CN101981187A - MHC Ⅱ类分子提呈的存活蛋白(Survivin)的部分肽及其利用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供新的肿瘤抗原、和在利用该肿瘤抗原治疗恶性肿瘤的方法中有用的新的治疗剂以及能够用于该治疗剂的肿瘤抗原。本发明提供新的肿瘤抗原和其利用法，所述肿瘤抗原具有诱导作为对存活蛋白特异性的CD4阳性T细胞的Th1细胞的表位。本发明为一种多肽，其由序列号17所示的氨基酸序列等构成，且具有使对存活蛋白特异性的Th细胞产生细胞因子的活性。本发明的肽具有下述活性：将其与抗原提呈细胞和CD4阳性T细胞一起孵育，从而诱导对存活蛋白特异性的Th细胞，此外，使该Sur/Th细胞产生细胞因子。

Description

MHC Ⅱ类分子提呈的存活蛋白(Survivin)的部分肽及其利用方法
技术领域
本发明涉及能够用于癌免疫疗法的抗原性多肽、和含有该多肽的恶性肿瘤治疗剂。
背景技术
作为难以医治的疾病-癌症(恶性肿瘤)的治疗方法之一，可列举利用患者个体所具有的免疫系统使癌细胞萎缩的、所谓癌免疫疗法。该方法的重点在于，如何使免疫系统识别癌细胞并将其作为异物、诱导出对癌细胞具有攻击性的免疫细胞。
参与抗肿瘤免疫的重要免疫细胞包括表达细胞表面蛋白CD8的细胞毒性性细胞(CD8阳性T细胞)、表达细胞表面蛋白CD4的T细胞(CD4阳性T细胞)。CD8阳性T细胞被活化时，将提呈与HLAI类分子结合的抗原的细胞溶解。CD4阳性T细胞为分泌细胞因子的Th细胞，被通过HLAII类分子提呈抗原的巨噬细胞和/或树突状细胞等活化，对诱导和维持CD8阳性T细胞发挥辅助功能。
此外，已知Th细胞根据所分泌的细胞因子的种类而分成Th1细胞(产生IFN-γ等)、Th2细胞(产生IL-4等)和Th0细胞(产生细胞因子能力低或同时产生IFN-γ、IL-4等)，各细胞的作用正不断地得到阐明。此外，CD4阳性T细胞通过针对MHC II类分子阴性肿瘤(MHC II类-肿瘤)的间接机制、如介导巨噬细胞的活化，或者通过针对MHC II类阳性肿瘤的直接机制，从而也能够具有效应功能。
迄今为止，人的癌免疫治疗中的T细胞研究主要聚焦于CD8阳性HLAI类限制性CTL应答(CD8+HLA class I restricted CTL response)的鉴定和诱导(专利文献1)。CD4阳性T细胞方面，报道了癌抗原之一的酪氨酸酶及其对CD4阳性T细胞的表位的鉴定以及几个表位(专利文献2)，但其数量明显少于CD8阳性HLA I类限制性肽的报告例。
此外，已经报道的酪氨酸酶在黑素细胞系列的正常细胞和肿瘤细胞中表达，是与被视为CD4阳性黑素瘤反应性T细胞的特异性靶标的MHC II类分子结合的唯一黑素瘤缔合性组织特异性抗原(非专利文献1)。然而，酪氨酸酶为仅在有限类型的肿瘤中表达的抗原，很难称其为癌免疫治疗中有希望的癌抗原。
最近，报道了一种基因，其编码被称为存活蛋白(Survivin)的、被CD8阳性T细胞识别的肿瘤特异性抗原(非专利文献2)。存活蛋白被鉴定为具有抑制凋亡作用的物质，是共由142个氨基酸残基构成的蛋白质。据报道，其显著特征为，存活蛋白在正常组织中限于胎儿组织、成人中的胸腺和精巢等组织表达，在肿瘤组织尤其是癌变的肺、结肠、乳腺、脾、前列腺和淋巴瘤等中表达增加(非专利文献2)。
还有报道指出，存活蛋白的表达增加与肿瘤性疾患的予后不良相关，认为该蛋白质作为肿瘤抗原显示出非常重要的作用，存活蛋白中的MHC II类限制性肽的鉴定正在进行(非专利文献3)。然而，非专利文献3中报告的肽所限制的HLA II类针对有限的HLA型，为适应临床，需要使用适应多种HLA型的多种肽。
非专利文献1：Topalian、S.L.等、1994年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、第91卷、第9461-9465页
非专利文献2：Chiara Casati等、CANCER RESEARCH、2003年、第63号、第4507-4515页
非专利文献3：Matthias Piesche等、Human Immunology、2007年、第68卷、第572-576页
专利文献1：WO95/19783号公报
专利文献2：WO97/11669号公报
发明内容
发明要解决的问题
本发明提供新的肿瘤抗原、和在利用该肿瘤抗原治疗恶性肿瘤的方法中有用的新的治疗剂以及能够用于该治疗剂的肿瘤抗原。
解决问题的手段
本发明人等通过实验发现，含有肿瘤抗原、和对该肿瘤抗原特异性的Th细胞的治疗剂具有能够使表达该肿瘤抗原的恶性肿瘤显著萎缩的效果；进一步，确定了能够用作该肿瘤抗原的新的抗原性肽，从而完成了下述各发明。
(1)一种多肽，其由下述的a)～g)中的任意一个氨基酸序列构成，且具有使对存活蛋白特异性的Th细胞产生细胞因子的活性，
a)序列号17所示的氨基酸序列；
b)在序列号17所示的氨基酸序列的N末端和/或C末端添加1～数十个任意的氨基酸而成的氨基酸序列；
c)序列号17所示的氨基酸序列的N末端的1～4个氨基酸缺失的氨基酸序列；
d)序列号17所示的氨基酸序列的C末端的1～5个氨基酸缺失的氨基酸序列；
e)序列号17所示的氨基酸序列中的1～数个氨基酸残基被置换和/或缺失的氨基酸序列；
f)在序列号17所示的氨基酸序列中的1～数个氨基酸残基被置换和/或缺失的氨基酸序列的N末端和/或C末端，添加1～数十个任意的氨基酸而成的氨基酸序列；
g)序列号17所示的氨基酸序列的N末端和/或C末端的1～5个氨基酸缺失的氨基酸序列中进一步置换了1～数个氨基酸残基的氨基酸序列。
(2)根据(1)所述的多肽，b)～g)的氨基酸序列构成的多肽具有由序列号17所示的氨基酸序列构成的多肽所具有的表位，该表位由CD4阳性T细胞诱导对存活蛋白特异性的Th细胞。
(3)编码(1)或(2)所述的多肽的核酸。
(4)含有(3)所述的核酸的载体。
(5)与(1)或(2)所述的多肽特异性结合的抗体。
(6)一种恶性肿瘤免疫治疗用疫苗，其含有(1)或(2)所述的多肽中的至少一种以上作为有效成分。
(7)一种诱导对存活蛋白特异性的Th细胞的方法，所述方法包括在体外孵育(1)或(2)所述的多肽中的至少一种以上、抗原提呈细胞和CD4阳性T细胞的工序。
(8)一种恶性肿瘤治疗剂，其含有(1)或(2)所述的多肽、以及对该多肽或存活蛋白特异性的Th细胞。
发明效果
本发明的肽通过与抗原提呈细胞和CD4阳性T细胞一起孵育，诱导对存活蛋白特异性的Th细胞(以下表示为Sur/Th细胞)；此外，具有使该Sur/Th细胞产生细胞因子的活性。该Sur/Th细胞特异性攻击表达存活蛋白的恶性肿瘤，因而本发明的肽能够用作恶性肿瘤治疗剂的成分。
此外，本发明的多肽，其组成氨基酸残基数少，并不限于通过基因重组法制备，也能通过有机合成的方法大量制造，因而在临床研究或临床应用中，能够稳定且廉价地供给。
此外，含有本发明的多肽的恶性肿瘤治疗剂通过将肿瘤抗原与对该肿瘤抗原特异性的Th细胞组合，能够更强烈地促进Th细胞产生细胞因子。所产生的细胞因子在生物体内针对表达该肿瘤抗原的恶性肿瘤引发特异性的抗肿瘤免疫反应，使肿瘤萎缩。
附图说明
图1是细胞内染色结果的图，其表示的是：对含有由HLA的基因型为HLA-DRB1*0101/HLA-DRB1*0901的人诱导出的Sur/Th细胞的细胞群，分别添加混合肽MIX1～MIX5时，对Sur/Th细胞的IFN-γ的产生进行测定的结果。图中，纵轴表示CD4的表达强度，横轴表示IFN-γ的表达强度。
图2是细胞内染色结果的图，其表示的是：对含有由HLA的基因型为HLA-DRB1*0101/HLA-DRB1*0901的人诱导出的Sur/Th细胞的细胞群，分别添加多肽SU16～SU22时，对Sur/Th细胞的IFN-γ的产生进行测定的结果。图中，纵轴表示CD4的表达强度，横轴表示IFN-γ的表达强度。
图3表示的是：对含有由HLA的基因型为HLA-DRB1*0101/HLA-DRB1*0901的人诱导出的Sur/Th细胞的细胞群，分别添加抗HLA-DP抗体、抗HLA-DQ抗体和抗HLA-DR抗体时，通过ELISA对Sur/Th细胞的IFN-γ的产生进行测定的结果。图中，纵轴表示IFN-γ(IFN-g)的产生量。
图4表示的是：对含有由HLA的基因型为HLA-DRB1*0101/HLA-DRB1*0901的人诱导出的Sur/Th细胞的细胞群、和对HLA的基因型分别为HLA-DRB1*1201/HLA-DRB1*1405、HLA-DRB1*0410/HLA-DRB1*1201、HLA-DRB1*0405/HLA-DRB1*0901、HLA-DRB1*0401/HLA-DRB1*0901、HLA-DRB1*0101/HLA-DRB1*0802和HLA-DRB1*0101/HLA-DRB1*0101的异基因的PBMC，分别添加SU18(congnate)和对照肽(irrelevant)时，通过ELISA对Sur/Th细胞的IFN-γ的产生进行测定的结果。图中，纵轴表示HLA的基因型，横轴表示IFN-γ(IFN-g)的产生量。
图5表示的是：对由HLA的基因型为HLA-DRB1*0101的人诱导出的Sur/Th细胞，分别添加多肽T1～T11时，通过ELISA对Sur/Th细胞的IFN-γ的产生进行测定的结果。图中，纵轴表示HLA的基因型，横轴表示IFN-γ(IFN-g)的产生量。
图6为ELISPOTassay图，其表示的是：对由HLA的基因型为HLA-DRB1*1201/HLA-DRB1*1502的人诱导出的Sur/Th细胞，分别添加多肽T1～T10时，测定产生IFN-γ的Sur/Th细胞的细胞数的结果。
图7表示的是：对含有由HLA的基因型为HLA-DQB1*0302/HLA-DQB1*0601的人诱导出的Sur/Th细胞的细胞群，分别添加抗HLA-DP抗体、抗HLA-DQ抗体和抗HLA-DR抗体时，通过ELISA对Sur/Th细胞的IFN-γ的产生进行测定的结果。图中，纵轴表示IFN-γ(IFN-g)的产生量。
图8表示的是：对含有由HLA的基因型为HLA-DQB1*0302/HLA-DQB1*0601的人诱导出的Sur/Th细胞的细胞群、和对HLA的基因型分别为HLA-DQB1*0301/HLA-DQB1*0302、HLA-DQB1*0401/HLA-DQB1*0602、HLA-DQB1*0302/HLA-DQB1*0401和HLA-DQB1*0301/HLA-DQB1*0601的异基因的PBMC，分别添加SU18(congnate)和对照肽(irrelevant)时，通过ELISA对Sur/Th细胞的IFN-γ的产生进行测定的结果。图中，纵轴表示HLA的基因型，横轴表示IFN-γ(IFN-g)的产生量。
图9表示的是：对由HLA的基因型为HLA-DQB1*0601的人诱导出的Sur/Th细胞，分别添加多肽T1～T10时，通过ELISA对Sur/Th细胞的IFN-γ的产生进行测定的结果。图中，纵轴表示HLA的基因型，横轴表示IFN-γ(IFN-g)的产生量。
图10表示的是：对由HLA的基因型为HLA-DQB1*0601的人诱导出的Sur/Th细胞，分别添加多肽S1～S17时，通过ELISA对Sur/Th细胞的IFN-γ的产生进行测定的结果。图中，纵轴表示HLA的基因型，横轴表示IFN-γ(IFN-g)的产生量。
具体实施方式
本发明涉及存活蛋白的部分多肽、含有该部分多肽的肿瘤抗原、以及含有该肿瘤抗原和对该肿瘤抗原特异性的Th细胞的恶性肿瘤治疗剂。本发明的恶性肿瘤治疗剂，优选含有：含有存活蛋白的部分多肽的肿瘤抗原、以及通过该肿瘤抗原由自治疗对象患者回收的CD4阳性T细胞诱导的对该肿瘤抗原特异性的Th细胞。
本发明的恶性肿瘤治疗剂由作为存活蛋白的部分多肽的肿瘤抗原和对该肿瘤抗原特异性的Th细胞组合而成，通过采取该构成，与对患者分别单独投与该肿瘤抗原或对该肿瘤抗原特异性的Th细胞时相比，在恶性肿瘤的萎缩作用中具有显著效果。
对含有存活蛋白的部分多肽的肿瘤抗原特异性的Th细胞是指，受该肿瘤抗原特异性刺激而产生细胞因子的Th细胞，可以是Th0细胞、Th1细胞、Th2细胞中的任意一种，Th1细胞更适合。所述对肿瘤抗原特异性的Th细胞可通过在适当条件下孵育该肿瘤抗原、表达HLA II类分子的抗原提呈细胞和CD4阳性T细胞而由该CD4阳性T细胞诱导制得。
本发明的方法中能够利用的CD4阳性T细胞可由采集的血液通过常规方法、例如使用MACS(Miltenyi Biotech公司)等的方法而分离出。本发明中，优选的是，利用从作为治疗对象的具有恶性肿瘤的患者回收的CD4阳性T细胞。
本发明的方法中能够利用的抗原提呈细胞只要是在表面表达HLA II类分子的细胞即可，除树突状细胞外还可列举出B细胞、巨噬细胞、单核细胞、非增殖性的转染子等，但并不限于此。
孵育既可以是同时对含有存活蛋白的部分多肽的肿瘤抗原、抗原提呈细胞和CD4阳性T细胞进行孵育；或者也可以是先孵育该肿瘤抗原和抗原提呈细胞，然后在CD4阳性T细胞共存下进行孵育。孵育的条件，可以是按照常规方法、例如Tim等(Immunology Today、1996年、第17卷、第3号、第138-146页)所述的方法，即，在IL-2的存在下，在HLA II类分子的介导下抗原提呈细胞提呈所需的抗原，由CD4阳性T细胞诱导对该抗原特异性的成熟Th细胞。此外，可基于西村等(J.Exp.Med.、1999年、第190卷、第5号、第617-627页)的记载对孵育的各种条件进行各种变更，能够由CD4阳性T细胞特异性诱导Th0细胞、Th1细胞、或Th2细胞中的任意一种。
通过用作为存活蛋白的部分多肽的肿瘤抗原再刺激时，对此时产生的各细胞的细胞因子(例如前述的Tim等)进行确认，可知Th0细胞、Th1细胞、或Th2细胞被诱导出来。确认细胞因子的产生可利用ELISA法、细胞内染色法、酶联免疫斑点(ELISPOT)法、以及其它各种方法。
本发明的多肽的一个方式，为相当于被称为存活蛋白的肿瘤抗原蛋白(前述非专利文献2)的第76～94位的氨基酸序列(序列号17，以下称为SU18)的抗原性多肽。
进一步，与SU18(序列号17)的多肽的氨基酸序列存在以下的b)～g)的关系的氨基酸序列所构成的多肽也可用作本发明的肿瘤抗原。
b)在序列号17所示的氨基酸序列的N末端和/或C末端添加1～数十个任意的氨基酸而成的氨基酸序列；
c)序列号17所示的氨基酸序列的N末端的1～4个氨基酸缺失的氨基酸序列；
d)序列号17所示的氨基酸序列的C末端的1～5个氨基酸缺失的氨基酸序列；
e)序列号17所示的氨基酸序列中的1～数个氨基酸残基被置换和/或缺失的氨基酸序列；
f)在序列号17所示的氨基酸序列中的1～数个氨基酸残基被置换和/或缺失的氨基酸序列的N末端和/或C末端，添加1～数十个任意的氨基酸而成的氨基酸序列；
g)序列号17所示的氨基酸序列的N末端和/或C末端的1～5个氨基酸缺失的氨基酸序列中进一步置换1～数个氨基酸残基的氨基酸序列。
上述的b)～g)的氨基酸序列，规定为构成具有如下性质的多肽：保持了存在于SU18中的表位，具有使Sur/Th细胞产生细胞因子的活性；或具有由CD4阳性T细胞诱导对存活蛋白或SU18特异性的Th细胞的表位。
b)～g)中规定的置换、缺失或添加的氨基酸残基的种类只要在保持之前所示的多肽的活性或功能的范围内则没有特别限制，b)和f)中的添加1～数十个氨基酸是指添加1～50个氨基酸、优选添加1～30个氨基酸、进一步优选添加1～15个氨基酸。
上述的氨基酸的置换、缺失或添加的优选例为沉默置换(silent)、缺失、和添加，尤其优选保守性氨基酸间的置换。这些例子，对于本发明的多肽使Sur/Th细胞产生细胞因子的活性、或由CD4阳性T细胞诱导对存活蛋白或SU18特异性的Th细胞的表位没有改变。代表性的保守性置换可举出疏水性氨基酸Ala、Val、Leu、和Ile之间的相互置换、羟基氨基酸Ser和Thr的相互置换、酸性残基Asp和Glu的相互置换、酰胺型氨基酸Asn和Gln的相互置换、碱性氨基酸Lys和Arg的相互置换、芳香类氨基酸Phe和Tyr的相互置换等。
SU18具有如下的活性：通过孵育存活蛋白、抗原提呈细胞和CD4阳性T细胞，使由CD4阳性T细胞诱导的Sur/Th细胞产生细胞因子。这意味着，SU18具有被Sur/Th细胞识别的表位，进一步，该表位被获取存活蛋白的抗原提呈细胞的表面所表达的MHC II类分子提呈。因此，含有存活蛋白、SU18和Sur/Th细胞的恶性肿瘤治疗剂为本发明的一个方式。此外，含有通过孵育存活蛋白和/或SU18、抗原提呈细胞和CD4阳性T细胞而由CD4阳性T细胞诱导的对SU18特异性的Th细胞的恶性肿瘤治疗剂也是本发明的一个方式。
认为SU18对于具有HLA-DRB1*0101这一HLA基因型的人为肿瘤抗原，同时，对HLA的基因型为HLA-DRB1*1201/HLA-DRG1*1502、或HLA-DQB1*0601的人而言也是成为肿瘤抗原的多肽。
上述的各多肽均是能够用作恶性肿瘤治疗剂的一个成分的新的多肽，具有由CD4阳性T细胞诱导对该多肽特异性的Th细胞的活性和/或使所述Th细胞或Sur/Th细胞产生细胞因子的活性。上述的各多肽的、使对该多肽或存活蛋白特异性的Th细胞产生细胞因子的活性，可通过利用各种公知的方法测定用该多肽刺激该Th细胞时所产生的细胞因子进行确认。例如，干扰素γ(IFN-γ)的产生可使用BD Bioscience制以及其它市售的ELISA试剂盒简便地测定、确认。
此外，本发明的一个方式即前述的各多肽只要具有构成其的氨基酸序列即可，例如还能够进一步加上对蛋白的分离纯化有用的通用标签序列His-Tag、适当的连接子(linker)序列、GFP类标记蛋白的氨基酸序列等，或者在多肽上添加生物素等标记化合物。因此，对构成本发明的一个方式即多肽的氨基酸序列，出于除了使对这些多肽特异性的Th细胞、Sur/Th细胞产生细胞因子或由CD4阳性T细胞诱导前述细胞之外的目的，而添加了任意的氨基酸残基、从而形成的氨基酸序列所构成的多肽、还是对本发明的多肽添加适当的标记化合物的多肽，只要具有使该细胞产生细胞因子的活性或具有由CD4阳性T细胞诱导特异性的Th细胞的表位，则这种多肽依然包含在本发明的范围内。
本发明的多肽，可通过对编码其的DNA应用各种公知的基因重组手法以重组蛋白形式制造该多肽。典型的例子为，使用适当的DNA合成仪合成编码本发明的多肽的DNA，适当选择或组合该技术领域的参考书例如Sambrook等的Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第2版(Cold Spring Harbor La boratory Press、1989年等)中介绍的各种方法，构建表达本发明的多肽的表达载体，用该表达载体转化大肠杆菌等适当的宿主细胞，生产该多肽。如前所述，此时可增加用于制造重组多肽的各种操作，如添加组氨酸标签等。
此外，本发明的多肽还可以以经各种保护基修饰过的氨基酸为原料通过化学合成来制造。不使用基因、宿主细胞而通过有机化学方法合成多肽的方法，对本领域技术人员而言是众所周知的。例如，“第5版实验化学讲座16有机化合物的合成IV”(相本三郎等著、日本化学会编)等介绍了多肽的化学合成的各种方法，本发明的多肽可使用这些方法中的任意一种来合成。此外，也可使用通常被称为多肽合成仪的市售仪器来合成。
上述的多肽通过在适当条件下与抗原提呈细胞和CD4阳性T细胞进行孵育，能够将CD4阳性T细胞诱导为Th细胞。这样，本发明也提供一种在体外对表达HLA II类分子的抗原提呈细胞、CD4阳性T细胞和上述的多肽进行孵育，来诱导对上述的多肽和/或存活蛋白特异性的Th细胞的方法。在孵育中，除IL-2外，优选添加IFN-γ、IL-12、或抗IL-4抗体中的一种以上，在所述条件下，能够诱导产生IFN-γ且较少产生IL-4的Th1细胞。
如前所述，该方法中能够利用的抗原提呈细胞只要是在表面表达HLA II类分子的细胞即可，除树突状细胞外，可列举出B细胞、巨噬细胞、单核细胞、非增殖性的转染子等，但并不限定于此。另外，孵育既可以是同时对上述多肽、抗原提呈细胞和CD4阳性T细胞进行孵育；也可以是先孵育本发明的多肽和抗原提呈细胞，然后在CD4阳性T细胞共存下进行孵育。此外，孵育本发明的肽、在细胞表面表达HLA II类分子的抗原提呈细胞和CD4阳性T细胞的各种条件方面，如前所述，可以是按照常规方法例如前述Tim等所述的方法中的孵育条件来确定，即，通过HLA II类分子的介导使抗原提呈细胞提呈所需的抗原，由CD4阳性T细胞诱导对该抗原特异性的成熟Th细胞。
根据本发明的方法，由患者处回收抗原提呈细胞和CD4阳性T细胞，将其与本发明的多肽一起孵育，从而能在体外诱导和培养Sur/Th细胞。将根据该方法诱导的Sur/Th细胞回输给患者，从而激活患者自身的免疫系统，能够期待肿瘤细胞的萎缩。
此外，本发明的多肽，通过将其投与给兔子等适当的动物，能在该动物体中诱导特异性识别存活蛋白的抗体。这样的抗体能够特异性检测表达存活蛋白的细胞的存在、即癌细胞的存在，能够有效用于恶性肿瘤的诊断。
本发明的恶性肿瘤治疗剂中，除肿瘤抗原和对该肿瘤特异性抗原特异性的Th细胞外，在不妨害上述作用的范围内，还可以含有药物制剂化中通常使用的各种赋形剂、其它药物活性成分等。尤其是，本发明的恶性肿瘤治疗剂优选处于能够稳定保持肿瘤抗原和对该肿瘤特异性抗原特异性的Th细胞的缓冲液或液体培养基的形态。
缓冲液的非限定性例子，可举出中性的缓冲生理盐水或磷酸缓冲生理盐水等。此外，还可进一步含有例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖、葡聚糖、麦芽糖等糖质、蛋白质、氨基酸、抗氧化剂、抑菌剂、螯合剂(例如、EDTA或谷胱甘肽)、佐剂(例如、氢氧化铝)、渗透压调节剂、悬浮剂、增粘剂和/或防腐剂等。
此外，本发明的恶性肿瘤治疗剂优选处于肿瘤抗原和对该肿瘤特异性抗原特异性的Th细胞混合的形态，也可以处于肿瘤抗原和该对肿瘤特异性抗原特异性的Th细胞分别保存而在使用时混合并投与的所谓试剂盒形态。
以下，示出实施例对本发明进一步进行详细说明，但本发明并不受这些实施例的限制。
实施例
<实施例1>SU18的鉴定
1)肽的合成
如由存活蛋白-2B(序列号56)的第1～20位的氨基酸序列构成的肽、第8～27位的氨基酸序列构成的肽、第14～34位的氨基酸序列构成的肽这样，从存活蛋白的N末端至C末端共设计25种(记作SU1～SU27)在C末端和/或N末端具有7～8氨基酸的重叠序列(Overlap sequence)的19～20个氨基酸残基所构成的肽(表1)，分别进行化学合成。
表1
Figure BPA00001232805500111
进一步，类似于SU1～SU5的肽混合物、SU6～SU10的肽混合物这样，按照SU1～SU27的顺序(但不包括SU17、19)制备五种(MIX1～MIX5)由5种肽构成的肽混合物。
2)单核细胞源树突状细胞和CD4阳性T细胞的制备
由HLA的基因型为HLA-DRB1*0101/HLA-DRB1*0901的健康者X的外周血，利用聚蔗糖Ficoll(Ficoll-Paque PLUS；GE HealThcare公司)双层法分离外周血单核细胞(以下表示为PBMC)。将PBMC(2×106个细胞/孔)接种在24孔板中，在1mL添加有重组IFN-γ(最终浓度10ng/mL)的含5％人血清培养基(5％human serum in AIM-V)中，于37℃、CO2培养箱内培养。2小时后，用丝裂霉素C(MMC、协和发酵工业公司)处理45分钟，使PBMC失活。洗涤MMC后残存的有附着性的PBMC即为单核细胞源抗原提呈细胞(PBMC-Ad)。进一步，使用Easy Sep(VERITAS公司)，由在诱导PBMC-Ad时获得的非附着性PBMC(PBMC-nonAd)获得CD4阳性T细胞。
3)含有使用合成肽的Sur/Th细胞的Th细胞群的建立
将本实施例2)中制备的PBMC-Ad和CD4阳性T细胞(1×106个细胞/孔)，在由5种本实施例1)中制备的存活蛋白重叠肽混合而成的肽(MIX1～5、最终浓度10μg/mL)存在下、在含5％人血清的AIM-V 1mL中，于37℃、CO2培养箱内开始共培养。
共培养开始7天后，与第一天同样地使用经重组IFN-γ处理的PBMC-Ad和肽MIX1～5，再刺激培养中的自体CD4阳性T细胞，进一步在此之后的2天后，添加重组IL-2至最终浓度10U/mL。进一步，在共培养开始第14天，对通过与第7天同样的处理所制得的PBMC-Ad和培养14天的自体CD4阳性T细胞进行第二次再刺激。进一步，在共培养开始21天后，重复与第14天同样的再刺激。
回收细胞，在带有含5％人血清AIM-V 200μL的96孔U型培养板(BD biosciences公司)中，向PBMC(1×105个细胞/孔)、和预先经PE标记的抗CD4抗体染色后的含Sur/Th细胞的Th细胞群(4×104个细胞/孔)，分别加入MIX1、MIX2、MIX3、MIX4、MIX5(10μg/mL)，于37℃、CO2培养箱内共培养2小时后，加入4μL 500μg/mL的brefeldine A(BFA；Sigma、Ayrshire公司)，进一步共培养4小时。回收细胞，加入200μL固定/破膜剂(Fixati on and Permeabilization solution)(BD Biosciences公司)，在室温下放置20分钟后，用0.5％BSA/PBS洗涤，加入FITC标记的IFN-γ抗体，在室温下染色15分钟。用0.5％BSA/PBS洗涤，使用流式细胞仪(FACS Calibur、BD bi osciences公司)读取荧光信号，使用CellQuestTM(BD biosciences公司)进行3色解析。其结果如图1所示。
如图1所示，获得了含有与MIX4特异性反应的Sur/Th细胞的Th细胞群。
4)多肽的鉴定
使用本实施例3)中获得的含有与MIX4特异性反应的Sur/Th细胞的Th细胞群，对多肽进行鉴定。
在带有含5％人血清AIM-V 200μL的96孔U型培养板(BD biosciences公司)中，向PBMC(1×105个细胞/孔)、和预先经PE标记的抗CD4抗体染色的含有与使用上述MIX4的细胞特异性反应的Sur/Th细胞的Th细胞群(4×104个细胞/孔)，分别添加SU16、SU18、SU20、SU21和SU22至最终浓度10μg/mL，于37℃、CO2培养箱内共培养2小时后，各加入500μg/mL的brefeldine A(BFA；Sigma、Ayrshire公司)4μL，进一步共培养4小时。回收细胞，加入200μL固定/破膜剂(BD Biosciences公司)，在室温下放置20分钟后，用0.5％BSA/PBS洗涤，分别加入FITC标记的IFN-γ抗体，在室温下染色15分钟。用含有0.5％BSA的PBS洗涤，使用流式细胞仪(FACS Calibur、BD biosciences公司)读取荧光信号，使用Cell QuestTM(BD biosciences公司)进行3色解析。其结果如图2所示。
如图2所示，在添加有SU18的细胞中，能够确认到抗原特异性地表达IFN-γ的细胞，由此可确认SU18为具有通过存活蛋白特异性的HLA II类分子提呈的表位的多肽。
<实施例2>HLA-DRB1*0101限制性(restricted)的SU18识别部位的研究
1)HLA限制性的确认
使用实施例1的4)中获得的含有与SU18特异性反应的Sur/Th细胞的Th细胞群和抑制抗体，来确认针对SU18的HLA限制性。
在带有含5％人血清AIM-V 200μL的96孔U型培养板(BD bioscience公司)中，向PBMC(1×105个细胞/孔)和含有与上述SU18特异性反应的Sur/Th细胞的Th细胞群(5×104个细胞/孔)，分别加入抗HLA-DP抗体(Serotech公司)、抗HLA-DQ抗体(Serotech公司)和抗HLA-DR抗体(BD bioscience公司)至最终浓度5μg/mL，在SU18肽存在下，于37℃、CO2培养箱内共培养24小时。培养后，使用ELISA试剂盒(BD Bioscience公司)测定培养上清中所含的IFN-γ。其结果如图3所示。
如图3所示，由IFN-γ的产生受到抗HLA-DR抗体抑制，可确认SU18受限于HLA-DR。
2)HLA-DR限制性的确认
由于实施例1的2)中采集了外周血的健康者的HLA的基因型为HLA-DRB1*0101和HLA-DRB1*0901，因此，使用对于实施例1的4)中获得的含有与SU18特异性反应的Sur/Th细胞的Th细胞群为同种异体(allogenic)的抗原提呈细胞，确认HLA-DR限制性。
将SU18(congnate)和对照肽(irrelevant)分别加到HLA的基因型分别为HLA-DRB1*1201/HLA-DRB1*1405、HLA-DRB1*0410/HLA-DRB1*1201、HLA-DRB 1*0405/HLA-DRB 1*0901、HLA-DRB 1*0401/HLA-DRB 1*0901、HLA-DRB1*0101/HLA-DRB1*0802和HLA-DRB1*0101/HLA-DRB1*0101的异基因的PBMC(1×105个细胞/孔)中，使得最终浓度为10μg/mL，处理2小时后，和含有与上述SU18特异性反应的Sur/Th细胞的Th细胞群(5×104个细胞/孔)一起分别在带有含5％人血清AIM-V 200μL的96孔U型培养板(BD Bioscience公司)中，于37℃、CO2培养箱内共培养24小时。培养后，使用ELISA试剂盒(BD Bioscience公司)测定培养上清中所含的IFN-γ。其结果如图4所示。
如图4所示，当使用HLA的基因型为HLA-DRB1*0101/HLA-DRB1*0802和HLA-DRB1*0101/HLA-DRB1*0101的PBMC时产生了IFN-γ，由此确认出SU18受限于HLA-DR中的HLA-DRB1*0101。
3)SU18部分缺失时识别部位的确认
使用实施例1的4)中获得的含有与SU18特异性反应的Sur/Th细胞的Th细胞群、和表2所示的作为刺激用肽即重叠肽T1～T11，确认出SU18部分缺失时的识别部位。
表2
  T1   EHKKHSSGCAFL   序列号26
  T2   EHKKHSSGCAFLS   序列号27
  T3   EHKKHSSGCAFLSV   序列号28
  T4   EHKKHSSGCAFLSVK   序列号29
  T5   HKKHSSGCAFLSVKK   序列号30
  T6   KKHSSGCAFLSVKKQ   序列号31
  T7   KHSSGCAFLSVKKQF   序列号32
  T8   HSSGCAFLSVKKQFE   序列号33
  T9   SSGCAFLSVKKQFE   序列号34
  T10   SGCAFLSVKKQFE   序列号35
  T11   GCAFLSVKKQFE   序列号36
在带有含5％人血清AIM-V 200μL的96孔U型培养板(BD bioscience公司)中，向PBMC(1×105个细胞/孔)和上述含有与SU18特异性反应的Sur/Th细胞的Th细胞群(5×104个细胞/孔)，分别加入重叠肽T1～T11至最终浓度10μg/mL，于37℃、CO2培养箱内共培养24小时。培养后，使用ELISA试剂盒(BD Bioscience公司)测定培养上清中所含的IFN-γ。其结果如图5所示。
如图5所示，使用重叠肽T6(SU18的N末端缺失2个氨基酸且C末端缺失2个氨基酸的肽)、T7(SU18的N末端缺失1个氨基酸且C末端缺失3个氨基酸的肽)、T8(SU18的C末端缺失4个氨基酸的肽)、T9(SU18的C末端缺失5个氨基酸的肽)、T10(SU18的C末端缺失6个氨基酸的肽)和T11(SU18的C末端缺失7个氨基酸的肽)时产生IFN-γ，可确认抗原特异性反应，由此可确认至少含有序列号37的肽即GCAFLSVKKQ(G：甘氨酸、C：半胱氨酸、A：丙氨酸、F：苯丙氨酸、L：亮氨酸、S：丝氨酸、V：缬氨酸、K：赖氨酸、Q：谷氨酰胺)的肽能够诱导对存活蛋白特异性的Sur/Th细胞。
<实施例3>HLA-DRB1*1201/HLA-DRB1*1502限制性的SU18识别部位的研究
1)含有Sur/Th细胞的Th细胞群的建立
按照实施例1的2)和3)所述的方法进行28天的共培养，由HLA的基因型为HLA-DRB1*1201/HLA-DRB1*1502的健康者的外周血，制备含有Sur/Th细胞的Th细胞群。进一步为了建立单一细胞群，在96孔U型培养板中，准备含有下述物质的培养基，加入前述Th细胞群(1个细胞/孔)，于37℃、CO2培养箱内进行共培养，其中，所述培养基中包含：人血清和胎牛血清的混合培养基(2.5％human serum、2.5％ fetal calf serum in AIM-V)200μL、PBMC-Ad(5×104个细胞/孔)、重组IL-2(最终浓度20U/mL)、重组IL-7(最终浓度10ng/mL)和植物凝集素(PHA、SEIKAGAKU Co.，最终浓度5μg/mL)。
在共培养开始14天后，将能观察到细胞的原始转化(blast)的孔，于带有含5％胎牛血清AIM-V 500μL的48孔板中扩大培养(Scale up)。以后，每隔一周通过使用SU18脉冲的PBMC-Ad进行再刺激，获得Sur/Th细胞克隆。
2)SU18部分缺失时的识别部位的确认
使用本实施例1中制备的Sur/Th细胞克隆、和表3所示的刺激用肽T1～T10，通过以下所示的ELISPOTassay确认SU18部分缺失时的识别部位。
表3
  T1   EHKKHSSGCAFL   序列号26
  T2   EHKKHSSGCAFLS   序列号27
  T3   EHKKHSSGCAFLSV   序列号28
  T4   EHKKHSSGCAFLSVK   序列号29
  T5   HKKHSSGCAFLSVKK   序列号30
  T6   KKHSSGCAFLSVKKQ   序列号31
  T7   KHSSGCAFLSVKKQF   序列号32
  T8   HSSGCAFLSVKKQFE   序列号33
  T9   SSGCAFLSVKKQFE   序列号34
  T10   SGCAFLSVKKQFE   序列号35
  T11   GCAFLSVKKQFE   序列号36
使用ELISPOT板(MAHA S4510、Millipore公司)和ELISPOT试剂盒(Mabtech、Nacka公司)进行ELISPOTassay。按照试剂盒的使用方法，在足量的抗原肽存在下、在用2μg/mL浓度包被抗人IFN-γ抗体(克隆名1-D1K，mAb公司)后的ELISPOT板上，培养特异性诱导的Th细胞和T-APCs。培养开始20小时后，用洗涤液(0.05％Tween20/PBS)洗涤培养上清。进一步，向板添加0.2μg/mL浓度的生物素化抗人IFN-γ抗体(mAb公司)，在4℃的状态下反应16小时。再次用上述洗涤液洗涤，各孔用PBS/链霉素AP液(上述试剂盒)100μL加满，在室温下反应1小时。然后，用上述洗涤液冲去上清，加满BCIP/NBT-Bule Liquid substrate solution(Sigma公司)，反应10分钟后，用蒸留水洗涤，终止反应。反应结束后，将板干燥，然后使用CTL ImmunoSpot酶标仪(Plate Reader)(Cellular Technology公司)进行测定。其结果如图6所示。
如图6所示，可确认T3(SU18的N末端缺失5个氨基酸的肽)和T8(SU18的C末端缺失4个氨基酸的肽)发生抗原特异性反应。因此，SU18即使是C末端缺失4个氨基酸或N末端缺失5个氨基酸，也能诱导对存活蛋白特异性的Sur/Th细胞。此外可知，SU18不仅对于HLA的基因型为HLA-DRB1*0101/HLA-DRB1*0901的患者，而且对HLA的基因型为HLA-DRB1*1201/HLA-DRB1*1502的患者而言，也是免疫疗法中有效的多肽。
<实施例4>HLA-DQB1*0601限制性的SU18识别部位的研究
1)HLA限制性的确认
由HLA的基因型为HLA-DQB1*0302/HLA-DQB1*0601的健康者Y的外周血，按照与实施例1的2)相同的方法制备CD4阳性T细胞，通过与实施例1的3)和4)相同的方法，获得含有与SU18特异性反应的Sur/Th细胞的Th细胞群。使用该与SU18特异性反应的Sur/Th细胞群和抑制抗体，确认针对SU18的HLA限制性。
在带有含5％人血清AIM-V 200μL的96孔U型培养板(BD bioscience公司)中，向PBMC(1×105个细胞/孔)和上述含有与SU18特异性反应的Sur/Th细胞的Th细胞群(5×104个细胞/孔)，分别加入抗HLA-DP抗体(Serotech公司)、抗HLA-DQ抗体(Serotech公司)和抗HLA-DR抗体(BDbioscience公司)，使最终浓度为5μg/mL，在SU18肽存在下，于37℃、CO2培养箱内共培养24小时。培养后，使用ELISA试剂盒(BD Bioscience公司)测定培养上清中所含的IFN-γ。其结果如图7所示。
如图7所示，IFN-γ的产生受到抗HLA-DQ抗体的抑制，由此可确认SU18受限于HLA-DQ。
2)HLA-DQ限制性的确认
使用对本实施例1)中获得的含有与SU18特异性反应的Sur/Th细胞的Th细胞群为同种异体的抗原提呈细胞，确认HLA-DQ限制性。
将SU18(congnate)和对照肽(irrelevant)分别加到HLA的基因型分别为HLA-DQB1*0301/HLA-DQB1*0302、HLA-DQB1*0401/HLA-DQB1*0602、HLA-DQB1*0302/HLA-DQB1*0401和HLA-DQB1*0301/HLA-DQB1*0601的异基因的PBMC(1×105个细胞/孔)中，使得最终浓度为10μg/mL，处理2小时后，和上述含有与SU18特异性反应的Sur/Th细胞的Th细胞群(5×104个细胞/孔)一起，分别在带有含5％人血清AIM-V 200μL的96孔U型培养板(BD Bioscience公司)中，于37℃、CO2培养箱内共培养24小时。培养后，使用ELISA试剂盒(BD Bioscience公司)测定培养上清中所含的IFN-γ。其结果如图8所示。
如图8所示，使用HLA的基因型为HLA-DQB1*0301/HLA-DQB1*0302和HLA-DQB1*0302/HLA-DQB1*0401的PBMC时，未产生IFN-g，使用为HLA-DQB1*0301/HLA-DQB1*0601的PBMC时产生了IFN-γ，由此，可确认SU18受限于HLA-DQ中的HLA-DQB1*0601。
3)SU18部分缺失时的识别部位的确认
使用本实施例1的1)中获得的含有与SU18特异性反应的Sur/Th细胞的Th细胞群、和表3所示的作为刺激用肽的重叠肽T1～T10，确认SU18部分缺失时的识别部位。
在带有含5％人血清AIM-V 200μL的96孔U型培养板(BD bioscience公司)中，向PBMC(1×105个细胞/孔)和上述含有与SU18特异性反应的Sur/Th细胞的Th细胞群(5×104个细胞/孔)，分别加入重叠肽T1～T10至最终浓度10μg/mL，于37℃、CO2培养箱内共培养24小时。培养后，使用ELISA试剂盒(BD Bioscience公司)测定培养上清中所含的IFN-γ。其结果如图9所示。
如图9所示，使用重叠肽T3(SU18的N末端缺失5个氨基酸的肽)、T4(SU18的N末端缺失4个氨基酸的肽)、T5(SU18的N末端缺失3个氨基酸且C末端缺失1个氨基酸的肽)、T6(SU18的N末端缺失2个氨基酸且C末端缺失2个氨基酸的肽)和T7(SU18的N末端缺失1个氨基酸且C末端缺失3个氨基酸的肽)时产生IFN-γ，可确认抗原特异性反应，由此可确认出至少含有序列号37的肽即KHSSGCAFLSV(K：赖氨酸、H：组氨酸、S：丝氨酸、G：甘氨酸、C：半胱氨酸、A：丙氨酸、F：苯丙氨酸、L：亮氨酸、V：缬氨酸)的肽能够诱导对存活蛋白特异性的Sur/Th细胞。
4)SU18部分置换时识别部位的确认
使用本实施例1)中获得的含有与SU18特异性反应的Sur/Th细胞的Th细胞群和表4所示的作为刺激用肽的、用丙氨酸(A)或甘氨酸(G)置换SU18的各氨基酸而形成的部分置换肽S1～S17，确认SU18部分置换时识别部位。
在带有含5％人血清AIM-V 200μL的96孔U型培养板(BD bioscience公司)中，向PBMC(1×105个细胞/孔)和上述含有与SU18特异性反应的Sur/Th细胞的Th细胞群(5×104个细胞/孔)，分别加入部分置换肽S1～S17至最终浓度10μg/mL，于37℃、CO2培养箱内共培养24小时。培养后，使用ELISA试剂盒(BD Bioscience公司)测定培养上清中所含的IFN-γ。其结果如图10所示。
如图10所示，使用部分置换肽S4(SU18的C末端起第4位的赖氨酸置换成丙氨酸的肽)、S5(SU18的C末端起第5位的组氨酸置换成丙氨酸的肽)、S7(SU18的C末端起第7位的丝氨酸置换成丙氨酸的肽)和S9(SU18的C末端起第9位的半胱氨酸置换成甘氨酸的肽)时几乎未产生INF-γ。即，可确认出至少为序列号55的肽XXXKHXSXCXXXXXXXXXX(Xaa：任意的氨基酸、K：赖氨酸、H：组氨酸、S：丝氨酸、C：半胱氨酸)的肽能诱导存活蛋白特异性的Sur/Th细胞。
Figure IPA00001232804800011
Figure IPA00001232804800021
Figure IPA00001232804800031
Figure IPA00001232804800071
Figure IPA00001232804800101

Claims (8)

1.一种多肽，其由下述的a)～g)中的任意一个氨基酸序列构成，且具有使对存活蛋白特异性的Th细胞产生细胞因子的活性，
a)序列号17所示的氨基酸序列；
b)在序列号17所示的氨基酸序列的N末端和/或C末端添加1～数十个任意的氨基酸而成的氨基酸序列；
c)序列号17所示的氨基酸序列的N末端的1～4个氨基酸缺失的氨基酸序列；
d)序列号17所示的氨基酸序列的C末端的1～5个氨基酸缺失的氨基酸序列；
e)序列号17所示的氨基酸序列中的1～数个氨基酸残基被置换和/或缺失的氨基酸序列；
f)在序列号17所示的氨基酸序列中的1～数个氨基酸残基被置换和/或缺失的氨基酸序列的N末端和/或C末端，添加1～数十个任意的氨基酸而成的氨基酸序列；
g)序列号17所示的氨基酸序列的N末端和/或C末端的1～5个氨基酸缺失的氨基酸序列中进一步置换了1～数个氨基酸残基的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中，b)～g)的氨基酸序列构成的多肽具有由序列号17所示的氨基酸序列构成的多肽所具有的表位，该表位由CD4阳性T细胞诱导对存活蛋白特异性的Th细胞。
3.一种核酸，其编码权利要求1或2所述的多肽。
4.一种载体，其含有权利要求3所述的核酸。
5.一种抗体，其与权利要求1或2所述的多肽特异性结合。
6.一种恶性肿瘤免疫治疗用疫苗，其以权利要求1或2所述的多肽中的至少一种以上作为有效成分。
7.一种诱导对存活蛋白特异性的Th细胞的方法，所述方法包括在体外对权利要求1或2所述的多肽中的至少一种以上、抗原提呈细胞和CD4阳性T细胞进行孵育的工序。
8.一种恶性肿瘤治疗剂，其含有权利要求1或2所述的多肽、以及对该多肽或存活蛋白特异性的Th细胞。
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