WO2017150698A1 - がん免疫療法に利用可能な抗原性ポリペプチド及び当該ポリペプチドを含む抗腫瘍剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】 本発明は、抗腫瘍剤として利用可能な新たな抗原性ポリペプチド及び当該ポリペプチドを含む抗腫瘍剤、特にがん免疫療法用ワクチンを提供することを目的とするものである。 【解決手段】 本発明は、下記のａ）、ｂ）又はｃ）のアミノ酸配列からなり、かつＴＷＩＳＴ１タンパク質に特異的なＣＴＬ及び／又はヘルパーＴ細胞の誘導能を有するポリペプチドに関する： ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列； ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に任意のアミノ酸が１～数十個付加されたアミノ酸配列； ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換された若しくは欠失した又は１若しくは数個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列。本発明によればＴＷＩＳＴ１タンパク質に特異的な細胞障害性Ｔ細胞及び／又はヘルパーＴ細胞、特にＴｈ１細胞を誘導することができ、したがって本発明のポリペプチドは抗腫瘍剤の有効成分として、特にがんワクチンとして利用することができる。
Description
本発明は、がん免疫療法に利用可能なＴＷＩＳＴ１タンパク質由来の抗原性ポリペプチド及び当該ポリペプチドを含む抗腫瘍剤に関する。
難治性の疾患であるがんに対する治療法の一つに、患者個体の持つ免疫系を利用してがん細胞を退縮させる、いわゆるがん免疫療法が挙げられる。この方法における重要な点は、如何にして免疫系にがん細胞を異物として認識させ、がん細胞に対して攻撃性を有する免疫細胞を導くかであり、そのようながん細胞に対する免疫応答を誘導することのできる抗腫瘍剤、いわゆるがんワクチンの研究開発が世界的に行われている。
がんワクチンの典型的な態様は、がん細胞で特異的に又は大量に発現しているタンパク質（がん抗原タンパク質）の部分アミノ酸配列を有する免疫原性ポリペプチドである。これまでに、ウィルムス（Ｗｉｌｍｓ）腫瘍遺伝子ＷＴ１にコードされているタンパク質であるＷＴ１タンパク質、悪性黒色腫（メラノーマ）におけるＭＡＧＥ、乳がんなどにおけるＨＥＲ２／ｎｅｕ、大腸がんにおけるＣＥＡその他多数のがん抗原タンパク質が報告され、それらに由来する免疫原性ポリペプチドを有効成分とするがんワクチンの開発が進められている。
従来、がん免疫療法においては、ＣＤ８を発現している細胞傷害性Ｔ細胞（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｍａ；ＣＴＬ、Ｔｃ細胞又はキラーＴ細胞とも呼ばれる、以下、ＣＴＬと表す）の利用が注目されていた。ＣＴＬは、ＨＬＡクラスＩ分子に結合する抗原を提示している細胞を溶解するＴ細胞であり、標的となる細胞に直接的に作用してこれを排除する能力を有するからである。しかし、近年の研究で、ＣＴＬだけでなく、このＣＴＬの誘導及び維持のためのヘルパー機能を有するヘルパーＴ細胞、特にＴｈ１細胞を利用することが、がん免疫療法の有効性を高めるために重要であることが実験的に明らかにされてきている。
このような観点に基づいて注目されているのが、がん抗原タンパク質に特異的なＣＴＬを誘導する機能を有するエピトープ（キラーエピトープ）及びヘルパーＴ細胞を誘導するエピトープ（ヘルパーエピトープ）を含む免疫原性ポリペプチドである。例えば、ＭＡＧＥ－Ａ４、サーバイビン又はＷＴ１などのがん抗原タンパク質において、それぞれに存在する複数のキラーエピトープ及びヘルパーエピトープを含む人工ポリペプチドが設計され、一定の効果を収めている（例えばＷＴ１について特許文献１）。
ＴＷＩＳＴ１タンパク質は、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の形態形成に係るｔｗｉｓｔのヒトホモログタンパク質である。ＴＷＩＳＴ１タンパク質の機能として、アポトーシスの阻害、化学療法への抵抗性及びがんの転移に関与することが指摘されており（非特許文献１）、膀胱がん、大腸がん、卵巣がんその他のがんの検出及び予後予測などにおいてＴＷＩＳＴ１タンパク質又はこれをコードする遺伝子の発現の検出が利用されている（例えば特許文献２、特許文献３）。
Ｍｉｌｌｅｒ ＳＪ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００６ ６６（５）：２５８４－９１
本発明は、抗腫瘍剤として利用可能な新たな抗原性ポリペプチド及び当該ポリペプチドを含む抗腫瘍剤、特にがん免疫療法用ワクチンを提供することを目的とする。
本発明者らは、ＴＷＩＳＴ１タンパク質に由来する抗原性ポリペプチドのうち、特定のアミノ酸配列からなるポリペプチドを利用することで、がん細胞に対する免疫応答を誘導することができることを見いだし、下記の各発明を完成した。
（１）下記のａ）、ｂ）又はｃ）のアミノ酸配列からなり、かつＴＷＩＳＴ１タンパク質に特異的なＣＴＬ及び／又はヘルパーＴ細胞の誘導能を有するポリペプチド。
ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に任意のアミノ酸が１～数十個付加されたアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換された若しくは欠失した又は１若しくは数個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列。
（２）ｃ）のアミノ酸配列が配列番号１１に示されるアミノ酸配列である、請求項１に記載のポリペプチド。
（３）下記のｄ）又はｅ）のアミノ酸配列からなり、かつＴＷＩＳＴ１タンパク質に特異的な細胞障害性Ｔ細胞及び／又はヘルパーＴ細胞の誘導能を有するポリペプチド。
ｄ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に任意のアミノ酸が１～数十個付加されたアミノ酸配列；
ｅ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換された又は１若しくは数個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列。
（４）（１）～（３）のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
（５）（４）に記載の核酸を含む、発現ベクター。
（６）（１）～（３）のいずれか一項に記載のポリペプチドの少なくとも一種以上と抗原提示細胞とＣＤ８陽性ナイーブＴ細胞及び／又はＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞とをインビトロでインキュベートする工程を含む、ＴＷＩＳＴ１タンパク質に特異的なＣＴＬ及び／又はヘルパーＴ細胞を誘導する方法。
（７）（１）～（３）のいずれか一項に記載のポリペプチドの少なくとも一種以上、（４）に記載の核酸の少なくとも一種以上又は（５）に記載の発現ベクターを有効成分として含む、抗腫瘍剤。
（８）前記ポリペプチドに特異性なＣＴＬ及び／又はヘルパーＴ細胞をさらに含む、（７）に記載の抗腫瘍剤。
（９）前記ポリペプチドを提示する抗原提示細胞をさらに含む、（７）又は（８）に記載の抗腫瘍剤。
（１０）（１）～（３）のいずれか一項に記載のポリペプチドの少なくとも一種以上、（４）に記載の核酸の少なくとも一種以上又は（５）に記載の発現ベクターを有効成分として含む、がんの転移抑制剤。
（１１）前記ポリペプチドに特異性なＣＴＬ及び／又はヘルパーＴ細胞をさらに含む、（１０）に記載のがん転移抑制剤。
（１２）前記ポリペプチドを提示する抗原提示細胞をさらに含む、（１０）又は（１１）に記載のがん転移抑制剤。
ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に任意のアミノ酸が１～数十個付加されたアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換された若しくは欠失した又は１若しくは数個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列。
（２）ｃ）のアミノ酸配列が配列番号１１に示されるアミノ酸配列である、請求項１に記載のポリペプチド。
（３）下記のｄ）又はｅ）のアミノ酸配列からなり、かつＴＷＩＳＴ１タンパク質に特異的な細胞障害性Ｔ細胞及び／又はヘルパーＴ細胞の誘導能を有するポリペプチド。
ｄ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に任意のアミノ酸が１～数十個付加されたアミノ酸配列；
ｅ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換された又は１若しくは数個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列。
（４）（１）～（３）のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
（５）（４）に記載の核酸を含む、発現ベクター。
（６）（１）～（３）のいずれか一項に記載のポリペプチドの少なくとも一種以上と抗原提示細胞とＣＤ８陽性ナイーブＴ細胞及び／又はＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞とをインビトロでインキュベートする工程を含む、ＴＷＩＳＴ１タンパク質に特異的なＣＴＬ及び／又はヘルパーＴ細胞を誘導する方法。
（７）（１）～（３）のいずれか一項に記載のポリペプチドの少なくとも一種以上、（４）に記載の核酸の少なくとも一種以上又は（５）に記載の発現ベクターを有効成分として含む、抗腫瘍剤。
（８）前記ポリペプチドに特異性なＣＴＬ及び／又はヘルパーＴ細胞をさらに含む、（７）に記載の抗腫瘍剤。
（９）前記ポリペプチドを提示する抗原提示細胞をさらに含む、（７）又は（８）に記載の抗腫瘍剤。
（１０）（１）～（３）のいずれか一項に記載のポリペプチドの少なくとも一種以上、（４）に記載の核酸の少なくとも一種以上又は（５）に記載の発現ベクターを有効成分として含む、がんの転移抑制剤。
（１１）前記ポリペプチドに特異性なＣＴＬ及び／又はヘルパーＴ細胞をさらに含む、（１０）に記載のがん転移抑制剤。
（１２）前記ポリペプチドを提示する抗原提示細胞をさらに含む、（１０）又は（１１）に記載のがん転移抑制剤。
本発明のペプチドは、これを抗原提示細胞並びにＣＤ８陽性ナイーブ細胞及び／又はＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞とインキュベートすることで、ＴＷＩＳＴ１タンパク質に特異的なＣＴＬ及び／又はヘルパーＴ細胞、特にＴｈ１細胞を誘導することができ、またＴＷＩＳＴ１タンパク質に特異的なヘルパーＴ細胞に対してサイトカインを産生させる活性を有している。これらＣＴＬ及び／又はヘルパーＴ細胞はＴＷＩＳＴ１タンパク質を発現しているがん細胞に対して特異的に免疫応答することができ、したがって本発明のポリペプチドは抗腫瘍剤の有効成分として、特にがんワクチンとして利用することができる。
また本発明のポリペプチドは、構成アミノ酸残基数が少なく、遺伝子組み換え手法に限らず、有機合成的方法によって大量に製造することができるので、臨床研究あるいは臨床応用において、安定的にかつ安価に供給され得る。
本発明の第１の態様は、下記のａ）、ｂ）又はｃ）のアミノ酸配列からなり、かつＴＷＩＳＴ１に特異的なＣＴＬ及び／又はヘルパーＴ細胞の誘導能を有するポリペプチドである。
ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に任意のアミノ酸が１～数十個付加されたアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換された若しくは欠失した又は１若しくは数個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列。
ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に任意のアミノ酸が１～数十個付加されたアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換された若しくは欠失した又は１若しくは数個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列。
Ｐｏｏｎ（Ｐｏｏｎ，Ｅ．Ｃ．Ｃ．、２０１１、Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ＴＷＩＳＴ１ ａｓ ａｎ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ．Ｄｏｃｔｏｒａｌ ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｌｏｎｄｏｎ）によれば、ＴＷＩＳＴ１タンパク質の１５０番目～１６２番目に相当するアミノ酸配列は、キラーエピトープに相当する。配列番号１に示されるアミノ酸配列の１０番目～２２番目のアミノ酸配列はＴＷＩＳＴ１タンパク質の１５０番目～１６２番目までのアミノ酸配列に相当し、したがって配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、前記キラーエピトープを含む。
キラーエピトープを有する免疫原性ポリペプチドは、かかるポリペプチド及び適当なサイトカインの存在下で抗原提示細胞とＣＤ８陽性ナイーブＴ細胞とをインキュベートすることによって、免疫原性ポリペプチドの由来である抗原タンパク質に特異的なＴ細胞（エフェクターＴ細胞）であるＣＴＬを誘導することができる。したがって、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ＴＷＩＳＴ１タンパク質に特異的なＣＴＬを誘導する能力を有する。
また、後の実施例に示すように、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、当該ポリペプチド及び適当なサイトカインの存在下で抗原提示細胞とＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞とをインキュベートすることによって、ＴＷＩＳＴ１タンパク質に特異的なエフェクターＴ細胞であるヘルパーＴ細胞、特にＴｈ１細胞を誘導することができる。すなわち、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにはヘルパーＴ細胞を誘導し得るヘルパーエピトープが存在しており、ＴＷＩＳＴ１タンパク質に特異的なヘルパーＴ細胞を誘導する能力を有する。
なお本発明における誘導とは、ナイーブＴ細胞を抗原特異的なＴ細胞であるエフェクターＴ細胞に分化させる又はナイーブＴ細胞をエフェクターＴ細胞として活性化させることと同義である。
このように、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、適当な条件下でＣＤ８陽性ナイーブＴ細胞及び／又はＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞からＴＷＩＳＴ１タンパク質に特異的なエフェクターＴ細胞であるＣＴＬ及び／又はヘルパーＴ細胞、特にＴｈ１細胞を誘導することができる。このことは、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドがＴＷＩＳＴ１タンパク質に特異的なエフェクターＴ細胞によって認識される２種のエピトープを有しており、さらに当該エピトープが、ＴＷＩＳＴ１タンパク質を取り込んだ抗原提示細胞の表面に発現しているＭＨＣクラスＩ分子及びクラスＩＩ分子によってそれぞれ提示されることを意味する。
本発明の第１の態様には、ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に任意のアミノ酸が１～数十個付加されたアミノ酸配列からなり、かつＴＷＩＳＴ１タンパク質に特異的なＣＴＬ及び／又はヘルパーＴ細胞の誘導能を有するポリペプチドも包含される。付加されるアミノ酸は１～５０個が好ましく、５～３０個がより好ましく、１０～２０個が特に好ましい。
抗原提示細胞は、内因性抗原やエンドサイトーシス等によって取り込んだ免疫原性タンパク質などをプロセッシングによってフラグメント化し、ＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ分子などの抗原提示分子を介して、前記フラグメントを抗原として提示することが知られている。
前述の通り、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに含まれているキラーエピトープ及びヘルパーエピトープは、抗原提示細胞内で当該ポリペプチドがプロセッシングを受けることで、抗原提示される。そのため、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に付加されたアミノ酸残基を有するポリペプチドも、抗原提示細胞のかかるプロセッシングによってフラグメント化されることで、最終的には配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに含まれているキラーエピトープ及びヘルパーエピトープが抗原提示されることとなる。このように、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に付加されたアミノ酸残基を有するポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと同様の誘導能を示し、本発明として利用することが可能である。
本発明の第１の態様には、ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換された若しくは欠失した又は１若しくは数個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列からなり、かつＴＷＩＳＴ１タンパク質に特異的なＣＴＬ及び／又はヘルパーＴ細胞の誘導能を有するポリペプチドも含まれる。その好ましい例は抗原性に対するサイレント置換、欠失及び付加、特に保存性アミノ酸間の置換であり、配列番号１に示されるアミノ酸配列に含まれるキラーエピトープ及び又はヘルパーエピトープの抗原性を変化させないものである。
１若しくは数個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるポリペプチドの例としては、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮ末端から１～３個のアミノ酸及び／又はＮ末端から１～８個のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができ、そのアミノ酸配列を配列番号１１として示す。
さらに、本発明の第１の態様には、ｄ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に任意のアミノ酸が１～数十個付加されたアミノ酸配列からなり、かつＴＷＩＳＴ１タンパク質に特異的なＣＴＬ及び／又はヘルパーＴ細胞の誘導能を有するポリペプチドも包含される。付加されるアミノ酸は１～５０個が好ましく、５～３０個がより好ましく、１０～２０個が特に好ましい。
同様に、本発明の第１の態様には、ｅ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換された又は１若しくは数個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列からなり、かつＴＷＩＳＴ１タンパク質に特異的なＣＴＬ及び／又はヘルパーＴ細胞の誘導能を有するポリペプチドも含まれる。その好ましい例は抗原性に対するサイレント置換、欠失及び付加、特に保存性アミノ酸間の置換であり、配列番号１１に示されるアミノ酸配列に含まれるキラーエピトープ及び又はヘルパーエピトープの抗原性を変化させないものである。
以下、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチドと、ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド、配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド及び前記ｂ）～ｅ）のポリペプチドを纏めて表すときは本発明のポリペプチドと、それぞれ表記する。
本発明のポリペプチドの、ＴＷＩＳＴ１タンパク質に特異的なＣＴＬ及び／又はヘルパーＴ細胞の誘導能は、前述のように、本発明のポリペプチド及び適当なサイトカインの存在下で抗原提示細胞とナイーブＴ細胞とをインキュベートし、ＴＷＩＳＴ１タンパク質に特異性を示すエフェクターＴ細胞が誘導されることを検出することで確認することができる。
ＣＤ８陽性ナイーブＴ細胞及びＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞は、採取された血液好ましくはがん免疫療法を必要とする患者から採取された血液から一般的な方法、例えばＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）等を用いた方法で単離することができる。
抗原提示細胞は、表面にＨＬＡクラスＩ分子又はＩＩ分子を発現している細胞であればよく、樹状細胞の他にＢ細胞、マクロファージ、単球、非増殖性のトランスフェクタント等を挙げることができるが、特に樹状細胞が好ましい。抗原提示細胞も、採取された血液好ましくはがん免疫療法を必要とする患者から採取された血液から一般的な方法で単離することができる。
インキュベーションは、抗原提示細胞に所望の抗原をＨＬＡクラスＩ又はクラスＩＩ分子を介して提示させ、ナイーブＴ細胞から当該抗原に特異的なエフェクターＴ細胞を誘導するための一般的な方法として行えばよい。例えば、ＣＴＬを誘導する場合はＣｈｅｎら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０００；１６５（２）９４８－９５５）に記載の方法にしたがって、またヘルパーＴ細胞を誘導する場合はＴｉｍら（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １９９６；１７（３） １３８－１４６）に記載の方法にしたがって行えばよい。特に、インキュベーションにおいてＴ細胞の成長因子であるＩＬ－２に加えて、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１２、又は抗ＩＬ－４抗体の１以上を添加することで、ＩＦＮ－γを産生し、かつＩＬ－４の産生が低いＴｈ１細胞を誘導することができる。
また、本発明のポリペプチドと抗原提示細胞とナイーブＴ細胞は同時にインキュベートしてもよく、あるいは本発明のポリペプチドと抗原提示細胞を先にインキュベートし、その後にナイーブＴ細胞を共存させてインキュベートしてもよい。
エフェクターＴ細胞であるＣＴＬ又はヘルパーＴ細胞が誘導されたことは、細胞の表面抗原の種類、サイトカイン産生能の確認、細胞内染色法、ＥＬＩＳＰＯＴ法その他の当業者に周知の方法によって確認することができる。例えば、インターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）の産生は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製その他の市販のＥＬＩＳＡキットを用いて、簡便に測定、確認することができる。
本発明のポリペプチドは、それらを構成するアミノ酸配列を有する限り、例えばタンパク質の分離精製に有用なタグ配列として汎用されているＨｉｓ－Ｔａｇや、適当なリンカー配列、ＧＦＰの様なマーカータンパク質のアミノ酸配列等をさらに付加したり、あるいはビオチン等の標識化合物を付加したりすることも可能であり、そのようなポリペプチドは依然として本発明のポリペプチドに包含される。
本発明のポリペプチドは、それらをコードする核酸に種々の公知の遺伝子組み換え手法を適用することで、組み換えタンパク質として製造することが可能である。また、本発明のポリペプチドは、種々の保護基で修飾されたアミノ酸を原料とする有機化学的合成法によって製造することもできる。また、一般にペプチドシンセサイザーと称される市販機器を用いて合成することもできる。
さらに、本発明のポリペプチドをコードする核酸、及びこれを含むベクターも、第１の態様に包含される。本発明の核酸は、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて、当業者に知られ又は周知である遺伝子組み換え手法又は化学合成手法により合成することができる。また、本発明のベクターは、本発明の核酸を発現可能に含むベクターであり、かかる核酸に加えて、転写発現を調節する任意の機能性塩基配列、例えばプロモーター配列、オペレーター配列、リボソーム結合部位、エンハンサーなどをさらに含んでいてもよい。これらの機能性塩基配列は核酸と機能的に連結され得る。
本発明の第２の態様は、本発明のポリペプチドの少なくとも一種以上と抗原提示細胞とＣＤ８陽性ナイーブＴ細胞及び／又はＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞とをインビトロでインキュベートする工程を含む、ＴＷＩＳＴ１タンパク質に特異的なＣＴＬ及び／又はヘルパーＴ細胞を誘導する方法に関する。本態様における抗原提示細胞、ＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、インキュベーションの条件、ＴＷＩＳＴ１タンパク質に特異的なＣＴＬ及び／又はヘルパーＴ細胞の誘導及び確認については、第１の態様において説明したとおりである。
本発明の第２の態様にかかる方法によって、ＴＷＩＳＴ１タンパク質に特異的なＣＴＬ及び／又はヘルパーＴ細胞をインビトロで調製することが可能となる。かかるＴＷＩＳＴ１タンパク質に特異的なＣＴＬ及び／又はヘルパーＴ細胞は、がん細胞特にＴＷＩＳＴ１タンパク質陽性がん細胞に対する免疫学的応答を示すことから、抗腫瘍剤又は転移抑制剤として利用することができる。
本発明の第３の態様は、本発明のポリペプチドの少なくとも一種以上、該ポリペプチドをコードする核酸の少なくとも一種以上又は該核酸を含む発現ベクターを有効成分として含む抗腫瘍剤又はがんの転移抑制剤である。
本発明の第３の態様には、有効成分であるポリペプチドとこれに特異性を有するＣＴＬ及び／又はヘルパーＴ細胞をさらに含む抗腫瘍剤又はがん転移抑制剤が包含される。さらに、有効成分であるポリペプチドと抗原提示細胞とを含む抗腫瘍剤又はがん転移抑制剤、並びに有効成分であるポリペプチドとこれに特異性を有するＣＴＬ及び／又はヘルパーＴ細胞と抗原提示細胞とを含む抗腫瘍剤又はがん転移抑制剤も、本発明の第３の態様に包含される。
本発明の第３の態様において、有効成分であるポリペプチドに特異性を有するＣＴＬ及び／又はヘルパーＴ細胞は、その投与を必要とする患者から回収されるＣＤ８陽性ナイーブＴ細胞及び／又はＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞を元に、有効成分であるポリペプチドを用いた前記第１の態様において説明した方法によって誘導されるエフェクターＴ細胞であることが好ましい。
ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチドに対する免疫応答は、ＨＬＡ－ＤＲ、特にＨＬＡ－ＤＲ１、ＤＲ１５及びＤＲ５３というＨＬＡの遺伝子型に拘束されるという特徴を有している。したがって本発明の抗腫瘍剤又はがん転移抑制剤は、ＨＬＡの遺伝子型がＤＲである患者に対して特に有効であると考えられる。ＨＬＡ－ＤＲ、特にＤＲ５３は日本人及び欧米人の約６０％に認められるＨＬＡの遺伝子型であり、したがって、本発明はより多くのがん患者に対して適用可能であることが期待される。
第３の態様にかかる抗腫瘍剤又はがん転移抑制剤は、がん特にＴＷＩＳＴ１陽性がんに罹患した患者に投与されることで、患者自身のがんに対する免疫系を活性化させ、腫瘍細胞を退縮させる及び／又はがんの転移を抑制することができるものと期待される。したがって本発明の第３の態様は、本発明のポリペプチドの少なくとも一種以上を、又は本発明のポリペプチドとこれに特異性を有するＣＴＬ及び／若しくはヘルパーＴ細胞とを、又は本発明のポリペプチドと抗原提示細胞とを、又は本発明のポリペプチドとこれに特異性を有するＣＴＬ及び／若しくはヘルパーＴ細胞と抗原提示細胞とを、治療を必要とする患者に対して投与することを含む、がんの治療方法又はがんの転移を抑制する方法として表すこともできる。
また、本発明のポリペプチドに代えて、本発明の核酸又は発現ベクターを有効成分とする抗腫瘍剤又は転移抑制剤も、第３の態様に包含される。さらに、本発明の第２の態様にかかる方法によって誘導されたＴＷＩＳＴ１タンパク質に特異的なＣＴＬ及び／又はヘルパーＴ細胞を有効成分とする細胞製剤も、本発明の抗腫瘍剤又は転移抑制剤として、第３の態様に包含される。第１の態様のポリペプチドは、かかるＣＴＬ及び／又はヘルパーＴ細胞をより効率的に誘導することができる点で、第３の態様の抗腫瘍剤又は転移抑制剤としてのより優れた細胞製剤の提供に資するものである。
本発明の抗腫瘍剤又はがん転移抑制剤は、上記の構成の他に、これらの作用を阻害しない範囲で、医薬の製剤化のために一般的に利用される種々の賦形剤や他の医薬活性成分等を含む医薬組成物であり得る。特に、本発明の抗腫瘍剤又はがん転移抑制剤は、ポリペプチドとＣＴＬ及び／又はヘルパーＴ細胞とを安定に保持できる緩衝液あるいは液体培地の形態、特に細胞製剤の形態にあることが好ましい。
緩衝液の非限定的な例としては、中性の緩衝化生理食塩水又はリン酸緩衝化生理食塩水等を挙げることができる。また、例えばグルコース、マンノース、スクロース、デキストラン、マンニトール等の糖質、タンパク質、アミノ酸、抗酸化剤、静菌剤、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ又はグルタチオン）、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、浸透圧調節剤、懸濁剤、増粘剤及び／又は保存剤等をさらに含んでいてもよい。
また本発明の抗腫瘍剤又はがん転移抑制剤は、ポリペプチドとＣＴＬ及び／又はヘルパーＴ細胞とが混合されている形態にあることが好ましいが、ポリペプチドと細胞とが別々に保存され、使用時に混合して投与することのできる、いわゆるキットの形態であってもよい。
本発明の抗腫瘍剤又はがん転移抑制剤の投与形態としては特に制限はなく、例えば皮下注射、静脈注射、皮内注射、筋肉内注射、腫瘍組織部位への局所注射が挙げられる。また、本発明の抗腫瘍剤又はがん転移抑制剤の投与量は、有効成分の種類に応じて異なるが、例えば、有効成分がポリペプチドである場合には通常０．０１～１０ｍｇ、有効成分が細胞である場合には通常１０６～１０１２細胞であって、対象の年齢、体重、症状、健康状態等に応じて、適宜調節される。
本発明の抗腫瘍剤又はがん転移抑制剤は、好ましくは、ＴＷＩＳＴ１タンパク質を発現している腫瘍を有する、又はＴＷＩＳＴ１タンパク質を発現する腫瘍の罹患若しくは再発のおそれがある対象に対して使用される。対象は、ヒト及びヒト以外の様々な動物、例えばイヌやネコ等の愛玩動物、ウシやブタ等の家畜動物、マウスやラット等の実験動物などであり、好ましくはヒトである。
以下、実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
＜細胞の調製＞
健常人の末梢血からファイコール密度勾配分離法を用いて、末梢血単核球（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌｓ；ＰＢＭＣｓ）を回収した。
健常人の末梢血からファイコール密度勾配分離法を用いて、末梢血単核球（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌｓ；ＰＢＭＣｓ）を回収した。
ＰＢＭＣｓから磁気細胞分離システム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いてＣＤ１４陽性細胞を分離し、ＧＭ－ＣＳＦ（終濃度１００ｎｇ／ｍＬ、ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）及びＩＬ－４（終濃度５０ｎｇ／ｍＬ、ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を添加したＡＩＭ－Ｖ培地（ｇｉｂｃｏ）を用いて６穴培養プレートにて７日間培養することによって樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ；ＤＣｓ）に分化させ、抗原提示細胞として用いた。また、ＰＢＭＣｓから同様にしてＣＤ４陽性Ｔ細胞を分離した。
９６穴平底培養プレートに、１×１０５／ｗｅｌｌのＣＤ４陽性Ｔ細胞、５×１０４／ｗｅｌｌのＤＣｓ、２００μＬの３％ヒトＡＢ型血清（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）含有ＡＩＭ－Ｖ培地、ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド（終濃度３μｇ／ｍＬ）を加え、ＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞とＤＣｓとのインキュベーションを行った。培養開始から７日後、ＣＤ４陽性Ｔ細胞をペプチド刺激するために、ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド（終濃度３μｇ／ｍＬ）とガンマ線照射した不活化ＰＢＭＣｓ（１×１０５／ｗｅｌｌ）を培養プレートに加え、その２日後にＩＬ－２（終濃度１０Ｕ／ｍＬ、シオノギ製薬）を添加した。その後、一週間おきにＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチドと不活化ＰＢＭＣｓを加え、エフェクターＴ細胞である活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞（以下、ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド特異的ヘルパーＴ細胞と表す）を持続的に増殖させた。
＜実施例１＞
ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド特異的ヘルパーＴ細胞のＨＬＡ拘束性の確認
１）ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２拘束性Ｔ細胞応答
ＨＬＡ遺伝子型がＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２（ＤＲ１５）である健常人の末梢血から調製したＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド特異的ヘルパーＴ細胞のＨＬＡ拘束性を調べた。９６穴平底培養プレートの各ウェルに、同一人から調製したＰＢＭＣｓ（５×１０４／ｗｅｌｌ）及びコントロールペプチド（ｉｒｒｅｌｅｖａｎｔ）又はＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド（ｃｏｇｎａｔｅ）を終濃度３μｇ／ｍＬで加えて２時間処理した後、ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド特異的ヘルパーＴ細胞（５×１０４／ｗｅｌｌ）を加え、ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド処理群の一部にはさらに抗ＤＲ抗体（Ｌ２４３、終濃度１０μｇ／ｍＬ、ＡＴＣＣ社）、又は対照として抗ＨＬＡ－ｃｌａｓｓ Ｉ抗体（Ｗ６／３２、終濃度１０μｇ／ｍＬ、ＡＴＣＣ社）を添加してインキュベーションを行った。２４～４８時間後の培養上清に含まれるＩＦＮ－γの産生量を、ＥＬＩＳＡキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて測定した。
ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド特異的ヘルパーＴ細胞のＨＬＡ拘束性の確認
１）ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２拘束性Ｔ細胞応答
ＨＬＡ遺伝子型がＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１５：０２（ＤＲ１５）である健常人の末梢血から調製したＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド特異的ヘルパーＴ細胞のＨＬＡ拘束性を調べた。９６穴平底培養プレートの各ウェルに、同一人から調製したＰＢＭＣｓ（５×１０４／ｗｅｌｌ）及びコントロールペプチド（ｉｒｒｅｌｅｖａｎｔ）又はＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド（ｃｏｇｎａｔｅ）を終濃度３μｇ／ｍＬで加えて２時間処理した後、ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド特異的ヘルパーＴ細胞（５×１０４／ｗｅｌｌ）を加え、ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド処理群の一部にはさらに抗ＤＲ抗体（Ｌ２４３、終濃度１０μｇ／ｍＬ、ＡＴＣＣ社）、又は対照として抗ＨＬＡ－ｃｌａｓｓ Ｉ抗体（Ｗ６／３２、終濃度１０μｇ／ｍＬ、ＡＴＣＣ社）を添加してインキュベーションを行った。２４～４８時間後の培養上清に含まれるＩＦＮ－γの産生量を、ＥＬＩＳＡキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて測定した。
ＴＷＩＳＴ１ＡポリペプチドはＩＦＮ－γ産生を増加させたが、その作用は抗ＤＲ抗体の存在下で阻害された（図１）。このことから、ＴＷＩＳＴ１ＡポリペプチドはＨＬＡ－ＤＲに拘束されることが確認された。
２）ＨＬＡ－ＤＲ５３拘束性及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１：０１（ＤＲ１）拘束性のＴ細胞応答
ＨＬＡ遺伝子型がＨＬＡ－ＤＲ５３又はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１：０１（ＤＲ１）である健常人の末梢血から調製したＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド特異的ヘルパーＴ細胞について、ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチドに対する特異的反応性を調べた。ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド特異的ヘルパーＴ細胞（５×１０４／ｗｅｌｌ）を、同一人から調製したＰＢＭＣｓ（５×１０４／ｗｅｌｌ）と、ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド（終濃度０～３０μｇ／ｍＬ）の存在下でインキュベートし、培養上清中のＩＦＮ－γ産生量を同様に測定した。
ＨＬＡ遺伝子型がＨＬＡ－ＤＲ５３又はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１：０１（ＤＲ１）である健常人の末梢血から調製したＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド特異的ヘルパーＴ細胞について、ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチドに対する特異的反応性を調べた。ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド特異的ヘルパーＴ細胞（５×１０４／ｗｅｌｌ）を、同一人から調製したＰＢＭＣｓ（５×１０４／ｗｅｌｌ）と、ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド（終濃度０～３０μｇ／ｍＬ）の存在下でインキュベートし、培養上清中のＩＦＮ－γ産生量を同様に測定した。
いずれのＨＬＡ遺伝子型を有するＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド特異的ヘルパーＴ細胞においても、ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド添加によるＩＦＮ－γ産生増加が用量依存的に認められた（図２、図３）。
さらに、拘束されるＨＬＡ型を調べるために、ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド特異的ヘルパーＴ細胞（５×１０４／ｗｅｌｌ）を、ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド（終濃度１０μｇ／ｍＬ）で事前に２時間処理されたＨＬＡ－ＤＲ１、ＤＲ８、ＤＲ１５又はＤＲ５３の遺伝子が導入されたマウス由来線維芽細胞株（Ｌ－ＤＲ１、Ｌ－ＤＲ８、Ｌ－ＤＲ１５及びＬ－ＤＲ５３、Ｄｒ．Ｓａｓａｚｕｋｉ，Ｋｙｕｓｙｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ及びＤｒ．Ｒ．Ｋａｒｒ，Ｋａｒｒ Ｐｈａｒｍａより入手）とインキュベートし、培養上清中のＩＦＮ－γ産生量を同様に測定した。
Ｌ－ＤＲ１、Ｌ－ＤＲ１５及びＬ－ＤＲ５３を用いた場合にはＩＦＮ－γ産生の増加が観察された一方、Ｌ－ＤＲ８を用いた場合にはＩＦＮ－γは検出されなかった。Ｌ－ＤＲ８及びＬ－ＤＲ１５の結果を図４に示す。このことから、ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチドは、ＨＬＡ－ＤＲ１、ＤＲ１５及びＤＲ５３に拘束されることが示された。
＜実施例２＞
ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド特異的ヘルパーＴ細胞のがん細胞株に対する反応性の評価
ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド特異的ヘルパーＴ細胞のがん細胞株に対する反応性を調べるために、ＴＷＩＳＴ１陽性がん細胞株の中からＤＲ５３陽性（Ｓａ３、ＨＳＣ４、Ｃａｋｉ１）、ＤＲ１陽性（ＨＳＣ４、ＳＷ８３９）及びＤＲ５３・ＤＲ１陰性（Ｊｕｒｋａｔ）の細胞株を選別した。各がん細胞株の細胞表面上にＨＬＡ－ｃｌａｓｓ ＩＩを強発現させるために、実験に使用する前にＩＦＮ－γ（終濃度１００Ｕ／ｍＬ）存在下で２日間培養した。各がん細胞株の培養プレートをリン酸緩衝液（ＰＢＳ）でよく洗浄し、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸、５ｍＭ）を用いて回収した。これらのがん細胞（３×１０４／ｗｅｌｌ）を、ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド特異的ヘルパーＴ細胞（５×１０４／ｗｅｌｌ）とインキュベートし、培養上清中のｈＧＭ－ＣＳＦ又はＩＦＮ－γの産生量を、ＥＬＩＳＡキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて測定した。ＨＬＡ－ＤＲ依存的な反応性であることを調べるため、一部の培養系に抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体を添加してインキュベートした。
ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド特異的ヘルパーＴ細胞のがん細胞株に対する反応性の評価
ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド特異的ヘルパーＴ細胞のがん細胞株に対する反応性を調べるために、ＴＷＩＳＴ１陽性がん細胞株の中からＤＲ５３陽性（Ｓａ３、ＨＳＣ４、Ｃａｋｉ１）、ＤＲ１陽性（ＨＳＣ４、ＳＷ８３９）及びＤＲ５３・ＤＲ１陰性（Ｊｕｒｋａｔ）の細胞株を選別した。各がん細胞株の細胞表面上にＨＬＡ－ｃｌａｓｓ ＩＩを強発現させるために、実験に使用する前にＩＦＮ－γ（終濃度１００Ｕ／ｍＬ）存在下で２日間培養した。各がん細胞株の培養プレートをリン酸緩衝液（ＰＢＳ）でよく洗浄し、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸、５ｍＭ）を用いて回収した。これらのがん細胞（３×１０４／ｗｅｌｌ）を、ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド特異的ヘルパーＴ細胞（５×１０４／ｗｅｌｌ）とインキュベートし、培養上清中のｈＧＭ－ＣＳＦ又はＩＦＮ－γの産生量を、ＥＬＩＳＡキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて測定した。ＨＬＡ－ＤＲ依存的な反応性であることを調べるため、一部の培養系に抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体を添加してインキュベートした。
ＤＲ５３陽性がん細胞株の結果を図５に、ＤＲ１陽性がん細胞株の結果を図６に示す。ＤＲ５３陽性がん細胞、ＤＲ１陽性がん細胞のいずれにおいてもｈＧＭ－ＣＳＦ又はＩＦＮ－γの産生亢進が認められたが、その作用は抗ＤＲ抗体の存在下で阻害された。このことから、ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド特異的ヘルパーＴ細胞は、がん細胞に対して反応性を有することが確認された。
＜実施例３＞
がん患者由来ＰＢＭＣｓのＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド反応性の評価
がん患者から、前記＜細胞の調製＞と同様にして、ＰＢＭＣｓ及びＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチドによって活性化されたＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド特異的ヘルパーＴ細胞とを調製した。このＰＢＭＣｓ（５×１０４／ｗｅｌｌ）とＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド特異的ヘルパーＴ細胞（５×１０４／ｗｅｌｌ）とを、ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド（終濃度３μｇ／ｍＬ）の存在下又は非存在下でインキュベートし、培養上清中のＩＦＮ－γ産生量を測定した。
がん患者由来ＰＢＭＣｓのＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド反応性の評価
がん患者から、前記＜細胞の調製＞と同様にして、ＰＢＭＣｓ及びＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチドによって活性化されたＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド特異的ヘルパーＴ細胞とを調製した。このＰＢＭＣｓ（５×１０４／ｗｅｌｌ）とＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド特異的ヘルパーＴ細胞（５×１０４／ｗｅｌｌ）とを、ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド（終濃度３μｇ／ｍＬ）の存在下又は非存在下でインキュベートし、培養上清中のＩＦＮ－γ産生量を測定した。
２名のがん患者由来の細胞についての結果を図７に示す。いずれの細胞においてもＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチドの添加によりＩＦＮ－γ産生が増加したことから、がん患者においてもＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド反応性のＴ細胞応答が起こることが確認された。
＜実施例４＞
マウスにおけるＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチドの特異的免疫賦活作用の評価
６－８週齢の雄性ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１／ＤＲＢ１＊０１：０１遺伝子組み換えマウス（Ａ２．ＤＲ１－Ｔｇマウス；フランスパスツール研究所）に、ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド（１００μｇ／１００μＬ ＰＢＳ）を試験開始０日目と１０日目に皮内投与した。試験開始から１５日目にジエチルエーテルを用いてＡ２．ＤＲ１－Ｔｇマウスを安楽死させ、所属リンパ節及び脾臓を回収した。リンパ球及び脾臓細胞を分離した。
マウスにおけるＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチドの特異的免疫賦活作用の評価
６－８週齢の雄性ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１／ＤＲＢ１＊０１：０１遺伝子組み換えマウス（Ａ２．ＤＲ１－Ｔｇマウス；フランスパスツール研究所）に、ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド（１００μｇ／１００μＬ ＰＢＳ）を試験開始０日目と１０日目に皮内投与した。試験開始から１５日目にジエチルエーテルを用いてＡ２．ＤＲ１－Ｔｇマウスを安楽死させ、所属リンパ節及び脾臓を回収した。リンパ球及び脾臓細胞を分離した。
ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド特異的な反応を検出するため、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いてＩＦＮ－γ産生細胞を検出した。上記のリンパ球（１×１０５／ｗｅｌｌ）及び脾臓細胞（５×１０５／ｗｅｌｌ）は、マウスＩＦＮ－γ抗体（ＡＮ１８、ＭＡＢＴＥＣＨ）で一晩４℃にて処理して抗体を固相化したＭＡＨＡＳ４５１０ ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ－ＨＡ（ミリポア社）において、１０％ウシ胎児血清（Ｂｉｏｗｅｓｔ社）含有ＲＰＭＩ１６４０（ナカライテスク社）培地を用いて、コントロールペプチド又はＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド（終濃度３μｇ／ｍＬ）存在下で２４時間インキュベートした。
インキュベーション後のプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳ－Ｔ）にて洗浄し、ビオチンが付加された抗マウスＩＦＮ－γ抗体（Ｒ４－６Ａ２、ＭＡＢＴＥＣＨ）にて一晩４℃にて反応させ、ＰＢＳ－Ｔにて洗浄後、ストレプトアビジンが付加されたアルカリフォスファターゼ（ＭＡＢＴＥＣＨ）を室温にて１時間反応させた。ＰＢＳ－Ｔにて洗浄後、発色させるためにＢＣＩＰ／ＮＢＴ（ＭＡＢＴＥＣＨ）を室温にて１０分間反応させ、蒸留水でプレートを洗浄することによって反応を止めた。発色した細胞の数を顕微鏡下でカウントした。
結果を図８に示す。ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチドの添加によりＩＦＮ－γ産生が増加したことから、ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチドは生体内においても特異的Ｔ細胞応答を活性化することが示された。
＜実施例５＞
マウスにおけるＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチドのがん細胞株肺転移抑制作用の評価
６－８週齢の雄性Ａ２．ＤＲ１－Ｔｇマウスに、ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド（１００μｇ／１００μＬ ＰＢＳ）を試験開始０日目と１０日目に皮内投与した。対照群として、ペプチドが含まれていない溶媒のみを投与した。試験開始から１５日目に、各マウスに５×１０５個のヒト口腔扁平上皮がん細胞株ＨＳＣ４（ＴＷＩＳＴ１陽性、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１：０１陽性）を尾静脈から接種した。接種後５日目にジエチルエーテルを用いてＡ２．ＤＲ１－Ｔｇマウスを安楽死させ、肺を回収した。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて肺組織からトータルＲＮＡを抽出し、Ｐｒｉｍｅｒｓｃｒｉｐｔ １ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いてｃＤＮＡを作成した。マウスＧａｐｄｈ及びヒトＣＸＣＬ１０の発現量を、Ｒｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０を使用したリアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより測定した。プローブとして、ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ（ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ｂｙ ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のＭｍ９９９９９９１５＿ｇ１及びＨｓ０１１２４２５２を使用した。
マウスにおけるＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチドのがん細胞株肺転移抑制作用の評価
６－８週齢の雄性Ａ２．ＤＲ１－Ｔｇマウスに、ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド（１００μｇ／１００μＬ ＰＢＳ）を試験開始０日目と１０日目に皮内投与した。対照群として、ペプチドが含まれていない溶媒のみを投与した。試験開始から１５日目に、各マウスに５×１０５個のヒト口腔扁平上皮がん細胞株ＨＳＣ４（ＴＷＩＳＴ１陽性、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１：０１陽性）を尾静脈から接種した。接種後５日目にジエチルエーテルを用いてＡ２．ＤＲ１－Ｔｇマウスを安楽死させ、肺を回収した。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて肺組織からトータルＲＮＡを抽出し、Ｐｒｉｍｅｒｓｃｒｉｐｔ １ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いてｃＤＮＡを作成した。マウスＧａｐｄｈ及びヒトＣＸＣＬ１０の発現量を、Ｒｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０を使用したリアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより測定した。プローブとして、ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ（ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ｂｙ ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のＭｍ９９９９９９１５＿ｇ１及びＨｓ０１１２４２５２を使用した。
結果を図９に示す。対照群ではマウス肺においてヒトＣＸＣＬ１０の発現が認められ、接種したＨＳＣ４がマウス肺に転移したものと推測された。一方、ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチドを皮内投与されたマウス由来の肺においてヒトＣＸＣＬ１０の発現は顕著に低減したことから、ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチドはヒトがん細胞の肺転移を抑制し得ることが示された。
＜実施例６＞最小認識配列の確認
表１に示すアミノ酸配列からなるオーバーラッピングペプチドＴ１～Ｔ９を化学合成法により作製した。Ｔ１はＴＷＩＳＴ１ＡポリペプチドのＮ末端１～１５番目のアミノ酸配列に相当するポリペプチドであり、Ｔ２～Ｔ９はＴ１から１アミノ酸残基ずつＣ末端側にずらした１５アミノ酸残基からなるペプチドである（図１０）。
表１に示すアミノ酸配列からなるオーバーラッピングペプチドＴ１～Ｔ９を化学合成法により作製した。Ｔ１はＴＷＩＳＴ１ＡポリペプチドのＮ末端１～１５番目のアミノ酸配列に相当するポリペプチドであり、Ｔ２～Ｔ９はＴ１から１アミノ酸残基ずつＣ末端側にずらした１５アミノ酸残基からなるペプチドである（図１０）。
実施例４に記載の方法に従って、Ａ２．ＤＲ１－ＴｇマウスにＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド（１００μｇ／１００μＬ ＰＢＳ）をアジュバント（ｃＧＡＭＰ：２．５ｍｇ）とともに投与した後、所属リンパ節を回収した。リンパ節から分離したリンパ球（ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチドに特異的なヘルパーＴ細胞を含む）を用いて、ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド及びＴ１～Ｔ９に対する反応性をＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて検討した。その結果を図１１に示す。
図１１に示されるように、Ｔ１、Ｔ２及びＴ３の反応性はＴＷＩＳＴ１Ａペプチドのそれと同等であること、及びＴ４～Ｔ９の反応性はＴＷＩＳＴ１Ａペプチドと比較して低いことが、それぞれ確認された。このことから、ＴＷＩＳＴ１ＡポリペプチドのＣ末端から８アミノ酸残基の欠失は反応性を低下させない一方、ＴＷＩＳＴ１ＡポリペプチドのＮ末端から３残基の欠失は反応性を低下させること、及び少なくともＫＬＳＫＩＱＴＬＫＬＡＡＲ（配列番号１１）が、ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチドに特異的に反応するヘルパーＴ細胞が認識する最小認識配列であることが確認された。
＜実施例７＞
ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド特異的ヘルパーＴ細胞のがん細胞増殖抑制能の評価
ヒト肺癌細胞株（Ｌｕ６５、１×１０６）をヌードマウスに皮内接種し、接種後１０日目及び１７日目に、前記＜細胞の調製＞で調製したＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド特異的ヘルパーＴ細胞（４×１０６）を尾静脈投与し、継時的に腫瘍径を測定した（図１２）。コントロールとして、ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド特異的ヘルパーＴ細胞に代えて抗ＣＤ３抗体で非特異的に活性化させたヘルパーＴ細胞の同数を又は生理食塩水を尾静脈投与したヌードマウスを用意した。
ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド特異的ヘルパーＴ細胞のがん細胞増殖抑制能の評価
ヒト肺癌細胞株（Ｌｕ６５、１×１０６）をヌードマウスに皮内接種し、接種後１０日目及び１７日目に、前記＜細胞の調製＞で調製したＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド特異的ヘルパーＴ細胞（４×１０６）を尾静脈投与し、継時的に腫瘍径を測定した（図１２）。コントロールとして、ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド特異的ヘルパーＴ細胞に代えて抗ＣＤ３抗体で非特異的に活性化させたヘルパーＴ細胞の同数を又は生理食塩水を尾静脈投与したヌードマウスを用意した。
コントロールマウスではいずれも、皮内移植されたＬｕ６５による腫瘍の増殖（腫瘍径の増大）が見られたのに対し、ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド特異的ヘルパーＴ細胞を投与したマウスでは腫瘍の退縮が観察された。このことから、ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド特異的ヘルパーＴ細胞は生体内において腫瘍増殖抑制能を示すことが確認された。
＜実施例８＞
ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド特異的ヘルパーＴ細胞のがん転移抑制能の評価
Ｌｕ６５（１×１０６）をヌードマウスに脾臓内接種し、接種後３日目にＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド特異的ヘルパーＴ細胞（４×１０６）を尾静脈投与した。コントロールとして、ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド特異的ヘルパーＴ細胞に代えて抗ＣＤ３抗体で非特異的に活性化させたヘルパーＴ細胞の同数を尾静脈投与したヌードマウスを用意した。
ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド特異的ヘルパーＴ細胞のがん転移抑制能の評価
Ｌｕ６５（１×１０６）をヌードマウスに脾臓内接種し、接種後３日目にＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド特異的ヘルパーＴ細胞（４×１０６）を尾静脈投与した。コントロールとして、ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド特異的ヘルパーＴ細胞に代えて抗ＣＤ３抗体で非特異的に活性化させたヘルパーＴ細胞の同数を尾静脈投与したヌードマウスを用意した。
Ｌｕ６５の脾臓内接種後１４日目（ヘルパーＴ細胞投与から１１日目）に肝臓を回収し、腫瘤の数を計測した（図１３）。その結果、コントロールマウスでは、肝臓の表面に腫瘤が多数観察されたのに対し、ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド特異的ヘルパーＴ細胞を投与したマウス由来の肝臓では、腫瘤は１～４つほどしか認められなかった。このことから、ＴＷＩＳＴ１Ａポリペプチド特異的ヘルパーＴ細胞は生体内において腫瘍の転移抑制能を示すことが確認された。
本発明のポリペプチド、抗腫瘍剤及びがん転移抑制剤は、医薬品の製造において産業上の利用可能性を有する。
Claims (12)
- 下記のａ）、ｂ）又はｃ）のアミノ酸配列からなり、かつＴＷＩＳＴ１タンパク質に特異的な細胞障害性Ｔ細胞及び／又はヘルパーＴ細胞の誘導能を有するポリペプチド。
ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に任意のアミノ酸が１～数十個付加されたアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換された若しくは欠失した又は１若しくは数個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列。 - ｃ）のアミノ酸配列が配列番号１１に示されるアミノ酸配列である、請求項１に記載のポリペプチド。
- 下記のｄ）又はｅ）のアミノ酸配列からなり、かつＴＷＩＳＴ１タンパク質に特異的な細胞障害性Ｔ細胞及び／又はヘルパーＴ細胞の誘導能を有するポリペプチド。
ｄ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に任意のアミノ酸が１～数十個付加されたアミノ酸配列；
ｅ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換された又は１若しくは数個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列。 - 請求項１～３のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
- 請求項４に記載の核酸を含む、発現ベクター。
- 請求項１～３のいずれか一項に記載のポリペプチドの少なくとも一種以上と抗原提示細胞とＣＤ８陽性ナイーブＴ細胞及び／又はＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞とをインビトロでインキュベートする工程を含む、ＴＷＩＳＴ１タンパク質に特異的な細胞障害性Ｔ細胞及び／又はヘルパーＴ細胞を誘導する方法。
- 請求項１～３のいずれか一項に記載のポリペプチドの少なくとも一種以上、請求項４に記載の核酸の少なくとも一種以上又は請求項５に記載の発現ベクターを有効成分として含む、抗腫瘍剤。
- 前記ポリペプチドに特異性な細胞障害性Ｔ細胞及び／又はヘルパーＴ細胞をさらに含む、請求項７に記載の抗腫瘍剤。
- 前記ポリペプチドを提示する抗原提示細胞をさらに含む、請求項７又は８に記載の抗腫瘍剤。
- 請求項１～３のいずれか一項に記載のポリペプチドの少なくとも一種以上、請求項４に記載の核酸の少なくとも一種以上又は請求項５に記載の発現ベクターを有効成分として含む、がんの転移抑制剤。
- 前記ポリペプチドに特異性な細胞障害性Ｔ細胞及び／又はヘルパーＴ細胞をさらに含む、請求項１０に記載のがん転移抑制剤。
- 前記ポリペプチドを提示する抗原提示細胞をさらに含む、請求項１０又は１１に記載のがん転移抑制剤。
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| JP2018503413A JPWO2017150698A1 (ja) | 2016-03-04 | 2017-03-03 | がん免疫療法に利用可能な抗原性ポリペプチド及び当該ポリペプチドを含む抗腫瘍剤 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021164563A1 (en) * | 2020-02-20 | 2021-08-26 | The University Of Hong Kong | Pd1-based vaccination composition and methods thereof |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015129790A1 (ja) * | 2014-02-26 | 2015-09-03 | 株式会社バイオイミュランス | Ｗｔ１抗原性ポリペプチド、及び該ポリペプチドを含む抗腫瘍剤 |
-
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| Title |
|---|
| JUN'YA OTAKE ET AL.: "Helper/killer-hybrid epitope long peptide (H/K-HELP", JOURNAL OF CLINICAL AND EXPERIMENTAL MEDICINE, vol. 244, no. 9, 2013, pages 767 - 778, XP008184647 * |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021164563A1 (en) * | 2020-02-20 | 2021-08-26 | The University Of Hong Kong | Pd1-based vaccination composition and methods thereof |
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