CN101148478A

CN101148478A - 链亲和素-肿瘤坏死因子α融合蛋白

Info

Publication number: CN101148478A
Application number: CNA2007100301206A
Authority: CN
Inventors: 高基民; 林来新妹; 周明乾; 胡志明
Original assignee: Southern Medical University
Current assignee: Southern Medical University
Priority date: 2007-09-06
Filing date: 2007-09-06
Publication date: 2008-03-26

Abstract

本发明提供一种融合蛋白，该蛋白主要由链亲和素、接头肽和肿瘤坏死因子α连接构成，其中链亲和素连接在接头肽的N端，肿瘤坏死因子α连接在接头肽的C端；所述的接头肽为SerSerGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer。该融合蛋白同时具有链亲和素和肿瘤坏死因子α的活性，可通过链亲和素与生物素的强力结合将肿瘤坏死因子α锚定在生物素化的肿瘤细胞表面，且能在γ射线灭活肿瘤细胞表面稳定存在，并仍保持肿瘤坏死因子α的活性。经本发明融合蛋白表面修饰的肿瘤疫苗具有预防和治疗肿瘤的作用，可用于制备预防和治疗肿瘤的疫苗。

Description

链亲和素-肿瘤坏死因子α融合蛋白

技术领域

本发明涉及基因工程和蛋白质工程领域，具体涉及肿瘤坏死因子α的重组蛋白。

背景技术

肿瘤坏死因子α(TNFα)由细菌脂多糖等活化的单核-巨噬细胞产生，可引起肿瘤组织出血坏死，具有如下功能：能直接杀灭肿瘤细胞而不损伤正常细胞；能增强巨噬细胞的活性和杀伤功能，增强巨噬细胞促进免疫应答的能力，发挥抗感染作用；能促进炎症局部的中性粒细胞的活性和聚集；能促进T淋巴细胞产生干扰素、IL-6等，增强机体抗病能力；能与IL-1、IL-2、干扰素等协同增强免疫力。但是，肿瘤坏死因子α血中浓度过高时，可引起休克、高热及肺、心脏和肾上腺损害，从而大大地限制了它的临床应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种可以对肿瘤细胞进行快速表面修饰并能够永久地锚定在肿瘤细胞表面的新型肿瘤坏死因子α。

本发明解决上述技术问题的技术方案是：

一种融合蛋白，该蛋白主要由链亲和素、接头肽和肿瘤坏死因子α连接构成，其中链亲和素连接在接头肽的N端，肿瘤坏死因子α连接在接头肽的C端；所述的接头肽为Ser Ser GlyGly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser。

本发明融合蛋白可通过将链亲和素基因、肿瘤坏死因子α基因以及连接所述的链亲和素和肿瘤坏死因子α的接头多核苷酸通过基因重组、转化构建工程菌表达获得，其中基因重组和转化的方法均为本领域普通技术人员所熟识的技术。

为了便于融合蛋白的分离纯化，本发明所述的融合蛋白的链亲和素部分的末端还可以连接有纯化标签，如组氨酸标签等。

本发明所述的融合蛋白，其氨基酸序列可以是SEQ NO.1或SEQ NO.2。

本发明还提供一种编码本发明融合蛋白的融合基因，该融合基因由成熟链亲和素cDNA、肿瘤坏死因子αcDNA通过TCG AGC GGG GGC AGC GGG GGC GGA GGC AGC GGC GGGGGC GGA TCC连接而成；该多核苷酸的成熟链亲和素cDNA的末端还可以连接有CAT CATCAC CATCAC CAT。

将所述的编码本发明融合蛋白的融合基因通过基因重组插入到原核表达载体中，然后转化大肠杆菌可获得能表达本发明融合蛋白的工程菌。

本发明还提供一种高效表达本发明融合蛋白的工程菌，该工程菌是转化了本发明融合基因的pET24重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)，其制备方法是：将本发明融合基因克隆于带有T7启动子的表达载体pET24中，构建成含有本发明融合基因的表达质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)后实现了高效表达，本发明融合蛋白在菌体中以包涵体的形式存在，表达量高达30～40％；从包涵体中分离纯化蛋白并复性处理后，即可获得本发明融合蛋白。

本发明融合蛋白同时具有链亲和素和肿瘤坏死因子α的活性，可通过链亲和素与生物素的强力结合将肿瘤坏死因子α锚定在生物素化的肿瘤细胞表面，且能在γ射线灭活肿瘤细胞表面稳定存在，并仍保持肿瘤坏死因子α的活性；但如果将本发明融合蛋白中的链亲和素连接在接头肽的C端，则所得的融合蛋白没有肿瘤坏死因子α的活性。

经本发明融合蛋白表面修饰的肿瘤疫苗具有预防和治疗肿瘤的作用，可用于制备预防和治疗肿瘤的疫苗。本发明所述的肿瘤疫苗是将本发明融合蛋白锚定在生物素化的肿瘤细胞表面获得的。

本发明所述的肿瘤疫苗的制备充分利用了蛋白质的氨基(即-NH2)易生物素化以及生物素与链亲和素高效而强有力几乎不可逆的结合这两个特性，先用生物素化试剂将生物素化学交联到欲修饰的肿瘤细胞表面，然后本发明融合蛋白借助链亲和素与生物素的特异结合将肿瘤坏死因子α迅速永久地锚定在肿瘤细胞表面，从而使肿瘤坏死因子α在局部达到持续有效的治疗浓度，以至不会引起全身的毒副反应。此外，由于一个链亲和素蛋白可结合四个生物素，因此本发明融合蛋白锚定到肿瘤细胞的量是可以精确控制的。

附图说明

图1是6His-SA-L-TNFα-pET24重组质粒的结构图。

图2是6His-SA-L-TNFα的SDS-PAGE电泳图，其中1是蛋白质分子量标准，2是未诱导全菌，3是诱导后全菌，4是包涵体，5和6是纯化的融合蛋白。

图3是用抗TNFα单克隆抗体及荧光标记的二抗经流式细胞仪对锚定在生物素化的B16.F10表面上本发明融合蛋白进行检测的结果，左峰为未修饰的细胞(阴性对照)，而右峰为锚定修饰的细胞。

图4是接种本发明肿瘤疫苗后的预防肿瘤小鼠模型的肿瘤生长情况曲线图，以GFP-L-SA修饰的B6.F10肿瘤细胞疫苗为实验对照，其中实线表示本发明融合蛋白组，虚线表示GFP-L-SA对照组。

图5是接种本发明肿瘤疫苗后的预防肿瘤小鼠模型的小鼠存活情况曲线图，以GFP-L-SA修饰的B6.F10肿瘤细胞疫苗为实验对照，其中实线表示本发明融合蛋白组，虚线表示GFP-L-SA对照组。

图6是接种本发明肿瘤疫苗后的治疗肿瘤小鼠模型的小鼠存活情况曲线图，以GFP-L-SA修饰的B6.F10肿瘤细胞疫苗为实验对照，其中实线表示本发明融合蛋白组，虚线表示GFP-L-SA对照组。

下面将通过实施例进一步说明本发明以及本发明具有的技术效果。

具体实施方式

下述实施例和实验所用的材料及方法如下：

细胞株、菌株与质粒：L929细胞株和B16.F10(鼠黑色素瘤细胞株)；菌株Streptomycesavidinii(亲和素链霉菌，ATCC)，DH5a和BL21(DE3)；原核表达质粒pET24a(Kana^r，Novagen)。

主要生化试剂及材料：DNeasy组织试剂盒和质粒DNA的制备试剂盒(Qiagen)，寡核苷酸的合成(Sigma)，Trizol，SuperScript II逆转录酶，Platinum Pfx DNA聚合酶和T4 DNA连接酶(Invitrogen)；TNF-标准品(R & D Systems)，琼脂糖和SDS-PAGE(Biorad)；2-Iminobiotin(Sigma)和Ni-NTA(Qiagen)填料；Sulfo-NHS-LC-Biotin(Pierce)和抗TNFα-单克隆抗体(BD Biosciences Pharmingen)。

DNA片段的连接、转化及转化子筛选，限制性内切酶分析，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳等常规方法均参照文献(Sambrook J，et al.Molecular Cloning-A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，New York，2nd edition，1989)或厂家提供的产品说明书；DNA序列分析在UTSW at Dallas的DNA测序服务中心完成。

例1 本发明融合蛋白6His-SA-L-TNFα的制备

1、用DNeasy组织试剂盒从亲和素链霉菌抽提出细菌的基因组DNA，然后用其作为模板，通过Platinum pfx DNA聚合酶进行PCR制备成熟链亲和素cDNA。

引物：5’GGAATTCCATATGCATCATCACCATCACCATGAGGCCGGCATCACCGGC

ACCTGG 3’(55nt)和5’GGAATTCGGCGGATCCGCCCCCGCCGCTGCCTCCGCCCCCG

CTGCCCCCGCTCGTCTGCTGAACGGCGTCGAGCGGGTTGCC 3’(82nt)。

反应条件：变性94℃，2min，循环(94℃，15s→60℃，15s→68℃，30s)25轮，最后68℃，5min。

2、用Trizol抽提起PHA-活化的外周血单个核细胞的总RNA，并以其作为模板，进行RT-PCR制备成熟TNFαcDNA。

引物：5’GGAATTCATGGTTCGTTCTTCTTCTCGTACTCC 3’(33nt)和5’CCCAAGCTTTCACAGAGCGATAATACCGAAGTATAC(36nt)。

3、构建6His-SA-L-TNFα-pET24重组质粒

制备的SA cDNA(不含终止码，两端分别含NdeI和EcoRI限制性内切酶位点)和TNFαcDNA(两端分别含EcoRI和HindIII限制性内切酶位点)，将上述SA和TNFα基因片段克隆于pET-24a载体中，获得6His-SA-L-TNFαpET24重组表达质粒(结构图如图1所示)。其中L为富含甘氨酸、丝氨酸的连接肽。重组表达质粒经DNA序列分析鉴定，验证其正确无误。

4、构建6His-SA-L-TNFα-pET24/BL21工程菌

6His-SA-L-TNFα-pET24重组表达质粒转化BL21(DE3)感受态细胞后，用含卡那霉素的LB平皿筛选。挑取转化平皿上的单菌落接种于加有卡那霉素(20μg/ml)的LB培养基中。经37℃摇床培养扩增至吸光度A600为0.4～0.5时，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG，37℃诱导表达4h，离心(8000g×10min)收获菌体，将细胞破碎后用12％的SDS-PAGE检测分析融合蛋白的表达情况。

5、融合蛋白6His-SA-L-TNFα的表达

融合蛋白6His-SA-L-TNFα在菌体中主要以包涵体的形式存在，其表达量达30～40％。

6、从包涵体中获得融合蛋白6His-SA-L-TNFα

a.制备包涵体：5克菌体悬于100ml 1xPBS中，冰浴中超声(电流270mA)，30秒×10次(每次间隔30秒)；接着于4℃离心10分钟(8000g)，将沉淀悬浮于100ml 1xPBS(内含4mol/L尿素，0.5％Triton X-100，20mmol/L EDTA)中进行漂洗，随后离心(1000g×10分钟)收集沉淀；漂洗两次后，溶于100mmol/L磷酸钠缓冲液，8mol/L尿素(pH8.0)中，15000g×15分钟，取上清液。

b.Ni-NTA柱层析：将步骤a得到的上清液上样于Ni-NTA柱(2.6×5cm)，用平衡液(100mmol/L磷酸钠缓冲液，8mol/L尿素，pH8.0)进行冲洗至样品A₂₈₀恢复至基线；然后用洗脱液(100mmol/L磷酸钠缓冲液，8mol/L尿素，pH4.5)进行洗脱，洗脱液经SDS-PAGE鉴定，收集融合蛋白质峰(融合蛋白6His-SA-L-TNFα的分子量为36KD)。

c.透析复性：将Ni-NTA柱层析纯化获得的6His-SA-L-TNF α融合蛋白调至OD₂₈₀＝0.2，在大于20倍体积的透析液(100mmol/L NaHCO₃，1.0mol/L尿素，1mmol/L还原型谷胱苷肽，0.2mmol/L氧化型谷胱苷肽，pH9.0)中4℃透析复性12小时；然后在50mmol/L NaHCO₃，500mmol/LNaCl，pH11中继续透析6小时；离心除去不溶物，收集上清。

d.2-Iminobiotin亲和柱层析：用平衡液(50mmol/LNaHCO₃，500mmol/LNaCl，pH11)洗脱5个柱体积后(柱体积0.5×2cm)，将收集的已复性融合蛋白质液上亲和层析柱，并用平衡液洗脱至样品A₂₈₀恢复至基线；然后，用50mmol/L NaAc，pH4.0洗脱，分管收集各洗脱峰，并用10×平衡液(500mmol/L NaHCO₃，5mol/L NaCl，pH11)将收集的融合蛋白质液调至pH8.0，并过滤除菌分装，储存于-20℃。

所得融合蛋白6His-SA-L-TNFα用SDS-PAGE鉴定，结果如图2所示。

7、利用L929细胞杀伤法对TNFα的活性进行测定，测得的TNFα活性为ED₅₀＝0.1～0.5ng/ml。

例2 6His-SA-L-TNFα修饰的肿瘤疫苗的制备

将10⁷个B16.F10细胞悬浮在1ml 1×PBS中，加入0.5mg Sulfo-NHS-LC-Biotin并混匀后，室温下作用30分钟；用1×PBS洗涤细胞3次后，每10⁶个B16.F10细胞加入200ng6His-SA-L-TNFα融合蛋白，冰上作用30分钟；1×PBS洗涤细胞1次后，然后用γ射线灭活(20000rad)，即可。

例3本发明融合蛋白对肿瘤细胞的修饰效果及其稳定性检测

用抗TNFα单克隆抗体及荧光标记的二抗经流式细胞仪对锚定在生物素化的B16.F10表面上的6His-SA-L-TNFα融合蛋白进行检测，结果见图3，几乎100％的肿瘤细胞被修饰，且肿瘤细胞表面有大量的TNFα。对锚定在肿瘤细胞表面的6His-SA-L-TNFα融合蛋白的稳定性经流式细胞仪进行分析表明，在一周内这些锚定的融合蛋白在细胞表面的数量无显著下降。

例4对锚定在生物素化的B16.F10表面上的本发明融合蛋白进行TNFα生物活性的测定

首先将表面已锚定了6His-SA-L-TNFα融合蛋白的10⁶个B16.F10经超声破碎，离心收集其不溶的膜性成分；然后将其悬浮于100μl完全培养基中，用L929细胞杀伤法对其中的TNFα进行生物活性测定，结果显示杀伤活性依赖于已锚定修饰细胞的不溶膜性成分的剂量，表明6His-SA-L-TNFα融合蛋白锚定在细胞表面后仍然能保持TNFα的生物活性。

例5本发明融合蛋白修饰的B6.F10肿瘤细胞疫苗预防肿瘤的效果

(1)材料：

本发明肿瘤疫苗：制备方法见实施例2；GFP-L-SA-6His(即绿色荧光蛋白和链亲和素的融合蛋白)修饰的、γ射线灭活(20000rad)的B6.F10肿瘤细胞：作为实验的阴性对照。

(2)方法：

分别将10⁶个GFP-L-SA-6His修饰的、γ射线灭活(20000rad)的B6.F10肿瘤细胞以及本发明肿瘤疫苗接种于C57BL/6小鼠左肋腹部的皮内，14天后加强一次；7天后，将10⁵未经任何处理的B6.F10肿瘤细胞接种于小鼠右肋腹部的皮下，然后观察肿瘤的生长情况和小鼠在40天内的成活情况

(3)结果：

有40％的免疫小鼠获得100％的保护(即无肿瘤生长)，阴性对照组全部有肿瘤生长(图4)。同时，本发明肿瘤疫苗的预防接种组的生存数及生存期显著高于GFP修饰的阴性对照组(图5)。

例6本发明融合蛋白修饰的B6.F10肿瘤细胞疫苗治疗肿瘤的效果。

(1)材料

(2)方法

将10⁵个未经任何处理的B6.F10肿瘤细胞接种于小鼠右肋腹部的皮下；4，11和18天后，分别将10⁶个6His-SA-L-TNFα修饰的、γ射线灭活(20000rad)的B6.F10肿瘤细胞接种于C57BL/6小鼠左肋腹部的皮内，然后观察肿瘤的生长情况和小鼠在40天内的成活情况。

(3)结果

如图6所示，本发明肿瘤疫苗治疗组的生存数及生存期显著高于GFP修饰的阴性对照组。

SEQUENCE LISTING

<110>南方医科大学

<120>链亲和素-肿瘤坏死因子α融合蛋白

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>329

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(2)..(7)

<223>组氨酸标签

<220>

<221>CHAIN

<222>(8)..(153)

<223>链亲和素核心部分，与成熟的全长抗生物素相比，在N-端缺失了13个氨基酸。

<220>

<221>DOMAIN

<222>(154)..(171)

<223>接头肽，并且其3′端含有BamHI和EcoRI的酶切位点。

<220>

<221>CHAIN

<222>(172)..(329)

<223>人成熟TNFα。

<400>1

Met His His His His His His Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr

1 5 10 15

Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala

20 25 30

Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr

35 40 45

Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly

50 55 60

Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala

65 70 75 80

His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala

85 90 95

Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn

100 105 110

Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys

115 120 125

Pro Ser Ala Ala Ser Ile Asp Ala Ala Lys Lys Ala Gly Val Asn Asn

130 135 140

Gly Asn Pro Leu Asp Ala Val Gln Gln Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly

145 150 155 160

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Phe Met Val Arg Ser Ser

165 170 175

Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro

180 185 190

Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu

195 200 205

Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser

210 215 220

Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly

225 230 235 240

Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala

245 250 255

Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro

260 265 270

Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu

275 280 285

Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu

290 295 300

Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly

305 310 315 320

Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu

325

<210>2

<211>323

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>CHAIN

<222>(1)..(147)

<220>

<221>DOMAIN

<222>(148)..(165)

<223>链接肽，并且其3′端含有BamHI和EcoRI的酶切位点

<220>

<221>CHAIN

<222>(166)..(323)

<223>人成熟TNFα。

<400>2

Met Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr

1 5 10 15

Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu

20 25 30

Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr

35 40 45

Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr

50 55 60

Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp

65 70 75 80

Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp

85 90 95

Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu

100 105 110

Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser Ile

115 120 125

Asp Ala Ala Lys Lys Ala Gly Val Asn Asn Gly Asn Pro Leu Asp Ala

130 135 140

Val Gln Gln Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

145 150 155 160

Gly Ser Ala Glu Phe Met Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp

165 170 175

Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu

180 185 190

Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu

195 200 205

Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile

210 215 220

Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro 0er Thr His Val

225 230 235 240

Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys

245 250 255

Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro

260 265 270

Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly

275 280 285

Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg

290 295 300

Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile

305 310 315 320

Ile Ala Leu

Claims

1.一种融合蛋白，该蛋白主要由链亲和素、接头肽和肿瘤坏死因子α连接构成，其中链亲和素连接在接头肽的N端，肿瘤坏死因子α连接在接头肽的C端；所述的接头肽为Ser SerGly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白的链亲和素部分的末端还连接有纯化标签。

3.一种融合基因，该融合基因编码权利要求1或2所述的融合蛋白。

4.一种表达载体，该载体含有权利要求3所述的融合基因。

5.一种工程菌，该工程菌转化了权利要求4所述的表达载体。

6.根据权利要求5所述的工程菌，其特征在于该工程菌是转化了本发明融合基因的pET24a重组质粒的大肠杆菌BL21。

7.权利要求1所述的融合蛋白在制备肿瘤疫苗中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其中所述的肿瘤疫苗是将权利要求1或2所述的融合蛋白锚定到经过生物素化的肿瘤细胞的表面获得的。