CN108289910A - 在体外人造淋巴结用于治疗和表位作图的t细胞的敏化和扩增 - Google Patents

在体外人造淋巴结用于治疗和表位作图的t细胞的敏化和扩增 Download PDF

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Abstract

具有残留疾病的HER2+浸润性乳腺癌(IBC)患者在新辅助化疗后具有抗HER2 1型T辅助细胞(Th1)细胞免疫缺陷和复发性疾病的重大风险。已经显示抗HER2 CD4+T细胞应答沿着乳腺癌连续统计逐渐减少‑健康供体和良性疾病患者的健康应答，HER2+导管原位癌患者的下调应答以及HER2+IBC患者几乎无应答。本发明涉及一种用于T细胞培养扩增的微环境的创建方法。扩增的T细胞可用于各种治疗和研究目的。

Description

在体外人造淋巴结用于治疗和表位作图的T细胞的敏化和 扩增
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年3月26日提交的美国临时专利申请No.62/138,684和2015年3月26日提交的美国临时专利申请No.62/138,969的优先权，其各自均以全文引用的方式并入本文中。
背景技术
具有残留疾病的HER2+浸润性乳腺癌(IBC)患者在新辅助化疗后具有抗HER2 1型T辅助细胞(Th1)细胞免疫缺陷和复发性疾病的重大风险。已经显示抗HER2 CD4+T细胞应答沿着乳腺癌连续统计逐渐减少-健康供体和良性疾病患者的健康应答，HER2+导管原位癌患者的下调应答以及HER2+IBC患者几乎无应答。
乳腺癌发病的终身风险几乎是八分之一。erb-B2致癌基因(HER-2/neu)是在大量乳腺癌、卵巢癌、胃食管癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌和其他实体瘤中过表达的分子驱动剂。HER2过表达(“HER2pos”)一种是包括约20-25％的乳腺癌(Meric，F.，等，J.AmColl.Surg.194：488-501(2002))的几种肿瘤类型中的驱动分子，其与侵袭性临床病程、抗化疗和乳腺癌的整体不良预后有关。见Henson,E.S.,Clin.Can.Res.12:845-53(2006)(“Henson，等”)和Wang,G.S.,Mol.Med.Rep.6:779-82(2012)。在乳腺癌初期，HER2过表达与增强的侵袭性(Roses，RE等，Cancer Epidemiol.Bioomarkers&Prev.18(5)：1386-9(2009))、肿瘤细胞迁移(Wolf-Yadlin，A.,等，Molecular Systems Biology 2:54(2006))和促血管生成因子(Wen，XF等，Oncogene 25：6986-96(2006))的表达相关，表明了HER2在促进致瘤性环境中的关键作用。在导管原位癌(“DCIS”)患者的回顾性分析中，过表达HER2的DCIS损伤与侵袭性乳腺癌相关的可能性高于不具有HER2过表达的DCIS病变的六倍以上。
尽管靶向HER2的分子靶向治疗(即，/曲妥单抗)与化疗相结合显著改善了HER2pos乳腺癌患者的生存率(Piccart-Gebhart.，MJ等，N.Eng.J.Med 353：1659-72(2005))，但是相当比例的患者变得对这种疗法具有抗性(Pohlmann，PR等，Clin.Cn.Res.15：7479-91(2009)(“Pohlman等”))。需要确定治疗失败风险高的患者亚组的策略，以及提高HER2靶向治疗应答率的新方法。尽管靶向HER2的分子靶向疗法(即曲妥珠单抗)在乳腺癌这种类型中已经产生了巨大的积极的临床效果，但对于晚期疾病状态下对现有的HER2疗法几乎具有普遍的抗性，加上相当比例的接受靶向治疗的妇女的疾病复发，证明了需要靶向HER2的其他策略。旨在减轻肿瘤进展和预防激发时复发的激活免疫系统针对HER2的疫苗的承诺尚未完全实现，仍然需要额外的检测和治疗来诊断和治疗HER2乳腺癌。
最近已经阐明了全身抗HER2 CD4+Th1应答在HER2驱动的乳腺肿瘤发生中的作用。已经确定在HER2pos乳腺癌中，在致瘤性连续体上的抗HER2 CD4+Th应答的进行性丧失似乎是HER2特异性和独立的调节性T细胞(Treg)。具体来说，抗HER2 CD4+Th1应答与HER2表达和疾病进展存在负相关性。Th1反应性特征谱显示在HER2pos乳腺肿瘤发生中跨连续体(HD(健康供体)àBD(良性乳腺活检)àHER2neg-DCIS(原位导管癌)àHER2neg-IBC(侵袭性乳腺癌)HER2pos-DCISàHER2pos-IBC(侵袭性乳腺癌)的抗HER2 Th1免疫力的显著逐步下降，见Datta，J.,等，Oncolmmunology2015(印刷中)和于2015年3月13日提交的美国序列号14/658,095(统称为“Datta等”)。HER2-脉冲型1型偏振树突状细胞(“DC1”)疫苗接种后HER2pos浸润性乳腺癌中的抗HER2 Th1抑制作用差异恢复，但使用曲妥珠单抗和化学疗法(“T/C”)或其他标准疗法如手术切除或放射进行HER2靶向治疗后，抑制应答未恢复。同上。恢复的抗HER2 Th1应答似乎耐久至少约六个月或更长。
T淋巴细胞亚群(CD4+或CD8+)的扩增是获得足够的T细胞进行过继性治疗或识别基于肽的疫苗的靶抗原上的表位的必要步骤。T细胞的扩增原则上是一个简单的过程。然而，在实践中存在许多技术问题，包括扩增水平不足、活化诱导的细胞死亡(凋亡)过早或抗原特异性和/或功能丧失。部分问题在于无法在体外复制体内淋巴结发生的抗原特异性T细胞扩增的环境。这些是包含除T淋巴细胞以外的许多不同细胞类型的专门组织，包括抗原递呈树突状细胞和基质细胞如上皮细胞。这些细胞类型中的每一种通过提供对于T细胞生长和维持细胞功能而言重要的接触依赖性信号(表面受体)和可溶性信号(细胞因子)起着不同的作用(目前已定义并且尚未得到表征)。
仍然需要新的治疗癌症的方法。因此，本领域需要具有用于治疗或预防乳腺癌和其它恶性肿瘤的额外的免疫治疗方法。本发明满足了这种需求。
发明内容
在一个实施例中，本发明提供了扩增T细胞的方法。在一个实施例中，该方法包括使T细胞与树突状细胞，至少两种细胞因子和T细胞生长因子中的一种或多种接触。
在一个实施例中，T细胞与抗原接触，从而产生抗原特异性T细胞。
在一个实施例中，树突状体是I型树突状细胞。
在一个实施例中，所述至少两种细胞因子是白细胞介素-7(IL-7)和白细胞介素-15(IL-15)。
在一个实施例中，T细胞生长因子是白细胞介素-2(IL-2)。
在一个实施例中，所述方法包括：a)在体外使T细胞与抗原结合的自体I型树突细胞DC接触，从而产生抗原特异性T细胞；b)使抗原特异性T细胞与IL-7和IL-5接触以产生刺激的抗原特异性T细胞；c)将刺激的抗原特异性T细胞与IL-2接触，从而产生维持抗原特异性和细胞功能的扩增的抗原特异性T细胞群。
在一个实施例中，本发明提供了通过本发明的方法产生的T细胞。
在一个实施例中，本发明提供了通过根据权利要求1-6所述的方法产生的展现抗肿瘤活性的培养的扩增抗原特异性T细胞群，其中所述细胞扩增至足以在哺乳动物中有效治疗的数量。在一个实施例中，本发明提供了通过本发明的方法产生的展现抗肿瘤活性的培养的扩增抗原特异性T细胞群，其中将细胞扩增至足以有效表位作图的数目。
在一个实施例中，本发明提供了编码来自抗原特异性T细胞的T细胞受体(TCR)的分离的多核苷酸，其中所述抗原特异性T细胞是通过本发明的方法产生的。
在一个实施例中，本发明提供了一种免疫治疗方法，包括向有需要的受试者施用T细胞，其中通过本发明的方法产生T细胞。
在一个实施例中，本发明提供了一种扩增T细胞群的方法，所述T细胞群包括从已经接种抗原疫苗的受试者的血液样品获得的至少一种T细胞，其包括以下步骤：使T细胞与一种或更多的树突状细胞或其前体、至少两种细胞因子和一种T细胞生长因子接触。
在一个实施例中，血液样品含有至少一种特异于疫苗抗原的T细胞群和至少一种树突状细胞前体。
在一个实施例中，将树突状细胞前体用抗原脉冲并激活至抗原特异性I型树突状细胞(DC1)，然后与T细胞共培养以产生抗原特异性I型树突状细胞。
在一个实施例中，所述至少两种细胞因子是白细胞介素-7(IL-7)和白细胞介素-15(IL-15)。
在一个实施例中，T细胞生长因子是白细胞介素-2(IL-2)。
在一个实施例中，所述方法包括：a)在体外用抗原特异性T细胞自体I型树突状细胞(DC1)共同培养来自患者样品的T细胞；b)使来自步骤a)的细胞与IL-7和IL-5接触以产生刺激的抗原特异性T细胞；c)随后将刺激的抗原特异性T细胞与IL-2接触，从而产生维持抗原特异性和细胞功能的扩增的抗原特异性T细胞群。
在一个实施例中，所述方法还包括重复步骤a)至c)一次到至少三次，以产生进一步扩增的抗原特异性T细胞群。
在一个实施例中，所述T细胞是CD4+。
在一个实施例中，所述抗原是HER2。
在一个实施例中，本发明提供了扩增CD4+T细胞群的方法，该CD4+T细胞群包含至少一种从已经接种了HER2疫苗的乳腺癌患者的血液样品获得的CD4+T细胞，包括以下步骤：使CD4+T细胞与一种或多种树突状细胞或其前体、至少两种细胞因子和一种T细胞生长因子接触。
在一个实施例中，用至少一种HER2 MHC II类肽脉冲样品中的至少一种树突状细胞前体，并与CD4+T细胞接触。
在一个实施例中，该方法还包括以下步骤：
a)用所述HER2脉冲的I型树突状细胞共培养来自权利要求1中的T细胞；
b)使来自步骤a)的细胞与IL-7和IL-5接触以产生刺激的抗原特异性T细胞；
c)随后将刺激的抗原特异性T细胞与IL-2接触，从而产生维持抗原特异性和细胞功能的扩增的抗原特异性T细胞群。
在一个实施例中，所述方法还包括重复步骤a)至c)从一次到至少三次，以产生进一步扩增的抗原特异性T细胞群。
附图说明
当结合附图阅读时，将更好地理解以下对本发明优选实施例的详细描述。为了说明本发明，在附图中示出了当前优选的实施例。然而，应当理解，本发明不限于附图中所示的实施例的精确布置和手段。
图1示出了接受辅助性HER2脉冲I型树突状细胞疫苗的新辅助治疗后具有残留疾病的四例HER2+IBC患者的抗HER2 Th1应答组库。每个患者被描绘成不同的颜色，并显示疫苗前、疫苗3个月后和疫苗6个月后的反应肽(n)(也称为“应答组库”)的数量。在疫苗接种后3个月(p＝0.01)，平均应答组库从接种前0.5±1种肽增加到3.25±0.96种肽，接种后6个月时增加4±0.8种肽(p＝0.01)。
图2示出了接受辅助HER2脉冲I型树突状细胞疫苗的新辅助治疗后具有残留疾病的四例HER2+IBC患者的抗HER2 Th1累积应答。每个患者被描绘成不同的颜色，并显示了疫苗前、疫苗3个月后和疫苗6个月后的累积应答(SFC/106细胞)。患者平均累积应答从接种前36.5±38.3SFC/106改善至疫苗接种后3个月(p＝0.04)151.0±60.0SFC/106，以及并在疫苗接种后6个月(p＝0.02)198.4±39.7SFC/106。
图3和图4示出了CD4+T细胞与用IL-2刺激的HER2肽脉冲I型树突状细胞疫苗接种的患者HER2特异性I型树突状细胞共培养并分别与对两种不同患者使用IL-2/7/15进行刺激进行对比。将来自各自患者的未成熟的树突状细胞(“iDC”)用以下MHC类Π肽：肽42-56(SEQ ID NO：1)、肽98-114(SEQ ID NO：2)、肽328-345(SEQ ID NO：SEQ ID NO：3)和肽776-790(SEQ ID NO：4)进行脉冲，并成熟为I型树突状细胞。然后将所得HER2脉冲的I型树突状细胞与CD4+T细胞共培养，并用单独的IL-2或IL-2/7/15刺激，如图所示。红色轮廓框表示显示特异性的特异性肽和刺激方案(特异性抗原：控制性抗原IFN-γ产生的比例大于2:1)。对于每组肽/刺激方案：“对照抗原”显示与对照抗原共培养的非特异性iDC；“特异性抗原”表示与用HER2抗原/肽脉冲的iDC共培养的抗HER2 CD4+T细胞；“T细胞”表示培养基中的抗HER2 CD4+T细胞。显示倍数扩增的图(定义为扩增后的T细胞数量/T细胞扩增前的数量)分别示于右侧。通过ELISA测定抗原特异性IFN-γ产生的特异性。
图5和图6示出了非特异性免疫应答后的特异应答：图5示出了HER2特异性I性树突状细胞的第一次刺激/扩增后的特异性应答，图6示出了用非特异性抗CD3/CD28在第二次刺激/扩增后的特异性应答的随后的损失。具有HER2特异性树突状细胞的CD4+T细胞的第一次刺激导致如图5中红色轮廓框所示的多种特异性免疫应答。图6示出了HER2特异性CD4+T细胞用非特异性抗CD3/CD28刺激导致四倍扩增(侧图)，但在四分之三肽组中具有特异性损失。来自患者的iDC用以下的MHCΠ类肽：肽42-56(SEQ ID NO：1)、肽98-114(SEQ ID NO：2)、肽328-345(SEQ ID NO：3)和肽776-790(SEQ ID NO：4)进行脉冲，并成熟至I型树突状细胞。然后将所得的HER2脉冲的I型树突状细胞与CD4+T细胞共培养，并用单独的IL-2或IL-2/7/15刺激，如图所示。
图7和图8示出了非特异性免疫应答，随后是特异性免疫应答：图7示出了CD4+T细胞的非特异性扩增。图8示出了在随后用HER2特异性I型树突状细胞刺激后未能获得特异性。用非特异性抗CD3/CD28的CD4+T细胞的第一次刺激导致3.8倍扩增(图7)。具有HER2特异性I型树突状细胞的非特异性CD4+T细胞的第二次刺激不能导致特异性免疫应答(图8)。来自患者的iDC患有用以下的MHCΠ类肽：肽42-56(SEQ ID NO：1)、肽98-114(SEQ ID NO：2)、肽328-345(SEQ ID NO：3)和肽776-790(SEQ ID NO：4)进行脉冲，并成熟至I型树突状细胞。然后将所得的HER2脉冲的I型树突状细胞与CD4+T细胞共培养，并用单独的IL-2或IL-2/7/15刺激，如图所示。
图9A和9B示出了HER2特异性Th1细胞的体外初次/第一次扩增，其比较与IL-2扩增的HER2特异性I型树突状细胞共培养的CD4+T细胞与用IL-2/7/15扩增的那些相比。未成熟树突状细胞(“iDC”)用以下MHCΠ类肽：肽42-56(SEQ ID NO：1)、肽98-114(SEQ ID NO：2)、肽776-790(SEQ ID NO：4)和肽927-941(SEQ ID NO：5)进行脉冲，并成熟为I型树突状细胞。然后将所产生的HER2脉冲I型树突状细胞与CD4+T细胞共培养，并用单独的IL-2或IL-2/7/15刺激，如图所示。红色轮廓框(图9B)表示显示特异性的特异性肽和刺激方案(特异性抗原：控制性抗原IFN-γ产生的比例大于2:1)。对于每组肽/刺激方案：“对照抗原”显示与对照抗原共培养的非特异性iDC；“特异性抗原”表示与用HER2抗原/肽脉冲的iDC共培养的抗HER2 CD4+T细胞；“T细胞”表示培养基中的抗HER2 CD4+T细胞。图9A示出了当用IL-2、IL-7和IL-15刺激时，Th1细胞的平均扩增倍数(定义为扩增后的T细胞数量/T细胞扩增前的数量)比单独用IL-2刺激显著更好(2.6±0.75相比1.0±0.12；p＝0.001)。图9B示出了通过ELISA通过抗原特异性IFN-γ产生测定的各种肽/扩增方案的特异性。用IL-2、IL-7和IL-15和单独IL-2的刺激都导致相同HER2肽776-790中的特异性的Th1应答。
图10A和10B示出了HER2脉冲的I型树突状细胞对抗CD3/CD28的体外二次/第二次扩增。用HER2肽脉冲的I型树突状细胞和抗CD3/CD28再刺激Th1细胞各自导致类似的倍数扩增(3.9±1.0相比4.3±2.0p＝0.7)(图10A)。然而，图10B示出了具有HER2特异性I型树突状细胞的Th1细胞的刺激增强了特异性Th1应答；而用抗CD3/CD28的非特异性刺激导致HER2-肽特异性的总体损失。使用以下MHCΠ类肽：肽42-56(SEQ ID NO：1)、肽98-114(SEQ ID NO：2)、肽776-790(SEQ ID NO：4)和肽927-941(SEQ ID NO：5)。红色轮廓框(图10B)表示显示特异性的特异性肽和刺激方案(特异性抗原：控制抗原IFN-γ产生比例大于2:1)(即肽42-56-和肽776-790的I型树突状细胞再刺激)。对于每组肽/刺激方案：“对照抗原”示出了与对照抗原共培养的非特异性iDC；“特异性抗原”代表与iDC共培养的抗HER2 CD4+T细胞，其用HER2抗原/肽脉冲；“T细胞”表示培养基中的抗HER2 CD4+T细胞。
图11A和11B示出了具有HER2脉冲I型树突状细胞的Th1细胞的第三次/第三次扩增(使用肽42-56(SEQ ID NO：1)、肽98-114(SEQ ID NO：2)、肽776-790(SEQ ID NO：4)和肽927-941(SEQ ID NO：5))。在用所示的HER2特异性I型树突状细胞进行第三次刺激之后，平均扩增倍数(4.32±0.5，43.7倍累积扩增(图11A)和抗原特异性(图11B))再次增加，特别是所有四种肽显示特异性和增加IFN–γ的产生。
图12-15示出了IL-2/7/15重复体外刺激(4次)HER2特异性CD4+Th1细胞的相继结果。对于所有图12-15，相应的左图通过IFN-γ产生显示肽特异性(“Tet”是破伤风患者对照)；相应的右图显示了所用特异性HER2-肽的倍数扩增。在图12中，使用两种另外的MHCΠ类肽来脉冲iDC：肽927-941(SEQ ID NO：5)、肽1166-1180(SEQ ID NO：6)以及上述图中使用的其它四种。然而，如在倍数扩增结果(图12，右图)中所见，肽328-345特异性和肽1166-1180特异性Th1细胞不产生足够的细胞以用于进一步扩增，因此，仅对剩余的四种多肽具有特异性的HER2 Thl细胞才被使用。顺序地，图12的第一次刺激显示仅针对肽776-790特异性Th1细胞的特异性；图13为第二次刺激显示肽42-56和肽776-790特异性Th1细胞的增加，特异性；图14为第三次扩增显示对所有四种肽的特异性，图15为第四次扩增，显示其中一种肽(肽927-941)的特异性丧失，留下三种剩余的HER2特异性肽。
图16示出了所有HER2特异性Th1细胞的图12-15中所示的四种扩增的累积扩增倍数，每组的最后一个条(点)显示累积扩增倍数。
详细说明
本发明涉及用于培养扩增抗原特异性辅助T细胞的体外微环境的创建方法。扩增的抗原特异性T细胞可以用于各种治疗和研究目的，例如用于癌症或其他病症的过继性T细胞治疗，或用于鉴定靶抗原上的表位以促进肽基疫苗的生产。
在一个实施例中，本发明包括与蛋白质或肽抗原组合使用自体I型树突状细胞(DC)以在体外刺激T细胞。刺激后，将至少两种可溶性因子(例如细胞因子)加入到T细胞中。在一些情况下，至少两种可溶性因子是白细胞介素-7(IL-7)和白细胞介素-15(IL-15)。将可溶性因子加入T细胞后，加入T细胞生长因子。在一些情况下，T细胞生长因子是白细胞介素-2(IL-2)。除了由I型树突状细胞天然产生的那些之外，可溶性因子支持T细胞功能的增殖和获取/维持。这种刺激过程可以在每周循环中重复，直到T细胞具有足够数量的治疗或表位扫描/作图。在一个实施例中，将T细胞扩增至过继治疗和表位作图研究所需的水平，同时保持抗原特异性和细胞功能。
定义
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属的本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文所述类似或等同的任何方法和材料可以用于本发明的实践或测试中，但是描述了优选的方法和材料。
通常，本文所用的命名法和细胞培养、分子遗传学、有机化学和核酸化学和杂交中的实验室程序是本领域公知的和通常使用的那些。
标准技术用于核酸和肽合成。技术和程序通常根据本领域的常规方法和各种一般参考文献(例如，Sambrook和Russell，2012，Molecular Cloning，A Laboratory Approach，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY，和Ausubel et al.，2012，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，NY)，其在本文件中提供。本文使用的命名法和下面描述的分析化学和有机合成中使用的实验室程序是本领域公知的和通常使用的那些。标准技术或其修饰用于化学合成和化学分析。
如本文所使用的，以下每个术语具有与本部分相关的含义。
本文中使用的冠词“一”和“一个”是指物品的语法对象中的一个或多于一个(即至少一个)。作为示例，“一个元素”是指一个元素或多于一个元素。
当涉及诸如量、时间持续等的可测定值时，本文所使用的“关于”旨在包括±20％或±10％或±5％或±1％的变化，或者与指定值相差±0.1％，因为这样的变化适于执行所公开的方法。
当在生物体、组织、细胞或组分的上下文中使用时，术语“异常”是指在至少一种可观察或可检测的特征(例如，年龄、治疗、时间等)中与显示“正常”的生物体，组织，细胞或组分(预期)各自的特点不同的那些生物体、组织、细胞或组分等。对于一种细胞或组织类型，正常或预期的特征对于不同的细胞或组织类型可能是异常的。
如本文所用，术语“活化”是指在充分的细胞表面部分连接以诱导明显的生物化学或形态学变化之后的细胞的状态。在T细胞的上下文中，这种活化是指被充分刺激以诱导细胞增殖的T细胞的状态。T细胞的活化也可以诱导细胞因子产生和调节或细胞溶解效应子功能的表现。在其他细胞的上下文下，该术语可以推测特定物理化学过程的上调或下调。术语“活化的T细胞”表示目前正在进行细胞分裂、细胞因子产生、调节或溶细胞效应子功能的表现的T细胞和/或最近经历了“活化”的过程。
于本文的乳腺癌的“辅助治疗”是指在初次治疗(即手术)后给予的任何治疗以增加长期存活的机会。“新辅助治疗”是初治前给予的治疗。
本文所用的术语“抗原”或“ag”定义为引发免疫应答的分子。这种免疫应答可能涉及抗体产生或特异性免疫活性细胞的活化，或两者兼有。本领域普通技术人员将理解，任何大分子，包括实际上所有的蛋白质或肽，都可以用作抗原。此外，抗原可以衍生自重组或基因组DNA。技术人员将理解，包含编码引发免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA因此编码如本文所用的术语“抗原”。此外，本领域技术人员将理解，抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。很明显，本发明包括但不限于使用多于一种基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以引发所需的免疫应答。此外，本领域技术人员将理解，抗原完全不需要由“基因”编码。很明显，抗原可以产生合成或可以衍生自生物样品。这样的生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物流体。
术语“药剂”、“配体”或“结合细胞表面部分的药剂”是指结合定义的细胞群的分子。该试剂可以结合存在于靶细胞群上的任何细胞表面部分，例如受体、抗原决定簇或其它结合位点。该试剂可以是蛋白质、肽、抗体及其抗体片段、融合蛋白、合成分子、有机分子(例如小分子)、碳水化合物等。在本说明书和T细胞刺激的背景下，使用抗体和天然配体作为这些药剂的典型实例。
本文使用的术语“结合细胞表面部分的试剂”和“细胞表面部分”在配体/抗配体对的上下文中使用。因此，这些分子应被视为显示特异性结合的互补/抗互补的分子组，通常具有相对高的亲和力。
“抗原递呈细胞”(APC)是能够活化T细胞的细胞，并且包括但不限于单核细胞/巨噬细胞、B细胞和树突状细胞(DCs)。
“抗原负载APC”或“抗原脉冲APC”包括已经暴露于抗原并被抗原活化的APC。例如，APC可以在体外成为负载Ag，例如在抗原存在下培养期间。所述APC也可以通过暴露于抗原而在体内加载。传统上，“抗原负载APC”以两种方式之一制备：(1)称为抗原肽的小肽片段直接“脉冲”到APC的外部；或(2)APC与全蛋白质或蛋白质颗粒一起孵育，然后由APC摄取。这些蛋白质被APC消化成小的肽片段，并最终传输并递呈在APC表面。此外，还可以通过将编码抗原的多核苷酸引入细胞来产生抗原负载的APC。
“抗HER2应答”是针对HER2蛋白的免疫应答。
本文所用的术语“抗肿瘤效应”是指通过肿瘤体积减少、肿瘤细胞数量减少、转移数量减少、预期寿命增加而表现出的生物学效应，或改善与癌症状况相关的各种生理症状。“抗肿瘤效应”也可以通过本发明的肽、多核苷酸、细胞和抗体在首先防止肿瘤发生的能力来体现。
本文所用的术语“自身免疫疾病”定义为由自身免疫反应引起的病症。自身免疫性疾病是一种自身免疫性疾病的结果对自身抗原的不适当和过度的应答。自身免疫性疾病的实例包括但不限于、艾迪森氏病、斑秃、强直性脊柱炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性腮腺炎、克罗恩病、糖尿病(I型)、营养不良性表皮松解性大疱性炎症、附睾炎、肾小球性肾炎、格雷夫斯病、吉兰巴尔综合征、桥本病、溶血性贫血、系统性红斑狼疮、多发性硬化、重症肌无力、寻常型天疱疮、牛皮癣、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、干燥综合征、脊柱关节病、甲状腺炎、血管炎、白癜风、粘液性水肿、恶性贫血、溃疡结肠炎等。
如本文所用，术语“自体”是指引用来自相同个体的任何材料，其随后被再次引入个体。“同种异体”是指衍生自同一物种的不同动物的移植物。
本文所用的术语“B细胞”定义为源自骨髓和/或脾的细胞。B细胞可以发育成产生抗体的浆细胞。
“CD4+Th1细胞”、“Th1细胞”、“CD4+T辅助细胞1型细胞”、“CD4+T细胞”等定义为表达蛋白质CD4并产生高水平的T-辅助细胞的亚型的细胞因子IFN-γ。另见“T-辅助细胞”。
本文所用的术语“癌症”被定义为其正常对照的独特性状损失导致未调节生长、缺乏分化、局部组织侵袭和/或转移的细胞的过度增殖。癌症的例子包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌、生殖细胞肿瘤等。
如本文所用的“共刺激信号”是指与主要信号(例如TCR/CD3连接)组合的信号，导致关键分子的T细胞增殖和/或上调或下调。
如本文所用的“共刺激信号”是指与主要信号(例如TCR/CD3连接)组合的信号，导致关键分子的T细胞增殖和/或上调或下调。
“共刺激分子”是指与共刺激配体特异性结合的T细胞上的同源结合配偶体，从而介导T细胞的共刺激应答，例如但不限于增殖。
如本文所用的术语“共刺激配体”包括特异性结合T细胞上的同源共刺激分子的抗原呈递细胞(例如，树突状细胞、B细胞等)上的分子，从而提供除了由例如TCR/CD3复合物与加载有肽的MHC分子的结合提供的主要信号之外的信号介导T细胞应答，包括但不限于增殖、激活、分化等。共刺激配体可以包括但不限于CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、诱导型共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、结合Toll配体受体的激动剂或抗体和与B7-H3特异性结合的配体。
“累积应答”是指患者组的联合免疫应答，其表示为来自给定的患者组的所有6种MHC II类结合肽的的应答斑点(来自IFN-γELISPOT分析的每106个细胞的斑点形成细胞“SFC”)的总和。
术语“树突状细胞”(DC)是存在于体内、体外、离体或宿主或受试者内的或可衍生自造血干细胞或单核细胞的抗原递呈细胞。树突状细胞及其前体可以从各种淋巴器官例如脾脏、淋巴结以及骨髓和外周血分离。所述树突状细胞具有特征形态，具有在树突细胞体的多个方向上延伸的薄层(板状伪足)。通常，树突细胞表达高水平的MHC和共刺激(例如B7-1和B7-2)分子。树突状细胞可以在体外诱导T细胞的抗原特异性分化，并且能够在体外和体内引发原代T细胞应答。
“DC疫苗接种”、“DC免疫”、“DC1免疫”等是指使用自体树突状细胞来利用免疫系统识别特定分子并对其施加特异性应答的策略。
“DC-1偏振树突状细胞”、“I型树突状细胞”和“1型极化树突状细胞”是指分泌Th1驱动的细胞因子的成熟树突状细胞，如IL-12、IL-18和IL-23。I型树突状细胞完全能够促进细胞介导的免疫。在本文优选实施例中，I型树突状细胞用HER2 MHCII类结合肽脉冲。
如本文所用，“活化的树突状细胞”是暴露于Toll样受体激动剂的树突状细胞。活化的树突状细胞可以或可以不装载抗原。
本文使用的术语“成熟DC”定义为表达分子的树突状细胞，包括高水平的MHC II类、CD80(B7.1)和CD86(B7.2)。相比之下，未成熟树突状细胞表达低水平的MHC II类、CD80(B7.1)和CD86(B7.2)分子，但仍然可以占据抗原。“成熟DC”也指存在于体内、体外、离体或DC1极化(即完全能够促进细胞介导的免疫)的宿主或受体中存在的抗原呈递细胞。
“疾病”是动物的健康状态，其中动物不能维持体内平衡，并且其中如果疾病没有改善，则动物的健康继续恶化。
动物中的“病症”是动物能够维持体内平衡的健康状态，但其中该动物的健康状况比不存在该疾病时更不利。未经治疗的疾病不一定会导致动物健康状况的进一步下降。
如果患者经历的疾病或病症的至少一种症状或症状的严重性或频率降低，疾病或病症就会“缓解”。
“有效量”或“治疗有效量”在本文中可互换使用，并且是指达到特定生物学结果的本文所述的化合物、制剂、材料或组合物的量。这样的结果可以包括但不限于通过本领域适合的任何方法测定的病毒感染的抑制。
如本文所用，“内源性”是指来自生物体、细胞、组织或系统内的任何物质。如本文所用，术语“外源性”是指从生物、细胞、组织或系统引入或产生的任何材料。
本文所用的术语“表位”被定义为可引起免疫应答，诱导B和/或T细胞应答的抗原上的小化学分子。抗原可以具有一个或多个表位。大多数抗原具有许多表位；即它们是多价的。通常，表位大小为大约5个氨基酸和/或糖。本领域技术人员理解，通常总体三维结构而不是分子的特定线性序列是抗原特异性的主要标准，因此将一个表位与另一个区分开。
“HER2”是人类表皮生长因子受体(“EGFR”)家族的成员。HER2在大约20-25％的人乳腺癌中过表达，并在许多其他癌症中表达。
“HER2结合肽”、“HER2 MHC II类结合肽”、“结合肽”、“肽抗原”、“HER2肽”、“免疫原性MHC II类结合肽”、“抗原结合肽”、“HER2表位”、“活性肽”等是指源自或基于HER2/neu蛋白的序列的MHC II类肽，是在所有人类乳腺癌及其等同物中约2025％发现的一种靶点。HER2细胞外结构域“ECD”是指HER2的结构域，其在细胞外，或者锚定于细胞膜或循环中，包括其片段。HER2细胞内结构域“ICD”是指细胞胞质内的HER2/neu蛋白的结构域。根据优选实施例，HER2表位或其它结合肽包含6种HER2结合肽，其包括3种HER2 ECD肽和3种HER2 ICD肽。优选的HER2 ECD肽包含：肽42-56:HLDMLRHLYQGCQVV(SEQ ID NO:1)；肽98-114:RLRIVRGTQLFEDNYAL(SEQ ID NO:2)；和肽328-345:TQRCEKCSKPCARVCYGL(SEQ ID NO:3)；优选的HER2 ICD肽包含：肽776-790:GVGSPYVSRLLGICL(SEQ ID NO:4)；肽927-941:PAREIPDLLEKGERL(SEQ ID NO:5)；和肽1166-1180:TLERPKTLSPGKNGV(SEQ ID NO:6)。
HER2pos”是一种乳腺癌的分类或分子亚型以及许多其他类型的癌症。HER2阳性目前通过FISH(荧光原位杂交)测定的基因扩增和2+或3+的病理染色强度来定义。
“HER2neg”是由FISH缺乏基因扩增定义的，并且在大多数情况下可以涵盖从0到2+的病理染色范围。本文所用的“同源”是指两个聚合物分子之间的亚基序列相似性，例如两个核酸分子，例如两个DNA分子或两个RNA分子，或两个多肽分子之间的亚单位序列相似性。当两个分子中的两个分子中的亚基位置被相同的单体亚基占据时，例如，如果两个DNA分子的每个位置被腺嘌呤占据，那么它们在该位置是完全的或100％同源的。两个序列之间的同源性百分比是匹配或同源位置的数量的直接函数，例如，如果两个化合物序列中位置的一半(例如，聚合物中的五个位置，长度的十个亚基中的五个位置)是同源的，则两个序列是50％相同，如果90％的位置，例如10个中的9个匹配或同源，则两个序列具有90％的同源性。举例来说，DNA序列5'ATTGCC3'和5 ATGGC3'具有50％的同源性。
此外，当术语“同源性”或“同一性”在本文中用于指核酸和蛋白质时，应理解为应用于核酸和氨基酸序列水平的同源性或同一性。
本文所用的术语“抑制”是指抑制或阻断活性或功能，例如相对于对照值的约百分之十。优选地，与对照值相比，活性被抑制或阻断50％，更优选75％，甚至更优选95％。如本文所用，“抑制”也意指通过可测量的量减少分子、反应、相互作用、基因、mRNA和/或蛋白质的表达、稳定性、功能或活性或完全阻止。抑制剂是例如结合、部分或完全阻断刺激、减少、预防、延迟激活、失活、脱敏或下调蛋白质、基因和mRNA稳定性、表达、功能和活性的化合物，例如拮抗剂。
如本文所使用的，“教学材料”包括可用于传达本发明的组合物和方法的有用性的出版物、记录、图表或任何其他表达介质。本发明的试剂盒的说明材料可以例如被固定在含有本发明的核酸、肽和/或组合物的容器中，或与包含核酸、肽和/或组合物的容器一起运输。或者，教学材料可以与容器分开运输，意图是教学材料和化合物由接收者协同使用。
白细胞介素2(“IL-2”或“IL2”)是白细胞介素，是免疫系统中的一种细胞因子信号分子。IL2是主要的T细胞生长和增殖因子。
白细胞介素7(“IL-7”或“IL2”)是由淋巴结中的间质上皮细胞产生的造血生长因子。IL-7对于淋巴细胞增殖和存活至关重要。
白细胞介素15(“IL-15”或“IL2”))是T细胞生长激活和存活因子。IL-15由成纤维细胞，树突状细胞和巨噬细胞产生。
“分离”是指从自然状态改变或移除。例如，天然存在于活体动物中的核酸或肽不是“分离的”，但与其天然状态的共存材料部分或完全分离的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以基本上纯化的形式存在，或可以存在于非天然环境中，例如宿主细胞。
本文所用的“加载”肽是指在MHC分子的上下文中呈递抗原。
本文使用的术语“主要组织相容性复合物”或“MHC”被定义为特异基因簇，许多这些基因簇编码抗原递呈中涉及的与进化相关的表面蛋白，这些表面蛋白是组织相容性中最重要的决定因素。I类MHC，或MHC I类主要在向CD8T淋巴细胞的抗原递呈中起主要作用。II类MHC或MHC II类主要在向CD4+T淋巴细胞的抗原递呈中起主要作用(T-辅助细胞)。
本文使用的“成熟DC”意思是表达包括高水平II类MHC，CD80(B 7.1)和CD86(B7.2)分子的树突状细胞。相反地，未成熟的树突状细胞(“iDCs”或“IDCs”)表达低水平的II类MHC，CD80(B7.1)和CD86(B7.2)分子，然而依旧能摄取抗原。“成熟DC”也指存在于体内，体外，离体，或在宿主或者是受试者内的抗原递呈细胞，也可以是极化的DC 1(即，其完全能够促进细胞-介导免疫)。
CD4+Th1应答(或Th1应答)的“度量”通过为每个受试组分析抗HER2 CD4+Th1免疫应答来定义：(1)整体抗HER2应答率(以应答＞1种反应肽的受试者的百分比表示)；(2)应答组库(以被每个受试组识别的反应肽的平均数量(n)表示)；和(c)累积应答(以来自每个受试组的6种II类MHC结合肽的全部反应斑点(来自IFN-γELISPOT分析的每106细胞的斑点形成细胞“SFC”)的全部数量来表示。
本文所用的术语“调节”是指在受试者中与在不存在治疗或化合物的情况下的受试者的应答水平相比和/或与其他相同但未经治疗的受试者应答水平相比，可调查受试者的应答水平的可检测的增加或降低。该术语包括扰乱和/或影响天然信号或应答，从而在受试者，优选人中介导有益的治疗应答。
“非可疑HER2neg”被定义为非-基因扩增和0或1+病理学染色。“可疑HER2neg”被定义为非-基因扩增，但在病理学染色为2+。
如本文所用，“群体”包括提及包含同源的、基本同源的或异类的细胞培养物的分离培养物。一般而言，“群体”也可以被视为“隔离”的细胞培养物。
如本文所用，“重组细胞”是包含重组多核苷酸的宿主细胞。
“应答率”或“抗-HER2应答率”在这里可交换使用，意思是对6种结合肽中的至少1种应答的受试者百分数。
“应答组库”被定义为被每个受试组识别的反应肽的平均数量(“n”)。
本文所使用的“样本”或“生物样本”意思是来自受试者的生物材料，包括但不限于器官、组织、外来体、血液、血浆、唾液、尿液和其他体液。样本可以是来自受试者的任何来源的材料样本。
本文使用的术语“特异性结合”是指识别并结合另一个分子或特征，但基本上不识别或结合样品中的其它分子或特征的分子，例如抗体。
术语“刺激”是指由刺激分子与其同源配体结合诱导的主要应答，从而介导信号转导事件，例如但不限于通过TCR/CD3复合物的信号转导。刺激可以介导某些分子的改变的表达，例如TGF-β的下调和/或细胞骨架结构的重组等。
本文所用的“刺激性配体”是指当存在于抗原呈递细胞(例如树突状细胞、B细胞等)上的配体可以与同源结合配偶体(本文称为“一种“刺激分子”)，从而介导T细胞的主要应答，包括但不限于激活，免疫应答的启动，增殖等。
如本文所用的术语“刺激分子”是指与存在于抗原呈递细胞上的同源刺激配体特异性结合的T细胞上的分子。
术语“受试者”、“患者”、“个体”等在这里可交换使用，指的是适用于在这里描述的方法的任何动物，或其无论在体外或在原位的细胞。在某种非限制实施例中，患者、受试者或者个体是人类。
如本文所用，“基本上纯化的”细胞是基本上不含其它细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞还指已经与其天然存在状态通常结合的其它细胞类型分离的细胞。在一些情况下，基本上纯化的细胞群体是指同源的细胞群。在其他情况下，该术语简称为已经与其天然状态相关联的细胞分离的细胞。在一些实施例中，细胞在体外培养。在其他实施例中，细胞不在体外培养。
本文所使用的术语“靶向治疗”指的是使用药物或其他物质的癌症治疗，所述药物或其他物质干扰通常涉及癌症细胞生长的特异靶分子，而对正常细胞几乎没有损害以实现抗肿瘤的作用。相反地，常规的细胞毒素化学疗法药物，针对所有正在分裂的细胞。在乳腺癌治疗单克隆抗体中，特别是其以HER2/neu受体作为目标。
“T/C”被定义为曲妥单抗和化学疗法。这指的在乳腺癌手术之前/之后接受曲妥单抗和化学疗法二种治疗的患者。
本文所使用的术语“T-细胞”被定义为在许多细胞-介导免疫反应中参与的胸腺来源的细胞。
本文所使用的术语“T-辅助细胞”、“辅助T细胞”、“Th细胞”等参照细胞表示能被本领域技术人员识别的包括不同细胞类型的淋巴细胞亚组(一种白血细胞或白血球)。特别地，T-辅助细胞是主要功能为促进其他B和T淋巴细胞和/或巨噬细胞的活化和发挥作用的T-效应细胞。辅助T细胞分化为“Th1”或“1型”和“Th2”或“2型”表型的两大细胞亚型。这些Th细胞分泌细胞因子、蛋白质或肽，所述细胞因子、蛋白质或肽刺激其他白血球或与其他白血球相互作用。这里使用的“Th1细胞”、“CD4+Th1细胞”、“CD4+1型T-辅助细胞”、“CD4+T细胞”等指的是已经表达表面糖蛋白CD4的成熟的T-细胞。当用肽抗原将CD4+T-辅助细胞通过在如树突状细胞的抗原-递呈肽(“APCs”)表面表达的II类MHC分子进行递呈时，CD4+T-辅助细胞被激活。一旦通过MHC-抗原复合物将CD4+T辅助细胞激活，CD4+T辅助细胞分泌高水平的如干扰素-γ(“IFN-γ”)的细胞因子。此细胞被认为高效地针对某些在宿主细胞内生存的引起疾病的细菌，并在人类癌症的抗癌应答中至关重要。
术语“细胞毒性T细胞”或“CD8+T细胞或”杀伤T细胞“是杀死靶细胞的T淋巴细胞，例如癌细胞，被感染的细胞或以其它方式损伤的细胞。
本文所使用的“Treg”、“Treg”和“调节性T细胞”指的是免疫系统的警察，用来调节免疫系统抗癌活性。其在某些癌症中会增加，其是在这些癌症类型中对免疫疗法产生抗性的中介物。
本文所用的术语“治疗性”是指治疗和/或预防。通过抑制、缓解或消除疾病状态获得治疗效果。
本文所使用的“治疗有效量”指的是本发明的化合物的数量，当给药患者时，改善疾病的症状。本发明的构成“治疗有效量”的化合物的数量会根据化合物、疾病状态及其严重性、被治疗患者的年龄等而变化。治疗有效量是通过一个本领域技术人员参考他自己的知识以及此发明来常规确定。
本文所使用的术语“治疗”指的是这里描述的治疗或预防措施。“治疗”方法采用对需要本发明中的治疗、组合物的受试者采取措施的方式，例如，受疾病或失调折磨的受试者，或最终可能获得此疾病或失调的受试者，为了预防、治疗、延期、降低严重性或改善一种多种失调或复发失调的症状，或者延长受试者的存活使其超出不施用此治疗时的预期存活。
本文所使用的术语“疫苗”被定义为被用来向动物，优选哺乳动物，更优选人类施用后引起免疫应答的物质。一旦引入受试者体内，疫苗可以引起免疫应答，该免疫应答包括但不限于，抗体生产，细胞因子和/或其他细胞应答。
范围：贯穿本发明，实施例的不同方面可以通过一个范围形式来表示。应该理解的是范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并不应该被解释为对实施例范围的刻板的限定。因此，范围的描述应该被认为已经明确公开所有可能的子范围以及在所述范围内的所有可能个体数值。例如，从1到6的范围的描述应该被认为已经具体公开了例如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等的子范围，以及在所述范围内的个体数值，例如1，2，2.7，3，4，5，5.3和6。无论所述范围的宽度如何，此解释都适用。具体描述
本发明涉及复制淋巴结的环境，用于产生用于过继治疗的治疗量的T细胞。T细胞也可用于鉴定靶抗原上的表位，以促进肽基疫苗的生产。
在一个实施例中，本发明提供复制淋巴结的环境的体外环境。在一个实施例中，淋巴结的复制包括向培养条件中提供一种或多种以下元素：1型树突状细胞、IL-15、IL-7和IL-2。
1型树突细胞过程，并将肽抗原呈递给T细胞，并提供所谓的“共刺激分子”，包括表达CD80和CD86(与T细胞上的CD28反受体结合)以及CD40(其与CD40L在T细胞上相互作用)。此外，树突状细胞产生可溶性因子，例如支持长寿命(抗凋亡因子)以及干扰素-γ产生(T细胞功能)的白细胞介素-12(IL-12)。树突状细胞产生许多其他对T细胞发育至关重要的因素。树突状细胞通常存在于淋巴结中，对于T细胞的活化和扩增是重要的。
IL-15是T细胞生长激活和存活因子。IL-15由成纤维细胞、树突状细胞和巨噬细胞产生。
IL-7是淋巴结间质上皮细胞产生的一个因子。IL-7对于淋巴细胞增殖和存活至关重要。
IL2是主要的T细胞生长和增殖因子。
因此，本发明提供用于组合细胞因子和树突状细胞的类型以产生期望的T细胞的组合物和方法。在一个实施例中，将T细胞扩增至过继治疗和表位作图研究所需的水平，同时保持抗原特异性和细胞功能。一方面，本发明涉及具有残留疾病的HER2+侵袭性乳腺癌(“IBC”)患者在新辅助化疗后具有抗HER2 1型T辅助细胞(Th1)细胞免疫缺陷和复发性疾病的重大风险的发现。它在Datta等示出抗HER2 CD4+T细胞应答沿着乳腺癌连续统计健康供体和良性疾病患者的健康应答逐渐减少，HER2+导管原位癌患者的下降应答以及HER2+IBC患者几乎无应答。本文探讨了(A)辅助1型极化树突状细胞(“DC1”)疫苗接种的作用和(B)扩增抗原特异性T细胞用于过继T细胞转移，以恢复抗HER2 Thl免疫力的方法。
本实施例还涉及在体外创建用于抗原特异性CD4+或CD8+T细胞的扩增培养的微环境的方法。扩增的抗原特异性T细胞可以用于各种治疗和研究目的，例如用于癌症或感染性疾病如慢性病毒感染的过继性T细胞治疗的其他条件和/或用于鉴定靶抗原上的表位以促进基于肽的疫苗的生产。
在一个实施例中，本发明包括使用自体I型树突状细胞(“DC Is”)与蛋白质或肽抗原结合以在体外刺激T细胞。刺激后，将至少两种可溶性因子(例如细胞因子)加入到T细胞中。在一些情况下，至少两种可溶性因子是白细胞介素-7(“IL-7”)和白细胞介素-15(“IL-15”)。将可溶性因子加入T细胞后，再加入T细胞生长因子。在一些情况下，T细胞生长因子是白细胞介素-2(“IL-2”)。除了由I型树突状细胞天然产生的那些之外，可溶性因子支持T细胞的增殖和获取/维持的功能。这种刺激过程可以在每周循环中重复，直到T细胞具有足够数量用于治疗或表位扫描/作图。在某些实施例中，将T细胞扩增至过继治疗和表位作图研究所需的水平，同时保持抗原特异性和细胞功能。
体内对HER-2脉冲I型树突状细胞疫苗接种的应答：IBC患者抗HER2CD4+Th1应答的 恢复
除了Datta等所教导的鉴定HER2pos-乳腺癌肿瘤发生连续体之间的抗HER2 CD4+Th1应答的进一步丧失之外，HER2pos浸润性乳腺癌中下调的抗HER2 Th1的应答在HER2脉冲型-1偏振树突状细胞(“DC1”)接种后有差异地恢复。使用曲妥珠单抗和化学疗法(“T/C”)或通过其他标准疗法(如手术切除或放射)进行HER2靶向治疗后，下调应答未恢复。恢复的抗HER2 Th1应答似乎耐久至少约六个月或更长时间。
新辅助治疗后具有残留疾病的HER2+IBC患者接受了辅助性HER2脉冲I型树突状细胞疫苗。使用HER2 II类肽肽脉冲的PBMC产生免疫应答，通过ELISPOT测定IFN-γ的产生。对CD4+Th1应答的三个指标进行应答评估：(1)总体抗HER2应答率(应答>1肽)，(2)反应肽数(应答组库)和(3)累积应答6种HER2肽。接种前Th1应答与接种3个月和6个月后的应答进行了比较。
Datta等描述了制备I型树突状细胞疫苗的方法。另见Koski，G.K.,等，J.Immonother.35(1)：54(2012)(“Koski等”)；Sharma，A.，等，Cancer 118(17)：4354(2012)(“Sharma等”)；Fracol，M.，等，Ann.Surg.Oncol.20(10)：3233(2013)；Lee，M.K.4th，等，Expert Rev.8(11)：e74698(2013)；Czerniecki，B.J.，等，Cancer Res.67(4)：1842(2007)；Czerniecki，B.J.等，Cancer Res.67(14)：6531(2007)；和美国公开申请US 2013/0183343A1。简言之，首先通过白细胞分离和淘洗将患者的单核细胞与其他白细胞分离。然后将这些单核细胞在含有粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)和白介素(“IL”)-4的无血清培养基(“SFM”)中培养成未成熟树突状细胞(“iDC”)。然后这些细胞优选用六种HER2 MHCII类结合肽进行脉冲，在本例中，由SEQ ID NO：1-6鉴定的结合肽，然后是干扰素(“IFN”)-γ和脂多糖(“LPS”)被添加以完成成熟和激活过程，以在注射到患者体内之前实现树突状细胞激活为I型树突状细胞。参见，Fracol，M.，等，Ann.Surg.Oncol.20(10):3233(2013)。至于HLA-A2pos患者，有一半的细胞与I类MHC结合肽进行脉冲，另外一半细胞与不同的MHC1类结合肽进行脉冲。
Datta等还描述了产生循环抗癌CD4+Th1应答(即IFN-γ分泌)的血液检测/测定，并且检测和测定所得的IFN-γ的生成量。在I型树突状细胞疫苗接种前和接种3个月和6个月后进行此类血液检查。在优选实施例中，基于受试者所患癌症的类型，用MHC II类免疫原性肽脉冲含有CD4+Th1细胞和抗原递呈细胞或其前体的受试血液样品，其能够在所述受试者中诱导免疫应答。优选地，抗原递呈细胞或其前体是成熟或未成熟的树突状细胞或其单核细胞前体。在特别优选的实施例中，癌症优选为表达HER2，哺乳动物受试者优选为人，更优选癌症为HER2pos乳腺癌，并且人类受试者是女性。
提供了一个优选实施例，用于通过从受试者中分离未预期的外周血单核细胞(“PBMC”)并且用包含HER2衍生的MHCII类抗原结合肽的组合物脉冲PBMCs，以在哺乳动物受试者中产生循环抗HER2 CD4+Th1应答，其中，该结合肽能够在受试者中产生免疫应答。不希望受任何特定理论的束缚，当将结合肽递呈于存在于PBMC样品中的CD4+Th1细胞时，它们激活CD4+Th1细胞，并且活化的CD4+Th1细胞产生干扰素-γ(“IFN-γ”)。衍生自受试者PBMC样品中包含的前体多能单核细胞的I型树突状细胞(I型偏振树突状细胞)是抗原递呈细胞(“APC”)，其在暴露于结合肽时变成负载有抗原的APC，其将MHC II类抗原结合肽递呈至样本中受试者的CD4+Th1细胞，由此激活CD4+Th1细胞以产生/分泌IFN-γ。随后测定由此产生的IFN-γ用于分析。
在本例中，根据该优选实施例，每个患者的PBMC用6种HER2特异性MHC II类肽，特别是具有SEQ ID NO：1-6所示序列的那些肽进行脉冲。通过IFN-γ酶联免疫斑(“ELISPOT”)检测法检测抗HER2 CD4+Th1细胞产生的IFN-γ。
在HER2pos癌症的特别优选的实施例中，树突状细胞、未成熟或1型偏振I型树突状细胞用能够在患者中产生免疫应答的包含由HER2衍生或基于HER2的6种MHC II型结合肽的组合物进行脉冲。HER2 MHCII类结合肽或表位包括：
肽42-56:HLDMLRHLYQGCQVV(SEQ ID NO:1)；
肽98-114:RLRTVRGTQLFEDNYAL(SEQ ID NO:2)；
肽328-345:TQRCEKCSKPCARVCYGL(SEQ ID NO:3)；
肽776-790:GVGSPYVSRLLGICL(SEQ ID NO:4)；
肽927-941:PAREIPDLLEKGERL(SEQ ID NO:5)；和
肽1166-1180:TLERPKTLSPGKNGV(SEQ ID NO:6)。
在实施例中，在供体具有A2.1血型HER2 MHC I类肽或表位包括：
肽369-377:KIFGSLAFL(SEQ ID NO:7)；和
肽689-697:RLLQETELV(SEQ ID NO:8)。
Datta等还描述了替代的优选实施例，通过将来自受试者血液样本内的预先未受刺激的纯化的CD4+T-细胞与自体未成熟或成熟的树突状细胞(“iDCs”或“成熟的树突状细胞”)共培养，在哺乳动物受试者内产生循环抗HER2 CD4+Th1应答，所述自体未成熟或成熟的树突状细胞是经过包括能够在受试者内产生免疫应答的、HER2-来源的II类MHC抗原结合肽的组合物脉冲的。不期望受任何具体理论的束缚，当结合肽被递呈到存在于T细胞样本中的CD4+Th1细胞时，它们激活CD4+Th1细胞并且此活化的CD4+Th1细胞产生/分泌干扰素-γ。未成熟的树突状细胞成熟到I型树突状细胞，其将II类MHC结合肽递呈到存在于样本中的受试者的CD4+Th1细胞从而激活CD4+Th1细胞产生IFN-γ，并随后进行测量以用于分析。
在受试者内产生抗-HER2免疫应答的两个可选的优选实施例中，抗-HER2 CD4+Th1细胞分泌的IFN-γ通过IFN-γ酶联免疫斑点法("ELISPOT")进行检测和测定，本领域技术人员应该知道可能使用其他方法进行检测。例如，可以使用流式细胞术，酶联免疫吸附测定(“ELISA”)和免疫荧光(“IF”)来监测免疫应答。可选地，与直接IFN-γ检测，例如示出全部CD4+细胞斑点的ELISPOT形成对照或者在此之外，在患者免疫监测的例子中，测定IFN-γ对IL-10的比例是有利的。这些检测尤其对于具有风险的患者是有利的。进一步，免疫荧光的应用通过使用以荧光来阅读结果的ELISPOT阅读器提供了测定和显现免疫应答的其他方法。在这样的实例中，结果能够被安排示出2，3种或更多的细胞因子/其他分泌的免疫分子，在相同的患者样本中每个结果用不同的颜色示出。在本例中，使用IFN-γELISPOT。
尽管目前优选的实施例是以六种HER2 II类MHC结合肽/抗原决定簇为特征，其他可能的HER2II类MHC肽可以用在目前的实施例中，因为整个HER2分子的任何组分只要其在患者体内有充分的免疫活性就可以作为其他结合肽的来源。
应答率：接种疫苗前，只有一名IBC患者产生免疫应答，在减去未刺激的背景后，在实验孔中定义为>20SFC/106细胞。与接种疫苗前的结果相比，所有接种疫苗的IBC患者产生免疫应答，定义为抗HER2 IFN-γposThl应答增加>2倍。
应答组库：图1示出了在IBC患者中，平均应答组库从接种前0.5±1种肽增加到3.25±0.96种肽，接种后6个月时增加4±0.8种肽(p＝0.01)。
累积应答：图2示出了疫苗接种后3个月(p＝0.04)，患者平均累积应答从36.5±38.3SFC/106接种前改善至151.0±60.0SFC/106，并在疫苗接种后6个月(p＝0.02)改善至198.4±39.7SFC/106。
除了乳腺癌，还有许多其他的HER2pos实体癌，例如，脑癌、膀胱癌、食管癌、肺癌、胰腺癌、肝脏癌、前列腺癌、卵巢癌、大肠癌和胃癌，以及其他癌，在这里描述的实施例中的物质和方法可以用于诊断和治疗上述癌症。因此，上述描述的六种抗HER2结合肽可以根据本文实施例进行使用，从而产生能够检测的免疫应答，并且上述描述的六种抗HER2结合肽对这些和其他表达HER2癌症的诊断是有用的。
可以通过使用上述描述的同样的抗-HER2结合肽或采用具有免疫原性的任何HER2组合物，例如DNA、RNA、肽或蛋白质或例如ICD和ECD结构域的组分来开发疫苗，所述疫苗以表达HER2的肿瘤为靶向物。例如，受试者可以接种针对可用来检测患者免疫应答的全HER2蛋白和六种上述参考结合肽的疫苗。也可以为其他类型的癌症开发类似的疫苗，例如包括HER1、HER3和c-MET的HER2家族的其他成员。
尽管现有的优选实施例旨在治疗和诊断女性的HER2pos乳腺癌，本领域技术人员应该很容易的理解到，本实施例不限于女性。目前的优选实施例包括男性，例如，表达HER2的前列腺癌，还包括其他哺乳动物受试者。
经确定的抗HER2 CD4+Th1应答的衰减使以下情况实现，在所述血液测验中产生的检测到的免疫应答只作为癌症诊断/应答的预测，如本文的例子，同时使用专门的疫苗来恢复患者的免疫反应。与依赖肿瘤细胞鉴定的诊断和治疗方法截然相反，本文描述的优选实施例将癌症诊断和治疗的重点转移到患者免疫力和血液测验的使用上，以以确定和/或预测针对癌症的免疫应答，包括具有复发风险的患者。
HER2特异性TH1细胞的体外扩增
在体外，HER2特异性Th1细胞通过与HER2肽脉冲I型树突状细胞共培养产生，并使用单独的IL-2或IL-2、IL-7和IL-15扩增。随后，通过重复HER2-肽脉冲I型树突状细胞共培养或通过抗CD3/CD28刺激来扩增Th1细胞。扩增倍数定义为：(扩增后的T细胞数量/扩增前的T细胞数量)；通过ELISA测定抗原特异性IFN-γ产生的特异性。
与T细胞扩增相关的本文实施例决不限于CD4+T细胞。因此，本文实施例提供了用于生长嵌合抗原受体T细胞(“CART细胞”)、细胞毒性T淋巴细胞(CD8+)以及所有其它种类的T细胞的方法。参见，例如，Datta，J.，等，"CD4+T-helper Type 1Cytokines和TrastuzumabFacilitate CD8+T-cell Targeting of HER-2/neuexpressing Cancers"CancerImmunol.Res.(2015)。
本实施例涉及复制淋巴结的环境，用于产生治疗量的抗原特异性T细胞、辅助细胞(CD4+)或细胞毒性(CD8+)，用于癌症或其他病症的过继性治疗。扩增的抗原特异性T淋巴细胞也可用于鉴定靶抗原上的表位以促进基于肽的疫苗的生产。
本文实施例提供了复制淋巴结的环境的体外环境。在该实施例中，淋巴结的复制包括向培养条件中提供一种或多种以下元素：1型树突状细胞、IL-15、IL-7和IL-2。
1型树突细胞过程，并将肽抗原递呈给T细胞，并提供所谓的“共刺激分子”，包括表面表达的CD80和CD86(与T细胞上的CD28反受体结合)以及CD40(其与CD40L相互作用)。此外，树突状细胞产生可支持长寿命(抗凋亡因子)以及IFN-γ产生(T细胞功能)的可溶性因子如白细胞介素-12(“IL-12”)。树突状细胞产生许多其他对T细胞发育至关重要的因素。树突状细胞通常存在于淋巴结中，对于T细胞的活化和扩增是重要的。
IL-15是T细胞生长激活和存活因子。IL-15由成纤维细胞、树突状细胞和巨噬细胞产生。
IL-7是淋巴结中间质上皮细胞产生的一个因子。IL-7对于淋巴细胞增殖和存活至关重要。
IL2是主要的T细胞生长和增殖因子。
因此，实施例提供了用于组合特定细胞因子和类型的树突状细胞的组合物和方法，同时也使用特定的淋巴细胞添加的时序和序列以产生期望的T细胞。在优选的实施例中，将T细胞扩增至过继治疗和表位作图研究所需的水平，同时保持抗原特异性和细胞功能。
T细胞来源
在扩增之前，从受试者获得T细胞源。受试者的实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。优选地，受试者是人。T细胞可以从许多来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脾组织和肿瘤。在本发明的某些实施例中，可以使用本领域可用的任何数量的T细胞系。在某些实施例中，可以使用本领域技术人员已知的任何技术如聚蔗糖(Ficoll)分离法从受试者收集的单位血液获得T细胞。在一个优选实施例中，通过单采或白细胞分离获得来自个体的循环血液的细胞。单采制品通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一个实施例中，可以洗涤通过单采采集收集的细胞以除去血浆部分并将细胞置于合适的缓冲液或培养基中用于随后的加工步骤。在一个实施例中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在替代的实施例中，洗涤溶液缺乏钙并且可能缺少镁，或者可能缺少许多(如果不是全部)二价阳离子。洗涤后，细胞可以重新悬浮在各种生物相容的缓冲液中，例如不含Ca的无Mg的PBS。或者，可以除去单采样品的不期望的组分，并将细胞直接重悬浮于培养基中。
在另一个实施例中，例如通过PERCOLLTM梯度离心，通过裂解红细胞并消耗单核细胞从外周血中分离T细胞。或者，可以从脐带分离T细胞。无论如何，可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离特异性T细胞亚群。
可以使用针对负选择细胞特有的表面标记的抗体的组合来实现通过阴性选择来富集T细胞群。优选的方法是通过负磁性免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，其使用针对存在于负选择的细胞上的细胞表面标记的单克隆抗体混合物。例如，为了通过阴性选择来富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。
为了通过阳性或阴性选择分离所需的细胞群，可以改变细胞和表面的浓度(例如颗粒如珠粒)。在某些实施例中，可能需要显著降低其中珠粒和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠粒的最大接触。例如，在一个实施例中，使用浓度为20亿个细胞/ml。在另一个实施例中，使用10亿个细胞/ml的浓度。在一个实施例中，使用大于1亿个细胞/ml。在另一个实施例中，使用1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000万个细胞/ml的细胞浓度。在另一个实施例中，使用0.75、0.8、0.85、0.9、0.95或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在另外的实施例中，可以使用1.25或1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可导致细胞产量增加、细胞活化和细胞扩增。
用于刺激的T细胞也可以在洗涤步骤后冷冻，其不需要单核细胞去除步骤。虽然不希望受理论束缚，但是冻结和随后的解冻步骤通过在细胞群中除去粒细胞和某种程度的单核细胞来提供更均匀的产物。在清除血浆和血小板的洗涤步骤之后，细胞可以悬浮在冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数是本领域已知的，并且在本文中将是有用的，但在非限制性实例中，一种方法包括使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白或其它合适细胞冷冻培养基的PBS。然后将细胞以每分钟1°的速度冷冻至-80℃并储存在液氮储罐的气相中。可以使用其他控制冷冻方法，也可以立即在-20℃或液氮中进行不受控制的冷冻。
T细胞的活化和扩增
通常，本发明的T细胞在复制淋巴结的条件下扩增。在一个实施例中，淋巴结的复制包括向培养条件中提供一种或多种以下元素：1型树突状细胞，IL-15、IL-7和IL-2。在一个实施例中，抗原特异性T细胞可以在一种或多种1型树突状细胞、IL-15、IL-7和IL-2的存在下扩增。
在一个实施例中，可以如本文所述刺激T细胞，例如通过与树突状细胞接触。树突状细胞能够向T细胞提供共刺激分子。T细胞与树突状细胞接触后，在IL-15、IL-7和IL-2的存在下培养T细胞。
在一些情况下，所述T细胞与包含树突状细胞、IL-15、IL-7和IL-2中的一种或多种的混合物共培养。在本发明的一个实施例中，混合物可以培养数小时(约3小时)至约14天，或之间的任何小时整数值。在另一个实施例中，可以将混合物培养21天。在一个实施例中，将T细胞培养约8天。在本发明的一个实施例中，将所述T细胞共培养2-3天。也可能需要几个刺激周期，使得T细胞的培养时间可以为60天或更长。适用于T细胞培养的条件包括可能含有增殖和生存所必需的因子(如血清(如胎牛或人血清)的合适培养基(如最简必需培养基或RPMI培养基1640或无血清培养基15)、白细胞介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α或对于本领域技术人员已知的细胞生长的任何其它添加剂。用于细胞生长的其它添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉和还原剂如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。
培养基可以包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、无血清培养基15和无血清培养基20，优化剂，添加氨基酸、丙酮酸钠和维生素，无血清或补充适量的血清(或血浆)或限定的一系列激素，和/或一定量的足以使T细胞生长和扩增的细胞因子。抗生素例如青霉素和链霉素仅包括在实验培养物中，而不是在要注入受试者的细胞的培养物中。靶细胞保持在支持生长所必需的条件下，例如适当的温度(例如37℃)和环境(例如，空气加5％的CO2)。
在一个实施例中，将T细胞扩增至过继治疗和表位作图研究所需的水平，同时保持抗原特异性和细胞功能。因此，任何细胞数量都在本发明的上下文中。通过本发明的方法刺激的细胞被激活，如信号转导的诱导、细胞表面标记的表达和/或增殖所示。适用于T细胞的一种这样的标记物是IFN-γ产生，其是重要的免疫调节分子。IFN-γ的产生对扩增免疫应答是非常有益的。
关于T细胞，根据所使用的条件，由本文所述的各种扩增方法产生的T细胞群可以具有各种特异性表型性质。这种表型性质包括增强CD25、CD154、IFN-γ和GM-CSF的表达，以及CD137、CD134、CD62L和CD49d的表达改变。差异控制这些部分表达的能力可能非常重要。例如，通过与在抗原递呈细胞(例如树突状细胞、单核细胞、甚至白血病B细胞或淋巴瘤)上表达的CD40分子的接触，在“定制的T细胞”上CD154的更高水平的表达表达将增强抗原递呈和免疫功能。各种公司目前正在采用这些策略，通过抗体或重组CD40L连接CD40。本文描述的方法允许以更生理的方式例如由T细胞递送相同的信号。通过调整T细胞激活过程增加IFN-γ分泌的能力可以有助于促进Th1型免疫应答的产生，对于抗肿瘤和抗病毒反应是重要的。如CD154所示，GM-CSF的增加的表达可以用于增强APC功能，特别是通过其对促进APC祖细胞成熟为更多功能上具有能力的APC(例如树突状细胞)的作用。改变CD137和CD134的表达可影响T细胞抗凋亡或对凋亡信号敏感的能力。控制粘附/归巢受体如CD62L和/或CD49d和/或CCR7的表达可以确定输注的T细胞回到淋巴器官、感染部位或肿瘤部位的能力。
可以通过多种方法监测本发明T细胞群体的表型性质，包括本领域技术人员已知的标准流式细胞术方法和ELISA方法。
本领域普通技术人员将容易理解，本文所述的细胞刺激方法可以在各种环境(即，容器)中进行。例如，这样的容器可以是培养瓶、培养袋或能够支持细胞的任何容器，优选在无菌环境中。在一个实施例中，本发明的生物反应器也是有用的。例如，几个制造商目前制造可用于生长细胞的装置并与本发明的方法组合使用。参见例如，Celdyne Corp.，Houston，TX；Unisyn Technologies，Hopkinton，MA；Synthecon，Inc.，Houston，TX；AastromBiosciences，Inc.，Ann Arbor，MI；Wave Biotech LLC，Bedminster，NJ。此外，涵盖这种生物反应器的专利包括美国专利号6,096,532、5,985,653、5,888,807和5,190,878，其通过引用并入本文。
在一个实施例中，使用具有基础摇臂平台的生物反应器，例如“The Wave”(WaveBiotech LLC，Bedminster，NJ)，其允许摇摆的变化速率和各种不同的摆动角度。本领域技术人员将认识到，任何允许针对细胞的最佳扩展的适当运动的平台都在本文发明的上下文中。在某些实施例中，本发明的刺激和膨胀方法提供了在培养过程中摇摆培养容器，所述方法是在每分钟摇摆1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20次。在某些实施例中，本发明的刺激和膨胀方法提供了将摇摆平台的角度设定为1.5°、2°、2.5°、3°、3.5°、4°、4.5°、5°、5.5°、6°、6.5°、7°、7.5°、8°、8.5°或9.0°。
在某些实施例中，生物反应器容器的容量为约0.1升至约200升培养基。本领域技术人员将容易地理解，用于培养的体积将根据起始细胞的数量和所需细胞的最终数量而变化。在具体实施例中，本发明的细胞例如T细胞以约0.2×106细胞/ml至约5×106细胞/ml及其间的任何浓度的初始浓度接种。在一个具体实施例中，细胞可以最初在静态环境中培养，并在培养基1、2、3、4、5、6、7、8或更多天的时间后在摇摆平台上转移到生物反应器。在相关实施例中，如上所述，在包括摇摆平台和集成磁体的生物反应器中进行刺激，激活和膨胀的整个过程。说明性的生物反应器包括但不限于“The Wave”。
在一个具体实施例中，本发明的细胞刺激方法在封闭系统(例如生物反应器)中进行，其允许以不同的速率(例如约0.1ml/分钟至约10ml/分钟)灌注培养基。因此，在某些实施例中，这种封闭系统的容器包括出口过滤器，入口过滤器和用于无菌转移到和从闭合系统传送的取样口。在其他实施例中，这种封闭系统的容器包括注射器泵和用于无菌转移到和从闭合系统传递的控制。另外的实施例提供了用于通过连续监测生物反应器容器的重量来控制培养基输入和输出的机构，例如称重传感器。在一个实施例中，系统包括气体集流管。在另一个实施例中，本文实施例的生物反应器包括CO2气体混合架，其将环境空气和CO2的混合物供应到生物反应器容器并将容器保持在正压力。在另一个实施例中，本发明的生物反应器包括CO2气体混合架，其将环境空气和CO2的混合物供应到生物反应器容器并将容器保持在正压力。在另一个实施例中，本发明的生物反应器包括可变加热元件。
在一个实施例中，允许培养基从第2、3、4、5或6天开始以约0.5至5.0升每天进入容器，直到达到所需的最终体积。在一个优选的实施例中，培养基从第4天开始以每天2升的速度进入容器，直到体积达到10升。一旦达到所需的体积，就可以启动培养基的灌注。在某些实施例中，培养基通过系统的灌注在大约培养的第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12天开始。在一个实施例中，当体积在约0.1升至约200升培养基时开始灌注。在一个具体实施例中，当最终体积为4、5、6、7、8、9、10或20升或更高体积时开始灌注。灌注速率可以为约0.5ml/分钟至约10ml/分钟。在某些实施例中，灌注速率为约1、2、2.5、3、3.5、4、4.5,5、5.5、6、6.5、7、7.5或8.0毫升/分钟。
在本发明的另一个实施例中，将细胞(例如T细胞)在闭合的静态系统中培养多达5天，然后转移到包含摇摆元件的封闭系统，以允许以变化的速度摇摆培养容器。
在某些方面，本发明的方法提供了在小于约两周内将细胞如T细胞扩增至约6×106个细胞/ml至约90×106个细胞/ml的浓度。特别地，本文的方法提供了将T细胞扩增到约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80或85×106个细胞/ml的浓度和其中的所有浓度。在某些实施例中，细胞在培养基的第5、6、7、8、9、10、11或12天达到期望的浓度，例如上面列出的任何浓度。在一个实施例中，T细胞在培养基的大约第4天至第12天的约24小时内膨胀至少约1.5倍。在一个实施例中，细胞例如T细胞在少于约两周内从约100×106的起始数目的细胞扩增至总共约500×109个细胞。在另外的实施例中，在小于约两周的时间内，T细胞从起始数量的细胞扩增至约500×106个，总计约为500×109个细胞。在相关实施例中，在少于约两周内，细胞从约100-500×106的起始数扩大至总计约200、300或400×109个细胞。
治疗
在某些实施例中，首先将T群与抗原接触，然后使其经受包含一个或多个树突状细胞、IL-15、IL-7和IL-2的混合物。在一个具体实施例中，通过单独或与佐剂联合或在树突状细胞上脉冲接种具有特定抗原的患者来诱导抗原特异性T细胞。使用本发明的刺激方法用于扩张的抗原特异性细胞也可以在体外产生。
本发明的另一方面提供了用于扩增抗原特异性T细胞的方法，包括使一组T细胞与抗原接触足以诱导对所述抗原特异性的T细胞活化的时间；在足以引起对所述抗原特异性的T细胞增殖的条件下和足以诱导对所述抗原特异性的T细胞增殖的条件下，将包含树突状细胞、IL-15、IL-7和IL-2中的一种或多种的混合物离子化所述抗原特异性T细胞群体，从而扩增抗原特异性T细胞。在一个实施例中，抗原是肿瘤抗原。在另一个实施例中，将抗原脉冲在抗原递呈细胞上或由抗原递呈细胞表达。在另一个实施例中，T细胞群在体外与所述抗原接触。在另一个实施例中，该方法包括至少一轮所述抗原特异性T细胞的肽-MHC四聚体分选。在某些实施例中，本发明所述方法还包括所述抗原特异性T细胞的至少一轮肽MHC四聚体磁选择。
本文发明的另一方面提供了一种治疗癌症的方法，包括向癌症患者施用根据本文提供的方法扩增的抗原特异性T细胞。
根据本发明产生的细胞也可用于治疗自身免疫性疾病。自身免疫性疾病的实例包括但不限于：获得性免疫缺陷综合征(AIDS，其是具有自身免疫组分的病毒性疾病)、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性艾迪生病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫内耳病(AIED)、自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、贝切特氏病、心肌病、腹腔注射性皮炎皮炎；慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIPD)、瘢痕性类天疱疮、冷凝集素疾病、冠状综合征、克罗恩病、德戈斯病、青少年皮肌炎、盘状狼疮、必需混合型冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、格雷夫斯疾病、吉兰巴利综合征、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、胰岛素依赖性糖尿病、青少年慢性关节炎(Still氏病)、青少年类风湿关节炎、梅尼埃病、混合性结缔组织病、多发性硬化症、重症肌无力、顽固性贫血、多发性动脉炎、多软骨炎、多腺性自身免疫综合征、风湿性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原发性丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、牛皮癣、银屑病关节炎、雷诺氏症、雷特综合征、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病(进行性系统性硬化症(PSS)、也称为系统性硬化症(SS))、干燥综合征、僵硬综合征、系统性红斑狼疮、高粱动脉炎、颞动脉炎/巨细胞性动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、白癜风和韦格纳肉芽肿病。
根据本发明产生的细胞也可用于治疗炎症性疾病。炎症性疾病的实例包括但不限于慢性和急性炎症性疾病。炎症性疾病的例子包括阿尔茨海默病、哮喘、特应性过敏、过敏、动脉粥样硬化、支气管哮喘、湿疹、肾小球性肾炎、移植物抗宿主病、溶血性贫血、骨关节炎、败血症、中风、组织和器官的移植、血管炎、糖尿病性视网膜病变和呼吸机诱发肺损伤。
本发明还提供了用于预防，抑制或减少动物中癌症或恶性细胞的存在的方法，其包括向动物施用本发明的抗癌有效量的抗肿瘤细胞。
本发明预期的免疫应答诱导的或预防，抑制或减少存在的癌症可包括但不限于黑素瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、白血病、浆细胞瘤、肉瘤、神经胶质瘤、胸腺瘤、乳腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肾细胞癌、胰腺癌、食管癌、脑癌、肺癌、卵巢癌、子宫颈癌、多发性骨髓瘤、肝细胞癌、鼻咽癌、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓系白血病(AML)、慢性粒细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和本领域已知的其他肿瘤。
可选的，本文所述的组合物可用于诱导或增强对致病生物体如病毒(例如单链RNA病毒、单链DNA病毒、双链DNA病毒、HIV、甲型肝炎、乙型和丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(CMV)、人类疱疹病毒4型(EBV)、人类乳头瘤病毒(HPV)、寄生虫(例如原生动物和后生动物病原体，如疟原虫属、利什曼原虫属、血吸虫种、锥虫属)、细菌(例如分枝杆菌、沙门氏菌、链球菌、大肠杆菌、葡萄球菌)、真菌(例如假丝酵母属、曲霉菌种)和卡氏肺孢子虫。
通过向受试者施用本发明组合物在动物中诱导的免疫应答可以包括能够杀死肿瘤和感染的细胞以及CD4+T细胞应答的由CD8+T细胞介导的细胞免疫应答。还可以诱导体液免疫应答，主要由在CD4+T细胞激活后产生抗体的B细胞介导。可以使用各种技术来分析由本领域熟知的本发明的组合物诱导的免疫应答的类型。例如，Coligan et al,CurrentProtocols in Immunology,John Wiley&Sons Inc.,1994。
表示“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，考虑到年龄、体重、肿瘤大小、感染程度或转移的个体差异以及患者状况，医生可以确定本发明的组合物的精确量。通常可以指出，包含本发明的受试细胞的药物组合物可以在适当的临床试验期间以待确定的剂量施用。本发明的细胞也可以以这些剂量多次施用。特定患者的最佳剂量和治疗方案可以由医学领域的技术人员容易地通过监测患者的疾病迹象并相应地调整治疗来确定。
本发明的细胞可以以剂量和途径施用，有时在适当的临床试验中确定。细胞组合物可以在这些范围内的剂量下多次施用。本发明的细胞可以与其他方法组合。用于给药的本发明的细胞可以是经历治疗的患者自体的，同种异体的或异源的。如果需要，治疗还可以包括施用有丝分裂原(例如PHA)或淋巴因子，细胞因子和/或趋化因子(例如GM-CSF、IL-4、IL-13、Flt3-L、RANTES、M1P1-α等等)，以增强免疫应答的诱导。
本发明的细胞的给药可以以任何方便的方式进行。本发明的细胞也可以通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内在皮下、皮内、肌内给药。在一些情况下，通过皮内或皮下注射将细胞施用于患者。在其他情况下，本发明的细胞由静脉内注射。在其他情况下，本发明的细胞直接注射到肿瘤或淋巴结中。
本发明的细胞也可以使用任意数量的基质施用。本发明通常通过调节T细胞的作为人造淋巴器官的新环境中利用这种基质来支持、维持或调节免疫系统。因此，本发明可以利用已证明在组织工程中有用的那些基质组合物和制剂。因此，可以用于本发明的组合物、装置和方法中的基质的类型实际上是无限的，并且可以包括生物和合成基质。在一个具体实例中，组合物和装置通过美国专利号5,980,889、5913998、5902745、5843069、5787900或5,626,561提出；这些专利的全部内容通过引用并入本文。基质包括当被给予哺乳动物宿主时与生物相容性通常相关的特征。基质可以由天然和/或合成材料形成。在需要在动物身体(例如植入物)中留下永久性结构或可移除结构的情况下，基质可以是不可生物降解的；或可生物降解。基质可以采用海绵、植入物、管、telfa垫、纤维、中空纤维、冻干组分、凝胶、粉末、多孔组合物或纳米颗粒的形式。此外，可以设计基质以允许接种的细胞或产生的细胞因子或其它活性剂的持续释放。在某些实施例中，本发明的基质是柔性和弹性的，并且可以描述为半固体支架，其可渗透物质如无机盐、含水流体和包括氧的溶解气体试剂。
本文中使用的基质作为生物相容性物质的实例。然而，目前本发明不限于基质，因此，无论在哪里出现术语基质，这些术语应该被读取以包括允许细胞保留或细胞穿过的装置和其他物质是生物相容的，并且能够允许大分子直接通过该物质，使得物质本身是半透膜或与特定的半透性物质结合使用。
在本发明的一个方面，本发明中的细胞可以在体内用作佐剂，如美国专利第6,464,973号所述。在另一个实施例中，本发明的细胞可以用作疫苗以针对感兴趣的抗原(例如本文所述的那些)(例如肿瘤抗原、病毒抗原、自身抗原等)体内诱导免疫应答。在一个实施例中，本发明的细胞可用于在体内产生免疫应答，或者单独施用或与其它免疫调节剂组合，并与其它已知疗法组合。
表位鉴定
在一个实施例中，本发明提供扩增抗原特异性T细胞的组合物和方法。抗原特异性T细胞可以根据本发明来扩增，包括使T细胞与一种或多种树突状细胞、IL-15、IL-7和IL-2接触的步骤。扩增的T细胞可用于鉴定抗原特异性T细胞受体(TCR)和从其衍生的表位。例如，可以克隆来自扩展的T细胞的TCR。克隆的TCR是开发用于治疗所需疾病或病症的特异性过继性T细胞疗法的有前景的工具。例如，克隆的TCR可用于产生用于疫苗的肽/抗原。
除了在抵抗感染中的作用外，T细胞还涉及癌细胞的破坏。自身免疫性疾病也与针对身体各部位的抗原特异性T细胞攻击有关。妨碍对这些疾病的机制的理解和干预的主要问题之一是鉴定对待研究的抗原特异的T细胞的困难。
TCR与结构中的抗体分子密切相关，并且它们参与抗原结合，尽管与抗体不同，它们不识别游离抗原；相反，它们结合由抗原递呈分子结合和递呈的抗原片段。一组重要的抗原递呈分子是向T细胞递呈抗原肽和蛋白质片段的MHC I类和II类分子。
以与抗体的抗原结合位点相似的方式产生TCR的抗原结合位点的变异性，并且还为大量不同的抗原提供特异性。多态性发生在TCR的二硫键连接的α(α)和β(β)或γ(γ)和δ(Δ)多肽的N末端结构域中的互补决定区(CDR)中。CDR环聚集在一起以形成类似于抗体的抗原结合位点的MHC-抗原结合位点，尽管在TCR中，与抗体相比，各种链各自含有两个另外的高变环。特异性抗原的TCR多样性也与抗原结合并递呈给TCR的APC表面上的MHC分子直接相关。在本文别处描述的实施例中，本发明的肽可以位于树突状细胞的MHC分子内，以便产生合适的T细胞。在一些实施例中，MHC分子通过在37℃，5％CO2下用不同浓度的肽将细胞孵育4小时而在细胞外负载肽，然后在无血清RPMI中洗涤一次。然而，在替代实施例中，用编码融合蛋白的多核苷酸转染抗原递呈细胞，所述融合蛋白包含通过柔性接头肽连接至至少MHC I类分子α链的肽。因此，当表达时，融合蛋白导致占据MHC I类结合槽的肽。合适的MHCI类分子和共刺激分子可从公共数据库获得。这种融合分子的合成的其它细节可以在Mottez，等J Exp Med.，1995年2月1日，181(2)：493-502中找到，其通过并入引入本文。表达肽和MHC分子的融合蛋白的优点是在抗原递呈细胞的表面上显示出高得多的肽浓度。
在制备T细胞的某些情况下，优选抗原递呈细胞与T细胞之间存在HLA匹配。也就是说，抗原递呈细胞显示T细胞供体为HLA阳性的等位基因的MHC分子。在一些实施例中，这通过从第一个体获得抗原递呈细胞和来自第二个体的T细胞来实现，其中第一个和第二个体具有HLA匹配。
然而，在替代实施例中，抗原递呈细胞和T细胞是从相同个体获得的，但抗原递呈细胞用编码相似HLA等位基因的MHC分子的多核苷酸转染。在一些实施例中，多核苷酸编码通过连接体编码与肽连接的MHC分子的蛋白质。在人类中存在许多HLA I类等位基因，并且由抗原递呈细胞显示的MHC分子，原则上可以是任何这些等位基因。然而，由于HLA-A*0201等位基因是特别普遍的，因此优选MHC分子为该等位基因。然而，可以使用任何HLA-A2等位基因，或者可以使用其他等位基因，例如HLA-A1、HLA-A3、HLA-A11和HLA-A24。
在另外的本发明的实施例中，提供了一种制备适于递送至患有癌症的患者的T细胞的方法。该方法包括提供表达第一HLA等位基因的HLA分子并将肽定位在HLA分子的结合槽中的树突状细胞。肽可以是或可以不是本发明的肽。然后用树突状细胞引导T细胞，从与第一HLA等位基因匹配的HLA个体获得T细胞。如本文别处所述，树突状细胞可以从第一供体个体和来自第二供体个体的T细胞获得，其中第一和第二供体个体是HLA匹配的。使用树突状细胞而不是非专业抗原递呈细胞的优点在于其导致T细胞的高得多的刺激。
在这些实施例中，优选的是，肽是细胞型特异性肽，也就是说，从特定细胞中比在其它细胞类型中仅表达，或以高得多的水平(例如至少高10倍的浓度)表达的蛋白获得的肽。
将根据本文所述实施例制备的T细胞施用于患者以治疗患者的癌症。原则上，实施例的T细胞能够用于治疗许多不同类型的癌症，包括白血病、淋巴瘤如非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤等。
因此，在本发明的一些实施例中，提供了包含本发明的T细胞和药学上可接受的载体，稀释剂或赋形剂的药物制剂，其进一步的细节可以在美国药典的Remmington'sPharmaceutical Sciences，1984Mack Publishing Company，Easton,USA中找到。
如本文其他地方所讨论的，用于向T细胞递呈肽的MHC分子的HLA等位基因是也由患者表达的HLA等位基因，因此当将T细胞施用于患者时，它们识别该HLA等位基因的MHC分子上展示的肽。
在一些替代实施例中，提供了多组(例如2组或3组)T细胞，每种T细胞对于不同的肽是特异的。在每种情况下，如本文别处所述，T细胞是同种异体的，也就是说在制备T细胞期间展示肽的MHC分子的HLA等位基因是在获得T细胞的供体个体中不表达的HLA等位基因。肽可以全部来自相同的细胞特异性蛋白质，也可以来自不同的蛋白质，但对于相同的细胞类型是特异的。肽可以是或可以不是本发明的肽。在一些实施例中，多组T细胞同时施用，但在其它实施例中，它们依次施用。
参考了T细胞的制备与提供。然而，应当理解，T细胞的重要特征是在T细胞上展示的T细胞受体(TCR)，更具体地说，T细胞受体对肽和MHC分子复合物的特异性。因此，在一些本发明的替代实施例中，在本文别处所述的T细胞的制备之后，收获并测序当与特定等位基因的MHC分子复合时对特定肽特异的T细胞的T细胞受体。然后产生编码T细胞受体的cDNA序列，其可用于在T细胞(例如患者自己的T细胞或来自供体的T细胞)中重组表达T细胞受体。例如，cDNA可以并入载体如病毒载体(例如逆转录病毒载体)、慢病毒载体、腺病毒载体或痘苗载体中。或者，可以遵循非病毒方法，例如使用裸DNA或脂质复合物和复合物或mRNA以转染T细胞。
因此，从供体个体“可获得”的T细胞包括以本文别处描述的方式重组获得的T细胞，因为重组表达的TCR是天然产生的。
由于转染的T细胞也显示其内源性TCR，因此优选在转染之前预先选择T细胞以消除会引起移植物抗宿主病的T细胞。在一些实施例中，预先选择T细胞，使得其内源TCR的特异性是已知的。例如，选择与磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3反应的T细胞。在其他实施例中，从患者获得T细胞，从而对患者天然耐受。这种方法只能在患者的T细胞健康的地方使用。
在一些替代实施例中，作为整体的T细胞受体不是重组表达的，而是负责其结合特异性的T细胞受体的区域被并入维持这些区域的确认的结构中。更具体地，对T细胞受体的互补决定区(CDR)1至3进行测序，并且这些序列在重组蛋白中保持相同的构象。
在一个实施例中，扩增的T细胞提供用于克隆与其相关的TCR和表位/抗原的来源。所鉴定的表位/抗原可用于产生疫苗。在一个实施例中，可以通过在通过表位作图鉴定的特定氨基酸位置修饰多肽(例如靶抗原)来构建疫苗接种抗原。因此，本发明包括通过表位作图鉴定目标抗原中修饰的相关位置的方法，在相关位置修饰靶抗原以产生变体，并将其包含在单独的候选制剂中。
疫苗接种抗原多肽可以通过许多方法进行表位映射，包括在WO00/26230和WO01/83559中详细公开的那些方法。简而言之，这些方法包括表位模式的数据库(从已知与抗蛋白抗体特异性结合的肽序列的输入确定)和用于分析给定蛋白质相对于表位模式数据库的3-D结构的算法。这将确定该蛋白质上可能的表位，并且将蛋白质序列中每个氨基酸的优先选择作为表位的一部分。
另一方面，提供了用于鉴定候选MHCΠ类表位的方法。在某些实施例中，可以使用用于候选表位鉴定的计算机实现的算法来鉴定候选表位。这样的计算机程序包括例如ΤΕΡΙTΟΡΕ程序(参见例如Hammer等，Adv.Immunol.66：67-100(1997)；Sturniolo et al.，Nat.Biotechnol.17：555-61(1999)；Manici等，J.Exp.Med.189：871-76(1999)；de Lalla等，J.Immunol.163：1725-29(1999)；Cochlovius等人，J.Immunol.165：4731-41(2000)；其公开内容通过引用并入本文)以及其他计算机实现的算法。
用于候选表位鉴定的计算机实现的算法可以在一组非常大的蛋白质、一组相关蛋白质(例如同系物、同系同源物或多态性变体)、不相关蛋白质的混合物、组织或器官的蛋白质中或在生物体的蛋白质组中鉴定例如单一蛋白质中的候选表位。使用这种方法，除了分析已知的候选分子靶之外，还可以基于表达的蛋白质的序列信息(例如，从推定的开放阅读框或cDNA文库)探询复杂组织或生物体，该方法作为有效、敏感以及具体的T细胞表位鉴定的方法。
鉴定候选表位后，可以形成与候选表位相对应的肽或肽集合。例如，一旦鉴定了候选表位，就可以制备跨越候选表位或其部分的重叠肽，以确认表位由MHC II类分子的结合，并且根据需要精制该表位的鉴定。可选的，可以制备肽池，其包括使用用于候选表位鉴定的计算机实现的算法鉴定的多个候选表位。
T细胞表位肽
本发明的T细胞肽是可从蛋白质抗原衍生的短肽。抗原递呈细胞可以通过表面MHC分子直接结合抗原和/或内化抗原并将其加工成能够结合MHC分子的短片段。肽结合MHC的特异性取决于肽和特定MHC分子的肽结合槽之间的特异性相互作用。
与MHC I类分子结合的肽通常在6至30之间，更通常在7至20个氨基之间或8至15个氨基酸之间。肽的氨基末端胺基与肽槽的一端的不变位点接触，羧基末端的羧酸基团与槽的另一端的不变位点结合。因此，通常，这些肽在极端氨基末端具有疏水或碱性羧基末端和不存在脯氨酸。肽沿着沟槽延伸确认，主链原子和保守的氨基酸侧链之间的沟槽进一步接触。肽长度的变化通过在肽主链中的扭结来适应，通常在脯氨酸或甘氨酸残基处。
结合MHC II类分子的肽通常是至少10个氨基酸，例如长度为约13-18个氨基酸，并且可以更长。这些肽沿着在两端开放的MHC II肽结合槽延伸确认。主要通过主链原子与排列肽结合槽的保守残基接触将肽保持在适当的位置。
本发明的肽可以使用化学方法制备。例如，可以通过固相技术(Roberge，J.Y.等(1995)Science 269：202-204)从树脂中切割并通过制备型高效液相色谱法纯化肽。可以根据制造商提供的说明书来实现自动合成，例如使用ABI 431A肽合成仪(Perkin Elmer)。
肽可以替代地通过重组方法或通过从较长多肽切割来制备。例如，可以通过从全长磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3蛋白切割而获得肽。肽的组成可以通过氨基酸分析或测序来证实。
本发明的肽可以在包含抗原递呈细胞和T细胞的抗原递呈系统中测试。例如，抗原递呈系统可以是鼠脾细胞制剂，来自扁桃体或PBMC的人细胞制备。可选的，抗原递呈系统可以包含特定的T细胞系/克隆和/或特定抗原递呈细胞类型。
可以通过T细胞增殖(例如使用3H-胸苷掺入)或细胞因子产生来测定T细胞活化。TH1型CD4+T细胞的活化可以例如通过IFN-γ产生来检测，这可以通过标准技术检测，例如ELISPOT测定。
在免疫应答期间抗原特异性T细胞的测定是疫苗开发、自体癌症治疗、移植、感染性疾病、炎症、自身免疫、毒性研究等中的重要参数。肽库是监测抗原特异性T细胞的关键试剂。本发明提供了使用肽文库分析样品中T细胞的改进方法，包括诊断、预后和免疫监测方法。此外，抗肿瘤治疗中肽文库的使用在本文其他地方描述，包括分离能够灭活或消除不需要的靶细胞的抗原特异性T细胞或分离能够调节其他免疫细胞的特异性T细胞。本发明还涉及包含一种或多种肿瘤衍生肽的MHC多聚体。
特定抗原肽的鉴定为制定针对癌症的诊断和治疗策略提供了新的机会。有利地，新的T细胞表位的鉴定使得能够生产MHC I类和II类多聚体、四聚体和五聚体，可用作提供免疫监测的增加的灵敏度的分析工具。此外，在患有疾病复发风险的个体的周围检测抗原特异性CTL是有用的诊断工具。
因此，在另一方面，本发明提供包含如本文所述的至少一种MHC I类或II型磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3肽表位的MHC多聚体、四聚体或五聚体。
实施例还提供用于鉴定可用于癌症治疗的肽的组合物和方法。预计与HLA-A*0201结合的候选蛋白的肽序列可以通过计算机算法鉴定。根据预测的亲和力选择肽用于500nM或更小的截止值，但也可以选择更高的值。合成肽，并可使用生物化学测定法确认与HLA-A*0201的结合。将肽结合与通过/失败对照肽(命名为100％)和阳性对照肽的结合进行比较。对于具有高于通过/失败对照肽的结合亲和力的肽，也合成相应的HLA-A*0201肽多聚体。测试这些肽产生与特异性HLA-A*0201复合物特异性应答的T细胞系的能力。细胞系可以称为多聚体、四聚体或五聚体阳性T细胞。多聚体阳性细胞表示相应肽的高免疫原性。可以测定额外的反应以评估细胞因子INF-γ、脱粒和杀死靶细胞的产量。
在一些实施例中，本发明的肽可以作为疫苗直接施用于患者。因此，本发明的肽是特异性蛋白质的免疫原性表位，并且用于引发对其各自蛋白质的T细胞应答。在一些实施例中，本发明的多肽作为疫苗直接施用于患者。例如，在患有白血病的患者中，向患者施用包含来自造血细胞特异性蛋白质的肽的多肽，以引起对该蛋白质的T细胞应答。T细胞应答导致造血细胞死亡，包括癌细胞，但是对这些细胞是特异性的，并且不会导致对其它细胞类型的免疫应答。
还应当注意，在许多患者中，直接施用这样的肽将不会引起T细胞应答，因为细胞特异性蛋白质是“自身蛋白质”，并且当存在于患者的HLA等位基因的MHC分子上时，能够结合多肽的任何T细胞是可以耐受的。也就是说，在选择过程中，将被应答的T细胞在患者的胸腺中被破坏，或者通过中枢或外周耐受机制失活。因此，本发明的肽优选用于产生从同种异体供体个体获得或可获得的T细胞。对于患者HLA阳性的HLA等位基因，该个体应优选为HLA阴性。例如，如果患者对于HLA等位基因HLA-A*0201为HLA阳性，则从HLA-A*0201阴性的个体获得T细胞。通常优选供体个体与患者HLA相同。然后提供抗原递呈细胞(APC)，其显示HLA-A*0201等位基因的MHC分子，并加载该肽。然后将供体个体的T细胞用APC引发，并使得到的细胞增殖。
然后使用包含多个肽-MHC分子(例如五聚体或四聚体)的人造结构来使能与HLA-A*0201抗原复合的本发明的肽结合的增殖T细胞。T细胞混合物中特异性HLA-A*0201复合物特异的T细胞与它们混合时具有与这些结构结合的能力。随后将T细胞与具有结合人造结构的能力的磁珠混合。然后通过磁珠的磁吸引将与其结合的人造结构和T细胞从剩余的混合物中除去。
治疗
抗原特异性T细胞可以每天多次施用于动物，或者其可以较不频繁地施用，例如每天一次，每周一次，每两周一次，每月一次，甚至更少的频率，如每隔几个月一次，甚至每年一次或更少。剂量的频率对于本领域技术人员将是显而易见的，并且将取决于任何数量的因素，例如但不限于所治疗的疾病的类型和严重程度、动物的类型和年龄等。
抗原特异性T细胞可与各种其它化合物(细胞因子、化学治疗药物和/或抗病毒药物等)共同施用。可选的，化合物可以在抗原特异性T细胞之前的一小时、一天、一周、一个月或甚至更多次或其任何置换的情况下给药。此外，化合物可以在施用抗原特异性T细胞或其任何置换之后一小时、一天、一周或甚至更多次施用。频率和给药方案对于本领域技术人员将是显而易见的，并且将取决于任何数量的因素，例如但不限于所治疗的疾病的类型和严重程度，动物的年龄和健康状况，给药化合物或化合物的同一性，各种化合物和抗原特异性T细胞的给药途径等。
在治疗方法中，本发明的组合物的施用可以是“预防性”或“治疗性”用途。当预防性地提供时，在任何症状之前提供本发明的组合物，尽管在具体实施例中，在发生一种或多种症状后提供疫苗以预防进一步症状发展或防止现在症状变差。组合物的预防性给药用于预防或改善任何随后的感染或疾病。当治疗提供时，在感染或疾病症状发作时或之后提供药物组合物。因此，本发明可以在预期暴露于致病剂或疾病状态之前或在感染或疾病开始之后提供。
组合物的有效量将是实现增强免疫应答的这种选择结果的量，并且这种量可以由本领域技术人员根据常规来确定。例如，用于治疗针对癌症或病原体的免疫系统缺陷的有效量可以是引起免疫系统激活所必需的量，导致在暴露于抗原后发展抗原特异性免疫应答。该术语也是“足够数量”的同义词。
任何特定应用的有效量可以根据诸如所治疗的疾病或病症，施用的具体组合，受试者的大小和/或疾病或病症的严重程度等因素而变化。本领域普通技术人员可以经验地确定本发明的特定组合物的有效量，而不需要不必要的实验。
实施例
通过参考以下实验实例进一步详细描述本发明。这些实施例仅是为了说明的目的而提供的，除非另有说明，否则不是限制性的。因此，本发明不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导而变得显而易见的任何和所有变化。
没有进一步描述，相信本领域普通技术人员可以使用前述描述和以下说明性实施例来制作和利用本发明并实践所要求保护的方法。因此，以下工作实施例具体指出本发明的优选实施例，并且不应被解释为以任何方式限制本发明的其余部分。
实施例1：在接种I型树突状细胞的乳腺癌患者中抗HER2 CD4+Th1应答的恢复
设计了以下研究来探索辅助1型极化树突状细胞(“DC1”)接种的作用。
新辅助治疗后，I型树突状细胞疫苗接种具有残留疾病的HER2+IBC患者
新辅助治疗后，具有残留疾病的4例HER2+IBC患者接受辅助性HER2脉冲I型树突状细胞疫苗。确定每个患者的Th1免疫应答在I型树突状细胞接种前，树突状细胞接种后3个月和接种后6个月，并从用六种HER2II类肽(SEQ ID NO：1-6)脉冲的患者PBMC产生，通过如上所述通过ELISPOT测定IFNγ产生。如前所述制备自体I型树突状细胞疫苗。对(1)整体抗HER2应答率(应答率>1肽)，(2)反应肽数(应答组库))和(3)六种HER2肽的累积应答进行评估。
结果：
应答率：接种疫苗前，只有一名IBC患者产生免疫应答，在减去未刺激的背景后，在实验孔中定义为>20个SFC/106个细胞。与接种疫苗前的结果相比，所有接种疫苗的IBC患者均产生免疫应答，定义为抗HER2 IFN-γposTh1应答增加>2倍。
应答组库：平均库从接种前的0.5±1个肽增加至3个月时的3.25±0.96个肽(p＝0.01)和6个月时的4±0.8个肽(图1)。
累积应答：疫苗接种后3个月(p＝0.04)，平均累积应答从36.5±38.3SFC/106接种前改善至151.0±60.0SFC/106，并在疫苗接种后6个月(p＝0.02)改善至198.4±39.7SFC/106(图2)。
结论：
用新辅助法化疗治疗后，用HER2脉冲I型树突状细胞疫苗接种具有残留疾病的HER2+IBC患者能增强抗HER2 Th1免疫应答。
抗HER2 Th1免疫应答在广度(应答组库)和深度(累积应答)方面均有所增加。
实施例2：HER2特异性Th1细胞的体外扩增
设计了以下研究以探询过继性T细胞转移在恢复抗HER2 Thl免疫中的作用。T细胞扩增到过继治疗和表位作图研究所需的水平，同时保持抗原特异性和细胞功能。简而言之，在体外，HER2特异性Th1细胞通过与HER2肽脉冲I型树突状细胞共培养而产生，并且使用单独的IL-2或IL-2、IL-7和IL-15扩增。随后通过重复HER2-肽脉冲I型树突状细胞共培养或通过抗CD3/CD28刺激来扩增Th1细胞。扩增倍数定义为：(扩增后T细胞数/扩增前T细胞数)；通过ELISA测定抗原特异性Πγ产生的特异性。
如本文所示，CD4+T细胞与用IL-2、IL-7和IL-15刺激的I型树突状细胞脉冲的HER2肽的重复共培养导致高度特异性抗HER2 Th1细胞的显著扩增，提供潜在收养细胞群。与特异性肽特异性I型树突状细胞和IL-2、IL-7和IL-15刺激的共培养可以模拟淋巴结环境，并可用于显著扩增任何抗原特异性Th1细胞群体。
不希望受任何特定理论的束缚，据信当受试者接种抗蛋白质抗原(例如肿瘤靶抗原)时，可在接种疫苗后从受试者中取出血液并收集。收集的血液含有树突状细胞前体以及低水平的特异于肿瘤靶抗原的T细胞。树突状细胞前体和T细胞彼此分离。树突状细胞前体可以用肿瘤靶蛋白/抗原加载/脉冲，然后激活至I型树突状细胞状态。然后可以将抗原特异性I型树突状细胞与T细胞共培养，并以合适的顺序将细胞因子(IL-15、IL-7和IL-2)加入到共培养物中。这个周期可以每周重复一次，直到T细胞生长到足够数量(例如1×109)。然后可以将T细胞提供给最初受试者，将大量T细胞灌注，使其身体不能自然产生。这种大型的抗原特异性T细胞可以具有很强的抗肿瘤活性。
实施例3-扩增T细胞的方法
HER2特异性I型树突状细胞的制备：
树突状细胞前体从HER2乳腺癌患者(DCIS)获得，其用如前所述的HER2肽脉冲I型树突状细胞疫苗接种。通过串联白细胞分离/逆流离心洗提获得树突状细胞前体。将树突状细胞在3×106个细胞中于37℃在含有GM-CSF 50ng/ml(Berlex，Richmond，CA)的1ml巨噬细胞无血清培养基(SFM-Gibco Life Technologies，Carlsbad，CA)中于37℃孵育。细胞最初接种后，用单一HER2肽抗原(42-56、98-114、328-345、776-790、927-941、1166-1180(SEQ IDNO：1-6)；20μg/ml)脉冲树突状细胞48-72小时。对于成熟，树突状细胞在6小时后用IFN-γ(1000U/ml)进一步活化，第二天用脂多糖(“LPS”)(10ng/ml)进一步活化。在LPS给药后6小时，在IL-12最大产生点收获HER2特异性I型树突状细胞。
CD4+T细胞制备：
也通过串联白细胞分离/逆流离心洗提从疫苗接种前(HER2脉冲I型树突状细胞疫苗接种)的乳腺癌患者获得淋巴细胞。使用人CD4+T细胞增殖试剂盒(StemcellTechnologies；Vancouver BC，Canada)通过阴性选择纯化CD4+T细胞。将CD4+T细胞以2×106个细胞/ml重悬于培养基(ISOCOVE's培养基，1％L-谷氨酰胺，1％青霉素/链霉素，1％丙酮酸钠，1％非必需氨基酸，联发科技；Manassas，VA和5％热灭活人AB血清)
DC1-CD4+共培养：
将I型树突状细胞以1:10的比例(2×105I型树突状细胞/ml和2×106CD4+T细胞/ml)与CD4+T细胞在24孔板接种，并在37℃下孵育。在共培养后48-72小时加入重组人IL-7(10ng/ml)和IL-15(10ng/ml)(BioLegend；San Diego，CA)。加入IL-7和IL-15后24小时，加入重组人IL-2(5U/ml)。
用于测试的HER2特异性iDC和用于再刺激的HER2特异性I型树突状细胞：
如上所述制备另外两组树突状细胞。在一组中，每个孔用单个肽抗原(20ug/ml)脉冲，并被认为是未成熟树突状细胞(“iDC”)。在第二组中，如上所述，每个孔用单一肽抗原(20μg/ml))脉冲，并成熟至I型树突状细胞。在先前的I型树突状细胞共培养后7至9天，收获HER2特异性CD4+T细胞。如上所述，T细胞也与I型树突状细胞共培养并用IL-7/15和IL-2刺激。用CD4+T细胞与HER2特异性I型树突状细胞共培养4次，重复该循环。
扩增方法概述
如前所述开发HER2特异性I型树突状细胞
第1天：培养单核细胞(每孔1种肽)
第4天：成熟的HER2特异性I型树突状细胞
AM：用抗原脉冲(20μg/ml)。
PM(6小时后)：加入IFN-γ
第5天：清除CD4+T细胞和I型树突状细胞共培养。
AM：LPS
6小时后：将2×106个CD4+T细胞与2×105个I型树突状细胞共培养
*共培养后48-72小时：加入IL-7(10ng/ml)和IL-15(10ng/ml)；
加入IL-7/15后24小时加入IL-2(5U/ml)；
(在IL-2单独存在的条件下，在共培养后72-96小时加入IL2(同时将IL-2加入IL2/7/15组)。
开发HER2特异性iDC用于ELISA测试以及HER2特异性I型树突状细胞用于再刺激
第9-11天：培养单核细胞(每孔2种肽的)
培养单核细胞48小时后：处理HER2特异性未成熟树突状细胞和成熟I型树突状细胞：用抗原脉冲(20μg/ml)
未成熟的树突状细胞：用抗原脉冲(20μg/ml)(同时给予未来的未成熟的树突状细胞和I型树突状细胞)。
I型树突状细胞：AM：用抗原脉冲(20μg/ml)
PM(6小时后)：加入HFN-g
第二天：iDC共培养和DC1共培养(即I型树突状细胞共培养后7-9天)
I型树突状细胞：AM：LPS
收获HER2特异性CD4+T细胞
收获HER2特异性iDC
→2×106个CD4+T细胞与2×105个iDC共培养
收获HER2特定的I型树突状细胞
→2×106个CD4+T细胞与2×105个I型树突状细胞共培养
第二天：在iDC共培养下进行ELISA
重复上述过程；恢复IL7/15刺激(*)
结果：
上述参考的方法用于实验和研究中，其结果示于图3-16中：
图3和图4示出了CD4+T细胞与用IL-2刺激的HER2特异性I型树突状细胞共培养并分别与接种HER2脉冲I型树突状细胞疫苗的两种不同患者用IL-2/7/15刺激的CD4+T细胞直接比较。
简单地说，来自各个患者的未成熟的树突状细胞(“iDC s”)用以下MHCII类肽脉冲：肽42-56(SEQ ID NO：1)、肽98-114(SEQ ID NO：2)、肽328-345(SEQ ID NO：3)和肽776-790(SEQ ID NO：4)，并成熟至树突状细胞。然后，将所得的HER2脉冲的I型树突状细胞与CD4+T细胞共培养，并用如图所示的IL-2单独或IL-2/7/15刺激。红色轮廓框表示显示特异性的特异性肽和刺激方案(特异性抗原控制抗原IFN-γ产生比例大于2:1)。因此，在图3中示出了肽42-56-IL2/7/15方案的特异性；肽98-114-IL-2方案和IL-2/7/15方案，肽328-345两种方案和肽776-790两种方案。在图4中，仅针对肽776-790(两种方案)示出了特异性。示出扩增倍数(定义为扩增后的T细胞数/T细胞预扩增数)在每个图中右侧显示。通常，IL-2/7/15刺激的扩增倍数比单独的IL-2刺激更大，如各个扩增倍数数据所示。通过ELISA测定抗原特异性IFN-γ产生的特异性。
图5和图6示出对非特异性免疫应答的特异性：图5示出了HER2特异性I型树突状细胞的第一次刺激/扩增后的特异性反应，图6示出了在与非特异性抗CD3/CD28进行第二次刺激/扩增后该特异性应答的随后损失。
具有HER2特异性I型树突状细胞的CD4+T细胞的第一次刺激导致多种特异性免疫应答，如图5中的红色轮廓框所示：肽42-56，IL2/7/15方案；肽98-114，两种方案，肽328-345，两种方案和肽776-790两种方案。图6示出了具有非特异性抗CD3/CD28刺激导致四倍扩增(侧图)的HER2特异性CD4+T细胞的第二次刺激，但是在四分之三肽组中具有特异性丧失(只有肽328-345在CD3/28扩增后显示特异性)。使用以下MHCII类肽脉冲自患者的iDC：肽42-56(SEQ ID NO：1)、肽98-114(SEQ ID NO：2)、肽328-345(SEQ ID NO：3)和肽776-790(SEQ ID NO：4)，并如上所述成熟为I型树突状细胞。然后将所得的HER2脉冲的I型树突状细胞与CD4+T细胞共培养，并用IL-2单独或IL-2/7/15刺激，如图所示。
图7和图8示出了非特异性免疫应答，随后是特异性免疫应答：图7示出了CD4+T细胞的非特异性扩增。图8示出了在随后用HER2特异性I型树突状细胞刺激后未能获得特异性。用非特异性抗CD3/CD28的CD4+T细胞的第一次刺激导致3.8倍扩增(图7)。具有HER2特异性I型树突状细胞的非特异性CD4+T细胞的第二次刺激不能导致特异性免疫应答(图8)。来自患者的iDC脉冲以下MHC II类肽：肽42-56(SEQ ID NO：1)、肽98-114(SEQ ID NO：2)、肽328-345(SEQ ID NO：3)和肽776-790(SEQ ID NO：4)，并如上所述成熟为I型树突状细胞。然后将所得的HER2脉冲的I型树突状细胞与CD4+T细胞共培养，并用IL-2单独或IL-2/7/15刺激，如图所示。
图9A和9B示出HER2特异性Th1细胞的体外初次/第一次扩增，其比较与IL-2扩增的HER2特异性I型树突状细胞共培养的CD4+T细胞与用IL-2/7/15扩增的那些相比。iDC用以下MHC类II肽脉冲：肽42-56(SEQ ID NO：1)、肽98-114(SEQ ID NO：2)、肽776-790(SEQ ID NO：4)和肽927-941(SEQ ID NO：5)，并且成熟到I型树突状细胞。然后将所得的HER2脉冲的I型树突状细胞与CD4+T细胞共培养，并用IL-2单独或IL-2/7/15刺激，如图所示。红色轮廓框(图9B)表示显示特异性的特异性肽和刺激方案(特异性抗原：控制性抗原IFN-γ产生的比例大于2:1)。图9A示出当用IL-2、IL-7和IL-15刺激时，Th1细胞的平均倍数扩增(定义为扩增后的T细胞数/扩增前的T细胞数)比仅用IL-2(2.6±0.75vs 1.0±0.12；p＝0.001)明显更好。图9B示出通过ELISA通过抗原特异性IFN-γ产生测定的各种肽/扩增方案的特异性。用IL-2、IL-7和IL-15和IL-2单独的刺激都导致相同HER2肽776-790中的特异性Th1应答。
初始扩增概述：IL-2相比IL-2/7/15。当使用IL-2、IL-7和IL-15刺激时，Th1细胞的平均倍数扩增明显高于单独使用IL-2(2.6±0.75相比1.0±0.12；p＝0.001)(图9A)。用IL-2、IL-7和IL-15和IL-2单独的刺激都导致在相同的HER2肽(肽776-790)中的特异性Th1应答(图9B)。图10A和10B示出了HER2脉冲的I型树突状细胞对抗CD3/CD28的体外二次/第二次扩增。用HER2肽脉冲的I型树突状细胞和抗CD3/CD28再刺激Th1细胞各自导致类似的倍数扩增(3.9±1.0相比4.3±2.0p＝0.7)(图10A)。然而，图10B示出了具有HER2特异性I型树突状细胞的Th1细胞的刺激增强了特异性Th1应答；而用抗CD3/CD28的非特异性刺激导致HER2-肽特异性的总体损失。使用以下MHCII类肽：肽42-56(SEQ ID NO：1)、肽98-114(SEQ ID NO：2)、肽776-790(SEQ ID NO：4)和肽927-941(SEQ ID NO：5)。红色轮廓框(图10B)表示显示特异性的特异性肽和刺激方案(特异性抗原：控制抗原IFN-γ产生比例大于2:1)(即肽42-56-和肽776-790的I型树突状细胞再刺激。
二次扩增概述：HER2肽脉冲I型树突状细胞对抗CD3/CD28。用HER2肽脉冲的I型树突状细胞和抗CD3/CD28再刺激Th1细胞各自导致类似的倍数扩增(图10A)。然而，用HER2特异性I型树突状细胞刺激Th1细胞增强了特异性Th1应答，而用抗CD3/CD28的非特异性刺激导致HER2-肽特异性的总体损失(图10B)。
用HER2脉冲I型树突状细胞的Th1细胞的第三次扩增，用指定的HER2特异性I型树突状细胞进行第三次刺激后，平均倍数扩增(4.32±0.5,43.7倍累积扩增(图11A)和抗原特异性(图11B)特别是所有四种肽(肽42-56(SEQ ID NO：1))、肽98-114(SEQ ID NO：2)、肽776-790(SEQ ID NO：4)和肽927-941(SEQ ID NO：5))显示特异性和增加的IFN-γ产生。
第三扩增总结：HER2肽脉冲I型树突状细胞。在用HER2特异性I型树突状细胞进行第三次刺激后，平均扩增倍数(4.32±0.5，43.7倍累积扩增)(图11A)和特异性-特异性肽和IFN-γ产生的数量(图11B)都再次增加。
总体而言，可以看出，在具有相同数目的T细胞的图9B、10B和11B中，IFN-γ产生从扩张到扩张以量增加。还可以看出，在第二次刺激中，非特异性CD3/CD28(图10B)，特异性完全丧失。细胞扩增为Th1表型，扩增50-200倍(图9A、10A和11A)，每个刺激变得更加具体和更强。图12-15示出了IL-2/7/15重复体外刺激(4次)HER2特异性CD4+Th1细胞的顺序结果。对于图12-15所示的所有结果，相应的左图通过IFN-γ产生显示肽特异性(“Tet”是破伤风患者对照)；相应的右图显示了所用特异性HER2-肽的倍数扩增。在图12中，除了上述研究中使用的其他五种之外，还使用另外的MHCII类肽来脉冲iDC：肽1166-1180(SEQ ID NO：6)。然而，如在倍数扩增结果(图12，右图)中所见，肽328-345特异性和肽1166-1180特异性Th1细胞不产生足够的细胞用于进一步扩增，因此仅对剩余的四种多肽具有特异性的HER2 Thl细胞才被使用。
顺序地，图12的第一次刺激显示仅针对肽776-790特异性Th1细胞的特异性；除了肽776-790特异性Th1细胞之外，第二刺激的图13示出了肽42-56的特异性增加；图14的第三次扩增示出了对所有四种肽特异性Th1细胞(肽42-56、肽98-114、肽776-790和肽927-941)的特异性，而图15为第四次扩增，其中一个肽(肽927-941)的特异性丧失，剩下三个剩余的HER2特异性肽(肽42-56、肽98-114和肽776-790)。
图16示出了所有HER2特异性Th1细胞的图12-15所示的四种扩增的累积扩增倍数，每组的最后一个条(点)显示累积扩增倍数。平均累积扩增倍数超过100倍。
结论：
CD4+T细胞与用IL-2、IL-7和IL-15刺激的I型树突状细胞脉冲的HER2肽的重复共培养导致高度特异性抗HER2 Th1细胞的显著扩增，提供潜在收养细胞群。
在总共四次刺激中的每次刺激导致增加的倍数扩增和增加的抗原特异性，而没有达到任一极限。确实有100-400倍的扩增。
与肽特异性I型树突状细胞和IL-2、IL-7和HL-15刺激的共培养可以模拟淋巴结环境，并用于显著扩增任何抗原特异性Th1细胞群体。本领域技术人员将容易地认识到，与T细胞扩增有关的本文实施例决不限于CD4+1细胞。因此，本文实施例提供了用于生长CART细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CD8+)以及所有其他种类的T细胞的方法。本文提供的结果表明，用新辅助化疗治疗后，具有残留疾病的HER2+IBC患者的HER2脉冲I型树突状细胞疫苗接种增强了抗HER2 Th1免疫应答。抗HER2 Th1免疫应答在广度(应答组库)和深度(累积应答)方面均有所增加。HER2特异性Th1细胞的过度转移可能在复发CD4+Th1免疫应答中起作用。用IL-2，IL-7和IL-15刺激的HER2-肽脉冲I型树突状细胞的重复共培养可导致高度特异性的抗HER2 Th1细胞的显著扩增。
实施例3：在DC1接种的乳腺癌患者中可以恢复抗HER2 CD4+Th1应答
T细胞亚群的扩增是获得足够的T细胞进行过继性治疗或识别基于肽的疫苗的靶抗原上的表位的必要步骤。T细胞的扩增原则上是一个简单的过程。然而，在实践中，存在许多技术问题，包括扩增水平不足，过早活化诱导的细胞死亡(凋亡)或抗原特异性和/或功能丧失。
部分问题在于无法在体外复制体内在淋巴结发生的抗原特异性T细胞的扩增。这些是包含除T细胞之外的许多不同细胞类型的专门组织，包括抗原呈递树突状细胞，基质细胞如上皮细胞。这些细胞类型中的每一种通过提供对T细胞生长和维持细胞功能重要的接触依赖性信号(表面受体)和可溶性信号(细胞因子)起着不同的作用。
设计实验以探讨(1)辅助型1型极化树突状细胞(DC1)疫苗接种和(2)过继性T细胞转移在恢复抗HER2 Thl免疫中的作用。T细胞扩增到过继治疗和表位作图研究所需的水平，同时保持抗原特异性和细胞功能。
现在描述这些实验中使用的材料和方法。
制备完全活化的树突状细胞
将新鲜洗脱的骨髓单核细胞在6孔微孔板(12×106细胞/孔)中培养。培养基由无血清培养基(SFMInvitrogenCarlsbadCA)组成。加入的GMCSF的最终浓度为50ng/ml，IL4为1000U/ml。细胞在37℃，5％CC中培养过夜。在一些批次中，在16-20小时后用足够的肽脉冲细胞并再培养6-8小时，之后加入1000U/ml的IFN-γ。树突状细胞用TLR激动剂LPS(TLR4,10ng/ml)或R848(TLR8,1μgml)成熟。
为了诱导Th1-极化细胞因子IL-12的产生，通过细胞因子IFN-γ或TLR激动剂细菌LPS和/或R848的组合活化树突状细胞。这应该诱导产生IFN-γ的T细胞。或者，树突状细胞可以通过ATP、细菌LTA、LPS和前列腺素E2(PGE2)的组合来激活。这可能导致IL-23、IL-6和IL-1β的扩增，导致由IL-17和IL-22分泌的Th17细胞主导的免疫应答。
扩增方法
HER2特异性I型树突状细胞如本文其他地方所述
第1天：培养单核细胞(每孔1种肽)
第4天：成熟的HER2特异性I型树突状细胞
AM：脉冲与抗原(20ug/ml)
PM(6小时后)：加入IFN-γ
第5天：清除CD4+T细胞和I型树突状细胞共培养。
AM：LPS
6小时后：将2×106个CD4+T细胞与2×105个I型树突状细胞共培养
共培养后48-72小时：加入IL-7(10ng/ml)和IL-15(10ng/ml)
加入IL-7/15后24小时加入IL-2(5U/ml)
(在IL-2单独条件下，在共培养后72-96小时加入IL2(同时将IL-2加入IL2/7/15组)
疫苗接种
新辅助治疗后具有残留疾病的HER2+IBC患者接受了辅助性HER2脉冲I型树突状细胞疫苗。使用HER2 II类肽肽脉冲的PBMC产生免疫应答，通过ELISPOT测定IFN-γ的产生。对应答进行如下评估：(1)总体抗HER2应答率(应答>1肽)，(2)反应肽数(应答组库)和(3)累积应答6种HER2肽。接种前Th1应答与接种3个月和6个月后的应答进行了比较。
HER2特异性Th1细胞的产生
在体外，HER2特异性Th1细胞通过与HER2肽脉冲I型树突状细胞共培养而产生，并且使用单独的IL-2或IL-2、IL-7和IL-15扩增。随后通过重复HER2-肽脉冲I型树突状细胞共培养或通过抗CD3/CD28刺激来扩增Th1细胞。扩增倍数定义为：(扩增后T细胞数/扩增前T细胞数)；通过ELISA测定抗原特异性IFNγ产生的特异性。
现在描述本文公开的实验结果。
体内-对HER2脉冲I型树突状细胞疫苗接种的Th1应答：
应答率：接种疫苗前，只有一名IBC患者产生免疫应答，在减去未刺激的背景后，在实验孔中定义为>20SFC/106细胞。与接种疫苗前的结果相比，所有接种疫苗的IBC患者产生免疫应答，定义为抗HER2IFN-γposThl应答增加>2倍。
应答组库：平均应答组库从接种前0.5±1种肽增加到3.25±0.96种肽，接种后6个月时增加4±0.8种肽(p＝0.01)(图1)。
累积应答：疫苗接种后3个月(p＝0.04)，平均累积应答从36.5±38.3SFC/106接种前改善至151.0±60.0SFC/106，并在疫苗接种后6个月(p＝0.02)改善至198.4±39.7SFC/106(图2)。
HER2特异性Th1细胞的体外扩增：
初始扩增：IL-2相比IL-2/7/15。当使用IL-2、IL-7和IL-15刺激时，Th1细胞的平均倍数扩增明显高于单独使用IL-2(2.6±0.75相比1.0±0.12；p＝0.001)(图9A)。用IL-2、IL-7和IL-15和IL-2单独的刺激都导致在相同的HER2肽中的特异性Th1应答(图9B)。
二次扩增：HER2肽脉冲I型树突状细胞对抗CD3/CD28。用HER2肽脉冲的I型树突状细胞再刺激Th1细胞各自导致导致3.9倍的扩增，10.1倍的累积扩增。类似地，随后用抗CD3/CD28刺激导致4.4倍扩增，11.5倍累积扩增(p＝0.5，图10A)。用HER2特异性I型树突状细胞对Th1细胞的再刺激增强了特异性Th1应答；而用抗CD3/CD28的非特异性刺激导致HER2-肽特异性的总体损失(图10B)。
第三扩增：HER2肽脉冲I型树突状细胞。在用HER2特异性I型树突状细胞进行第三次刺激后，平均扩增倍数(4.32±0.5，图11A)和特异性(图11B)都再次增加。
第四次扩增：T细胞可以扩增第四轮刺激。观察到T细胞继续扩增并维持T细胞功能(图12)。本文提供的结果表明，用新辅助化疗治疗后，具有残留疾病的HER2+IBC患者的HER2-脉冲DC1疫苗接种增强了抗HER2 Th1免疫应答。抗HER2 Th1免疫应答在广度(应答谱)和深度(累积应答)方面均有所增加。HER2特异性Th1细胞的过度转移可能在复发CD4+Th1免疫应答中起作用。用IL-2、IL-7和IL-15刺激的HER2-肽脉冲I型树突状细胞的重复共培养可导致高度特异性抗HER2 Th1细胞的显著扩增。
不希望受任何特定理论的束缚，据信当受试者接种抗蛋白质抗原(例如肿瘤靶抗原)时，在接种疫苗后可以从受试者中取出血液。可以收集含有树突状细胞前体的血液以及针对肿瘤靶抗原特异性的低水平的T细胞。树突状细胞前体和T细胞彼此分离。树突状细胞前体可以装载肿瘤靶蛋白，然后激活。然后可以将它们与T细胞共培养，并以合适的顺序将细胞因子(IL-15、IL-7和IL-2)加入到共培养物中。这个周期可以每周重复一次，直到T细胞生长到足够数量(例如1×109)。然后可以将T细胞提供给最初受试者，将大量T细胞灌注，使其身体不能自然产生。这种大型的抗原特异性T细胞可以具有很强的抗肿瘤活性。
本文引用的每个专利，专利申请和出版物的公开内容通过整体引用并入本文。虽然已经参考具体实施例公开了本发明，但是显然，在不脱离本发明的真实精神和范围的情况下，本领域技术人员可以设计出本发明的其它实施例和变型。所附权利要求旨在被解释为包括所有这样的实施例和等同变化。

Claims (26)

1.扩增T细胞的方法，所述方法包括使所述T细胞与树突状细胞，至少两种细胞因子和T细胞生长因子中的一种或多种接触。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述T细胞与抗原接触，从而产生抗原特异性T细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述树突状细胞是I型树突状细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少两种细胞因子是白细胞介素-7(IL-7)和白细胞介素-15(IL-15)。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述T细胞生长因子是白细胞介素-2(IL-2)。
6.根据权利要求1所述的方法，包括：
a)将T细胞与体外结合抗原的自体I型树突状细胞DC接触，从而产生抗原特异性T细胞；b)使抗原特异性T细胞与IL-7和IL-5接触以产生刺激的抗原特异性T细胞；
c)将刺激的抗原特异性T细胞与IL-2接触，从而产生维持抗原特异性和细胞功能的扩增的抗原特异性T细胞群。
7.一种通过根据权利要求1-6所述的任何一种方法产生的T细胞。
8.一种培养的扩增抗原特异性T细胞的群，其通过根据权利要求1-6所述的任何一种方法产生抗肿瘤活性，其中所述细胞扩增至足以在哺乳动物中有效治疗的数量。
9.一种培养的扩增抗原特异性T细胞群，其通过根据权利要求1-6所述的任何一种方法产生抗肿瘤活性，其中将细胞扩增至足以有效表位作图的数目。
10.编码来自抗原特异性T细胞的T细胞受体(TCR)的分离的多核苷酸，其中所述抗原特异性T细胞是通过根据权利要求1-6所述的任何一种方法产生的。
11.一种免疫治疗方法，包括将T细胞施用于有需要的受试者，其中所述T细胞通过根据权利要求1-6所述的任何一种方法产生。
12.一种扩增T细胞群的方法，所述T细胞群包含从已经接种抗原的受试者的血液样品获得的至少一种T细胞，包括以下步骤：使所述T细胞与一种或多种树突细胞或其前体、至少两种细胞因子和一种T细胞生长因子接触。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述血液样品含有至少一种特异于疫苗抗原的T细胞群和至少一种树突状细胞前体。
14.根据权利要求12所述的方法，其中树突状细胞前体用抗原脉冲并激活至抗原特异性I型树突细胞(DC1)，然后与所述T细胞共培养以产生抗原特异性I型树突细胞。
15.根据权利要求12所述的方法，其中至少两种细胞因子是白细胞介素-7(IL-7)和白细胞介素-15(IL-15)。
16.根据权利要求12所述的方法，其中所述T细胞生长因子包括白细胞介素-2(“IL-2”)。
17.根据权利要求12所述的方法，包括：
a)在患者样品中用抗原特异性T细胞自体I型树突状细胞(DC1)体外共培养所述T细胞；
b)使来自步骤a)的细胞与IL-7和IL-5接触以产生刺激的抗原特异性T细胞；和
c)随后将刺激的抗原特异性T细胞与IL-2接触，由此产生维持抗原特异性和细胞功能的扩增的抗原特异性T细胞群。
18.根据权利要求17所述的方法，还包括重复步骤a)至c)从一次到至少三次以产生进一步扩增的抗原特异性T细胞群。
19.根据权利要求12所述的方法，其中所述T细胞是CD4+。
20.根据权利要求12所述的方法，其中所述抗原是HER2。
21.扩增CD4+T细胞群的方法，该CD4+T细胞群包含至少一种从已经接种了HER2的乳腺癌患者的血液样品获得的CD4+T细胞，包括以下步骤：将所述CD4+T细胞与一种或多种树突状细胞或其前体、至少两种细胞因子和一种T细胞生长因子接触。
22.根据权利要求21所述的方法，其中样品中的至少一种树突状细胞前体用HER2MHCII类肽进行脉冲并与所述CD4+T细胞接触。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述至少两种细胞因子是白细胞介素-7(IL-7)和白细胞介素-15(IL-15)。
24.根据权利要求21所述的方法，其中所述T细胞生长因子是白细胞介素-2(IL-2)。
25.根据权利要求21所述的方法，包括：
a)用所述HER2脉冲的I型树突状细胞共培养如权利要求1所述的T细胞；
b)使来自步骤a)的细胞与IL-7和IL-15接触以产生刺激的抗原特异性T细胞；
c)随后将刺激的抗原特异性T细胞与IL-2接触，由此产生维持抗原特异性和细胞功能的扩增的抗原特异性T细胞群。
26.根据权利要求25所述的方法，还包括重复步骤a)至c)从一次至至少三次以产生进一步扩增的抗原特异性T细胞群。
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