CN114853873A

CN114853873A - 经修饰的白细胞介素-7蛋白及其用途

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Publication number: CN114853873A
Application number: CN202210387475.5A
Authority: CN
Inventors: 梁世焕; 崔东勋; 林惠星
Original assignee: Genexine Inc
Current assignee: Genexine Inc
Priority date: 2015-06-11
Filing date: 2016-06-10
Publication date: 2022-08-05
Also published as: JP2018518955A; KR20160146584A; US20190106471A1; HK1256149A1; RU2018100181A; KR101986368B1; EP3307766A4; JP2022130427A; KR20180068938A; JP7087047B2; US20180273596A1; RU2018100181A3; CN108093638A; US11041007B2; EP3307766A1; RU2708160C2; JP2021052772A; KR20180069775A; US20170158746A1; KR101873201B1

Abstract

本发明涉及经修饰的白细胞介素‑7蛋白及其用途。本发明的修饰IL‑7或包含其的IL‑7融合蛋白可以高产率获得，并且在病毒感染和癌症模型中具有生物活性。因此，它们可以用于各种疾病的预防和治疗。

Description

经修饰的白细胞介素-7蛋白及其用途

技术领域

本发明涉及经修饰的白细胞介素-7蛋白及其用途。

背景技术

白细胞介素-7或与其具有相似活性的多肽(以下称为“IL-7”)是能够促进由B细胞和T细胞介导的免疫应答的免疫刺激性细胞因子，特别地，IL-7在适应性免疫系统中发挥着重要作用。IL-7主要由骨髓和胸腺中的基质细胞分泌，但也由角质形成细胞，树突细胞，肝细胞，神经元和上皮细胞产生(Heufler C et al.,1993,J.Exp.Med.178(3):1109-14；Kroncke R et al.,1996,Eur.J.Immunol.26(10):2541-4:Sawa Y et al., 2009,Immunity 30(3):447-57；Watanabe M et al.,1995,J.Clin.Invest.95(6):2945-53)。

具体地，IL-7通过T细胞和B细胞的存活和分化、淋巴细胞的存活、刺激自然杀伤(NK)细胞的活性等来激活免疫功能，特别地，IL-7对于T细胞和B细胞的发育起着重要作用。IL-7与肝细胞生长因子 (HGF)结合并作为初前B细胞生长刺激因子和T细胞受体β(TCRβ)的V(D)J重排的辅助因子 (Muegge K,1993,Science 261(5117):93-5)。

另外，IL-7通过淋巴组织诱导(LTi)细胞调节淋巴结的发育并促进幼稚T细胞或记忆T细胞的存活和分裂。根据最近报道的病毒感染的临床结果，IL-7维持幼稚T细胞或记忆T细胞(Amila Patel,J Antimicrob Chemother 2010)。此外，IL-7通过促进IL-2和干扰素-γ的分泌来增强人体的免疫应答。

即，IL-7是促进T细胞，B细胞及其他免疫细胞的存活和增殖的细胞因子，是能够在例如病毒感染，癌症和免疫系统损伤等各种疾病的免疫治疗剂的候选材料。最近，一些关于恶性肿瘤和人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的临床研究证实了IL-7增加人体免疫力的作用(Fry TJ et al.,2002,Blood 99(11):3892-904； Muegge K et al.,1993,Science 261(5117):93-5；Rosenberg SA et al.,J.Immunother.29(3):313-9)。另外，IL- 7也被用于移植异体干细胞后的免疫恢复(Snyder KM,2006,Leuk.Lymphoma 47(7):1222-8)和淋巴细胞减少症的治疗。

癌症是威胁生命的疾病。癌细胞提供了一种能够抑制免疫系统的环境，使其能够在不被免疫细胞识别的情况下生长。癌症患者表现出免疫恶化，其中主要由于抗癌治疗(例如化学疗法，放射疗法)而导致T细胞减少或在诊断癌症时显示T细胞数目减少。另外，尽管细胞毒性T淋巴细胞、效应T细胞和巨噬细胞聚集在癌组织内，但它们不能有效地去除癌细胞。此外，由于抑制免疫效应细胞功能的T调节细胞 (Treg)和骨髓衍生抑制细胞(MDSC)等存在于癌组织中，所以免疫细胞不能有效抑制癌细胞的增殖。

在这种情况下，最近强调了免疫疗法。免疫疗法可以与目前用于癌症治疗的化学疗法或放射疗法联合使用。尤其是，IL-7的利用被认为是通过克服T细胞数量减少的淋巴细胞减少症而增强免疫功能的替代方法。

慢性感染通过诱导识别病毒的T细胞的耗竭而得以维持。例如，通过感染如HIV，乙型肝炎 (HBV)，丙型肝炎(HCV)和猿免疫缺陷病毒(SIV)等病毒，初始免疫应答被强烈诱导，但是病毒特异性T细胞的功能随着时间的推移逐渐降低。特别是PD-1，LAG-3，TIM-3，IL-10受体，TGF-β受体等，可以降低病毒特异性T细胞的功能。

然而，IL-7通过克服免疫抑制信号系统，恢复病毒特异性T细胞丧失的功能，或抑制其功能的降低 (Pellegrini M,2009May；15(5):528-36)。此外，IL-7诱导T细胞增殖并增加Bcl-2的表达，从而促进T细胞的扩增和存活。

此外，IL-7产生细胞因子，并通过抑制SOCS3(细胞因子信号转导抑制介质)的表达来帮助保持其功能。此外，由于产生IL-22，IL-7降低了免疫病理学(Som G.Nanjappa,Blood.2011；117(19):5123-5132, Marc Pellegrini,Cell 144,601-613,February 18,2011。

但是，为了医药利用目的而生产重组体IL-7时，与一般的重组蛋白相比，存在杂质增加，IL-7降解量和大规模生产不易实现的问题。以前，Cytheris公司开发了一种合成的IL-7，它是一种具有特定二硫键的构象体(Cys:1-4；2-5；3-6)(U.S.Patent No.7,585,947)。然而，由于合成IL-7的生产需要复杂的变性过程，所以制造过程并不容易。因此，迫切需要开发一种可以大规模生产和易于生产的修饰IL-7蛋白质。

为此，制造了可以大规模生产和易于制造的修饰IL-7，从而完成了本发明。

发明内容

技术问题

本发明的一个目的是提供修饰IL-7。

本发明的另一个目的是提供包括修饰IL-7的融合蛋白。

本发明的另一个目的是提供编码修饰IL-7或包含其的融合蛋白的核酸，包含所述核酸的载体和包含所述载体的宿主细胞，以及用于制备所述修饰IL-7的方法及包含其的融合蛋白的方法。

本发明的另一个目的是提供包含修饰IL-7或包含其的融合蛋白的药物组合物及其用途。

技术问题

为了实现上述目的，本发明提供了一种修饰IL-7，其与由1至10个氨基酸组成的寡肽连接。

此外，本发明提供了IL-7融合蛋白，其包含第一结构域、第二结构域和第三结构域，所述第一结构域包含具有IL-7活性或其相似活性的多肽；所述第二结构域包含由甲硫氨酸，甘氨酸或其组合组成的具有1 至10个氨基酸残基的氨基酸序列；所述第三结构域延长白细胞介素-7融合蛋白半衰期。

此外，本发明提供编码修饰IL-7或IL-7融合蛋白的核酸，含有所述核酸的表达载体和含有所述表达载体的宿主细胞。

另外，本发明提供了使用所述核酸，所述表达载体和所述宿主细胞生产或制备修饰IL-7或IL-7融合蛋白的方法。

此外，本发明提供了使用修饰IL-7或IL-7融合蛋白预防或治疗疾病的方法。

有益效果

本发明的修饰IL-7不经变性处理而以高产量地生产。因此，本发明的修饰IL-7或包含其的融合蛋白可以应用于各种医药领域。

附图说明

图1是用于产生本发明的修饰IL-7或包含其的融合蛋白的基因构建体的示意图。

图2显示了所制备的IL-7融合蛋白的每日细胞单位生产量(pg/细胞/天，p/c/d)的评估结果，其中图2A显示了培养基中的IL-hyFc量，而图2B显示了在培养基中的培养MGM-IL-7-hyFc的量。

图3显示不同浓度的氯化钠下的IL-7-hyFc和包含其的MGM-IL-7-hyFc的稳定性的比较结果。

图4显示不同浓度的氯化钠下的IL-7-hyFc和MGM-IL-7-hyFc之间的天然PAGE的比较结果。

图5分别显示了制备的IL-7融合蛋白的相对生产量(图5A)和纯度(图5B)的比较结果。

图6显示了将制备的IL-7融合蛋白皮下给药至SD大鼠模型后的随时间变化的血清药物水平图。

图7显示了将制备的IL-7融合蛋白皮下给药至SD大鼠模型后，每种蛋白质给药的抗药物抗体(ADA) 的生产水平的结果

图8表示将所制备的IL-7融合蛋白皮下给药至SD大鼠模型后，随时间增加白细胞数(WBC)的效果的图。

图9显示所制备的IL-7融合蛋白和标准物质之间的活性的比较结果。

图10显示了根据制备的IL-7融合蛋白的给药，在致死性流感病模型中，体重变化(图10A)和存活率变化(图10B)的图。

图11显示了在癌细胞移植疾病模型中，根据所制备的IL-7融合蛋白的给药的抗癌作用的形态学观察的图像。

具体实施方式

本发明提供具有以下结构的修饰IL-7：

A-IL-7；

其中A是由1至10个氨基酸残基组成的寡肽，IL-7是白细胞介素7或具有其相似活性的多肽。

如本文所用，术语“具有IL-7活性或其相似活性的多肽”是指具有与IL-7相同或相似的序列和活性的多肽或蛋白质。除非在本发明中另外指出，否则该术语可以用作可与IL-7融合蛋白的第一结构域互换的概念。

IL-7包括由SEQ ID NOS：1至6表示的氨基酸序列组成的多肽。此外，IL-7可以与SEQ ID NO：1 至6的序列具有约70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％或更高的序列一致性。

IL-7可以包括IL-7蛋白或其片段。具体地，IL-7可以来自人，大鼠，小鼠，猴，牛或绵羊。

具体地，人IL-7可以具有由以下表示的氨基酸序列：SEQ ID NO：1(Genbank收录号P13232)；大鼠 IL-7可以具有由以下表示的氨基酸序列：SEQ ID NO：2(Genbank收录号P56478)；小鼠IL-7可以具有由以下表示的氨基酸序列：SEQ ID NO：3(Genbank收录号P10168)；猴IL-7可以具有由以下表示的氨基酸序列：SEQ ID NO：4(Genbank收录号001279008)；牛IL-7可以具有由以下表示的氨基酸序列：SEQ ID NO：5(Genbank收录号P26895),而绵羊IL-7可以具有由以下表示的氨基酸序列：SEQ ID NO：6(Genbank 收录号Q28540)。

另外，IL-7蛋白或其片段可以包括各种修饰蛋白或肽，即变体。上述修饰可以通过对野生型IL-7的至少一种蛋白进行置换，删除或添加而不改变IL-7的功能的方法来进行。这些不同的蛋白质或肽可以与野生型蛋白具有70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同源。

传统上，以丙氨酸取代野生型氨基酸残基，但是该取代可以进行保守氨基酸取代，其对于整个蛋白质电荷，即极性或疏水性，不产生作用或产生作用弱。

对于保守氨基酸取代，可以参考下面的表1。

[表1]

对于每个氨基酸，额外的保守取代包括氨基酸的“同源物”。具体地，“同源物”是指将亚甲基 (CH₂)插入到氨基酸侧链的β位侧链而得到的氨基酸。“同源物”的实例可以包括高苯丙氨酸，高精氨酸，高丝氨酸等，但不限于此。

如本文所用，术语“IL-7蛋白质”可以用作包括“IL-7蛋白质及其片段”的概念。除非另有说明，否则术语“蛋白质”，“多肽”和“肽”可以用作互换的概念。

在修饰IL-7的结构中，A可以直接与IL-7的N端连接，或者通过接头连接，除非另有说明，否则该术语可以用作可以与IL-7融合蛋白的第二结构域互换的概念。

在本发明中，A可以与IL-7的N端连接。A的特征在于它包含1至10个氨基酸，所述氨基酸可以选自甲硫氨酸，甘氨酸及其组合。

甲硫氨酸和甘氨酸不会在人体内诱导免疫反应。由大肠杆菌产生的蛋白治疗剂总是在N端包含甲硫氨酸，但没有报道不良反应。而且，甘氨酸被广泛用作GS接头，并且不在像度拉糖肽(Dulaglutide)那样的商业产品中诱导免疫应答(Cell Biophys.1993 Jan-Jun；22(103):189-224)。

在一个示例性实施例中，A可以是包含1至10个选自甲硫氨酸(Met，M)，甘氨酸(Gly，G)及其组合的氨基酸的寡肽，并且优选为选自1到5个氨基酸的寡肽。例如，A可以具有选自以下任何序列的N端序列：甲硫氨酸，甘氨酸，甲硫氨酸-甲硫氨酸，甘氨酸-甘氨酸，甲硫氨酸-氨酸，甘氨酸-甲硫氨酸，甲硫氨酸-甲硫氨酸-甲硫氨酸，甲硫氨酸-甲硫氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甲硫氨酸，甘氨酸-甲硫氨酸-甲硫氨酸，甲硫氨酸-甘氨酸-甘氨酸，甘氨酸-甲硫氨酸-甘氨酸，甘氨酸-甘氨酸-甲硫氨酸和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸。具体地，A可以由具有选自以下序列的氨基酸序列表示：甲硫氨酸，甘氨酸，甘氨酸，甲硫氨酸- 甲硫氨酸，甘氨酸-甘氨酸，甲硫氨酸-甘氨酸，甘氨酸-甲硫氨酸，甲硫氨酸-甲硫氨酸-甲硫氨酸，甲硫氨酸-甘氨酸-甲硫氨酸-甘氨酸，甘氨酸-甘氨酸-甲硫氨酸和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸。

本发明的另一个方面提供了IL-7融合蛋白，其包含第一结构域、第二结构域和第三结构域，所述第一结构域包含具有IL-7活性或其相似活性的多肽；所述第二结构域包含具有1至10个选自甲硫氨酸，甘氨酸或其组合的氨基酸残基的氨基酸序列；所述第三结构域延长白细胞介素-7融合蛋白半衰期。

第三结构域可以连接到第一结构域或第二结构域的N端或C端。另外，包括第一结构域和第二结构域的IL-7可以连接到第三结构域的两个末端。

第三结构域可以是用于增加体内半衰期的融合配偶体，并且优选为可以包括选自以下的任一项：免疫球蛋白的Fc区或其部分，白蛋白，白蛋白结合多肽，Pro/Ala/Ser(PAS)，人绒毛膜促性腺激素β亚基 C端肽(CTP)，聚乙二醇(PEG)，氨基酸长链非结构亲水序列(XTEN)，羟乙基淀粉(HES)，白蛋白结合小分子，以及它们的组合。

当第三结构域是免疫球蛋白的Fc区时，其可以是经修饰的免疫球蛋白的Fc区。具体地，经修饰的免疫球蛋白的Fc区可以是：由于与Fc受体和/或补体的结合亲和力的修饰而导致抗体依赖性细胞毒性 (ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)减弱的Fc区。经修饰的免疫球蛋白可以选自IgG1，IgG2， IgG3，IgG4，IgA1，IgA2，IgD，IgE及其组合。具体地，经修饰的免疫球蛋白的Fc区可以从N端到C 端包括铰链区，CH2结构域和CH3结构域。特别地，所述铰链区可以包括人IgD铰链区；所述CH2结构域可以包括人IgD的部分氨基酸残基和人IgG4CH2结构域的部分氨基酸残基；并且所述CH3结构域可以包括人IgG4 CH3结构域的部分氨基酸残基。

另外，两种融合蛋白可以形成二聚体，例如，当第三结构域是Fc区时，Fc区可以彼此结合并由此形成二聚体。

如本文所用，术语“Fc区”，“Fc片段”或“Fc”是指包含免疫球蛋白的重链恒定区2(CH2)和重链恒定区3(CH3)的蛋白，但不包括其重链可变区和轻链以及轻链恒定区(CL1)，且其还可以包含重链恒定区的铰链区。在本发明中，杂合Fc或其杂合Fc片段可被称为“hFc”或“hyFc”。

此外，如本文所用，术语“Fc区变体”是指通过取代Fc区中的部分氨基酸或通过组合不同种类的Fc 区而制备的变体。Fc区变体可防止在铰链区被切断。具体地，可以修饰SEQID NO：9的第144个氨基酸和/或第145个氨基酸。优选地，所述变体可以是其中第144个氨基酸K被G或S取代的变体和其中第145个氨基酸E被G或S取代的变体。

另外，经修饰的免疫球蛋白的Fc区或Fc区变体可以由下式(I)表示：

式(I)

N’-(Z1)p-Y-Z2-Z3-Z4-C’。

在上式(I)中，

N'是多肽的N端，而C'是多肽的C端；

p为0或1的整数；

Z1是具有在SEQ ID NO:7的第90至98位的氨基酸残基中，从第98位的氨基酸残基向N端的5至 9个连续氨基酸残基的氨基酸序列；

Y是具有在SEQ ID NO：7的第99至162位氨基酸残基中，从第162位的氨基酸残基向N端的5至 64个连续氨基酸残基的氨基酸序列；

Z2是具有在SEQ ID NO：7的第163至199位的氨基酸残基中，从第163位的氨基酸残基向C端的 4至37个连续氨基酸残基的氨基酸序列；

Z3是具有在SEQ ID NO：8的第115至220位的氨基酸残基中，从第220位的氨基酸残基向N端的 71至106个连续的氨基酸残基的氨基酸序列；以及

Z4是具有从SEQ ID NO：8的第221至327位氨基酸残基中的第221位的氨基酸残基向C端的80至 107个连续氨基酸残基的氨基酸序列。

此外，本发明的Fc片段的形式可以是：具有天然糖链，与天然形式相比增加的糖链或减少的糖链，或者可以是脱糖基化的形式。免疫球蛋白Fc糖链可以通过常规方法例如化学方法，酶促方法和使用微生物的遗传工程方法来修饰。从Fc片段去除糖链，导致与第一补体成分C1的C1q部分的结合亲和力急剧降低，并且ADCC或CDC减少或丧失，从而不会在体内诱导任何不必要的免疫应答。就此而言，去糖基化或非糖基化形式的免疫球蛋白Fc区作为药物载体可能更适合于本发明的目的。如本文所用，术语“去糖基化”是指其中从Fc片段酶促去除糖的Fc区。另外，术语“非糖基化”是指Fc片段由原核生物以非糖基化形式产生，并且优选在大肠杆菌中产生。

此外，经修饰的免疫球蛋白的Fc区可以包括SEQ ID NO：9(hyFc)，SEQ ID NO：10(hyFcM1)， SEQ ID NO：11(hyFcM2)，SEQ ID NO：12(hyFcM3))或SEQ ID NO：13(hyFcM4)的氨基酸序列。另外，经修饰的免疫球蛋白的Fc区可以包括SEQ ID NO：14的氨基酸序列(非裂解性小鼠Fc)。

根据本发明，经修饰的免疫球蛋白的Fc区可以是美国专利号7,867,491中所述的，并且免疫球蛋白的 Fc区的产生可以参考美国专利号7,867,491中的公开进行。

第二结构域可以直接连接到第一结构域的N端或通过接头连接。具体地，结果可能是第二结构域-第一结构域或第二结构域-接头-第一结构域的形式。

第三结构域可以直接连接到第一结构域或第二结构域或通过接头连接。具体地，结果的形式可以是：第二结构域-第一结构域-第三结构域，第三结构域-第二结构域-第一结构域，第二结构域-第一结构域-接头-第三结构域，第三结构域-接头-第二结构域-第一结构域，第二结构域-接头-第一结构域-接头-第三结构域，或第三结构域-接头-第二结构域-第一结构域。

当接头是肽接头时，连接可能发生在任何连接区域。可以使用本领域已知的交联剂使它们偶联。交联剂的实例可以包括N-羟基琥珀酰亚胺酯，例如1,1-双(重氮乙酰基)-2-苯基乙烷，戊二醛和4-叠氮基水杨酸；亚氨酸酯包括二琥珀酰亚胺酯如3,3'-二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)和双功能马来酰亚胺如双-N-马来酰亚胺-1,8-辛烷，但不限于此。

另外，接头可以是白蛋白接头或肽接头。肽接头可以是由Gly和Ser残基组成的10至20个氨基酸残基的肽。

当接头以化学键之一形成时，该化学键可以是二硫键，二胺键，硫醚-胺键，羧基-胺键，酯键和共价键。

在一个示例性实施例中，本发明的修饰IL-7可以具有包含具有IL-7活性或其相似活性的多肽的A-IL- 7结构和由1至10个氨基酸组成的寡肽。

在具体实施例中，修饰IL-7可以具有由SEQ ID NOS：15至20组成的氨基酸序列。此外，修饰IL- 7可以与由SEQ ID NO：15至20组成的氨基酸序列有70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％， 93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同源性。

在另一个示例性实施例中，本发明的修饰IL-7或IL-7融合蛋白包含第一结构域、第二结构域和第三结构域，所述第一结构域包含具有IL-7活性或其相似活性的多肽；所述第二结构域包含由甲硫氨酸，甘氨酸或其组合组成的具有1至10个氨基酸残基的氨基酸序列；所述第三结构域是经修饰的免疫球蛋白的 Fc区，且其与第一结构域的C端偶联。

IL-7融合蛋白可具有由SEQ ID NOS：21至25组成的氨基酸序列。另外，IL-7融合蛋白可以与由 SEQ ID NO：21至25组成的氨基酸序列有70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％， 95％，96％，97％，98％或99％同源性。

本发明的另一个方面提供了编码修饰IL-7或IL-7融合蛋白的分离的核酸分子。

核酸分子可以是编码具有选自SEQ ID NOS：15至25的氨基酸序列的多肽的核酸分子。核酸分子可以包括选自SEQ ID NOS：29至39的多核苷酸序列。

核酸分子可以进一步包括信号序列或前导序列。

如本文所用，术语“信号序列”是指引导生物活性分子药物和融合蛋白分泌的片段，并且在宿主细胞中翻译后被切断。本发明的信号序列是编码启动穿透内质网(ER)膜的蛋白质运动的氨基酸序列的多核苷酸。本发明中有用的信号序列包括：抗体轻链信号序列，例如抗体14.18(Gillies et al.,J.Immunol. Meth 1989.125:191-202)；抗体重链信号序列，例如抗体重链信号序列MOPC141(Sakano et al.,Nature,1980. 286:676-683)；以及本领域已知的其它信号序列(例如,参见Watson et al.,Nucleic Acid Research,1984. 12:5145-5164)。

信号肽的特征是本领域公知的，信号肽通常具有16至30个氨基酸，但是它们可以包含更多或更少数目的氨基酸残基。常规的信号肽由碱性N端区域，中央疏水区域和更具极性的C端区域这三个区域组成。

中心疏水区包括4至12个疏水残基，其在未成熟多肽易位期间通过膜脂质双层固定信号序列。启动之后，信号序列通常被称为信号肽酶的细胞酶在ER的内腔中切断。具体地，信号序列可以是组织纤维蛋白溶酶原激活(tPa)的分泌信号序列，单纯疱疹病毒糖蛋白D(HSV gDs)的信号序列，或生长激素。优选地，可以使用在包括哺乳动物等的高等真核细胞中使用的分泌信号序列。另外，作为分泌信号序列，可以使用包含在野生型IL-7中的信号序列，或者其可以在用宿主细胞中高表达频率的密码子取代后使用。

本发明的另一个方面提供了包括编码修饰IL-7或IL-7融合蛋白的分离的核酸分子的表达载体。

如本文所用，术语“载体”应理解为一种核酸工具，其包括可被引入宿主细胞中以进行重组并插入宿主细胞的基因组中或作为附加体自发复制的核苷酸序列。载体可以包括线性核酸，质粒，噬菌粒，粘粒，RNA载体，病毒载体及其类似物。病毒载体的实例可以包括逆转录病毒，腺病毒和腺伴随病毒，但不限于此。

如本文所用，术语靶蛋白的“基因表达”或“表达”理解为指代DNA序列的转录，mRNA转录物的翻译以及融合蛋白产物或其片段的分泌。

如本文所用，术语“宿主细胞”是指可以导入重组表达载体的原核细胞和真核细胞。如本文所用，术语“转导的”，“转化的”和“转染的”是指使用本领域已知的技术将核酸引入(例如载体)细胞中。

如本文所用，术语靶蛋白的“基因表达”或“表达”理解为指DNA序列的转录，mRNA转录物的翻译以及Fc融合蛋白产物或抗体或其抗体片段的分泌。

有用的表达载体可以是RcCMV(Invitrogen，Carlsbad)或其变体。表达载体可包括用于促进哺乳动物细胞中靶基因的连续转录的人巨细胞病毒(CMV)和用于增加转录后RNA的稳定性状态的牛生长激素的聚腺苷酸化信号序列。在本发明的示例性实施例中，表达载体是pAD15，其是RcCMV的修饰形式。

在其他方面中，本发明提供包含所述表达载体的宿主细胞。可以使用合适的宿主细胞，通过转导或转染本发明的DNA序列来表达和/或分泌靶蛋白。

适用于本发明的宿主细胞的实施例可以包括永生化杂交瘤细胞，NS/0骨髓瘤细胞，293细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，HeLa细胞，人羊水衍生细胞(CapT细胞)或COS细胞。

在另一方面，本发明提供了一种生产蛋白质的方法，其包括用表达载体培养转化的细胞；从培养物或从培养过程中获得的细胞中收集修饰IL-7或包含IL-7的融合蛋白。

可以从培养基或细胞提取物中纯化修饰IL-7或包含IL-7的融合蛋白。例如，在获得分泌有重组蛋白的培养基的上清液之后，可以将上清液通过商业市场上可获得的蛋白质浓缩过滤器来浓缩，例如Amicon 或Millipore Pellicon超滤单元。然后，可以通过本领域已知的方法纯化浓缩物。例如，可以使用与蛋白质A偶联的基质进行纯化。

在另一方面，本发明提供了一种制备修饰IL-7的方法，所述方法包括连接寡肽和多肽的N端，所述寡肽包括具有1至10个选自甲硫氨酸、甘氨酸或其组合的氨基酸残基的氨基酸序列，所述多肽具有IL-7 的活性或其相似活性。

上述制备方法还可以包括连接由异源序列组成的多肽的步骤，且可以通过上述制备方法制备IL-7融合蛋白。特别地，由异源序列组成的多肽可以是选自如下的任一种：免疫球蛋白的Fc区或其部分，白蛋白，白蛋白结合多肽，PAS，人绒毛膜促性腺激素β亚基的CTP，PEG，XTEN，HES，白蛋白结合小分子及其组合。

在另一方面，本发明提供了一种制备修饰IL-7的方法，所述方法包括：将编码寡肽的多核苷酸编码连接至编码多肽的多核苷酸的N端，所述寡肽包括具有1至10个选自甲硫氨酸、甘氨酸或其组合的氨基酸残基的氨基酸序列，所述多肽包括具有IL-7活性或其相似活性的第一结构域的氨基酸序列，从而制备连接的多核苷酸；和，表达所述连接的多核苷酸来收集修饰IL-7蛋白。

上述制备方法还可以包括连接编码由异源序列组成的多肽的多核苷酸的步骤，且可以通过上述制备方法制备IL-7融合蛋白。特别地，由异源序列组成的多肽可以选自以下任一种：免疫球蛋白的Fc区或其部分，白蛋白，白蛋白结合多肽，PAS，人绒毛膜促性腺激素β亚基的CTP，PEG，XTEN，HES，白蛋白结合小分子及其组合。

在另一方面，本发明提供用于预防或治疗疾病的药物组合物，其含有修饰IL-7或IL-7融合蛋白。

可以施用本发明的修饰IL-7或IL-7融合蛋白给药以促进幼稚T细胞或预先存在的T细胞或移植的T 细胞的扩增或存活，或促进体外分离的T细胞聚集体的增殖。

这些疾病可能是慢性肝炎，癌症或传染病。所述癌症可能是头颈癌或子宫颈癌，所述慢性肝炎可能是乙型肝炎或丙型肝炎。此外，所述传染病可以是病毒感染，并且所述病毒可以选自流感病毒，CMV， HSV-1，HSV-2，HIV，HCV，HBV，西尼罗河热病毒和登革热病毒。另外，该疾病可能是淋巴细胞减少症(淋巴球减少症)或由淋巴细胞特别是T细胞数量低下引起的任何症状，疾病和综合征。

本发明的修饰IL-7或IL-7融合蛋白还可以包含药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体可以是适合于递送给患者的任何无毒材料。所述载体可以是蒸馏水，醇，脂肪，蜡或惰性固体。此外，其中还可以包含任何药学上可接受的佐剂(缓冲剂，分散剂)。

另外，含有本发明的修饰IL-7或IL-7融合蛋白的药物组合物可以通过各种方法对受试者给药。例如，所述组合物可以通过胃肠外给药，例如皮下，肌内或静脉内给药。所述组合物可以通过常规的无菌方法灭菌。所述组合物可含有药学上可接受的辅助物质和调节生理条件如pH调节，毒性调节剂及其类似物所需的佐剂。具体实例可以包括乙酸钠，氯化钾，氯化钙，乳酸钠等包含在制剂中的融合蛋白的浓度可以广泛地变化。例如，以重量计，融合蛋白的浓度可以小于约0.5％，通常或至少约1％至多达15％至20％。浓度可以基于所选的特定给药方法，流体体积，粘度等来选择。

在另一方面，本发明提供了通过以含有本发明的修饰IL-7或IL-7融合蛋白作为活性成分的组合物给药来预防或治疗疾病的方法。

所述方法包括将治疗有效量的本发明的修饰IL-7或IL-7融合蛋白对有需要的受试者给药，所述受试者具有与目标疾病直接相关或不相关的健康状态。受试者可以是哺乳动物，优选为人类。

本发明的组合物可以以任何途径给药。本发明的组合物可以通过直接给药(例如通过注射，移植或局部施用到组织区域中来局部给药)或系统给药(例如肠胃外或口服)来经由适当的手段提供给动物。当通过静脉内，皮下，眼内，腹膜内，肌内，口服，直肠内，眼内，脑内，颅内，脊柱内，心室内，鞘内，脑池内，囊内，鼻内或气雾剂给药来非肠道地施用本发明的组合物给药时，所述组合物优选包含体液或其溶液的一部分的水性或生理上可应用的悬浮液。因此，所述组合物中可以加入生理上可接受的载体或转运体并递送给患者，这不会对患者的电解质和/或体积平衡产生负面影响。因此，生理上可接受的载体或转运体可以是生理盐水。

此外，包括含有本发明的修饰IL-7或IL-7融合蛋白的核酸的DNA构建体(或基因组构建体)可以用作基因治疗方案的一部分。

在本发明中，为了重构或补充所需蛋白质的功能，能够在特定细胞中表达融合蛋白的表达载体可与任何生物学有效载体一起给药。这可以是能够将编码所需蛋白质或IL-7融合蛋白的基因有效地体内递送到细胞中的任何制剂或组合物。

为了使用编码修饰IL-7或IL-7融合蛋白的核酸进行基因治疗，可将目标基因插入病毒载体，重组细菌质粒或重组真核质粒中。病毒载体可以包括重组逆转录病毒，腺病毒，腺伴随病毒和单纯疱疹病毒-1 等编码本发明的融合蛋白的核酸用于基因治疗的人类给药剂量可以在0.1mg至200mg的范围内。在一个示例性实施例中，编码本发明融合蛋白的核酸对于人类的优选剂量可以在0.6mg至100mg的范围内。在一个示例性实施例中，编码本发明融合蛋白的核酸对于人类的优选剂量可以在1.2mg至50mg的范围内。

本发明的修饰IL-7或IL-7融合蛋白的单位剂量可以在0.001mg/kg至10mg/kg的范围内。在一个示例性实施例中，修饰IL-7或IL-7融合蛋白的单位剂量可以在0.01mg/kg至2mg/kg的范围内。在一个示例性实施例中，蛋白的单位剂量对于人类可以在0.02mg/kg至1mg/kg的范围内。单位剂量可能因治疗对象疾病和不良反应的不同而异。修饰IL-7蛋白的给药，可以通过定期快速浓注或外部储库(例如静脉袋)或通过连续静脉内，皮下或从内部(例如生物腐蚀植入物)腹膜内给药来进行。

本发明的修饰IL-7或IL-7融合蛋白可以与对有待预防或治疗的疾病具有预防或治疗效果的其它药物或生理活性物质组合给药，或者可以与其他药物组合配制成组合制剂，例如可以与免疫刺激剂如造血生长因子，细胞因子，抗原和佐剂组合给药。造血生长因子可以是干细胞因子(SCF)，G-CSF，GM-CSF 或Flt-3配体。细胞因子可以是γ干扰素，IL-2，IL-15，IL-21，IL-12，RANTES或B7-1。

使用含有本发明的修饰IL-7或IL-7融合蛋白的组合物用于预防或治疗疾病的方法，还可以包括与其他药物或生理活性物质组合给药，且可以根据疾病的类型、患者的健康状况、治疗或预防的目的、以及其他待给药的药物或生理活性物质，确定联合给药途径、给药时期和剂量。

本发明的方式

下文将结合实施例详细描述本发明。以下实施例旨在进一步说明本发明而不限制其范围。

实施例1：制备修饰IL-7蛋白，其中含与IL-7偶联的寡肽

制备修饰IL-7蛋白，其中含与IL-7的N端偶联的寡肽。使用人IL-7序列(SEQ IDNO:1)作为IL- 7，而使用甲硫氨酸(M)，甘氨酸(G)，MM，GG，MG，GM，MMM，MMG，MGM，GMM， MGG，GMG，GGM，GGG，DDD或MMMM序列作为寡肽。

如图1A所示，制备具有‘A'-IL-7”结构的各种形式的修饰IL-7。在本实施例中，使用甲硫氨酸 (M)，甘氨酸(G)，MM，GG，MG，GM，MMM，MMG，MGM，GMM，MGG，GMG，GGM， GGG，DDD或MMMM序列作为第二结构域(寡肽，‘A’)。对于与寡肽融合的作为第一结构域的IL-7，使用SEQID NO:28的核酸序列。获得IL-7与寡肽融合形式的完整核酸序列，然后插入到表达载体中。作为阴性对照，以相同的方式制备不具有寡肽修饰的IL-7蛋白质。

将包含A-IL-7基因的表达载体转染到HEK293细胞中。基于300mL悬浮培养物，使用208.3μg DNA和416.6μg(μL)聚乙烯亚胺(PEI)(w/w)制备复合物，然后转染到HEK293F细胞中。转染 6天后，获得细胞培养物并进行蛋白质印迹(western blot)，由此评估靶蛋白的表达率。然后，将培养物以8,000rpm离心30分钟，除去培养碎片，并使用孔径为0.22μm的瓶顶过滤器过滤。作为结果，获得含有M-IL-7，G-IL-7，MM-IL-7，GG-IL-7，MG-IL-7，GM-IL-7，MMM-IL-7，MMG-IL-7，MGM-IL- 7，GMM-IL-7，MGG-IL-7，GMG-IL-7，GGM-IL-7和MMMM-IL-7的修饰IL-7的培养液。

实施例2：制备IL-7融合蛋白，其中Fc区与IL-7的C端偶联

制备IL-7融合蛋白，即第二结构域-第一结构域-第三结构域，其中由异源氨基酸序列组成的多肽进一步与修饰IL-7的C端偶联。使用人IL-7(SEQ ID NO:1)的序列作为第一结构域，而使用M，G，MM， GG，MG，GM，MMM，MMG，MGM，GMM，MGG，GMG，GGM，GGG，DDD或MMMM序列作为第二结构域。使用Fc区(SEQ ID NO:9或14)的序列作为第三结构域。

如图1B所示，制备由第二结构域，第一结构域和第三结构域组成的各种形式的IL-7融合蛋白。在该实施例中，使用甲硫氨酸(M)，甘氨酸(G)，MM，GG，MG，GM，MMM，MMG，MGM，GMM，MGG，GMG，GGM，GGG，DDD或MMMM序列作为第二结构域；使用人IL-7作为第一结构域；使用杂合Fc(hFc，hyFc)或小鼠非裂解性Fc作为第三结构域。

具体地，使用美国专利号7,867,491中公开的hFc(杂合Fc)作为杂合Fc。hFc可以与生理活性蛋白偶联，因此与现有的经修饰的免疫球蛋白的Fc区相比，表现出优异的体内半衰期。

以与实施例1相同的方式制备基因表达载体并转染，培养细胞以制备含有各种形式的IL-7融合蛋白的培养液。作为结果，获得含有G-IL-7-hyFc，M-IL-7-hyFc，MM-IL-7-hyFc，GG-IL-7-hyFc，MG-IL-7- hyFc，GM-IL-7-hyFc，MMM-IL-7-hyFc，MMG-IL-7-hyFc，MGM-IL-7-hyFc，GMM-IL-7-hyFc，MGG-7- hyFc，GGM-IL-7-hyFc，GGG-IL-7-hyFc，DDD-IL-7-hyFc或MMMM-IL-7-hyFc蛋白的培养液。另外，作为对照组，生产含有由第一结构域和第三结构域组成的IL-7-hyFc蛋白质的培养液。

实施例3：修饰IL-7和修饰IL-7融合蛋白的生产和纯化

比较上述实施例中修饰IL-7和修饰IL-7融合蛋白的生产量。对于每种融合蛋白，测量培养液中蛋白质的量和细胞中存在的蛋白质的量。

通过获得细胞培养液来测量细胞外分泌的蛋白质的浓度，通过细胞裂解获得细胞中的蛋白质的量，并通过ELISA法测量浓度。作为第一抗体，使用人IL-7特异性抗体(Southern Biotech，目录号10122- 01)；作为第二抗体，使用生物素(BD，目录号554494)和链霉亲和素-HRP(BD，目录号554066)。

下表2中示出了生产量因寡肽与N端偶联的存在而改变的结果。

[表2]

其结果如表2所示，与未与寡肽偶联的IL-7相比，或与偶联了并非甲硫氨酸和甘氨酸的氨基酸的 DDD-IL-7,相比，MGM-IL-7的生成量增加。

此外，当hyFc进一步与修饰IL-7的C端融合时，产生的蛋白质显示出以高浓度存在，相对总产量显示出约2.8倍的增加。

实施例4:所制备的修饰IL-7和IL-7融合蛋白的生产量评估

在实施例2中制备的基因构建体中，将IL-7-hyFc和MGM-IL-7-hyFc蛋白质的每个基因插入到pAD15 载体中。然后，通过电穿孔方法将pAD15载体转染到CHO DG44细胞(哥伦比亚大学，美国)中进行贴壁或悬浮培养。在贴壁培养的情况下，电穿孔后5小时，培养基更换为含有10％dFBS(Gibco，USA， 30067-334)，MEMα(Gibco，12561，USA，目录号12561-049)，HT(5-羟基泰烟酰胺，Gibco，USA， 11067-030)的培养基。转染48小时后，将培养基更换为含有10％dFBS而不含HT的MEMα培养基，并进行HT选择。用HT选择完成的克隆进行MTX扩增以扩大生产力，细胞传代培养2或3次以稳定细胞。

在HT选择和MTX扩增后，评估修饰IL-7(A-IL-7)和IL-7融合蛋白(A-IL-7-hyFc)的单位生产率(pg/细胞/天，pcd，p/c/d)。在传代培养中，回收培养上清液，测定细胞数，使用人IgG ELISA试剂盒(Bethyl,USA)从上清液中测定各蛋白量。根据下面的公式1计算单位生产率，评估生产细胞系(pg/ 细胞/天，pcd)：

[公式1]

使用通过单位生产率评估选择的克隆，进行限制性稀释克隆(LDC)，且作为结果，选择生产率提高的单细胞克隆。使用无血清培养基将所选单细胞克隆作为悬浮细胞系进行培养。通过将单个传代培养物设定为3天，并传代培养35次来评估长期稳定性(LTS)测试，结果显示在图2中。

如图2A所示，N端不与寡肽偶联的IL-7融合蛋白没有显示生成量随着MTX浓度增加而增加。在这方面，为了进一步提高生产力，进行4次TX处理，但是效果不佳。但是，如图2B所示，N端与寡肽结合的IL-7融合蛋白(MGM-IL-7-hyFc)以MTX浓度依赖性方式显示生产率的显着提高。在LDL性能之后，蛋白质的生成量显示为约28pg/细胞/天和约16ug/mL。

从以上可以确认，寡肽与IL-7蛋白质的偶联对提高所制备的重组IL-7的生成量显示出优异的效果。

实施例5:所制备的修饰IL-7和IL-7融合蛋白的稳定性的确认

将上述实施例中得到的IL-7-hyFc和MGM-IL-7-hyFc蛋白质的培养液样品纯化，对纯化的蛋白质进行尺寸排阻(SE)HPLC，确认蛋白根据氯化钠浓度的稳定性。

首先，将IL-7-hyFc和MGM-IL-7-hyFc蛋白在缓冲液中稀释至1mg/mL的浓度。稀释的蛋白质用1 mL注射器和0.2μm过滤器过滤并加入小瓶中。将小瓶插入到插入件中并用小瓶盖封闭。将蛋白质分别以20μL的量注射到SE-HPLC系统中。在以下条件下进行SE-HPLC，通过其所得到的峰值来确认纯度。

<SE-HPLC进行条件>

柱：TSK-GEL G3000SW x L柱(7.8mm×300mm)(Tosoh,Japan)

柱温：25℃

固定相：50mM磷酸钠和100mM、200mM或300mM氯化钠(pH 6.8)的混合缓冲液

流速：0.6mL/min

分析时间：40min

分析方法：等强度方法

结果如图3所示，与IL-7-hyFc蛋白相比，尽管氯化钠浓度改变，MGM-IL-7-hyFc蛋白显示出稳定的模式。

实施例6:所制备的修饰IL-7和IL-7融合蛋白的天然PAGE确认

如下，再次证实根据实施例5中证实的修饰IL-7融合蛋白和IL-7融合蛋白之间的对氯化钠浓度的稳定性差异。

具体地，使用在与上述实施例相同的条件下制备的IL-7-hyFc和MGM-IL-7-hyFc，根据下表3中描述的条件进行天然PAGE。使用G-CSF-hyFc作为对照组。

[表3]

结果如图4所示，与IL-7-hyFc蛋白相比，MGM-IL-7-hyFc蛋白没有聚集，这与SE-HPLC的结果一致。

实施例7:所制备的修饰IL-7和IL-7融合蛋白的培养样品的分析

根据实施例5和6的结果，在可产生IL-7-hyFc或MGM-IL-7-hyFc蛋白的细胞系中，选择具有最高生产量的细胞系。然后，在与实施例5相同的条件下，通过相同的方法获得传代培养液并进行SE-HPLC。

结果如图5A所示，将所生产的IL-7-hyFc蛋白质的量设定为100％并与之相比，MGM-IL-7-hyFc的相对生产量为2091％，约为其21倍。另外，将目标蛋白质的量相对于各宿主细胞产生的总蛋白质进行比较时，IL-7-hyFc的纯度约为11.3％，二MGM-IL-7-hyFc蛋白质的纯度约为66.4％，从而显示约6倍的增加(图5B)。

从结果可以确认，寡肽与IL-7蛋白的偶联，对提高所制备的重组IL-7蛋白的纯度和生成量显示出优异的效果。

实施例8:所制备的修饰IL-7和IL-7融合蛋白的药代动力学

通过比较所制备的IL-7-hyFc和MGM-IL-7-hyFc重组蛋白的半衰期和曲线下面积(AUC)来确认药代动力学曲线(PK)。

首先，将雄性Sprague Dawley(SD)大鼠(5只大鼠/组)分别以每种重组蛋白质0.2mg/kg的量皮下给药。在给药前和给药后4,8,12,24,48,72,96,120,144和168小时收集血样，并在室温下保存30分钟使血样凝集。将凝集的血液样品以3,000rpm离心10分钟，获得每个样品的血清并将其储存在深冻冰箱中。

通过设计用于特异性检测未发生裂解的重组蛋白的完整形式的试验方法分析样品。具体地，该方法是通过用与人IL-7偶联的鼠源捕获抗体(R&D，目录号MAB207))包被板，并将含有所制备的重组蛋白的物样品加载到所述板上，然后使用第二抗体(SouthernBiotech，目录号9190-05)检测目标蛋白，所述第二抗体偶联有与鼠源人免疫球蛋白G4(IgG4)缀合的HRP。用含有10％脱脂乳的1×PBS将样品稀释 10倍，并以在标准曲线的线性位置进行分析，从而定量样品。结果如图6所示，其显示为每个时间点的血液中剩余的蛋白质量和曲线下的药物浓度面积。

作为结果，IL-7-hyFc和MGM-IL-7-hyFc重组蛋白显示出相似的AUC值(约1.2倍)。如此，证实了作为第二结构域的寡肽的融合不引起第一结构域的药代动力学变化。因此，MGM-IL-7-hyFc重组蛋白和IL-7-hyFc重组蛋白在体内可表现出类似的药代动力学特征。

实施例9:所制备的修饰IL-7和IL-7融合蛋白的免疫原性

比较如上制备的IL-7-hyFc和MGM-IL-7-hyFc重组蛋白的给药的抗药物抗体(ADA)产生能力，从而检查每种IL-7融合蛋白的抗原性。

首先，将以与实施例8中所述相同的方式获得的血液样品装载到用0.2μg/孔的IL-7-hyFc或MGM- IL-7-hyFc重组蛋白包被的板上。然后，使用与HRP缀合的大鼠免疫球蛋白抗体(Southern Biotech，目录号1031-05)，使用用于检测大鼠中的ADA的测试方法分析样品。

具体地，通过稀释样品直到ADA的反应变得与正常大鼠血清(Negative Cut CutOff；NCO)的反应相同，并且通过光学密度测量根据稀释倍数的样品反应。结果如图7所示。

结果如图7所示，IL-7-hyFc和MGM-IL-7-hyFc达到阴性截止值(NCO)所需的稀释倍数是相似的。从结果证实，作为第二结构域的寡肽的融合，不增加抗原性。

实施例10:所制备的修饰IL-7和IL-7融合蛋白的药效学性质

比较根据上述制备的MGM-IL-7-hyFc和IL-7-hyFc重组蛋白给药时的白细胞数(WBC)，确认各蛋白质的药效动力学性质。

首先，每种蛋白质以0.2mg/kg的量皮下给药于雄性SD大鼠(5只大鼠/组)。然后，在给药前和给药后的第1周，第2周和第3周从大鼠采集血样。为了防止血液样本的凝集，以EDTA处理的试管取得样本，混合5分钟并稳定化，通过全血计数(CBC)分析WBC的数量。

结果如图8所示，IL-7-hyFc和MGM-IL-7-hyFc重组蛋白在给药后第2周以相似的方式将WBC数量增加到最高水平。也就是说，第二结构域寡肽的融合没有引起药效动力学没有改变。因此，证实了IL- 7-hyFc和MGM-IL-7-hyFc重组蛋白可以表现出相似的药效动力学性质。

实施例11:所制备的修饰IL-7和IL-7融合蛋白的体外活性的比较

使用作为小鼠未成熟B淋巴细胞的2E8细胞(ATCC，TIB-239)进行生物活性的分析。

首先，将细胞接种到96孔板(1×10⁵个细胞/50μL/孔)中，并将MGM-IL-7-hyFc的浓度从750pM 逐步稀释至2.93pM，且在孔中处理。将细胞在37℃，5％CO₂的培养箱中培养70小时，用浓度为20 μL/孔的MTS处理，再在培养箱(37℃，5％CO₂)中培养4小时。然后，在490nm处测量吸光度。具体地，使用WHO国际标准人IL-7(NIBSC编码：90/530，10万单位)作为对照组。产生随MGM-IL-7- hyFc处理浓度变化的校准曲线(4-参数拟合)，分析结果示于图9。

结果如图9所示，基于国际标准100,000单位，MGM-IL-7-hyFc的基于logEC₅₀活性显示为126000单位，基于PLA活性显示为371000单位。这表明，考虑到IL-7的分子数目，MGM-IL-7-hyFc的活性与国际标准人IL-7的活性相似或更高。

实施例12:所制备的修饰IL-7融合蛋白在感染致死量的流感病毒的模型中的预防和治疗效果

通过麻醉，然后通过鼻腔施用3LD₅₀H5N2病毒(A/Aquatic bird/Korea/W81/2005)，制备具有致死剂量的流感的小鼠模型。通常，感染病毒的小鼠从

天开始体重下降，一周后死亡。对由此制备的疾病模型，用实施例2和4中制备的IL-7重组蛋白经鼻腔给药，并将IL-7-mFc(小鼠Fc)(SEQ ID NO： 27)用作对照组。

特别地，G-CSF可以抑制早期流感病毒感染，增殖嗜中性粒细胞，从而促进免疫反应。因此，G- CSF-hyFc被用作另一个实验组。

每个实验组使用6只小鼠，在感染致命剂量流感前第14天，通过鼻腔给药IL-7-mFc(IL-7-小鼠Fc)， MGM-IL-7-hyFc或G-CSF-hyFc。然后，给予3LD₅₀H5N2病毒，观察20天的体重和存活率。

结果如图10所示，所有组的体重开始下降(图10A)。然而，IL-7-mFc处理组和MGM-IL-7-hyFc 处理组的体重减少差距逐渐减小，体重逐渐恢复，其存活率高，与对照组不同。IL-7-mFc处理组100％存活，MGM-IL-7-hyFc处理组显示83％的存活率(图10B)。

观察到MGM-IL-7-hyFc的作用稍低于IL-7-mFc的原因似乎是由于物种之间的差异。也就是说，在小鼠的体内系统中，人衍生的Fc的功能低于鼠源的Fc。

同时，用PBS或G-CSF-hyFc处理的组显示非常低的效果，因此在10天内感染致死量的流感的小鼠的存活率为0％。

总之，MGM-IL-7-hyFc重组蛋白在流感模型中显示出强烈的作用，但是G-CSF-hyFc并非如此，这表明MGM-IL-7在流感中非常有效。

实施例13:所制备的修饰IL-7融合蛋白在具有TC-1癌症疾病的模型中的治疗效果

为了制备患有子宫内膜癌的疾病模型，给小鼠腹膜内施用3mg的Depo-Provera以调整其月经期。在 4天内，将小鼠用壬苯醇醚-9(N9，USP，目录号1467950)对小鼠阴道给药，以刺激阴道组织，并通过用PBS洗涤除去剩余的N9。然后，为了将癌细胞移植到子宫中，施用1×10⁵个TC-1细胞(Dr.Jae-Tae LEE,School of Medicine,Kyungpook NationalUniversity)，然后在1天后，将1μg的MGM-IL-7-hyFc对子宫颈给药。

作为结果，在以融合蛋白给药28天后，TC-1肿瘤细胞移植到子宫颈内或阴道内部并生长。即，如图11所示，癌细胞增殖并暴露在阴道口外。在以PBS给药的对照组的情况下，观察到10只小鼠中有6 只具有TC-1细胞的增殖，并且其中一只由于癌细胞的过度增殖而死亡。

相反，在以MGM-IL-7融合蛋白给药的实验组中，仅观察到10只小鼠中有2只出现TC-1细胞增殖的症状，没有小鼠死亡。因此，证实了修饰IL-7融合蛋白对癌症的预防和治疗是有效的。

序列表

<110> 格纳西尼有限公司

<120> 经修饰的白细胞介素-7蛋白及其用途

<130> PCB602014GNX

<150> KR 2015/0082793

<151> 2015-06-11

<160> 40

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 177

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> amino acid sequence of human IL-7 (Accession number : P13232)

<400> 1

Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile

1 5 10 15

Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys

20 25 30

Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu

35 40 45

Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe

50 55 60

Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe

65 70 75 80

Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser

85 90 95

Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr

100 105 110

Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala

115 120 125

Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu

130 135 140

Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu

145 150 155 160

Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu

165 170 175

His

<210> 2

<211> 154

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> amino acid sequence of rat IL-7 (Accession number : P56478)

<400> 2

Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Ile Pro Pro Leu Ile

1 5 10 15

Leu Val Leu Leu Pro Val Thr Ser Ser Asp Cys His Ile Lys Asp Lys

20 25 30

Asp Gly Lys Ala Phe Gly Ser Val Leu Met Ile Ser Ile Asn Gln Leu

35 40 45

Asp Lys Met Thr Gly Thr Asp Ser Asp Cys Pro Asn Asn Glu Pro Asn

50 55 60

Phe Phe Lys Lys His Leu Cys Asp Asp Thr Lys Glu Ala Ala Phe Leu

65 70 75 80

Asn Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ile Ser

85 90 95

Glu Glu Phe Asn Asp His Leu Leu Arg Val Ser Asp Gly Thr Gln Thr

100 105 110

Leu Val Asn Cys Thr Ser Lys Glu Glu Lys Thr Ile Lys Glu Gln Lys

115 120 125

Lys Asn Asp Pro Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Arg Glu Ile Lys Thr

130 135 140

Cys Trp Asn Lys Ile Leu Lys Gly Ser Ile

145 150

<210> 3

<211> 154

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> amino acid sequence of mouse IL-7 (Accession number : P10168)

<400> 3

Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Ile Pro Pro Leu Ile

1 5 10 15

Leu Val Leu Leu Pro Val Thr Ser Ser Glu Cys His Ile Lys Asp Lys

20 25 30

Glu Gly Lys Ala Tyr Glu Ser Val Leu Met Ile Ser Ile Asp Glu Leu

35 40 45

Asp Lys Met Thr Gly Thr Asp Ser Asn Cys Pro Asn Asn Glu Pro Asn

50 55 60

Phe Phe Arg Lys His Val Cys Asp Asp Thr Lys Glu Ala Ala Phe Leu

65 70 75 80

Asn Arg Ala Ala Arg Lys Leu Lys Gln Phe Leu Lys Met Asn Ile Ser

85 90 95

Glu Glu Phe Asn Val His Leu Leu Thr Val Ser Gln Gly Thr Gln Thr

100 105 110

Leu Val Asn Cys Thr Ser Lys Glu Glu Lys Asn Val Lys Glu Gln Lys

115 120 125

Lys Asn Asp Ala Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Arg Glu Ile Lys Thr

130 135 140

Cys Trp Asn Lys Ile Leu Lys Gly Ser Ile

145 150

<210> 4

<211> 177

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> amino acid sequence of monkey IL-7 (Accession number :

NP_001279008)

<400> 4

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1 5 10 15

Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys

20 25 30

Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu

35 40 45

Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe

50 55 60

Asn Phe Phe Lys Arg His Leu Cys Asp Asp Asn Lys Glu Gly Met Phe

65 70 75 80

Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Lys Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser

85 90 95

Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr

100 105 110

Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Lys Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala

115 120 125

Leu Gly Glu Pro Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu

130 135 140

Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Ser Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu

145 150 155 160

Gln Lys Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu

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His

<210> 5

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> amino acid sequence of cow IL-7 (Accession number : P26895)

<400> 5

Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Ile Pro Pro Leu Ile

1 5 10 15

Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Ser Gly Lys

20 25 30

Asp Gly Gly Ala Tyr Gln Asn Val Leu Met Val Asn Ile Asp Asp Leu

35 40 45

Asp Asn Met Ile Asn Phe Asp Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Pro Asn

50 55 60

Phe Phe Lys Lys His Ser Cys Asp Asp Asn Lys Glu Ala Ser Phe Leu

65 70 75 80

Asn Arg Ala Ser Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ile Ser

85 90 95

Asp Asp Phe Lys Leu His Leu Ser Thr Val Ser Gln Gly Thr Leu Thr

100 105 110

Leu Leu Asn Cys Thr Ser Lys Gly Lys Gly Arg Lys Pro Pro Ser Leu

115 120 125

Ser Glu Ala Gln Pro Thr Lys Asn Leu Glu Glu Asn Lys Ser Ser Lys

130 135 140

Glu Gln Lys Lys Gln Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Ile Leu Leu Gln

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Lys Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Arg Gly Ile Lys Glu His

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<211> 176

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> amino acid sequence of sheep IL-7 (Accession number : Q28540)

<400> 6

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1 5 10 15

Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Phe Ser Gly Lys

20 25 30

Asp Gly Gly Ala Tyr Gln Asn Val Leu Met Val Ser Ile Asp Asp Leu

35 40 45

Asp Asn Met Ile Asn Phe Asp Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Pro Asn

50 55 60

Phe Phe Lys Lys His Ser Cys Asp Asp Asn Lys Glu Ala Ser Phe Leu

65 70 75 80

Asn Arg Ala Ala Arg Lys Leu Lys Gln Phe Leu Lys Met Asn Ile Ser

85 90 95

Asp Asp Phe Lys Leu His Leu Ser Thr Val Ser Gln Gly Thr Leu Thr

100 105 110

Leu Leu Asn Cys Thr Ser Lys Gly Lys Gly Arg Lys Pro Pro Ser Leu

115 120 125

Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Asn Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys

130 135 140

Glu Gln Arg Lys Gln Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Ile Leu Leu Gln

145 150 155 160

Lys Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Arg Gly Ile Thr Glu His

165 170 175

<210> 7

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> amino acid sequence of human IgD constant region (Genbank

accession No. P01880)

<400> 7

Ala Pro Thr Lys Ala Pro Asp Val Phe Pro Ile Ile Ser Gly Cys Arg

1 5 10 15

His Pro Lys Asp Asn Ser Pro Val Val Leu Ala Cys Leu Ile Thr Gly

20 25 30

Tyr His Pro Thr Ser Val Thr Val Thr Trp Tyr Met Gly Thr Gln Ser

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Gln Pro Gln Arg Thr Phe Pro Glu Ile Gln Arg Arg Asp Ser Tyr Tyr

50 55 60

Met Thr Ser Ser Gln Leu Ser Thr Pro Leu Gln Gln Trp Arg Gln Gly

65 70 75 80

Glu Tyr Lys Cys Val Val Gln His Thr Ala Ser Lys Ser Lys Lys Glu

85 90 95

Ile Phe Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro

100 105 110

Thr Ala Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala

115 120 125

Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys

130 135 140

Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu

145 150 155 160

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165 170 175

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210 215 220

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260 265 270

Val Lys Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala

275 280 285

Ala Ser Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile

290 295 300

Leu Leu Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe

305 310 315 320

Ala Pro Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ser Thr Thr Phe Trp Ala

325 330 335

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340 345 350

Tyr Thr Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala

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Ser Arg Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His Gly Pro Met Lys

370 375 380

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<211> 327

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> amino acid sequence of Partial human IgG4 constant region

(Genbank accession No. AAH25985)

<400> 8

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

<210> 9

<211> 245

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> amino acid sequence of hyFc

<400> 9

Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys

1 5 10 15

Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His

20 25 30

Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

35 40 45

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

50 55 60

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

65 70 75 80

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

85 90 95

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

100 105 110

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

115 120 125

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

130 135 140

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

145 150 155 160

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

165 170 175

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

180 185 190

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

195 200 205

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

210 215 220

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

225 230 235 240

Leu Ser Leu Gly Lys

245

<210> 10

<211> 245

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> amino acid sequence of hyFcM1

<400> 10

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1 5 10 15

Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His

20 25 30

Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

35 40 45

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

50 55 60

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

65 70 75 80

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

85 90 95

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

100 105 110

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

115 120 125

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

130 135 140

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

145 150 155 160

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

165 170 175

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

180 185 190

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

195 200 205

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

210 215 220

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

225 230 235 240

Leu Ser Leu Gly Lys

245

<210> 11

<211> 245

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> amino acid sequence of hyFcM2

<400> 11

Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Gly Ser Lys Glu Lys

1 5 10 15

Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His

20 25 30

Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

35 40 45

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

50 55 60

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

65 70 75 80

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

85 90 95

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

100 105 110

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

115 120 125

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

130 135 140

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

145 150 155 160

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

165 170 175

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

180 185 190

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

195 200 205

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

210 215 220

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

225 230 235 240

Leu Ser Leu Gly Lys

245

<210> 12

<211> 245

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> amino acid sequence of hyFcM3

<400> 12

Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Ser Gly Lys Glu Lys

1 5 10 15

Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His

20 25 30

Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

35 40 45

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

50 55 60

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

65 70 75 80

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

85 90 95

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

100 105 110

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

115 120 125

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

130 135 140

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

145 150 155 160

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

165 170 175

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

180 185 190

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

195 200 205

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

210 215 220

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

225 230 235 240

Leu Ser Leu Gly Lys

245

<210> 13

<211> 245

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> amino acid sequence of hyFcM4

<400> 13

Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Ser Ser Lys Glu Lys

1 5 10 15

Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His

20 25 30

Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

35 40 45

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

50 55 60

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

65 70 75 80

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

85 90 95

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

100 105 110

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

115 120 125

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

130 135 140

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

145 150 155 160

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

165 170 175

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

180 185 190

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

195 200 205

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

210 215 220

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

225 230 235 240

Leu Ser Leu Gly Lys

245

<210> 14

<211> 243

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> amino acid sequence of mouse IgG Fc variant

<400> 14

Ala Ser Ala Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys

1 5 10 15

Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe

20 25 30

Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val

35 40 45

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile

50 55 60

Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr

65 70 75 80

His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro

85 90 95

Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Ala Phe Ala Cys Ala Val

100 105 110

Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro

115 120 125

Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu

130 135 140

Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp

145 150 155 160

Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr

165 170 175

Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

180 185 190

Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu

195 200 205

Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His

210 215 220

His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys Gly Gly Gly Asn

225 230 235 240

Ser Gly Ser

<210> 15

<211> 153

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> amino acid sequence of modified IL-7(M)

<400> 15

Met Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val

1 5 10 15

Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly

20 25 30

Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys

35 40 45

Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu

50 55 60

Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu

65 70 75 80

Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln

85 90 95

Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys

100 105 110

Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp

115 120 125

Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn

130 135 140

Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His

145 150

<210> 16

<211> 154

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> amino acid sequence of modified IL-7(MM)

<400> 16

Met Met Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser

1 5 10 15

Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile

20 25 30

Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile

35 40 45

Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys

50 55 60

Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His

65 70 75 80

Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly

85 90 95

Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr

100 105 110

Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn

115 120 125

Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp

130 135 140

Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His

145 150

<210> 17

<211> 155

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> amino acid sequence of modified IL-7(MMM)

<400> 17

Met Met Met Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu

1 5 10 15

Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu

20 25 30

Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His

35 40 45

Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg

50 55 60

Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu

65 70 75 80

His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr

85 90 95

Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro

100 105 110

Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu

115 120 125

Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys

130 135 140

Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His

145 150 155

<210> 18

<211> 155

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> amino acid sequence of modified IL-7(MGM)

<400> 18

Met Gly Met Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu

1 5 10 15

Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu

20 25 30

Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His

35 40 45

Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg

50 55 60

Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu

65 70 75 80

His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr

85 90 95

Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro

100 105 110

Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu

115 120 125

Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys

130 135 140

Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His

145 150 155

<210> 19

<211> 155

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> amino acid sequence of modified IL-7(DDD)

<400> 19

Asp Asp Asp Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu

1 5 10 15

Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu

20 25 30

Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His

35 40 45

Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg

50 55 60

Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu

65 70 75 80

His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr

85 90 95

Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro

100 105 110

Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu

115 120 125

Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys

130 135 140

Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His

145 150 155

<210> 20

<211> 156

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> amino acid sequence of modified IL-7(MMMM)

<400> 20

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Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys

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Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg

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Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His

145 150 155

<210> 21

<211> 398

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<213> Artificial Sequence

<220>

<223> amino acid sequence of modified IL-7(M) fused hyFc

<400> 21

Met Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val

1 5 10 15

Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly

20 25 30

Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys

35 40 45

Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu

50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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<223> amino acid sequence of modified IL-7(MM) fused hyFc

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290 295 300

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Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

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<211> 400

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<220>

<223> amino acid sequence of modified IL-7(MGM) fused hyFc

<400> 24

Met Gly Met Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu

1 5 10 15

Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu

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Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His

35 40 45

Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg

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Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu

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Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

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Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

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<210> 25

<211> 401

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> amino acid sequence of modified IL-7(MMMM) fused hyFc

<400> 25

Met Met Met Met Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr

1 5 10 15

Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys

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Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg

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His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala

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Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp

65 70 75 80

Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys

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100 105 110

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Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr

130 135 140

Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His Arg Asn Thr Gly

145 150 155 160

Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu

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Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu

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Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

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Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp

210 215 220

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Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val

245 250 255

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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys

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Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

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Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

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Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

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Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys

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Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

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Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

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Lys

<210> 26

<211> 397

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> amino acid sequence of human IL-7 fused hyFc

<400> 26

Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu

1 5 10 15

Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser

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Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp

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Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val

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Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser

100 105 110

Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu

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Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys

130 135 140

Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu

145 150 155 160

Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr

165 170 175

Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu

180 185 190

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

195 200 205

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln

210 215 220

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

225 230 235 240

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

245 250 255

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

260 265 270

Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

275 280 285

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

290 295 300

Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

305 310 315 320

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

325 330 335

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

340 345 350

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

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<211> 395

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> amino acid sequence of human IL-7 fused nonlytic mouse Fc

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Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu

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Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val

85 90 95

Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser

100 105 110

Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu

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Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys

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Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His Ala Ser Ala Glu Pro Arg Gly Pro

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Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Glu

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Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu

180 185 190

Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

195 200 205

Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu

210 215 220

Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr

225 230 235 240

Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser

245 250 255

Gly Lys Ala Phe Ala Cys Ala Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro

260 265 270

Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln

275 280 285

Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val

290 295 300

Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val

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Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu

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Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg

340 345 350

Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val

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<211> 531

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> nucleotide sequence of human IL-7

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ctgatggtgt ccatcgacca gctgctggat tctatgaagg agattgggag taactgcctg 180

aacaatgagt tcaacttctt caaacggcac atttgtgatg ccaacaagga gggaatgttc 240

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<210> 29

<211> 534

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<223> nucleotide sequence of modified IL-7(M)

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caggtgaagg gcagaaagcc cgccgccctg ggcgaggccc agcccaccaa gagcctggag 420

gagaacaaga gcctgaagga gcagaagaag ctgaacgacc tgtgcttcct gaagagactg 480

ctgcaggaga tcaagacctg ctggaacaag atcctgatgg gcaccaagga gcac 534

<210> 30

<211> 537

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> nucleotide sequence of modified IL-7(MM)

<400> 30

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ggccaggtga agggcagaaa gcccgccgcc ctgggcgagg cccagcccac caagagcctg 420

gaggagaaca agagcctgaa ggagcagaag aagctgaacg acctgtgctt cctgaagaga 480

ctgctgcagg agatcaagac ctgctggaac aagatcctga tgggcaccaa ggagcac 537

<210> 31

<211> 540

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> nucleotide sequence of modified IL-7(MMM)

<400> 31

atgttccacg tgagcttcag atacatcttc ggcctgcccc ccctgatcct ggtgctgctg 60

cccgtggcca gcagcatgat gatggactgc gacatcgagg gcaaggacgg caagcagtac 120

gagagcgtgc tgatggtgag catcgaccag ctgctggaca gcatgaagga gatcggcagc 180

aactgcctga acaacgagtt caacttcttc aagagacaca tctgcgacgc caacaaggag 240

ggcatgttcc tgttcagagc cgccagaaag ctgagacagt tcctgaagat gaacagcacc 300

ggcgacttcg acctgcacct gctgaaggtg agcgagggca caaccatcct gctgaactgc 360

accggccagg tgaagggcag aaagcccgcc gccctgggcg aggcccagcc caccaagagc 420

ctggaggaga acaagagcct gaaggagcag aagaagctga acgacctgtg cttcctgaag 480

agactgctgc aggagatcaa gacctgctgg aacaagatcc tgatgggcac caaggagcac 540

<210> 32

<211> 540

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> nucleotide sequence of modified IL-7(MGM)

<400> 32

atgttccacg tgagcttcag gtacatcttc ggcctgccac ccctgatcct ggtgctgctg 60

cctgtggcca gctccatggg gatggactgc gacatcgagg gaaaagacgg caagcagtac 120

gaaagcgtgc tgatggtgtc catcgaccag ctgctggatt ctatgaagga gattgggagt 180

aactgcctga acaatgagtt caacttcttc aaacggcaca tttgtgatgc caacaaggag 240

ggaatgttcc tgtttcgggc cgctagaaaa ctgaggcagt tcctgaagat gaacagcacc 300

ggagactttg atctgcatct gctgaaagtg tctgagggca ccacaatcct gctgaactgc 360

actgggcagg tgaaaggaag gaagcctgcc gctctgggag aggctcagcc aaccaagtca 420

ctggaggaaa acaaaagcct gaaggaacag aagaaactga atgacctgtg ctttctgaaa 480

cggctgctgc aggagatcaa aacatgttgg aacaagattc tgatgggcac caaggagcac 540

<210> 33

<211> 540

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> nucleotide sequence of modified IL-7(DDD)

<400> 33

atgttccacg tgagcttcag atacatcttc ggcctgcccc ccctgatcct ggtgctgctg 60

cccgtggcca gcagcgacga tgacgactgc gacatcgagg gcaaggacgg caagcagtac 120

gagagcgtgc tgatggtgag catcgaccag ctgctggaca gcatgaagga gatcggcagc 180

aactgcctga acaacgagtt caacttcttc aagagacaca tctgcgacgc caacaaggag 240

ggcatgttcc tgttcagagc cgccagaaag ctgagacagt tcctgaagat gaacagcacc 300

ggcgacttcg acctgcacct gctgaaggtg agcgagggca caaccatcct gctgaactgc 360

accggccagg tgaagggcag aaagcccgcc gccctgggcg aggcccagcc caccaagagc 420

ctggaggaga acaagagcct gaaggagcag aagaagctga acgacctgtg cttcctgaag 480

agactgctgc aggagatcaa gacctgctgg aacaagatcc tgatgggcac caaggagcac 540

<210> 34

<211> 543

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> nucleotide sequence of modified IL-7(MMMM)

<400> 34

atgttccacg tgagcttcag atacatcttc ggcctgcccc ccctgatcct ggtgctgctg 60

cccgtggcca gcagcatgat gatgatggac tgcgacatcg agggcaagga cggcaagcag 120

tacgagagcg tgctgatggt gagcatcgac cagctgctgg acagcatgaa ggagatcggc 180

agcaactgcc tgaacaacga gttcaacttc ttcaagagac acatctgcga cgccaacaag 240

gagggcatgt tcctgttcag agccgccaga aagctgagac agttcctgaa gatgaacagc 300

accggcgact tcgacctgca cctgctgaag gtgagcgagg gcacaaccat cctgctgaac 360

tgcaccggcc aggtgaaggg cagaaagccc gccgccctgg gcgaggccca gcccaccaag 420

agcctggagg agaacaagag cctgaaggag cagaagaagc tgaacgacct gtgcttcctg 480

aagagactgc tgcaggagat caagacctgc tggaacaaga tcctgatggg caccaaggag 540

cac 543

<210> 35

<211> 1284

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> nucleotide sequence of modified IL-7(M) fused hyFc

<400> 35

atgttccacg tgagcttcag atacatcttc ggcctgcccc ccctgatcct ggtgctgctg 60

cccgtggcca gcagcatgga ctgcgacatc gagggcaagg acggcaagca gtacgagagc 120

gtgctgatgg tgagcatcga ccagctgctg gacagcatga aggagatcgg cagcaactgc 180

ctgaacaacg agttcaactt cttcaagaga cacatctgcg acgccaacaa ggagggcatg 240

ttcctgttca gagccgccag aaagctgaga cagttcctga agatgaacag caccggcgac 300

ttcgacctgc acctgctgaa ggtgagcgag ggcacaacca tcctgctgaa ctgcaccggc 360

caggtgaagg gcagaaagcc cgccgccctg ggcgaggccc agcccaccaa gagcctggag 420

gagaacaaga gcctgaagga gcagaagaag ctgaacgacc tgtgcttcct gaagagactg 480

ctgcaggaga tcaagacctg ctggaacaag atcctgatgg gcaccaagga gcacaggaac 540

acaggcagag gcggcgagga gaagaagaag gagaaggaga aggaggagca ggaggaaaga 600

gagaccaaga cccccgagtg ccccagccac acccagcccc tgggcgtgtt cctgttccct 660

cccaagccca aggacaccct gatgatcagc agaacccccg aggtgacctg cgtggtcgtg 720

gatgtgagcc aggaagatcc cgaagtgcag ttcaactggt acgtggatgg cgtggaagtg 780

cacaacgcca agaccaagcc cagagaagag cagttcaact ccacctacag agtggtgagc 840

gtgctgaccg tgctgcacca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtgtcc 900

aacaaaggcc tgcccagctc catcgagaag accatcagca aagccaaagg ccagcccaga 960

gaaccccagg tgtacaccct gcctcccagc caggaagaga tgaccaagaa ccaggtgtcc 1020

ctgacctgcc tggtgaaagg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggaaagcaac 1080

ggccagcccg agaacaatta caagacaacc cctcccgtgc tggatagcga tggcagcttc 1140

tttctgtaca gcagactgac cgtggacaag agcagatggc aggaaggcaa cgtgttcagc 1200

tgcagcgtga tgcacgaagc cctgcacaac cactacaccc agaagagcct gtccctgagc 1260

ctgggcaagt gactcgagtc taga 1284

<210> 36

<211> 1272

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> nucleotide sequence of modified IL-7(MM) fused hyFc

<400> 36

atgttccacg tgagcttcag atacatcttc ggcctgcccc ccctgatcct ggtgctgctg 60

cccgtggcca gcagcatgat ggactgcgac atcgagggca aggacggcaa gcagtacgag 120

agcgtgctga tggtgagcat cgaccagctg ctggacagca tgaaggagat cggcagcaac 180

tgcctgaaca acgagttcaa cttcttcaag agacacatct gcgacgccaa caaggagggc 240

atgttcctgt tcagagccgc cagaaagctg agacagttcc tgaagatgaa cagcaccggc 300

gacttcgacc tgcacctgct gaaggtgagc gagggcacaa ccatcctgct gaactgcacc 360

ggccaggtga agggcagaaa gcccgccgcc ctgggcgagg cccagcccac caagagcctg 420

gaggagaaca agagcctgaa ggagcagaag aagctgaacg acctgtgctt cctgaagaga 480

ctgctgcagg agatcaagac ctgctggaac aagatcctga tgggcaccaa ggagcacagg 540

aacacaggca gaggcggcga ggagaagaag aaggagaagg agaaggagga gcaggaggaa 600

agagagacca agacccccga gtgccccagc cacacccagc ccctgggcgt gttcctgttc 660

cctcccaagc ccaaggacac cctgatgatc agcagaaccc ccgaggtgac ctgcgtggtc 720

gtggatgtga gccaggaaga tcccgaagtg cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggaa 780

gtgcacaacg ccaagaccaa gcccagagaa gagcagttca actccaccta cagagtggtg 840

agcgtgctga ccgtgctgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtg 900

tccaacaaag gcctgcccag ctccatcgag aagaccatca gcaaagccaa aggccagccc 960

agagaacccc aggtgtacac cctgcctccc agccaggaag agatgaccaa gaaccaggtg 1020

tccctgacct gcctggtgaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggaaagc 1080

aacggccagc ccgagaacaa ttacaagaca acccctcccg tgctggatag cgatggcagc 1140

ttctttctgt acagcagact gaccgtggac aagagcagat ggcaggaagg caacgtgttc 1200

agctgcagcg tgatgcacga agccctgcac aaccactaca cccagaagag cctgtccctg 1260

agcctgggca ag 1272

<210> 37

<211> 1275

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> nucleotide sequence of modified IL-7(MMM) fused hyFc

<400> 37

atgttccacg tgagcttcag atacatcttc ggcctgcccc ccctgatcct ggtgctgctg 60

cccgtggcca gcagcatgat gatggactgc gacatcgagg gcaaggacgg caagcagtac 120

gagagcgtgc tgatggtgag catcgaccag ctgctggaca gcatgaagga gatcggcagc 180

aactgcctga acaacgagtt caacttcttc aagagacaca tctgcgacgc caacaaggag 240

ggcatgttcc tgttcagagc cgccagaaag ctgagacagt tcctgaagat gaacagcacc 300

ggcgacttcg acctgcacct gctgaaggtg agcgagggca caaccatcct gctgaactgc 360

accggccagg tgaagggcag aaagcccgcc gccctgggcg aggcccagcc caccaagagc 420

ctggaggaga acaagagcct gaaggagcag aagaagctga acgacctgtg cttcctgaag 480

agactgctgc aggagatcaa gacctgctgg aacaagatcc tgatgggcac caaggagcac 540

aggaacacag gcagaggcgg cgaggagaag aagaaggaga aggagaagga ggagcaggag 600

gaaagagaga ccaagacccc cgagtgcccc agccacaccc agcccctggg cgtgttcctg 660

ttccctccca agcccaagga caccctgatg atcagcagaa cccccgaggt gacctgcgtg 720

gtcgtggatg tgagccagga agatcccgaa gtgcagttca actggtacgt ggatggcgtg 780

gaagtgcaca acgccaagac caagcccaga gaagagcagt tcaactccac ctacagagtg 840

gtgagcgtgc tgaccgtgct gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 900

gtgtccaaca aaggcctgcc cagctccatc gagaagacca tcagcaaagc caaaggccag 960

cccagagaac cccaggtgta caccctgcct cccagccagg aagagatgac caagaaccag 1020

gtgtccctga cctgcctggt gaaaggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggaa 1080

agcaacggcc agcccgagaa caattacaag acaacccctc ccgtgctgga tagcgatggc 1140

agcttctttc tgtacagcag actgaccgtg gacaagagca gatggcagga aggcaacgtg 1200

ttcagctgca gcgtgatgca cgaagccctg cacaaccact acacccagaa gagcctgtcc 1260

ctgagcctgg gcaag 1275

<210> 38

<211> 1275

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> nucleotide sequence of modified IL-7(MGM) fused hyFc

<400> 38

atgttccacg tgagcttcag gtacatcttc ggcctgccac ccctgatcct ggtgctgctg 60

cctgtggcca gctccatggg gatggactgc gacatcgagg gaaaagacgg caagcagtac 120

gaaagcgtgc tgatggtgtc catcgaccag ctgctggatt ctatgaagga gattgggagt 180

aactgcctga acaatgagtt caacttcttc aaacggcaca tttgtgatgc caacaaggag 240

ggaatgttcc tgtttcgggc cgctagaaaa ctgaggcagt tcctgaagat gaacagcacc 300

ggagactttg atctgcatct gctgaaagtg tctgagggca ccacaatcct gctgaactgc 360

actgggcagg tgaaaggaag gaagcctgcc gctctgggag aggctcagcc aaccaagtca 420

ctggaggaaa acaaaagcct gaaggaacag aagaaactga atgacctgtg ctttctgaaa 480

cggctgctgc aggagatcaa aacatgttgg aacaagattc tgatgggcac aaaggaacac 540

cgcaatactg ggcggggcgg ggaggaaaag aaaaaggaga aggaaaagga ggaacaggag 600

gaaagagaga ctaagacccc agaatgtccc agccatactc agcccctggg ggtgttcctg 660

tttcccccta aacctaagga taccctgatg atcagcagga cacccgaggt gacctgcgtg 720

gtcgtggatg tgagccagga agatcccgaa gtgcagttca actggtacgt ggatggcgtg 780

gaagtgcaca acgccaagac caagcccaga gaagagcagt tcaactccac ctacagagtg 840

gtgagcgtgc tgaccgtgct gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 900

gtgtccaaca aaggcctgcc cagctccatc gagaagacca tcagcaaagc caaaggccag 960

cccagagaac cccaggtgta caccctgcct cccagccagg aagagatgac caagaaccag 1020

gtgtccctga cctgcctggt gaaaggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggaa 1080

agcaacggcc agcccgagaa caattacaag acaacccctc ccgtgctgga tagcgatggc 1140

agcttctttc tgtacagcag actgaccgtg gacaagagca gatggcagga aggcaacgtg 1200

ttcagctgca gcgtgatgca cgaagccctg cacaaccact acacccagaa gagcctgtcc 1260

ctgagcctgg gcaag 1275

<210> 39

<211> 1278

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> nucleotide sequence of modified IL-7(MMMM) fused hyFc

<400> 39

atgttccacg tgagcttcag atacatcttc ggcctgcccc ccctgatcct ggtgctgctg 60

cccgtggcca gcagcatgat gatgatggac tgcgacatcg agggcaagga cggcaagcag 120

tacgagagcg tgctgatggt gagcatcgac cagctgctgg acagcatgaa ggagatcggc 180

agcaactgcc tgaacaacga gttcaacttc ttcaagagac acatctgcga cgccaacaag 240

gagggcatgt tcctgttcag agccgccaga aagctgagac agttcctgaa gatgaacagc 300

accggcgact tcgacctgca cctgctgaag gtgagcgagg gcacaaccat cctgctgaac 360

tgcaccggcc aggtgaaggg cagaaagccc gccgccctgg gcgaggccca gcccaccaag 420

agcctggagg agaacaagag cctgaaggag cagaagaagc tgaacgacct gtgcttcctg 480

aagagactgc tgcaggagat caagacctgc tggaacaaga tcctgatggg caccaaggag 540

cacaggaaca caggcagagg cggcgaggag aagaagaagg agaaggagaa ggaggagcag 600

gaggaaagag agaccaagac ccccgagtgc cccagccaca cccagcccct gggcgtgttc 660

ctgttccctc ccaagcccaa ggacaccctg atgatcagca gaacccccga ggtgacctgc 720

gtggtcgtgg atgtgagcca ggaagatccc gaagtgcagt tcaactggta cgtggatggc 780

gtggaagtgc acaacgccaa gaccaagccc agagaagagc agttcaactc cacctacaga 840

gtggtgagcg tgctgaccgt gctgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 900

aaggtgtcca acaaaggcct gcccagctcc atcgagaaga ccatcagcaa agccaaaggc 960

cagcccagag aaccccaggt gtacaccctg cctcccagcc aggaagagat gaccaagaac 1020

caggtgtccc tgacctgcct ggtgaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1080

gaaagcaacg gccagcccga gaacaattac aagacaaccc ctcccgtgct ggatagcgat 1140

ggcagcttct ttctgtacag cagactgacc gtggacaaga gcagatggca ggaaggcaac 1200

gtgttcagct gcagcgtgat gcacgaagcc ctgcacaacc actacaccca gaagagcctg 1260

tccctgagcc tgggcaag 1278

<210> 40

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> oligopeptides conjugated with IL-7

<400> 40

Met Met Met Met

1

Claims

1.经修饰的白细胞介素-7，其具有以下结构:

A-IL-7

其中A是由1至10个氨基酸残基组成的寡肽，所述氨基酸残基由甲硫氨酸、甘氨酸及其组合组成，所述寡肽不是单个甲硫氨酸，

且

所述IL-7是白细胞介素-7或具有与其相似的活性的多肽。

2.根据权利要求1所述的经修饰的白细胞介素-7，其特征在于，所述IL-7具有选自SEQID NOS:1至6的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的经修饰的白细胞介素-7，其特征在于，所述A与IL-7的N端相连。

4.根据权利要求1所述的经修饰的白细胞介素-7，其特征在于，所述A具有选自以下任何序列之一：甘氨酸，甲硫氨酸-甲硫氨酸，甘氨酸-甘氨酸，甲硫氨酸-氨酸，甘氨酸-甲硫氨酸，甲硫氨酸-甲硫氨酸-甲硫氨酸，甲硫氨酸-甲硫氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甲硫氨酸，甘氨酸-甲硫氨酸-甲硫氨酸，甲硫氨酸-甘氨酸-甘氨酸，甘氨酸-甲硫氨酸-甘氨酸，甘氨酸-甘氨酸-甲硫氨酸和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸。

5.白细胞介素-7融合蛋白，包括以下结构域(a)、(b)和(c)：

(a)第一结构域，其包括白细胞介素-7或具有与其相似活性的多肽；

(B)第二结构域，其包括具有1至10个选自甲硫氨酸、甘氨酸或其组合的氨基酸残基的寡肽，所述寡肽不是单个甲硫氨酸；以及

(c)第三结构域，其延长白细胞介素-7融合蛋白的半衰期。

6.根据权利要求5所述的白细胞介素-7融合蛋白，其特征在于，所述第三结构域与第一结构域或第二结构域的N端或C端连接。

7.根据权利要求5所述的白细胞介素-7融合蛋白，其特征在于，所述第三结构域为选自以下的任一种：免疫球蛋白的Fc区或其部分、白蛋白、白蛋白结合多肽、Pro/Ala/Ser(PAS)、人绒毛膜促性腺激素β亚基C端肽(CTP)、聚乙二醇(PEG)、氨基酸长链非结构亲水序列(XTEN)、羟乙基淀粉(HES)、白蛋白结合小分子、及其组合。

8.根据权利要求5所述的白细胞介素-7融合蛋白，其特征在于，所述第三结构域包括经修饰的免疫球蛋白的Fc区。

9.根据权利要求8所述的白细胞介素-7融合蛋白，其特征在于，所述经修饰的免疫球蛋白选自IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1，IgA2，IgD，IgE及其组合。

10.根据权利要求8所述的白细胞介素-7融合蛋白，其特征在于，所述经修饰的免疫球蛋白的Fc区从N端到C端包括铰链区、CH2结构域和CH3结构域，

其中，所述铰链区包括人IgD铰链区，

所述CH2结构域包括人IgD和人IgG4的CH2结构域的氨基酸残基的一部分，以及

所述CH3结构域包括人IgG4 CH3结构域的氨基酸残基的一部分。

11.根据权利要求8所述的白细胞介素-7融合蛋白，其特征在于，所述经修饰的免疫球蛋白的Fc区由下式(I)表示：

式(I)

N’-(Z1)p-Y-Z2-Z3-Z4-C’

其中，N'是多肽的N端，而C'是多肽的C端；

所述p为0或1的整数；

所述Z1是具有在SEQ ID NO:7的第90至98位的氨基酸残基中，从第98位的氨基酸残基向N端的5至9个连续氨基酸残基的氨基酸序列；

所述Y是具有在SEQ ID NO：7的第99至162位氨基酸残基中，从第162位的氨基酸残基向N端的5至64个连续氨基酸残基的氨基酸序列；

所述Z2是具有在SEQ ID NO：7的第163至199位氨基酸残基中，从第163位的氨基酸残基向C端的4至37个连续氨基酸残基的氨基酸序列；

所述Z3是具有在SEQ ID NO：8的第115至220位的氨基酸残基中，从第220位的氨基酸残基向N端的71至106个连续氨基酸残基的氨基酸序列；以及

所述Z4是具有在SEQ ID NO：8的第221至327位氨基酸残基中，从第221位的氨基酸残基向C端的80至107个连续氨基酸残基的氨基酸序列。

12.根据权利要求5所述的经修饰的白细胞介素-7融合蛋白，其特征在于，所述第三结构域具有选自SEQ ID NOS:9至14的氨基酸序列。

13.编码根据权利要求1至12中任一项所述的经修饰的白细胞介素-7或白细胞介素-7融合蛋白的分离核酸分子。

14.根据权利要求13所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码具有选自SEQ IDNOS：15至25的氨基酸序列的多肽。

15.根据权利要求13所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括具有选自SEQ IDNOS：29至39的碱基序列的多肽。

16.表达载体，其包括根据权利要求13至15中任一项所述的核酸分子。

17.宿主细胞，其包括根据权利要求16所述的表达载体。

18.制备根据权利要求1至12中任一项所述的蛋白的方法，包括：

(a)培养由根据权利要求16所述的表达载体转化的细胞；和

(b)从步骤(a)获得的培养物或细胞中收集经修饰的白细胞介素-7或白细胞介素-7融合蛋白。

19.制备根据权利要求1至4中任一项所述的经修饰的白细胞介素-7的方法，包括将第二结构域连接至第一结构域的N端，所述第二结构域包括具有1至10个选自甲硫氨酸、甘氨酸或其组合的氨基酸残基的氨基酸序列，所述氨基酸序列不是单个甲硫氨酸，所述第一结构域具有白细胞介素-7的活性或其相似活性。

20.制备根据权利要求5至12中任一项所述的白细胞介素-7融合蛋白的方法，包括：

将第二结构域连接至第一结构域的N端，所述第二结构域包括具有1至10个选自甲硫氨酸、甘氨酸或其组合的氨基酸残基的氨基酸序列，所述氨基酸序列不是单个甲硫氨酸，所述第一结构域具有白细胞介素-7的活性或其相似活性；和

将第一结构域的C端连接至第三结构域；

其中，第三结构域是选自以下的任一种：免疫球蛋白的Fc区或其部分，白蛋白，白蛋白结合多肽，PAS，人绒毛膜促性腺激素β亚基的CTP，PEG，XTEN，HES，白蛋白结合小分子及其组合。

21.制备根据权利要求1至4中任一项所述的经修饰的白细胞介素-7的方法，包括：

(a)通过将编码多肽的多核苷酸连接至编码第一结构域的多核苷酸的N端来制备连接的多核苷酸，其中所述多肽具有第二结构域的氨基酸序列，该第二结构域的氨基酸序列包括具有1至10个选自甲硫氨酸、甘氨酸或其组合的氨基酸残基的氨基酸序列，所述氨基酸序列不是单个甲硫氨酸，所述第一结构域具有白细胞介素-7的活性或其相似活性；和

(b)通过表达所述连接的多核苷酸来收集经修饰的白细胞介素-7。

22.制备根据权利要求5至12中任一项所述的白细胞介素-7融合蛋白的方法，包括：

(a)通过将编码多肽的多核苷酸和编码第三结构域的多核苷酸，分别连接到编码第一结构域的多核苷酸的N端和C端，来制备连接的多核苷酸，所述多肽具有第二结构域的氨基酸序列，该第二结构域的氨基酸序列包括具有1至10个选自甲硫氨酸、甘氨酸或其组合的氨基酸残基的氨基酸序列，所述氨基酸序列不是单个甲硫氨酸，所述第一结构域具有白细胞介素-7的活性或其相似活性；和

(b)通过表达所述连接的多核苷酸来收集白细胞介素-7，

其中，第三结构域是选自以下的任一种：免疫球蛋白的Fc区或其部分、白蛋白、白蛋白结合多肽、PAS、人绒毛膜促性腺激素β亚基的CTP、PEG、XTEN，HES、白蛋白结合小分子及其组合。

23.用于预防或治疗疾病的药物组合物，其包括根据权利要求1至12任一项所述的经修饰的白细胞介素-7或白细胞介素-7融合蛋白。

24.根据权利要求23所述的药物组合物，其特征在于，其进一步包括药学上可接受的载体。

25.根据权利要求23所述的药物组合物，其特征在于，所述疾病选自癌症、流感、乙型肝炎、丙型肝炎、淋巴细胞减少症(淋巴球减少症)和病毒感染。

26.根据权利要求1至12中任一项所述的经修饰的白细胞介素-7或白细胞介素-7融合蛋白在制备用于预防或治疗疾病的药物上的用途。

27.根据权利要求26所述的用途，其特征在于，所述疾病选自头颈癌、子宫颈癌、流感、乙型肝炎、丙型肝炎和病毒感染。