CN101942020A - 链亲和素/白细胞介素7融合蛋白 - Google Patents

链亲和素/白细胞介素7融合蛋白 Download PDF

Info

Publication number
CN101942020A
CN101942020A CN2010100033721A CN201010003372A CN101942020A CN 101942020 A CN101942020 A CN 101942020A CN 2010100033721 A CN2010100033721 A CN 2010100033721A CN 201010003372 A CN201010003372 A CN 201010003372A CN 101942020 A CN101942020 A CN 101942020A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gly
ser
leu
ala
thr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2010100033721A
Other languages
English (en)
Inventor
高基民
张振
许晓玲
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wenzhou Medical College
Original Assignee
Wenzhou Medical College
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wenzhou Medical College filed Critical Wenzhou Medical College
Priority to CN2010100033721A priority Critical patent/CN101942020A/zh
Publication of CN101942020A publication Critical patent/CN101942020A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Landscapes

  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明提供了一种融合蛋白，该蛋白由接头肽连接一链亲和素和一白细胞介素-7构成，其中所述的接头肽的氨基酸序列为Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly GlySer。本发明融合蛋白同时具有链亲和素和白细胞介素-7的活性，可通过链亲和素与生物素的强力结合将白细胞介素-7锚定在生物素化的肿瘤细胞表面，且能在γ射线灭活肿瘤细胞表面稳定存在，并仍保持白细胞介素-7的活性。经本发明融合蛋白表面修饰的肿瘤疫苗具有预防和治疗肿瘤的作用，可用于制备预防和治疗肿瘤的疫苗。

Description

链亲和素/白细胞介素7融合蛋白
技术领域
本发明涉及基因工程和蛋白质工程领域，具体涉及来源于动物的多肽，特别是白细胞介素-7。
背景技术
白细胞介素-7(Interleukin-7，IL-7)是基质细胞产生的、调节淋巴细胞和巨噬细胞分化、增殖和活化的细胞因子。主要作用是促进前B细胞的生长，其不仅是T、B淋巴细胞分化成熟过程中的重要生长因子，还是多能干细胞和髓系前体细胞的移动因子，同时，IL-7还能促进T细胞功能，诱导单核巨噬细胞表达多种细胞因子。因此，IL-7具有抗肿瘤和增强机体免疫功能等作用。IL-7基因用来修饰肿瘤细胞，制备肿瘤细胞疫苗，以增强肿瘤抗原的免疫原性。通过原位基因转染(或转导)在肿瘤病灶局部实现IL-7持续有效表达的治疗策略，已在表浅膀胱癌的临床前研究中显示出诱人的前景。但是，用基因修饰法制备肿瘤细胞疫苗存在如下固有缺陷：修饰效率一般都较低(尤其是原位基因转染或转导)，并取决于肿瘤细胞类型；因影响因素较多，致使治疗基因的蛋白质表达产物的有效浓度在局部难于达到并较长时间地维持，从而实际抗肿瘤的临床效果非常有限；因个体差异和获得肿瘤标本时肿瘤细胞的成活状态不一致，往往有些病人因无法提供成活状态较好的肿瘤细胞，最终不能制成自体肿瘤细胞疫苗；往往有潜在的病毒载体安全性问题(所谓“遗传毒性”)和免疫原性问题(反复使用同一病毒载体会影响导入基因的表达效率)；很难同时高效表达多个具有协同作用的免疫刺激因子，并对它们的表达量进行精确控制。此外，基因修饰的自体肿瘤细胞疫苗制备比较费时，不易大规模开展和广泛使用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种可以对肿瘤细胞进行快速表面修饰并能够永久地锚定在肿瘤细胞表面的新型白细胞介素-7。
本发明解决上述技术问题的技术方案是：
一种融合蛋白，该蛋白由接头肽连接一链亲和素和一白细胞介素-7构成，其中所述的接头肽的氨基酸序列为Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser。
本发明融合蛋白中的链亲和素位于接头肽的N端或C端；其中链亲和素位于接头肽的N端的融合蛋白(如SEQ NO.2)的活性和链亲和素位于接头肽的C端的融合蛋白(如SEQ NO.1)相当。
本发明融合蛋白可通过将链亲和素基因、白细胞介素-7基因以及连接所述的链亲和素和白细胞介素-7的接头多核苷酸通过基因重组、转化构建工程菌表达获得，其中基因重组和转化的方法均为本领域普通技术人员所熟识的技术。
为了便于融合蛋白的分离纯化，本发明所述的融合蛋白的链亲和素部分的末端还可以连接有纯化标签，如本发明融合蛋白SEQ NO.3的链亲和素的C端连有组氨酸标签、本发明融合蛋白SEQ NO.4的链亲和素的N端连有组氨酸标签。
本发明还提供一种编码本发明融合蛋白的多核苷酸，该多核苷酸由成熟链亲和素cDNA、成熟白细胞介素-7cDNA通过TCG AGC GGG GGC AGC GGG GGC GGA GGC AGC GGCGGG GGC GGA TCC连接而成；该多核苷酸中成熟链亲和素cDNA的末端还可以连接有CATCAT CAC CAT CAC CAT。
将所述的编码本发明融合蛋白的多核苷酸通过基因重组插入到原核表达载体中，然后转化大肠杆菌可获得高效表达本发明融合蛋白的工程菌；所述的原核表达载体可以是pET24a或pET21a，大肠杆菌为BL21(DE3)。
本发明融合蛋白在上述工程菌中主要以包涵体的形式存在，从包涵体中分离纯化蛋白并复性处理后，即可获得本发明融合蛋白。
本发明融合蛋白采用富含甘氨酸和丝氨酸的链接肽连接白细胞介素-7和链亲和素，此15肽非常灵活，有助于融合蛋白中各单元蛋白质分子的独立折叠，从而保存各自的生物活性，使融合蛋白具有链亲和素和白细胞介素-7的双重活性，可通过链亲和素与生物素的强力结合将白细胞介素-7锚定在生物素化的肿瘤细胞表面，且能在γ射线灭活肿瘤细胞表面稳定存在，并仍保持白细胞介素-7的活性。
经本发明融合蛋白表面修饰的肿瘤疫苗具有预防和治疗肿瘤的作用，本发明所述的肿瘤疫苗是将本发明融合蛋白锚定在生物素化的肿瘤细胞表面获得的。另外，融合蛋白可以直接锚定于生物素化的肿瘤细胞表面，直接发挥抗肿瘤作用。
本发明所述的肿瘤疫苗的制备充分利用了蛋白质的氨基(即-NH2)易生物素化以及生物素与链亲和素高效而强有力几乎不可逆的结合这两个特性，先用生物素化试剂将生物素化学交联到欲修饰的肿瘤细胞表面，然后本发明融合蛋白借助链亲和素与生物素的特异结合将白细胞介素-7迅速永久地锚定在肿瘤细胞表面，从而使白细胞介素-7在局部达到持续有效的治疗浓度；再者，由于一个链亲和素蛋白可结合四个生物素，因此本发明融合蛋白锚定到肿瘤细胞的量是可以精确控制的。
附图说明
图1是IL 7-L-SA-6His-pET24重组质粒的结构图。
图2是6His-SA-L-IL7-pET24重组质粒的结构图。
图3是融合蛋白IL7-L-SA-6His的SDS-PAGE电泳图，其中1是分子量标准，2是工程菌诱导前，3是工程菌诱导后；4是包涵体，5是Ni-NTA柱层析后；6是2-Iminobiotin亲和柱层析后。
图4是用抗IL-7单克隆抗体及荧光标记的二抗经流式细胞仪对锚定在生物素化的B16.F10表面上本发明融合蛋白进行检测的结果，左峰为未修饰的细胞(阴性对照)，而右峰为本发明融合蛋白锚定修饰的细胞。
图5是用ConA刺激小鼠胸腺细胞MTT法对锚定在生物素化的B16.F10表面上本发明融合蛋白的IL-7进行生物活性测定的结果，以锚定在生物素化的B16.F10表面上SA-GFP为阴性对照。
图6是接种本发明肿瘤疫苗后的预防肿瘤小鼠模型的小鼠存活情况曲线图，以SA-GFP修饰的B6.F10肿瘤细胞疫苗加单独IL7为实验对照，PBS为空白对照。
图7是接种本发明融合蛋白治疗小鼠表浅膀胱癌模型的小鼠存活情况曲线图，以SA-GFP融合蛋白及单独IL7为实验对照，PBS为空白对照。
下面将通过实施例进一步说明本发明以及本发明具有的技术效果。
具体实施方式
下述实施例和实验所用的材料及设备如下：
细胞株、菌株与质粒：B16.F10(鼠黑色素瘤细胞株)；菌株Streptomyces avidinii(亲和素链霉菌，ATCC)，DH5a和BL21(DE3)；原核表达质粒pET24a(Kanar，Novagen)。
主要生化试剂及材料：DNeasy组织试剂盒和质粒DNA的制备试剂盒(Qiagen)，寡核苷酸的合成(Sigma)，Trizol，SuperScript II逆转录酶，Platinum Pfx DNA聚合酶和T4DNA连接酶(Invitrogen)；IL-7标准品(R & D Systems)，琼脂糖和SDS-PAGE(Biorad)；2-Iminobiotin(Sigma)和Ni-NTA(Qiagen)填料；Sulfo-NHS-LC-Biotin(Pierce)和抗IL-7单克隆抗体(BD Biosciences Pharmingen)。
DNA片段的连接、转化及转化子筛选，限制性内切酶分析，SDS-聚丙烯酰胺凝胶点泳等常规方法均参照文献(Sambrook J，et al.Molecular Cloning-A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，New York，2nd edition，1989)或厂家提供的产品说明书；DNA序列分析在大连宝生物工程公司的DNA测序服务中心完成。
例1融合蛋白IL7-L-SA-6His的制备
1、用DNeasy组织试剂盒从亲和素链霉菌抽提出细菌的基因组DNA，然后用其作为模板，
通过Platinum pfx DNA聚合酶进行PCR制备成熟链亲和素cDNA。
引物：5’GGAATTCTCAAGCGGGGGCAGCGGGGGCGGAGGCAGCGGCGGGGGCGGATCCGCCGACCCCTCCAAGGACTCGAAGGCC 3’(78nt)和
5’GTGGTGCTCGAGCTGCTGAACGGCGTCGAGCGGGTTGCC 3’(39nt)。
反应条件：变性94℃，2min，25个循环(94℃，15s→60℃，15s→68℃，30s)，最后68℃，5min。
2、用Trizol抽提起PHA-活化的外周血淋巴细胞的总RNA，并以其作为模板，进行RT-PCR制备成熟IL-7cDNA。
引物：5’CGGGATCCCATATGGATTGTGATATTGAAGGTAAAG 3’(36nt)和
5’CGGAATTCGTGTTCTTTAGTGCCCATC3’(27nt)
反应条件：变性94℃，2min，25个循环(94℃，15s→60℃，15s→68℃，30s)，最后68℃，5min。
3、构建IL7-L-SA-6His-pET21重组质粒
制备的IL-7cDNA(不含终止码，两端分别含NdeI和EcoRI限制性内切酶位点)和SA cDNA(不含终止码，两端分别含EcoRI和XhoI限制性内切酶位点)，将上述IL-7和SA基因片段克隆于pET-21a载体中，获得IL7-L-SA-6His-pET21重组表达质粒(结构图如图1所示)。其中L为富含甘氨酸、丝氨酸的连接肽(15肽)。重组表达质粒经DNA序列分析鉴定，验证其正确无误。
4、构建IL7-L-SA-6His-pET21/BL21(DE3)工程菌
IL7-L-SA-6His-pET21重组表达质粒转化后BL21(DE3)感受态细胞后，用含氨苄霉素的LB平皿筛选。挑取转化平皿上的单菌落接种于加有氨苄霉素(50μg/ml)的LB培养基中。经37℃摇床培养扩增至吸光度A600为0.4～0.5时，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG，37℃诱导表达4h，离心(8000g×10min)收获菌体，将细胞破碎后用12％的SDS-PAGE检测分析融合蛋白的表达情况。
5、融合蛋白IL7-L-SA-6His的表达
融合蛋白IL7-L-SA-6His在菌体中主要以包涵体的形式存在，其表达量达20～30％。
6、从包涵体中获得融合蛋白IL7-L-SA-6His
a.制备包涵体：5克菌体悬于100ml 1xPBS中，冰浴中超声(电流270mA)，30秒×10次(每次间隔30秒)；接着于4℃离心10分钟(8000g)，将沉淀悬浮于100ml 1xPBS(内含4mol/L尿素，0.5％Triton X-100，20mmol/L EDTA)中进行漂洗，随后离心(1000g×10分钟)收集沉淀；漂洗两次后，溶于100mmol/L磷酸钠缓冲液，8mol/L尿素(pH 8.0)中，
15000g×15分钟，取上清液。
b.Ni-NTA柱层析：将步骤a得到的上清液上样于Ni-NTA柱(2.6×5cm)，用平衡液(100mmol/L磷酸钠缓冲液，8mol/L尿素，pH8.0)进行冲洗至样品A280恢复至基线；然后用洗脱液(100mmol/L磷酸钠缓冲液，8mol/L尿素，pH4.5)进行洗脱，洗脱液经SDS-PAGE鉴定，收集融合蛋白质峰(融合蛋白IL7-L-SA-6His的分子量为36.3KD)。
c.透析复性：将Ni-NTA柱层析纯化获得的IL7-L-SA-6His融合蛋白调至OD280＝0.2，在大于20倍体积的透析液(100mmol/L NaHCO3，1.0mol/L尿素，1mmol/L还原型谷胱苷肽，0.2mmol/L氧化型谷胱苷肽，pH 9.0)中4℃透析复性12小时；然后在50mmol/LNaHCO3，500mmol/LNaCl，pH 11中继续透析6小时；离心除去不溶物，收集上清。
d.2-Iminobiotin亲和柱层析：用平衡液(50mmol/L NaHCO3，500mmol/L NaCl，pH 11)洗脱5个柱体积后(柱体积0.5×2cm)，将收集的已复性融合蛋白质液上亲和层析柱，并用平衡液洗脱至样品A280恢复至基线；然后，用50mmol/L NaAc，pH4.0洗脱，分管收集各洗脱峰，并用10x平衡液(500mmol/LNaHCO3，5mol/LNaCl，pH 11)将收集的融合蛋白质液调至pH8.0，并过滤除菌分装，储存于-20℃。
所得融合蛋白IL7-L-SA-6His用SDS-PAGE鉴定，结果如图3所示。
7、利用ConA刺激小鼠胸腺细胞对IL-7的活性进行测定，测得的IL-7活性为1×106U/mg。
例2融合蛋白6His-SA-L-IL7的制备
1、制备成熟链亲和素cDNA：方法与例1同。
引物：
5’GGAATTCCATATGCATCATCACCATCACCATGAGGCCGGCATCACCGGCACCTGG3’(55nt)和
5’GGAATTCGGCGGATCCGCCCCCGCCGCTGCCTCCGCCCCCGCTGCCCCCGCTCGTCTGCTGAACGGCGTCGAGCGGGTTGCC 3’(82nt)。
2、制备成熟IL-7cDNA：方法与例1同。
引物：
5’CGGGATCCGATTGTGATATTGAAGGT 3’(26nt)
和5’CGCTCGAGTCAGTGTTCTTTAGTGCC 3’(26nt)。
3、构建6His-SA-L-IL7-pET24重组质粒
制备的SA cDNA(不含终止码，两端分别含NdeI和BamHI限制性内切酶位点)和IL-7cDNA(两端分别含BamHI和XhoI限制性内切酶位点)，将上述SA和IL-7基因片段克隆于pET-24a
载体中，获得6His-SA-L-IL7-pET24重组表达质粒(结构图如图2所示)。其中L为富含甘氨酸、丝氨酸的连接肽。重组表达质粒经DNA序列分析鉴定，验证其正确无误。
4、构建6His-SA-L-IL7-pET24/BL21(DE3)工程菌：方法与例1同。
5、融合蛋白6His-SA-L-IL7的表达
融合蛋白6His-SA-L-IL7在菌体中主要以包涵体的形式存在，6His-SA-L-IL7融合蛋白的分子量为34.5KD，其表达量达20～30％。
6、从包涵体中获得融合蛋白6His-SA-L-IL7：方法与例1同。
7、利用ConA刺激小鼠胸腺细胞对IL-7的活性进行测定，测得的IL-7活性为1×106U/mg，与IL7-L-SA-6His融合蛋白相当。
例3IL7-L-SA-6His或6His-SA-L-IL7融合蛋白修饰的肿瘤疫苗的制备
将107个B16.F10细胞悬浮在1ml 1×PBS中，加入0.5mg Sulfo-NHS-LC-Biotin并混匀后，室温下作用30分钟；用1×PBS洗涤细胞3次后，每106个B16.F10细胞加入200ngIL7-L-SA-6His或6His-SA-L-IL7融合蛋白，冰上作用30分钟；1×PBS洗涤细胞1次后，然后用γ射线灭活(20000rad)即可。
例4本发明融合蛋白对肿瘤细胞的修饰效果及其稳定性检测
用抗IL-7单克隆抗体及荧光标记的二抗经流式细胞仪对锚定在生物素化的B16.F10表面上的IL7-L-SA-6His或6His-SA-L-IL7融合蛋白进行检测，结果见图4，几乎100％的肿瘤细胞被修饰，且肿瘤细胞表面有大量的IL-7。对锚定在肿瘤细胞表面的IL7-L-SA-6His融合蛋白的稳定性经流式细胞仪进行分析表明，在一周内这些锚定的融合蛋白在细胞表面的数量无显著下降。
例5对锚定在生物素化的B16.F10表面上的本发明融合蛋白进行IL-7生物活性的测定
首先将表面已锚定了IL7-L-SA-6His或6His-SA-L-IL7融合蛋白的106个B16.F10经超声破碎，离心收集其不溶的膜性成分；然后将其悬浮于100μl完全培养基中，用ConA刺激小鼠胸腺细胞MTT法对其中的IL-7进行生物活性测定，结果如图5所示，活化的淋巴细胞的生长增殖依赖于已锚定修饰细胞的不溶膜性成分的剂量，表明IL7-L-SA-6His或6His-SA-L-IL7融合蛋白锚定在细胞表面后仍然能保持IL-7的生物活性。
例6本发明融合蛋白修饰的B6.F10肿瘤细胞疫苗预防肿瘤的效果
(1)材料：
本发明肿瘤疫苗：制备方法见实施例3；SA-GFP(即绿色荧光蛋白和链亲和素的融合蛋白)修饰的、γ射线灭活(20000rad)的B6.F10肿瘤细胞：作为实验的阴性对照。
(2)方法：
分别将106个SA-GFP修饰的、γ射线灭活(20000rad)的B6.F10肿瘤细胞以及本发明肿瘤疫苗接种于C57BL/6小鼠左肋腹部的皮内，14天后加强一次；7天后，将105未经任何处理的B6.F10肿瘤细胞接种于小鼠右肋腹部的皮下，然后观察肿瘤的生长情况和小鼠在40天内的成活情况
(3)结果：
有20％的免疫小鼠获得100％的保护(即无肿瘤生长)，阴性对照组全部有肿瘤生长(图6)。同时，本发明肿瘤疫苗的预防接种组的生存数及生存期显著高于GFP修饰的阴性对照组(图7)。
例7本发明融合蛋白治疗小鼠表浅膀胱癌的效果。
(1)材料：见实施例6。
(2)方法
制备小鼠表浅膀胱癌模型，攻击所用MB49细胞数量为1×106，攻击后第三天，开始治疗。腹腔注射麻醉小鼠，膀胱插管，灌注100ul 1mg/ml活化生物素，保留30分钟，然后应用PBS冲洗3遍，灌注0.15mg/ml的SA-IL7治疗，同时应用SA-GFP或IL7为实验对照，PBS为阴性对照，保留1小时。治疗每周2次，共治疗3周。然后观察肿瘤的生长情况和小鼠的存活情况。
(3)结果
如图7所示，本发明融合蛋白治疗组的生存数及生存期显著高于阴性对照组。
SEQUENCE LISTING
<110>温州医学院
<120>链亲和素/白细胞介素7融合蛋白
<160>4
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>327
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<222>(1)..(153)
<223>人成熟IL-7
<220>
<221>DOMAIN
<222>(156)..(170)
<223>甘氨酸和丝氨酸的链接肽(L)，此15肽非常灵活，有助于融合蛋白中各单元蛋白质分子的独立折叠，从而保存各自的生物活性，最终提高融合蛋白的双重活性。
<220>
<221>CHAIN
<222>(180)..(327)
<223>链亲和素(SA)
<400>1
Met Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val
1               5                   10                  15
Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly
            20                  25                  30
Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys
        35                  40                  45
Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu
    50                  55                  60
Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu
65                  70                  75                  80
Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln
                85                  90                  95
Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys
            100                 105                 110
Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp
        115                 120                 125
Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn
    130                 135                 140
Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His Glu Phe Ser Ser Gly Gly Ser
145                 150                 155                 160
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Trp Pro His His His
                165                 170                 175
His His His Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly
            180                 185                 190
Ser Thr Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr
        195                 200                 205
Tyr Glu Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly
    210                 215                 220
Arg Tyr Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly
225                 230                 235                 240
Trp Thr Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr
                245                 250                 255
Thr Trp Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr
            260                 265                 270
Gln Trp Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser
        275                 280                 285
Thr Leu Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala
    290                 295                 300
Ser Ile Asp Ala Ala Lys Lys Ala Gly Val Asn Asn Gly Asn Pro Leu
305                 310                 315                 320
Asp Ala Val Gln Gln Ile Glu
                325
<210>2
<211>314
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<222>(1)..(147)
<223>链亲和素
<220>
<221>DOMAIN
<222>(148)..(162)
<223>连接肽，并且其3’端含有BamHI的酶切位点。
<220>
<221>CHAIN
<222>(163)..(314)
<223>人成熟IL7。
<400>2
Met Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr
1               5                   10                  15
Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu
            20                  25                  30
Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr
        35                  40                  45
Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr
    50                  55                  60
Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp
65                  70                  75                  80
Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp
                85                  90                  95
Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu
            100                 105                 110
Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser Ile
        115                 120                 125
Asp Ala Ala Lys Lys Ala Gly Val Asn Asn Gly Asn Pro Leu Asp Ala
    130                 135                 140
Val Gln Gln Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
145                 150                 155                 160
Gly Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser
                165                 170                 175
Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile
            180                 185                 190
Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile
        195                 200                 205
Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys
    210                 215                 220
Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His
225                 230                 235                 240
Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly
                245                 250                 255
Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr
            260                 265                 270
Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn
        275                 280                 285
Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp
    290                 295                 300
Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
305                 310
<210>3
<211>333
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<222>(1)..(153)
<223>人成熟IL-7的cDNA
<220>
<221>DOMAIN
<222>(156)..(170)
<223>富含甘氨酸和丝氨酸的链接肽(L)，此15肽非常灵活，有助于融合蛋白中各单元蛋白质分子的独立折叠，从而保存各自的生物活性，最终提高融合蛋白的双重活性。
<220>
<221>CHAIN
<222>(180)..(327)
<223>链亲和素。
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(328)..(333)
<223>组氨酸标签
<400>3
Met Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val
1               5                   10                  15
Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly
            20                  25                  30
Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys
        35                  40                  45
Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu
    50                  55                  60
Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu
65                  70                  75                  80
Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln
                85                  90                  95
Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys
            100                 105                 110
Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp
        115                 120                 125
Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn
    130                 135                 140
Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His Glu Phe Ser Ser Gly Gly Ser
145                 150                 155                 160
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Trp Pro His His His
                165                 170                 175
His His His Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly
            180                 185                 190
Ser Thr Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr
        195                 200                 205
Tyr Glu Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly
    210                 215                 220
Arg Tyr Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly
225                 230                 235                 240
Trp Thr Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr
                245                 250                 255
Thr Trp Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr
            260                 265                 270
Gln Trp Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser
        275                 280                 285
Thr Leu Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala
    290                 295                 300
Ser Ile Asp Ala Ala Lys Lys Ala Gly Val Asn Asn Gly Asn Pro Leu
305                 310                 315                 320
Asp Ala Val Gln Gln Ile Glu His His His His His His
                325                 330
<210>4
<211>320
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>人工序列
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(2)..(7)
<223>组氨酸标签
<220>
<221>CHAIN
<222>(8)..(153)
<223>链亲和素
<220>
<221>DOMAIN
<222>(154)..(168)
<223>连接肽，并且其3’端含有BamHI的酶切位点。
<220>
<221>CHAIN
<222>(169)..(320)
<223>人成熟IL7
<400>4
Met His His His His His His Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr
1               5                   10                  15
Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala
            20                  25                  30
Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr
        35                  40                  45
Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly
    50                  55                  60
Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala
65                  707                  5                  80
His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala
                85                  90                  95
Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn
            100                 105                 110
Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys
        115                 120                 125
Pro Ser Ala Ala Ser Ile Asp Ala Ala Lys Lys Ala Gly Val Asn Asn
    130                 135                 140
Gly Asn Pro Leu Asp Ala Val Gln Gln Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly
145                 150                 155                 160
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp
                165                 170                 175
Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu
            180                 185                 190
Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn
        195                 200                 205
Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu
    210                 215                 220
Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr
225                 230                 235                 240
Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile
                245                 250                 255
Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu
            260                 265                 270
Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys
        275                 280                 285
Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln
    290                 295                 300
Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
305                 310                 315                 320

Claims (10)

1.一种融合蛋白，该蛋白由接头肽连接一链亲和素和一白细胞介素-7构成，其中所述的接头肽的氨基酸序列为Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser。
2.根据权利要求1所述的一种融合蛋白，其特征在于所述的链亲和素位于接头肽的N端。
3.根据权利要求2所述的一种融合蛋白，其氨基酸序列为SEQ.NO 2。
4.根据权利要求1所述的一种融合蛋白，其特征在于所述的链亲和素位于接头肽的C端。
5.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述的的链亲和素部分的末端连接有纯化标签。
6.一种基因，该基因编码权利要求1、2、3或4融合蛋白。
7.一种表达载体，该表达载体含有权利要求5所述的基因。
8.一种工程菌，该工程菌转化了权利要求6所述的表达载体。
9.权利要求1、2、3或4所述的融合蛋白在制备肿瘤疫苗中的应用。
10.一种肿瘤疫苗，该肿瘤疫苗是将权利要求1、2、3或4所述的融合蛋白锚定到经过生物素化的肿瘤细胞的表面获得的。
CN2010100033721A 2010-01-16 2010-01-16 链亲和素/白细胞介素7融合蛋白 Pending CN101942020A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2010100033721A CN101942020A (zh) 2010-01-16 2010-01-16 链亲和素/白细胞介素7融合蛋白

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2010100033721A CN101942020A (zh) 2010-01-16 2010-01-16 链亲和素/白细胞介素7融合蛋白

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101942020A true CN101942020A (zh) 2011-01-12

Family

ID=43434244

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2010100033721A Pending CN101942020A (zh) 2010-01-16 2010-01-16 链亲和素/白细胞介素7融合蛋白

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN101942020A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102180972A (zh) * 2011-03-09 2011-09-14 温州医学院 用于结核杆菌培养滤液蛋白10(cfp-10)定量检测的标准品研制
JP2021052772A (ja) * 2015-06-11 2021-04-08 ジェネクシン・インコーポレイテッドＧｅｎｅｘｉｎｅ， Ｉｎｃ． 改変されたインターロイキン−７タンパク質およびその使用

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102180972A (zh) * 2011-03-09 2011-09-14 温州医学院 用于结核杆菌培养滤液蛋白10(cfp-10)定量检测的标准品研制
JP2021052772A (ja) * 2015-06-11 2021-04-08 ジェネクシン・インコーポレイテッドＧｅｎｅｘｉｎｅ， Ｉｎｃ． 改変されたインターロイキン−７タンパク質およびその使用
JP7087047B2 (ja) 2015-06-11 2022-06-20 ジェネクシン・インコーポレイテッド 改変されたインターロイキン－７タンパク質およびその使用
JP2022130427A (ja) * 2015-06-11 2022-09-06 ジェネクシン・インコーポレイテッド 改変されたインターロイキン－７タンパク質およびその使用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101319247B (zh) Il-2选择性激动剂和拮抗剂
CN101321781A (zh) 一种核苷酸疫苗
CN104736553A (zh) 细胞穿透肽
MX2010014078A (es) Composiciones y metodos para inmunogenecidad mejorada de somatostatina.
CN104220080A (zh) 用于加强cd4+t细胞应答的经修饰表位
CN103980354A (zh) 真菌免疫调节蛋白FIP-ppl及其基因
CN105175527A (zh) 一种乳腺癌特异性的热休克蛋白复合物及其应用
WO2017177907A1 (zh) 抗免疫检查点pd-l1和pd-l2肿瘤疫苗
CN103626877A (zh) 含ny-eso-1的融合蛋白、制备方法及应用
CN101942020A (zh) 链亲和素/白细胞介素7融合蛋白
KR20220052987A (ko) Ebv 유래 항원에 특이적인 tcr 작제물
CN101698852A (zh) 具有cd137l功能的蛋白或多肽及其基因和应用
CN101492508A (zh) 链亲和素/白细胞介素15融合蛋白
CN101981187A (zh) MHC Ⅱ类分子提呈的存活蛋白(Survivin)的部分肽及其利用方法
CN111529700A (zh) 一种多房棘球蚴亮氨酰胺肽酶亚单位疫苗lap及其制备方法与应用
CN1824775A (zh) 重组人血管抑素k1－3的制备工艺及其制品在肿瘤治疗药物中的应用
JP2008526686A (ja) インターロイキン−２の中和能を有する免疫治療用製剤
JP2009520472A (ja) 腫瘍抗原由来最適化潜在性ペプチドで構成される免疫原性ポリペプチド及びその使用
CN101899117A (zh) 链亲和素/白细胞介素21融合蛋白
CN101148477A (zh) 链亲和素-白细胞介素2融合蛋白
CN1727362B (zh) 癌胚抗原阳性肿瘤治疗性疫苗的制备及应用
CN101148478A (zh) 链亲和素-肿瘤坏死因子α融合蛋白
WO2017177908A1 (zh) Pd-l1和pd-l2重组蛋白及其用途
CN104292341A (zh) 一种凝血八因子融合蛋白及其制备方法和用途
CN1908015B (zh) 能抑制her2高表达肿瘤细胞增殖的稳定的小分子多肽

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20110112