KR102333377B1 - 키메라 항원 수용체 - Google Patents

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노일 이뮨 바이오테크 가부시키가이샤
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Abstract

표적 항원 결합 영역과, 막관통 영역과, T세포 활성화 시그널 전달 영역을 포함하고, 상기 표적 항원이 강글리오시드(ganglioside) GM2인, 키메라 항원 수용체.

Description

키메라 항원 수용체
본 발명은, 키메라 항원 수용체, 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포, 및 키메라 항원 수용체를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 벡터 등에 관한 것이다.
본 출원은 2017년 3월 27일에 출원된 일본 특허출원 2017-061461호에 기초하는 우선권을 주장하고, 그 내용을 여기에 원용한다.
키메라 항원 수용체(Chimeric Antigen Receptor:이하, 'CAR'라고도 한다)는, 암세포의 세포 표면 항원을 인식하는 단일 가닥 항체와, T세포의 활성화를 유도하는 시그널 전달 영역을 융합시킨 인공적인 키메라 단백질이다. 예를 들면, 종양 반응성을 갖지 않는 통상의 말초혈 T세포(말초혈 T임파구)에 CAR을 코딩하는 유전자를 도입함으로써, CAR을 발현 가능한 CAR 발현 T세포(이하, 'CAR-T 세포'라고도 한다)를 대량으로 제작하는 것이 가능해진다. 이와 같은 CAR-T 세포는 종양 반응성을 갖고, 주요 조직 적합 유전자 복합체(MHC)와의 상호작용에 의존하지 않고 암세포의 상해를 유도하는 것이 가능해진다.
CAR-T 세포의 투여에 의한 암면역 요법, 보다 구체적으로는, 환자로부터 T세포를 채취하고, 이 T세포에 CAR을 코딩하는 유전자를 도입해 증폭시켜 다시 환자에게 이입하는 요법은, 현재 전 세계에 걸쳐 임상시험이 진행되고 있고, 백혈병이나 임파종 등의 조혈기 악성 종양 등에서 유효성을 나타내는 결과가 얻어지고 있다.
그러나, CAR-T 세포에 의한 암면역 요법에서 유효한 결과가 얻어지고 있는 것은, 조혈기 악성 종양에 대해서만이고, 현재, 고형 종양에 대해서는 유효성을 나타내는 결과를 얻지 못하고 있다. 고형 종양에 대해 유효한 CAR을 개발하기 위해서는 표적 항원의 선택이 중요하여, 고형 종양에 대해 적용 가능한 표적 항원의 탐색이 요구되고 있다.
한편, CAR-T 세포 요법이 고형 종양에 대해 효과를 얻지 못하고 있는 요인으로, CAR-T 세포의 생체내에서의 생존률이 낮다는 점, 종양 국소에의 집적이 낮다는 점, 종양 세포가 분비하는 면역 억제 인자 등에 의한 활성 저해 등을 생각할 수 있다. 이와 같은 문제를 해결하는 방법으로, CAR을 코딩하는 핵산과 함께, T세포의 면역 기능 촉진 인자를 코딩하는 핵산을, T세포에 도입하는 방법이 보고되고 있다(특허 문헌 1).
특허 문헌 1:국제 공개 제2016/056228호
특허 문헌 1에서는, 인간 고형 종양에 발현하는 항원을 표적으로 한 CAR-T 세포의 효과는 확인되고 있지 않기 때문에, 이와 같은 항원에 대해 유효성을 나타내는 CAR-T 세포가 요구되고 있다.
따라서, 본 발명은, 고형 종양 항원을 표적 항원으로 하는 신규 CAR, 및 고형 종양에 대해 유효한 CAR-T 세포를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 다음과 같은 형태를 포함한다.
(1) 표적 항원 결합 영역과, 막관통 영역과, T세포 활성화 시그널 전달 영역을 포함하고, 상기 표적 항원이 강글리오시드(ganglioside) GM2인, 키메라 항원 수용체.
(2) 상기 표적 항원 결합 영역이 항강글리오시드 GM2 항체의 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 포함하는, (1)에 기재된 키메라 항원 수용체.
(3) 상기 항강글리오시드 GM2 항체가 하기 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항체인, (2)에 기재된 키메라 항원 수용체:
(a) 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 또한 강글리오시드 GM2에 대한 결합능을 갖는 항체;
(b) 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 복수 개의 아미노산이 변이한 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역과, 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 복수 개의 아미노산이 변이한 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 또한 강글리오시드 GM2에 대한 결합능을 갖는 항체; 및
(c) 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역과, 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 또한 강글리오시드 GM2에 대한 결합능을 갖는 항체.
(4) 상기 중쇄 가변 영역이 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역이 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, (3)에 기재된 키메라 항원 수용체.
(5) 상기 항강글리오시드 GM2 항체가 단일 가닥 항체(scFv)인, (2)∼(4) 중 어느 하나에 기재된 키메라 항원 수용체.
(6) 상기 scFv가 하기 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리펩티드인, (5)에 기재된 키메라 항원 수용체:
(a) 서열 번호 10, 12, 14 및 16으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
(b) 서열 번호 10, 12, 14 및 16으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 강글리오시드 GM2에 대한 결합능을 갖는 폴리펩티드; 및
(c) 서열 번호 10, 12, 14 및 16으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에서 1 또는 복수 개의 아미노산이 변이한 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 강글리오시드 GM2에 대한 결합능을 갖는 폴리펩티드.
(7) 상기 막관통 영역이 CD8의 막관통 영역인, (1)∼(6) 중 어느 하나에 기재된 키메라 항원 수용체.
(8) 상기 CD8의 막관통 영역이 하기 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함하는, (7)에 기재된 키메라 항원 수용체:
(a) 서열 번호 20에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
(b) 서열 번호 20에 기재된 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 막관통능을 갖는 폴리펩티드; 및
(c) 서열 번호 20에 기재된 아미노산 서열에서, 1 또는 복수 개의 아미노산이 변이한 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 막관통능을 갖는 폴리펩티드.
(9) T세포 활성화 시그널 전달 영역이 CD3ζ의 T세포 활성화 시그널 전달 영역인, (1)∼(8) 중 어느 하나에 기재된 키메라 항원 수용체.
(10) 상기 CD3ζ의 T세포 활성화 시그널 전달 영역이 하기 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함하는, (9)에 기재된 키메라 항원 수용체:
(a) 서열 번호 28에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
(b) 서열 번호 28에 기재된 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 동일성(상동성)을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 T세포 활성화 시그널 전달능을 갖는 폴리펩티드; 및
(c) 서열 번호 28에 기재된 아미노산 서열에서, 1 또는 복수 개의 아미노산이 변이한 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 T세포 활성화 시그널 전달능을 갖는 폴리펩티드.
(11) 상기 T세포 활성화 시그널 전달 영역이 CD28의 T세포 활성화 시그널 전달 영역 및 4-1BB의 T세포 활성화 시그널 전달 영역 중 적어도 하나를 더 포함하는, (9) 또는 (10)에 기재된 키메라 항원 수용체.
(12) 상기 CD28의 T세포 활성화 시그널 전달 영역이 하기 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함하는, (11)에 기재된 키메라 항원 수용체:
(a) 서열 번호 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
(b) 서열 번호 24에 기재된 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 동일성(상동성)을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 T세포 활성화 시그널 전달능을 갖는 폴리펩티드; 및
(c) 서열 번호 24에 기재된 아미노산 서열에서, 1 또는 복수 개의 아미노산이 변이한 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 T세포 활성화 시그널 전달능을 갖는 폴리펩티드.
(13) 상기 4-1BB의 T세포 활성화 시그널 전달 영역이 하기 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함하는, (11)에 기재된 키메라 항원 수용체:
(a) 서열 번호 26에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
(b) 서열 번호 26에 기재된 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 동일성(상동성)을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 T세포 활성화 시그널 전달능을 갖는 폴리펩티드; 및
(c) 서열 번호 26에 기재된 아미노산 서열에서, 1 또는 복수 개의 아미노산이 변이한 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 T세포 활성화 시그널 전달능을 갖는 폴리펩티드.
(14) 상기 T세포 활성화 시그널 전달 영역이 CD28, 4-1BB 및 CD3ζ의 T세포 활성화 시그널 전달 영역을 포함하고, N말단측으로부터 CD28, 4-1BB 및 CD3ζ의 순서로 배치되어 있는, (11)∼(13) 중 어느 하나에 기재된 키메라 항원 수용체.
(15) (1)∼(14) 중 어느 하나에 기재된 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포.
(16) IL-7 및 CCL19 중 적어도 하나를 더 발현하는, (15)에 기재된 세포.
(17) IL-7 및 CCL19 모두를 발현하는, (16)에 기재된 세포.
(18) 상기 IL-7이 하기 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함하는, (16) 또는 (17)에 기재된 세포:
(a) 서열 번호 59에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
(b) 서열 번호 59에 기재된 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, T세포의 면역 기능 촉진 기능을 갖는 폴리펩티드; 및
(c) 서열 번호 59에 기재된 아미노산 서열에서, 1 또는 복수 개의 아미노산이 변이한 아미노산 서열로 이루어지고, T세포의 면역 기능 촉진 기능을 갖는 폴리펩티드.
(19) 상기 CCL19가 하기 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함하는, (16)∼(18) 중 어느 하나에 기재된 세포:
(a) 서열 번호 61에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
(b) 서열 번호 61에 기재된 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, T세포의 면역 기능 촉진 기능을 갖는 폴리펩티드; 및
(c) 서열 번호 61에 기재된 아미노산 서열에서, 1 또는 복수 개의 아미노산이 변이한 아미노산 서열로 이루어지고, T세포의 면역 기능 촉진 기능을 갖는 폴리펩티드.
(20) 상기 세포가 면역 세포인, (15)∼(19) 중 어느 하나에 기재된 세포.
(21) 상기 면역 세포가 T세포인, (20)에 기재된 세포.
(22) (1)∼(14) 중 어느 하나에 기재된 키메라 항원 수용체를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리 뉴클레오티드.
(23) IL-7을 코딩하는 염기 서열 및 CCL19를 코딩하는 염기 서열 중 적어도 하나를 더 포함하는, (22)에 기재된 폴리 뉴클레오티드.
(24) IL-7을 코딩하는 염기 서열 및 CCL19를 코딩하는 염기 서열 모두를 포함하는, (23)에 기재된 폴리 뉴클레오티드.
(25) (1)∼(14) 중 어느 하나에 기재된 키메라 항원 수용체를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 벡터.
(26) IL-7을 코딩하는 염기 서열 및 CCL19를 코딩하는 염기 서열 중 적어도 하나를 더 포함하는, (25)에 기재된 벡터.
(27) IL-7을 코딩하는 염기 서열 및 CCL19를 코딩하는 염기 서열 모두를 포함하는, (26)에 기재된 벡터.
(28) (1)∼(14) 중 어느 하나에 기재된 키메라 항원 수용체를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리 뉴클레오티드 또는 벡터를 세포에 도입하는 것을 포함하는, 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포의 제조 방법.
(29) IL-7을 코딩하는 염기 서열 및 CCL19를 코딩하는 염기 서열 중 적어도 하나를 포함하는 폴리 뉴클레오티드 또는 벡터를 세포에 더 도입하는 것을 포함하는, (28)에 기재된 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포의 제조 방법.
(30) IL-7을 코딩하는 염기 서열 및 CCL19를 코딩하는 염기 서열 모두를 포함하는 폴리 뉴클레오티드 또는 벡터를 세포에 도입하는 것을 포함하는, (29)에 기재된 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포의 제조 방법.
(31) (15)∼(20) 중 어느 하나에 기재된 세포를 함유하는 의약 조성물.
(32) 종양을 치료 또는 예방하기 위한 의약 조성물인, (31)에 기재된 의약 조성물.
본 발명에 의하면, 고형 종양 항원을 표적 항원으로 하는 신규 CAR, 및 고형 종양에 대해 유효한 CAR-T 세포가 제공된다.
도 1a는 항GM2 CAR 구조물(construct)을 나타낸 모식도이다.
도 1b는 IL-7/CCL19 발현-항GM2 CAR 벡터 및 상기 벡터가 도입된 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포를 나타낸 모식도이다.
도 2는 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포에서의 CAR의 발현 레벨을 플로사이토메트리(flow cytometry)로 확인한 결과를 나타낸 도면이다. 왼쪽은 비유전자 도입 T세포, 오른쪽은 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포에서의 결과이다.
도 3은 항GM2 CAR 발현 T세포의 배양 상청액 중의 IL-7 및 CCL19의 농도를, ELISA에 의해 측정한 결과를 나타낸 도면이다. 도면 중, 'GM2 CAR'은 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포를 나타내고, 'non infection'은 비유전자 도입 T세포를 나타낸다(이후의 도면에서도 동일하다).
도 4는 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포를 이용한 종양 세포 상해성 시험 및 공배양 시험의 시험 스케줄을 나타낸 도면이다.
도 5a는 4 종류의 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포를 이용한 크롬 방출 시험의 결과를 나타낸 도면이다. 도 5a는 악성중피종 세포주(Y-meso8A, MSTO211H)를 타겟 세포로 한 시험의 결과이다. 도면 중, 'VL15VH', 'VL25VH', 'VH15VL' 및 'VH25VL'은, 각각, 당해 서열을 항GM2 CAR의 scFv 서열로서 포함하는 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포에서의 결과를 나타낸다(이후의 도면에서도 동일하다).
도 5b는 4 종류의 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포를 이용한 크롬 방출 시험의 결과를 나타낸 도면이다. 도 5b는 골수종 세포주(KMS-11, KMS-28PE)를 타겟 세포로 한 시험의 결과이다.
도 6a는 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포와 대조군 CAR-T 세포의 크롬 방출 시험의 결과를 비교한 도면이다. 도 6a는 악성중피종 세포주(Y-meso8A)를 타겟 세포로 한 시험의 결과이다. 도면 중, 'FITC CAR-T'는, 음성 대조군으로서 이용한 항FITC CAR-T 세포를 나타낸다(이후의 도면에서도 동일하다).
도 6b는 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포와 대조군 CAR-T 세포의 크롬 방출 시험의 결과를 비교한 도면이다. 도 6b는 골수종 세포주(KMS11)를 타겟 세포로 한 시험의 결과이다.
도 6c는 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포와 대조군 CAR-T 세포의 크롬 방출 시험의 결과를 비교한 도면이다. 도 6c는 대장암 세포주(SW480)를 타겟 세포로 한 시험의 결과이다.
도 7은 GM2 양성의 악성중피종 세포주(Y-meso8A)와 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포 또는 대조군 세포의 공배양 시험의 결과를 나타낸 도면이다. 도면 중, 'tumor only'는, 종양 세포만을 배양한 것이다(이후의 도면에서도 동일하다).
도 8은 GM2 양성의 악성중피종 세포주(MSTO221H)와 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포 또는 대조군 세포의 공배양 시험의 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 GM2 음성의 대장암 세포주(SW480)와 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포 또는 대조군 세포의 공배양 시험의 결과를 나타낸 도면이다.
도 10은 각 종양 세포주와 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포 또는 대조군 세포의 공배양 시험의 배양 상청액 중의 IFN-γ를 ELISA로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 11a는 루시퍼라아제(luciferase)를 발현하는 MSTO211H를 흉강내 투여한 면역 부전 마우스에, 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포 또는 비유전자 도입 T세포를 투여했을 때의 종양 증식 추이를 나타낸 도면이다.
도 11b는 루시퍼라아제를 발현하는 MSTO211H를 복강내 투여한 면역 부전 마우스에, 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포 또는 비유전자 도입 T세포를 투여했을 때의 종양 증식 추이를 나타낸 도면이다.
도 12는 루시퍼라아제를 발현하는 MSTO211H를 흉강내 투여한 면역 부전 마우스에, 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포 또는 비유전자 도입 T세포를 투여했을 때의 종양 증식 추이를 해석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 13은 루시퍼라아제를 발현하는 MSTO211H를 흉강내 투여한 면역 부전 마우스에, 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포, 항GM2 CAR 발현 T세포 또는 비유전자 도입 T세포를 투여했을 때의 종양 증식 추이를 해석한 결과를 나타낸 도면이다. 도면 중, '×'는 마우스가 사망한 것을 나타낸다.
도 14는 루시퍼라아제를 발현하는 MSTO211H를 흉강내 투여한 면역 부전 마우스에, 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포, 항GM2 CAR 발현 T세포 또는 비유전자 도입 T세포를 투여했을 때의 종양 증식 추이에 대한 효과를 해석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 15는 루시퍼라아제를 발현하는 MSTO211H를 흉강내 투여한 면역 부전 마우스에, 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포, 항GM2 CAR 발현 T세포 또는 비유전자 도입 T세포를 투여했을 때의 마우스 생존률에 대한 효과를 해석한 결과를 나타낸 도면이다.
본 발명에 의해 제공되는 폴리펩티드, 폴리 뉴클레오티드, 벡터 및 세포는, 단리된 상태일 수 있다. 즉, 본 명세서에서 기재하는 폴리펩티드, 폴리 뉴클레오티드, 벡터 및 세포는, 단리된 폴리펩티드, 단리된 폴리 뉴클레오티드, 단리된 벡터 및 단리된 세포일 수 있다.
[키메라 항원 수용체(항GM2 CAR)]
일 실시 형태에 있어서, 본 발명은, 표적 항원 결합 영역과, 막관통 영역과, T세포 활성화 시그널 전달 영역을 포함하고, 상기 표적 항원이 강글리오시드 GM2인, 키메라 항원 수용체를 제공한다.
본 명세서에 있어서, '키메라 항원 수용체(CAR)'란, 표적 항원 결합 영역과, 막관통 영역과, T세포 활성화 시그널 전달 영역을 포함하는, 키메라 단백질을 의미한다. 한편, 키메라 단백질이란, 2종 이상의 이종 단백질 유래의 서열을 포함하는 단백질을 의미한다. CAR은, 상기 3개의 영역만을 포함하는 것으로 한정되지 않고, 다른 영역을 포함하는 것도 포함한다.
＜표적 항원 결합 영역＞
본 실시 형태의 CAR은, 표적 항원이 강글리오시드 GM2(이하, 단순히 'GM2'라고도 한다)인, 표적 항원 결합 영역을 포함한다.
'표적 항원 결합 영역'이란, CAR이 T세포에서 발현했을 때, 세포 외에서 표적 항원에 결합하는 세포외 영역을 의미한다. CAR-T 세포에서 발현한 CAR은 세포막으로 이행해, 세포 외에 위치하는 표적 항원 결합 영역과 세포 내에 위치하는 T세포 활성화 시그널 전달 영역이 세포막을 관통하는 막관통 영역을 개재해 연결되어 있는 상태가 된다. CAR-T 세포가 표적 항원을 막항원으로서 갖는 세포에 접하면, 표적 항원 결합 영역이 당해 표적 항원에 결합하고, 이에 따라 T세포 활성화 시그널 전달 영역으로부터 T세포 내에 T세포 활성화 시그널이 전달되어 T세포가 활성화 된다.
본 실시 형태의 CAR에 있어서, 표적 항원 결합 영역이 결합하는 표적 항원은 GM2이다.
GM2는 시알산(sialic acid)을 갖는 당지질인 강글리오시드의 일종이다. 강글리오시드는 동물의 세포막을 구성하고, 친수성 측쇄인 당쇄와 소수성 측쇄인 스핑고신(sphingosine) 및 지방산으로 구성되는 분자이다. 강글리오시드는 시알산의 결합형, 결합수, 및 비환원 말단에 결합하는 N-아세틸갈락토사민(GalNAc) 및 갈락토오스(Gal)의 결합의 유무에 의해 분류된다. GM2는 GalNAcβ1-4(SAα2-3) Galβ1-4Glcβ1-1 Ceramide의 당쇄 구조를 갖는 강글리오시드의 하나이다.
강글리오시드의 종류와 발현량은 세포종, 장기종, 동물종 등에 의해 다르고, 세포가 암화(canceration)하는 과정에서 강글리오시드의 발현이 양적 및 질적으로 변화하는 것이 알려져 있다(Cancer Res 45: 2405-14(1985)). GM2는 정상세포에서는 거의 발현이 인정되지 않지만, 폐암, 신경아종, 신경교종, 흑색종(melanoma), 악성중피종, 골수종 등의 종양에서 발현하는 것이 보고되고 있다(Cancer Res 45: 2405-14(1985); Cancer Res 50: 7444-9(1990); Cancer Sci vol. 102 no. 12: 2157-2163; Cancer Sci vol. 106 no. 1: 102-107(2015)).
표적 항원 결합 영역은 GM2에 특이적으로 결합 가능한 것이면 특별히 한정되지 않지만, GM2에 특이적으로 결합 가능한 단일 클론 항체(이하, '항GM2 항체'라고도 한다)의 항원 결합 영역을 포함하는 것이 바람직하다. 항체의 '항원 결합 영역'이란, 항체에서 항원과의 결합에 관여하는 영역을 가리키고, 구체적으로는 상보성 결정 영역(Complementarity Determining Region: CDR)을 포함하는 영역을 가리킨다. 항체의 항원 결합 영역은 당해 항체의 적어도 1개의 CDR을 포함한다. 바람직한 형태에 있어서, 항체의 항원 결합 영역은 당해 항체의 6개의 CDR을 모두 포함한다. 한편, CDR은, CDR의 정의로서 알려진 임의의 정의로 결정할 수 있고, 예를 들면 Kabat, Chothia, AbM, cotact 등에 의한 정의를 이용할 수 있다. 바람직하게는, Kabat의 정의에 의한 CDR을 들 수 있다.
표적 항원 결합 영역에 사용 가능한 항GM2 항체는, 특별히 한정되지 않고, 공지의 것이라도 되고, 새롭게 제작한 것이라도 된다. 항GM2 항체를 새롭게 제작하는 경우, 항GM2 항체의 제작은 공지의 방법으로 실시하면 된다. 예를 들면, 동물을 GM2로 면역해 하이브리도마(hybridoma)를 얻는 방법, 파지 디스플레이(phage display)법 등을 이용할 수 있다.
항GM2 항체가 유래하는 생물은, 특별히 한정되지 않지만, 인간 항체인 것이 바람직하다. 인간 항GM2 항체의 예로는, 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열을 중쇄 가변(VH) 영역으로 갖고, 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 경쇄 가변(VL) 영역으로 갖는 항체 등을 들 수 있다. 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 VH 영역의 Kabat의 정의에 의한 CDR 1∼3의 아미노산 서열을, 각각, 서열 번호 63∼65에 나타낸다. 또한, 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 VL 영역의 Kabat의 정의에 의한 CDR 1∼3의 아미노산 서열을, 각각, 서열 번호 66∼68에 나타낸다.
바람직한 형태에 있어서, 표적 항원 결합 영역은 항GM2 항체의 VH 영역과 VL 영역을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들면, 항GM2 항체의 VH 영역과 VL 영역을 포함하는 단일 가닥 항체(scFv)를 포함하는 폴리펩티드는, 표적 항원 결합 영역의 바람직한 예이다. scFv는 항체의 VH 영역과 VL 영역을 펩티드 링커(peptide linker)로 연결한 폴리펩티드이며, CAR의 표적 항원 결합 영역으로서 일반적으로 이용되고 있다.
scFv를 이용하는 경우, VH 영역과 VL 영역을 연결하는 펩티드 링커는, 특별히 한정되지 않고, scFv에 일반적으로 이용되는 것을 사용하면 된다. 펩티드 링커의 예로는, 예를 들면 링커 15(서열 번호 6), 링커 25(서열 번호 8) 등을 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다.
scFv에 이용하는 VH 영역과 VL 영역은, 항GM2 항체의 VH 영역과 VL 영역을 이용하면 된다. 항GM2 항체의 바람직한 예는, 전술한 바와 같다. 또한, scFv에 이용하는 VH 영역과 VL 영역은, GM2에 대한 결합능을 유지하는 한, 일부 서열을 개변한 것이라도 무방하다. 예를 들면, scFv로는 다음과 같은 것을 바람직하게 이용할 수 있다.
(1a) 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 VH 영역의 CDR 1∼3을 포함하는 VH 영역과, 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 VL 영역의 CDR 1∼3을 포함하는 VL 영역을 포함하고, GM2에 대한 결합능을 갖는 scFv.
(1b) 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 VH 영역과, 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 VL 영역을 포함하고, GM2에 대한 결합능을 갖는 scFv.
(1c) 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 복수 개의 아미노산이 변이한 아미노산 서열로 이루어지는 VH 영역과, 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 복수 개의 아미노산이 변이한 아미노산 서열로 이루어지는 VL 영역을 포함하고, GM2에 대한 결합능을 갖는 scFv.
(1d) 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 동일성(상동성)을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 VH 영역과, 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 동일성(상동성)을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 VL 영역을 포함하고, GM2에 대한 결합능을 갖는 scFv.
상기 (1a)에서, CDR 이외의 서열(프레임워크 서열)은 기존의 인간 항체의 프레임워크 서열을 이용하는 것이 바람직하다. 예를 들면, GenBank 등의 공지의 서열 데이터베이스에 등록되어 있는 인간 항체의 아미노산 서열의 프레임워크 서열, 인간 항체의 각 서브그룹에 유래하는 공통 서열(Human Most Homologous Consensus Sequence; Kabat, E. A. 등의 Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991)로부터 선택된 아미노산 서열 등으로부터 선택할 수 있다.
상기 (1c)에서, '복수 개'는, 예를 들면 2∼30개일 수 있고, 2∼20개인 것이 바람직하고, 2∼10개인 것이 보다 바람직하고, 2∼5개인 것이 더욱 바람직하다. 또한, '변이'는, 결실(缺失), 치환, 부가 및 삽입 중 어느 하나라도 되고, 이들의 조합이라도 된다. 또한, 변이의 위치는, CDR 1∼3 이외의 영역(즉, 프레임워크 영역)인 것이 바람직하다.
상기 (1d)에서, 서열 동일성은 70% 이상인 한, 특별히 한정되지 않지만, 80% 이상인 것이 바람직하고, 85% 이상인 것이 보다 바람직하고, 90% 이상인 것이 더욱 바람직하고, 95% 이상인 것이 한층 더 바람직하고, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상인 것이 특히 바람직하다. 한편, 아미노산 서열끼리의 서열 동일성(상동성)은, 2개의 아미노산 서열을, 대응하는 아미노산이 가장 많이 일치하도록, 삽입 및 결실에 해당되는 부분에 갭을 넣으면서 병치하여, 얻어진 얼라인먼트(alignment) 중의 갭을 제외한 아미노산 서열 전체에 대한 일치한 아미노산의 비율로서 구해진다. 아미노산 서열끼리의 서열 동일성은, 당해 기술 분야에서 공지의 각종 상동성 검색 소프트웨어를 이용해 구할 수 있다. 예를 들면, 아미노산 서열의 서열 동일성의 값은, 공지의 상동성 검색 소프트웨어 BLASTP에 의해 얻어진 얼라인먼트를 기초로 한 계산에 의해 얻을 수 있다.
scFv의 구체예로는, 예를 들면 서열 번호 10, 12, 14 및 16으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 10, 12, 14 및 16으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드; 서열 번호 10, 12, 14 및 16으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에서 1 또는 복수 개의 아미노산이 변이한 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GM2에 대한 결합능을 갖는 폴리펩티드; 서열 번호 10, 12, 14 및 16으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 동일성(상동성)을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GM2에 대한 결합능을 갖는 폴리펩티드 등을 들 수 있다. 한편, '복수 개'및 '변이'에 대해서는 전술한 바와 같다. 또한, '서열 동일성'에 대해서도 전술한 바와 같다.
＜막관통 영역＞
'막관통 영역'이란, CAR이 T세포에서 발현했을 때, 세포막을 관통해 존재하고, 세포외 영역과 세포내 영역을 연결하는 영역을 의미한다. 막관통 영역은, 세포막을 관통하는 기능을 갖는 폴리펩티드라면 특별히 한정되지 않는다. 막관통 영역은, 천연 단백질에 유래하는 것이라도 되고, 인위적으로 설계한 것이라도 무방하다. 천연 단백질에 유래하는 막관통 영역은, 임의의 막결합 단백질 또는 막관통 단백질로부터 취득할 수 있다. 바람직한 형태에서, 막관통 영역은, 표적 항원 결합 영역에 대한 표적 항원의 결합에 대응해, T세포 활성화 시그널 전달 영역에 활성화 시그널을 전달할 수 있다.
막관통 영역으로는, 예를 들면 T세포 수용체의α쇄 및 β쇄, CD3ζ, CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, ICOS, CD154, GITR 등의 막관통 영역을 들 수 있다. 바람직한 예로는, CD8의 막관통 영역을 들 수 있다. 이들 단백질이 유래하는 생물은, 특별히 한정되지 않지만, 인간인 것이 바람직하다. 이들 단백질의 아미노산 서열은, GenBank 등의 공지의 서열 데이터베이스로부터 입수 가능하다. 예를 들면, 인간 CD8의 아미노산 서열의 예로는, GenBank 번호: NM_001768.6으로 등록된 것 등을 들 수 있고, 막관통 영역의 아미노산 서열로는, 서열 번호 20에 기재된 아미노산 서열을 들 수 있다.
또한, 막관통 영역은, 상기와 같은 천연 단백질 유래의 막관통 영역의 변이체라도 된다. 천연 단백질 유래의 막관통 영역의 변이체의 예로는, 예를 들면 다음과 같은 것을 들 수 있다.
(2a) 천연 단백질 유래의 막관통 영역의 아미노산 서열(예를 들어, 서열 번호 20)과 70% 이상의 서열 동일성(상동성)을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 막관통능을 갖는 폴리펩티드.
(2b) 천연 단백질 유래의 막관통 영역의 아미노산 서열(예를 들어, 서열 번호 20)에서, 1 또는 복수 개의 아미노산이 변이한 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 막관통능을 갖는 폴리펩티드.
상기 (2a)에서, 서열 동일성은 70% 이상인 한, 특별히 한정되지 않지만, 80% 이상인 것이 바람직하고, 85% 이상인 것이 보다 바람직하고, 90% 이상인 것이 더욱 바람직하고, 95% 이상인 것이 특히 바람직하다.
상기 (2b)에서, '복수 개'는, 예를 들면 2∼10개일 수 있고, 2∼5개인 것이 바람직하고, 2∼4개인 것이 보다 바람직하고, 2 또는 3개인 것이 더욱 바람직하다. 또한, '변이'는 결실, 치환, 부가 및 삽입 중 어느 하나라도 되고, 이들의 조합이라도 무방하다.
＜T세포 활성화 시그널 전달 영역＞
'T세포 활성화 시그널 전달 영역'이란, CAR이 T세포에서 발현했을 때, 세포 내에 위치하고, T세포 내에 T세포 활성화 시그널을 전달하는 영역을 의미한다. T세포에 있어서는, T세포 수용체(T cell Receptor: TCR)에 MHC·펩티드 복합체가 결합하면, TCR·CD3 복합체를 개재해 세포 내에 T세포 활성화 시그널이 전달되어, 여러 가지 인산화 시그널이 야기된다(1차 시그널 전달). 또한, T세포의 세포 표면상에 발현하는 공동자극 분자(costimulatory molecule)는, 항원 제시 세포의 세포 표면상에 발현하는 각 공동자극 분자에 특이적인 리간드와의 결합에 의해 세포 내에 공동자극 시그널을 전달해, T세포의 활성화를 보조하는 것이 알려져 있다(2차 시그널 전달).
본 명세서에 있어서, 'T세포 활성화 시그널 전달'이란, 상기 1차 시그널 전달 및 2차 시그널 전달을 전부 포함한다. 또한, 'T세포 활성화 시그널 전달 영역'이란, 상기 1차 시그널 전달 및 2차 시그널 전달에 관여하는 단백질의, 당해 시그널 전달에 관여하는 세포내 영역을 의미한다.
T세포 활성화 시그널 전달 영역은, T세포 활성화 시그널 전달에 관여하는 단백질의 T세포 활성화 시그널 전달 영역이라면, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 1차 시그널 전달에는, 면역 수용체 활성화 티로신 모티프(immunoreceptor tyrosine-based activation motif: ITAM)가 관여하는 것이 알려져 있다. 이 때문에, T세포 활성화 시그널 전달 영역의 예로는, ITAM을 갖는 단백질의 T세포 활성화 시그널 전달 영역을 들 수 있다. ITAM을 갖는 단백질의 예로는, 예를 들면 CD3ζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD66d 등을 들 수 있다. 이들 단백질의 ITAM을 포함하는 T세포 활성화 시그널 전달 영역은, CAR에 이용하는 T세포 활성화 시그널 전달 영역의 바람직한 예이다. 보다 바람직한 예로는, CD3ζ 등의 T세포 활성화 시그널 전달 영역을 들 수 있다.
또한, 2차 시그널 전달에는, 전술한 바와 같이 공동자극 분자가 관여한다. 이 때문에, T세포 활성화 시그널 전달 영역의 예로는, 공동자극 분자의 시그널 전달 영역도 들 수 있다. 공동자극 분자의 예로는, 예를 들면 CD2, CD4, CD5, CD8, CD27, CD28, OXO40(CD134), 4-1BB(CD137), ICOS, CD154, HVEM, GITR, Fc Receptor-associated γchain 등을 들 수 있다. 이들 단백질의 T세포 활성화 시그널 전달 영역도 또한, CAR에 이용하는 T세포 활성화 시그널 전달 영역의 바람직한 예이다. 보다 바람직한 예로는, CD28, 4-1BB 등의 T세포 활성화 시그널 전달 영역을 들 수 있다.
상기의 단백질이 유래하는 생물은, 특별히 한정되지 않지만, 인간인 것이 바람직하다. 한편, 이들 단백질의 아미노산 서열은, GenBank 등의 공지의 서열 데이터베이스로부터 입수 가능하다. 예를 들면, 인간 CD3ζ의 아미노산 서열의 예로는, GenBank 번호: NM_000734.3으로 등록된 것 등을 들 수 있고, T세포 활성화 시그널 전달 영역의 아미노산 서열로는, 서열 번호 28에 기재된 아미노산 서열을 들 수 있다. 또한, 인간 CD28의 아미노산 서열의 예로는, GenBank 번호: NM_006139.2로서 등록된 것 등을 들 수 있고, T세포 활성화 시그널 전달 영역의 아미노산 서열로는, 서열 번호 24에 기재된 아미노산 서열을 들 수 있다. 또한, 인간 4-1BB의 아미노산 서열의 예로는, GenBank 번호: NM_001561.5로서 등록된 것 등을 들 수 있고, T세포 활성화 시그널 전달 영역의 아미노산 서열로는, 서열 번호 26에 기재된 아미노산 서열을 들 수 있다.
또한, T세포 활성화 시그널 전달 영역은, 상기와 같은 천연 단백질 유래의 T세포 활성화 시그널 전달 영역의 변이체라도 된다. 천연 단백질 유래의 활성화 시그널 전달 영역의 변이체의 예로는, 예를 들면 다음과 같은 것을 들 수 있다.
(3a) 천연 단백질 유래의 T세포 활성화 시그널 전달 영역의 아미노산 서열(예를 들어, 서열 번호 24, 26, 28)과 70% 이상의 서열 동일성(상동성)을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 T세포 활성화 시그널 전달능을 갖는 폴리펩티드.
(3b) 천연 단백질 유래의 T세포 활성화 시그널 전달 영역의 아미노산 서열(예를 들어, 서열 번호 24, 26, 28)에서, 1 또는 복수 개의 아미노산이 변이한 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 T세포 활성화 시그널 전달능을 갖는 폴리펩티드.
상기 (3a)에서, 서열 동일성은 70% 이상인 한, 특별히 한정되지 않지만, 80% 이상인 것이 바람직하고, 85% 이상인 것이 보다 바람직하고, 90% 이상인 것이 더욱 바람직하고, 95% 이상인 것이 특히 바람직하다.
상기 (3b)에서, '복수 개'는, 예를 들면 1차 시그널 전달에 관여하는 단백질의 것을 이용하는 경우에는, 2∼30개일 수 있고, 2∼20개인 것이 바람직하고, 2∼10개인 것이 보다 바람직하고, 2∼5개인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 예를 들면 공동자극 분자의 것을 이용하는 경우에 '복수 개'는, 2∼15개일 수 있고, 2∼10개인 것이 바람직하고, 2∼5개인 것이 보다 바람직하고, 2 또는 3개인 것이 더욱 바람직하다. 또한, '변이'는 결실, 치환, 부가 및 삽입 중 어느 하나라도 되고, 이들의 조합이라도 무방하다.
본 실시 형태의 CAR이 포함하는 T세포 활성화 시그널 전달 영역의 수는, 1개로 한정되지 않고, 복수의 T세포 활성화 시그널 전달 영역을 포함할 수도 있다. 이 경우, 복수의 T세포 활성화 시그널 전달 영역은, 같은 것이라도 되고, 상이한 것이라도 무방하다. 바람직한 형태에서는, CAR은 T세포 활성화 시그널 전달 영역을 2개 이상 포함한다. 이 경우, CAR이 포함하는 T세포 활성화 시그널 전달 영역은, 1차 시그널 전달에 관여하는 T세포 활성화 시그널 전달 영역과 2차 시그널 전달에 관여하는 T세포 활성화 시그널 전달 영역의 조합인 것이 바람직하다. 구체예로는, CD3ζ와 CD28의 T세포 활성화 시그널 전달 영역의 조합, CD3ζ와 4-1BB의 T세포 활성화 시그널 전달 영역의 조합, CD3ζ와 CD28와 4-1BB의 T세포 활성화 시그널 전달 영역의 조합 등을 들 수 있다.
한편, 1차 시그널 전달에 관여하는 T세포 활성화 시그널 전달 영역과 2차 시그널 전달에 관여하는 T세포 활성화 시그널 전달 영역을 조합하는 경우, 1차 시그널 전달에 관여하는 T세포 활성화 시그널 전달 영역을 C말단측에 배치하는 것이 바람직하다. 상기의 구체예에서는, CD3ζ의 T세포 활성화 시그널 전달 영역을, CD28이나 4-1BB의 T세포 활성화 시그널 전달 영역보다 C말단측에 배치하는 것이 바람직하다. CD28과 4-1BB를 함께 이용하는 경우, 어떤 배치순이라도 무방하지만, N말단측으로부터 CD28, 4-1BB의 순으로 배치하는 예를 들 수 있다.
T세포 활성화 시그널 전달 영역을 1개만 이용하는 경우에는, 1차 시그널 전달에 관여하는 T세포 활성화 시그널 전달 영역을 이용하는 것이 바람직하고, CD3ζ의 T세포 활성화 시그널 전달 영역을 이용하는 것이 보다 바람직하다.
＜그 외의 영역＞
본 실시 형태의 CAR은, 상기의 영역 외에, 다른 영역을 포함할 수도 있다. 다른 영역의 예로는, 세포외 힌지 영역, 세포질 영역, 스페이서 영역, 시그널 펩티드 등을 들 수 있다.
(세포외 힌지 영역)
'세포외 힌지 영역'이란, 세포외의 표적 항원 결합 영역과 막관통 영역을 연결하는 영역을 의미한다. 바람직한 형태에 있어서, 본 실시 형태의 CAR은 세포외 힌지 영역을 포함한다.
세포외 힌지 영역은, 표적 항원 결합 영역과 막관통 영역을 연결할 수 있는 것이라면 특별히 한정되지 않는다. 천연 단백질에 유래하는 것이라도 되고, 인위적으로 설계된 것이라도 무방하다. 세포외 힌지 영역은, 예를 들면 1∼100개 정도의 아미노산, 바람직하게는 10∼70개 정도의 아미노산으로 구성할 수 있다. 세포외 힌지 영역은, 표적 항원 결합 영역의 GM2 결합능을 방해하지 않고, 또한 T세포 활성화 시그널 전달 영역에 의한 시그널 전달을 방해하지 않는 것이 바람직하다.
세포외 힌지 영역으로는, 예를 들면 CD8, CD28, CD4 등의 세포외 힌지 영역을 들 수 있다. 또한, 면역 글로불린(예를 들면, IgG4 등)의 힌지 영역을 사용해도 무방하다. 바람직한 예로는, CD8의 세포외 힌지 영역을 들 수 있다.
상기의 단백질이 유래하는 생물은, 특별히 한정되지 않지만, 인간인 것이 바람직하다. 한편, 이들 단백질의 아미노산 서열은, GenBank 등의 공지의 서열 데이터베이스로부터 입수 가능하다. 인간 CD8의 아미노산 서열의 예로는 상기의 것을 들 수 있고, 세포외 힌지 영역의 아미노산 서열로는, 서열 번호 18에 기재된 아미노산 서열을 들 수 있다.
또한, 세포외 힌지 영역은, 상기와 같은 천연 단백질 유래의 세포외 힌지 영역의 변이체라도 된다. 천연 단백질 유래의 세포외 힌지 영역의 변이체의 예로는, 예를 들면 다음과 같은 것을 들 수 있다.
(4a) 천연 단백질 유래의 세포외 힌지 영역의 아미노산 서열(예를 들어, 서열 번호 18)과 70% 이상의 서열 동일성(상동성)을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드.
(4b) 천연 단백질 유래의 세포외 힌지 영역의 아미노산 서열(예를 들어, 서열 번호 18)에서, 1 또는 복수 개의 아미노산이 변이한 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드.
상기 (4a)에서, 서열 동일성은 70% 이상인 한, 특별히 한정되지 않지만, 80% 이상인 것이 바람직하고, 85% 이상인 것이 보다 바람직하고, 90% 이상인 것이 더욱 바람직하고, 95% 이상인 것이 특히 바람직하다.
상기 (4b)에서, '복수 개'는, 예를 들면 2∼20개일 수 있고, 2∼15개인 것이 바람직하고, 2∼10개인 것이 보다 바람직하고, 2∼5개인 것이 더욱 바람직하다. 또한, '변이'는 결실, 치환, 부가 및 삽입 중 어느 하나라도 되고, 이들의 조합이라도 무방하다.
(세포질 영역)
'세포질 영역'이란, 막관통 단백질에서 막관통 영역의 세포질측 말단에 인접하는 영역이며, 3∼50개 정도의 아미노산으로 이루어지는 영역이다. 바람직한 형태에서, 본 실시 형태의 CAR은 세포질 영역을 포함한다. 세포질 영역은, 막관통 단백질의 막관통 영역의 세포질측에 인접하는 영역이라면 특별히 한정되지 않는다. 세포질 영역을 개재해 막관통 영역과 T세포 활성화 시그널 전달 영역을 연결함으로써 막관통 영역의 구조를 안정시킬 수 있다. 세포질 영역은 천연 단백질에 유래하는 것이라도 되고, 인위적으로 설계된 것이라도 무방하다. 세포질 영역은, 예를 들면 3∼50개 정도의 아미노산, 바람직하게는 4∼20개 정도의 아미노산, 보다 바람직하게는 5∼10개 정도의 아미노산으로 구성할 수 있다. 세포질 영역은 막관통 영역과 동일한 단백질에 유래하는 것이 바람직하다. 막관통 영역과 동일한 단백질에 유래하는 세포질 영역을 이용함으로써, 막관통 영역의 구조를 보다 안정적으로 유지할 수 있다.
세포질 영역으로는, 예를 들면 상기 막관통 영역에서 예로 든 단백질의 세포질 영역을 들 수 있다. 바람직한 예로는, CD8의 세포질 영역을 들 수 있다. 이들 단백질이 유래하는 생물은, 특별히 한정되지 않지만, 인간인 것이 바람직하다. 세포질 영역의 아미노산 서열로는, 서열 번호 22에 기재된 아미노산 서열을 들 수 있다.
또한, 세포질 영역은, 상기와 같은 천연 단백질 유래의 세포질 영역의 변이체라도 된다. 천연 단백질 유래의 세포질 영역의 변이체의 예로는, 예를 들면 다음과 같은 것을 들 수 있다.
(5a) 천연 단백질 유래의 세포질 영역의 아미노산 서열(예를 들어, 서열 번호 22)과 70% 이상의 서열 동일성(상동성)을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 막관통 영역 안정능을 갖는 폴리펩티드.
(5b) 천연 단백질 유래의 세포질 영역의 아미노산 서열(예를 들어, 서열 번호 22)에서, 1 또는 복수 개의 아미노산이 변이한 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 막관통 영역 안정능을 갖는 폴리펩티드.
상기 (5a)에서, 서열 동일성은 70% 이상인 한, 특별히 한정되지 않지만, 80% 이상인 것이 바람직하고, 85% 이상인 것이 보다 바람직하고, 90% 이상인 것이 더욱 바람직하고, 95% 이상인 것이 특히 바람직하다.
상기 (5b)에서, '복수 개'는, 예를 들면 2∼5개일 수 있고, 2∼4개인 것이 바람직하고, 2 또는 3개인 것이 보다 바람직하다. 또한, '변이'는 결실, 치환, 부가 및 삽입 중 어느 하나라도 되고, 이들의 조합이라도 무방하다.
(스페이서 영역)
'스페이서 영역'이란, 단백질의 2개의 기능 영역(도메인)을 연결하는 짧은 펩티드이다. 일 형태에 있어서, 본 실시 형태의 CAR은, 상기의 표적 항원 결합 영역, 막관통 영역, T세포 활성화 시그널 전달 영역 등의 각 영역이, 스페이서 영역을 개재해 연결되어 있어도 된다. 스페이서 영역은, 특별히 한정되지 않고, 키메라 단백질의 제작에 일반적으로 이용되는 것을 사용하면 된다. 스페이서 영역의 길이로는, 1∼100 아미노산, 바람직하게는 10∼50 아미노산을 들 수 있다. 스페이서 영역의 예로는, 글리신-세린 연속 서열 등을 들 수 있다.
(시그널 펩티드)
'시그널 펩티드'는, 막단백질이나 분비 단백질의 국소화(localization)를 지시하는 펩티드이다. 일 형태에 있어서, 본 실시 형태의 CAR은 시그널 펩티드를 포함할 수 있다. 시그널 펩티드는, 일반적으로, 막단백질의 N말단에 존재하는 5∼60개 정도의 아미노산으로 이루어지는 펩티드이며, 국소화가 완료된 성숙 단백질에서는 제거되어 있다.
본 실시 형태의 CAR에 이용하는 시그널 펩티드는, 세포막으로의 국소화를 지시하는 시그널 펩티드인 것이 바람직하고, 막단백질의 시그널 펩티드인 것이 바람직하다. 시그널 펩티드의 예로는, T세포 수용체의α쇄 및 β쇄, CD3ζ, CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, ICOS, CD154, GITR, 면역 글로불린 중쇄, 면역 글로불린 경쇄 등의 시그널 펩티드를 들 수 있다. 시그널 펩티드의 아미노산 서열의 구체예로는, 서열 번호 57에 기재된 아미노산 서열을 들 수 있다.
본 실시 형태의 CAR에 있어서, 상기의 각 영역은, N말단으로부터 표적 항원 결합 영역, 막관통 영역, T세포 활성화 시그널 전달 영역의 순으로 배치할 수 있다. 이들 각 영역은, 서로 직접 연결되어 있어도 되고, 다른 영역이나 스페이서 서열 등을 개재해 연결되고 있어도 무방하다.
본 실시 형태의 CAR이 세포외 힌지 영역을 포함하는 경우, 세포외 힌지 영역은 표적 항원 결합 영역과 막관통 영역 사이에 배치된다. 또한, 본 실시 형태의 CAR이 세포질 영역을 포함하는 경우, 세포질 영역은 막관통 영역과 T세포 활성화 시그널 전달 영역 사이에 배치된다.
또한, 본 실시 형태의 CAR이 시그널 펩티드를 포함하는 경우, 시그널 펩티드는 CAR의 N말단에 배치된다.
본 실시 형태의 CAR의 구체예로는, 항GM2 항체의 scFv를 포함하는 표적 항원 결합 영역, CD8의 막관통 영역(또는 그 변이체), CD28의 T세포 활성화 시그널 전달 영역(또는 그 변이체), 4-1BB의 T세포 활성화 시그널 전달 영역(또는 그 변이체) 및 CD3ζ의 T세포 활성화 시그널 전달 영역(또는 그 변이체)을 포함하는 CAR을 들 수 있다. 보다 바람직한 예로는, 항GM2 항체의 scFv를 포함하는 표적 항원 결합 영역, CD8의 세포외 힌지 영역(또는 그 변이체), CD8의 막관통 영역(또는 그 변이체), CD8의 세포질 영역(또는 그 변이체), CD28의 T세포 활성화 시그널 전달 영역(또는 그 변이체), 4-1BB의 T세포 활성화 시그널 전달 영역(또는 그 변이체) 및 CD3ζ의 T세포 활성화 시그널 전달 영역(또는 그 변이체)을 포함하는 CAR을 들 수 있다.
이와 같은 CAR로는, 예를 들면 서열 번호 40, 42, 44 및 46으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CAR을 들 수 있다. 한편, 서열 번호 40, 42, 44 및 46에 기재된 아미노산 서열에서, 1∼19위의 서열은 시그널 펩티드에 해당한다. 따라서, 상기의 예에서의 성숙한 CAR은, 각각, 서열 번호 40에 기재된 아미노산 서열의 20∼874위의 아미노산 서열, 서열 번호 42에 기재된 아미노산 서열의 20∼884위의 아미노산 서열, 서열 번호 44에 기재된 아미노산 서열의 20∼874위의 아미노산 서열, 서열 번호 46에 기재된 아미노산 서열의 20∼884위의 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 형태에 있어서, 본 실시 형태의 CAR은, 서열 번호 40, 42, 44 및 46으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진다. 또한, 성숙한 CAR은, 서열 번호 40에 기재된 아미노산 서열의 20∼874위의 아미노산 서열, 서열 번호 42에 기재된 아미노산 서열의 20∼884위의 아미노산 서열, 서열 번호 44에 기재된 아미노산 서열의 20∼874위의 아미노산 서열 및 서열 번호 46에 기재된 아미노산 서열의 20∼884위의 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진다.
[항GM2 CAR을 발현하는 세포(항GM2 CAR 발현 세포)]
일 실시 형태에 있어서, 본 발명은 상기 실시 형태의 CAR을 발현하는 세포를 제공한다.
본 실시 형태의 세포는, 상기 실시 형태의 CAR(이하, '항GM2 CAR'라고도 한다)을 발현하고, 세포 표면상에 당해 CAR을 갖고 있다. GM2 발현 세포에서 GM2는 세포 표층에 많이 존재하고 있다. 본 실시 형태의 세포가 GM2 발현 세포에 접하면, 항GM2 CAR의 표적 항원 결합 영역에 의해 GM2 발현 세포 표층의 GM2에 결합한다. 이에 따라, 본 실시 형태의 세포가 활성화되어, 세포 상해성 과립의 방출이나 사이토카인 생성이 일어난다. 이들 세포 상해성 과립이나 사이토카인에 의해, GM2 발현 세포가 파괴된다.
본 실시 형태의 세포는, 포유동물 세포인 것이 바람직하고, 예를 들면 인간 세포, 또는 마우스, 래트, 소, 양, 말, 개, 돼지, 원숭이 등의 비인간 포유동물 세포라도 되지만, 인간 세포인 것이 보다 바람직하다. 세포의 종류는, 특별히 한정되지 않고, 혈액, 골수액, 비장, 흉선, 림프절 등으로부터 채취된 세포; 원발성 종양, 전이성 종양, 암성 복수 등의 암조직에 침윤하는 면역 세포 등을 들 수 있다. 바람직한 예로는, 면역 세포를 들 수 있고, 말초혈로부터 분리된 말초혈 단핵구 등을 바람직하게 이용할 수 있다. 말초혈 단핵구에 포함되는 세포 중에서도, 이펙터 세포(effector cell)가 바람직하고, 특히 바람직한 세포로는, T세포 및 그 전구세포를 들 수 있다. T세포의 종류는, 특별히 한정되지 않고,αβ T세포,γδ T세포, CD8 양성 T세포, 세포 상해성 T세포, CD4 양성 T세포, 헬퍼 T세포, 메모리 T세포, 나이브 T세포, 종양 침윤 T세포, NK(Natural Killer) T세포 등의 어느 T세포라도 된다. 이들 중에서도, CD8 양성 T세포 또는 세포 상해성 T세포인 것이 보다 바람직하다.
본 실시 형태의 세포는, 항GM2 CAR 외에, 인터류킨(Interleukin: IL)-7 및 케모카인(C-C 모티프) 리간드 19(Chemokine(C-C motif) Ligand 19: CCL19)의 적어도 하나를 더 발현하고 있는 것이 바람직하다. 바람직한 형태에 있어서, 본 실시 형태의 세포는, (i) 항GM2 CAR과 (ⅱ) IL-7 및 CCL19의 적어도 하나를 발현하는 세포이다. 보다 바람직하게는, 본 실시 형태의 세포는 항GM2 CAR와, IL-7 및 CCL19를 발현하는 세포이다.
IL-7은, T세포의 생존에 필수의 사이토카인으로, 골수, 흉선, 림프계 기관·조직의 스트로마 세포 등의 비조혈 세포에 의해 생성되지만, T세포에서의 생성은 거의 인정되지 않는다.
한편, CCL19는, 주로 림프절의 수지상 세포(dendritic cell)나 대식 세포(macrophage)로부터 생성되고, 그 수용체인 CC 케모카인 수용체 7(Chemokine(C-C motif) Receptor 7: CCR7)를 개재해 T세포나 B세포, 성숙한 수지상 세포의 이동(migration)을 야기하는 기능을 갖는다.
IL-7 및 CCL19가 유래하는 생물은, 특별히 한정되지 않지만, 인간인 것이 바람직하다. 한편, 이들 단백질의 아미노산 서열은, GenBank 등의 공지의 서열 데이터베이스로부터 입수 가능하다. 예를 들면, 인간 IL-7의 아미노산 서열의 예로는, GenBank 번호: NM_000880.3(서열 번호 59)으로 등록된 것 등을 들 수 있다. 또한, 인간 CCL19의 아미노산 서열의 예로는, GenBank 번호: NM_006274.2(서열 번호 61)로서 등록된 것 등을 들 수 있다. 한편, IL-7 및 CCL19는 시그널 펩티드를 갖고, 성숙 단백질에서는 시그널 펩티드가 제거되어 있다. 예를 들면, 서열 번호 59에 기재된 인간 IL-7의 아미노산 서열에서, 1∼25위의 서열은 시그널 펩티드에 해당한다. 또한, 예를 들면 서열 번호 61에 기재된 인간 CCL19의 아미노산 서열에서, 1∼21위의 서열은 시그널 펩티드에 해당한다.
또한, IL-7 및 CCL19는, 상기와 같은 천연 단백질의 변이체라도 된다. IL-7의 변이체의 예로는, 예를 들면 다음과 같은 것을 들 수 있다.
(6a) 천연 IL-7의 아미노산 서열(예를 들어, 서열 번호 59)과 70% 이상의 서열 동일성(상동성)을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, T세포의 면역 기능 촉진 기능을 갖는 폴리펩티드.
(6b) 천연 IL-7의 아미노산 서열(예를 들어, 서열 번호 59)에서, 1 또는 복수 개의 아미노산이 변이한 아미노산 서열로 이루어지고, T세포의 면역 기능 촉진 기능을 갖는 폴리펩티드.
또한, CCL19의 변이체의 예로는, 예를 들면 다음과 같은 것을 들 수 있다.
(7a) 천연 CCL19의 아미노산 서열(예를 들어, 서열 번호 61)과 70% 이상의 서열 동일성(상동성)을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, T세포의 면역 기능 촉진 기능을 갖는 폴리펩티드.
(7b) 천연 CCL19의 아미노산 서열(예를 들어, 서열 번호 61)에서, 1 또는 복수 개의 아미노산이 변이한 아미노산 서열로 이루어지고, T세포의 면역 기능 촉진 기능을 갖는 폴리펩티드.
한편, 'T세포의 면역 기능 촉진 기능'이란, T세포의 생존, 증식, 세포 상해 활성, 이동 활성, 종양 조직에의 침윤 활성 등을 유지·촉진하는 기능을 의미한다.
상기 (6a) 및 (7a)에서, 서열 동일성은 70% 이상인 한, 특별히 한정되지 않지만, 80% 이상인 것이 바람직하고, 85% 이상인 것이 보다 바람직하고, 90% 이상인 것이 더욱 바람직하고, 95% 이상인 것이 특히 바람직하다.
또한, 상기 (6b) 및 (7b)에서, '복수 개'는, 예를 들면 2∼30개일 수 있고, 2∼20개인 것이 바람직하고, 2∼10개인 것이 보다 바람직하고, 2∼5개인 것이 더욱 바람직하다. 또한, '변이'는 결실, 치환, 부가 및 삽입 중 어느 하나라도 되고, 이들의 조합이라도 무방하다.
또한, IL-7 및 CCL19의 변이체는, 이들 단백질의 시그널 펩티드를 다른 시그널 펩티드로 변경한 것이라도 되고, 시그널 펩티드를 제거한 것이라도 무방하다. 바람직하게는, IL-7 및 CCL19의 변이체는 분비 단백질의 시그널 펩티드를 갖고, 세포 외로 분비된다.
본 실시 형태의 세포가 단리된 T세포인 경우, 항GM2 CAR와 함께, IL-7 및 CCL19 중 적어도 하나를 발현함으로써, T세포의 면역 기능이 촉진되어, GM2 발현 세포에 대한 세포 상해 활성, 종양 조직에의 침윤, 종양 미세 환경에서의 생존 능력이 뛰어난 T세포가 될 수 있다.
또한, 본 실시 형태의 세포는, 항GM2 CAR 외에, 자살 유전자를 발현하는 것이라도 된다. 본 실시 형태의 세포가, 자살 유전자를 발현하고 있는 것에 의해, 필요에 따라, 본 실시 형태의 세포에 아포토시스(apoptosis)를 유도하는 것이 가능하게 된다. 자살 유전자는, 특별히 한정되지 않고, 공지의 것을 이용할 수 있다. 예를 들면, 자살 유전자로는, 단순 헤르페스바이러스의 티미딘키나아제(HSV-TK) 유전자, 유도성 카스파제 9(inducible caspase 9) 유전자 등을 들 수 있다. HSV-TK를 발현하는 세포는, 간사이클로비르(ganciclovir)를 공존시킴으로써 세포사를 유도할 수 있다. 또한, 유도성 카스파제 9를 발현하는 세포는, AP1903 등의 2량체 유도 화합물(chemical induction of dimerization: CID)를 공존시킴으로써 세포사를 유도할 수 있다. 자살 유전자의 아미노산 서열은, GenBank 등의 공지의 서열 데이터베이스로부터 입수 가능하다. 또한, 시판 중인 자살 유전자를 포함하는 벡터 등의 서열을 이용할 수도 있다.
본 실시 형태의 세포는, 항GM2 CAR을 함유하는 세포(바람직하게는 T세포)라고도 할 수 있다. 본 실시 형태의 세포의 바람직한 예는, 항GM2 CAR와, IL-7 및 CCL19 중 적어도 하나를 함유하는 세포(바람직하게는 T세포)라고도 할 수 있다. 본 실시 형태의 세포의 보다 바람직한 예는, 항GM2 CAR, IL-7 및 CCL19를 함유하는 세포(바람직하게는 T세포)라고도 할 수 있다. 본 실시 형태의 세포의 더 바람직한 예는, 항GM2 CAR, IL-7, CCL19, 및 자살 유전자를 함유하는 세포(바람직하게는 T세포)라고도 할 수 있다.
본 실시 형태의 세포는, 후술하는, 항GM2 CAR을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리 뉴클레오티드 또는 벡터를 세포에 도입함으로써 얻을 수 있다.
[항GM2 CAR을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리 뉴클레오티드]
일 실시 형태에 있어서, 본 발명은, 항GM2 CAR을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리 뉴클레오티드를 제공한다.
본 실시 형태의 폴리 뉴클레오티드는, 항GM2 CAR을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것이라면, 특별히 한정되지 않는다. 항GM2 CAR은, 상기 [키메라 항원 수용체(항GM2 CAR)]의 항에 기재한 바와 같다. 본 실시 형태의 폴리 뉴클레오티드는, 상기 [키메라 항원 수용체(항GM2 CAR)]의 항에서 예시한 항GM2 CAR의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것인 것이 바람직하다.
예를 들면, 표적 항원 결합 영역을 코딩하는 염기 서열로는, 항GM2 항체의 scFv를 코딩하는 염기 서열을 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열과 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것을 예시할 수 있다. 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열로는, 서열 번호 1, 49, 51 또는 53에 기재된 염기 서열을 예시할 수 있다. 또한, 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열로는, 서열 번호 3, 50, 52 또는 54에 기재된 염기 서열을 예시할 수 있다.
이들 염기 서열은, 링커를 코딩하는 염기 서열로 연결되어 있는 것이 바람직하다. 링커에 대해서는, 상기 '키메라 항원 수용체'의 항에 기재한 바와 같다. 예를 들면, 상기에서 예시한 링커 15를 코딩하는 염기 서열로는, 서열 번호 5 또는 55에 기재된 염기 서열을 예시할 수 있다. 또한, 링커 25를 코딩하는 염기 서열로는, 서열 번호 7 또는 56에 기재된 염기 서열을 예시할 수 있다.
항GM2 항체의 scFv를 코딩하는 염기 서열의 구체예로는, 서열 번호 9, 11, 13 또는 15에 기재된 염기 서열 등을 들 수 있다.
표적 항원 결합 영역을 코딩하는 염기 서열로는, 도입하는 세포의 생물종에 따라 코돈 최적화되어 있는 것이 바람직하고, 인간 세포에 도입하는 경우에는 인간 코돈에 최적화되어 있는 것이 바람직하다.
또한, 막관통 영역 및 T세포 활성화 시그널 전달 영역을 코딩하는 염기 서열은, GenBank 등의 공지의 서열 데이터베이스로부터 입수 가능하다. 또한, GM2 CAR이 세포외 힌지 영역 등의 다른 영역을 포함하는 경우, 당해 다른 영역을 코딩하는 염기 서열도 또한, GenBank 등의 공지의 서열 데이터베이스로부터 입수 가능하다.
예를 들면, 막관통 영역으로서 인간 CD8의 막관통 영역을 이용하는 경우, 인간 CD8를 코딩하는 염기 서열로는, GenBank 번호: NM_001768.6으로 등록된 것 등을 들 수 있고, 막관통 영역을 코딩하는 염기 서열로는, 서열 번호 19에 기재된 염기 서열을 예시할 수 있다.
또한, 예를 들면 T세포 활성화 시그널 전달 영역으로 인간 CD3ζ, 인간 CD28, 인간 4-1BB의 T세포 활성화 시그널 전달 영역을 이용하는 경우, 인간 CD3ζ, 인간 CD28 및 인간 4-1BB를 코딩하는 염기 서열로는, 각각, GenBank 번호: NM_000734.3, NM_006139.2 및 NM_001561.5로서 등록된 것 등을 들 수 있고, 인간 CD3ζ, 인간 CD28 및 인간 4-1BB의 T세포 활성화 시그널 전달 영역을 코딩하는 염기 서열로는, 각각, 서열 번호 27, 23 및 25에 기재된 염기 서열을 예시할 수 있다.
또한, 예를 들면 세포외 힌지 영역으로 인간 CD8의 세포외 힌지 영역을 이용하는 경우, 세포외 힌지 영역을 코딩하는 염기 서열로는, 서열 번호 17에 기재된 염기 서열을 예시할 수 있다.
또한, 예를 들면 세포질 영역으로 인간 CD8의 세포질 영역을 이용하는 경우, 세포질 영역을 코딩하는 염기 서열로는, 서열 번호 21에 기재된 염기 서열을 예시할 수 있다.
상기 각 영역을 코딩하는 염기 서열은, 공지의 것으로 한정되지 않고, 상기 각 영역을 코딩하는 염기 서열이라면 어떤 서열이라도 무방하다. 유전자 코드의 축퇴(degeneracy)에 의해, 1개의 아미노산에 대응하는 코돈은 복수 존재한다. 따라서, 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열은 다수 존재한다. 상기 각 영역을 코딩하는 염기 서열은, 이들 영역을 코딩하는 한, 유전자 코드의 축퇴에 의해 생성되는 복수의 염기 서열 중 어느 것이라도 무방하다.
상기 각 영역을 코딩하는 염기 서열로는, 도입하는 세포의 생물종에 따라 코돈 최적화되어 있는 것이 바람직하고, 인간 세포에 도입하는 경우에는 인간 코돈에 최적화되어 있는 것이 바람직하다.
또한, 상기 각 영역을 코딩하는 염기 서열은, 천연 단백질 유래의 각 영역의 변이체를 코딩하는 것이라도 된다. 각 영역의 변이체에 대해서는, 상기 [키메라 항원 수용체(항GM2 CAR)]의 항에 기재한 바와 같다.
항GM2 CAR의 각 영역을 코딩하는 염기 서열은, 5'측으로부터 차례로, 표적 항원 결합 영역, 막관통 영역, T세포 활성화 시그널 전달 영역의 순으로 배치되어 있는 것이 바람직하다. 시그널 펩티드, 세포외 힌지 영역 등을 이용하는 경우에는, 시그널 펩티드를 표적 항원 결합 영역의 5'측에 배치하고, 세포외 힌지 영역을 표적 항원 결합 영역과 막관통 영역 사이에 배치하는 것이 바람직하다. 이들 영역을 코딩하는 염기 서열은 직접 연결되어 있어도 되고, 스페이서 영역을 코딩하는 염기 서열을 개재해 연결되어 있어도 무방하다. 스페이서 영역에 대해서는, 상기 [키메라 항원 수용체(항GM2 CAR)]의 항에 기재한 바와 같다.
항GM2 CAR을 코딩하는 염기 서열의 구체예로는, 서열 번호 39, 41, 43 및 45로 이루어지는 군으로부터 선택되는 염기 서열 등을 들 수 있다.
본 실시 형태의 폴리 뉴클레오티드는, 항GM2 CAR의 각 영역을 코딩하는 염기 서열로 이루어지는 폴리 뉴클레오티드를, 직접 또는 스페이서 서열을 개재해 연결함으로써 얻을 수 있다. 항GM2 CAR의 각 영역을 코딩하는 폴리 뉴클레오티드는, 각 영역의 염기 서열에 기초해, 공지의 방법으로 화학 합성함으로써 취득해도 된다. 또한, T세포 등으로부터 추출한 DNA나, T세포 등으로부터 추출한 RNA를 역전사해 얻은 cDNA를 템플릿으로 하여, PCR법이나 등온 증폭법 등에 의해 각 영역을 코딩하는 폴리 뉴클레오티드를 증폭해 취득해도 된다. 이와 같이 하여 얻은 각 영역을 코딩하는 폴리 뉴클레오티드는, 번역 후의 각 영역의 기능이 손상되지 않는 범위내에서, 치환, 결실, 부가, 삽입 등의 개변을 실시해도 무방하다.
본 실시 형태의 폴리 뉴클레오티드는, 항GM2 CAR을 코딩하는 염기 서열 외에, 프로모터, 증폭자(enhancer), 폴리A 부가 시그널, 종결자(terminator) 등의 제어 서열이나, 다른 단백질을 코딩하는 염기 서열 등을 포함하고 있어도 된다.
다른 단백질로는, 예를 들면 IL-7 및 CCL19를 들 수 있다. 이들 단백질을 코딩하는 염기 서열은, GenBank 등의 공지의 서열 데이터베이스로부터 입수 가능하다. 예를 들면, 인간 IL-7을 이용하는 경우, 인간 IL-7을 코딩하는 염기 서열로는, GenBank 번호: NM_002190.2(서열 번호 58)로서 등록된 것 등을 들 수 있다. 또한, 인간 CCL19를 이용하는 경우, 인간 CCL19를 코딩하는 염기 서열의 예로는, GenBank 번호: NM_006274.2(서열 번호 60)로서 등록된 것 등을 들 수 있다.
또한, 이들 단백질을 코딩하는 염기 서열은, 공지의 것으로 한정되지 않고, 이들 단백질을 코딩하는 염기 서열이라면 어떠한 서열이라도 되고, 유전자 코드의 축퇴에 의해 생성되는 복수의 염기 서열 중 어느 하나라고 된다. 이들 단백질을 코딩하는 염기 서열로는, 도입하는 세포의 생물종에 따라 코돈 최적화되어 있는 것이 바람직하고, 인간 세포에 도입하는 경우에는 인간 코돈에 최적화되어 있는 것이 바람직하다.
또한, 이들 단백질을 코딩하는 염기 서열은, 천연 IL-7 및 천연 CCL19의 변이체를 코딩하는 것이라도 된다. 이들 변이체에 대해서는, 상기 [항GM2 CAR을 발현하는 세포(항GM2 CAR 발현 세포)]의 항에 기재한 바와 같다.
또한, 다른 단백질로는, 자살 유전자를 들 수도 있다. 자살 유전자에 대해서는, 상기 [항GM2 CAR을 발현하는 세포(항GM2 CAR 발현 세포)]의 항에 기재한 바와 같다. 자살 유전자를 코딩하는 염기 서열은, GenBank 등의 공지의 서열 데이터베이스로부터 입수 가능하다. 또한, 시판 중인 자살 유전자를 포함하는 벡터 등의 서열을 이용할 수도 있다.
본 실시 형태의 폴리 뉴클레오티드가, 다른 단백질을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 경우, 항GM2 CAR을 코딩하는 염기 서열과 당해 다른 단백질을 코딩하는 염기 서열 사이에는, 2A 펩티드 등의 자기 절단형 펩티드를 코딩하는 염기 서열이나, IRES(internal ribozyme entry site) 서열 등을 개재시켜도 된다. 또한, 다른 단백질이 2개 이상인 경우, 당해 다른 단백질의 사이에도 자기 절단형 펩티드나 IRES 등을 개재시켜도 된다. 이들 서열을 개재시킴으로써, 1개의 프로모터로부터 복수의 단백질을 독립적으로 발현시킬 수 있다.
2A 펩티드로는, 예를 들면 피코르나바이러스(picornavirus), 로타바이러스(rotavirus), 곤충 바이러스(insect virus), 아프타바이러스(aphthovirus), 트리파노소마 바이러스(trypanosoma virus) 등의 2A 펩티드를 예시할 수 있다. 구체예로서, 피코르나바이러스의 2A 펩티드(F2A)의 아미노산 서열을 서열 번호 62에 나타낸다. 2A 펩티드를 코딩하는 염기 서열은, 도입하는 세포의 생물종에 따라 코돈 최적화되어 있는 것이 바람직하고, 인간 세포에 도입하는 경우에는 인간 코돈에 최적화되어 있는 것이 바람직하다.
또한, 본 실시 형태의 폴리 뉴클레오티드는, 항GM2 CAR을 코딩하는 염기 서열 및 다른 단백질을 코딩하는 염기 서열의 단백질 코드 서열마다, 프로모터, 증폭자, 폴리A 부가 시그널, 종결자 등의 제어 서열을 갖는 것이라도 된다. 또한, 일부의 단백질 코드 서열이 독립적으로 제어 서열을 갖고, 그 외의 단백질 코드 서열이 2A 펩티드나 IRES 등을 개재해 연결되어 공통의 제어 서열을 갖는 것이라도 무방하다.
[항GM2 CAR을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 벡터]
일 실시 형태에 있어서, 본 발명은, 항GM2 CAR을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 벡터를 제공한다.
상기 실시 형태의 폴리 뉴클레오티드는, 벡터의 형태라도 된다. 벡터의 종류는 특별히 한정되지 않고, 일반적으로 사용되는 발현 벡터 등을 사용할 수 있다. 벡터는 직쇄상이라도 되고, 환상이라도 되며, 플라스미드(plasmid) 등의 비바이러스 벡터라도 되고, 바이러스 벡터라도 되고, 트랜스포존(transposon)에 의한 벡터라도 된다. 벡터로는, 예를 들면 바이러스 벡터, 플라스미드 벡터, 에피소말 벡터(episomal vector), 인공 염색체 벡터 등을 들 수 있다.
바이러스 벡터로는, 예를 들면 센다이바이러스(Sendai virus) 벡터, 레트로바이러스(retrovirus, 렌티바이러스(lentivirus)를 포함한다) 벡터, 아데노바이러스(Adenovirus) 벡터, 아데노관련 바이러스(adeno-associated virus) 벡터, 헤르페스바이러스(herpes virus) 벡터, 백시니바이러스(vaccinia virus) 벡터, 폭스바이러스(pox virus) 벡터, 폴리오바이러스(polio virus) 벡터, 신드비스바이러스(sindbis virus) 벡터, 라브도바이러스(rhabdovirus) 벡터, 파라믹소바이러스(paramyxovirus) 벡터, 오르토믹소바이러스(orthomyxovirus) 벡터 등을 들 수 있다.
플라스미드 벡터로는, 예를 들면 pA1-11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neo 등의 동물세포 발현용 플라스미드 벡터를 들 수 있다.
에피소말 벡터는, 염색체외에서 자율 복제 가능한 벡터이다. 에피소말 벡터로는, 예를 들면 EBV, SV40 등에 유래하는 자율 복제에 필요한 서열을 벡터 요소로서 포함하는 벡터를 들 수 있다. 자율 복제에 필요한 벡터 요소로는, 구체적으로는, 복제 개시점과, 복제 개시점에 결합해 복제를 제어하는 단백질을 코딩하는 유전자를 들 수 있다. 예를 들면, EBV에서는 복제 개시점 oriP와 EBNA-1 유전자, SV40에서는 복제 개시점 ori와 SV40LT 유전자를 들 수 있다.
인공 염색체 벡터로는, 예를 들면 YAC(Yeast artificial chromosome) 벡터, BAC(Bacterial artificial chromosome) 벡터, PAC(P1-derived artificial chromosome) 벡터 등을 들 수 있다.
본 실시 형태의 벡터의 바람직한 예로는, 바이러스 벡터를 들 수 있고, 보다 바람직한 예로는 레트로바이러스 벡터를 들 수 있다. 레트로바이러스 벡터로는, pMSGV1 벡터(Tamada k et al., Clin Cancer Res 18: 6436-6445(2012))나 pMSCV 벡터(Takara Bio 제품)를 예시할 수 있다. 레트로바이러스 벡터를 이용함으로써, 벡터중의 유전자가 호스트 세포의 게놈에 도입되어, 호스트 세포중에서 장기간 안정적으로 발현시키는 것이 가능해진다.
본 실시 형태의 벡터는, 상기 [항GM2 CAR을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리 뉴클레오티드]의 항에 기재한 염기 서열 외에, 복제 개시점, 복제 개시점에 결합해 복제를 제어하는 단백질을 코딩하는 염기 서열, 약제 내성 유전자, 리포터 유전자 등의 마커 유전자를 코딩하는 염기 서열 등을 포함하고 있어도 된다.
항GM2 CAR을 코딩하는 염기 서열은, 적절한 프로모터의 제어하에서 발현되도록, 벡터내에 배치되는 것이 바람직하다. 또한, 다른 단백질을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 경우는, 이들 염기 서열도 적절한 프로모터의 제어하에서 발현되도록 벡터내에 배치되는 것이 바람직하다. 프로모터로는, 예를 들면 SRα 프로모터, SV40 초기 프로모터, 레트로바이러스의 LTR, CMV(사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus)) 프로모터, RSV(라우스 육종 바이러스) 프로모터, HSV-TK(단순 헤르페스바이러스 티미딘키나아제) 프로모터, EF1α 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터(metallothionein promoter), 열충격 프로모터(heat shock promoter) 등을 들 수 있다. 또한, 인간 CMV의 IE 유전자의 증폭자를 프로모터와 함께 이용해도 된다. 일례로는, CAG 프로모터(사이토메갈로바이러스 증폭자, 닭 β-엑틴 프로모터 및 β-글로빈 유전자의 폴리A 시그널 부위를 포함한다) 등을 들 수 있다. 또한, 상기 [항GM2 CAR을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리 뉴클레오티드]에 기재한 바와 같이, 각 단백질 코드 서열 사이에 자기 절단형 펩티드를 코딩하는 염기 서열이나 IRES를 배치해, 공통의 프로모터의 제어하에서 전사되도록 해도 된다.
바람직한 형태에 있어서, 본 실시 형태의 벡터는, 항GM2 CAR을 코딩하는 염기 서열 외에, IL-7을 코딩하는 염기 서열 및 CCL19를 코딩하는 염기 서열 중 적어도 하나를 더 포함한다. 보다 바람직한 형태에 있어서, 본 실시 형태의 벡터는, 항GM2 CAR을 코딩하는 염기 서열 외에, IL-7을 코딩하는 염기 서열 및 CCL19를 코딩하는 염기 서열을 더 포함한다.
바람직하게는, 본 실시 형태의 벡터는, 적절한 프로모터에 기능적으로 연결된 항GM2 CAR을 코딩하는 염기 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, 본 실시 형태의 벡터는, 항GM2 CAR을 코딩하는 염기 서열, IL-7을 코딩하는 염기 서열 및 CCL19를 코딩하는 염기 서열이, 자기 절단형 펩티드를 코딩하는 염기 서열 또는 IRES를 개재해 연결된 염기 서열을 포함하고, 당해 염기 서열은, 적절한 프로모터에 기능적으로 연결되어 있다. 한편, '프로모터에 기능적으로 연결되었다'란, 프로모터의 제어하에서 발현되도록, 프로모터의 하류에 연결되어 있는 것을 의미한다. 상기의 예에서, 항GM2 CAR을 코딩하는 염기 서열, IL-7을 코딩하는 염기 서열 및 CCL19를 코딩하는 염기 서열의 배치 순서는, 특별히 한정되지 않고, 임의의 배치 순서로 할 수 있다.
[항GM2 CAR을 발현하는 세포의 제조 방법]
일 실시 형태에 있어서, 본 발명은, 항GM2 CAR을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리 뉴클레오티드 또는 벡터를 세포에 도입하는 것을 포함하는, 항GM2 CAR을 발현하는 세포의 제조 방법을 제공한다.
상기 실시 형태의 항GM2 CAR을 발현하는 세포(이하, '항GM2 CAR 발현 세포'라고도 한다)는, 상기 실시 형태의 항GM2 CAR을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리 뉴클레오티드 또는 벡터를 세포에 도입함으로써 얻을 수 있다. 세포 내에 도입된 폴리 뉴클레오티드 또는 벡터는, 항GM2 CAR을 발현 가능한 상태로 세포 내에서 유지된다. '발현 가능한 상태'란, 항GM2 CAR을 코딩하는 염기 서열이 전사·번역될 수 있는 상태에 있는 것을 의미한다.
폴리 뉴클레오티드 또는 벡터를 세포에 도입하는 방법은, 특별히 한정되지 않고, 공지의 방법을 이용할 수 있다. 예를 들면, 바이러스 감염법, 리포펙션(lipofection)법, 미량주사법(microinjection), 인산칼슘법, DEAE-덱스트란법, 전기천공법(electroporation method), 트랜스포존을 이용하는 방법, 입자총(particle gun) 법등을 들 수 있다.
또한, 벡터가 레트로바이러스 벡터인 경우, 벡터가 갖고 있는 LTR 서열 및 패키지 시그널 서열에 기초해 적절한 패키지 세포를 선택하고, 이를 사용해 레트로바이러스 입자를 조제해도 된다. 패키지 세포로는, 예를 들면 PG13, PA317, GP+E-86, GP+envAm-12, Psi-Crip 등을 예시할 수 있다. 또한, 트랜스펙션(transfection) 효율이 높은 293 세포나 293 T세포를 패키지 세포로서 이용할 수도 있다. 각종 레트로바이러스 벡터 및 당해 벡터의 패키지에 사용 가능한 패키지 세포는, 널리 시판되고 있기 때문에, 이들 시판품을 이용해도 무방하다. 예를 들면, GP2-293 세포(Takara Bio 제품), Plat-GP세포(Cosmo Bio 제품), PG13 세포(ATCC CRL-10686), PA317 세포(ATCC CRL-9078) 등을 이용할 수 있고, Retrovirus packaging Kit Eco(Takara Bio 제품) 등의 시판 중인 키트를 이용해도 무방하다.
항GM2 CAR 발현 세포에, IL-7, CCL19, 자살 유전자 등의 다른 외래 단백질을 발현시키는 경우, 이들 다른 단백질을 코딩하는 염기 서열을, 항GM2 CAR을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 벡터에 포함시키도록 해도 되고, 다른 벡터에 포함시키도록 해도 된다. 다른 단백질을 코딩하는 염기 서열을 다른 벡터에 포함시키는 경우, 항GM2 CAR을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 벡터와, 동시에 또는 각각, 당해 벡터를 세포에 도입할 수 있다.
또한, 항GM2 CAR 발현 세포는, 항GM2 CAR을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리 뉴클레오티드를, 공지의 유전자 편집 기술 등을 이용해 적절한 프로모터의 제어하에서 발현 가능하도록, 세포의 게놈에 도입함으로써 제조해도 된다. 유전자 편집 기술로는, 예를 들면 징크 핑거 뉴클레아제(Zinc Finger Nuclease), TALEN(Transcription activator-like effector nuclease), CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)-Cas 시스템, PPR(pentatricopeptide repeat) 등의 엔도뉴클레아제(endonuclease)를 이용하는 기술을 들 수 있다. 항GM2 CAR 발현 세포에 다른 외래 단백질을 발현시키는 경우도 마찬가지로, 유전자 편집 기술 등을 이용해, 다른 외래 단백질을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리 뉴클레오티드를, 적절한 프로모터의 제어하에서 발현 가능하도록, 세포의 게놈에 도입해도 된다. 예를 들면, 적절한 프로모터에 기능적으로 연결된 항GM2 CAR(또는 다른 단백질)를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리 뉴클레오티드를, 세포 게놈의 비코드 영역 등에 도입하는 방법; 항GM2 CAR(또는 다른 단백질)를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리 뉴클레오티드를, 세포 게놈의 내재성 프로모터의 하류에 도입하는 방법 등을 들 수 있다. 내재성 프로모터로는, 예를 들면 TCRα, TCRβ의 프로모터 등을 들 수 있다.
항GM2 CAR을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리 뉴클레오티드 또는 벡터를 세포에 도입한 후, 당해 세포에서의 항GM2 CAR의 발현은 플로사이토메트리, RT-PCR, 노던 블로팅(Northern blotting), 웨스턴 블로팅(Western blotting), ELISA, 형광 면역 염색 등의 공지의 방법에 의해 확인할 수 있다. 또한, IL-7 및 CCL19 등의 다른 외래 단백질의 발현도, 마찬가지로 공지의 방법에 의해 확인할 수 있다.
[항GM2 CAR 발현 세포를 함유하는 의약 조성물]
일 실시 형태에 있어서, 본 발명은, 항GM2 CAR 발현 세포를 함유하는, 의약 조성물을 제공한다.
항GM2 CAR 발현 세포는, GM2 발현 세포에 대해, 특이적인 세포 상해 활성을 나타낸다. 이 때문에, 항GM2 CAR 발현 세포는, GM2 발현 세포가 관여하는 질환을 치료 또는 예방하기 위해 사용할 수 있다. GM2는, 폐암, 신경아종, 신경교종, 흑색종, 악성중피종, 골수종 등을 포함하는 폭넓은 종양 세포에 발현하고 있는 것으로부터, 항GM2 CAR 발현 세포를 함유하는 의약 조성물은, 종양을 치료 또는 예방하기 위한 의약 조성물로서 이용할 수 있다. 종양은, 골조직, 연골 조직, 지방조직, 근육조직, 혈관 조직 및 조혈조직의 어느 것에서 생긴 것이라도 된다. 종양으로는, 예를 들면 신경교종, 흑색종, 악성중피종, 폐암, 췌장암, 두경부암, 간암, 자궁암, 방광암, 담관암, 식도암, 정소 종양, 갑상선암, 뇌종양, 전립선암, 대장암, 신장 암, 난소암, 유방암, 선암, 편평상피암, 선편평상피암, 미분화 암, 대세포 암, 소세포 암, 피부암, 질암, 경부암, 비장암, 기관암, 기관지암, 소장암, 위암, 담낭 암, 정소암 등의 암; 골육종, 연골육종, 유잉육종, 악성 혈관내피종, 악성 신경초종, 연부 조직 육종 등의 육종; 신경아종, 간아종, 골수아종, 신장아종(nephroblastoma), 췌장아종(pancreatoblastoma), 흉막폐아종, 망막아종 등의 아종; 배세포 종양; 림프종, 백혈병, 골수종 등의 혈액암 등을 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 특히, 본 실시 형태의 의약 조성물은, GM2를 발현하는 종양을 치료 또는 예방하기 위한 의약 조성물로서 매우 적합하다. GM2를 발현하는 종양으로는, 예를 들면 폐암, 신경아종, 신경교종, 흑색종, 악성중피종, 골수종 등을 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 종양이 GM2를 발현하고 있는지 여부는, 예를 들면 항GM2 항체 등을 이용한 공지의 방법에 의해 확인할 수 있다. 공지의 방법으로서는, 플로사이토메트리, ELISA, 면역 염색, 형광 면역 염색 등을 예시할 수 있다. 항GM2 CAR 외에, IL-7 및 CCL19의 어느 하나 또는 모두를 발현하는 세포(바람직하게는 T세포)는, GM2를 발현하는 종양이라면, 고형 종양에 대해서도 강한 세포 상해 활성을 발휘할 수 있다. 이 때문에, 항GM2 CAR, 그리고 IL-7 및 CCL19의 어느 하나 또는 모두를 발현하는 세포(바람직하게는 T세포)를 함유하는 본 실시 형태의 의약 조성물은, GM2를 발현하는 고형 종양에 대해, 특별히 바람직하게 이용할 수 있다. 따라서, 항GM2 CAR, 그리고 IL-7 및 CCL19의 어느 하나 또는 모두를 발현하는 세포(바람직하게는 T세포)를 함유하는 고형 종양을 치료 또는 예방하기 위한 의약 조성물은, 본 실시 형태의 의약 조성물의 바람직한 예이다. '고형 종양'이란, 조혈계 조직으로부터 발생하는 혈액암 이외의 종양을 의미하고, 상피세포암 및 비상피세포암을 포함한다.
본 실시 형태의 의약 조성물은, 항GM2 CAR 발현 세포 외에, 약학적으로 허용되는 담체 등의 다른 성분을 함유하고 있어도 된다. 다른 성분으로는, 예를 들면 약학적으로 허용되는 담체 외에, 사이토카인 등의 T세포 활성화 인자, 면역 자극제(immunostimulant), 면역 체크 포인트 저해제, 다른 CAR을 발현하는 세포, 항염증제 등을 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 약학적으로 허용되는 담체로는, 세포 배양 배지, 생리 식염수, 인산 완충액, 구연산 완충액 등을 들 수 있다.
본 실시 형태의 의약 조성물은, 공지의 방법에 의해 투여할 수 있지만, 바람직하게는, 주사 또는 주입에 의해 환자에게 투여할 수 있다. 투여 경로로는 정맥내 투여가 바람직하지만, 이것으로 한정되지 않고, 종양내 주입 등에 의해 투여해도 된다.
본 실시 형태의 의약 조성물은, 항GM2 CAR 발현 세포를 치료적 유효량 함유할 수 있다. '치료적 유효량'이란, 질환의 치료 또는 예방을 위해 유효한 약제의 양을 의미한다. 치료적 유효량은, 투여 대상의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중 등에 의해 변동될 수 있다. 본 실시 형태의 의약 조성물에 있어서, 상기의 항GM2 CAR 발현 세포의 치료적 유효량은, 예를 들면 항GM2 CAR 발현 세포가 종양의 증식을 억제할 수 있는 양일 수 있다.
본 실시 형태의 의약 조성물의 투여량 및 투여 간격은, 투여 대상의 연령, 성별 및 체중 등, 질환의 종류, 진행도 및 증상 등, 그리고 투여 방법 등에 의해, 적절하게 선택할 수 있다. 투여량으로는, 치료적 유효량을 투여할 수 있으며, 예를 들면, 1회의 투여에서, 투여 세포의 개수로서 1×104∼1×1010개, 바람직하게는 1×105∼1×109개, 보다 바람직하게는 5×106∼5×108개를 들 수 있다.
본 실시 형태의 의약 조성물의 투여 간격으로는, 예를 들면 1주마다, 10∼30일마다, 1개월마다, 3∼6개월마다, 1년마다 등으로 할 수 있다. 또한, 항GM2 CAR 발현 세포는, 투여 대상의 체내에서 자율적으로 증식할 수 있기 때문에, 단 1회의 투여로 할 수도 있다. 또한, 투여 후에 체내의 항GM2 CAR 발현 세포의 수를 모니터링해, 그 결과에 따라 투여 시기를 결정하도록 해도 된다.
또한, 본 실시 형태의 의약 조성물은, 다른 항암제와 병용해 이용할 수 있다. 다른 항암제로는, 시클로포스파미드(cyclophosphamide) 등의 알킬화제, 펜토스타틴(pentostatin) 등의 대사길항제, 리툭시맙(rituximab) 등의 분자 표적제, 이매니팁(imatinib) 등의 키나제 저해제, 보르테조밉(bortezomib) 등의 프로테아좀 저해제, 시클로스포린(cyclosporin) 등의 칼시뉴린 저해제, 이다루비신(idarubicin)등의 항암성 항생 물질, 이리노테칸(irinotecan) 등의 식물 알카로이드, 시스플라틴(cisplatin) 등의 플라티나 제재, 타목시펜(tamoxifen) 등의 호르몬 요법제, 니볼루맙(nivolumab), 펜브롤리주맙(pembrolizumab) 등의 면역 제어제 등을 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다.
또한, 다른 형태에 있어서, 본 발명은, 1) 종양을 치료 또는 예방하기 위한 의약 조성물의 제조에서의, 항GM2 CAR 발현 세포의 사용, 2) 항GM2 CAR 발현 세포를 대상(예를 들어, GM2를 발현하는 종양에 걸린 환자, 종양의 외과적 절제를 실시한 환자 등)으로 투여하는 것을 포함하는, GM2를 발현하는 종양을 치료 또는 예방하는 방법, 3) 종양의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 항GM2 CAR 발현 세포, 4) 종양을 치료 또는 예방하기 위한 항GM2 CAR 발현 세포의 사용을 제공한다.
또한, 다른 형태에 있어서, 본 발명은, 상기 실시 형태의 벡터를 포함하는, 항GM2 CAR 발현 세포를 제작하기 위한 키트를 제공한다. 당해 키트는, 상기 실시 형태의 벡터를 포함하고 있으면 특별히 제한되지 않고, 항GM2 CAR 발현 세포를 제작하기 위한 설명서나, 벡터를 세포에 도입하기 위해 이용하는 시약 등을 포함하고 있어도 된다.
《실시예》
이하, 실시예에 의해 본 발명을 설명하지만, 본 발명이 이하의 실시예로 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] IL-7 및 CCL19를 발현하는 항GM2 CAR 발현 T세포의 제작(T세포의 면역 기능 촉진 인자의 선택)
T세포의 기능을 제어할 수 있는 분자는 적어도 생체내에 수백 종류 존재한다. 본 발명자들은, CAR-T 세포에서의 항종양 효과를 높이기 위한 면역 기능 촉진 인자로서, 방대한 조합중에서 IL-7과 CCL19를 선택했다.
한편, 상기 IL-7은 T세포의 생존에 필수의 사이토카인으로, 골수, 흉선 및 림프계 기관·조직 등에 존재하는 스트로마 세포 등의 비조혈 세포에 의해 생성된다. 한편, T세포에는, IL-7의 생성 능력은 거의 인정되지 않는다.
또한, 상기 CCL19는 주로 림프절 중의 수지상 세포나 대식 세포로부터 생성 되고, 그 수용체인 CCR7를 개재해 T세포나 B세포, 성숙한 수지상 세포의 이동을 야기하는 기능을 갖는다.
(항GM2 CAR의 scFv 서열)
항GM2 scFv의 서열을, 기존의 GM2 항체의 서열에 기초해 설계했다. VL 및 VH의 순서나 링커의 종류를 비교하기 위해, VL-링커 15-VH(서열 번호 9: VL15VH), VL-링커 25-VH(서열 번호 11: VL25VH), VH-링커 15-VL(서열 번호 13: VH15VL), 및 VH-링커 25-VL(서열 번호 15: VH25VL)의 각 DNA 단편을 합성했다. 한편, 이후의 실시예에서는, 특별히 기재가 있는 경우를 제외하고, 항GM2 scFv 서열로서 VL15VH를 사용했다.
(IL-7 및 CCL19를 발현하는 항GM2 CAR 발현 벡터의 제작)
먼저, 인간 IL-7(종결코돈 없음)과, 그에 이어지는 F2A와 인간 CCL19를 코딩하는 IL-7-F2A-CCL19 DNA 단편(서열 번호 33: IL-7-F2A-CCL19)을 화학 합성했다. 다음으로, pMSGV1 레트로바이러스 발현 벡터(Tamada k et al., Clin Cancer Res 18: 6436-6445(2012))에 마우스 항CD20 scFv, 마우스 CD8 막관통 영역, 마우스 CD28-4-1BB-CD3ζ 세포내 시그널 모티프, 및 마우스 IL-7-F2A-마우스 CCL19로 이루어지는 구조물을 삽입한 기존의 마우스 항CD20 CAR-IL-7/CCL19 벡터를 이용해, 벡터내의 마우스 IL-7-F2A-CCL19의 영역을, 합성한 인간 IL-7-F2A-CCL19 DNA 단편(서열 번호 33)으로, 제한 효소(Nsⅱ 및 SalI) 처리 및 결찰(ligation)에 의해 치환했다. 또한, 인간 항CD20 scFv, 인간 CD8 막관통 영역, 및 인간 CD28-4-1BB-CD3ζ 세포내 시그널 모티프로 이루어지는 인간 항CD20 CAR DNA 단편(서열 번호 37: 항CD20 CAR)을 화학 합성해, 벡터 내의 마우스 항CD20 CAR 영역을 이 DNA 단편으로 제한 효소(NcoI 및 EcoI) 처리 및 결찰에 의해 치환했다. 마지막으로, 인간 항GM2 scFv를 코딩하는 DNA 단편(서열 번호 9, 11, 13, 15)을 화학 합성해, 벡터 내의 항CD20 scFv를 이 DNA 단편으로 제한 효소(NcoI 및 NotI) 처리 및 결찰에 의해 치환했다. 한편, 항GM2 CAR DNA 단편의 구조물을 도 1a에, 얻어진 벡터의 배치도를 도 1b에 나타냈다.
(IL-7/CCL19 및 HSV-tk를 발현하는 항GM2 CAR 발현 벡터의 제작)
CAR-T 세포 요법에서는, 표적 항원에 대한 강력한 면역 응답에 의해 사이토카인 방출 증후군 등의 전신성 부작용이 일어나는 경우가 있다. 이 문제에 대응하기 위해 자살 유전자로서 헤르페스바이러스 유래 티미딘키나아제 유전자 HSV-tk를 도입한 CAR 구조물을 제작했다. 이 구조물을 유전자 도입해 CAR-T 세포에 HSV-tk를 발현시키면, 사이토메갈로바이러스 치료약인 간사이클로비르(ganciclovir)의 첨가에 의해 CAR-T 세포는 아포토시스(apoptosis)가 유도되어 사멸하는 것으로부터, 간사이클로비르 투여에 의해 체내의 CAR-T 세포의 제어가 가능해진다.
우선 IL-7-F2A-CCL19-HSV-tk DNA 단편(서열 번호 35: IL-7-F2A-CCL19-HSV-tk)을 화학 합성했다. 다음으로, IL-7 및 CCL19를 발현하는 항GM2 CAR 발현 벡터(서열 번호 39) 내의 IL-7-F2A-CCL19의 영역을, 합성한 IL-7-F2A-CCL19-HSV-tk DNA 단편(서열 번호 35)으로, 제한 효소(Nsⅱ 및 SalI) 처리 및 결찰에 의해 치환해, IL-7/CCL19 및 HSV-tk를 발현하는 항GM2 CAR 발현 벡터(서열 번호 47)를 제작했다.
(IL-7/CCL19 발현-항GM2 CAR 벡터를 도입한 레트로바이러스의 제작)
T세포로의 유전자 도입을 위해 레트로바이러스를 제작했다. 리포펙타민(Lipofectamine) 3000(Life Technology 제품)을 이용해, 전술의 IL-7/CCL19 발현-항GM2 CAR 벡터와 p-Ampho 플라스미드(Takara Bio 제품)를 GP2-293 패키지 세포주(Takara Bio 제품)에 트랜스펙션 함으로써, IL-7/CCL19 발현-항GM2 CAR 벡터를 도입한 레트로바이러스를 제작했다. 트랜스펙션으로부터 48시간 후에 상기 레트로바이러스를 함유하는 상청액을 회수했다.
상기 GP2-293 세포의 배양액으로는, 10% FCS, 100 U/㎖의 페니실린, 100 mg/㎖의 스트렙토마이신을 첨가한 DMEM을 이용했다. 또한, 후술하는 실시예에서 이용하는 T세포의 배양액으로는, 2.0% 인간 AB형 혈청(Sigma 제품), 1% Penicillin-Streptmycin(Wako Pure Chemical Industries 제품), 2.5 ㎍/㎖의 암포테리신 B(Bristol-Myers Squibb 제품)을 함유하는 GT-T551을 이용했다.
(T세포의 형질 도입)
건강한 도너의 혈액으로부터 말초혈 단핵구를 채취해, T세포 활성화를 위해 항CD3 단일 클론 항체(5 ㎍/㎖) 및 레트로넥틴(RetroNectin, 등록상표: Takara Bio 제품, 25 ㎍/㎖)을 고층화(固層化)한 플레이트 상에서, 2×106개의 IL-2(200 IU/㎖: Peprotech 제품)와 함께, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 3일간 배양했다. 배양 개시 후 2일째에, 전술한 바와 같이 제작한 IL-7/CCL19 발현-항GM2 CAR 벡터를 도입한 레트로바이러스를 함유하는 상청액을, 미리 25 ㎍/㎖의 레트로넥틴(Takara Bio 제품)으로 코팅한 표면 미처리 24 웰 플레이트에 1웰당 500㎕씩 첨가하고, 2000 g, 2시간의 원심에 의해 레트로바이러스 프리로드 플레이트를 제작했다. 플레이트는 총 2매 제작하고, 원심 종료후, 1.5% BSA/PBS로 세정해, 사용할 때까지 4℃에서 보존했다. 배양 3일째에, 활성화시킨 세포를 상기 플레이트로부터 회수해, 세포 현탁액(1×105 cells/㎖)으로 조제했다. 이 세포 현탁액을 1웰당 1㎕씩 레트로바이러스 프리로드 플레이트에 첨가하고, IL-2(최종 농도 200 IU/㎖) 존재하에서 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양해, 1회차의 레트로바이러스 감염을 행했다. 다음날(배양 4일째), 각 웰의 세포 용액을 보존하고 있던 2매째의 바이러스 프리로드 플레이트로 옮겨, 500 g로 1분간 원심 후, 37℃에서 4시간 배양해, 2회차의 감염을 행했다. 37℃에서 4시간 배양 후, 각 웰의 세포 현탁액 1㎖를 새로운 12 웰 세포 배양 플레이트로 옮겨, IL-2(200 IU/㎖)를 함유하는 새로운 배양액(GT-T551)으로 4배로 희석하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양했다. 말초혈 단핵구의 배양 개시일부터 계산해 7일째까지 배양해, IL-7/CCL19 발현-항GM2 CAR 벡터를 도입한 T세포(항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포)를 얻었다(도 1b). 또한 동시에, CAR 음성 세포 대조군으로서, 건강한 도너로부터 얻은 말초혈 단핵구를 같은 방법으로 활성화하지만, 레트로바이러스 감염을 행하지 않은 비유전자 도입 세포를 제작했다.
[실시예 2] 플로사이토메트리에 의한 CAR 발현 측정(플로사이토메트리 해석)
GM2를 항원으로서 인식하는 CAR의 발현 레벨 해석을, 2색 플로사이토메트리 해석에 의해 실시했다. 제작한 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포를, 비오틴화 프로틴 L(GenScript 제품), 알로피코시아닌(APC) 표지 스트렙트아비딘(Affymetrix 제품), 및 APC 표지 항CD8 단일 클론 항체(Affymetrix 제품)와 반응시켜, 염색을 실시했다. 플로사이토메트리는 EC800(소니 제품)을 이용하고, 데이터 해석은 FlowJo software(Tree Star 제품)를 이용했다.
결과를 도 2에 나타낸다. 왼쪽은 CAR 유전자 도입이 없는 세포, 오른쪽은 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포의 결과이다. 또한, 도면 중의 수치는 각각의 개체군의 퍼센티지를 나타낸다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포에서 약 68%의 CAR의 발현이 확인되었다.
[실시예 3] IL-7, CCL19의 생성
(항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포에서의 배양 상청액 중의 IL-7, CCL19 농도 측정)
전술한 배양 7일째의 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포 또는 비유전자 도입 세포의 배양 상청액을 회수해, 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포에 의한 IL-7 및 CCL19의 생성에 대해 시판 중인 ELISA 키트(각각 Peprotech 및 R&D systems 제품)를 이용해 검토했다.
[결과]
결과를 도 3에 나타낸다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포의 배양 상청액 중(GM2 CAR)에서, IL-7에 대해서는 300 pg/㎖ 이상, CCL19에 대해서는 2000 pg/㎖ 이상 검출되었다. 이 결과로부터, 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포는 IL-7 및 CCL19를 발현하고, 또한 발현한 IL-7 및 CCL19가 세포 외로 분비되는 것이 확인되었다. 한편, 대조군의 비유전자 도입 T세포의 배양 상청액 중(non infection)에서는, IL-7 및 CCL19 모두 검출 한계 이하(Not detected)였다.
[실시예 4] 각 종양 세포의 GM2 발현
(플로사이토메트리 해석)
악성중피종의 세포주 Y-meso8A, MSTO211H, 골수종의 세포주 KMS-11, KMS-28PE, 대장암의 세포주 SW480을, Alexa 488로 표지한 항GM2 항체와 대조군의 항DNP 항체로 염색하고, 플로사이토메트리 해석에 의해 각 종양 세포에서의 GM2의 발현을 측정했다. Alexa 488 표지 항GM2 항체 및 Alexa 488 표지 항DNP 항체는, 모두 10 ㎍/샘플로 염색을 실시했다.
대장암 세포주 SW480에서는 GM2의 발현이 인정되지 않았지만, 악성중피종 세포주 Y-meso8A, MSTO211H와 골수종 세포주 KMS-11, KMS-28PE에서 GM2의 발현이 확인되었다.
[실시예 5] 세포 상해성 시험
(항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포에 의한 51Cr 방출 시험 1)
도 4는, 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포 제작, 세포 상해성 시험, 공배양 시험의 시험 스케줄을 나타낸 도면이다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 8일째에 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포를 회수하고, 표준적인 4시간 51Cr 방출 아세이를 이용해 종양 세포에 대한 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포의 세포 상해 활성을 평가했다.
인간 GM2를 발현하는 각종 종양 세포를 타겟 세포로서 이용했다. 상기 종양 세포주를, 100 μCi Na2 51CrO4 존재하, 37℃에서 1시간 배양한 후에, 3회 세정해, 96 웰 V-바닥 플레이트(Nunc 제품)에 1웰당 5×103개를 첨가했다. 그 후, 이펙터 T세포로서 항GM2 CAR의 scFv의 VH 및 VL, 그리고 링커의 조합을 바꾼 4 종류의 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포, 또는 비유전자 도입 T세포를 첨가해, 타겟 세포와 37℃에서 4시간 공배양을 실시했다. 한편, 이펙터/타겟비(E/T ratio)는 2.5, 5, 10, 20, 40의 범위에서 조정했다. 타겟 세포의 최대 방출과 자연 방출은, 타겟 세포를 10% Triton-X(Sigma-Aldrich 제품) 함유 배양액 또는 배양액만으로 배양함으로써 측정했다. 상청의 51Cr 방출은 TopCount 신틸레이션 카운터(PerkinElmer 제품)로 측정했다. 세포 상해 활성의 비율은, 식: 세포 상해 활성(%)=[(시험 방출-자연 방출)/(최대 방출-자연 방출)]×100으로 산출했다.
[결과]
결과를 도 5a 및 도 5b에 나타낸다. 도 5a는 악성중피종 세포주(Y-meso8A, MSTO211H)를 타겟 세포로 한 결과이며, 도 5b는 골수종 세포주(KMS-11, KMS-28PE)를 타겟 세포로 한 결과이다. 도면 중, 'VL15VH', 'VL25VH', 'VH15VL' 및 'VH25VL'은, 각각, 당해 서열을 항GM2 CAR의 scFv 서열로서 포함하는 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포를 나타낸다. 도 5a 및 도 5b에 나타낸 바와 같이, 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포는, VH, VL 및 링커의 어떤 조합에 의해서도, 종양 세포주에 대한 세포 상해성을 나타냈다. 한편, 대조군의 비유전자 도입 T세포(non infection)는, 종양 세포주에 대한 세포 상해 활성을 거의 나타내지 않았다. 한편, 도 5a 및 도 5b의 그래프의 횡축은 이펙터(T세포)와 타겟(종양 세포)의 비를 E/T ratio로 나타내고, 종축은 세포 상해 활성(%)을 나타낸다.
(항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포에 의한 51Cr 방출 시험 2)
항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포에 의한 세포 상해 활성의 GM2 특이성을 검토하기 위해, 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포, CAR-T 세포의 대조군으로서의 FITC를 인식하는 항FITC CAR-T 세포, 및 비유전자 도입 T세포를 이용해, 각 세포의 GM2 양성 종양 세포주 및 GM2 음성 종양 세포주에 대한 세포 상해 활성을 비교 검토했다. 한편, 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포에는, scFv 서열로서 VL15VH를 포함하는 것을 이용했다.
[결과]
결과를 도 6a∼도 6c에 나타낸다. 도 6a는 악성중피종 세포주(Y-MESO8A), 도 6b는 골수종 세포주(KMS11), 도 6c는 대장암 세포주(SW480)를 타겟 세포로 한 결과이다. 도 6a∼도 6c에 나타낸 바와 같이, 항FITC CAR-T 세포(FITC CAR-T)는 어떤 타겟 세포에 대해서도 유의미한 세포 상해 활성은 인정되지 않고, 비유전자 도입 T세포(non infection)와 거의 동일한 정도였다. 한편, 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포(GM2 CAR-T)는, GM2를 발현하는 세포(Y-MESO8A, KMS11)에 대해서는 세포 상해성을 나타냈지만, GM2를 발현하지 않는 세포(SW480)에 대해서는 세포 상해성을 나타내지 않았다. 이로부터 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포는 GM2 특이적으로 세포 상해 활성을 유도하는 것이 확인되었다. 한편, 도 6a∼도 6c의 그래프의 횡축은 이펙터(T세포)와 타겟(종양 세포)의 비를 E/T ratio로 나타내고, 종축은 세포 상해 활성(%)을 나타낸다.
(공배양 시험)
도 4에 나타낸 바와 같이, 7일째에 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포를 회수해, GM2 양성 종양 세포주 또는 GM2 음성 종양 세포주와 함께 24 웰 세포 배양 플레이트상에서 이펙터:종양 세포비를 1:1∼1:3이 되도록 조정한 다음, 37℃ 인큐베이터에서 공배양을 실시했다. 공배양 개시부터 2∼3일 후에 세포 상해 활성을 현미경 관찰함과 함께, 배양 상청액 중에 생성된 IFN-γ를 시판 중인 IFN-γ ELISA 키트(BioLegend 제품)를 이용해 측정했다. 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포의 대조군으로서, 항FITC CAR 발현 T세포 및 비유전자 도입 T세포를 이용했다.
[결과]
결과를 도 7∼도 9에 나타낸다. 도 7 및 도 8은 악성중피종 세포주(Y-meso8A, MSTO221H), 도 9는 대장암 세포주(SW480)를 타겟 세포로 한 결과이다. 도 7∼도 9에 나타낸 바와 같이, 대조군의 항FITC CAR 발현 T세포(FITC CAR-T) 또는 비유전자 도입 T세포(non-infection)와 타겟 종양 세포의 공배양에서는, 어떤 타겟 종양 세포도 종양만의 웰(tumor only)과 동일한 정도로 증식하고 있는 것이 관찰되었다.
한편, 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포(GM2 CAR-T)에서는, 타겟 종양 세포의 종류에 따라 종양의 증식에 차이가 인정되었다. GM2 음성 타겟 세포(SW480: 도 9)와의 공배양에서는, 타겟 종양 세포는 종양만의 웰과 마찬가지로 증식하고 있었다. 한편, GM2 양성 종양 세포(Y-meso8A: 도 7, MSTO221H: 도 8)와의 공배양에서는, 종양 세포만의 웰 및 대조군 세포와의 공배양의 웰과 비교해, 분명하게 종양 세포의 수가 감소하고 있는 것이 관찰되었다.
이들 결과로부터, 51Cr 방출 아세이와 마찬가지로, 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포는 항원 특이적으로 종양 세포를 상해하고 있는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 10에 나타낸 바와 같이, 공배양 후의 상청액을 이용한 IFN-γ의 ELISA에 있어서도, 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포와 GM2 양성 타겟 세포(MSTO221H, Y-meso8A)의 공배양의 상청액에서만 IFN-γ의 생성이 확인되었다.
[실시예 6] 종양 모델에서의 치료 효과
(X선 조사 마우스에의 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포의 투여)
면역 부전 마우스인 NOD/SCID/IL2rgKO(NSG) 마우스에 2 Gy의 X선 조사 후, 1×104개의 루시퍼라아제 발현 MSTO211H를 복강 또는 흉강에 접종했다. 이 복강내 종양 모델군(n=2) 또는 흉강내 종양 모델군(n=3)에 대해, 1일 후에 2.5×107개의 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포(CAR 발현이 확인된 세포로서는 1×107개) 또는 대조군으로서 동수의 비유전자 도입 T세포를 정맥내에 투여했다. 세포 투여일을 day 0으로 하고, IVIS 이미지 시스템(Perkin Elmer 제품)을 이용해 종양 용량(=루시퍼라아제 활성에 의한 발광 강도)을 경시적으로 평가했다.
[결과]
마우스의 종양 용량의 추이의 결과를 도 11a 및 도 11b에 나타낸다. 도 11a는 흉강내 종양 모델에서의 결과이고, 도 11b는 복강내 종양 모델에서의 결과이다. 도 11a에 나타낸 바와 같이, 흉강내 종양 모델에서는 비유전자 도입 T세포를 투여한 군(non infection)에서 종양의 증식을 확인할 수 있었지만, 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포 투여군(GM2 CAR-T)에서는 분명한 종양의 증식이 인정되지 않았다. 또한, 도 11b에 나타낸 바와 같이, 복강내 종양 접종 모델에서는, 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포 투여군(GM2 CAR-T)에서는 day 3까지는 종양의 증식이 인정되었지만 그 이후는 서서히 종양이 축소되었다. 이들 결과로부터, 흉강내 종양 모델 및 복강내 종양 모델의 모두에서, 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포는 뛰어난 항종양 활성을 나타내는 것이 분명해졌다.
(X선 비조사 마우스에의 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포의 투여)
다음으로, NSG 마우스에 X선 조사의 전처치없이 흉강내에 종양을 접종한 모델에서 항종양 효과를 검토했다. 1×104개의 루시퍼라아제 발현 MSTO211H를 흉강에 접종하고, 다음날, 1.6×107개의 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포(CAR 발현 세포로서는 1×107개) 또는 대조군으로서 동수의 비유전자 도입 T세포를 정맥내에 투여했다(항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포 투여군 n=6, 비유전자 도입 T세포 투여군 n=5). 세포 투여일을 day 0으로 하고, 전술한 바와 마찬가지로 IVIS 이미지 시스템을 이용해 종양 증식을 경시적으로 평가했다.
[결과]
마우스의 종양 용량의 추이의 결과를 도 12에 나타낸다. 도 12에 나타낸 바와 같이, 비유전자 도입 T세포 투여군(non infection)에서는 종양이 서서히 증식해 갔다. 한편, 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포 투여군(GM2 CAR-T)에서는, day 9까지는 종양이 증식 경향을 나타냈지만, 그 이후는 1마리를 제외하고 종양은 증식하지 않고 없어졌다. 전술한 X선 조사의 전처치를 실시한 모델과 마찬가지로, 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포는 뛰어난 항종양 효과를 유도하는 것이 확인되었다.
[실시예 7] 종양 모델에서의 치료 효과
(항GM2 CAR 발현 T세포의 제작)
IL-7-F2A-CCL19 DNA 단편을 포함하지 않는 것 외에는, IL-7/CCL19 발현-항GM2 CAR 벡터와 같은 구성을 갖는 항GM2 CAR 발현 벡터를 제작했다. 실시예 1과 같은 방법으로, 이 항GM2 CAR 발현 벡터를 T세포에 형질 도입해 항GM2 CAR 발현 T세포를 얻었다.
(마우스에의 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포 또는 항GM2 CAR 발현 T세포의 투여)
면역 부전 마우스인 NOD/SCID/IL2rgKO(NSG) 마우스에, 1×104개의 루시퍼라아제 발현 MSTO211H를 흉강에 접종했다. 이 흉강내 종양 모델군에 대해, 1일 후에 2.2×106개의 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포(CAR 발현이 확인된 세포로서는 1×106개), 동수의 항GM2 CAR 발현 T세포(CAR 발현이 확인된 세포로서는 1×106개), 또는 대조군으로서 동수의 비유전자 도입 T세포를 정맥내에 투여했다(각 군 n=5). 세포 투여일을 day 1로 하고, IVIS 이미지 시스템(Perkin Elmer 제품)을 이용해 종양 용량(=루시퍼라아제 활성에 의한 발광 강도)을 경시적으로 평가했다.
[결과]
마우스의 종양 용량의 추이의 결과를 도 13에 나타낸다. 도 13 중, '×'는 마우스가 사망한 것을 나타낸다. 도 13에 나타낸 바와 같이, 흉강내 종양 모델에서는, 비유전자 도입 T세포를 투여한 군(non infection)에서는, 경시적으로 종양의 증식을 확인할 수 있고, day 57 시점에서 생존하는 마우스는 없었다. 항GM2 CAR 발현 T세포를 투여한 군(GM2 CAR-T(-)IL-7/CCL19)에서도 경시적으로 종양이 증식했지만, 비유전자 도입 T세포 투여군과 비교하면, 종양 증식의 억제가 보였다. 한편, 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포 투여군(GM2 CAR-T(+)IL-7/CCL19)에서는, 다른 군과 비교해 종양의 증식이 억제되어, day 70 이후에도 마우스는 생존하고 있었다.
도 14는, 도 13에서의 발광 강도의 추이를 그래프화한 것이다. 도 14의 그래프의 횡축은 마우스 흉강내에 종양 세포를 접종한 이후의 경과일수, 종축은 종양 세포로부터의 발광 강도(×106 photons/sec)를 나타낸다. 비유전자 도입 T세포 투여군(non infection) 및 항GM2 CAR 발현 T세포 투여군(GM2 CAR-T(-)IL-7/CCL19)에서는, day 57 시점에서 생존 마우스가 없었기 때문에 그 이후의 플롯은 없다. 도 14에서는, 비유전자 도입 T세포 투여군(non infection)과 비교해, 항GM2 CAR 발현 T세포 투여군(GM2 CAR-T(-)IL-7/CCL19)에서의 종양의 증식이 조금 억제되고 있는 것을 확인할 수 있다. 한편, 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포 투여군(GM2 CAR-T(+)IL-7/CCL19)에서는, 종양의 증식이 거의 일정한 범위내에 억제되고 있었다.
또한, 도 15는, 마우스의 생존률의 추이를 나타낸 그래프이다. 도 15의 그래프의 횡축은 마우스 흉강내에 종양 세포를 접종한 이후의 경과일수, 종축은 마우스의 생존률(%)을 나타낸다. 도 15에 나타낸 바와 같이, 항GM2 CAR 발현 T세포 투여군(GM2 CAR-T(-)IL-7/CCL19)에서는, 비유전자 도입 T세포 투여군(non infection)과 비교해, 생존 기간의 약간의 연장 경향이 확인되었다. 한편, 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포 투여군(GM2 CAR-T(+)IL-7/CCL19)에서는, 비유전자 도입 T세포 투여군 및 항GM2 CAR 발현 T세포 투여군과 비교해, 생존률의 개선(생존 기간의 연장 효과)이 확인되었다.
이상의 결과로부터, 항GM2 CAR-IL-7/CCL19 발현 T세포는 뛰어난 항종양 활성을 갖는 것이 분명해졌다.
《산업상의 이용 가능성》
본 발명에 의하면, 고형종양 항원을 표적 항원으로 하는 신규 CAR, 및 고형 종양에 대해 유효한 CAR-T 세포가 제공된다. 본 발명의 CAR-T 세포는 폐암, 신경아종, 신경교종, 흑색종, 악성중피종, 골수종 등의 GM2를 발현하는 고형 종양의 치료 또는 예방에 적용할 수 있다.
본 출원은, 일본에서 출원된 일본 특허출원 2017-61461(출원일 2017년 3월 27일)을 기초로 하고, 그 내용은 본 명세서에 모두 포함된다.
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accagggtct cagtacagcc 1620 accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg caggccctgc cccctcgcga attcggaagc 1680 ggagtgaaac agactttgaa ttttgacctt ctcaagttgg cgggagacgt ggagtccaac 1740 cctggaccat gcatgttcca tgtttctttt aggtatatct ttggacttcc tcccctgatc 1800 cttgttctgt tgccagtagc atcatctgat tgtgatattg aaggtaaaga tggcaaacaa 1860 tatgagagtg ttctaatggt cagcatcgat caattattgg acagcatgaa agaaattggt 1920 agcaattgcc tgaataatga atttaacttt tttaaaagac atatctgtga tgctaataag 1980 gaaggtatgt ttttattccg tgctgctcgc aagttgaggc aatttcttaa aatgaatagc 2040 actggtgatt ttgatctcca cttattaaaa gtttcagaag gcacaacaat actgttgaac 2100 tgcactggcc aggttaaagg aagaaaacca gctgccctgg gtgaagccca accaacaaag 2160 agtttggaag aaaataaatc tttaaaggaa cagaaaaaac tgaatgactt gtgtttccta 2220 aagagactat tacaagagat aaaaacttgt tggaataaaa ttttgatggg cactaaagaa 2280 cacggaagcg gagtgaaaca gactttgaat tttgaccttc tcaagttggc gggagacgtg 2340 gagtccaacc ctggacctat ggccctgcta ctggccctca gcctgctggt tctctggact 2400 tccccagccc caactctgag tggcaccaat gatgctgaag 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720 ctgcagcccg aggacatcgc cacctactac tgccaacaga ggtcctccta cccctacacc 780 ttcggcggcg gcaccaaagt ggagatcaag gcggccgcat tcgtgccggt cttcctgcca 840 gcgaagccca ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 900 cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 960 agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 1020 gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgcaacc acaggaacag gagtaagagg 1080 agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc 1140 aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc ccgtttctct 1200 gttgttaaac ggggcagaaa gaagctcctg tatatattca aacaaccatt tatgagacca 1260 gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt agctgccgat ttccagaaga agaagaagga 1320 ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc 1380 cagaaccagc tctataacga gctcaatcta ggacgaagag aggagtacga tgttttggac 1440 aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa 1500 ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag atggcggagg cctacagtga gattgggatg 1560 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cactactacg gctacatgtt cgcttactgg ggacagggca ccctggtgac cgtgagctcc 360 <210> 50 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL region of anti-GM2 antibody for VL25VH <400> 50 gatatccaac tgacccagtc cccttccagc ctgagcgctt cccccggaga cagggtgaca 60 attacctgca gcgccagctc ctccgtgagc tacatgcact ggttccagca gaagcccggc 120 aaggccccca agctgtggat ctactccaca agcaacctgg cctccggcgt gcctgccaga 180 tttagcggaa gcggcagcgg cacatcctac agcctgacca tctccaggct gcagcccgag 240 gacatcgcca catactactg ccagcagagg tccagctacc cttacacatt cggaggcggc 300 accaaggtgg agatcaag 318 <210> 51 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH region of anti-GM2 antibody for VH15VL <400> 51 gaggtgcagc tggtgcagtc cggagccgag gtgaagaagc ctggcgccag cgtgaaggtg 60 agctgtaagg cctccggcta caccttcacc gactacaaca tggactgggt caagcagagc 120 cctggccagg gcctggagtg gatgggctat atctacccca acaacggcgg caccggctac 180 aaccagaagt tcaagagcaa ggtcaccatc accgtggaca cctccacctc cacagcctac 240 atggagctgc acagcctgag gagcgaggat accgccgtgt actactgcgc tacctacggc 300 cattactacg gatacatgtt cgcctactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtgtcctcc 360 <210> 52 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL region of anti-GM2 antibody for VH15VL <400> 52 gacatccagc tgacacaatc ccccagcagc ctgagcgcta gccccggcga tagggtgaca 60 attacctgca gcgcctccag ctccgtgtcc tacatgcact ggtttcagca aaagcccggc 120 aaggccccta agctgtggat ctacagcacc agcaacctgg ccagcggagt gcctgccaga 180 tttagcggca gcggcagcgg caccagctac agcctgacca tcagcagact gcagcccgag 240 gatatcgcca cctactactg ccagcagagg agctcctacc cctacacatt cggcggcgga 300 accaaggtgg agatcaag 318 <210> 53 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH region of anti-GM2 antibody for VH25VL <400> 53 gaagtgcagc tggtgcagtc cggagctgag gtgaagaagc ccggcgccag cgtgaaggtc 60 agctgcaaag ccagcggcta taccttcacc gactacaaca tggactgggt gaagcagagc 120 cccggccaag gcctcgagtg gatgggatac atctacccca acaacggcgg caccggctac 180 aaccagaagt tcaagagcaa ggtgaccatc accgtggaca catccacaag caccgcctat 240 atggagctcc acagcctgag gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc cacctacggc 300 cactactacg gctatatgtt cgcctactgg ggccagggca ccctggtgac agtgtcctcc 360 <210> 54 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL region of anti-GM2 antibody for VH25VL <400> 54 gatatccagc tgacacagag ccctagctcc ctgagcgcta gccctggcga cagagtgacc 60 atcacctgca gcgccagctc cagcgtgagc tacatgcact ggttccagca gaaacccggc 120 aaggccccca agctgtggat ctacagcacc agcaatctgg ctagcggcgt gcctgccagg 180 tttagcggat ccggcagcgg cacctcctac tccctgacaa tctccagact gcagcccgag 240 gacatcgcca cctactactg ccaacagagg tcctcctacc cctacacctt cggcggcggc 300 accaaagtgg agatcaag 318 <210> 55 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> linker 15 for VH15VL <400> 55 ggaggaggag gaagcggagg cggcggctcc ggcggaggcg gatcc 45 <210> 56 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> linker 25 for VH25VL <400> 56 tccagcgccg atgatgccaa gaaggatgcc gccaaaaagg acgacgctaa gaaggatgac 60 gccaagaagg acggc 75 <210> 57 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> signal peptide <400> 57 Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser <210> 58 <211> 531 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 58 atgttccatg tttcttttag gtatatcttt ggacttcctc ccctgatcct tgttctgttg 60 ccagtagcat catctgattg tgatattgaa ggtaaagatg gcaaacaata tgagagtgtt 120 ctaatggtca gcatcgatca attattggac agcatgaaag aaattggtag caattgcctg 180 aataatgaat ttaacttttt taaaagacat atctgtgatg ctaataagga aggtatgttt 240 ttattccgtg ctgctcgcaa gttgaggcaa tttcttaaaa tgaatagcac tggtgatttt 300 gatctccact tattaaaagt ttcagaaggc acaacaatac tgttgaactg cactggccag 360 gttaaaggaa gaaaaccagc tgccctgggt gaagcccaac caacaaagag tttggaagaa 420 aataaatctt taaaggaaca gaaaaaactg aatgacttgt gtttcctaaa gagactatta 480 caagagataa aaacttgttg gaataaaatt ttgatgggca ctaaagaaca c 531 <210> 59 <211> 177 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile 1 5 10 15 Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys 20 25 30 Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu 35 40 45 Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe 50 55 60 Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe 65 70 75 80 Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser 85 90 95 Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr 100 105 110 Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala 115 120 125 Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu 130 135 140 Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu 145 150 155 160 Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu 165 170 175 His <210> 60 <211> 294 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 60 atggccctgc tactggccct cagcctgctg gttctctgga cttccccagc cccaactctg 60 agtggcacca atgatgctga agactgctgc ctgtctgtga cccagaaacc catccctggg 120 tacatcgtga ggaacttcca ctaccttctc atcaaggatg gctgcagggt gcctgctgta 180 gtgttcacca cactgagggg ccgccagctc tgtgcacccc cagaccagcc ctgggtagaa 240 cgcatcatcc agagactgca gaggacctca gccaagatga agcgccgcag cagt 294 <210> 61 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Met Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ser Leu Leu Val Leu Trp Thr Ser Pro 1 5 10 15 Ala Pro Thr Leu Ser Gly Thr Asn Asp Ala Glu Asp Cys Cys Leu Ser 20 25 30 Val Thr Gln Lys Pro Ile Pro Gly Tyr Ile Val Arg Asn Phe His Tyr 35 40 45 Leu Leu Ile Lys Asp Gly Cys Arg Val Pro Ala Val Val Phe Thr Thr 50 55 60 Leu Arg Gly Arg Gln Leu Cys Ala Pro Pro Asp Gln Pro Trp Val Glu 65 70 75 80 Arg Ile Ile Gln Arg Leu Gln Arg Thr Ser Ala Lys Met Lys Arg Arg 85 90 95 Ser Ser <210> 62 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F2A <400> 62 Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala 1 5 10 15 Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 25 <210> 63 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 of VH region of anti-GM2 antibody <400> 63 Asp Tyr Asn Met Asp 1 5 <210> 64 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of VH region of anti-GM2 antibody <400> 64 Tyr Ile Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Ser <210> 65 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of VH region of anti-GM2 antibody <400> 65 Tyr Gly His Tyr Tyr Gly Tyr Met Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 66 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 of VL region of anti-GM2 antibody <400> 66 Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His 1 5 10 <210> 67 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of VL region of anti-GM2 antibody <400> 67 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 68 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of VL region of anti-GM2 antibody <400> 68 Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr 1 5

Claims (21)

  1. 키메라 항원 수용체, IL-7 및 CCL19을 발현하는 분리된 세포로,
    상기 키메라 항원 수용체는 표적 항원 결합 영역과, 막관통 영역과, T세포 활성화 시그널 전달 영역을 포함하고,
    여기서 상기 표적 항원 결합 영역은 항강글리오시드 GM2 항체의 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 포함하고,
    상기 항강글리오시드 GM2 항체는
    (a) 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 강글리오시드 GM2에 대한 결합능을 갖는 항체로, 여기서 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3는 Kabat, Chothia, AbM 또는 contact의 정의에 의해 결정되는 항체;
    (b) 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 2 내지 10개의 아미노산이 변이된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역과, 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 2 내지 10개의 아미노산이 변이된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 강글리오시드 GM2에 대한 결합능을 갖는 항체로, 여기서 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 내 변이의 위치는 Kabat, Chothia, AbM 또는 contact의 정의에 의해 결정되는 CDR1, CDR2 및 CDR3이외의 영역인 항체; 및
    (c) 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역과, 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 강글리오시드 GM2에 대한 결합능을 갖는 항체로, 여기서 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 내 변이의 위치는 Kabat, Chothia, AbM 또는 contact의 정의에 의해 결정되는 CDR1, CDR2 및 CDR3 이외의 영역인 항체
    로 이루어진 군에서 선택된 항체인, 키메라 항원 수용체, IL-7 및 CCL19을 발현하는 분리된 세포.
  2. 제1항에 있어서, 여기서 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 63에 기재된 아미노산 서열, 서열번호 64에 기재된 아미노산 서열, 및 서열번호 65에 기재된 아미노산 서열로 이루어지며,
    경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 66에 기재된 아미노산 서열, 서열번호 67에 기재된 아미노산 서열, 및 서열번호 68에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 분리된 세포.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 중쇄 가변 영역이 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역이 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 분리된 세포.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항강글리오시드 GM2 항체가, 단일 가닥 항체(scFv)인, 분리된 세포.
  5. 제4항에 있어서, 상기 scFv는,
    (a) 서열 번호 10, 12, 14 및 16으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    (b) 서열 번호 10, 12, 14 및 16으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 강글리오시드 GM2에 대한 결합능을 갖는 폴리펩티드로, 여기서 상기 서열번호 10, 12, 14, 및 16으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열 내 변이의 위치는 Kabat, Chothia, AbM 또는 contact의 정의에 의해 결정되는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 이외의 영역인 폴리펩티드; 및
    (c) 서열 번호 10, 12, 14 및 16으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에서 1 또는 2 내지 20개의 아미노산이 변이된 아미노산 서열로 이루어지고, 강글리오시드 GM2에 대한 결합능을 갖는 폴리펩티드로, 여기서 상기 서열번호 10, 12, 14, 및 16으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열 내 변이의 위치는 Kabat, Chothia, AbM 또는 contact의 정의에 의해 결정되는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 이외의 영역인 폴리펩티드
    로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드인 분리된 세포.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분리된 세포가 면역 세포인, 분리된 세포.
  7. 키메라 항원 수용체를 코팅하는 염기 서열, IL-7을 코딩하는 염기 서열 및 CCL19를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로,
    상기 키메라 항원 수용체는 표적 항원 결합 영역과, 막관통 영역과, T세포 활성화 시그널 전달 영역을 포함하고,
    여기서 상기 표적 항원 결합 영역은 항강글리오시드 GM2 항체의 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 포함하고,
    상기 항강글리오시드 GM2 항체는
    (a) 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역과, 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 강글리오시드 GM2에 대한 결합능을 갖는 항체로, 여기서 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3는 Kabat, Chothia, AbM 또는 contact의 정의에 의해 결정되는 항체;
    (b) 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 2 내지 10개의 아미노산이 변이된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역과, 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 2 내지 10개의 아미노산이 변이된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 강글리오시드 GM2에 대한 결합능을 갖는 항체로, 여기서 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 내 변이의 위치는 Kabat, Chothia, AbM 또는 contact의 정의에 의해 결정되는 CDR1, CDR2 및 CDR3 이외의 영역인 항체; 및
    (c) 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역과, 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 강글리오시드 GM2에 대한 결합능을 갖는 항체로, 여기서 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 내 변이의 위치는 Kabat, Chothia, AbM 또는 contact의 정의에 의해 결정되는 CDR1, CDR2 및 CDR3 이외의 영역인 항체
    로 이루어진 군에서 선택된 항체인, 폴리뉴클레오티드.
  8. 제7항에 있어서, 여기서 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 63에 기재된 아미노산 서열, 서열번호 64에 기재된 아미노산 서열, 및 서열번호 65에 기재된 아미노산 서열로 이루어지며,
    경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 66에 기재된 아미노산 서열, 서열번호 67에 기재된 아미노산 서열, 및 서열번호 68에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 중쇄 가변 영역이 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역이 서열 번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  10. 제7항에 있어서, 상기 항강글리오시드 GM2 항체가, 단일 가닥 항체(scFv)인, 폴리뉴클레오티드.
  11. 제10항에 있어서,
    여기서 상기 scFv 는
    (a) 서열 번호 10, 12, 14 및 16으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    (b) 서열 번호 10, 12, 14 및 16으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 강글리오시드 GM2에 대한 결합능을 갖는 폴리펩티드로, 여기서 상기 서열번호 10, 12, 14, 및 16으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열 내 변이의 위치는 Kabat, Chothia, AbM 또는 contact의 정의에 의해 결정되는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 이외의 영역인 폴리펩티드; 및
    (c) 서열 번호 10, 12, 14 및 16으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에서 1 또는 2 내지 20개의 아미노산이 변이된 아미노산 서열로 이루어지고, 강글리오시드 GM2에 대한 결합능을 갖는 폴리펩티드로, 여기서 상기 서열번호 10, 12, 14, 및 16으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열 내 변이의 위치는 Kabat, Chothia, AbM 또는 contact의 정의에 의해 결정되는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 이외의 영역인 폴리펩티드
    로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드인 폴리뉴클레오티드.
  12. 제7항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  13. 제7항에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 제12항에 따른 벡터를 세포로 도입하는 것을 포함하는 키메라 항원 수용체 발현용 분리된 세포를 생산하는 방법.
  14. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 따른 세포를 포함하는 종양을 치료 또는 예방하기 위한 의약 조성물.
  15. 삭제
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