指将细胞外的目标抗原结合区域与膜贯通区域连结的区域。在优选的方式中，本实施方式的CAR包含细胞外铰链区域。
细胞外铰链区域只要是能够将目标抗原结合区域与膜贯通区域连结的区域就没有特别限定。可以来自天然蛋白质，也可以是人为设计的。细胞外铰链区域例如可以由1～100个左右的氨基酸、优选10～70个左右的氨基酸构成。优选细胞外铰链区域不妨碍目标抗原结合区域的GM2结合能力，且不妨碍T细胞活化信号传递区域的信号传递。
作为细胞外铰链区域，例如可举出CD8、CD28、CD4等细胞外铰链区域。另外，也可以使用免疫球蛋白(例如IgG4等)的铰链区域。作为优选的例子，可以举出CD8的细胞外铰链区域。
上述蛋白质所来源的生物没有特别限定，优选为人。另外，这些蛋白质的氨基酸序列可从GenBank等公知的序列数据库获得。作为人CD8的氨基酸序列的例子，可以举出上述的氨基酸序列，作为细胞外铰链区域的氨基酸序列，可以举出序列号18中记载的氨基酸序列。
另外，细胞外铰链区域也可以是来自上述天然蛋白质的细胞外铰链区域的变异体。作为来自天然蛋白质的细胞外铰链区域的变异体的例子，例如可以举出以下的例子。
(4a)由与来自天然蛋白质的细胞外铰链区域的氨基酸序列(例如序列号18)具有70％以上的序列同一性(相同性)的氨基酸序列构成的多肽。
(4b)由来自天然蛋白质的细胞外铰链区域的氨基酸序列(例如序列号18)中一个或多个氨基酸变异而成的氨基酸序列构成的多肽。
在上述(4a)中，只要序列同一性为70％以上，就没有特别限定，优选为80％以上，更优选为85％以上，进一步优选为90％以上，特别优选为95％以上。
在上述(4b)中，“多个”例如可以为2～20个，优选为2～15个，更优选为2～10个，进一步优选为2～5个。另外，“变异”可以是缺失、替换、附加以及插入中的任一种，也可以是它们的组合。
(细胞质区域)
“细胞质区域”是指在膜贯通蛋白质中与膜贯通区域的细胞质侧末端邻接的区域，是由3～50个左右的氨基酸构成的区域。在优选的方式中，本实施方式的CAR包含细胞质区域。细胞质区域只要是膜贯通蛋白质的与膜贯通区域的细胞质侧邻接的区域即可，没有特别限定。通过经由细胞质区域将膜贯通区域与T细胞活化信号传递区域连结，能够使膜贯通区域的构造稳定。细胞质区域可以来自天然蛋白质，也可以是人为设计的。细胞质区域例如可以由3～50个左右的氨基酸、优选4～20个左右的氨基酸、更优选5～10个左右的氨基酸构成。细胞质区域优选与膜贯通区域来自相同的蛋白质。通过使用与膜贯通区域来自相同蛋白质的细胞质区域，能够更稳定地保持膜贯通区域的构造。
作为细胞质区域，例如可举出上述膜贯通区域中举出的蛋白质的细胞质区域。作为优选的例子，可以举出CD8的细胞质区域。这些蛋白质所来源的生物没有特别限定，优选为人。细胞质区域的氨基酸序列可举出序列号22中记载的氨基酸序列。
另外，细胞质区域也可以是来自上述天然蛋白质的细胞质区域的变异体。作为来自天然蛋白质的细胞质区域的变异体的例子，例如可以举出以下的例子。
(5a)由与来自天然蛋白质的细胞质区域的氨基酸序列(例如序列号22)具有70％以上的序列同一性(相同性)的氨基酸序列构成，且具有膜贯通区域稳定能力的多肽。
(5b)由来自天然蛋白质的细胞质区域的氨基酸序列(例如序列号22)中一个或多个氨基酸变异而成的氨基酸序列构成，并且具有膜贯通区域稳定能力的多肽。
在上述(5a)中，只要序列同一性为70％以上，就没有特别限定，优选为80％以上，更优选为85％以上，进一步优选为90％以上，特别优选为95％以上。
在上述(5b)中，“多个”例如可以为2～5个，优选为2～4个，更优选为2或3个。另外，“变异”可以是缺失、替换、附加以及插入中的任一种，也可以是它们的组合。
(间隔区域)
“间隔区域”是指连结蛋白质的2个功能区域(域)的短肽。在一个方式中，本实施方式的CAR中，也可以经由间隔区域连结上述的目标抗原结合区域、膜贯通区域、T细胞活化信号传递区域等各区域。间隔区域没有特别限定，只要使用嵌合蛋白质的制作中通常使用的间隔区域即可。作为间隔区域的长度，可以举出1～100氨基酸、优选10～50氨基酸。作为间隔区域的例子，可以举出甘氨酸-丝氨酸连续序列等。
(信号肽)
“信号肽”是指示膜蛋白质或分泌蛋白质的局部化的肽。在一个方式中，本实施方式的CAR可包含信号肽。信号肽通常是由存在于膜蛋白质的N末端的5～60个左右的氨基酸构成的肽，在局部化完成的成熟蛋白质中被除去。
本实施方式的CAR中使用的信号肽优选为指示向细胞膜局部化的信号肽，优选为膜蛋白质的信号肽。信号肽的例子可列举T细胞受体的α链及β链、CD3ζ、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154、GITR、免疫球蛋白重链、免疫球蛋白轻链等信号肽。作为信号肽的氨基酸序列的具体例，可以举出序列号57记载的氨基酸序列。
在本实施方式的CAR中，上述各区域可以从N末端开始按照目标抗原结合区域、膜贯通区域、T细胞活化信号传递区域的顺序配置。这些各区域既可以相互直接连结，也可以经由其他区域或间隔序列等连结。
在本实施方式的CAR包含细胞外铰链区域的情况下，细胞外铰链区域配置在目标抗原结合区域与膜贯通区域之间。另外，在本实施方式的CAR包含细胞质区域的情况下，细胞质区域配置在膜贯通区域与T细胞活化信号传递区域之间。
另外，在本实施方式的CAR包含信号肽的情况下，信号肽配置于CAR的N末端。
作为本实施方式的CAR的具体例，可列举包含抗GM2抗体的scFv的目标抗原结合区域、CD8的膜贯通区域(或其变异体)、CD28的T细胞活化信号传递区域(或其变异体)、4-1BB的T细胞活化信号传递区域(或其变异体)、以及CD3ζ的T细胞活化信号传递区域(或其变异体)的CAR。作为更优选的例子，可列举包含抗GM2抗体的scFv的目标抗原结合区域、CD8的细胞外铰链区域(或其变异体)、CD8的细胞质区域(或其变异体)、CD28的T细胞活化信号传递区域(或其变异体)、4-1BB的T细胞活化信号传递区域(或其变异体)、以及CD3ζ的T细胞活化信号传递区域(或其变异体)的CAR。
作为这样的CAR，例如可列举包含从由序列号40、42、44和46组成的组选择的氨基酸序列的CAR。需要说明的是，序列号40、42、44、及46中记载的氨基酸序列中，1～19位的序列相当于信号肽。因此，上述例子中成熟的CAR分别包括序列号40所记载的氨基酸序列的20～874位的氨基酸序列、序列号42所记载的氨基酸序列的20～884位的氨基酸序列、序列号44所记载的氨基酸序列的20～874位的氨基酸序列、序列号46所记载的氨基酸序列的20～884位的氨基酸序列。
在优选的方式中，本实施方式的CAR由从序列号40、42、44和46组成的组选择的氨基酸序列构成。另外，成熟的CAR由序列号40所记载的氨基酸序列的20～874位的氨基酸序列、序列号42所记载的氨基酸序列的20～874位的氨基酸序列、序列号44所记载的氨基酸序列的20～874位的氨基酸序列、序列号46所记载的氨基酸序列的20～884位的氨基酸序列组成的组中选择的氨基酸序列构成。
[表达抗GM2 CAR的细胞(抗GM2 CAR表达细胞)]
在一个实施方式中，本发明提供表达上述实施方式的CAR的细胞。
本实施方式的细胞表达上述实施方式的CAR(以下也称为“抗GM2 CAR”)，在细胞表面上具有该CAR。在GM2表达细胞中，GM2大量存在于细胞表层。如果本实施方式的细胞与GM2表达细胞接触，则通过抗GM2 CAR的目标抗原结合区域，与GM2表达细胞表层的GM2结合。由此，本实施方式的细胞被活化，引起细胞伤害性颗粒的释放或细胞因子产生。通过这些细胞伤害性颗粒或细胞因子，GM2表达细胞被破坏。
本实施方式的细胞优选为哺乳动物细胞，例如，人细胞，或小鼠、大鼠、牛、羊、马、狗、猪、猴等非人哺乳动物细胞，更优选为人细胞。细胞的种类没有特别限定，可以举出从血液、骨髓液、脾脏、胸腺、淋巴结等采集的细胞；原发性肿瘤、转移性肿瘤、癌性腹水等癌组织中浸润的免疫细胞等。作为优选的例子，可以举出免疫细胞，可以优选使用从末梢血分离的末梢血单核细胞等。在末梢血单核细胞包含的细胞中，优选效应细胞，作为特别优选的细胞，可以举出T细胞及其前体细胞。T细胞的种类没有特别限定，可举出αβT细胞、γδT细胞、CD8阳性T细胞、细胞伤害性T细胞，CD4阳性T细胞、辅助性T细胞、记忆T细胞、初始T细胞、肿瘤浸润T细胞、自然杀伤T细胞等的任意T细胞。其中，更优选为CD8阳性T细胞或细胞伤害性T细胞。
本实施方式的细胞优选除了抗GM2 CAR以外，还表达白细胞介素(Interleukin：IL)-7和趋化因子(C-C基序)配体19(Chemokine(C–C motif)Ligand 19：CCL19)中的至少一者。在优选的方式中，本实施方式的细胞是表达(i)抗GM2 CAR与(ii)IL–7及CCL19中的至少一者的细胞。更优选本实施方式的细胞是表达抗GM2 CAR、IL-7和CCL19的细胞。
IL-7是T细胞的生存所必须的细胞因子，由骨髓、胸腺、淋巴器官·组织的基质细胞等非造血细胞产生，但几乎未确认到在T细胞中的产生。
另一方面，CCL19主要由淋巴结的树状细胞或巨噬细胞产生，具有通过其受体即CC趋化因子受体7(Chemokine(C–C motif)Receptor 7：CCR7)引起T细胞、B细胞或成熟的树状细胞的迁移的功能。
IL-7和CCL19的来源生物没有特别限定，优选为人。另外，这些蛋白质的氨基酸序列可从GenBank等公知的序列数据库获得。例如，作为人IL-7的氨基酸序列的例子，可举出作为GenBank号NM_000880.3(序列号59)而登录者等。另外，作为人CCL19的氨基酸序列的例子，可举出作为GenBank号NM_006274.2(序列号61)而登录者等。另外，IL-7和CCL19具有信号肽，在成熟蛋白质中，信号肽被除去。例如，在序列号59记载的人IL-7的氨基酸序列中，1～25位的序列相当于信号肽。另外，例如在序列号61记载的人CCL19的氨基酸序列中，1～21位的序列相当于信号肽。
另外，IL-7和CCL19也可以是如上所述的天然蛋白质的变异体。作为IL-7的变异体的例子，例如可以举出以下的例子。
(6a)由与天然IL-7的氨基酸序列(例如序列号59)具有70％以上的序列同一性(相同性)的氨基酸序列构成、具有T细胞的免疫功能促进功能的多肽。
(6b)由天然IL-7的氨基酸序列(例如序列号59)中的一个或多个氨基酸变异而成的氨基酸序列构成、具有T细胞的免疫功能促进功能的多肽。
另外，作为CCL19的变异体的例子，例如可以举出以下的例子。
(7a)由与天然CCL19的氨基酸序列(例如序列号61)具有70％以上的序列同一性(相同性)的氨基酸序列构成、具有T细胞的免疫功能促进功能的多肽。
(7b)由天然CCL19的氨基酸序列(例如序列号61)中的一个或多个氨基酸变异而成的氨基酸序列构成、具有T细胞的免疫功能促进功能的多肽。
需要说明的是，“T细胞的免疫功能促进功能”是指维持、促进T细胞的生存、增殖、细胞伤害活性、迁移活性、对肿瘤组织的浸润活性等的功能。
在上述(6a)和(7a)中，只要序列同一性为70％以上，就没有特别限定，优选为80％以上，更优选为85％以上，进一步优选为90％以上，特别优选为95％以上。
另外，在上述(6b)和(7b)中，“多个”例如可以为2～30个，优选为2～20个，更优选为2～10个，进一步优选为2～5个。另外，“变异”可以是缺失、替换、附加以及插入中的任一种，也可以是它们的组合。
另外，IL-7和CCL19的变异体中，可以将这些蛋白质的信号肽变更为其他信号肽，也可以除去信号肽。优选IL-7和CCL19的变异体具有分泌蛋白质的信号肽，分泌到细胞外。
在本实施方式的细胞为分离的T细胞的情况下，通过与抗GM2 CAR一起表达IL-7和CCL19中的至少一者，T细胞的免疫功能被促进，能够成为对GM2表达细胞的细胞伤害活性、向肿瘤组织的浸润、在肿瘤微细环境下的生存能力优异的T细胞。
另外，本实施方式的细胞除了抗GM2 CAR以外，也可以表达自杀基因。本实施方式的细胞通过表达自杀基因，可根据需要在本实施方式的细胞中诱导凋亡。自杀基因没有特别限定，可以使用公知的。例如，作为自杀基因，可举出单纯疱疹病毒的胸苷激酶(HSV-TK)基因、诱导性caspase9(inducible caspase 9)基因等。表达HSV-TK的细胞通过使丙氧鸟苷共存而能够诱导细胞死亡。另外，表达诱导性caspase9的细胞能够通过使AP1903等的二聚体诱导化合物(chemical induction of dimerization：CID)共存而诱导细胞死亡。自杀基因的氨基酸序列可从GenBank等公知的序列数据库获得。另外，也可以利用市售的包含自杀基因的载体等的序列。
也可以说本实施方式的细胞是包含抗GM2 CAR的细胞(优选为T细胞)。也可以说本实施方式的细胞的优选的例子是包含抗GM2 CAR以及IL–7和CCL19中的至少一种的细胞(优选为T细胞)。也可以说本实施方式的细胞的更优选的例子是包含抗GM2 CAR、IL-7和CCL19的细胞(优选为T细胞)。也可以说本实施方式的细胞的更优选的例子是含有抗GM2 CAR、IL-7、CCL19和自杀基因的细胞(优选为T细胞)。
本实施方式的细胞可以通过将包含后述的编码抗GM2 CAR的碱基序列的多核苷酸或载体导入细胞而得到。
[包含编码抗GM2 CAR的碱基序列的多核苷酸]
在一个实施方式中，本发明提供包含编码抗GM2 CAR的碱基序列的多核苷酸。
本实施方式的多核苷酸只要包含编码抗GM2 CAR的碱基序列，就没有特别限定。抗GM2 CAR如上述[嵌合抗原受体(抗GM2 CAR)]一项中所记载。本实施方式的多核苷酸优选包含编码上述[嵌合抗原受体(抗GM2 CAR)]一项中例示的抗GM2 CAR的氨基酸序列的碱基序列。
例如，作为编码目标抗原结合区域的碱基序列，可以举出编码抗GM2抗体的scFv的碱基序列。更具体而言，可例示包含编码序列号2记载的氨基酸序列的碱基序列和编码序列号4记载的氨基酸序列的碱基序列者。作为编码序列号2记载的氨基酸序列的碱基序列，可以例示序列号1、49、51或53中记载的碱基序列。另外，作为编码序列号4记载的氨基酸序列的碱基序列，可以例示序列号3、50、52或54中记载的碱基序列。
这些碱基序列优选通过编码连接子的碱基序列连结。关于连接子，如上述“嵌合抗原受体”一项中所记载的那样。例如，作为编码上述例示的连接子15的碱基序列，可以例示序列号5或55中记载的碱基序列。另外，作为对连接子25进行编码的碱基序列，可以例示序列号7或56中记载的碱基序列。
作为编码抗GM2抗体的scFv的碱基序列的具体例，可以举出序列号9、11、13或15中记载的碱基序列等。
作为编码目标抗原结合区域的碱基序列，优选根据导入的细胞的生物种，进行密码子优化，在导入人细胞的情况下，优选进行人密码子优化。
另外，编码膜贯通区域及T细胞活化信号传递区域的碱基序列可从GenBank等公知的序列数据库获得。另外，在GM2 CAR包含细胞外铰链区域等其他区域的情况下，编码该其他区域的碱基序列也可以从GenBank等公知的序列数据库获得。
例如，在使用人CD8的膜贯通区域作为膜贯通区域的情况下，作为编码人CD8的碱基序列，可以举出作为GenBank号NM_001768.6而登录者等，作为编码膜贯穿区域的碱基序列，可以例示序列号19中记载的碱基序列。
另外，例如，在使用人CD3ζ、人CD28、人4-1BB的T细胞活化信号传递区域作为T细胞活化信号传递区域的情况下，作为编码人CD3ζ、人CD28和人4-1BB的碱基序列，可以分别举出作为GenBank号NM_000734.3、NM_006139.2、及NM_001561.5而登录者等，作为编码人CD3ζ、人CD28和人4-1BB的T细胞活化信号传递区域的碱基序列，可以分别例示序列号27、23和25中记载的碱基序列。
另外，例如，在使用人CD8的细胞外铰链区域作为细胞外铰链区域的情况下，作为编码细胞外铰链区域的碱基序列，可以例示序列号17中记载的碱基序列。
另外，例如，在使用人CD8的细胞质区域作为细胞质区域的情况下，作为编码细胞质区域的碱基序列，能够例示序列号21中记载的碱基序列。
编码上述各区域的碱基序列不限于公知的，只要是编码上述各区域的碱基序列，则可以是任意的序列。由于基因编码的缩聚，与1个氨基酸对应的密码子存在多个。因此，编码同一氨基酸序列的碱基序列存在多个。编码上述各区域的碱基序列只要编码这些区域，则可以是因基因编码的缩聚而产生的多个碱基序列中的任一种。
作为编码上述各区域的碱基序列，优选根据导入的细胞的生物种，进行密码子优化，在导入人细胞的情况下，优选进行人密码子优化。
另外，编码上述各区域的碱基序列也可以是编码来自天然蛋白质的各区域的变异体的碱基序列。关于各区域的变异体，如上述[嵌合抗原受体(抗GM2 CAR)]一项中所记载。
编码抗GM2 CAR的各区域的碱基序列优选从5’侧起依次按照目标抗原结合区域、膜贯通区域、T细胞活化信号传递区域的顺序配置。在使用信号肽、细胞外铰链区域等的情况下，优选将信号肽配置在目标抗原结合区域的5’侧，将细胞外铰链区域配置在目标抗原结合区域与膜贯通区域之间。编码这些区域的碱基序列可以直接连结，也可以经由编码间隔区域的碱基序列而连结。间隔区域如上述[嵌合抗原受体(抗GM2 CAR)]一项中所记载。
作为编码抗GM2 CAR的碱基序列的具体例，可以举出从由序列号39、41、43和45组成的组选择的碱基序列等。
本实施方式的多核苷酸可通过直接或经由间隔序列连结由编码抗GM2 CAR的各区域的碱基序列构成的多核苷酸而得到。编码抗GM2 CAR的各区域的多核苷酸也可以通过基于各区域的碱基序列，利用公知的方法化学合成来取得。另外，也可以将对从T细胞等提取的DNA、从T细胞等提取的RNA进行逆转录而得到的cDNA作为模板，通过PCR法、等温扩增法等对编码各区域的多核苷酸进行扩增来取得。对这样得到的各区域进行编码的多核苷酸也可以在不丧失翻译后的各区域的功能的范围内进行替换、缺失、附加、插入等的改变。
本实施方式的多核苷酸除了编码抗GM2 CAR的碱基序列之外，还可以包含启动子、增强子、多聚A附加信号、终止子等控制序列、编码其他蛋白质的碱基序列等。
作为其他蛋白质，例如可列举出IL-7和CCL19。编码这些蛋白质的碱基序列可从GenBank等公知的序列数据库获得。例如，在使用人IL-7的情况下，作为编码人IL-7的碱基序列，可以举出作为GenBank号NM_002190.2(序列号58)而登录者等。另外，在使用人CCL19的情况下，作为编码人CCL19的碱基序列的例子，可列举作为GenBank号NM_006274.2(序列号60)而登录者等。
另外，编码这些蛋白质的碱基序列不限于公知的，只要是编码这些蛋白质的碱基序列，则可以是任何序列，也可以是因基因编码的缩聚而产生的多个碱基序列中的任一种。作为编码这些蛋白质的碱基序列，优选根据导入的细胞的生物种，进行密码子优化，在导入人细胞的情况下，优选进行人密码子优化。
另外，编码这些蛋白质的碱基序列也可以是编码天然IL-7和天然CCL19的变异体的碱基序列。关于这些变异体，如上述[表达抗GM2 CAR的细胞(抗GM2 CAR表达细胞)]的项中所记载的那样。
另外，作为其他蛋白质，也可举出自杀基因。关于自杀基因，如上述[表达抗GM2CAR的细胞(抗GM2 CAR表达细胞)]的项中所记载的那样。编码自杀基因的碱基序列可从GenBank等公知的序列数据库获得。另外，也可以利用市售的包含自杀基因的载体等的序列。
本实施方式的多核苷酸包含编码其他蛋白质的碱基序列的情况下，在编码抗GM2CAR的碱基序列与编码该其他蛋白质的碱基序列之间也可以存在编码2A肽等自切断型肽的碱基序列或IRES(internal ribozyme entry site)序列等。另外，在其他蛋白质为2个以上的情况下，也可以在该其他蛋白质之间存在自切断型肽或IRES等。通过存在这些序列，能够由一个启动子独立地表达多个蛋白质。
作为2A肽，例如可例示小核糖核酸病毒、轮状病毒、昆虫病毒、口疮病毒、锥虫病毒等2A肽。作为具体例，小核糖核酸病毒的2A肽(F2A)的氨基酸序列示于序列号62。编码2A肽的碱基序列优选根据导入的细胞的生物种而进行密码子优化，在导入人细胞的情况下，优选进行人密码子优化。
另外，本实施方式的多核苷酸也可以在编码抗GM2 CAR的碱基序列和编码其他蛋白质的碱基序列的蛋白质编码序列的每个上具有启动子、增强子、多聚A附加信号、终止子等控制序列。另外，也可以一部分的蛋白质序列独立地具有控制序列，其他的蛋白质编码序列经由2A肽或IRES等连结而具有共同的控制序列。
[包含编码抗GM2 CAR的碱基序列的载体]
在一个实施方式中，本发明提供包含编码抗GM2 CAR的碱基序列的载体。
上述实施方式的多核苷酸也可以是载体的形态。载体的种类没有特别限定，可以使用通常使用的表达载体等。载体可以是直链状也可以是环状，可以是质粒等非病毒载体，也可以是病毒载体，还可以是基于转座子的载体。作为载体，例如可以举出病毒载体、质粒载体、附加型载体和人工染色体载体等。
作为病毒载体，例如可以举出仙台病毒载体、逆转录病毒(包括慢病毒)载体，腺病毒载体、腺伴随病毒载体、疱疹病毒载体、痘苗病毒载体、痘病毒载体，脊髓灰质炎病毒载体、希尔比斯病毒载体、弹状病毒载体，副粘液病毒载体、正粘液病毒载体等。
作为质粒载体，例如可举出pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo等动物细胞表达用质粒载体。
附加型载体是能够在染色体外进行自主复制的载体。作为附加型载体，例如可以举出包含来自EBV、SV40等的自主复制所需的序列作为载体要素的载体。作为自主复制所需的载体要素，具体而言，可以举出编码复制起始点和与复制起始点结合来控制复制的蛋白质的基因。例如，EBV可以举出复制起始点oriP与EBNA-1基因，SV40可以举出复制起始点ori和SV40LT基因。
作为人工染色体载体，例如可举出YAC(Yeast artificial chromosome)载体、BAC(Bacterial artificial chromosome)载体、PAC(P1–derived artificial chromosome)载体等。
作为本实施方式的载体的优选例，可以举出病毒载体，作为更优选的例子，可以举出逆转录病毒载体。作为逆转录病毒载体，可以例示pMSGV1载体(Tamada k et al.，ClinCancer Res18：6436-6445(2012))或pMSCV载体(Takara Bio公司制)。通过使用逆转录病毒载体，载体中的基因被组合到宿主细胞的基因组中，能够在宿主细胞中长时间稳定地表达。
本实施方式的载体除了上述[含有编码抗GM2 CAR的碱基序列的多核苷酸]的项中记载的碱基序列之外，还可以包含编码复制起始点、与复制起始点结合并控制复制的蛋白质的碱基序列、编码抗药性基因、报告基因等标记基因的碱基序列等。
编码抗GM2 CAR的碱基序列优选以在适当启动子的控制下表达的方式配置在载体内。另外，在含有编码其他蛋白质的碱基序列的情况下，这些碱基序列也优选以在适当的启动子的控制下表达的方式配置在载体内。作为启动子，例如可以举出SRα启动子、SV40初始启动子、逆转录病毒的LTR、CMV(巨细胞病毒)启动子、RSV(劳斯肉瘤病毒)启动子、HSV-TK(单纯疱疹病毒胸苷激酶)启动子、EF1α启动子、金属硫蛋白启动子、热休克启动子等。另外，也可以将人CMV的IE基因的增强子与启动子一起使用。作为一个例子，可以举出CAG启动子(包括巨细胞病毒增强子、鸡β–肌动蛋白启动子、β–球蛋白基因的多聚A信号部位)等。另外，也可以如上述[包含编码抗GM2 CAR的碱基序列的多核苷酸]中记载的那样，在各蛋白质编码序列间配置编码自切断型肽的碱基序列或IRES，在共同的启动子的控制下进行转录。
在优选的方式中，本实施方式的载体除了编码抗GM2 CAR的碱基序列之外，还包含编码IL-7的碱基序列和编码CCL19的碱基序列中的至少一者。在更优选的方式中，本实施方式的载体除了编码抗GM2 CAR的碱基序列以外，还包含编码IL-7的碱基序列和编码CCL19的碱基序列。
优选本实施方式的载体包含编码与适当的启动子功能性连结的抗GM2 CAR的碱基序列。更优选本实施方式的载体中包括碱基序列，该碱基序列是编码抗GM2 CAR的碱基序列、编码IL-7的碱基序列、以及编码CCL19的碱基序列经由编码自切断型肽的碱基序列或IRES连结而成，并且该碱基序列与适当的启动子功能性连结。需要说明的是，“与启动子功能性连结”是指，以在启动子的控制下表达的方式连结于启动子的下游。在上述的例子中，编码抗GM2 CAR的碱基序列、编码IL-7的碱基序列、以及编码CCL19的碱基序列的配置顺序没有特别限定，可以为任意的配置顺序。
[表达抗GM2 CAR的细胞的制作方法]
在一个实施方式中，本发明提供一种表达抗GM2 CAR的细胞的制作方法，其包括将包含编码抗GM2 CAR的碱基序列的多核苷酸或载体导入细胞中。
表达上述实施方式的抗GM2 CAR的细胞(以下，也称为“抗GM2 CAR表达细胞”)可通过将包含编码上述实施方式的抗GM2 CAR的碱基序列的多核苷酸或载体导入细胞而得到。导入至细胞内的多核苷酸或载体以能够表达抗GM2 CAR的状态维持在细胞内。“能够表达的状态”是指编码抗GM2 CAR的碱基序列处于能够转录、翻译的状态。
将多核苷酸或载体导入细胞的方法没有特别限定，可以使用公知的方法。例如，可以举出病毒感染法、脂质体转染法、微注入法、磷酸钙法、DEAE-葡聚糖法、电穿孔法、使用转座子的方法、粒子枪法等。
另外，载体为逆转录病毒载体时，也可以基于载体所具有的LTR序列和包装信号序列选择适当的包装细胞，使用其制备逆转录病毒粒子。包装细胞的实例例如可以例示PG13、PA317、GP+E-86、GP+envAm–12、Psi–Crip等。另外，也可以将转染效率高的293细胞或293T细胞用作包装细胞。各种逆转录病毒载体以及可用于该载体的包装的包装细胞广泛市售，因此也可以使用它们的市售品。例如，可以使用GP2-293细胞(Takara Bio公司制)、Plat-GP细胞(Cosmo bio公司制)、PG13细胞(ATCC CRL-10686)、PA317细胞(ATCC CRL-9078)等，也可以使用Retrovirus packagin Kit Eco(Takara Bio公司制)等市售的试剂盒。
在抗GM2 CAR表达细胞中表达IL-7、CCL19、自杀基因等其他外来蛋白质的情况下，可以使编码这些其他蛋白质的碱基序列包含在包含编码抗GM2 CAR的碱基序列的载体中，也可以包含在其他载体中。使编码其他蛋白质的碱基序列包含在其他载体中的情况下，可以与将包含编码抗GM2 CAR的碱基序列的载体同时或分别地将该载体导入细胞中。
另外，抗GM2 CAR表达细胞也可以通过使用公知的基因编辑技术等，将包含编码抗GM2 CAR的碱基序列的多核苷酸以能够在适当的启动子的控制下表达的方式组装到细胞的基因组中而制造。作为基因编辑技术，例如，可举出使用锌指核酸酶、TALEN(转录活化因子样效应核酸酶)、CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short PalindromicRepeat)-Cas系统、PPR(pentatricopeptide repeat)等内切核酸酶的技术。在抗GM2 CAR表达细胞中表达其他外来蛋白质的情况下，也同样地，可以使用基因编辑技术等，将包含编码其他外来蛋白质的碱基序列的多核苷酸以能够在适当的启动子的控制下表达的方式组装到细胞的基因组中。例如，可以举出将包含编码与适当启动子功能性地连结的抗GM2 CAR(或其他蛋白质)的碱基序列的多核苷酸组装到细胞基因组的非编码区域等的方法；将包含编码抗GM2 CAR(或其他蛋白质)的碱基序列的多核苷酸组装到细胞基因组的内在性启动子的下游的方法等。作为内在性启动子，例如可列举出TCRα、TCRβ的启动子等。
将包含编码抗GM2 CAR的碱基序列的多核苷酸或载体导入细胞后，该细胞中的抗GM2 CAR的表达可通过流式细胞仪、RT-PCR、RNA印迹、蛋白质印迹、ELISA、荧光免疫染色等公知的方法来确认。另外，IL-7和CCL19等其他外来蛋白质的表达也同样可以通过公知的方法来确认。
[包含抗GM2 CAR表达细胞的药物组合物]
在一个实施方式中，本发明提供包含抗GM2 CAR表达细胞的药物组合物。
抗GM2 CAR表达细胞对GM2表达细胞显示出特异的细胞伤害活性。因此，抗GM2CAR表达细胞可以用于治疗或预防与GM2表达细胞有关的疾病。由于GM2表达在包括肺癌、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、黑素瘤、恶性间皮瘤、骨髓瘤等的广泛的肿瘤细胞中，所以含有抗GM2 CAR表达细胞的药物组合物可以作为用于治疗或预防肿瘤的药物组合物来利用。肿瘤可以是骨组织、软骨组织、脂肪组织、肌肉组织、血管组织及造血组织的任一种中所产生的。作为肿瘤，例如可以举出神经胶质瘤、黑素瘤、恶性间皮瘤、肺癌、胰癌、头颈部癌、肝癌、子宫癌、膀胱癌、胆道癌、食道癌、精巢肿瘤、甲状腺癌、脑肿瘤、前列腺癌，大肠癌、肾癌、卵巢癌、乳癌、腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、未分化癌、大细胞癌、小细胞癌、皮肤癌、阴道癌、颈部癌、脾脏癌、气管癌、支气管癌、小肠癌、胃癌、胆囊癌、精巢癌等癌症；骨肉瘤、软骨肉瘤、尤因氏肉瘤、恶性血管内皮瘤、恶性神经鞘瘤、软组织肉瘤等肉瘤；神经母细胞瘤、肝母细胞瘤、髓母细胞瘤、肾母细胞瘤、胰母细胞瘤、胸膜肺母细胞瘤、视网膜母细胞瘤等母细胞瘤；胚细胞肿瘤；淋巴瘤、白血病、骨髓瘤等血液癌等，但并不限于这些。特别是，本实施方式的药物组合物适合作为用于治疗或预防表达GM2的肿瘤的药物组合物。作为表达GM2的肿瘤，例如可以举出肺癌、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、黑素瘤、恶性间皮瘤、骨髓瘤等，但并不限于这些。肿瘤是否表达GM2例如可以通过使用抗GM2抗体等的公知的方法来确认。作为公知的方法，可以例示流式细胞仪、ELISA、免疫染色、荧光免疫染色等。除了抗GM2 CAR以外，表达IL-7和CCL19中的任一者或两者的细胞(优选T细胞)只要是表达GM2的肿瘤，则对于实体肿瘤也能够发挥强的细胞伤害活性。因此，含有表达抗GM2 CAR、以及IL-7和CCL19中的任一者或两者的细胞(优选T细胞)的本实施方式的药物组合物特别适用于表达GM2的实体肿瘤。因此，用于治疗或预防含有表达抗GM2 CAR、以及IL-7和CCL19中的任一者或两者的细胞(优选T细胞)的实体肿瘤的药物组合物是本实施方式的药物组合物的适合的例子。“实体肿瘤”是指从造血系组织产生的血液癌以外的肿瘤，包含上皮细胞癌和非上皮细胞癌。
本实施方式的药物组合物除了抗GM2 CAR表达细胞以外，还可以含有药学上允许的担体等其他成分。作为其他成分，例如，除了药学上允许的担体以外，还可以举出细胞因子等T细胞活化因子、免疫活化剂、免疫检验点抑制剂、其他表达CAR的细胞、抗炎症剂等，但并不限定于这些。作为药学上允许的担体，可以举出细胞培养培养基、生理盐水、磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液等。
本实施方式的药物组合物可以通过公知的方法投与，优选可以通过注射或输液投与给患者。作为投与途径，优选静脉内投与，但并不限定于此，也可以通过向肿瘤内注入等投与。
本实施方式的药物组合物能够包含治疗有效量的抗GM2 CAR表达细胞。“治疗有效量”是指对于疾病的治疗或预防有效的药剂量。治疗有效量可根据投与对象的疾病的状态、年龄、性别及体重等而变动。在本实施方式的药物组合物中，上述抗GM2 CAR表达细胞的治疗有效量例如可以是抗GM2 CAR表达细胞能够抑制肿瘤的增殖的量。
本实施方式的药物组合物的投与量及投与间隔可以根据投与对象的年龄、性别及体重等、疾病的种类、发展度及症状等、以及投与方法等适当选择。作为投与量，可以投与治疗有效量，例如，在1次投与中，作为投与细胞的个数，可以举出1X104～1X1010个、优选1X105～1X109个、更优选5X106～5X108个。
作为本实施方式的药物组合物的投与间隔，例如可以设为每1周、每10～30天、每1个月、每3～6月、每1年等。另外，抗GM2 CAR表达细胞能够在投与对象的体内自主地增殖，因此也可以一次性投与。另外，也可以在投与后监测体内的抗GM2 CAR表达细胞的数量，根据其结果决定投与时期。
另外，本实施方式的药物组合物可以与其他抗癌剂并用。作为其他抗癌剂，可列举环磷酰胺等烷基化剂、喷司他丁等代谢拮抗剂、利妥昔单抗等分子靶向药、伊马替尼等的激酶抑制剂、硼替佐米等蛋白酶体抑制剂、环孢霉素等钙调磷酸化酶抑制剂、伊达比星等抗癌性抗生物质、伊立替康等植物生物碱，顺铂等铂制剂、他莫昔芬等激素疗法药、欧狄沃、派姆单抗等免疫控制药等，但并不限定于这些。
另外，在其他方式中，本发明提供1)在用于治疗或预防肿瘤的药物组合物的制造中的抗GM2 CAR表达细胞的用途，2)治疗或预防表达GM2的肿瘤的方法，其包括将抗GM2 CAR表达细胞向对象(例如罹患表达GM2的肿瘤的患者、进行了肿瘤外科切除的患者等)投与，3)用于肿瘤的治疗或预防的抗GM2 CAR表达细胞，4)用于治疗或预防肿瘤的抗GM2 CAR表达细胞的用途。
另外，在另一方式中，本发明提供一种用于制造抗GM2 CAR表达细胞的试剂盒，其包括上述实施方式的载体。该试剂盒只要包含上述实施方式的载体就没有特别限制，可以含有用于制造抗GM2 CAR表达细胞的说明书、用于将载体导入细胞的试剂等。
实施例
以下，通过实施例来说明本发明，但本发明不限定于以下的实施例。
[实施例1]表达IL-7和CCL19的抗GM2 CAR表达T细胞的制作(T细胞的免疫功能促进因子的选择)
能够控制T细胞的功能的分子在生物体内至少存在数百种。本发明人等从庞大的组合中选择了IL-7和CCL19作为用于提高CAR-T细胞中的抗肿瘤效果的免疫功能促进因子。
需要说明的是，上述IL-7是T细胞的生存所必须的细胞因子，由存在于骨髓、胸腺和淋巴器官组织等的基质细胞等非造血细胞产生。另一方面，在T细胞中几乎没有发现IL-7产生能力。
另外，上述CCL19主要由淋巴结中的树状细胞或巨噬细胞产生，具有经由作为其受体的CCR7引起T细胞、B细胞、成熟的树状细胞的迁移的功能。
(抗GM2 CAR的scFv序列)
基于已知的GM2抗体的序列来设计抗GM2 scFv的序列。为了比较VL和VH的顺序和连接子的种类，合成了VL–连接子15-VH(序列号9：VL15VH)、VL–连接子25-VH(序列号11：VL25VH)、VH–连接子15-VL(序列号13：VH15VL)和VH–连接子25-VL(序列号15：VH25VL)的各DNA片段。此外，在以下的实施例中，除了特别记载的情况以外，使用VL15VH作为抗GM2 scFv序列。
(表达IL-7和CCL19的抗GM2 CAR表达载体的制作)
首先，化学合成编码人IL-7(无终止密码子)、以及F2A和人CCL19的IL-7-F2A-CCL19DNA片段(序列号33：IL-7-F2A-CCL19)。接着，使用将小鼠抗CD20 scFv、小鼠CD8膜贯通区域、小鼠CD28-4-1BB-CCL3ζ细胞内信号基序、以及小鼠IL-7-F2A-小鼠CCL19构成的构建体插入到pMSGV1逆转录病毒表达载体(Tamada k et al.,Clin Cancer Res18:6436-6445(2012))而成的已知的小鼠抗CD20 CAR-IL-7/CCL19载体，以合成的人IL-7-F2A-CCL19DNA片段(序列号33)，利用限制酶(NsiI和Sal I)处理和连接来置换载体内的小鼠IL-7-F2A-CCL19的区域。进而，化学合成由人抗CD20 scFv、人CD8膜贯通区域、以及人CD28-4-1BB-CD3ζ细胞内信号基序构成的人抗CD20 CAR DNA片段(序列号37：抗CD20 CAR)，将载体内的小鼠抗CD20 CAR区域以该DNA片段通过限制酶(Nco I和Eco I)处理和连接置换。最后，化学合成编码人抗GM2 scFv的DNA片段(序列号9、11、13、15)，以该DNA片段利用限制酶(NcoI和Not I)处理和连接来置换载体内的抗CD20 scFv。需要说明的是，图1A表示抗GM2 CARDNA片段的构建体，图1B表示所得到的载体的配置图。
(表达IL-7/CCL19和HSV-tk的抗GM2 CAR表达载体的制作)
在CAR-T细胞疗法中，有时会由于对目标抗原的强力免疫应答而引起细胞因子释放综合症等全身性副作用。为了应对该问题，制作了将作为自杀基因的来自疱疹病毒的胸苷激酶基因HSV–tk导入得到的CAR构建体。当将该构建体进行基因导入而使CAR-T细胞表达HSV-tk时，通过添加作为巨细胞病毒治疗药物的丙氧鸟苷而使CAR-T细胞被诱导凋亡而死亡，因此，通过投与丙氧鸟苷能够控制体内的CAR-T细胞。
首先，化学合成IL-7-F2A-CCL19-F2A-HSV-tk DNA片段(序列号35：IL-7-F2A-CCL19-HSV-tk)。接着，用合成的IL-7-F2A-CCL19-HSV-tk DNA片段(序列号35)通过限制酶(Nsi I和Sal I)处理和连接对表达IL-7和CCL19的抗GM2 CAR表达载体(序列号39)内的IL-7-F2A-CCL19的区域进行置换，制作表达IL-7/CCL19和HSV-tk的抗GM2 CAR表达载体(序列号47)。
(导入了IL-7/CCL19表达-抗GM2 CAR载体的逆转录病毒的制作)
为了向T细胞导入基因而制作逆转录病毒。使用脂质体3000(life technologies公司制)，将上述的IL-7/CCL19表达-抗GM2 CAR载体和p-Ampho质粒(Takara Bio公司制)转染至GP2-293包装细胞株(Takara Bio公司制)，由此制作导入了IL-7/CCL19表达-抗GM2CAR载体的逆转录病毒。在转染48小时后，回收含有所述逆转录病毒的上清。
作为上述GP2-293细胞的培养液，使用加入了10％FCS、100U/ml的青霉素、100mg/ml的链霉素的DMEM。另外，作为后述的实施例中使用的T细胞的培养液，使用含有2.0％人AB型血清(Sigma公司制)、1％Penicillin-Streptmycin(和光纯药公司制)、2.5μg/ml的两性霉素B(百时美施贵宝公司制)的GT-T551。
(T细胞的转导)
从健康者供体的血液采集末梢血单核细胞，为了T细胞的活化，在将抗CD3单克隆抗体(5μg/ml)及RetroNectin(注册商标：Takara Bio公司制、25μg/ml)固层化的板上，与2×106个IL-2(200IU/ml：Peprotech公司制)一起在37℃、5％CO2的培养器中培养3天。培养开始后第2天，将含有导入了上述制作的IL-7/CCL19表达-抗GM2 CAR载体的逆转录病毒的上清，在预先用25μg/ml的RetroNectin(Takara Bio公司制)涂布的表面未处理24孔板中每孔各添加500μl，通过2000g离心2小时来制作逆转录病毒预载板。共计制作2片板，离心结束后，用1.5％BSA/PBS清洗，在4℃下保存至使用。培养第3天，将活化的细胞从上述板回收，调整细胞悬浊液(1×105cells/ml)。将该细胞悬浊液每孔1ml地添加到逆转录病毒预载板中，在IL-2(最终浓度200IU/ml)的存在下，在37℃、5％CO2的培养器中培养24小时，进行第1次的逆转录病毒感染。次日(培养第4天)，将各孔的细胞溶液移至保存的第2片病毒预载板上，以500g离心1分钟后，在37℃下培养4小时，进行第2次感染。在37℃下培养4小时后，将各孔的细胞混浊液1ml转移到新的12孔细胞培养板上，用含有IL-2(200IU/ml)的新培养液(GT-T551)稀释至4倍，在37℃、5％CO2培养器中进行培养。从末梢血单核细胞的培养开始日计算培养至第七日，得到导入了IL-7/CCL19表达-抗GM2 CAR载体的T细胞(抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞)(图1B)。另外，同时，作为CAR阴性细胞对照组，以同样的方法使从同一健康者供体获得的末梢血单核细胞活性化，但不进行逆转录病毒感染，制作了非基因导入细胞。
[实施例2]通过流式细胞仪的CAR表达测量(流式细胞仪分析)
通过双色流式细胞仪解析来进行将GM2识别为抗原的CAR的表达水平的解析。使所制作的抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞与生物素化protein L(GenScript公司制)、别藻蓝蛋白(APC)标记链霉亲和素(Affymetrix公司制)、以及APC标记抗CD8单克隆抗体(Affymetrix公司制)反应，进行染色。流式细胞仪使用EC800(索尼公司制造)，数据解析使用FlowJo software(Tree Star公司制)。
将结果示于图2。左图为无CAR基因导入的细胞，右图为抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞的结果。另外，图中的数值表示各个群体的百分比。如图2所示，在抗GM2CAR-IL-7/CCL19表达T细胞中，确认到约68％的CAR表达。
[实施例3]IL-7、CCL19的产生
(抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞的培养上清中的IL-7、CCL19浓度的测定)
回收上述培养第7天的抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞或非基因导入细胞的培养上清，使用市售的ELISA试剂盒(分别为Peprotech公司制和R&D systems公司制)对由抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞对IL-7和CCL19的产生进行了研究。
[结果]
结果示于图3。如图3所示，在抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞的培养上清(GM2CAR)中，检测到IL–7为300pg/ml以上，CCL19为2000pg/ml以上。由该结果确认出：抗GM2CAR-IL-7/CCL19表达T细胞表达IL-7和CCL19，且表达的IL-7和CCL19分泌到细胞外。另一方面，在对照组的非基因导入T细胞的培养上清(non-infection)中，IL-7及CCL19均为检测界限以下(Not detected)。
[实施例4]各肿瘤细胞的GM2表达
(流式细胞仪解析)
用Alexa488标记的抗GM2抗体和对照组的抗DNP抗体对恶性间皮瘤的细胞株Y-meso8A、MSTO211H、骨髓瘤的细胞株KMS-11、大肠癌的细胞株SW480进行染色，通过流式细胞仪解析来测定各肿瘤细胞中的GM2的表达。Alexa488标记抗GM2抗体及Alexa488标记抗DNP抗体均以10μg/样品进行染色。
虽然在大肠癌细胞株SW480中没有发现GM2的表达，但在恶性间皮瘤细胞株Y-meso8A、MSTO211H和骨髓瘤细胞株KMS-11、KMS-28PE中确认到GM2的表达。
[实施例5]细胞伤害性试验
(抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞的51Cr释放试验1)
图4表示抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞制作、细胞伤害性试验、共培养试验的试验时间表。如图4所示，在第8天回收CAR-IL-7/CCL19表达T细胞，使用标准的4小时51Cr释放测定来评价CAR-IL-7/CCL19表达T细胞对肿瘤细胞的细胞伤害活性。
将表达人GM2的各种肿瘤细胞用作靶细胞。将所述肿瘤细胞株在100μCi Na2 51CrO4的存在下、在37℃下培养1小时后，清洗3次，在96孔V底板(Nunc公司制)中每孔添加5×103个。其后，作为效应T细胞，添加改变了抗GM2 CAR的scFv的VH及VL以及连接子的组合的4种抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞、或非基因导入T细胞，与靶细胞在37℃下进行4小时共培养。另外，效靶比(E/T ratio)在2.5、5、10、20、40的范围内进行调整。靶细胞的最大释放和自然释放通过将靶细胞在含有10％Triton-X(Sigma-Aldrich公司制)的培养液或仅培养液中进行培养来测定。上清的51Cr释放用TopCount闪烁计数器(PerkinElmer公司制)测定。细胞伤害活性的比例如下式计算：细胞伤害活性(％)＝[(试验释放-自然释放)/(最大释放-自然释放)]×100。
[结果]
将结果示于图5A和图5B。图5A是将恶性间皮瘤细胞株(Y-meso8A、MSTO211H)作为靶细胞的结果，图5B是将骨髓瘤细胞株(KMS-11、KMS-28PE)作为靶细胞的结果。图中，“VL15VH”、“VL25VH”、“VH15VL”及“VH25VL”分别表示包含该序列作为抗GM2CAR的scFv序列的抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞。如图5A和图5B所示，抗GM2CAR-IL-7/CCL19表达T细胞通过VH、VL及连接子的任意组合，均显示对肿瘤细胞株的细胞伤害性。另一方面，对照组的非基因导入T细胞(non infection)几乎不显示对肿瘤细胞株的细胞伤害活性。另外，图5A和图5B的图表的横轴用E/T ratio表示效应(T细胞)与靶(肿瘤细胞)之比，纵轴表示细胞伤害活性(％)。
(抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞的51Cr释放试验2)
为了研究抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞的细胞伤害活性的GM2特异性，使用抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞、识别作为CAR-T细胞的对照组的FITC的抗FITC CAR-T细胞和非基因导入T细胞，比较研究各细胞对于GM2阳性肿瘤细胞株和GM2阴性肿瘤细胞株的细胞伤害活性。需要说明的是，抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞使用包含VL15VH作为scFv序列的细胞。
[结果]
将结果示于图6A～C。图6A是将恶性间皮瘤细胞株(Y-MESO8A)、图6B是将骨髓瘤细胞株(KMS11)、图6C是将大肠癌细胞株(SW480)作为靶细胞的结果。如图6A～C所示，抗FITCCAR-T细胞(FITC CAR-T)对于任一靶细胞都没有发现有意义的细胞伤害活性，与非基因导入T细胞(non infection)大致相同程度。另一方面，抗GM2CAR-IL-7/CCL19表达T细胞(GM2CAR-T)虽然对表达GM2的细胞(Y-MESO8A、KMS11)显示出细胞伤害性，但对于不表达GM2的细胞(SW480)不显示细胞伤害性。由此确认了抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞对GM2特异性地诱导细胞伤害活性。需要说明的是，图6A～C的图表的横轴用E/T ratio表示效应(T细胞)与靶(肿瘤细胞)之比，纵轴表示细胞伤害活性(％)。
(共培养试验)
如图4所示，在第7天回收抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞，与GM2阳性阴性肿瘤细胞株或GM2阴性肿瘤细胞株一起在24孔细胞培养板上，将效应细胞：肿瘤细胞比调节至1:1-1:3后，在37℃培养器中进行共培养。从共培养开始2～3天后，用显微镜观察细胞伤害活性，并且使用市售的IFN-γELISA试剂盒(BioLegend公司制)测定培养上清中产生的IFN-γ。使用抗FITC CAR表达T细胞和非基因导入T细胞作为抗GM2CAR-IL-7/CCL19表达T细胞的对照组。
[结果]
结果示于图7～9。图7、8是以恶性间皮瘤细胞株(Y-meso8A、MSTO221H)为靶细胞的结果，图9是以大肠癌细胞株(SW480)为靶细胞的结果。如图7-9所示，在对照组的抗FITCCAR表达T细胞(FITC CAR-T)或非基因T细胞(non-infection)与靶肿瘤细胞的共培养中，观察到任何靶肿瘤细胞均与只有肿瘤的孔(tumor only)同种程度地增殖。
另一方面，在抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞(GM2 CAR-T)中，根据靶肿瘤细胞的种类不同，观察到肿瘤的增殖差异。在与GM2阴性靶细胞(SW480：图9)共培养中，靶肿瘤细胞与只有肿瘤的孔同样地增殖。另一方面，观察到与GM2阳性肿瘤细胞(Y-meso8A：图7，MSTO221H：图8)共培养中，与仅具有肿瘤细胞的孔和具有对照组细胞的共培养孔相比，肿瘤细胞的数量明显减少。
从这些结果，与51Cr释放测定类似，确认了抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞抗原特异性地伤害肿瘤细胞。另外，如图10所示，在使用共培养后的上清的IFN-γ的ELISA中，也确认了仅在抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞和GM2阳性靶细胞(MSTO221H，Y-meso8A)的共培养的上清中产生IFN-γ。
[实施例6]肿瘤模型的治疗效果
(向X射线照射的小鼠投与抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞)
对免疫缺陷小鼠NOD/SCID/IL2rgKO(NSG)小鼠用2Gy的X射线照射后，在腹腔或胸腔接种1×104个荧光素酶表达MSTO211H。对于该腹腔内肿瘤模型组(n＝2)或胸腔内肿瘤模型组(n＝3)，一天后在静脉内投与2.5×107个抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞(1×107个已确认CAR表达的细胞)或作为对照组的相同数量的非基因导入T细胞。将细胞投与日设为day0，使用IVIS成像系统(PerkinElmer公司制)经时地评价肿瘤容量(＝荧光素酶活性的发光强度)。
[结果]
小鼠的肿瘤容量的推移结果示于图11A和B中。图11A是胸腔内肿瘤模型中的结果，图11B是腹腔内肿瘤模型中的结果。如图11A所示，在胸腔内肿瘤模型中，在投与非基因导入T细胞的组(non infection)中确认了肿瘤的增殖，但在投与抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞的组(GM2 CAR-T)中未确认到明显的肿瘤增殖。另外，如图11B所示，在腹腔内肿瘤接种模型中，在投与抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞的组(GM2 CAR-T)中，至day3为止确认了肿瘤增殖，但之后肿瘤慢慢缩小。这些结果表明，在胸腔内肿瘤模型和腹腔内肿瘤模型的任一个中，抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞均显示出优异的抗肿瘤活性。
(向未经X射线照射的小鼠投与抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞)
接着，研究NSG小鼠不进行X射线照射的前处理而在胸腔内接种了肿瘤的模型中的抗肿瘤效果。将1×104荧光素酶表达MSTO211H接种至胸腔，第二天，在静脉内投与1.6×107个抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞(1×107个CAR表达细胞)或相同数量的非基因导入T细胞作为对照组(抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞投与组n＝6，非基因导入T细胞投与组n＝5)。细胞投与日设为day0，与上述类似地使用IVIS成像系统，经时地评价肿瘤增殖。
[结果]
小鼠的肿瘤容量的推移结果示于图12中。如图12所示，在非基因导入T细胞投与组(non infection)中肿瘤慢慢增殖。另一方面，在抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞投与组(GM2 CAR-T)中，到day9为止肿瘤显示增殖倾向，但随后，除一只之外，肿瘤不增殖而消退。与上述X射线照射的前处理模型相似，确认了抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞诱导优异的抗肿瘤效果。
[实施例7]肿瘤模型中的治疗效果
(抗GM2 CAR表达T细胞的制作)
除了不包含IL-7-F2A-CCL19 DNA片段之外，制作具有与IL-7/CCL19表达-抗GM2CAR载体相同构成的抗GM2 CAR表达载体。以与实施例1类似的方法，将该抗GM2 CAR表达载体转导至T细胞，获得抗GM2 CAR表达T细胞。
(向小鼠投与抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞或抗GM2 CAR表达T细胞)
向免疫缺陷小鼠NOD/SCID/IL2rgKO(NSG)小鼠在胸腔中接种1×104个荧光素酶表达MSTO211H。对于该胸腔内肿瘤模型组，一天后在静脉内投与2.2x106个抗GM2CAR-IL-7/CCL19表达T细胞(1x106个确认了CAR表达的细胞)、相同数量的抗GM2 CAR表达T细胞(1x106个确认了CAR表达的细胞)、或相同数量的非基因导入T细胞作为对照组(各组n＝5)。将细胞投与日设为day1，使用IVIS成像系统(PerkinElmer公司制)经时地评价肿瘤容量(＝荧光素酶活性的发光强度)。
[结果]
图13示出了小鼠肿瘤容量的推移结果。图13中，"×"表示小鼠死亡。如图13所示，在胸腔内肿瘤模型中，在投与非基因导入T细胞的组(non infection)中，能够确认肿瘤随时间的增殖，在day57的时间点没有存活的小鼠。虽然在投与抗GM2 CAR表达T细胞的组(GM2CAR-T(-)IL-7/CCL19)中肿瘤随时间增殖，但与投与非基因导入T细胞的组相比，观察到肿瘤增殖的抑制。另一方面，在投与抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞的组(GM2CAR-T(+)IL-7/CCL19)中，与其他组相比，肿瘤增殖受到抑制，并且day70以后也有小鼠存活。
图14是将图13中的发光强度的推移图表化的图。图14的图表的横轴表示在小鼠胸腔内接种肿瘤细胞后经过的天数，纵轴表示来自肿瘤细胞的发光强度(×106光子/秒)。在投与非基因导入T细胞的组(non infection)和投与抗GM2 CAR表达T细胞的组(GM2CAR-T(-)IL-7/CCL19)中，因为在day57时间点没有存活的小鼠，因此此后没有画图。在图14中，可以确认，与投与非基因导入T细胞的组(non infection)相比，投与抗GM2 CAR表达T细胞的组(GM2 CAR-T(-)IL-7/CCL19)中的肿瘤增殖被轻微抑制。另一方面，在投与抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞的组(GM2 CAR-T(+)IL-7/CCL19)中，肿瘤的增殖被抑制在几乎一定的范围内。
另外，图15是示出小鼠存活率推移的图表。图15的图表的横轴表示在小鼠胸腔内接种肿瘤细胞后的经过天数，纵轴表示小鼠的生存率(％)。如图15所示，确认了与投与非基因导入T细胞的组(non infection)相比，投与抗GM2 CAR表达T细胞的组(GM2CAR-T(-)IL-7/CCL19)具有存活时间稍微延长的倾向。另一方面，确认了与投与非基因导入T细胞的组和投与抗GM2 CAR表达T细胞的组相比，投与抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞的组(GM2 CAR-T(+)IL-7/CCL19)具有改善的存活率(存活时间延长的效果)。
从上述结果，明确了抗GM2 CAR-IL-7/CCL19表达T细胞具有优异的抗肿瘤活性。
工业实用性
根据本发明，提供了以实体瘤抗原为目标抗原的新型CAR和对实体瘤有效的CAR-T细胞。本发明的CAR-T细胞能够适用于治疗或预防肺癌、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、黑素瘤、恶性间皮瘤、骨髓瘤等表达GM2的实体肿瘤。
本申请基于在日本申请的日本特愿2017-61461(申请日2017年3月27日)，其内容全部包含在本说明书中。
序列表
<110> 诺伊尓免疫生物科技株式会社
<120> 嵌合抗原受体
<130> PC25381
<150> JP2017-061461
<151> 2017-03-27
<160> 68
<170> PatentIn 3.5版本
<210> 1
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL15VH的抗GM2抗体的VH区
<400> 1
gaagtgcagc tggtgcagtc cggagccgag gtgaaaaagc ctggcgcctc cgtcaaggtg 60
agctgcaagg ccagcggcta tacattcacc gactataaca tggactgggt gaagcagagc 120
cccggccagg gactggagtg gatgggctac atctacccca ataacggcgg caccggctac 180
aaccagaagt tcaagtccaa ggtgaccatc accgtggaca ccagcaccag caccgcctac 240
atggaactgc acagcctcag aagcgaagac accgctgtgt actactgcgc cacctacggc 300
cactactacg gctacatgtt cgcctactgg ggacagggca ccctggtgac cgtcagcagc 360
<210> 2
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗GM2抗体的VH区
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu His Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Tyr Gly His Tyr Tyr Gly Tyr Met Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 3
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GM15的抗GM2抗体的VL区
<400> 3
gacatccagc tgacccagtc ccctagcagc ctgtccgcta gccccggaga cagagtgacc 60
atcacctgtt ccgccagctc cagcgtgagc tacatgcact ggttccagca gaagcccggc 120
aaggccccca agctgtggat ctacagcacc agcaacctgg cttccggcgt gcctgccaga 180
ttttccggct ccggcagcgg cacaagctac tccctgacca tcagcagact gcagcccgaa 240
gacatcgcca cctactactg tcagcagagg agcagctacc cctacacctt cggcggcggc 300
accaaggtgg agatcaag 318
<210> 4
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗GM2抗体的VL区
<400> 4
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 5
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL15VH的接头15
<400> 5
ggcggcggcg gaagcggagg cggcggcagc ggcggaggcg gaagc 45
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头15
<400> 6
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 7
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL25VH的接头25
<400> 7
agctccgctg acgacgctaa gaaggacgct gccaagaagg acgacgccaa gaaggatgac 60
gccaaaaaag acggc 75
<210> 8
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头25
<400> 8
Ser Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp Asp Ala
1 5 10 15
Lys Lys Asp Asp Ala Lys Lys Asp Gly
20 25
<210> 9
<211> 723
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗GM2scFv（VL15VH）
<400> 9
gacatccagc tgacccagtc ccctagcagc ctgtccgcta gccccggaga cagagtgacc 60
atcacctgtt ccgccagctc cagcgtgagc tacatgcact ggttccagca gaagcccggc 120
aaggccccca agctgtggat ctacagcacc agcaacctgg cttccggcgt gcctgccaga 180
ttttccggct ccggcagcgg cacaagctac tccctgacca tcagcagact gcagcccgaa 240
gacatcgcca cctactactg tcagcagagg agcagctacc cctacacctt cggcggcggc 300
accaaggtgg agatcaaggg cggcggcgga agcggaggcg gcggcagcgg cggaggcgga 360
agcgaagtgc agctggtgca gtccggagcc gaggtgaaaa agcctggcgc ctccgtcaag 420
gtgagctgca aggccagcgg ctatacattc accgactata acatggactg ggtgaagcag 480
agccccggcc agggactgga gtggatgggc tacatctacc ccaataacgg cggcaccggc 540
tacaaccaga agttcaagtc caaggtgacc atcaccgtgg acaccagcac cagcaccgcc 600
tacatggaac tgcacagcct cagaagcgaa gacaccgctg tgtactactg cgccacctac 660
ggccactact acggctacat gttcgcctac tggggacagg gcaccctggt gaccgtcagc 720
agc 723
<210> 10
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗GM2scFv（VL15VH）
<400> 10
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser
115 120 125
Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys
130 135 140
Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Asn Met Asp Trp Val Lys Gln
145 150 155 160
Ser Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Tyr Pro Asn Asn
165 170 175
Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Ser Lys Val Thr Ile Thr
180 185 190
Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu His Ser Leu Arg
195 200 205
Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Gly His Tyr Tyr
210 215 220
Gly Tyr Met Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
225 230 235 240
Ser
<210> 11
<211> 753
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗GM2scFv（VL25VH）
<400> 11
gatatccaac tgacccagtc cccttccagc ctgagcgctt cccccggaga cagggtgaca 60
attacctgca gcgccagctc ctccgtgagc tacatgcact ggttccagca gaagcccggc 120
aaggccccca agctgtggat ctactccaca agcaacctgg cctccggcgt gcctgccaga 180
tttagcggaa gcggcagcgg cacatcctac agcctgacca tctccaggct gcagcccgag 240
gacatcgcca catactactg ccagcagagg tccagctacc cttacacatt cggaggcggc 300
accaaggtgg agatcaagag ctccgctgac gacgctaaga aggacgctgc caagaaggac 360
gacgccaaga aggatgacgc caaaaaagac ggcgaagtcc agctggtgca gagcggcgct 420
gaggtgaaga agcctggcgc cagcgtcaag gtgagctgta aggcctccgg ctacaccttc 480
accgactaca acatggattg ggtgaagcag agccccggac agggcctgga gtggatgggc 540
tacatctacc ccaacaacgg cggcaccggc tacaaccaga aattcaagtc caaggtgacc 600
atcaccgtgg acaccagcac atccaccgcc tacatggaac tgcacagcct gaggtccgag 660
gacacagccg tgtactactg cgctacctac ggccactact acggctacat gttcgcttac 720
tggggacagg gcaccctggt gaccgtgagc tcc 753
<210> 12
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗GM2scFv （VL25VH）
<400> 12
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Asp Asp Ala
100 105 110
Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp Asp Ala Lys Lys Asp Asp Ala Lys
115 120 125
Lys Asp Gly Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
130 135 140
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
145 150 155 160
Thr Asp Tyr Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Gly Leu
165 170 175
Glu Trp Met Gly Tyr Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn
180 185 190
Gln Lys Phe Lys Ser Lys Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser
195 200 205
Thr Ala Tyr Met Glu Leu His Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Gly His Tyr Tyr Gly Tyr Met Phe Ala Tyr
225 230 235 240
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
245 250
<210> 13
<211> 723
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗GM2scFv（VH15VL）
<400> 13
gaggtgcagc tggtgcagtc cggagccgag gtgaagaagc ctggcgccag cgtgaaggtg 60
agctgtaagg cctccggcta caccttcacc gactacaaca tggactgggt caagcagagc 120
cctggccagg gcctggagtg gatgggctat atctacccca acaacggcgg caccggctac 180
aaccagaagt tcaagagcaa ggtcaccatc accgtggaca cctccacctc cacagcctac 240
atggagctgc acagcctgag gagcgaggat accgccgtgt actactgcgc tacctacggc 300
cattactacg gatacatgtt cgcctactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtgtcctcc 360
ggaggaggag gaagcggagg cggcggctcc ggcggaggcg gatccgacat ccagctgaca 420
caatccccca gcagcctgag cgctagcccc ggcgataggg tgacaattac ctgcagcgcc 480
tccagctccg tgtcctacat gcactggttt cagcaaaagc ccggcaaggc ccctaagctg 540
tggatctaca gcaccagcaa cctggccagc ggagtgcctg ccagatttag cggcagcggc 600
agcggcacca gctacagcct gaccatcagc agactgcagc ccgaggatat cgccacctac 660
tactgccagc agaggagctc ctacccctac acattcggcg gcggaaccaa ggtggagatc 720
aag 723
<210> 14
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗GM2scFv（VH15VL）
<400> 14
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu His Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Tyr Gly His Tyr Tyr Gly Tyr Met Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser
130 135 140
Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala
145 150 155 160
Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys
165 170 175
Ala Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val
180 185 190
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr
195 200 205
Ile Ser Arg Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
210 215 220
Arg Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
225 230 235 240
Lys
<210> 15
<211> 753
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗GM2scFv（VH25VL）
<400> 15
gaagtgcagc tggtgcagtc cggagctgag gtgaagaagc ccggcgccag cgtgaaggtc 60
agctgcaaag ccagcggcta taccttcacc gactacaaca tggactgggt gaagcagagc 120
cccggccaag gcctcgagtg gatgggatac atctacccca acaacggcgg caccggctac 180
aaccagaagt tcaagagcaa ggtgaccatc accgtggaca catccacaag caccgcctat 240
atggagctcc acagcctgag gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc cacctacggc 300
cactactacg gctatatgtt cgcctactgg ggccagggca ccctggtgac agtgtcctcc 360
tccagcgccg atgatgccaa gaaggatgcc gccaaaaagg acgacgctaa gaaggatgac 420
gccaagaagg acggcgatat ccagctgaca cagagcccta gctccctgag cgctagccct 480
ggcgacagag tgaccatcac ctgcagcgcc agctccagcg tgagctacat gcactggttc 540
cagcagaaac ccggcaaggc ccccaagctg tggatctaca gcaccagcaa tctggctagc 600
ggcgtgcctg ccaggtttag cggatccggc agcggcacct cctactccct gacaatctcc 660
agactgcagc ccgaggacat cgccacctac tactgccaac agaggtcctc ctacccctac 720
accttcggcg gcggcaccaa agtggagatc aag 753
<210> 16
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗GM2scFv（VH25VL）
<400> 16
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu His Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Tyr Gly His Tyr Tyr Gly Tyr Met Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ser Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys
115 120 125
Asp Ala Ala Lys Lys Asp Asp Ala Lys Lys Asp Asp Ala Lys Lys Asp
130 135 140
Gly Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro
145 150 155 160
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr
165 170 175
Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Trp Ile
180 185 190
Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Leu Gln Pro
210 215 220
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Tyr
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245 250
<210> 17
<211> 165
<212> DNA
<213> 智人
<400> 17
ttcgtgccgg tcttcctgcc agcgaagccc accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca 60
ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg 120
gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg gacttcgcct gtgat 165
<210> 18
<211> 55
<212> PRT
<213> 智人
<400> 18
Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
1 5 10 15
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
20 25 30
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
35 40 45
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
50 55
<210> 19
<211> 63
<212> DNA
<213> 智人
<400> 19
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60
acc 63
<210> 20
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人
<400> 20
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr
20
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人
<400> 21
ctttactgca accacaggaa c 21
<210> 22
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 22
Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn
1 5
<210> 23
<211> 123
<212> DNA
<213> 智人
<400> 23
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60
gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120
tcc 123
<210> 24
<211> 41
<212> PRT
<213> 智人
<400> 24
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 25
<211> 138
<212> DNA
<213> 智人
<400> 25
cgtttctctg ttgttaaacg gggcagaaag aagctcctgt atatattcaa acaaccattt 60
atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa 120
gaagaaggag gatgtgaa 138
<210> 26
<211> 46
<212> PRT
<213> 智人
<400> 26
Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
1 5 10 15
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
20 25 30
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu
35 40 45
<210> 27
<211> 339
<212> DNA
<213> 智人
<400> 27
ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 60
ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 120
ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 180
aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 240
cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 300
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 339
<210> 28
<211> 113
<212> PRT
<213> 智人
<400> 28
Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
1 5 10 15
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
20 25 30
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
35 40 45
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
50 55 60
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
65 70 75 80
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
85 90 95
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
100 105 110
Arg
<210> 29
<211> 849
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8（铰链）_CD8（跨膜）_CD28（信号）_4-1BB（信令）_CD3z（信令）
<400> 29
ttcgtgccgg tcttcctgcc agcgaagccc accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca 60
ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg 120
gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg 180
cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc ctgtcactgg ttatcaccct ttactgcaac 240
cacaggaaca ggagtaagag gagcaggctc ctgcacagtg actacatgaa catgactccc 300
cgccgccccg ggcccacccg caagcattac cagccctatg ccccaccacg cgacttcgca 360
gcctatcgct cccgtttctc tgttgttaaa cggggcagaa agaagctcct gtatatattc 420
aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact actcaagagg aagatggctg tagctgccga 480
tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac 540
gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag ctctataacg agctcaatct aggacgaaga 600
gaggagtacg atgttttgga caagagacgt ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg 660
agaaggaaga accctcagga aggcctgtac aatgaactgc agaaagataa gatggcggag 720
gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt 780
taccagggtc tcagtacagc caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg 840
ccccctcgc 849
<210> 30
<211> 283
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8（铰链）_CD8（跨膜）_CD28（信令）_4-1BB（信令）_CD3z（信令）
<400> 30
Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
1 5 10 15
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
20 25 30
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
35 40 45
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
50 55 60
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn
65 70 75 80
His Arg Asn Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met
85 90 95
Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro
100 105 110
Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Phe Ser Val
115 120 125
Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
130 135 140
Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
145 150 155 160
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser
165 170 175
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
180 185 190
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
195 200 205
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
210 215 220
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
225 230 235 240
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
245 250 255
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
260 265 270
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
275 280
<210> 31
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EcoRI_F2A-NsiI
<400> 31
gaattcggaa gcggagtgaa acagactttg aattttgacc ttctcaagtt ggcgggagac 60
gtggagtcca accctggacc atgcat 86
<210> 32
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EcoRI_F2A-NsiI
<400> 32
Glu Phe Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys
1 5 10 15
Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Cys
20 25
<210> 33
<211> 909
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL7_F2A_CCL19_SalI
<400> 33
atgttccatg tttcttttag gtatatcttt ggacttcctc ccctgatcct tgttctgttg 60
ccagtagcat catctgattg tgatattgaa ggtaaagatg gcaaacaata tgagagtgtt 120
ctaatggtca gcatcgatca attattggac agcatgaaag aaattggtag caattgcctg 180
aataatgaat ttaacttttt taaaagacat atctgtgatg ctaataagga aggtatgttt 240
ttattccgtg ctgctcgcaa gttgaggcaa tttcttaaaa tgaatagcac tggtgatttt 300
gatctccact tattaaaagt ttcagaaggc acaacaatac tgttgaactg cactggccag 360
gttaaaggaa gaaaaccagc tgccctgggt gaagcccaac caacaaagag tttggaagaa 420
aataaatctt taaaggaaca gaaaaaactg aatgacttgt gtttcctaaa gagactatta 480
caagagataa aaacttgttg gaataaaatt ttgatgggca ctaaagaaca cggaagcgga 540
gtgaaacaga ctttgaattt tgaccttctc aagttggcgg gagacgtgga gtccaaccct 600
ggacctatgg ccctgctact ggccctcagc ctgctggttc tctggacttc cccagcccca 660
actctgagtg gcaccaatga tgctgaagac tgctgcctgt ctgtgaccca gaaacccatc 720
cctgggtaca tcgtgaggaa cttccactac cttctcatca aggatggctg cagggtgcct 780
gctgtagtgt tcaccacact gaggggccgc cagctctgtg cacccccaga ccagccctgg 840
gtagaacgca tcatccagag actgcagagg acctcagcca agatgaagcg ccgcagcagt 900
taagtcgac 909
<210> 34
<211> 300
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL7_F2A_CCL19_SalI
<400> 34
Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile
1 5 10 15
Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys
20 25 30
Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu
35 40 45
Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe
50 55 60
Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe
65 70 75 80
Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser
85 90 95
Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr
100 105 110
Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala
115 120 125
Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu
130 135 140
Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu
145 150 155 160
Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu
165 170 175
His Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu
180 185 190
Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu Leu Leu Ala
195 200 205
Leu Ser Leu Leu Val Leu Trp Thr Ser Pro Ala Pro Thr Leu Ser Gly
210 215 220
Thr Asn Asp Ala Glu Asp Cys Cys Leu Ser Val Thr Gln Lys Pro Ile
225 230 235 240
Pro Gly Tyr Ile Val Arg Asn Phe His Tyr Leu Leu Ile Lys Asp Gly
245 250 255
Cys Arg Val Pro Ala Val Val Phe Thr Thr Leu Arg Gly Arg Gln Leu
260 265 270
Cys Ala Pro Pro Asp Gln Pro Trp Val Glu Arg Ile Ile Gln Arg Leu
275 280 285
Gln Arg Thr Ser Ala Lys Met Lys Arg Arg Ser Ser
290 295 300
<210> 35
<211> 2112
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL7_F2A_CCL19_HSVtK_SalI
<400> 35
atgttccatg tgagcttcag gtacatcttc ggactgcctc ctctcatcct ggtcctcctc 60
cccgtggcca gctccgactg tgacatcgaa ggaaaggatg gcaagcagta cgaaagcgtg 120
ctgatggtga gcatcgatca gctcctggat tccatgaagg aaatcggctc caactgcctc 180
aacaatgagt tcaacttttt taagaggcat atctgcgacg ccaacaagga gggcatgttt 240
ctgttcaggg ccgccaggaa gctgagacag ttcctcaaga tgaatagcac cggcgacttc 300
gacctccatc tgctgaaggt gtccgaggga accaccatcc tgctgaactg caccggccaa 360
gtgaagggaa gaaaacctgc tgccctgggc gaggctcagc ctaccaagag cctcgaggag 420
aacaaaagcc tgaaggagca gaagaagctg aacgacctgt gcttcctcaa gaggctcctg 480
caggagatta agacctgttg gaacaagatc ctgatgggca caaaggagca cggatccggc 540
gtgaagcaga ccctgaactt tgacctgctc aaactggccg gcgacgtcga gtccaatcct 600
ggacctatgg ctctgctgct cgccctgagc ctgctcgtcc tctggacctc ccctgctcct 660
accctgagcg gcaccaatga cgctgaagac tgctgcctgt ccgtgaccca gaagcctatc 720
cccggatata tcgtgaggaa ttttcattac ctcctgatca aggacggctg tagagtgccc 780
gccgtcgtgt tcacaacact cagaggcagg cagctgtgtg ctccccccga ccagccttgg 840
gtggagagaa tcattcagag actgcaaagg acctccgcta agatgaagag gaggtccagc 900
ggcagcggag tgaagcagac actgaatttc gacctgctca agctggccgg cgatgtggag 960
agcaaccctg gacctatggc ttcctacccc ggacatcagc acgcttccgc cttcgaccag 1020
gccgctagaa gcagaggaca ctccaataga aggacagccc tgaggcctag gagacagcag 1080
gaggccaccg aggtgaggcc cgagcagaaa atgcccaccc tgctgagagt gtatattgat 1140
ggaccccacg gcatgggaaa aaccaccaca acccagctgc tggtggctct gggaagcagg 1200
gatgatattg tgtacgtccc cgaacctatg acatattgga gggtcctcgg cgcctccgag 1260
accatcgcca acatttacac cacccagcac aggctggatc agggagagat ctccgccggc 1320
gatgctgccg tggtgatgac cagcgcccag atcactatgg gtatgcctta tgccgtgacc 1380
gacgctgtgc tggctcctca cattggcggc gaagccggat cctcccatgc tccccctcct 1440
gccctcacac tgatctttga cagacatcct atcgccgctc tgctgtgcta ccccgccgct 1500
aggtacctga tgggcagcat gacccctcag gccgtgctgg cttttgtggc cctcattccc 1560
cccacactgc ctggcacaaa tatcgtgctc ggcgccctgc ctgaggacag gcacatcgat 1620
aggctggcta agagacagag acccggagag aggctggatc tcgctatgct ggccgccatc 1680
aggagggtgt acggcctgct ggccaacacc gtgagatatc tccagtgtgg cggatcctgg 1740
agggaagact ggggccaact gagcggcaca gctgtgcctc ctcaaggcgc tgagccccag 1800
agcaacgctg gacccagacc tcacatcggc gataccctgt tcaccctgtt tagagcccct 1860
gagctcctgg cccctaacgg cgacctgtac aatgtgttcg cttgggccct ggatgtgctc 1920
gccaagagac tcaggagcat gcacgtcttc attctggact acgaccagtc ccccgctggc 1980
tgcagagatg ccctgctcca gctgacctcc ggcatggtgc agacccacgt gaccacccct 2040
ggaagcatcc ccacaatctg cgacctggcc aggacctttg ccagagaaat gggagaagcc 2100
aactgagtcg ac 2112
<210> 36
<211> 701
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL7_F2A_CCL19_HSVtK_SalI
<400> 36
Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile
1 5 10 15
Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys
20 25 30
Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu
35 40 45
Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe
50 55 60
Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe
65 70 75 80
Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser
85 90 95
Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr
100 105 110
Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala
115 120 125
Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu
130 135 140
Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu
145 150 155 160
Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu
165 170 175
His Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu
180 185 190
Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu Leu Leu Ala
195 200 205
Leu Ser Leu Leu Val Leu Trp Thr Ser Pro Ala Pro Thr Leu Ser Gly
210 215 220
Thr Asn Asp Ala Glu Asp Cys Cys Leu Ser Val Thr Gln Lys Pro Ile
225 230 235 240
Pro Gly Tyr Ile Val Arg Asn Phe His Tyr Leu Leu Ile Lys Asp Gly
245 250 255
Cys Arg Val Pro Ala Val Val Phe Thr Thr Leu Arg Gly Arg Gln Leu
260 265 270
Cys Ala Pro Pro Asp Gln Pro Trp Val Glu Arg Ile Ile Gln Arg Leu
275 280 285
Gln Arg Thr Ser Ala Lys Met Lys Arg Arg Ser Ser Gly Ser Gly Val
290 295 300
Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu
305 310 315 320
Ser Asn Pro Gly Pro Met Ala Ser Tyr Pro Gly His Gln His Ala Ser
325 330 335
Ala Phe Asp Gln Ala Ala Arg Ser Arg Gly His Ser Asn Arg Arg Thr
340 345 350
Ala Leu Arg Pro Arg Arg Gln Gln Glu Ala Thr Glu Val Arg Pro Glu
355 360 365
Gln Lys Met Pro Thr Leu Leu Arg Val Tyr Ile Asp Gly Pro His Gly
370 375 380
Met Gly Lys Thr Thr Thr Thr Gln Leu Leu Val Ala Leu Gly Ser Arg
385 390 395 400
Asp Asp Ile Val Tyr Val Pro Glu Pro Met Thr Tyr Trp Arg Val Leu
405 410 415
Gly Ala Ser Glu Thr Ile Ala Asn Ile Tyr Thr Thr Gln His Arg Leu
420 425 430
Asp Gln Gly Glu Ile Ser Ala Gly Asp Ala Ala Val Val Met Thr Ser
435 440 445
Ala Gln Ile Thr Met Gly Met Pro Tyr Ala Val Thr Asp Ala Val Leu
450 455 460
Ala Pro His Ile Gly Gly Glu Ala Gly Ser Ser His Ala Pro Pro Pro
465 470 475 480
Ala Leu Thr Leu Ile Phe Asp Arg His Pro Ile Ala Ala Leu Leu Cys
485 490 495
Tyr Pro Ala Ala Arg Tyr Leu Met Gly Ser Met Thr Pro Gln Ala Val
500 505 510
Leu Ala Phe Val Ala Leu Ile Pro Pro Thr Leu Pro Gly Thr Asn Ile
515 520 525
Val Leu Gly Ala Leu Pro Glu Asp Arg His Ile Asp Arg Leu Ala Lys
530 535 540
Arg Gln Arg Pro Gly Glu Arg Leu Asp Leu Ala Met Leu Ala Ala Ile
545 550 555 560
Arg Arg Val Tyr Gly Leu Leu Ala Asn Thr Val Arg Tyr Leu Gln Cys
565 570 575
Gly Gly Ser Trp Arg Glu Asp Trp Gly Gln Leu Ser Gly Thr Ala Val
580 585 590
Pro Pro Gln Gly Ala Glu Pro Gln Ser Asn Ala Gly Pro Arg Pro His
595 600 605
Ile Gly Asp Thr Leu Phe Thr Leu Phe Arg Ala Pro Glu Leu Leu Ala
610 615 620
Pro Asn Gly Asp Leu Tyr Asn Val Phe Ala Trp Ala Leu Asp Val Leu
625 630 635 640
Ala Lys Arg Leu Arg Ser Met His Val Phe Ile Leu Asp Tyr Asp Gln
645 650 655
Ser Pro Ala Gly Cys Arg Asp Ala Leu Leu Gln Leu Thr Ser Gly Met
660 665 670
Val Gln Thr His Val Thr Thr Pro Gly Ser Ile Pro Thr Ile Cys Asp
675 680 685
Leu Ala Arg Thr Phe Ala Arg Glu Met Gly Glu Ala Asn
690 695 700
<210> 37
<211> 1641
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗hCD20 CAR
<400> 37
atggattgga cctggaggat cctgtttctg gtggctgccg ccaccggagc ccattcccag 60
atcgtgctga gccagagccc tgccattctg agcgccagcc ccggcgaaaa ggtgaccatg 120
acctgcaggg ccagcagcag cgtgtcctac atccactggt tccagcagaa gcccggctcc 180
agccccaaac cctggatcta cgccaccagc aatctggcca gcggcgtgcc tgtgagattc 240
tccggcagcg gcagcggcac aagctatagc ctgaccatct ccagagtgga ggccgaggat 300
gccgccacct actactgcca gcagtggacc agcaaccccc ccacattcgg aggcggcacc 360
aagctggaga tcaaaggcgg aggcggcagc ggcggaggcg gcagcggagg cggaggaagc 420
caagtgcagc tgcagcagcc tggagctgag ctggtgaagc ctggcgcctc cgtcaagatg 480
agctgcaagg ccagcggcta cacattcacc agctacaaca tgcactgggt gaagcagacc 540
cccggaagag gcctggagtg gatcggagcc atctaccccg gcaacggcga taccagctat 600
aaccagaagt tcaagggcaa ggccaccctc accgccgaca agagcagcag caccgcctac 660
atgcagctga gcagcctgac ctccgaggac agcgccgtgt actactgcgc caggtccacc 720
tactatggcg gcgactggta cttcaacgtg tggggcgccg gaacaaccgt gaccgtgagc 780
gccgcggccg cattcgtgcc ggtcttcctg ccagcgaagc ccaccacgac gccagcgccg 840
cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg 900
tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac acgagggggc tggacttcgc ctgtgatatc 960
tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc 1020
ctttactgca accacaggaa caggagtaag aggagcaggc tcctgcacag tgactacatg 1080
aacatgactc cccgccgccc cgggcccacc cgcaagcatt accagcccta tgccccacca 1140
cgcgacttcg cagcctatcg ctcccgtttc tctgttgtta aacggggcag aaagaagctc 1200
ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc 1260
tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa ggaggatgtg aactgagagt gaagttcagc 1320
aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag ggccagaacc agctctataa cgagctcaat 1380
ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg gacaagagac gtggccggga ccctgagatg 1440
gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat 1500
aagatggcgg aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg 1560
cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac 1620
atgcaggccc tgccccctcg c 1641
<210> 38
<211> 547
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗hCD20 CAR
<400> 38
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Ala His Ser Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala
20 25 30
Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val
35 40 45
Ser Tyr Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro
50 55 60
Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe
65 70 75 80
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val
85 90 95
Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn
100 105 110
Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu
130 135 140
Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met
145 150 155 160
Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp
165 170 175
Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr
180 185 190
Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala
195 200 205
Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser
210 215 220
Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr
225 230 235 240
Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr
245 250 255
Val Thr Val Ser Ala Ala Ala Ala Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala
260 265 270
Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
275 280 285
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
290 295 300
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile
305 310 315 320
Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser
325 330 335
Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Ser Lys Arg Ser
340 345 350
Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
355 360 365
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
370 375 380
Ala Tyr Arg Ser Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu
385 390 395 400
Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln
405 410 415
Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly
420 425 430
Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
435 440 445
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
450 455 460
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
465 470 475 480
Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu
485 490 495
Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys
500 505 510
Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu
515 520 525
Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu
530 535 540
Pro Pro Arg
545
<210> 39
<211> 2625
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗GM2 CAR (VL15VH)
<400> 39
atggattgga cctggaggat tctgttcctg gtggctgctg ccacaggcgc ccattccgac 60
atccagctga cccagtcccc tagcagcctg tccgctagcc ccggagacag agtgaccatc 120
acctgttccg ccagctccag cgtgagctac atgcactggt tccagcagaa gcccggcaag 180
gcccccaagc tgtggatcta cagcaccagc aacctggctt ccggcgtgcc tgccagattt 240
tccggctccg gcagcggcac aagctactcc ctgaccatca gcagactgca gcccgaagac 300
atcgccacct actactgtca gcagaggagc agctacccct acaccttcgg cggcggcacc 360
aaggtggaga tcaagggcgg cggcggaagc ggaggcggcg gcagcggcgg aggcggaagc 420
gaagtgcagc tggtgcagtc cggagccgag gtgaaaaagc ctggcgcctc cgtcaaggtg 480
agctgcaagg ccagcggcta tacattcacc gactataaca tggactgggt gaagcagagc 540
cccggccagg gactggagtg gatgggctac atctacccca ataacggcgg caccggctac 600
aaccagaagt tcaagtccaa ggtgaccatc accgtggaca ccagcaccag caccgcctac 660
atggaactgc acagcctcag aagcgaagac accgctgtgt actactgcgc cacctacggc 720
cactactacg gctacatgtt cgcctactgg ggacagggca ccctggtgac cgtcagcagc 780
gcggccgcat tcgtgccggt cttcctgcca gcgaagccca ccacgacgcc agcgccgcga 840
ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc 900
cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg agggggctgg acttcgcctg tgatatctac 960
atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt 1020
tactgcaacc acaggaacag gagtaagagg agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac 1080
atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc aagcattacc agccctatgc cccaccacgc 1140
gacttcgcag cctatcgctc ccgtttctct gttgttaaac ggggcagaaa gaagctcctg 1200
tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt 1260
agctgccgat ttccagaaga agaagaagga ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg 1320
agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1380
ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1440
ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1500
atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1560
gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1620
caggccctgc cccctcgcga attcggaagc ggagtgaaac agactttgaa ttttgacctt 1680
ctcaagttgg cgggagacgt ggagtccaac cctggaccat gcatgttcca tgtttctttt 1740
aggtatatct ttggacttcc tcccctgatc cttgttctgt tgccagtagc atcatctgat 1800
tgtgatattg aaggtaaaga tggcaaacaa tatgagagtg ttctaatggt cagcatcgat 1860
caattattgg acagcatgaa agaaattggt agcaattgcc tgaataatga atttaacttt 1920
tttaaaagac atatctgtga tgctaataag gaaggtatgt ttttattccg tgctgctcgc 1980
aagttgaggc aatttcttaa aatgaatagc actggtgatt ttgatctcca cttattaaaa 2040
gtttcagaag gcacaacaat actgttgaac tgcactggcc aggttaaagg aagaaaacca 2100
gctgccctgg gtgaagccca accaacaaag agtttggaag aaaataaatc tttaaaggaa 2160
cagaaaaaac tgaatgactt gtgtttccta aagagactat tacaagagat aaaaacttgt 2220
tggaataaaa ttttgatggg cactaaagaa cacggaagcg gagtgaaaca gactttgaat 2280
tttgaccttc tcaagttggc gggagacgtg gagtccaacc ctggacctat ggccctgcta 2340
ctggccctca gcctgctggt tctctggact tccccagccc caactctgag tggcaccaat 2400
gatgctgaag actgctgcct gtctgtgacc cagaaaccca tccctgggta catcgtgagg 2460
aacttccact accttctcat caaggatggc tgcagggtgc ctgctgtagt gttcaccaca 2520
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<213> 人工序列
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Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Cys Met Phe
565 570 575
His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile Leu Val
580 585 590
Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly
595 600 605
Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp
610 615 620
Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe
625 630 635 640
Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe
645 650 655
Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly
660 665 670
Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu
675 680 685
Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly
690 695 700
Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu
705 710 715 720
Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu
725 730 735
Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His Gly
740 745 750
Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly
755 760 765
Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ser
770 775 780
Leu Leu Val Leu Trp Thr Ser Pro Ala Pro Thr Leu Ser Gly Thr Asn
785 790 795 800
Asp Ala Glu Asp Cys Cys Leu Ser Val Thr Gln Lys Pro Ile Pro Gly
805 810 815
Tyr Ile Val Arg Asn Phe His Tyr Leu Leu Ile Lys Asp Gly Cys Arg
820 825 830
Val Pro Ala Val Val Phe Thr Thr Leu Arg Gly Arg Gln Leu Cys Ala
835 840 845
Pro Pro Asp Gln Pro Trp Val Glu Arg Ile Ile Gln Arg Leu Gln Arg
850 855 860
Thr Ser Ala Lys Met Lys Arg Arg Ser Ser
865 870
<210> 45
<211> 2655
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗GM2 CAR (VH25VL)
<400> 45
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tactacggct atatgttcgc ctactggggc cagggcaccc tggtgacagt gtcctcctcc 420
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675 680 685
Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln
690 695 700
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Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn
740 745 750
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755 760 765
Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro
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Gly Pro Met Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ser Leu Leu Val Leu Trp Thr
785 790 795 800
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820 825 830
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835 840 845
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850 855 860
Val Glu Arg Ile Ile Gln Arg Leu Gln Arg Thr Ser Ala Lys Met Lys
865 870 875 880
Arg Arg Ser Ser
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 抗GM2 CAR (VL15VH)_HSV tk
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ctgagcggca cagctgtgcc tcctcaaggc gctgagcccc agagcaacgc tggacccaga 3540
cctcacatcg gcgataccct gttcaccctg tttagagccc ctgagctcct ggcccctaac 3600
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cagctgacct ccggcatggt gcagacccac gtgaccaccc ctggaagcat ccccacaatc 3780
tgcgacctgg ccaggacctt tgccagagaa atgggagaag ccaac 3825
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<211> 1275
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗GM2 CAR (VL15VH)_HSV tk
<400> 48
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
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Ala His Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
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Ser Pro Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val
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100 105 110
Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu
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210 215 220
Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Gly
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Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile
275 280 285
Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala
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Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr
305 310 315 320
Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu
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355 360 365
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595 600 605
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Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe
645 650 655
Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly
660 665 670
Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu
675 680 685
Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly
690 695 700
Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu
705 710 715 720
Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu
725 730 735
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740 745 750
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Tyr Ile Val Arg Asn Phe His Tyr Leu Leu Ile Lys Asp Gly Cys Arg
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Val Pro Ala Val Val Phe Thr Thr Leu Arg Gly Arg Gln Leu Cys Ala
835 840 845
Pro Pro Asp Gln Pro Trp Val Glu Arg Ile Ile Gln Arg Leu Gln Arg
850 855 860
Thr Ser Ala Lys Met Lys Arg Arg Ser Ser Gly Ser Gly Val Lys Gln
865 870 875 880
Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn
885 890 895
Pro Gly Pro Met Ala Ser Tyr Pro Gly His Gln His Ala Ser Ala Phe
900 905 910
Asp Gln Ala Ala Arg Ser Arg Gly His Ser Asn Arg Arg Thr Ala Leu
915 920 925
Arg Pro Arg Arg Gln Gln Glu Ala Thr Glu Val Arg Pro Glu Gln Lys
930 935 940
Met Pro Thr Leu Leu Arg Val Tyr Ile Asp Gly Pro His Gly Met Gly
945 950 955 960
Lys Thr Thr Thr Thr Gln Leu Leu Val Ala Leu Gly Ser Arg Asp Asp
965 970 975
Ile Val Tyr Val Pro Glu Pro Met Thr Tyr Trp Arg Val Leu Gly Ala
980 985 990
Ser Glu Thr Ile Ala Asn Ile Tyr Thr Thr Gln His Arg Leu Asp Gln
995 1000 1005
Gly Glu Ile Ser Ala Gly Asp Ala Ala Val Val Met Thr Ser Ala
1010 1015 1020
Gln Ile Thr Met Gly Met Pro Tyr Ala Val Thr Asp Ala Val Leu
1025 1030 1035
Ala Pro His Ile Gly Gly Glu Ala Gly Ser Ser His Ala Pro Pro
1040 1045 1050
Pro Ala Leu Thr Leu Ile Phe Asp Arg His Pro Ile Ala Ala Leu
1055 1060 1065
Leu Cys Tyr Pro Ala Ala Arg Tyr Leu Met Gly Ser Met Thr Pro
1070 1075 1080
Gln Ala Val Leu Ala Phe Val Ala Leu Ile Pro Pro Thr Leu Pro
1085 1090 1095
Gly Thr Asn Ile Val Leu Gly Ala Leu Pro Glu Asp Arg His Ile
1100 1105 1110
Asp Arg Leu Ala Lys Arg Gln Arg Pro Gly Glu Arg Leu Asp Leu
1115 1120 1125
Ala Met Leu Ala Ala Ile Arg Arg Val Tyr Gly Leu Leu Ala Asn
1130 1135 1140
Thr Val Arg Tyr Leu Gln Cys Gly Gly Ser Trp Arg Glu Asp Trp
1145 1150 1155
Gly Gln Leu Ser Gly Thr Ala Val Pro Pro Gln Gly Ala Glu Pro
1160 1165 1170
Gln Ser Asn Ala Gly Pro Arg Pro His Ile Gly Asp Thr Leu Phe
1175 1180 1185
Thr Leu Phe Arg Ala Pro Glu Leu Leu Ala Pro Asn Gly Asp Leu
1190 1195 1200
Tyr Asn Val Phe Ala Trp Ala Leu Asp Val Leu Ala Lys Arg Leu
1205 1210 1215
Arg Ser Met His Val Phe Ile Leu Asp Tyr Asp Gln Ser Pro Ala
1220 1225 1230
Gly Cys Arg Asp Ala Leu Leu Gln Leu Thr Ser Gly Met Val Gln
1235 1240 1245
Thr His Val Thr Thr Pro Gly Ser Ile Pro Thr Ile Cys Asp Leu
1250 1255 1260
Ala Arg Thr Phe Ala Arg Glu Met Gly Glu Ala Asn
1265 1270 1275
<210> 49
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL25VH的抗GM2抗体的VH区
<400> 49
gaagtccagc tggtgcagag cggcgctgag gtgaagaagc ctggcgccag cgtcaaggtg 60
agctgtaagg cctccggcta caccttcacc gactacaaca tggattgggt gaagcagagc 120
cccggacagg gcctggagtg gatgggctac atctacccca acaacggcgg caccggctac 180
aaccagaaat tcaagtccaa ggtgaccatc accgtggaca ccagcacatc caccgcctac 240
atggaactgc acagcctgag gtccgaggac acagccgtgt actactgcgc tacctacggc 300
cactactacg gctacatgtt cgcttactgg ggacagggca ccctggtgac cgtgagctcc 360
<210> 50
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL25VH的抗GM2抗体的VL区
<400> 50
gatatccaac tgacccagtc cccttccagc ctgagcgctt cccccggaga cagggtgaca 60
attacctgca gcgccagctc ctccgtgagc tacatgcact ggttccagca gaagcccggc 120
aaggccccca agctgtggat ctactccaca agcaacctgg cctccggcgt gcctgccaga 180
tttagcggaa gcggcagcgg cacatcctac agcctgacca tctccaggct gcagcccgag 240
gacatcgcca catactactg ccagcagagg tccagctacc cttacacatt cggaggcggc 300
accaaggtgg agatcaag 318
<210> 51
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH15VL的抗GM2抗体的VH区
<400> 51
gaggtgcagc tggtgcagtc cggagccgag gtgaagaagc ctggcgccag cgtgaaggtg 60
agctgtaagg cctccggcta caccttcacc gactacaaca tggactgggt caagcagagc 120
cctggccagg gcctggagtg gatgggctat atctacccca acaacggcgg caccggctac 180
aaccagaagt tcaagagcaa ggtcaccatc accgtggaca cctccacctc cacagcctac 240
atggagctgc acagcctgag gagcgaggat accgccgtgt actactgcgc tacctacggc 300
cattactacg gatacatgtt cgcctactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtgtcctcc 360
<210> 52
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH15VL的抗GM2抗体的VL区
<400> 52
gacatccagc tgacacaatc ccccagcagc ctgagcgcta gccccggcga tagggtgaca 60
attacctgca gcgcctccag ctccgtgtcc tacatgcact ggtttcagca aaagcccggc 120
aaggccccta agctgtggat ctacagcacc agcaacctgg ccagcggagt gcctgccaga 180
tttagcggca gcggcagcgg caccagctac agcctgacca tcagcagact gcagcccgag 240
gatatcgcca cctactactg ccagcagagg agctcctacc cctacacatt cggcggcgga 300
accaaggtgg agatcaag 318
<210> 53
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH25VL的抗GM2抗体的VH区
<400> 53
gaagtgcagc tggtgcagtc cggagctgag gtgaagaagc ccggcgccag cgtgaaggtc 60
agctgcaaag ccagcggcta taccttcacc gactacaaca tggactgggt gaagcagagc 120
cccggccaag gcctcgagtg gatgggatac atctacccca acaacggcgg caccggctac 180
aaccagaagt tcaagagcaa ggtgaccatc accgtggaca catccacaag caccgcctat 240
atggagctcc acagcctgag gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc cacctacggc 300
cactactacg gctatatgtt cgcctactgg ggccagggca ccctggtgac agtgtcctcc 360
<210> 54
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH25VL的抗GM2抗体的VL区
<400> 54
gatatccagc tgacacagag ccctagctcc ctgagcgcta gccctggcga cagagtgacc 60
atcacctgca gcgccagctc cagcgtgagc tacatgcact ggttccagca gaaacccggc 120
aaggccccca agctgtggat ctacagcacc agcaatctgg ctagcggcgt gcctgccagg 180
tttagcggat ccggcagcgg cacctcctac tccctgacaa tctccagact gcagcccgag 240
gacatcgcca cctactactg ccaacagagg tcctcctacc cctacacctt cggcggcggc 300
accaaagtgg agatcaag 318
<210> 55
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH15VL的接头15
<400> 55
ggaggaggag gaagcggagg cggcggctcc ggcggaggcg gatcc 45
<210> 56
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH15VL的接头15
<400> 56
tccagcgccg atgatgccaa gaaggatgcc gccaaaaagg acgacgctaa gaaggatgac 60
gccaagaagg acggc 75
<210> 57
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号肽
<400> 57
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Ala His Ser
<210> 58
<211> 531
<212> DNA
<213> 智人
<400> 58
atgttccatg tttcttttag gtatatcttt ggacttcctc ccctgatcct tgttctgttg 60
ccagtagcat catctgattg tgatattgaa ggtaaagatg gcaaacaata tgagagtgtt 120
ctaatggtca gcatcgatca attattggac agcatgaaag aaattggtag caattgcctg 180
aataatgaat ttaacttttt taaaagacat atctgtgatg ctaataagga aggtatgttt 240
ttattccgtg ctgctcgcaa gttgaggcaa tttcttaaaa tgaatagcac tggtgatttt 300
gatctccact tattaaaagt ttcagaaggc acaacaatac tgttgaactg cactggccag 360
gttaaaggaa gaaaaccagc tgccctgggt gaagcccaac caacaaagag tttggaagaa 420
aataaatctt taaaggaaca gaaaaaactg aatgacttgt gtttcctaaa gagactatta 480
caagagataa aaacttgttg gaataaaatt ttgatgggca ctaaagaaca c 531
<210> 59
<211> 177
<212> PRT
<213> 智人
<400> 59
Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile
1 5 10 15
Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys
20 25 30
Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu
35 40 45
Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe
50 55 60
Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe
65 70 75 80
Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser
85 90 95
Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr
100 105 110
Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala
115 120 125
Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu
130 135 140
Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu
145 150 155 160
Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu
165 170 175
His
<210> 60
<211> 294
<212> DNA
<213> 智人
<400> 60
atggccctgc tactggccct cagcctgctg gttctctgga cttccccagc cccaactctg 60
agtggcacca atgatgctga agactgctgc ctgtctgtga cccagaaacc catccctggg 120
tacatcgtga ggaacttcca ctaccttctc atcaaggatg gctgcagggt gcctgctgta 180
gtgttcacca cactgagggg ccgccagctc tgtgcacccc cagaccagcc ctgggtagaa 240
cgcatcatcc agagactgca gaggacctca gccaagatga agcgccgcag cagt 294
<210> 61
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 61
Met Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ser Leu Leu Val Leu Trp Thr Ser Pro
1 5 10 15
Ala Pro Thr Leu Ser Gly Thr Asn Asp Ala Glu Asp Cys Cys Leu Ser
20 25 30
Val Thr Gln Lys Pro Ile Pro Gly Tyr Ile Val Arg Asn Phe His Tyr
35 40 45
Leu Leu Ile Lys Asp Gly Cys Arg Val Pro Ala Val Val Phe Thr Thr
50 55 60
Leu Arg Gly Arg Gln Leu Cys Ala Pro Pro Asp Gln Pro Trp Val Glu
65 70 75 80
Arg Ile Ile Gln Arg Leu Gln Arg Thr Ser Ala Lys Met Lys Arg Arg
85 90 95
Ser Ser
<210> 62
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F2A
<400> 62
Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala
1 5 10 15
Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 63
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗GM2抗体VH区的CDR1
<400> 63
Asp Tyr Asn Met Asp
1 5
<210> 64
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗GM2抗体VH区的CDR2
<400> 64
Tyr Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 65
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗GM2抗体VH区的CDR3
<400> 65
Tyr Gly His Tyr Tyr Gly Tyr Met Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 66
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗GM2抗体VL区的CDR1
<400> 66
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His
1 5 10
<210> 67
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗GM2抗体VL区的CDR2
<400> 67
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 68
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗GM2抗体VL区的CDR3
<400> 68
Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5

Claims (21)

1.一种嵌合抗原受体，包括目标抗原结合区域、膜贯通区域、T细胞活化信号传递区域，其中，所述目标抗原是神经节苷脂GM2。
2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述目标抗原结合区域包括抗神经节苷脂GM2抗体的重链可变区域和轻链可变区域。
3.如权利要求2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗神经节苷脂GM2抗体是从由以下(a)-(c)组成的组中选择的抗体：
(a)包括重链可变区域和轻链可变区域，并且具有对神经节苷脂GM2的结合能力的抗体，其中，所述重链可变区域包含序列号2记载的氨基酸序列构成的重链可变区域的CDR1、CDR2和CDR3，所述轻链可变区域包含序列号4记载的氨基酸序列构成的轻链可变区域的CDR1、CDR2和CDR3；
(b)包括重链可变区域和轻链可变区域，并且具有对神经节苷脂GM2的结合能力的抗体，其中，所述重链可变区域由序列号2记载的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸变异而成的氨基酸序列构成，所述轻链可变区域由序列号4记载的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸变异而成的氨基酸序列构成；以及
(c)包括重链可变区域和轻链可变区域，并且具有对神经节苷脂GM2的结合能力的抗体，其中，所述重链可变区域由与序列号2记载的氨基酸序列具有70％以上的序列同一性的氨基酸序列构成，所述轻链可变区域由与序列号4记载的氨基酸序列具有70％以上的序列同一性的氨基酸序列构成。
4.如权利要求3所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述重链可变区域包括序列号2记载的氨基酸序列，所述轻链可变区域包括序列号4记载的氨基酸序列。
5.如权利要求2-4中任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗神经节苷脂GM2抗体是单链抗体(scFv)。
6.如权利要求5所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述scFv是从以下(a)-(c)组成的组中选择的多肽：
(a)包括从序列号10、12、14和16组成的组选择的氨基酸序列的多肽；
(b)由与序列号10、12、14和16组成的组选择的氨基酸序列具有70％以上的序列同一性的氨基酸序列构成并且具有相对于神经节苷脂GM2的结合能力的多肽；以及
(c)由序列号10、12、14和16组成的组选择的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸变异而成的氨基酸序列构成并且具有相对于神经节苷脂GM2的结合能力的多肽。
7.一种细胞，表达权利要求1-6中任一项所述的嵌合抗原受体。
8.如权利要求4所述的细胞，其特征在于，所述细胞还表达IL-7和CCL19中的至少一种。
9.如权利要求8所述的细胞，其特征在于，所述细胞表达IL-7和CCL19两者。
10.如权利要求7-9中任一项所述的细胞，其特征在于，所述细胞是免疫细胞。
11.一种多核苷酸，包括编码权利要求1-6中任一项所述的嵌合抗原受体的碱基序列。
12.如权利要求11所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸还包括编码IL-7的碱基序列和编码CCL19的碱基序列中的至少一种。
13.如权利要求12所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包括编码IL-7的碱基序列和编码CCL19的碱基序列两者。
14.一种载体，包括编码权利要求1-6中任一项所述的嵌合抗原受体的碱基序列。
15.如权利要求9所述的载体，其特征在于，所述载体还包括编码IL-7的碱基序列和编码CCL19的碱基序列中的至少一种。
16.如权利要求15所述的载体，其特征在于，所述载体包括编码IL-7的碱基序列和编码CCL19的碱基序列两者。
17.一种表达嵌合抗原受体的细胞的制造方法，包括将多核苷酸或载体导入细胞，所述多核苷酸或载体包括编码权利要求1-6中任一项所述的嵌合抗原受体的碱基序列。
18.如权利要求17所述的表达嵌合抗原受体的细胞的制造方法，其特征在于，还包括将包括编码IL-7的碱基序列和编码CCL19的碱基序列中的至少一种的多核苷酸或载体导入细胞。
19.如权利要求18所述的表达嵌合抗原受体的细胞的制造方法，其特征在于，还包括将包括编码IL-7的碱基序列和编码CCL19的碱基序列两者的多核苷酸或载体导入细胞。
20.一种药物组合物，包括权利要求7-10中任一项所述的细胞。
21.如权利要求20所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物用于治疗或预防肿瘤。
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