TWI374031B

TWI374031B -

Info

Publication number: TWI374031B
Application number: TW093140800A
Authority: TW
Inventors: Hiroshi Shiku; Atsunori Hiasa; Satoshi Okumura; Hiroaki Naota; Yoshihiro Miyahara
Original assignee: Univ Mie; Takara Bio Inc
Priority date: 2004-10-01
Filing date: 2004-12-27
Publication date: 2012-10-11
Also published as: US8168191B2; KR20060029591A; JP2006101735A; JP4731867B2; KR20100028074A; US20060073126A1; TW200611706A; US20090068209A1; US9243227B2; KR101008245B1; US20120238012A1

Description

1374031 九、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明係關於一種經導入RNA之T淋巴細胞作為抗原呈現細胞加以利用之抗原特異性之T淋巴球之誘導方法，以及將經誘導之T淋巴球作為癌症或感染症之治療劑之利用。又，關於一種對於作為腫瘤相關抗原之MAGE-A4或者

SAGE具有特異性之HLA-A2402限制性之細胞傷害性T淋巴球（CTL)及識別其之抗原肽，以及作為該等CTL誘導劑及制癌劑之利用。進而，關於一種用以檢測出該CTL之MHC-抗原肽複合體4聚體化之四聚物。【先前技術】於細胞傷害性T淋巴球（CTL)中，具有可藉由特異性T細胞受器（T cell receptor ;以下略稱為TCR)識別複合體，從而傷害於細胞表面呈現該複合體之細胞者，上述複合體為抗原肽與經主要組織適合性抗原基因複合體（major histocompatibility gene complex ; 以下，略稱為 MHC)所編碼之主要組織適合性抗原MHC(如為人類，則稱為人類白血球抗原（human leukocyte antigen)，以下略稱為HLA)分子之結合物。如此之CTL由於僅識別傷害含有與自體相同之HLA分子之目標細胞，故而得以稱之為HLA限制性CTL。因此為使該細胞之傷害反應成立，必須具備如下情形，1)存在具有特異性TCR之CTL，2)必須存在不僅與HLA結合，且可形成可藉由TCR識別之複合體的抗原肽，才能成為可於呈現於 HLA之CTL中得以識別之抗原肽。 98408-981218.doc ί i 1374031 如此之抗原肽藉由例如於哺乳類細胞之細胞内合成之打原等，於内質網中得以處理，並分解為較小之抗原決定^ 肽而生成，進而與HLA分子相會合，呈現於細胞表面。換言之，於由多個亞單元所構成之蛋白體複合體中蛋白質可分解為由8〜15個胺基酸所構成之肽，該等中之若干終由 TAP運輪體自細胞質運載至内質網。若該等肽可以内質網與種類Ι/β2微球蛋白（microglobulin)之異質二聚物相結合，則可作為3分子複合體得以穩定化，並通過高基氏體，輸送至細胞表面。表現腫瘤相關抗體或者腫瘤特異性抗原蛋白質之腫瘤細胞應可呈現於腫瘤細胞表面藉由T淋巴球得以識別之HLA限制性抗原肽。進而’已明確即使由病毒、細菌或原蟲、以及真菌所引起之感染，對於該等微生物所具有之抗原之CTL於感染防禦方面可具有重要角色。眾所周知HLA種類I分子主要有HLA-A、·Β、-C，而結合於該等並得以呈現之抗原肽包含8〜丨〇個胺基酸，進而具有根據各個HL A分子而各不相同之一定構造上的特徵。例如，尤其眾所周知的是作為結合於世界上最常見之 HLA-A2.1分子之肽係包含9〜10個具有自N末端第二位之 Leu，且具有於C末端之Leu或者Val之胺基酸者。乂，尤其眾所周知的是結合於以日本人為首之亞洲人種中較多之 HLA-A24分子之肽係包含9〜10個含有自N末端第二位之 Tyr、Phe、Met以及Trp中之任一者，且具有於c末端之Leu、 lie、Trp以及Phe中之任一者之胺基酸者（非專利文獻丨）。 98408-981218.doc 1374031 至今為止作為抗原肽已被鑒定之腫瘤抗原，有對於 HLA-A1 之 MAGE-卜 MAGE-3，對於 HLA-A2.1 之 MAGE-3、 MARTI、酪胺酸酶、gpl〇〇 ' HER2/neu、CEA 等，對於 HLA-Cwl 之 MAGE-3，對於 HLA-B44 之 MAGE-3，對於 HLA-B37 之 MAGE-A4，對於 HLA-A24 之 MAGE-1 、

MAGE-2、MAGE-3、CEA、HER2/neu、酪胺酸酶 ' β·索烴素（catenin)等。該等中之多數者首先株化識別腫瘤細胞之種類I限制性CTL，並鑒定該CTL所識別之腫瘤抗原，繼而藉由基因學之方法選出腫瘤抗原蛋白質中之最小單位，進而以有關對於HLA種類I分子結合主結構之資訊為基準選出最小單位中之肽（非專利文獻2)。又，首先基於與上述HLA 種類I分子結合肽共通之主結構構造，選出腫瘤抗原蛋白質中之HLA種類I分子結合肽，繼而利用抗原呈現細胞選擇可誘導CTL者，其後藉由可否誘導對腫瘤細胞具有傷害性之 CTL而最終決定抗原肽。（非專利文件3、4)。

另一方面，HLA種類I分子可分類為若干亞型，但其之保有亞型之種類於人種間具有較大差異，全世界中HLA-A2為最多，占白種人之45%。因此，該HLA-A2限制性抗原肽之鑒定最為先進。HLA-A2於曰本人申佔有40%，然而若觀察其亞型則與白種人相似，HLA-A*0201為20%，剩餘較多的係A* 0206。對於該等亞型之結合肽係互為不同，主要研究之HLA-A2為HLA-A*0201。而另一方面，HLA-A24佔有日本人60%以上，在亞洲人種中該HLA-A24與其他人種相比佔有率較高。因此，HLA-A24限制性抗原肽之發現具有如下 { S3 98408-98l218.doc 1374031 重要之作用，對於藉由誘導於亞洲人種尤其日本人中對腫瘤細胞特異性作用之CTL而提供治療腫瘤方面有效之cTl。即使相同之抗原，亦由於基於HLA之差異而抗原肽不同，因而誘導利用有抗原肽之CTL係較為煩雜。為解決該問題經過實行各種研究，然而仍未得到可滿足之成果，所研究之一為T淋巴球誘導方法’其係將抗原基因形質導入來自患者本身（自體）之抗原呈現細胞中從而對其加以利用。作為抗原呈現細胞，對作為專職抗原呈現細胞而眾所周知之B 細胞、巨噬細胞、以及樹突狀細胞加以研究，並以樹突狀細胞為中心，實施作為疫苗之佐劑等而使用之臨床試驗（非專利文獻5)。然而’該等抗原呈現細胞存在為對於免疫誘導準備必須之量而耗費勞力之問題。B細胞藉由EB病毒之不死化可大量調製，然而就使用病毒而言存在安全性之問題。又’關於基因導入法’不可否認使用病毒載體或質體 DNA之基因導入，將基因插入染色體上，可能產生新的變異體。非專利文獻 1 : Journal of Immunology(J. Immunol)，第 155卷，第 4307〜4312頁（1995)。非專利文獻 2 : Proceedings of the National Academy of The Sciences of The USA(Proc. Natl· Acad. Sci. USA),第 91 卷，第 3515〜3519頁（1994)。非專利文獻 3 : Proceedings of the National Academy of The Sciences of The USA，第 91卷，第 2105〜2109 頁（1994) 非專利文獻 4: Journal of Experimental of Medicine (J. 98408-981218.doc •9· 1374031

Exp. Med)，第 179卷，第 92 卜930 頁（1994) 非專文獻 5 : Journal of Immunotherapy(J. Immunotherapy)，第21卷，第41〜47頁（1998) [發明所欲解決之問題]

HLA-A24限制性抗原肽，於腫瘤相關抗原之情形時具有 MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、CEA、HER2/neu ' 酪胺酸酶、β索烴素等，但與HLA-A2.1相比，其解析依然落後，故而業者希望發現對於種種腫瘤抗原的新穎抗原肽。因此亞洲人種，尤其日本人中對腫瘤細胞起特異性作用之CTL 之解析亦較為落後，所以尚無法提供對於腫瘤治療較為有效之CTL。又，使用眾所周知作為專職抗原呈現細胞之Β細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞實施CTL誘導試驗具有該等細胞之處理問題，例如採集或擴大培養之問題。此外，先前，關於Τ 淋巴球之抗原呈現能尚不清楚。

CTL為藉由該細胞表面之Τ細胞受器（TCR)與CD3分子之複合體，與MHC分子共同識別結合於抗原呈現細胞或者目標細胞表面之MHC分子之抗原肽，並得以活化，從而引起各種免疫反應，關於CTL動態或功能之解析必須使用細胞自體，因此使用各種細胞株、抗原基因轉形株等實施各種研究從而不斷實行該解析。然而，最近使用之MHC四聚物係以生物素-鏈黴抗生素蛋白法將MHC-抗原肽複合體4聚體化者，顯而易見代替抗原呈現細胞或目標細胞，又作為具有目標TCR之CTL之特異性測定法，其有效性較高。然 98408-981218.doc ί S] 1374031 而，由於對應於TCR，換言之，對應於hla以及抗原肽之差八所必湏之複合體各自不同，因而需要多種四聚物》【發明内容】本發明者等研究對於腫瘤抗原有效之CTL之誘導方法，其…果知悉如下，可以植物血凝素等之T細胞活化劑刺激自體淋巴球，使用以電穿透法將編碼抗原之RNA導入於其者作為抗原呈現細胞，隨後即可誘導抗原特異性CT]L。進而，誘導對於作為膣瘤抗原之MAGE_A4、SAGE2 HLA_A24限制性CTL，從而鑒定為該CTL所識別之HLa_A24限制性抗原肽係含有以序列編號1或2所表示之胺基酸序列之肽。因此，可明確該抗原肽藉由人類末梢血液淋巴球誘導（：1^較為有效。同時，明確知悉，將使用序列編號丨或2之抗原肽而調製之MHC-肽複合體以生物素_鏈黴抗生素蛋白進行4 聚體化之四聚物加以調製，其將對檢測CTL較為有效，從而完成本發明。本發明之第一態樣係關於一種T淋巴球，其經導入編碼作為目標抗原之RN A，並具有誘導可識別上述抗原之τ淋巴球之活性。本發明之第二態樣係關於一種含有第一態樣之T淋巴球之免疫誘導劑。本發明之第三態樣係關於一種識別上述抗原之T淋巴球之誘導方法，其特徵在於’使用第一態樣之T淋巴球作為抗原呈現細胞。本發明之第四態樣係關於一種癌症或感染症之治療劑， 98408-9812l8.d( 1374031 其含有藉由第·一悲樣之τ淋巴球之誘導方法而誘導之τ淋巴球作為有效成分。本發明之第五邊樣係關於一種C D 8陽性細胞傷害性τ淋巴球’其識別呈現複合體於細胞表面之細胞，該複合體係選自以序列編號1或2所表示之人類主要組織適合性抗原 (HLA)-A24限制性抗原肽以及其之功能性誘導體中至少一種之抗原肽與HLA-A24分子之複合體。

本發明之第六態樣係關於一種含有第五態樣之細胞傷害性T淋巴球作為有效成分之制癌劑。本發明之第七態樣係關於一種第五態樣之細胞傷害性τ 淋巴球之誘導劑，其含有選自以序列編號2所表示之人類主要組織適合性抗原（HLA)-A24限制性抗原肽以及其之功能性誘導體中至少一種之抗原肽作為有效成分。

本發明之第八態樣係關於一種制癌劑，其含有選自以序列編號1或2所表示之人類主要組織適合性抗原（HLa)_A24 限制性抗原肽以及其之功能性誘導體中至少一種之抗原狀作為有效成分。本發明之第九態樣係關於一種T細胞受器檢測用之四聚物’其含有以序列編波1或2所表示之人類主要組織適合性抗原（HLA)-A24限制性抗原肽以及其之功能性誘導體，且為第五態樣之細胞傷害性T淋巴球所具有。 [發明之效果] 藉由本發明可提供一種使用易於獲得之T淋巴球作為抗原呈現細胞之CTL之誘導方法，又’可提供一種（HLA)_A24 98408-981218.doc 1374031 限制性之新穎抗原肽。使用上述抗原呈現細胞、抗原肽而誘導之CTL於例如癌症治療方面較為有效。【實施方式】本發明之第一態樣係關於一種誘導抗原識別性之T淋巴球之方法，其特徵在於，使用經導入可編碼作為目標抗原之RNA之自體T淋巴球作為抗原呈現細胞（APC)。

於本發明中，使用編碼抗原（作為目標抗原）之RNA，該抗原較為理想的是可誘導特異性識別該抗原之細胞傷害性T 淋巴球。上述抗原並未特別加以限定，例如，可列舉腫瘤相關抗原，感染性微生物抗原。作為腫瘤相關抗原，除MAGE族以外，又可舉例SAGE、 LAGE、NY-ESO-1、WT-1、hTERT等。作為感染性微生物

抗原，可列舉EBNA-3A等之EB病毒抗原、CMVpp65等之巨細胞病毒抗原、療病毒抗原、流行性感冒病毒抗原、HI V 病毒抗原、沙門氏菌（Salmonella)抗原、桿鐵細菌（Shigella) 抗原、腸桿菌（Enterobacter)抗原以及來自原蟲或真菌之抗原等。編碼抗原之RNA通常可藉由基因學之方法調製。又，亦可使用自細胞調製之RNA。例如，若自細胞抽出編碼抗原之RNA並逆轉錄為cDNA，藉由PCR增幅該cDNA，則可於本發明中使用以該增幅DNA作為模板而轉錄之RNA。於獲得選殖cDNA之質體之情形時，可使用該等作為RNA合成之模板。藉由如此之方法，即使自少量細胞亦可調製可用於本發明之充分量的RN A。

98408-981218.doc -13- 1374031 人為將編碼抗原之RNA導入於作為抗原呈現細胞而使用之T淋巴球之方法並無特別限定，可以電穿透法 (electroporation)、粒子槍法、填酸飼法、脂轉染法、脂質體法等物理方法導入。又，可實施使用反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體等之病毒載體之基因導入，於細胞内表現RN A。

若作為抗原呈現細胞而使用之T淋巴球為患者本身之 CD3陽性細胞（自體T淋巴球），或者來自HLA之類型與患者相一致之施體之CD3陽性細胞，則CD4，CD8陽性均為良好，然而較好是CD4陽性T淋巴球。再者，接受同種造血幹細胞移植等移植之患者亦可使用移植片施體之T淋巴球。T 淋巴球必須使用植物血凝素（PHA)、刀豆蛋白A(ConA)等之凝集素或抗CD3抗體，並使用添加有IL-2、IL-7等培養基實行活化。用於活化之條件為通常使用之條件並無特殊限定。作為抗原呈現細胞而使用，須實行伽馬射線照射或絲裂黴素等處理。

使用上述第一態樣之T淋巴球作為抗原呈現細胞，可誘導抗原識別之T淋巴球（本發明之第三態樣）。受到誘導之抗原識別性T淋巴球為CD8陽性之細胞傷害性T淋巴球（CTL)或 CD4陽性之疱疹T淋巴球之任一者，然而隨所使用之起始材料而各不相同，例如，可使用自血液採集之末梢血液單核細胞（PBMC)或以使用抗CD8抗體與磁珠之方法自PMBC分離之CD8陽性淋巴球，若使用PBMC，則可獲得通常混合抗原識別性CTL以及疱疹T淋巴球兩者之淋巴球，然而若使用 i S1 98408-981218.doc 14 1374031 CD8陽性細胞，則可獲得含有CTL之T淋巴球。於活體外誘導該CTL之情形時，例如可使用來自上述Τ淋巴球與HLA之類型相一致之生物體之體外切除試料加以誘導。於本說明書中之體外切除試料，除血液以外，亦包含藉由手術等切除之淋巴結、脾臟、其他各種内臟，並可較好地使用存在於該等試料中之淋巴球或浸潤淋巴球細胞。例如於使用血液之情形時，可藉由將經導入上述抗原

RNA之Τ淋巴球的抗原刺激加以重複，而誘導CTL至由末梢血液單核細胞（peripheral blood mononuclear cell·;以下略稱為PBMC)所得之淋巴球，上述末梢血液單核細胞係自HLA 類型為一致之人類血液調製而成。作為具有穩定之細胞傷害性之淋巴球，經誘導之CTL亦可藉由加以選殖化而予以維持。例如，可藉由將银養細胞、抗原、各種細胞激素、抗CD3抗體刺激供予經誘導之CTL中而得以增殖。

經誘導之抗原特異性CTL之活性於將來自於誘導CTL抗原之肽加以脈衝處理後，可藉由對以放射性物質等標識之目標細胞之傷害性（放射性物質之游離）予以測定。又，亦可藉由放射能之獲得而測定對於將抗原肽施以脈衝處理之抗原呈現細胞之CTL增殖反應。可於抗原DNA作為形質導入或經導入抗原RN A之目標細胞或抗原呈現細胞而使用。或者可藉以測定自CTL或目標細胞得以抗原特異性游離之抗原特異性之GM-CSF、IFN-γ等細胞激素量而檢測。亦可使用藉由其他螢光色素等得以標識之抗原肽-HLA複合體而直接確認。於該種情形時，例如使CTL與和CTL特異性抗體

98408-981218.doc -15- 偶合之第一螢光標記接觸’其後使之與和第二螢光標記耦合之抗原肽-MHC複合體接觸’繼而藉由FACS(螢光-活化細胞分類（fluorescence-activated cell sorting))分析實施二重標識細胞之存在。如此處理’使用第一態樣之T淋巴球而誘導之ctl可作為癌症或感染症之治療劑使用（本發明之第四態樣）。該治療劑可以下述第六態樣之制癌劑為標準施以製劑化而用於治療0 本發明之第一態樣係關於一種免疫誘導劑，其含有第一態樣之T淋巴球作為有效成分。該免疫誘導劑可以該τ淋巴球懸濁於醫藥上所容許之稀釋劑中之形式提供。再者，此處所言之稀釋劑為例如適於保存該T淋巴球之培養基、生理鹽水、或者磷酸緩衝生理鹽水，以培養基而言並無特殊之限疋，然而一般可列舉有RPMI、AIM-V、X-VIVO10等之吳養基。又於該免疫誘導劑中亦可基於穩定化之目標添加醫藥上所容許之載體。再者此處所言之載體為人類血清白蛋白等。於該免疫誘導劑中含有第一態樣之每一種τ淋巴球為 1〇4〜108個/1111之1'淋巴球，而較好是55<1〇5〜5><1〇7個/如。上述免疫誘導劑除可對於上述τ淋巴球之施體（自體）拍與外，亦可對HLA之類型為一致之其他個體（異體）投與。上述免疫誘導劑投與於人類之情形時，例如可以注射器向成下 '皮内、靜脈内投與，就成人每人之注射量而言通常巧设為Τ淋巴球之數量為每一種丁淋巴球1〇6〜1〇w個。再者上述範圍為大致標準故並非僅限於此。進而，可反覆投與詞 98408-981218.doc •16- 製劑直至獲得期望之效果。再者作為有效成分之T淋巴球每 —種為1〇6〜l〇lG個。再者上述範圍為大致標準故並非僅限於此。又，由於所含有之細胞係來自於投與之人類者，或HL A 之類型為同一者’故而該免疫誘導劑之毒性未特別確認。於已投與上述免疫誘導劑之個體中可誘導CTL，其識別由RN A編碼之抗原’而該rn A藉由該免疫誘導劑所含有之τ 淋巴球得以導入。本發明之第五態樣係一種CD8陽性之細胞傷害性T淋巴球（CTL) ’其識別於細胞表面呈現以序列編號丨或2所表示之 HLA-A24限制性抗原肽或其之功能性誘導體與HLA-A24分子之複合體之細胞。顯示於序列編號1、2之胺基酸序列之肽為分別來自MAGE-A4、SAGE之HLA-A24限制性抗原肽。因此，上述CTL對於目標細胞或者抗原呈現細胞將產生特異性細胞溶解或細胞激素游離反應。於本發明書中，所謂HLA-A24限制性抗原肽之功能性誘導體係指具有與HL A-A24分子之複合體形成能，並且可由可識別複合體之CTL得以識別者，所形成的複合體為以序列編號1或2表示之抗原肽與HLA-A24分子之複合體。例如’於以序列編號1或2表示之肽之胺基酸序列中，藉由1個或數個胺基酸之缺失、取代為其他胺基酸或胺基酸類似物、及/或附加1個或數個胺基酸或者胺基酸類似物，或者該等之組合而使胺基酸序列不同，然而其係具有與 HLA-A24分子之複合體形成能，並且所形成之複合體係由本發明之CTL得以識別之肽。功能性誘導體之胺基酸之序 98408-981218.doc 17 1374031 列長度較好是9〜10個殘基，但並非僅限於此。再者，所謂本說明書中之胺基酸類似物表示各種胺基酸之N-醯化物、 0-醯化物、酯化物、醯胺酸化物、烷化物等。又，若與HLA-A24分子之複合體藉由CTL得以識別，則抗原肽之N末端或游離的胺基可結合醛基、乙醯基、第三丁氧基羰基（t-Boc)等。又，若與HLA-A24分子之複合體藉由 CTL得以識別，則抗原肽之C末端或游離的羧基可結合曱基、乙基、第三丁基、苯曱基等。

功能性誘導體可藉由使用可識別以序列編號1或2表示之抗原肽與HLA-A24分子之複合體之CTL加以鑒定，例如，可列舉下述方法。

第一方法：將作為功能性誘導體之候補物質與HLA-A24 表現細胞混合，洗淨未與HLA-A24分子結合之候補物質後，使之與CTL產生反應。若可確認候補物質之特異性、細胞傷害性、細胞激素之游離、或增殖反應則判斷為功能性誘導體。第二方法：將候補物質添加於具有抗原呈現能之細胞中，使之反應適當之時間，例如，對於接受將抗原載入於細胞内之處理，並且於細胞表面呈現抗原肽與HLA分子之複合體所需之時間，反應後，與CTL產生反應。若可確認候補物質之特異性之細胞激素游離或增殖反應則判斷該物質為功能性誘導體。第三方法：使編碼候補物質之胺基酸序列之核酸結合於下述具有抗原呈現能之細胞上之HLA-A24分子上可呈現肽 I S3 98408-981218.doc -18- 1374031 之表現載體中，藉由該重組載體使CTL與具有經轉形之抗原呈現能之細胞反應。若可確認候補物質之特異性之細胞激素游離或增殖反應則判斷該物質為功能性誘導體。

至於上述功能性誘導體，例如於以序列編號1或2表示之肽之胺基酸序列中，為強化與HLA-A24分子之結合，而可列舉於如下肽之中具有與HLA-A24分子之結合能，並且與 HLA-A24分子之複合體為以序列編號1或2表示之肽和 HLA-A24分子之複合體可藉由CTL得以識別者，上述肽係自N末端起第二位之胺基酸於結合於HLA-A24分子之肽中以選自特徵性之Tyr、Phe、Met、Trp之胺基酸取代者，及/ 或C末端之胺基酸於結合於HLA-A24分子之肽中以選自 Leu、lie、Trp、Phe之胺基酸取代者。例如，可舉例將作為序列編號2表示之胺基酸序列之C末端胺基酸之Phe取代為

Leu之肽。

又，於序列編號1或2所示之胺基酸序列之1個或數個胺基酸為經取代之胺基酸序列表示之肽，亦可列舉如下肽中，具有與HLA-A24分子之結合能，與HLA-A24分子之複合體可藉由本發明之CTL得以識別者，上述肽係取代為側鏈與分別得以取代之胺基酸類似之胺基酸或者胺基酸類似物者。作為側鏈類似之胺基酸可列舉例如甘胺酸（Gly)與丙胺酸（Ala);纈胺酸（Val)、異亮胺酸（lie)、白胺酸（Leu)與甲硫胺酸（Met);天冬醯胺（Asn)與榖胺醯胺（Gin);天冬胺酸（Asp) 與穀醯胺酸（Glu);絲胺酸（Ser)與蘇胺酸（Thr);離胺酸（Lys) 與精胺酸（Arg);苯丙胺酸（Phe)與酪胺酸（Tyr)。

98408-981218.doc 19 1374031 本發明之第六態樣係關於一種含有第五態樣之CTL作為有效成分之制癌劑。該制癌劑特別對於可確認第五態樣之CTL所識別抗原表現即對於可確認MAGE-4或SAGE之表現之癌症治療有效。可以將上述CTL懸濁於醫藥上所容許之稀釋劑中之態樣提供該制癌劑。再者，此處所言之稀釋劑為例如適於保存 CTL之培養基、生理鹽水、或磷酸緩衝生理鹽水。至於培養基則並非係特別限定者，一般可列舉RPMI、AIM-V、 X-VIVO10等培養基。又於該制癌劑中亦可以穩定化為目標添加醫藥上所容許之載體。再者此處所言之載體為人類血 /月白蛋白等。於該制癌劑申可含有第五態樣之每種Ctl為 104〜108個/ml之CTL ’而較好是5χ105〜5M07個/ml。將上述制癌劑投與人類時可使用注射器投與，至於成人每人注射量，通常設為CTL數為CTL每種為1〇6〜ίο1。個。再者’上述範圍係大概標準並非僅限於此。又，因作為有效成分之CTL係來自注射人類者，或HLA之類型為相同者，故而未特別確認該免疫誘導劑之毒性。本發明之第七態樣係關於一種第五態樣之CTL之誘導劑，其含有序列編號1或2之抗原肽或其之功能性誘導體作為有效成分。CTL誘導劑可作為單獨或與其他分子（輔助τ 細胞抗原肽以及/或佐劑）之混合物以將抗原肽懸濁於生理鹽水或碌酸緩衝生理鹽水中之形式而供給，該抗原肽亦可作為與高級脂肪酸或輔助T細胞抗原肽之共同結合體咬與 HLA-A24分子之複合體。該誘導劑中可含有抗原肽每種^ 98408-981218.doc -20- iS] 1374031 〇_οι〜1〇〇重量％的抗原肽，而較好是〇丨〜95重量0/〇。該CTL誘導劑可利用於用以在活體外使本發明之cTl增殖之培養基之添加物，以Τ淋巴球增殖活性、延遲型皮膚反應作為指標之免疫發作狀態之診斷。例如作為對培養基之添加物而使用時，使用量係以培養基中之肽濃度計，抗原肽每種為1 ng/ml〜100 pg/m卜較好是1〇μ§/ηι卜至於培養基一般可列舉含有血清之RPMI、ΑΙΜ_ ν等之培養基。本發明之第八態樣係關於一種制癌劑，其含有選自序列編號1或2之抗原肽或其功能性誘導體作為有效成分之至少一種之抗原肽。該制癌劑可以提供為”單獨的抗原肽、2) 抗原肽與醫藥上所容許之載體及/或稀釋劑之混合物 '或3) 進而若為必須則以於上述1)st2)中加入輔助劑之形式。再者此處所s之載體例如為人類血清白蛋白，又至於稀釋劑則例如為磷酸緩衝液、蒸餾水、生理鹽水等。至於輔助劑可列舉藥學上所容許之佐劑。至於佐劑有⑷弗氏听⑽幻完全佐劑、（b)弗氏（Freund)不完全佐劑、⑷氫氧化鋁、明礬等之無機物凝膠體、⑷溶血印磷脂、二甲基十八烧基漠化錢等界面活性劑、（e)硫酸右旋㈣、聚1C等聚陰離子、⑴ 牧胺I基肽、特夫素等之肽、（g)立彼⑻叫公司製之單鱗酿脂質（m〇noph〇sph〇ryi lipid ; MpL)A#，然而並未特別加以限定。將該制癌劑投與人類時，例如亦可以注射器向皮下、皮内、靜脈内投與’亦可以喷霧等方法自黏膜之皮膚吸收等，與。於該制癌劑中可含有每—種該抗原肽為g〇i〜i〇〇重量％之抗原肽，而較好是卜95重量％。成人每人之投與 ]

98408-981218.doc -21 - 1374031 量以肽濃度計，每一種抗原肽為Ο · 1 pg/kg〜10 mg/kg、較好是1 pg/kg〜1 mg/kg，特別好的是1 pg/kg〜100 gg/kg。再者投與於人類時，該肽之毒性並未特別加以確認。

本發明之第九態樣係關於一種四聚物，其結合於含有以序列編號1或2表示之人類主要組織適合性抗原（HLA)-A24 限制性抗原肽以及其功能性誘導體且為第五態樣之細胞傷害性T淋巴球所具有之TCR。該四聚物係將於β2微球蛋白存在下製作之HLA-A24分子與抗原肽之複合體以生物素-鏈黴抗生素蛋白法實行4聚體化者，其可代替CTL之細胞傷害性測定而可作為以較短時間測定之簡單活性測定法。特別是，可用於對於僅含有微量PBMC等之CTL之檢體中CTL之檢測或CTL之分離。可使用於用以監測患者體内Τ淋巴球之ELISPOT (Enzyme-linked Immunospot，酵素-連結之免疫點）或細胞傷害性試驗之目標細胞使用四聚物可用於細胞傷害性T淋巴球之監測。

[實施例] 以下，藉由實施例就本發明進一步加以具體說明，但本發明並非係侷限該等實施例者。實施例1使用HLA-A2402基因轉殖鼠之HLA-A2402限制性 CTL抗原決定位（抗原肽）之鑒定 (1)材料與方法 HHDA2402+/-P2m-/-小鼠構築由HLA-A2402之引導序列、人類β2微球蛋白、 ί 98408-981218.doc -22- 1374031 HLA-A2402al以及α2區域、H-2Db α3之轉膜區域，以及細胞質區域所成之DNA構造（HHDA2402)，並將其選殖於表現載體pcDNA3.1(易彼羅金公司製）。將HHDA2402之4-kb之 Sall-Notl片段注入於來自懷孕C57BL/6小鼠之卵子。使 HHDA2402表現之小鼠與β2ιη-/-小鼠（Jackson Laboratory， Bar Harbor’ ME)交配，將所獲得之HHDA2402+/-P2m+/-與β2ηι-/-小鼠交配，從而製作HHDA2402+/-p2m-/-小鼠（以下，HHDA2402小鼠）。

(2)細胞株於TAP運輪體缺乏株T2轉染HLA-A2402cDNA並製作 T2A24株。使用其他以下細胞株。乳癌細胞株R27(A2402陰性）、食道癌株KE-4(A2402陽性）、食道癌株TE-10(A2402陽性）、慢性骨髓性白血病株K562(A2402陰性）、肺癌株 11-18(A2402陽性）、胎兒性腎細胞293(A2402陰性）》以將 HLA-A2402cDNA轉染之方式製作 R27A244、K562A24、 293A24。人類B-淋巴母細胞（LCL)係自源自HLA-A2402陽性或陰性之自願者細胞使用EBV病毒並藉由常法得以製作。 (3) 質體將全長之MAGE-A4、SAGE、EBNA-3A之cDNA選殖於 pcDNA3.1。 (4) 基因槍之免疫 HHDA2402小鼠（6〜8週齡，雌）之腹壁内使用Helios Gene Gun System(Bio-Rad)以氦加壓350-400 psi投與塗布有質體 DNA之金粒子。再者，金粒子係依據製造廠商之手冊調製

98408-981218.doc •23· 1374031 的。二週後實施調壓之投與，在此一週後採集脾細胞。 (5) 小鼠CD8陽性T細胞之調製於最终免疫後第一週，藉由使用有CD8 a(Lyt2)微珠之 MACS系統（Miltenyi Biotec，德國），正向選擇CD8陽性細胞。所獲得之T細胞區份係以流式細胞分析儀分析純度為 95%以上者。 (6) ELISP0T檢定（小鼠）

以2 pg/ml之抗-小鼠 IFN-γ mAb(純種系 R4-6A2， PharMingen)於4°C塗布96孔之石肖化纖維ELISPOT薄板 (MAHA S4510 ; Millipore，Bedford，MA)—夜。於各孔以磷酸緩衝生理鹽水（PBS)洗淨後，於放入有FCS之培養基予以阻斷（37°C、2小時）。將源自免疫小鼠之分離狀態的新鮮 CD8陽性細胞（1 X 1 05/孔）以及各種肽脈衝處理之CD8陰性細胞（lx 106/孔）散播於各扎，並設為最終液量為200 μ卜以37°C 培養22小時後，使用加入有0.05% Tween 20之 PBS(PBS-Tween)充分加以洗淨，添加1.25 pg/ml生物素化之抗-小鼠IFN-γ mAb(PharMingen) ’以4°C培養一夜。以 PBS-Tween洗淨後，添加100 μΐ 1 pg/ml鏈黴抗生素蛋白-鹼性磷酸酶共軛物（Mabtech)，於室溫反應90分鐘並以 PBS-Tween洗淨後，以驗性填酸酶共輛物受質套組 (BioRad，Hercules，CA)實行染色。繼而，以蒸館水洗淨並停止反應，此後乾燥薄板，計算斑點數。 (7) 抗原決定位肽之推定以 Bioinformatics & Molecular Analysis Section(BIMAS)

{ SI 98408-981218.doc -24- 1374031 HLA Peptide Binding Prediction 網站(URL ; http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla-bind/)檢索可能具有 HLA-A2402結合能之9個殘基肽。選擇下述表1記載之五個來自SAGE之肽，10個來自MAGE-A4之肽，藉由肽合成機實行化學合成。此外，合成來自EB病毒之EBNA3A246_254 (RYSIFFDYM)以及來自 HER2 之 HER263-71(TYLPTNASL)。所使用之肽純度為90%以上。表1 抗原名胺基酸位置胺基酸序列 SAGE 841-848 NYER1FILL (序列編號3) 776-784 LYKPDSNEFi序列編號4) 715-723 LYATVIHDI(庠列編號2) 621 〜629 QYAAVTHNIC序列編號5) 250-258 TYNVPEEKMi序列編號6) MAGE-A4 239-247 VYGEPRKLLi序列編號7) 143-151 N YKRCFP VI(序列編號1) 271-279 EFLWGPRAL(序列編號8) 151-159 IFGKASESU序列編號9) 113-121 KVDELAHFLi序列編號 1 〇) 283-291 S YVKVLEHV(序列編號 11) 124-132 KYRAKELVT(序列編號 12) 199-207 KTGLLIIVL(序列編號 13) 301-309 AYPSLREAAi 序列編號 14) 43-51 SSPLVPGTU序列編號15) 使用遺傳因子搶將編碼來自EB病毒之ΈΒΝΑ3Α遺傳因子

之表現質體於HHDA2402小鼠上實行免疫。於二次免疫後’ 調製來自脾臟之CD8 + T細胞，使用於上述ΕΒΝΑ3Α246·254 肽施以脈衝之CD8陰性細胞作為目標細胞並實施ELISP0T 檢定。其結果可檢測出EBNA3A246.254肽特異性CTL(圖la)。其次，就來自為腫瘤.精巢抗原之MAGE-A4、SAGE之候補肽（上述表1)實施同樣之ELISP0T檢定。其結果於MAGE-A4 [S3 98408-981218.doc •25- 1374031 中 2 個狀（MAGE-A4239-247 及 MAGE-A4i43-151)為陽性（圖 lb)。同樣於SAGE中 2個肽（SAGE776-784 及 SAGE715_723)亦為陽性（圖lc)。其次，對野生型之C57BL6小鼠實施上述同樣之試驗，其後僅MAGE-A4239-247與SAGE776_784為陽性。因此，MAGE-A4143.151與SAGE7丨5·723可鑒定為呈現於HLA-A2402之抗原肽。

實施例2使用導入mRNA之CD4陽性PHA幼芽細胞之 HLA-A2402抗原肽特異性人類細胞傷害性T淋巴球（CTL)之調製 (1) mRNA之調製使MAGE-A4與SAGE質體為直鏈。活體外轉錄係使用T7 聚合酶（mMESSAGE mMACHINE T7 套組；Ambion， Austin，TX)並依據製造廠商之手冊而實施。此後，使用聚 Α 聚合酶（聚（Α)拖尾套組（Poly(A) Tailing Kit); Ambion， Austin，TX)並依據製造廠商之手冊實行聚甘胺酸化。將戶斤得之RNA懸濁於水中，使用前於-80°C保存。

(2) CD4陽性植物血凝素（PHA)幼芽細胞之調製將藉由使用有MACS CD4微珠（Miltenyi Biotec，德國）之正向選擇而分離所得之新鮮CD4陽性細胞，於24孔薄板 (Corning，NY)中以每孔 1 〜2χ106 個/ml RPMI-1640 培養基（25 mM Hepes、10%非活化人類AB血清、2 mM L-縠胺酿胺、 100U/ml青黴素、l〇〇pg/ml鏈黴素）之細胞濃度培植。於第 0天將10 pg/ml之PHA(HA15，Murex，UK)添加於培養基。於第3天將一半培養基交換為含有IL-2(20 U/ml)以及 98408^981218.doc •26· 1374031 IL-7(40 ng/ml)之完全培養基。每三日反覆同樣之操作。於培養後14〜28天以實施電穿透法之方式，使用所得之活化 CD4陽性細胞作為抗原呈現細胞。 (3) 於使用有mRNA導入之CD4陽性幼芽細胞之活體外之人類CTL誘導

將5χ105個藉由PBMC並使用MACS CD8微珠（Miltenyi Biotec)而分離之CD8 + T細胞藉由1χ1〇5個以放射線（3〇 Gy) 照射之mRNA導入CD4 + PHA幼芽細胞，於96孔圓底薄板 (Nunc)中施以刺激》7曰後，藉由ΙχΙΟ5個以放射線（30 Gy) 照射之mRNA導入CD4 + PHA幼芽細胞施以再刺激CD8 + T 細胞。進而於添加有IL-2(20 IU/m)之培養基中培養7天。 (4) CTL之活體外增幅

為了增幅含有抗原特異性CTL之敏感化CD8 + T細胞，而添加以電穿透法經導入目標抗原mRNA之自體LCL(5 χΙΟ6 個）、自體PBMC(2.5xl07個）與IL-2(20 IU/ml)，使用 25 ml 燒瓶（Corning)以無抗CD3抗體之狀態下加以培養。 (5)界限稀釋於96孔圓底薄片（Nunc)中以成為0.3個/孔之方式加以稀釋，並添加自體PBMC(5xl04個/孔），放射線照射LCL(lxl04 個/孔），IL-2(20 IU/ml)以及抗 CD3mAb(30 ng/ml)加以培養。將作為目標之抗原呈現細胞之溶解之CD8 + T細胞進而於存在放射線照射PBMC，放射性照射LCL以及抗CD3mAb 之狀態下得以增幅。 (6)ELISPOT檢定（人類） 3 98408-981218.doc -27· 1374031

將96孔之硝化纖維ELISPOT薄板（MAHA S4510 ; Millipore，Bedford，ΜΑ)以 2 gg/ml抗人類 IFN-YmAb〇-DIK)於4t：下塗布一夜。將各孔以PBS洗淨後，於加入有10% 人類AB血清之培養基實行阻斷（37°C、2小時）。將效應細胞 (2 X 1 〇4/孔）以及經過肽脈衝處理之T2A24細胞（5 X 104/孔）撒播於各孔。於37°(：下培養18小時後，以PBS-Tween充分洗淨，並添加1.25 pg/ml生物素化抗-小鼠iFN-γ mAb (PharMingen)，於 4°C 下培養一夜。以 PBS-Tween洗淨後，添加100 μΐ之1 pg/ml鏈黴抗生素蛋白-鹼性磷酸酶共軛物 (Mabtech)，於室溫下反應60分鐘，並以PBS-Tween洗淨，其後以鹼性磷酸酶共軛物受質套組（BioRad，Hercules，CA) 加以染色。繼而，以蒸餾水洗淨並停止反應，此後乾燥薄板，並計算斑點數。 (7)51Cr游離細胞傷害性檢定

細胞傷害性係依據常法而實施。目標細胞以100 gCi(3.7xl06Bq)51Cr實行標識，於96孔之V底薄片使lxlO4個目標細胞與改變細胞數之效應細胞於37。(：下反應。5小時後，收集1 00 μΐ上清液並加以測定。連續進行三次檢定，並計算三孔之特異性溶解之平均百分比。特異性細胞傷害活性（％)=[(各孔之測定值-最小放出值）/(最大放出值-最小放出值）]XI 00 於上式中，最小放出值係僅放有目標細胞以及Κ5 62細胞之孔之51Cr量，並表示來自目標細胞之5〗Cr之自由游離量。又’最大放出值表示於目標細胞添加界面活性劑三硝基曱 I S] 98408-981218.doc -28- 1374031 苯X_100從而破壞細胞時之51Cr游離量。 - 以活體外經導入mRNA之自體CD4 + PHA幼芽細胞使自健康人而調製之CD8 +細胞敏感化。以經導入MAGE-A4 mRNA之自體CD4 + pha幼芽細胞施以兩次刺激後，可獲得 MAGE-A4特異性整體CTL(圖2a)。以mRNA導入自體LCL、

自體PBMC以及IL-2增幅其整體細胞所獲得之細胞顯示於將MAGE_A4i43-i5i肽加以脈衝處理之T2A24細胞中特異性反應（圖2b)。由限界稀釋法所得之# 2-28細胞藉由 MAGE-A4M3·丨S1四聚物染色為陽性，但作為對象使用之四聚參物並未染色（圖3a)。繼而’該# 2-28細胞於將MAGE-A4143-151 肽施以脈衝處理之目標細胞對於HLA-A2402限制性顯示出細胞傷害性（圖3b左）。進而，該2-28細胞對於表現MAGE-A4 以及HLA-A2402兩者之腫瘤細胞株顯示出細胞傷害性（圖 3b右）。因此MAGE-A4143_151肽顯示出如下特性，不僅於 mRNA導入CD4+PHA幼芽細胞而且於HLA-2402陽性腫瘤細胞中MAGE-A4抗原顯示為細胞内處理從而得以抗原呈現。其次，SAGE7丨5·723特異性整體CTL透過經導入截平之 SAGE mRNA之CD4 +幼芽細胞藉由兩次刺激得以誘導（圖 4a)。藉由流式細胞分析儀分析，可知悉該整體CTL係含有 SAGE7 1 5.723 HLA-A24四聚物陽性之CD8+細胞者（圖4b)。 SAGE7 1 5.723待異性HLA-A24 CTL細胞# 22藉由界線稀釋法得以製作。該# 22細胞為SAGE7丨5_723 HLA-A24四聚物陽性 (圖5a)。該細胞若與透過將SAGE基因全長編碼之質體而實

98408-981218.doc -29- 1374031 行基因導入處理之293-A2402共同培養則分泌IFN-γ(圖 5b)。該細胞對於K562A24以及R27A24(兩者均表現 HLA-A2402與SAGE)任一者均顯示出細胞傷害性（圖5c左以及中）。進而對於經導入SAGE基因之mRNA之A2402+ LCL 細胞顯示出特異性細胞傷害性（圖5c右）。實施例3 SAGE7丨5·723特異性CD8+T細胞可自A2402陽性健康人以較高準確率得以誘導。

使用有活體外之肽經過脈衝之CD8-之PBMC對人類CTL 之誘導

於ΙχΙΟ7個CD8陰性PBMC中以10 μΜ之肽於室溫下脈衝1 小時，而於37°C5%C02下脈衝1小時後，作為抗原呈現細胞使用。其次，對於經過分離之5χ105個CD8+T細胞，以將肽施以脈衝處理之1 X 106個之CD8-PBMC刺激10〜12日。於第 1、4、7曰，半量交換培養基，並追加人類1!^-2(20 11；/1111)、 IL-7(5 0 ng/ml)。誘導係於 24孔（Nunc)薄板以 200 μΐ之 RPMI 培養基（25 mM Hepes，10%非活化人類ΑΒ血清，2 mM L-穀胺醯胺，100 U/ml青黴素，1〇〇 gg/ml鏈黴素）加以實施。於HLA-A2402陽性之健康人志願者中，研究HLA-A2402 限制性SAGE71 5.723特異性CTL是否可藉由以將SAGE7丨5_723 肽脈衝處理之CD8陰性之PBMC於活體外刺激CD8 +細胞一次檢測而得以誘導。於6個HLA-A2402 +健康人中之3人，於活體外之混合淋巴球反應10曰後，檢測出 SAGE7 1 5.723HLA-A24四聚物陽性T細胞。於圖6表示其一例之解析結果。 ί S3 98408-981218.doc •30· 實施例4四聚物之製作以及流式細胞分析儀之分析 MHC-肽四聚物之製作，於大腸菌使之表現HLA-A2402重鏈與β2-微球蛋白作為不溶性聚合物。重鏈之C末端附加成為生物素化酶BirA之受質之序列。單體之ΗίΑ/β2-微球蛋白 /肽複合體於活體外在MAGE-A4143_m肽或SAGE7i5_723存在下使之可折疊。MHC於BirA酶重組體（Avidity，Denver，co， US A)得以生物素化，並使用藻赤癖素-標記之鏈黴抗生素蛋白（Molecular Probes，Eugene，OR，USA)予以 4聚體化。於染色中，以四聚物20 pg/ml使敏感化CD8 + T細胞於 37°C下反應30分鐘，此後於三色抗-CD8 單株抗體 (Cal tag，Burlingame，CA，USA)與冰上使之反應 15 分鐘。洗淨後，所染色之細胞以流式細胞分析儀（FACS Calibur ; Becton Dickinson)分析。 [產業之利用可能性] 本發明之抗原識別T淋巴球之誘導方法可誘導對於抗腫瘤性或抗感染性微生物抗原具特異性之T淋巴球而與HLA 無關，故而所誘導之特異性T淋巴球作為對於癌症或感染症之免疫療法之治療劑有用。又，對於作為腫瘤相關抗原之 MAGE-A4或SAGE具有特異性之HLA-A2402限制性之細胞傷害性T淋巴球以及其所識別之抗原肽作為免疫治療法之制癌劑係有效。進而，使用該抗原肽之MHC-抗原肽複合體四聚物對於所調製之CTL之功能測定或投與CTL後之監測為有用。【圖式簡單說明】 98408-981218.doc -31 · 1374031 圖1係表示HHDA2402+/-P2m·/-小鼠中肽免疫原性之圖。亦係表示來自由使用（a)EBNA3AcDNA、（b)MAGE-A4cDNA 以及（c)S AGEcDNA之質體並藉由基因搶免疫之小鼠所調製之脾臟CD8+T細胞之IFN-yELISPOT檢定結果之圖。

圖2係表示來自MAGE-A4之肽於人類中的免疫原性之圖》(a)係表示於經導入MAGE-A4或SAGE之mRNA的自體 CD4 + PHA幼芽細胞中經過二次敏感化處理之人類整體 CTL之IFN-γ ELISPOT檢定結果之圖。經導入MAGE-A4或 SAGE之mRNA的自體LCL作為APC使用。（b)係表示於經導入MAGE-A4或SAGE之mRNA之自體LCL、自體PBMC與 IL-2(20 IU/ml)增幅孔# 2之結果之圖。以將候補肽施以脈衝處理之T2A24作為APC而使用所得之細胞之方式實施 ELISPOT檢定。圖3係表示於MAGE-A4143.151肽細胞内處理後與HLA- A240 共同向細胞表面呈現之結果之圖。（a之左）MAGE- 5丨

特異性CTL#2-28細胞於MAGE- Α4丨43_m Α24四聚物染色中為陽性。（a之右）對照四聚物為陰性。（b之左）該# 2-28細胞對於HLA-A2402依存性顯示出MAGE-A4i43-151特異性細胞傷害性，又，（b之右）識別出於HLA-A2402與MAGE-A4 經表現之腫瘤細胞株之細胞内予以處理之MAGE-A4M3.151 肽。圖4係表示SAGE71 5-723肽於人類之免疫原性之圖。（a)係表示使用有於SAGE mRNA導入自體CD4+PHA幼芽細胞中經過二次敏感化處理所得之人類整體CTL細胞之IFN-γ i S1 98408-981218.doc -32- 1374031 ELISPOT檢定結果之圖。至於目標細胞，使用將SAGE715.723 肽施以脈衝處理或將對照肽施以脈衝處理之T2A24細胞。（b) 係表示孔#2擴大培養之整體CTL之結果之圖。所得之CTL 於SAGE7 1 5-723四聚物染色中為陽性。（c)僅於使用將 SAGE7〗5_723肽施以脈衝處理之T2A24作為目標細胞之情形時游離IFN-γ。圖5顯係表示於SAGE715_723肽之細胞内處理後與 HLA-A240共同向細胞表面呈現之結果之圖。（a)自 SAGE7 1 5.723特異性整體CTL所獲得之SAGE 715-723 特異性之 CTL # 22細胞於SAGE715_723A24四聚物染色中為陽性。（b) 將該# 22細胞（ΙχΙΟ4個）與SAGE cDNA形質轉化293A24細胞（lxl04個）於96孔圓底薄板中培養18小時，則IFN-γ得以游離。（c)係該# 22細胞對於表現HLA-A2402以及SAGE之 K5 62A24與R27A24顯示出細胞傷害性（c之左與中）。又，對於經導入SAGE mRNA之A2402陽性之LCL亦顯示出特異性細胞傷害性（c之右）。圖6係表示檢測健康人PBMC中之SAGE715_723特異性前體之結果之圖。於各孔放入5χ105個CD8+T細胞，並於將 SAGE715-723狀施以脈衝處理之CD8-PBMC中將其施以敏感化處理。於第十日，實施四聚物檢定，所試驗之6人中之3 人檢測出SAGE7 1 5.723 A24四聚物陽性之CD8 + T細胞。圖6 為其之一例之解析結果。 98408-981218.doc -33 -

Claims

093140800號專利申請案文申請專利範圍替換本(101年6月） 1. 一種CD4陽性之T淋巴球，其係經導入編碼腫瘤相關抗原或感染性微生物抗原之RNA ’並具有誘導識別腫瘤相關抗原或感染性微生物抗原之T淋巴球之活性。 2 ·如請求項1之T淋巴球，其係以植物血凝素活化之CD4陽性 T淋巴球。 3. —種免疫誘導劑’其係含有如請求項1或2之CD4陽性T淋巴球。 4. 一種CD8陽性之T淋巴球，其係經導入編碼腫瘤相關抗原善或感染性微生物抗原之RNA，並具有誘導識別腫瘤相關抗原或感染性微生物抗原之T淋巴球之活性。 5. —種免疫誘導劑，其係含有如請求項4之CD8陽性T淋巴球。 6. 一種識別腫瘤相關抗原或感染性微生物抗原之τ淋巴球之誘導方法，其係使用經導入編碼腫瘤相關抗原或感染性微生物抗原之RNA之CD4陽性或CD8陽性之T淋巴球作為抗原呈現細胞。鲁 7. 如請求項ό之誘導方法，其中τ淋巴球為以植物血凝素活化之CD4陽性細胞。 8·如請求項6之誘導方法，其中識別抗原之τ淋巴球為CD8 . 陽性之細胞傷害性Τ淋巴球。 9.如請求項6至8中任一項之誘導方法，其係使用自癌組織所調製之RNA。 10·如請求項6至8中任一項之誘導方法’其係使用表現 98408-丨010627.doc 1374031 EBNA3 A、CMVpp65中之至少一種病毒抗原之rna。 11. 一種癌症或感染症之治療劑’其係含有藉由如請求項 6〜10中任一項之方法誘導之T淋巴球作為有效成分。 12. —種CD8陽性之細胞傷害性T淋巴球，其係可識別於細跑表面呈現抗原肽與HLA-A24分子之複合體之細胞，該抗原肽係選自以序列編號2所示之人類主要組織適合性抗原（HLA)-A24限制性抗原肽、以及其之功能性誘導體中的至少一種者。 13. —種制裱劑，其係含有如請求項12之細胞傷害性T淋巴球作為有效成分。 14. 一種如請求項12之細胞傷害性T淋巴球之誘導劑，其係含有選自以序列編號2所示之人類主要組織適合性抗原 ' (HLA)-A24限制性抗原肽 '以及其之功能性誘導體中至少一種抗原肽作為有效成分。 15. —種制癌劑，其係含有選自以序列編號2所示之人類主要紐·織適合性抗原（HLA)-A24限制性抗原肽、以及其之功能性誘導體中至少一種抗原肽作為有效成分。 16_ —種檢測如請求項12之細胞傷害性τ淋巴球所具有之τ細胞受器用之四聚物，其係含有選自以序列編號2所表示之人類主要組織適合性抗原（HLA)-A24限制性抗原肽、以及其之功能性誘導體。 98408-1010627.doc -2-