JPS63502271A - 天然のコロニ−促進因子‐１の精製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 天然のコロニー促進因子−１の精製 技術的分野 本発明はタンパクの精製、その精製産物、およびそれから作成されるＤＮＡプロ ーブに関するものである。特に９本発明はネズミおよびヒトのコロニー促進因子 −１（ＣＳＦ−１’）の精製と配列決定に関するものである。

宜且皇文献 種々の組織に極めて低濃度で生産されるある因子の、骨髄の先祖細胞の顆粒球お よび／またはマクロファージへの成長および発達を促進する能力は、この１５年 間に知られてきた。

多くの種の血清、尿サンプル、および組織抽出液中のそのような因子の存在は、 半固体培養培地上に置かれた骨髄細胞によるコロニー形成の促進を測るインビト ロ分析で示される。

インビボ分析は知られていない。これらの因子はそのようなコロニーの形成を誘 導するので、この因子はまとめてコロニー促進因子（ＣＳＦ　）と呼ばれた。

さらに最近、得られるコロニーに見られる細胞の型により決定されるヒトＣ５Ｆ タンパクに少なくとも４つのサブクラスがあることが解った。１つのサブクラス Ｃ５Ｆ−１では、主にマクロファージを含むコロニーになる。他のサブクラスは 中性染色性顆粒球とマクロファージの両方；中性染色性顆粒球のみ；中性染色性 顆粒球、好酸性顆粒球、およびマクロファージ、を含むコロニーを生じる。

上のヒトＣＳＦの初めの３つに類似のネズミ因子がある。さらに、　ＩＬ−３と 呼ばれるネズミ因子は、すべてのこれら細胞型に加え巨核球、赤血球、およびマ スト細胞を種々組合せで含むネズミ骨髄細胞のコロニーを誘導する。これらのＣ ＳＦはＤｅｘｔｅｒ。

Ｔ、Ｍ、、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９８４）　３０９　：　７４６．およびＶａｄ ａｓ、　Ｍ、Ａ、、　ｅｔここでの発明はこれらサブクラスの最初のもの、　Ｃ ５Ｆ−１の成分であるタンパクの精製に関するものである。このサブクラスはさ らに特異的ラジオノムノアフセイとラジオリセブターアッセイにより性格づけお よび特徴づけられるｍ−例えば。

精製Ｃ５Ｆ−１に対して生じた抗体は、他のサブクラスの生物学的活性に影響す ることなく、特異的にＣ５Ｆ−１活性を抑えることができ、またマクロファージ 細胞系列Ｊ７７４はＣ５Ｆ−１に特異的に結合するりセブターを含む。これらの 分析の記述はＤａｓ。

Ｓ、に、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｌｏｏｄ　（１９８１）　５８　：　６３０に より出版されている。

種々Ｃ５Ｆタンパクの精製方法が発表された。

５ｔａｎｌｅｙ、　Ｅ、Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｗ　（１ ９７７）　２５２　：　４３０５゜はネズミＬ９２９細胞のＣＳＦタンパクを比 活性約ｌＸｌ０”ユニット／■に精製し、それは主にマクロファージ生産を促進 した。Ｗａｈｅｅｄ、　Ａ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｌｏｏｄ　（１９８２）　 ６０　：　２３８．はマウスＬ−細胞の（：５Ｆ−１をウサギ抗体カラムを用い てほぼ均一にまで精製し、ネズミ配列の最初の２５アミノ酸を報告した（Ｂｅｎ −Ａｖｒａｍ。

Ｃ，Ｍ、　ｅｔ　ａｔ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（ＵＳＡ ）　（１９８５）　８８２　：　４４８６　）。

５ｔａｎｌｅｙ、　Ｅ、Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　（１９ ７７）　２５２　：　４３０５−４３１２はヒト尿からＣ５Ｆ−１精製手順を開 示し、またＤａｓ、　Ｓ、に、。

ｅｔ　ａｌ、　Ｂｌｏｏｄ　（１９８１）　５８　：　６３０　：　Ｊ　Ｂｉｏ ｌ　Ｃｈｅｍ　（１９８２）　２５７：　１３６７９はヒト尿Ｃ５Ｆ−１を比活 性５Ｘ１０’ユニツト／■で得。

それはマクロファージのみを生じた。そして培養マウスＬ−細胞とヒト尿から調 製したＣ３Ｆ−１タンパクの糖付加とそれらの活性の関係の概要を示した。Ｗａ ｎｇ、　Ｆ、Ｆ、、　ｅｔ　ａｌ、、’　Ｊ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９ ８３）　２１　：　２６３．はヒト尿Ｃ５Ｆ−１を比活性１０’Ｕ／ｍｇで得た 。

Ｗａｈｅｅｄ、　Ａ、、　、ｅｔ　ａｌ、は比活性０．７−２．３ｘ　１０’　 Ｕ／ｍｇのヒト尿Ｃ５Ｆ−１をウサギ抗体カラムで得た（シ卯」蝕二Ｉ工（１９ ８４）　１２：　４３４　）　。

Ｗｕ、　Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　（１９７９）　２５ ４　：　６２２６．は培養ヒトすい腰痛（ＭＩＡＰａＣａ　）細胞からＣ５Ｆタ ンパクを精製し。

それはネズミ顆粒球とマクロファージコロニーを増殖させたと報告した。得られ たタンパクは約７Ｘ１０’ユニツト／■の比活性を有していた。

種々のＣ５Ｆの部分精製標品がまた。ヒトおよびマウスの肺細胞のコンディショ ンドメディウムから（Ｆｏｊｏ、　Ｓ、Ｓ、、　ｅｔ　ａｌ＋Ｂｉｏｃｈｅｍｉ ｓｔｒ　（１９７Ｂ）　１７　：　３１０９　；　Ｂｕｒｇｅｓｓ、　Ａ、Ｗ、 、　ｅｔ　ａｌ。

Ｊ、Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｗ　（１９７７）　２５２　：　１９９８）　；ヒトＴ− リンパ芽球細胞から（Ｌｕｓｉｓ、　Ａ、Ｊ、、　ａｔ　ａｌ、　Ｂｌｏｏｄ　 （１９８１）　５７　：　１３　；　Ｕ、Ｓ、　Ｐａｔｅｎｔ。

４．４３８．０３２）　；ヒト胎盤のコンディションドメディウムから見掛は上 均−にそして比活性７Ｘ１０’ユニツト／■で（向。

Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　（１９８０）　１９　：　３ ８４６）＋報告された。

出願中の米国特許第６９８．３５８号は１組換えＤＮＡ技術によるヒトおよびネ ズミのＣ３Ｆ−１のクローニングと発現を述べている。べつのサブクラスのＣＳ Ｆタンパク、ネズミおよびヒトのＧＭ−ＣＳＦ、が精製され、そのｃＤＮＡがク ローン化された。

このタンパクはＧｏｕｇｈ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９８４）　３ ０９　：　７６３−７６７により、他のｃｓｐ　、例えばＣ５Ｐ−１と明らかに 異なることが示された。ネズミのＩＬ−３がＦｕｎｇ、　Ｌｃ、Ｉ　ｅｔ　ａｌ ＋　Ｎａｔｕｒｅ　（１９８４）３０７　：　２３３によりクローニングされた 。また、　Ｙｏｋｏｔａ、　Ｔ、＋ｅｔ　ａｌ、　ＰＮＡＳ　（１９８４）　８ １　：　１０７０−１０７４　；　Ｗｏｎｇ、　Ｇ、Ｇ、、　ｅｔ　ａｌ。

５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８５）　２２８　：　８１０−８１５　；　Ｌｅｅ、　 Ｆ、、　ｅｔ　ａｌ、　ＰＮＡＳ　（１９８５）８２　：　４３６０−４３６４ 　、およびＣａｎｔｒｅｌｌ、　Ｍ、Ａ、、　ｅｔ　ａｌ、　ＰＮＡＳ　（１９ ８５）皿：　６２５０−６２５４を参照。

主主里至皿丞 １つの観点では１本発明は９本発明により決定された一次アミノ酸配列を有する 。精製された天然のヒトおよびネズミＣ３Ｆ−１タンパク、および多量のそのよ うなタンパクとそのような配列情報を得る方法に関するものである。精巧な精製 技術と注意深い配列決定はヒトおよびネズミ両型のＮ末端配列の同定を可能にし た。これにより、症状を分析し、そして症状に相関したＣ３Ｆ−１タンパクの変 化を調べるのに有用なプローブの作成が可能になる。このプローブはまた。　Ｃ ５Ｆ−１タンパクの組換え操作による生産を行うのに有用なＣ３Ｆ−１をコード するＤＮＡを得る道具としてを用である。このようにして。

他の観点では１本発明は決定配列に基づき設計されるプローブに関するものであ る。

ある−面では９本発明はを椎動物からのＣ３Ｆ−１精製の改良法に関するもので ある。これらの方法は、有効な特異的精製段階を行うためのイムノアフィニティ ークロマトグラフィーの利用と次いで混在物を除くための逆相ＨＰＬＣの使用を 含む。

モノクローナル抗体がイムノアフイニテイークロマトク゛ラフイ一段階に使われ るであろう。他の面で番よ１本発明番ま得られた天然の精製Ｃ５Ｆ−１と、精製 品から決定されたアミノ酸酉己りＩＪに基づき設計されるＤＮＡプローブに関す るものである。

皿坐皿工星説里 第１図は精製天然タンパクから決定されたヒト尿およびＭＩＡＰａＣａおよびネ ズミＬ−９２９細胞のＣ５Ｆ−１の部分アミノ酸配列を示す。

第２図はネズミＣ５Ｆ−１のアミノ酸配列から設計されたオＩＪゴマ−プローブ の配列を示す。

第３図はヒトＣ５Ｆ−１のアミノ酸配列から設計されたオＩＪゴマーブロー°プ の配列を示す。

生１旦坐実立皿様 サレル活性スベクトルー−すなわち、　Ｍｅｔｃａｌｆ、　ｏ、ｌ　Ｊ　Ｃｅ１ ｌハＬ旦Ｌ（１９７０）７６　：　８９の標準インビトロ　コロニー促進分析の 適用により、主にマクロファージコロニーを形成するｍ−を示すタンパクを指す 。この因子はまた＊　ＭｏｏｒｅＪ、Ｎ、、　ｅｔａｌ、　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ 　（１９８３）　１３１　：　２３７４　とＰｒｙｓｔｏｗｓｋｙ、　Ｍ、Ｂ、 、　ｅｔａｔ、　Ａｍ　Ｊ　Ｐａｔｈｏｌ　（１９８４）　１１４　：　１４９ の骨髄増殖分析で活性がある。このタンパクはいかなるを椎動物種、好ましくは 哺乳類種、そして最も好ましくはヒトまたはネズミ検体から単離されるであろう 、いくらか種特異性があるようである：ヒトＣ３Ｆ−１はヒトおよびネズミの骨 髄細胞の両者に作用する；ネズミＣ５Ｆ−１はヒト細胞に活性を示さない、従っ て、ヒ）ＣＳＦ−１はＤａｓ、　Ｓ、に、、　ｅｔ　ａｌ、　Ｂｌｏｏｄ　（１ ９８１）　５８　：　６３０の特異的ネズミ　ラジオリセプター分析で陽性であ るべきで、そしてヒトタンパクの生物学的活性はヒト尿Ｃ５Ｆ−１の中和抗血清 で阻害される（Ｄａｓ、　ｓ、ＬＩ　ｅｔ　ａｌ＋前出）。

Ｃ５Ｆ−１のある別の性質がごく最近見出され、それには、成熟マクロファージ （Ｍｏｏｒｅ、　Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、　５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８４）　２２３ ：　１７８　）からのＥプロスタグランジン系、インターロイキン−１，および インターフェロンの分泌のこのタンパクによる促進能、そして下に述べる単球へ の別の効果が含まれる。後者の活性に対する機構は現在不明で、そしてここでの 定義の為に、定義の規準を、出発物質として適当な種の骨髄細胞を用いる単球／ マクロファージコロニー形成の促進能とする。

（Ｃ５Ｆ−１の増殖効果は単核食作用系統の細胞に限定されること（Ｓｔａｎｌ ｅｙ、　ａＪ、ｌ　Ｔｈｅ　Ｌ　ｔｏ　ｈｏｋｉｎｅｓ　（１９８１）＋　Ｓｔ ｅｗａｒｔ、　Ｗ。

Ｅ、、　ＩＩ、　ｅｔ　ａｌ、著、　ＨｕＩＩｌａｎａ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｃ１１ ｆｔｏｎ、ＮＪ　）　、ＰＩ）＋　１０２−１３２）　、およびＣ５Ｆ−１のり セプターはこれらの細胞系列に限定されること（Ｂｙｒｎｅ＊’　Ｐ、Ｖ、、　 ｅｔ　ａｌ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ　（１９８１）　９１：　８４８））が知ら れている。

すべてのタンパクの場合と同様、正確な化学構造は多数の因子に依存する。イオ ン化するアミノ基およびカルボキシル基が分子中にあるので、特定のタンパクは 酸性または塩基性塩、または中性型として得られる。適当な環境条件にある時定 義に含む。さらに、−次アミノ酸配列は、糖成分による誘導体化（＄１！付加） 、または脂肪、リン酸塩、アセチル基などの他の付加的分子により、より一般的 には多糖類との結合により、大きくなるであろう。−次アミノ酸配列はまた。凝 集して複合体、大半は二量体を形成するであろう。実際、天然して単離される。

このような増大のある面は、生産宿主の翻訳後のプロセッシングシステムにより 達成される：、他のそのような修飾はインビトロで導入されるであろう。とにか く。

主題のタンパクは、上記特定したようなタンパク活性が存在する限り、凝集また は誘導体化の状態にかかわらずＣ５Ｆ−１の定義内にある。もちろん、そのよう な修飾は２種々のアッセイにおいてタンパクの活性を高めるまたは低下させるこ とにより、量的または質的に活性に影響するであろう。

さらに、鎖中の個々のアミノ酸残基は、酸化、還元、またはタンパクレベルでの 他の誘導体化により修飾されるであろう。あるいはタンパクは活性断片を得るた めに切断されるであろう。活性を損なわないような変換がこの定義中に含まれる 。もちろん、異なるを椎動物種由来のＣ５Ｆ−１は完全な相同性を示すとは考え られず、これらの変化はこの定義に含まれる。

１−コロ１注 本発明のＣ３Ｆ−１タンパクは、幹髄細胞からの単球−前駆体／マクロファージ 細胞生産を促進し、よって免疫システムの効果性を高めること、および成熟マク ロファージ中でのリンホカインの分泌のようなこれらの分化細胞の機能を促進す ること、の両方が可能である。

ある通用においては、これらのタンパクは化学療法の付属物として有用である。

化学療法的治療により免疫システムが抑制されることはよく理解されている。そ れらが向けられる腫瘍細胞を破壊することに成功しても、化学療法的治療はしば しば、免疫システムの細胞への化学毒性物質の副作用により、患者を死亡させる ことがある。Ｃ５Ｆ−１をこのような患者に投薬することは、　Ｃ３Ｆ−１が骨 髄−由来前駆体の増殖とマクロファージへの分化を媒介・促進させることができ るため。

免疫システムを再刺激して、この副作用を防ぎ、よって患者が２次感染を受ける 傾向を防ぐことになる。このような治療により助けられるであろう他の患者とし ては、白血病で骨髄移植の治療を受けた人たちが含まれる。彼らはしばしば拒絶 を防ぐために免疫抑制の状態にある。それらの患者にとっても、　Ｃ３Ｆ−１の 投与により免疫抑制は回復しうる。

一般に、化学療法、骨髄移植、もしくは病気のような免疫る免疫抑制にかかって いるいかなる被検者も、　Ｃ５Ｆ−１を薬学的に使用できることにより恩恵を得 るであろう。さらに被検者は、生来のシステムのマクロファージを補うために、 　Ｃ３Ｆ−１で処理した骨髄のインビトロ培養物または他の適当な調製品により 産生されたすでに分化した増加量のマクロファージの供給を受けることができる であろう。これらの調製品には。

このように培養し２局所的または全身的な治療のために戻すことができる患者本 人の血液単球の調製品を含む。Ｃ３Ｆ−１がマクロファージによるリンホカイン の産生を促進することができることにより、腫瘍と感染の治療においてもまたＣ ５Ｆ−１は直接的に有用となる。

Ｃ５Ｆ−１は、ネズミ由来マクロファージによるインターフェロンの産生を促進 しくＦｌｅｉｔ＋　Ｈ，Ｂ、＋ら、　Ｊ　Ｃｅ１ｌ　Ｐｈ　５ｉｏｌ　（１９８ １）１０８　：　３４７　”）　、そしてＭＩＡＰａＣａ細胞由来のヒトの部分 精製Ｃ３Ｆ−１は、後述のように、ヒト単球からのインターフェロンとＴＮＦの ポリＩＣ誘導された産生を促進する。さらに、　Ｃ５Ｆ−１はヒト血液単球によ る骨＠Ｃ５Ｆの産生を促進する。

さらに後述されるものは、（ＬＩＥＩ胞条件培地からの）ネズミＣ５Ｆ−１が、 ネズミ肉腫ＴＵ５標的を殺すために正常Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス腹腔マクロフアー ジを刺激できる能力、の説明である。

この活性はＣ５Ｆ−１が前処理としてエフェクターフェイズ（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｐｈａｓｅ　）中に用いられる場合に最も効果的である。Ｃ９Ｆ−１がそれを行 う能力は、他のコロニー促進因子により示されるものよりもずっと高い。さらに 、ネズミ細胞のウィルスを攻撃する能力はＣ５Ｆ−１により高められる。

（ネズミＣ３Ｆ−１は、ネズミマクロファージを、　Ｐ８１５腫瘍細胞に対し細 胞静力学的（ｃｙｔｏｓｔａｔｉｃ）となるように（Ｗｉｎｇ。

Ｅ、Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ　Ｃ１１ｎ　Ｉｎｖｅｓｔ　（１９８２）　６９ 　：　２７０）　、もしくは他の白血病標的を殺さないように（Ｒａｌｐｈ、　 Ｐ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｃｅ１ｌＩ＋ｎｍｕｎｏｌ　（１９８３）　７６　：　１ ０）　、刺激するという矛盾した報告がされている。　Ｎｏｇａｗａ、　Ｒ，Ｔ 、＋　らＣｅ１ｌ　Ｉｍｎ＋ｕｎｏｌ　（１９８０）　５３　：１１６は、　Ｃ ３Ｆ−１が酵母を取込んで殺すようにマクロファージを刺激しうろことを報告し ている。） よって、免疫抑制それ自身を克服することに加え、マクロファージの分泌と活性 を促進することにより侵入生物もしくは悪性細胞を破壊するために、　Ｃ３Ｆ− １を用いることができる。

本発明のＣ５Ｆ−１は、タンパク物質の投与に関する当業者に・標準的な従来の 方法でフォーミュレーションできる。注射による投与が好ましい：フォーミュレ ーションには、懸濁液。

乳濁液、もしくは注射可能なものに再構成するための固体組成、の溶液が含まれ る。適当な賦形剤には９例えばリンガ−液、バンク液、水９食塩水、グリセロー ル、デキストロース溶液、などが含まれる。それに加え９本発明のＣ３Ｆ−１は 、適切な反応を促進するために細胞調製物と前処理してもよく。

そして調製物全体もしくはその上清を被検体に与えることができる。この後示す ように、　Ｃ３Ｆ−１刺激の反応で種々の型の血液細胞により産生された物質は 所望の標的に対して効果的であり、侵入ウィルスまたは腫瘍を攻撃するというこ れら血液細胞それ自身の性質が増強される。被検体自身の細胞を抜取ってこのよ うに利用するか、あるいは例えば、他の和合可能な個人の単球もしくは白血球を その処理（インキュベーション）に用いることができる。

Ｃ５Ｆ−１と名づけられたある型の活性の存在がいくらか前から知られているが 、配列決定ができるほど十分純粋な形でそれに関連するタンパクの十分な量が得 られてはいす、よって。

病気の状態を、リンホカインをコードする物質のそれに関連した核酸パターンに 基づいて、研究するための、ＤＮＡプローブの構築は不可能であった。本発明は プローブを構築できるほど十分な配列の情報を提供する。種々の付加的な精製手 段により、ＤＮＡオリゴマープローブの構築を可能とするいくつかのアミノ酸配 列を提供するのに十分な純度のＣ５Ｆ−１が。

ヒト尿、旧ＡＰａＣａ細胞およびネズミＬ細胞から得られている。

そのプローブは、病気の状態を評価することと同様に、全タンパクのコード配列 を得るのに有用である。もちろん、精製されたタンパクは前記のように治療的に も有用であり、また診断と治療に用いるための抗体産生にとっても有用である。

旦＝且袈 本発明のＣ５Ｆ−１タンパクは、いくつかの方法で、Ｎ末端配列を得るのに十分 な均質性と量で精製された。

後述するように、ヒト尿Ｃ５Ｆ−１はＤａｓ、　Ｓ、に、、　ｅｔ　ａｌ、　Ｂ ｌｏｏｄ（１９８１）　５８　：　６３０に記載の標準的方法により部分的に精 製され、それに続いて、セファロースＢカラムに取付けたＹＹＧ１０６というネ ズミＣ５Ｆ−１に対するラットのモノクローナル抗体を用いたアフィニティー精 製段階（Ｓｔａｎｌｅｙ、　Ｅ、Ｒ，、Ｍ旦蝕並」払「並（１９８５）　１１６ 　：　５６４）を行った。精製の最終段階は０．１％ＴＦＡ／３０％アセトニト リル−０，１％ＴＦＡ／６０％アセトニトリルのバッファー系での逆相ＨＰＣＬ であった。

フォルポル・ミリスティック酢酸の誘導により無血清状態で産生されたＭＩＡＰ ａＣａでは、細胞上澄液をリン酸カルシウムゲルクロマトグラフィ　（Ｄａｓ（ 前出）に従って）、続いてレンチルレクチンを用いたアフィニティークロマトグ ラフィー（ＤａｓのＣｏｎＡアフィニティ一段階の代わりに）、そして次に。

セファロースＢに結合させたＹＹＧ１０６のモノクローナル抗体を用いたイムノ アフィニティ一段階、そして逆相ＨＰＬＣにがけた。

ネズミＣ５Ｆ−１をまず５ｔａｎｌｅｙ、　Ｅ、Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、　Ｊ　Ｉｍ ｍｕｎｏｌ　Ｍｅｔｈ（１９８１）　４２　：　２５３−２８４の記載に従って 精製し、続いてヒトタンパクに対する前出のイムノアフィニティーカラムにかけ 。

そして次に逆相ＨＰＬＣにかけた。ネズミＣ５Ｆ−１も、Ｌ細胞上澄を直接リン 酸カルシウムクロマトグラフィーにかけ１次に前述のアフィニティークロマトグ ラフィー、続いて逆相ＨＰＬＣを用いた短縮手順により調製した。

一般に、イムノアフィニティークロマトグラフィ一段階。

好ましくはモノクローナル抗体調製物を用いたイムノアフィニティ一段階、それ に続いて逆相■ＰＬＣを利用した。　Ｃ５Ｆ−１りＰＡＧＥを用いて分析しても よい。

イムノアフィニティークロマトグラフィーには標準的方法の使用が含まれ、これ によれば抗体調製物はセファロース。

デキストランまたはポリアクリルアミドのような適当なポリマー支持体に、その 支持体の性質に合うような手法で支持される。この段階で使用されるポリクロー ナル抗体の調製物は。

ヒトの尿またはネズミＬ細胞培地由来のもののような精製タンパクを用いて被検 体、好ましくはウサギ、マウス、またはラットのような哺乳動物の被検体を免疫 化することにより調製する。抗血清をポリクローナル組成物として直接用いても よく、また免疫化した被検体の肺臓細胞または末梢血液白血球を例えばＫｏｈｌ ｅｒとＦｌｉｌｓｔｅｉｎの融合手法を用いて永久増殖化してもよい。うまく融 合した細胞を次に、モノクローナル抗体産生系統を得るために、　Ｃ３Ｆ−１に 対する抗体の産生により選別する。不変の組成物が容易に得られるために、もち ろんモノクローナル調製物が好ましい。特に好ましいモノクローナル抗体は、ラ ットの骨髄腫系統とネズミＬ細胞Ｃ３Ｆ−１で免疫化したラットの肺臓細胞との 細胞融合体である。　ＹＹＧ１０６細胞系統により産生されたものである。細胞 系列ＹＹＧ１０６は、　１９８６年２月５日付で、　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐ ｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　１２３０１Ｐａｒｋｌａｗｎ　 Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ　２０８５２＋　Ｕ、Ｓ、Ａ、に、 受理番号ＨＢ９０１４で寄託された。

逆相ＨＰＬＣに関しても、標準的な技術を用いる。アルキル−。

アリール−、ルアリール−９またはアリールアルキル−誘導体化支持体のような ２例えばフェニルセファロースまたはフェニルＴＳＫなどのどのような疎水カラ ムを用いてもよい。溶出勾配は支持体の選出に依る。

アミノ酸の組成決定と配列決定は標準的な手法により行ったが、さらに後述され るように１手法は入手可能なタンパクにより生じる特殊な問題に適合させた。

Ｄ、プローブの 前記の精製タンパクから得られた配列の情報を用いて、標準的な市販の技術を用 いてオリゴマーＤＮＡ配列を構築した。

プローブの混合物を用いることにより、または哺乳動物の発現において望まれる コドンを含む限られた数の特別なオリゴマーを用いることにより、コドン使用頻 度を考慮に入れる。

旦−爽施■ 次に述べる実施例は１本発明を説明するものであり、限定するものではない。

Ｅ、１．　然のヒトＣ５Ｆ−１の　リ ヒトの尿Ｃ５Ｆ−１を、　Ｄａｓ、　Ｓ、に、、らＢｌｏｏｄ　（１９８１）　 ５８　：　６３０゜により記述された標準的な方法により部分精製し＋ｔｌｔい てセファロースＢカラムに取付けられたＹＹＧ１０６と呼ばれるネズミＣ３Ｆ− １に対するラットのモノクローナル抗体を用いたアフィニティー精製段階（Ｓｔ ａｎｌｅｙ、　Ｅ、Ｒ，＋　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚ　ｍｏｌ　（１９８５）１ １６　：　５６４　’）にかけた。精製の最終段階は０．１％ＴＦＡ／３０％ア セトニトリル−０，１％ＴＦＡ／６０％アセトニトリルパンファー系による逆相 ＨＰＬＣであった。

フォルポル・ミリスティック酢酸を用いた誘導により、無血清状態で産生された ＭｒＡＰａＣａに関しては、細胞上澄液をリン酸カルシウムゲルクロマトグラフ ィー（Ｄａｓ（前出）に従う）にかけ、続いて（ＤａｓのＣｏｎＡアフィニティ 一段階の代わりに）レンチルレクチンを用いたアフィニティークロマトグラフィ ー、そして次にセファロースＢに結合させたＹＹＧ１０６モノクローナル抗体を 用いたイムノアフィニティ一段階、そして逆相ＨＰＬＣにかけたこの両方は前述 の通りである。′すでに均質にまで精製されている尿とＭＩＡＰａＣａタンパク を。

自動シークエンサーによるエドマン分解を用いてアミノ酸配列決定にかけた。第 ３図に示されるプローブ構築ができるのに十分なヒ）ＣＳＦのＮ末端配列を決定 した（第１図）。

より詳細には、　ＭＩＡＰａＣａと尿の両方のＣ５Ｆ−１について用いたすべて の緩衝液は、３ｍＭのＮａＮ３とＯ，ＯＩ　ｇ　／　１．のＰＥＧ−６０００を 含む。各々の場合の初期段階は、ＤＥＡＥ−セルロースクロマトグラフィーであ る。約１００　ｆｆｉのプールされた尿もしく）よ、それに匹敵する量のＣ５Ｆ −１活性を含む量のＭＩＡＰａＣａ培地をｐ）１７．４に調製し、塩を除去する ために透析する。透析液を次に３０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液、　ｐＨ７，４ で前平衡化したＤＥＡＥセルロースカラム（乾燥重量２００ｇ、　Ｅａｓｔｍａ ｎ　）にかける。

カラムを４０ｍＭＮａＣｌを含む同じ緩衝液で洗浄し、２５０ｍＭＮａＣ１を含 む同じ緩衝液で溶出させる。骨髄買主決定による分析でＣ５Ｆ−１を含む両分を 、イオンを除去するために透析または限外濾過する。脱イオン化した溶出液を次 にリン酸カルシウムゲル（５８ｍｆ／ｇタンパク）で処理し、１０１の５１１Ｉ Ｍリン酸ナトリウム、　ｐＨ６，５を用いたデカンテーションにより、そのゲル を洗浄する。そのスラリーを２．５１に再懸濁し、　Ｃ５Ｆ−１を溶出させるた めに、　２５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、　ｐＨ６，５に合わせ、　１２． ０ＯＯＸ　ｇ、　１０分での遠心分離によりゲルから分離し、さらにＤＥＡＥセ ルロースクロマトグラフィーにかけるために５０−に濃縮する。

１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液、　ｐＨ７，４の溶出Ｃ５Ｆ−１を次に同 じ緩衝液で前平衡化したＤＥＡＥセルロースカラムにかけ、同じ緩衝液でＮａＣ １の直線勾配（０−１５０ｍＭ）を用いて溶出させた。Ｃ３Ｆ−１は約７５　１ ３０ｍＭのＮａＣ１で溶出し、それらの両分を透析し、　ＣｏｎＡセファロース のアフィニティークロマトグラフィーにかけるため１５Ｗｉに゛濃縮する。

濃縮液を１０Ｏｎ＋Ｍ酢酸塩＋　ＩＭ　ＮａＣ１＊　１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、　 １０ｍＭ　ＣａＣＩｚ。

１０ｍＭ　ＭｎＣ１ｚ、　ｐＨ６，０（ＣｏｎＡ緩衝液）中に溶解し、　Ｃｏｎ Ａセファロースカラム（ファルマシア）にかける。そのカラムを４℃でＣｏｎＡ 緩衝液で洗浄し、１００ｍＦＩα−メチルーＤ−グルコシドを含む同じ緩衝液で 溶出させ、骨髄買主検定で決定したＣ５Ｆ−１を含む分画をプールし、ゲル濾過 のために３−に濃縮する。

Ｃ５Ｆ−１を３Ｏｎ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　、　ｐＨ７，４にして、同じ緩衝 液で平衡化したバイオゲルＰ−１００カラムにかける。活性分画はボイドボリュ ーム中に溶出し、それをプールして５０ｍＭリン酸塩。

ｐＨ６，５で透析する。

ゲル濾過段階からプールした溶出液をその後１次のバラグラフに述べるように調 製した抗Ｃ５Ｆ−１モノクローナル抗体に誘導体化させたＰＡＢＡＥ−Ｓｅｐｈ −４Ｂカラム１−につき１０’ＵのＣ５Ｆ−１を用いてイムノソルベントクロマ トグラフィーにかける。

１０％ＦＣＳ−α培地の懸濁培養で維持したハイプリドーマより産生されるモノ クローナル抗体ＹＹＧ１０６を用いてカラムを調製した。部分精製したネズミＬ 細胞のＣ３Ｆ−１で免疫化したラットの＊Ｉｉ：細胞とラット骨髄腫系統との細 胞融合によりハイブリドーマを得た。所望のモノクローナル抗体産生用の無血清 培地を、洗浄した細胞（１０’／ｄ）をＨＢＩＯＩ培地（ＨａｎａＢｉｏｌｏｇ ｉｃｓ、　Ｂｅｒ’ｋｅｌｅｙ、　ＣＡ　）中で培養し、細胞生存性が２５％に 落ちた培地から培地を４ＯＯＸｇ、１５分間の遠心分離により回収することによ り調製する。回収した培地を次に硫酸アンモニウムで５０％飽和にし、４℃、１ ２００Ｘｇで１５分間、遠心分離することにより沈澱を集め、　２０ｍＭリン酸 ナトリウム緩衝液。

ｐＨ７，１で透析し、４℃で同じ緩衝液で平衡化したＤＥＡＥアフィゲルブルー （ＢｉｏＲａｄ　Ｌａｂｓ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ　Ｃｅｎｔｅｒ、　ＮＹ　） カラムにかける。そのカラムを２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、　ｐＨ７，１ で洗浄し、この緩衝液のＯ−０，１５Ｍ　ＮａＣ１勾配を用いて目的のモノクロ ーナル抗体を溶出させる。分画の抗体活性を決定し。

活性分画をプールし、限外濾過により濃縮する。

充填ベッドボリュームのＰＡＢＡＥ−５ｅｐｈ　（ｐ−アミノベンズアミドエチ ル誘導体化させたセファロース４Ｂ）を０．５Ｍ　ＨＣＩ　（冷）で洗浄し、７ 分間氷上でインキュベートした０、２Ｍ　ＮａＮ０ｚで処理する。少な（とも２ 倍量の氷冷した蒸留水でゲルを３回洗浄し、同量の洗浄したゲルと濃縮モノクロ ーナル抗体（０，２Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液、　ｐＨ８，０中で３■／−）と を混合し。

４℃で１６時間振とうした。その結果生じる誘導体化ＰＡＢＡＥ−Ｓｅｐｈ−４ Ｂを次に、５倍量の１％トリエタノールアミンの５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　 、　ｐＨ８，５，５倍量の６Ｍ尿素の０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、　ｐＨ７， ４そして０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、　ｐＨ６，５での平衡化の前に５ 倍量の０．４１’！重炭酸ナトリウムを順番に用いて洗浄する。）前述のように プールしたゲル濾過溶出液を、　ＰＡＢＡＥ−Ｓｅｐｈ−４Ｂ抗体誘導体化カラ ムを用いて、　１０’Ｕ／ＩＲ１，４℃で処理し、カラムに再循環させる。その カラムを５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、　ｐＨ６，５，次に４Ｍ　ＫＳＣＮ を用いて溶出させる前に１００ｍＭグリシン−ＨＣｌ　、　ｐＨ２，０，次に０ ．１Ｍグリシン−ＨＣｌ　、　ｐＨ２，０で洗浄し、その最終の溶出液を０．６ 力ラム倍量の１Ｍ重炭酸アンモニウムを含む容器に集める。溶出液を分けて０． ０１　ｇ　／　ｉ！ＰＥＧ−６０００に対して透析する。

得られたヒト尿Ｃ５Ｆ−１は約８Ｘ１０’Ｕ／■の比活性をもつ。

ヒトの尿またはＭＩＡＰａＣａのＣ５Ｆ−１を次に、後述の０．１％ＴＦＡ／ア セトニトリル勾配を用いた逆相ＨＰＬＣにかける。

無血清培地由来のいくつかのｌ’１ＩＡＰａｃａ調製物については。

前出のリン酸カルシウムゲル濾過段階により、続いてＣｏｎＡの代わりにレンチ ルレクチンを用い他は前出の通りにアフィニティークロマトグラフィーにより、 続いて前出のイムノアブツルバントクロマトグラフィーとＨＰＬＣ段階により、 精製を行う。

ＨＰＬＣ溶出液のＳＤＳゲル電気泳動は、ヒトの尿とＭＩＡＰａＣａの調製物の 両方について均質性を確証する。

（以下余白） フズしニブ！す」袋 ヒトＣＳＦの充分なＮ末端配列を、第３図で示すプローブの構築を行なえるよう に決定した。精製した旧ＡＰａＣａおよび尿のＣ３Ｆ−１のＮ末端配列は同一で ある。得られた合成オリゴヌクレオチドは、ヒトの様々な症状の診断や原因の決 定に有用久２パ久ｑ茸製 ネズミのＣ３Ｆ−１は、　５ｔａｎｌｅｙ、　Ｅ、Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、　Ｊ　Ｂ ｉｏｌ　Ｃｈｅｍ（１９７７）　２５２：４３０５；５ｔａｎｌｅｙ、Ｅ、Ｒ， 、ｅｔ　ａｌ、　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｍｅｔｈ（１９８１）４２；２５３−２ ８４．およびＷａｎｇ、　Ｆ、Ｆ、、　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｃ ｈｅｍ（１９８３）　２１　：２６３−２７５により、開示されているものと同 様の、標準的な方法により精製できる。他方では、バッチのリン酸カルシウムゲ ルクロマトグラフィ一段階（Ｓｔａｎｌｅｙ、Ｅ、Ｒ，、Ｊ　Ｉｍｍｕｎ厘並） （上記））に面接続いてイムノアフィニティークロマトグラフィーを行うことが できる。

さらに詳しくは、無血清し細胞の条件培地の最初の調製を５ｔａｎｌｅｙ、Ｅ、 Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｍｅｔｈ　（上記）で述べられてい るように行い１次いでリン酸カルシウムゲルを無血清し細胞の条件培地（４０ｄ ／ｉ！培地＞２０−４０７！に加えることによりリン酸カルシウムゲルクロマト グラフィーに供し、ゲルを繰り返されるバンチ処理で沈澱させる前に。

−２０℃で１０分間、混合液をかきまぜる。　・１０６Ｕ／−で用いる以外は、 ヒトのタンパクと関連して上記で述べたように、　ＹＹＧ１０６抗体付きのＰＡ ＢＡＥ−５ｅｐｂ−４Ｂを用いて。

溶出物をアフィニティークロマトグラフィーに供し、第２の溶出段階は省略する 。

このように精製したネズミの材料を、上記で述べたように逆相ＨＰＬＣおよびＴ ＦＡ／アセトニトリルでの溶出に供する。精製したネズミの材料の比活性は、約 ４−８　ＸＩＯ’υ／ｒｎｇである。

ヒトより精製したＣ５Ｆ−１と同様に、精製したネズミのＣ５Ｆ−１は２分子量 の４０−６０％であるアスパラギン結合複合型の糖である１重度に糖化された二 量体である。２−メルカプトエタノール存在下での５Ｏ３−ＰＡＧＥ上で、精製 した調製物は７０ｋｄと９０ｋｄの見かけの分子量を有し、還元すると７０ｋｄ と９０ｋｄＯ元の分子量の二量体に由来する４０ｋｄのメージャーバンドと３３ ｋｄのマイナーバンドになった。４０ｋｄのサブユニットは３３ｋｄのサブユニ ット以上により多く糖化されており、また両サブユニットのＮ末端配列が同一で あることは明らかである。

マウスのタンパクの全組成のデータも以下に示されでいるように得た。これらの データは、良好な回収を示すそのアミノ酸に対する正確な相対モル％を示してい るが、ヒスチジやシスティンは良い収率で得られなかったので、数は絶対的では ない。

（以下余白） ヱま込衆　モル％　且基／１２５ 残基／１２５への変換は１分子量からの配列の長さの概算に基づいている。

一次構造の決定は、自動エドマン分解装置を用い、そして逆相ＨＰＬＣにより逐 次的に分解されたアミノ酸を分析することにより１行なった。従来通りでの配列 決定は、初めの１３個のＮ末端アミノ酸配列となった。１０番目にメチオニンが 存在し。

限られた数のメチオニン残基が存在するため、　ＣＮＢｒ分解したタンパクを、 断片の前分画なしでシークエンサーに負荷し。

３つの配列だけを得た。これらは９期待したＮ末端配列、すなわち既知のＮ末端 配列に重複してｌ１ｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｎで始まる配列、および約５０％の収率で Ｘ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓで始まる配列であった。

後者の２つの断片と最初の既知の配列の量の差により、限られた数の残基を通じ て３断片を同時に配列決定できた。

次に配列決定を、精製したＣＮＢｒ内部断片に藺して行なった。

このＮ末端のＧｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓペプチドに混在する断片を、０−フタルア ルデヒドで処理してＮ末端にプロリンを持たない断片をブロックすることにより 除去した（内部配列は７番目にプロリンを有する）。配列決定を続け、内部断片 の次の残基をこのように固定した。配列決定の結果を第１図に示す。データは、 ２つの同一のサブユニ７）を含む二量体タンパクに。

そして単一のサブユニ７）の両端に由来するペプチドのＣＮＢｒによる放出に一 致し、これらの末端は残基１−２５で、内部の断片であり、各々はおよその分子 量が２．５ｋｄである。

前述のデータは、　１４．５ｋｄの分子量の非糖化サブユニットに基づ＜　Ｃ５ Ｆ−１の配列のおよそ半分を表している。Ｌ−細胞Ｃ５Ｆ−１は約６０重量％が 炭水化物で、唯一の糖化されうる部位（３７゜３８、および３９番目の位置）が 同定されているので１分子の残りは重度に糖化されたものである。

プｙ：≦８因叶袈 第２図は、得た配列の情報を基にして調製したネズミのＣ３Ｆ−１に相補的な、 一連のオリゴヌクレオチド　プローブを示している。これらは、コドン重複にあ てはまるよう混合プローブであり、あるいは哺乳動物の優先コドンに好都合とな るように設計されている。

Ｅ、３．生“・ゝ Ｃ５Ｆ−１の活性に関する付加的なデータは１部分精製したＭＩＡＰａＣａ’　 Ｃ５Ｆ−１あるいはネズミのし一細胞Ｃ３Ｆ−１を用いて得られた。Ｃ５Ｆ−１ が、　１０倍にまで誘導したヒト卓球によるインターフェロンや腫瘍壊死因子（ ＴＮＦ）の産生を高めることが示された。Ｃ５Ｆ−１はまた。マクロファージの 抗腫瘍毒性を促進することが示された。

一ヒト車球によるＴＮＦ　の　准 ＭＴＡＰａＣａ　Ｃ５Ｆ−１を、リン酸カルシウム　ゲル濾過およびレンチルレ クチン　りロマトグラフィーにより上澄液より精製した。リンホカイン産生のア ッセイ用に、末梢血管付着細胞を、各１０７個の細胞を含む重複したフラスコで 保温した。１つのフラスコを上記で精製した１０００１１／ｍｆｃｓＦ−１で処 理した。

３日後、細胞を集め、洗浄し、そして５ｘｌＯ’／−の細胞濃度に再懸濁して、 ２４ウエルのプレート０．５ｍｌ’／ｍｌ用で蒔いた。

ウェルを４８時間、１０μｇ／ｄ　ＬＰＳおよび２０ｎｇ／ｍｆ　ＰＭＡで処理 し、上澄液をＴＮＦアフセイ用に集めた。Ｃ３Ｆで処理した細胞は、未処理の細 胞の約９倍高いＴＮＦ分泌を示した（１６２１１７　ｍｌｌに対して１５０００ ／ｍｆ）。

ヒト　°によるイン　−フェロン　の　１インターフエロン産生におけるＣ５Ｆ −１の効果を決めるための同様の実験において、末梢血管付着細胞を、上記で述 べたように１００００／ｍｆｆ　Ｃ５Ｆ−１の存在下あるいは非存在下で３日間 保温し、集め、５Ｘ１０’／−となるよう再懸濁し、そして上記で述べたように ２５ウエルのプレートに蒔いた。種々の量のポリＩＣを加えて、細胞にインター フェロン産生の誘導をした。

上澄液を、　ＶＳＶの感染したＧＭ２５０４細胞におけるその細胞変性効果によ り、インターフェロン産生についてアッセイした。

Ｃ５Ｆ−１促進細胞は、　ＦＩｃＣｏｒｍｉｃｋ、　Ｆ、、　ｅｔ　ａｌ、　Ｍ ｏｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ（１９８４）土：１６６で述べられているように、５ ０μｇ／−のポリＩＣで誘導したときに、　１００Ｕ／＋ｎ１の産生を示した。

これに対し同等に誘導された未処理細胞は３０／艷以下の産生であった。

ヒト　による　オ　Ｃ５Ｆ　の　′佳 単球を３日間、±Ｃ５Ｆ−１と保温し、それから表１のように骨ｖＢｃｓＦの産 生を誘導した。示されている３つの代表的な実験は、異なる供与者由来の血液を 用いた。

（以下余白） ４賓 鍼− それゆえに、　Ｃ５Ｆ−１はＣＳＦ−ＧＭ生産を促進する。

ネズミマクロファージによる重　の　ＩＩ：のコロニー　佳　との　φ六 マクロファージの刺激をアッセイするために、Ｌ−細胞条件培地より得たネズミ Ｃ３Ｆ−１を肉腫の標的を壊死させるネズミマクロファージの能力の促進を示す アッセイで、　ｐｃＣ５Ｆ−１７マクロフアージを、　Ｃ３Ｆ−１存在下あるい は非存在下で、１日間、インビトロで保温し、それからガンマ　インターフェロ ンを含む１０％ｖ／ｖ　ｃｏｎＡ誘導（１０μｇ／−）の肺臓リンホカイン（Ｌ Ｋ）に対して３Ｈ−チミジンラベルしたマウス肉腫ＴＵ５細胞を２０：１の比で 混ぜた。続いて４８時間にわたるラベルしたチミジンの放出を、腫瘍細胞壊死の 測定標準として用いた。

１２０００／ｍｆｃｓＦ−１を含むネズミＬ−細胞条件培地としてＣ３Ｆ−１を 加える効果を、以下の表に示す。

（以下余白） Ｃ５Ｆ−１＋ＬＫ　４９　２６ ＣＳＦ’４　ＬＫ　５１　３１ Ｃ５Ｆ−Ｉ　Ｃ３Ｆ−１＋ＬＫ　６０　５４ＣＳＦ−１＋ＬＫ　４７　３４ Ｃ５Ｆ−１７ ＣＳＦ−Ｉ　ＬＫ　４９　４０ ＣＳＦ−Ｉ　Ｃ３Ｆ−１＋ＬＫ　・６９　９７標的細胞を壊死させる能力の増加 が、　Ｃ５Ｆ−１を増殖の予備１日の間か、あるいは誘導期間かのどちらかに加 えるかで。

注目された。しかし、最も劇的な効果は、これら期間中の両方でＣ５Ｆ−１が存 在するときに、観察された。

単球やマクロファージの刺激の原因としての、細菌のリボ多糖（ＬＰＳ）の汚染 の可能性を、除外した。用いたＣ３Ｆ−１のＬＰＳ含量は低かった（　＜　０． ３Ｈｇ／３００００　Ｃ３Ｆ−１，カブトガニ遊走細胞の抽出液による）。抗Ｃ ５Ｆ−１カラムに通用することにより活性を除いた。ポリミキシンＢをＬＰＳを 中和させるのに用いた。

Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス由来のマクロファージはＣ５Ｆ−１に応答するが。

ＬＰＳには応答しない。

ＣＳＦ−ＧＭを、５μｇ　ＬＰＳのＩＶ投投与５問ス肺より調製した。肺を切り 刻み，無血清培地で３日間保温し，　ＹＹＧ１０６アフイニテイーカラムを用い て上澄液からＣ３Ｆ−１を枯渇させた（ＣＳＦ−１含量を２７０Ｕ／−から７８ Ｕ／−にまで減少させた）。Ｃ３Ｆ−Ｇを同様に処理したＬＤＩ無血清培地より 調製した．　ＣＳＦ−ＧＭおよびＣ５Ｆ−Ｇの両含量を．コロニー促進アッセイ により．　２００００／ｍｆでアッセイした。

腹膜マクロファージを．前出の培地のいずれかの４０％か。

１日間２００００／−のＣ３Ｆ−１でアッセイしたし一細胞培地かの。

いずれかで保温し，それから付加的な培地かＬＫで４８時間保温し，上で述べた ようにＴυ５壊死をアッセイした。

結果を第６図に示す。Ｃ３Ｆ−１はＴＵ５に対する毒性の顕著な増強を示したが ，　Ｃ３Ｆ−ＧとＣ５Ｆ−ＧＭのどちらも効果はなかった。

ネズミの　ウィルス２　の　准 付着したネズミのチオグリコレート−誘導マクロファージを３日間Ｃ５Ｆ−１と 保温し，　ＶＳＶで一晩感染させた。ポリミキシンＢを試験サンプルに加え，イ ンターフェロンのＬＰＳ誘導を阻止した。以下の表は，付着したままの細胞のク リスタルバイオレット染色を示している。

（以下余白） ｊＬ別 処理　クリスタル　バイオレフト 培地／ＶＳＶ無　・１５８±．０１９ 培地＋ＶＳＶ　・０５８３　＋．０２　・０４９±．００９ＣＳＦ−１６２５　 Ｕ／＋ｄ＋ＶＳＶ　、１３９±．０１Ｂ　・１７７±．０４１２５０　＋　ｖｓ ｖ　−１６７±．０６　−２０５±．０７２５００　＋　ｖＳＶ　−ｔ６ｏ±． ０６　・２１９±．０４５０００　＋　ＶＳＶ　、１５０±．０３　−２０２± ．０６以上より，　Ｃ５Ｆ−１処理した細胞はｖＳｖに対するマクロファージの 保護を示した。

Ｅ．　４．　Ｃ５Ｆ−１のフォーミュレーション組換えにうより産生されたヒト Ｃ５Ｆ−１は，標準的な製薬的手順を用いて投薬に用いられるよう作成できる。

通常のＣ５Ｆ−１は，注入できる形態で調製されるだろうし，また単一の活性の ある成分として，あるいは他のタンパクまたは相補するか同様の活性を持つ他の 化合物と組合わせて用いてもよい。そのような他の化合物には，アドリアマイシ ンのような別の抗腫瘍剤あるいはＩＬ−１，−２，および−３．アルファー、ベ ーター、およびガンマ−インターフェロンおよび腫瘍壊死因子ようなリンホカイ ンが含まれる。Ｃ５Ｆ−１の活性成分の効果は，そのような付加的な成分の存在 により高められるもしくは改善されることがある。上記で述べたように、　Ｃ５ Ｆ−１は適当な血液細胞と有利な方法で相互作用をすることがあり、それゆえに 本発明の組成物は、　Ｃ５Ｆ−１とそのような細胞との保温混合液を含む。この 場合、付加的なリンホカインは存在してもしなくてもよい。そのような保温混合 液の上澄液分画か。

あるいは細胞も同様に含む完全な混合液かのどちらかを用いてもよい。

ネス°′ミ　ｃＳＦ　引７”Ｏ−プ゛ Ｇｌｕ−）１ｉｓ−Ｃｙｓ−５ｅｒ−Ｈｉｓコード０乙列　ＧＡＡＣＡＴＴＧＴ （，１）ＣＡＧＣＣＴ Ｊ歪　種紙８ い°Ｊ） ｆＬ才目＠喧潰　ＴＧ　ＡＧＡ　ＡＣＡＡＴＧＴＴＣ’ｒｃｃｃ 鴇　２　固 しｌ−Ｃ８Ｆ　の　了ミｌＯＯ乙夕゛」　おｄオリク゛マー、、ａ″ＧＬ’Ｕ　 ＶＡＬ　ＳＥＲｃｔｕ　ｒｙｉ　ｃｙｓ　ＳＥＲ−）ＩＩｓ　ＭＥＴ　ＩＬＥ　 ＧＬＹ＋−＋−−＾＊内８ｍ−ｍ、　ＰＣＴ／ＵＳ　８６１００２Ｓ＋　２１Ｉ ＩＩ−・ｉＩＩ＋ａＩ＾ｅｍｓ＋、ａ、ｍ、　ｐｅｒ／１３５８６１００２５！ ？）Ｉ：ＩＥ二＜ＴｏＴＨＥ：ＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬＳＥＡ：ＩＣＨＲＥ？ ＯＲＴＣＮ

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．脊椎動物ＣＳＦ−１の精製法であって，所望のＣＳＦ−１を含む溶液をイム ノアフィニティーカラムで処理すること，および得られたＣＳＦ−１含有分画を 続いて逆相ＨＰＬＣにかけること，を包含する脊椎動物ＣＳＦ−１の精製法。
2. ２．前記ＣＳＦ−１が哺乳動物ＣＳＦ−１であり，そして前記イムノアフィニテ ィーカラムが，哺乳動物ＣＳＦ−１に対し免疫化した哺乳動物により産生される 抗体を含有する請求の範囲第１項に記載の方法。
3. ３．前記抗体がネズミＬ細胞ＣＳＦ−１で免疫化したウサギにより産生される請 求の範囲第２項に記載の方法。
4. ４．前記ＣＳＦ−１が哺乳動物ＣＳＦ−１であり，そして前記イムノアフィニテ ィーカラムがハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体を含有し，該 ハイブリドーマにおいて１パートナーが哺乳動物ＣＳＦ−１に対し免疫化した哺 乳動物由来の抗体産生細胞である，請求の範囲第１項に記載の方法。
5. ５．前記抗体がハイブリドーマＹＹＧ１０６により産生される請求の範囲第３項 に記載の方法。
6. ６．前記逆相ＨＰＬＣが０．１％ＴＦＡ／３０％アセトニトリル−０．１％ＴＦ Ａ／６０％アセトニトリルバッファー系を使用する請求の範囲第１項に記載の方 法。
7. ７．請求の範囲第１項に記載の方法により調製される天然脊椎動物ＣＳＦ−１。
8. ８．以下のＮ末端配列を有する精製された天然ＣＳＦ−１蛋白：【配列がありま す】．
9. ９．以下のＮ末端配列を有する精製された天然ＣＳＦ−１蛋白：【配列がありま す】．
10. １０．以下の内部配列を有する精製された天然ＣＳＦ−１蛋白：【配列がありま す】．
11. １１．以下の配列から成る群より選択される配列を含有するＤＮＡ断片： 【配列があります】； 【配列があります】； 【配列があります】； 【配列があります】； 【配列があります】；および 【配列があります】．
12. １２．第３図に示すＤＮＡ配列から成る群より選択される配列を含有するＤＮＡ 断片。
13. １３．単球のインターフェロン産生を増強する方法であって，該単球を有効量の 精製天然ＣＳＦ−１で処理することを包含する方法。
14. １４．単球のＴＮＦ産生を増強する方法であって，該単球を有効量の精製天然Ｃ ＳＦ−１で処理することを包含する方法。
15. １５．マクロファージによる標的細胞の壊死を増強する方法であって，該マクロ ファージを有効量の精製天然ＣＳＦ−１で処理することを包含する方法。
16. １６．単球のＧＭ−ＣＳＦ産生を増強する方法であって，該単球を有効量の精製 天然ＣＳＦ−１で処理することを包含する方法。
17. １７．マクロファージにウィルス感染耐性を誘導する方法であって，該マクロフ ァージを有効量の精製天然ＣＳＦ−１で処理することを包含する方法。
18. １８．被検体の免疫系を増強する方法であって，該被検体に有効量の精製天然Ｃ ＳＦ−１を投与することを包含する方法。
19. １９．哺乳動物の免疫系を増強するための組成物であって，精製天然ＣＳＦ−１ を少なくとも１つの付加成分と混合した状態で含有する組成物。
20. ２０．前記付加成分が製薬賦形剤である請求の範囲第１９項に記載の組成物。
21. ２１．前記付加成分が細胞培養物の上清である請求の範囲第１９項に記載の組成 物。
22. ２２．前記付加成分が細胞培養物である請求の範囲第１９項に記載の組成物。