JPH06500228A - 白血球由来の成長因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 白血球由来の成長因子 発明の背景 発明の分野 本発明はＰＤＧＦ様活性を有するかＰＤＧＦとは構造上具なる白血球由来の成長 因子に関する。この新規の成長因子は、創傷［ｗｏｕｎｄｓ］の治療に有効であ る。また、この成長因子に対する抗体はフィブロティック症状［ｆｉｂｒｏｔｉ ｃ　ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ］の処置に有効である。

先行技術 怪我直後の数分間は、血小板かその創傷部位に付着し血餅形成を促進する。する と食細胞的な細胞（白血球およびマクロファージ）がその創傷を清拭し、そして 結合組繊細胞（繊維芽細胞および滑らかな筋肉様の細胞）が細胞外マトリックス ［ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｍａｔｒｉｘ］を増殖させ沈着させる。そして 最後に内皮細胞が創傷部位を血管再生する［ｒｅｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅ］。

走化性は、化学物質源に対し傾斜方向に運動する細胞の一定ａｎｔ］は、走化性 を特異的に刺激する化学物質である。それは創傷部位に食細胞、繊維芽細胞およ び内皮細胞の整然とした補充をすることに深く関与する細胞の型に特異性の化学 誘引物質の逐次的産生である。Ｃ５Ａ、血小板因子４、エラスチンペプチドおよ びある種の合成Ｎ−ホルミルメチオニルペプチドが食細胞（好中球および単球） を引き付ける。フィブロネクチンおよび血小板由来成長因子はマトリックス産生 細胞を呼び集める。フィブロネクチンはまた内皮細胞の移動を刺激する。

化学誘引物質として作用する特定因子に応答する細胞能は、いくつかの生化学的 原因に依存している。第一に、誘因物質分子がある箇所で産生され、その箇所か らそれら誘因物質分子が周囲の組織に分散することかでき、それで問題の細胞に 到達することができなければならない。第二に、標的細胞は化学誘引物質の僅か な量を検出する特異的手段（即ち特異的高親和性受容体）を持っていなければな らない。そして最後に化学誘引物質によるその受容体の占拠は、細胞内で生化学 変化を開始させるのに違いなく、それが細胞の運動のため細胞骨格機構を動が創 傷部位における結合組織増殖は、種々のポリペプチド成長因子によって促進され る。コンピテンス因子［ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ　ｆａｃｔｏｒｓ］　（ＰＤＧＦ 、繊維芽細胞成長因子、単球由来成長因子）は細胞周期のＧ。期にある静止して いる細胞を活性化し、静止細胞をして成長促進因子［ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ　 ｆａｃｔｏｒｓ］に応答できるようにする。成長促進因子（インシュリン、ソマ トメジンＡとｃ１胞状マクロファージ由来成長因子）は、細胞が８期に入るよう 刺激する。

ＰＤＧＦは結合細胞の化学誘引物質と、そうした細胞のマイトジェンとの両者で あって、「マイトアトラクタント」と呼ばれる。しかし繊維芽細胞に対し分裂促 進的作用を持つか、繊維芽細胞に対し化学誘引物質的でないその他の成長因子（ 例えば上皮成長因子、形質転換成長因子αとβ、ソマトメジンＡとＣ１およびイ ンシュリン）もある。上皮成長因子（ＥＧＦ）は腸上皮細胞のマイトアトラクタ ントである。

細胞外マトリックスは、コラーゲン、糖タンパク質およびプロテオグリカンから なる。細胞はコラーゲンに直接結合しないが、アタッチメント因子と呼ばれる糖 タンパク質を介して相互に作用する。これらの因子として、フィブロネクチン、 ラミニン［１ａｎｉｎｉｎｌ、コンドロネクチン［ｃｈｏｎｄｒｏｎｅｃｔｉｎ ］がある。

線維症［ｆｉｂｒｏｓｉｓ］は、実質組織［ｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌ　ｔｉｓｓ ｕｅコにおける結合組織、多くはコラーゲン、の過剰な沈着で、結合組織を治癒 するため過度に長引かされた信号の結果と考えられているため、［創傷治癒の暗 部Ｊ　［ｔｈｅ　ｄａｒｋ　５ｉｄｅ　ｏｆ　ｗｏｕｎｄ　ｒｅｐａｉｒ］とさ れている。以下を参照。Ｒｏｓｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇｙ 　ｏｆ　Ｐｌａｔｅｌｅｔ−Ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ、　 Ｃｅ１ｌ、　４６：１５５−１６９　（１９８６）；Ｒｏｓｓ、　Ｐｌａｔｅｌ ｅｔ−Ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　 Ｗｅｄ、、　３８ニア１−７９　（１９８７）；　Ｇｒｏｔｅｎｄｏｒｓｔ、　 ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒｓ　 （ＰＤＧＦ　＆　ＴＧＦβ）　ａｔ　ｔｈｅ　５ｉｔｅ　ｏｆ　Ｔｉ５ｓｕｅ　 Ｒｅｐａｉｒ、　１ｎＧＲＯＷＴＨＦＡＣＴＯＲＳ　ＡＮＤ　０ＴＨＥＲＡＳＰ ＥＣＴＳ　ＯＦ　ＷＯＵＮＤ　ＨＥＡＬＩＮＧ：　ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ　ＡＮ ＤＣＬＩＮＩＣＡＬ　ＩＭＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ、　ｐｐ、　４７−５４　（１ ９８８）；　Ｇｒｏｔｅｎｄａｒｓｔ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ 　Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ　ｏｆ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｒｅｐａｉｒ、　１ｎＳｏｆｔ　 ａｎｄ　Ｈａｒｄ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｒｅｐａｉｒ；　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａ ｎｄ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ａｓｐｅａｔｓ、　ｐｐ、　２０−４０　（１９８４ ）；　Ｇｒｏｔｅｎｄｏｒｓｔ　ａｎｄ　Ｍａｒｔｉｎ、　Ｃｅ１ｌ　Ｍｏｖｅ Ｉｏｅｎｔｓ　ｉｎ　ｆｏｕｎｄ−Ｈｅａｌｉｎｇ　ａｎｄ　Ｆｉｂｒｏｓｉｓ 、　Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ、、　１０：３８５−４０３　（１９８６）；　Ｇｒｏ ｔｅｎｄｏｒｓｔ、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｈｅｒｎｏａｔｔｒａｃｔａｎｔｓ　ｉｎ 　Ｆｉｂｒｏｔｉｃ　Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、Ｉｎ　Ｆｉｂｒｏｓｉｓ、Ｃ１ｂａ 　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ（１９８５）。

ヒト血小板由来成長因子は、分子量約３０．０００ダルトンの二量体糖タンパク 質である。ＰＤＧＦのナノモル濃度［ｎａｎｏｍｏｌａｒ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａ ｔｉｏｎｓ］は、３Ｔ３細胞中で複製を刺激する。そのジスルフィド結合の還元 はＰＤＧＦの分裂促進的作用を破壊する。

ＰＤＧＦの八−鎖およびＢ−鎖は互いに関係しているが、ＰＤＧＦかヘテロダイ マーか、またはホモダイマーの混合物かは知られていない。Ａ鎖もまた、１８ｋ Ｄ、　１５ｋＤ、　１４ｋＤ、および１１ｋＤの形で存在する不均質の［ｈｅｔ ｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ］ものであるか、Ｂ鎖の唯一の形式は１６ｋＤである。Ｊ ｏｈｎｓｓｏｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ、、　１０４：６６　（１９８２）を参照せよ。ＰＤＧＦは 同質［ｈ□ｍｏｇｅｎｅｉｔｙ］にまて純化した。Ｈｅ１ｄｉｎ、　ｅｔ　ａｌ 、、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、、　１９３：９０７　（１９８１）参照。　ＰＤ ＧＦのＡ鎖遺伝子のｃＤＮＡ配列はＢｅｔｓｈｏｌｔｚ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎ ａｔｕｒｅ、　３２０：６９５　（１９８６）に記載されている。ＰＤＧＦ−１ とＰＤＧＦ−２両者のアミノ酸配列はＤｏｏｌｉｔｔｉｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　 ５ｃｉｅｎｃｅ、　２２１：２７５　（１９８３）に発見されるであろう。ＰＤ ＧＦ類似体の発現に関してはＺｙｉ＋ｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、　ＥＰ　Ａｐｐｌｎ １７７．９５７　（１９８６）参照。抗ＰＤＧＦ抗体は、Ａ鎖またはＢ鎖由来の 合成ペプチド（例えばｖｓ、　Ａ９２−１１９またはＢ７９−１０７）に対する 抗体と同様、購入可能である。ＰＤＧＦの生物学的活動についてはＲｏｓｓ、　 Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｍｅｄ、、　３８ニア１　（１９８７）　ａｎｄ　Ｒｏｓ ｓ、　ｅｔａｌ、、　Ｃｅ１１．４６：１５５　（１９８６）にまとめられてい る。

血小板由来成長因子分子を創傷治癒の促進に使用するのに不都合ない（つかの面 かある。第一に、ＰＤＧＦは、より小さなグリコジル化されていない単量体ペプ チドに比較し産生か困難で高価なものとなる二量体グリコジル化タンパク質であ る点である。また、３つのイソフオーム［ｉｓｏｆｏｒｍ］が存在する点である （ＡＡ、ＡＢ、ＢＢ）。これらのイソフオームは結合組繊細胞上に異なる生物学 的活性を発現するか、現在、どのような型のどれほどの量のものが組織治癒部位 に存在するかは知られていない。しかし発明者らの研究所における研究で、ヒト の創傷液中には本物のＰＤＧＦペプチドは痕跡程闇しか存在しないことが判明し た。

特別関心がある作用は、ＰＤＧＦの化学誘引物質作用である。

Ｇｒｏｔｅｎｄｏｒｓｔ、　Ｃｅ１ｌ、　３６：２７９−８５　（１９８４）は 、マイトジェンとしてＰＤＧＦに応答する細胞（ウシ大動脈平滑筋細胞、ヒト皮 膚繊維芽細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞およびＮＲＫ細胞）も走化性応答を示したが 、ＰＤＧＦがマイトジェン的でない細胞（ウシ大動脈内皮細胞、ＭＤＣＫ細胞、 ＴＥＲＡ細胞およびＰＡＭ２１２細胞）にあっては化学誘引されなかった。Ｇｒ ｏｔｅｎｄｏｒｓｔらＰＮＡＳ　ＣＵＳＡ）、？８：３６６９　（１９８１）は 、粥状硬化症的な形成につながる平滑筋細胞の血管の中膜から内膜への移動がＰ ＤＧＦ起因性であることを示唆している。

低親和性血小板因子−４（ＬＡＰＦ４）とも呼ばれる結合組織活性ペプチドｎＩ 　（ＣＴＡＰ−ＩＩＩ）は、分子量約９．３００ダルトンの分子をもつアシドエ タノールに安定な、僅かに塩基性の（等電点８．５）タンパク質で、路内のジス ルフィド結合によって影響される構造を持つ８５の残基の単一ポリペプチド鎖で ある。

Ｃａ５ｔｏｒ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　ａｎｄ　Ｒｈｅｕｍａ ｔｉｓｍ、　２０：８５９　（１９７１）；Ｃａ５ｔｏｒ、　ｅｔ　ａｌ、、　 ＰＮＡＳ　（ＵＳＡ）、　８０ニア６５　（１９８３）；　Ｃａ５ｔｏｒ、　ｅ ｔ　ａｌ。

、　Ｂｉｏｃｈｅｉ＋１ｓｔｒｙ、　２４：１７６２　（１９８５）；　Ｃａ５ ｔｏｌ、　Ｊ、Ｒｈｅｕｃａｔｏｌ、、　５ｕｐｐ１．１１：５５　（１９８３ ）、そのアミノ酸配列は既に知られており、抗ＣＴＡＰＩ［Ｉ抗体も入手できる 。Ｃａ５ｔｅｒら（１９８３）参照。その（マイクログラムレベルで見られる） 生物活性は、ＤＮＡ合成、ヒアルロン酸合成、硫酸塩のプロテオグリカンへの組 込み、プロスタグランジンＥ２合成、プラスミノーゲン活性体の分泌、グルコー スの取込み、およびラフタート［１ａｃｔａｔｅ］の形成である。

Ｃａ５ｔｅｒら（１９８５）参照。Ｍｕｌｌｅｎｂａｃｂ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、 Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、。

２６１ニア１９　（１９８６）はＣＴＡＰＩＩｒをコードする遺伝子を合成し、 このタンパク質を酵母中に発現させた。ＨＰＬＣ精製組換えタンパク質は半最高 マイトジェン的活性を１０−７Ｍレベルで発現すると言われていた。

ＣＴＡＰＩＩＩ　（ＬＡＰＦ−４）のマイトジェン的活性はＢｏｌｔ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２５：１９８８　（１９８６） で疑問視されている。

Ｈｏ１ｔはテストされた最初のＬＡ−ＰＦ４原剤は３Ｔ３細胞に分裂促進的であ ると考えたが、氏のより一層精製されたＬＡ−ＰＦ４は不活性であった。氏は「 テストされた物質の純度が重要な問題である」と言っている。

βトロンボグロブリン（β−ＴＧ）はＣＴＡＰ−ＩＩＩの分裂促進的に不活性な 一部切断のフオームである。それはＣＴＡＰ−■のＮ末端テトラペプチドを欠く もので、残りの８１残基は明らかにマイトンエンとして独立に活性でない。しか しβ−ＴＧは走化性である。ｔｌｏｌｔ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｘｐ、　Ｈｅｍ ａｔｏｌ、、　１６：３０２　（１９８８）参照。

一方、血小板ベースのタンパク質（ＰＢＰ）は９残基のＮ末端エクステンション をもつＣＴＡＰ−ＩＩＩである。ＰＢＰは最初、１−１０ｎｇ／ａｌｌの濃度の ３７３細胞マイトジエンであると報告されていた。Ｐａｕｌ、　ｅｔ　ａｌ、、 　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　１８：８８３　（１９８０）。

その後このグループは説を撤回し、精製ＰＢＰはマイトジェン活性がないと宣言 した。Ｈｏ１ｔ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９８６）ｖ照、　我々は組換えＤＮＡ技 術でＰＢＰを発現させようとする試みについては未見である。

Ｓｈｉｍｏｋａｄｏ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１１．４３：２７７　（１９８５ ）は胞状［ａｌｖｅｏｌａｒ］マクロファージで条件を整えられた培地を分断し てマイトジェン活性のある断片を得ている。抗ＰＤＧＦ抗体は分子量１２〜１３ ゜０００ダルトンの単量体タンパク質を免疫沈降［ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐａ ｔｅコさせた。そのタンパク質はそれ以上特徴つけられたり精製されてはいない 。

Ｍａｒｔｉｎｅｔ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　３１９：１５８　（１ ９８６）は、活性化されたヒト血液単球（マクロファージ）がＰＤＧＦ様活性を 持つ物質、特に間葉細胞に走化性活性を有し、繊維芽細胞に成長コンビテンス活 性を有する物質を放出することを報告している。この物質はその天然の繊維芽細 胞受容体および抗ＰＤＧＦ抗体からＰＤＧＦを取り除いた。ＰＤＧＦと同様、Ｍ ａｒｔｉｎｅｔの仲介者か現れ生物学的活性のジスルフィド結合をめた。

Ｐｅｎｃｅｖ　ａｎｄ　Ｇｒｏｔｅｎｄｏｒｓｔ、　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　Ｒｅ５ ｅａｒｃｈ、　３°３３３　（１９８８発行：　しかし実際には１９８９年２月 に公表）　Ｍａｔｓｕｏｋａ　ａｎｄ　Ｇｒｏｔｅｎｄｏｒｓｔ、　ＰＮＡＳ　 （ＵＳＡ）、　８６：４４１６　Ｄｕｎｅ　１９８９）は、走化性成長因子に関 し本発明者らの仕事に関係しているが、彼らの仕事は部分的に精製された生タン パク質の研究に限定されている。

ＣｏｌＣｏ１１ａ、　ＥＰ　Ａｐｐｌｎ　２４３．１７９は成長、走化性または 分化［ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ］因子からなる創傷治癒組成物につき記 載している。

Ｕｒｒｙ、　Ｕ、Ｓ、　４．６９３．７１８．は、トロポエラスチン［ｔｒｏｐ ｏｅｌａｓｔｉｎ］におけるペプチド反復に対応する合成ペプチドによる繊維芽 細胞走化性の刺激につき述へている。

ここに引用の参考文献はいずれも本願発明に対する先行技術または先行する関連 技術であるとすることは許されない。ここに挙げた日付は文献上に記載の日付で あって特許出願の目的における公表日でない。またここに引用の文献は関係する 限り本願中に取り込むものとする。

発明の概要 ＰＤＧＦはヒト創傷液中にある主要なミトアトラクタント［のｉ　ｔｏａｔｔｒ ａｃｔａｎｔ］ではない。ヒト創傷液は多クローン抗ヒトＰＤＧＦ抗体に反応し たが、反応ペプチドはＰＤＧＦにもそのサブユニットにも十分に応答しなかった 。ＰＤＧＦは約３０ｋＤａの分子量であるか、本発明に係る２種は各々、１６〜 １７ｋＤａと３４〜３６ｋＤａであって、ＰＤＧＦと共移動［ｃｏｍｉｇｒａｔ ｅ］　Ｌなかった。免疫的に純化された［ｉｍｎｕｎｏｐｕｒｉｆｉｅｄ］ペプ チドはＰＤＧＦのＡ鎖ま１６ｋＤａのペプチドは、ヒト単球により分泌される１ ６ｋＤａの単量体化学誘引物質に応答すると信じられており、またＰＤＧＦのＡ 鎖またはＢ鎖から識別されている。

トした。この新しいペプチドは、単球ばかりでなく好中球によっても分泌される ので、“白血球由来成長因子”　（ＬＤＧＦ）とここでは呼ぶことにする。

このｃＤＮＡは、選択された宿主中で機能的なプロモーターに操作可能に結合す ることでき、それでＬＤＧＦがその宿主中きない仕方で挙動する。すなわちＬＤ ＧＦは、繊維芽細胞とか、平滑筋細胞およびアストログリア細胞のような結合組 繊細胞にとっては強力な走化性、かつマイトジェン因子であるが、内皮細胞とか 、上皮細胞あるいは白血球にはそうでない。実験データはこれが同一の細胞表面 受容体分子とＰＤＧＦおよびＬＤＧＦ双方との相互作用に起因していることを示 唆している。これらの受容体は、形質転換成長因子αまたはβ、上皮成長因子、 インシュリン様成長因子、繊維芽細胞成長因子、インターロイキン、腫瘍壊死因 子、インターフェロン、その他、赤血球因子４、結合組織活性ペプチド■、ある いは黒色腫成長刺激活性（ｇｒｏ　ｇｅｎｅ生成物）のようなテスト済みの上記 以外の成長遺伝子ファミリー［ｇｒｏ−ｇｅｎｅ　ｆａｍｉｌｙ］の既知の成長 因子とは結合しない。

できるであろう。通常の治癒しつつある創傷に比しこの因子の増加レベルか見ら れる、特に、連層とか、静脈血行静止、糖尿性潰瘍［ｄｉａｂｅｔｉｃ　ｕｌｃ ｅｒ］などの慢性皮膚潰瘍を含む多（の治癒悪化状態の処置に有効であろう。ま た、抗腫傷薬またはステロイドによる化学療法など、患者か治癒しそこなった処 置を経験している手術による創傷でうまく創傷治癒されていないときの処置に有 効である。皮膚創傷のほかにもこの物質は、骨移植、骨折仮関節［ｂｏｎｅ　ｆ ｒａｃｔｕｒｅ　ｎｏｎ−ｕｎｉｏｎｓ］、人為的な関節置換、膿補修などの結 合組織形成の促進が望ましい場合の怪我や外科的処理の手当に有効である。眼科 分野ではこの物質は、極めて僅かな出血しか起こらず創傷はなかなか治癒しない 前部手術後の手術創傷の促進に非常に有効である。この物質はＰＤＧＦと変わら ない仕方で作用し、上記の状態下でのＰＤＧＦの効力を証明しているので、発明 者らはこの物質がＰＤＧＦか作用するのと同じ標的細胞に適切な刺激を与えるこ とを確信している。

それはＰＤＧＦより小さく、たった一つのサブユニットしか含ます、グリコシレ ージョイン［ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ］部位を一つも持たすＰＤＧＦのよう な糖タンパク質でないので、ＬＤＧＦは製造するのかずっと簡単でコスト安であ る。

ここに論じである研究は、ＬＤＧＦが治癒過程の初期段階でヒト創傷に存在する 主要な成長因子であることを示している。

したかってこの因子の追加こそ、創傷治癒の自然の進行過程に一層近い模倣なの である。この因子の使用は、創傷部位にずっと少ない量しか存在しないＰＤＧＦ に比較し、好ましくない副作用を引き起こすことかより少ない。

好ましい実施例の詳細な説明 本発明は、創傷の処置に有効な白血球由来成長因子（ＬＤＧＦ）に関する。結合 組繊細胞の創傷部位には走化性運動があり、ヒト創傷液により条件付けられた培 地から自然発生する走化性因子およびマイトジェン因子の精製に関する。この因 子は、抗ＰＤＧＦ抗体により認識されるが、ＰＤＧＦのＡ鎖またはＢ鎖特異性抗 体によっては認識されない１６ｋＤの単量体タンパク質として特徴付けられてお り、ＰＤＧＦの細胞受容体に相互反応し、ブロモシアンおよびギ酸に対する感受 性につきＰＤＧＦのＡ鎖およびＢ鎖とは区別されている。好ましい実施例では、 この因子は固定化したヘパリンにアフイニテイクロマトグラフイで部分的に精製 される。

第二の面から見れば、本発明は新規な走化性因子をコードする遺伝子が抗ＰＤＧ Ｆ抗体との発現ライブラリーをイムノスクリーンすることによって同定されると いう発見に関係する。この遺伝子またはその断片は、関連する遺伝子を同定し分 離するためのオリゴヌクレオチドプローブとして使用することかてきる。

第三の而として本発明は、新規な因子ＬＤＧＦをコードする遺伝子のクローニン グおよび発現に関係し、そのアミノ酸配列をここに明らかにしているか、単球条 件付は培地およびヒト創傷液から精製した走化性因子であると考えられる。組換 え技術によるＬＤＧＦの生成か好ましい。

第四の面として本発明は、突然変異誘発されたＬＤＧＦ遺伝子の発現、または組 換えＬＤＧＦタンパク質の酵素処理から得られる新規な走化性因子及び／又はマ イトジェン因子の発生にも関係する。

第五の面として、本発明はＬＤＧＦ様タンパク質に対する抗体の調製、ならびに あるＬＤＣＦ特性を模倣する抗抗体の調製にも係わる。

ＬＤＧＦは、例えば単球細胞培養の表面物とか、ヒト創傷液といった天然物から 精製して得ることができる。しかし合成すればより容易に得ることが可能である 。

好ましくはＬＤＧＦは、そのＬＤＧＦをコードする遺伝子をプロモーターに操作 可能に結び付け、形質転換した宿主細胞中にそのプロモーターの制御下でその遺 伝子を発現させることによって調製される。遺伝子は本実施例におけるようにｃ 　ＤＮＡであってもよいし、ゲノムＬＤＧＦ配列（ＬＤＧＦ関連のｃＤＮＡを、 ちょうどゲノムライブラリーに対する免疫プローブのように、雑種形成プロモー ターまたは抗ＰＤＧＦ抗体として使って同定する）であってもよい、または合成 りＮＡ　（ＬＤＧＦのｃＤＮＡか配列されているので）でもよい。

この細胞は原核細胞（例、細菌）でも真核細胞（例、酵母、哺乳動物）でもよい 。好ましい宿主細胞はＥ、　ｃｏｌｉである。プロモーターは宿主細胞中で機能 的［ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ］でなければならない。好ましいプロモーターはＴ− ７フアージである。ＬＤＧＦは好ましくは形質転換細胞から分泌されるが、もし そうでないなら、この細胞はＬＤＧＦを回収するため後で溶解されなければなら ない。

ＬＤＧＦは次にその特異的活性を増進するように精製される。

好ましくは抗ＰＤＧＦ　（またはＬＤＧＦ）イムノアフィニティ力ラムを使い、 及び／又はヘパリン・セファロースへのアフィニティクロマトグラフィによって ＬＤＧＦは精製される。

ＬＤＧＦに対する多クローン抗体および単クローン抗体を生じさせるのに精製Ｌ ＤＧＦが使われる。これら抗体は、追加的なＬＤＧＦの免疫精製において、ある いは創傷液中のＬＤＧＦ分析の際、あるいはまた、フィブロティック［ｆｉｂｒ ｏｔｉｃ］状態の処置に使用される。

創傷液中のＬＤＧＦのレベルを観察すれば、その創傷部位における治癒作用に関 し有益な示唆か得られるであろう。その分析は好ましくはイムノアッセイである が、コンビティティブフオーマットまたはサンドイッチフォーマットで行われる 。１コンピテイテイブフオーマツトではサンプルＬＤＧＦは、不溶化抗体のため 標識付けたＬＤＧＦで競合させるが、好ましくは抗ＬＤＧＦ抗体であって抗ＰＤ ＧＦ抗体であってもよい。１サンドイツチフす一マットでは、サンプルＬＤＧＦ は不溶化抗体および標識付けた抗体の両者に結合されている。反応物導入のオー ダーは様々である。

ＬＤＧＦに対する抗体はＬＤＧＦ／ＰＤＧＦ受容体を阻止するのに使うことかで き、それによってその受容体の過度の刺激から生ずるフィブロティック状態を処 置することができる。

組換えＤＮＡ技術による生成が好ましいか、ＬＤＣＦ分子（または類似体）は、 アミノ酸またはオリゴヌクレオチドのインビを有していると信じられる。ＬＤＧ ＦのＮ末端エクステンション（ＰＢＰに比し）は、これらの活性を実質的に促進 するもので、ＰＤＧＦ−Ｂ鎖タンパク質中のシスティンと並ぶＬＤＣＦの３つの システィンは特別の意味を持つものと考えられる。類似体はＬＤＣＦ遺伝子の部 位特異的な突然変異生成（Ｚｏｌｌｅｒ　Ｓｍ１ｔｈ、　１９８４；　ＤＮＡ　 ｖｏｌ、　３．４７９−４８８）およびその突然変異遺伝子の発現によって調製 される。好ましくは、類似体はＰＢＰとは異なりＬＤＧＦの特殊な「Ｎ末端エク ステンションＪ　［Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｌを少なくとも 持っている実質的に相同なものがよい。

追加的なシスティン残基を含むＰＤＧＦのＢ鎖と相同な配列に有意義に追加する のは、ＬＤＧＦ分子のこの領域である。またこの分子のこの領域の水治療法スロ ットは、ＰＤＧＦのＢ鎖分子に非常に類似するもので、抗体と受容体の交差反応 性を説明する類似の３次構造についてのさらなる証明となる。発明者らはその生 物学的および免疫学的テストて精製ＣＴＡＰ−ＤＩ。

ＰＢＰおよびβ−ＴＧを試験し、それらか不活性であることを発見したので、追 加的なＮ末端ペプチド領域はＰＤＧＦ様の生物学的活性にとり必須のものである と考えている。ｒＬＤＧＦ様タンパク質」という言葉は、Ｎ末端エクステンショ ンを実質的に持つか、ＰＤＧＦ、ＰＢＰ、ＣＴＡＰ−ＩＩＩおよびβ−トロンホ グロブリンを排除する類似体という意味である。好ましくは、ｒＬＤＧＦ様タン パク質」はＰＤＧＦ、ＰＢＰ、ＣＴＡＰ−Ｉ［Ｉまたはβ−トロンホグロブリン よりも、ここに定義した生ＬＤＧＦの方に相同であるのかよい。相同性はＮｅｅ ｄｌｅｍａｎ　Ｗｉｎｓａｈ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　４８：４４３− ４５３　（１９７０）のアルゴリズムにより、窓１００、ギャップペナルティ１ ０１サイズペナルテイ２、最大ギャップ５０で決定される。

これらのアルゴリズムは、シングルもしくはマルチプルの挿入、削除または置換 によってＬＤＧＦとは異なる。確実さを以てアプリオリに与えられる突然変異に ついて述べることは不可能だか、次のような一般化が言えると考える。すなわち 、もし次の判断基準の１つまたは２つ以上か満足されるならば、突然変異は活性 に影響を与える傾向か強まると。

（１）突然変異は、ＬＤＧＦをＰＢＰから区別する３４−ＡＡのＮ末端エクステ ンションに影響を及ぼすこと。

（２）突然変異は、ＬＤＣＦとＰＤＧＦのＢ踏量に保存されているアミノ酸の１ つに影響を及ぼすこと。

（３）突然変異は、ＬＤＧＦの親水領域（図２）中に存在するアミノ酸に影響し 、したかって溶媒に露出される傾向かある。

（４）図３に表されたように、突然変異はＬＤＧＦのαヘリックスまたはβシー ト領域に影響する。特にもしその突然変異か実質的に二次構造を変化させる傾向 があるときはそうである。

（５）突然変異は、図５に示された両親媒性αヘリックスの両親媒性を実質的に 増減させる。

（６）突然変異はＬＤＧＦの疎水領域中にある残基のサイズを実質的に変化する もので、したがってその分子の核の一部をなすと考えられる。

（７）突然変異は有意的に異なる構造の１つでアミノ酸を交換する。

５ｃｈｕｌ　ｔｚとＳｃｈｉｒｍｅｒは、Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏ ｔｅｉｎ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ１４−１６．１７０　（１９７９）で、相同有機 体の対応するタンパク質問にはアミノ酸の変化が頻繁であることを分析している 。この分析は交換群が存在することを露見するもので、かかる群中のアミノ酸は 優先的に相互交換する。５ｃｈｕｌｔｚとＳｃｈｉｒｍｅｒはこのような交換群 につき次の４種を区別している。

Ｉ　Ｐｈｅ、　Ｔｙｒ、　Ｔｒｐ　（芳香族アミノ酸）［Ｉ　Ｌｙｓ、　Ａｒｇ 、　Ｈｉｓ　（正電荷アミノ酸）ｍ　Ｖａｌ、　Ｌｅｕ、　Ｉｌｅ、　Ｍｅｔ、 　Ｃｙｓ　（大脂肪族アミノ酸）ＩＶ　Ｓｅｒ、　Ｔｈｒ、　Ａｓｐ、　Ａｓｎ 、　Ｇｌｙ、　Ａｌａ、　Ｇｌｕ、　Ｇｌｎ、　Ｐｒｏ　（小アミノ酸） ＳｃｈｕｌｔｚとＳｃｈｉｒｍｅｒはまた、各アミノ酸の突然変異傾向について も述べている。Ｉｄ、、　１７１−１７２．最も頻繁に交換されるアミノ酸は、 セリン、メチオニン、およびアスパラギンであって、最も少なく突然変異される アミノ酸はトリプトファン、システィン、およびチロシンである。トリプトファ ンは最も大きい側鎖を持つ。システィンはジスルフィド架橋に参加する。チロシ ンは非常に強力な水素結合を形成する。

従来の交換についてのより厳格な定義はＧＥＮＥＰＲＯ（ＲｉｖｅｒｓｉｄｅＳ ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のアラインメントプログラムにより採択された。

次の群を認める。（Ａｌａ、　Ｇｌｙ）、（Ａｓｐ、　Ｇｌｕ）、（Ｐｈｅ、　 Ｔｙｒ）、（Ｉｌｅ。

Ｌｅｕ、　Ｖａｔ）、（Ｌｙｓ、　Ａｒｇ）、（Ａｓｎ、　Ｇｌｎ）および（３ ｅｒ、　Ｔｈｒ）である。

もしＬＤＧＦの生物学的活性を実質的に変化させたいならば（例えばＬＤＧＦの 細胞表面受容体につき増大されたアフィニチイを持つＬＤＧＦを得るためとか、 ＬＤＧＦの走化性活性およびマイトジェン活性のバランスを変更するため）、上 記基準に従った活性に影響する傾向にある突然変異が導入されることになる。こ れら突然変異の多くは勿論、活性を促進するよりも出させないものである。１策 としてＬＤＧＦ遺伝子をランダムに突然変異誘発しくその長平方向に沿って行っ たり、あるいは活性を左右する傾向にある残基に集中的に行ったりして）、それ から機能的突然変異体をスクリーニングすることかできる。

あるいは、候補となる突然変異体をランダムでない部位特異的突然変異生成によ り個々に調製してがらスクリーニングしてもよい。

突然変異生成の取組み方については下記診照。Ｂｏｔｓｔｅｉｎ　ａｎｄＳｈｏ ｒｔｌｅ、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２２９：１１９３　（１９８５）　Ａｂａｒｚ ｕａ　ａｎｄ　Ｍａｒｉａｎｓ。

ＰＮＡＳ　（ＵＳＡ）、　８１：２０３０−３４　（１９８４）；　Ｆａｓａｎ ｏ、　ｅｔ　ａｌ、、　ＰＮＡＳ　（ＵＳＡ）、　８１：４００８−１２　（１ ９８４）；　Ｍｙｅｒｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２２９：２４ ２　（１９８５）；　Ｍａｔｔｅｕｃｉ　ａｎｄ　Ｈｅｙｎｅｋｅｒ、　Ｎｕｃ ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１１：３１１３（１９８３）＋　ａｎｄ　 Ｖｅｉｌｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ、　３４：３１５−２３　（１９８５ ）ＬＤＧＦ中に「従来通りの」突然変異体だけを作ること、即ち活性に影響しな いような変化を作ることが次の目標である。

上記の基準はここでも同様に有効である。繰り返すが変化の効果につき不確実な 限り、集中的なランダムの突然変異生成か採用されることになる。

免疫学的挙動は必ずしも生物学的挙動と連携する関係にはないが、抗ＰＤＧＦ　 （またはＬＤＧＦ）抗体のスクリーニングも有効であろう。類似体もまたＰＤＧ Ｆ　（またはＬＤＧＦ）受容体への結合をコンビティティブに抑制する能力をめ てＰＤＧＦ（またはＬＤＧＦ）でスクリーニングされてもよい。

タンパク質分解のデグラデーション［ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ］に対する安定性 を向上させたＬＤＧＦの類似体を調整することが有利であろう。こうした類似体 は慢性的創傷の処置に特に有効と考えられる。というのは、プロテアーゼは創傷 部位に存在する天然の成長因子を減らすので、多数の専門家は損傷部位における プロテアーゼの過剰生成が慢性的創傷の場合における阻害されている治癒の根本 原因であると感しているからである。これらの類似体は、分子の不活性な形態で あるＣＴＡＰ−１１１１１，ＰＢＰおよびβ−ＴＧのデグラデーションを可能に するプロテアーゼの切断部位［ｃｌｅａｖａｇｅ　５ｉｔｅ］にある一部のアミ ノ酸を置き換えることによって作り出すことかできる。例えば、位置３５と３６ にある２個のセリン残基はトレオニンと置き換えることかでき、また位置４４の アスパラギン残基はグルタミンと置き換えることかできる。（両方の従来通りの 置換はＧＥＮＥＰＲＯの基準によったもの）　その他の適当な置換も上記の部位 および同様な部位における集中的ランダム突然変異生成によって決定することが できる。

ここに詳細を記載していないか分子生物学および免疫学の技術として通常のもの については以下を診照。Ｓａｍｂｒｏｃｋ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ　ａｎｄ　Ｍａｎ ｉａｔｉｓ、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ　Ｍａｎｕａｌ。

Ｖｏｌｓ、　１−３　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ：　２ｄ　ｅｄ 、　１９８９）、　ａｎｄ　Ｈａｒｌｏｗａｎｄ　Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉ ｅｓ：　＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨ ａｒｂｏｒ：　１９８８） 例１一定条件下の培地から単離された単球由来成長因子の特性 物質および方法 成長因子 ヒトＰＤＧＦは血小板から単離され、前述の方法で均質に精製された（Ｇｒｏｔ ｅｎｄｏｒｓｔ、　１９８４）　、　ＰＤＧＦのＡ鎖ホモダイマー　［ｈｏｎｏ ｄｉｍｅｒ］とＢ鎖ホモダイマーを、Ｂｉｏｃｈｅ［、Ｉｎｃ、またはＡＭＧＥ Ｎ、　Ｉｎｃ、で購入した。ＳＤＳ　ＰＡＧＥケル電気泳動および逆相高性能液 体クロマトグラフィで決定された純粋な物質か以下の生物学的アッセイ全てて使 われ、抗ヒトＰＤＧＦ抗体を産生じている。

抗体 ＰＤＧＦのＡ鎖（前駆体分子のアミノ酸９２−１１９）およびＰＤＧＦのＢ鎖（ アミノ酸７９−１０７）のアミノ酸末端配列を含む合成ペプチドまたは精製ＰＤ ＧＦがヤギに特異的抗体を産生ずるため使用された。ヤギは不完全フロインドア ジュバント中の２０μｇの精製ＰＤＧＦまたは５０μｇの合成ペプチドを多数陵 内注射して免疫された。不完全フロインドアジュバント中の純粋ＰＤＧＦ２０μ ｇ（５０μｇの合成ペプチド）で第４回目のチャレンジをした後、最後の免疫後 ７日間免疫血清が集められ、免疫沈降［ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏ ｎ］およびウェスタンプロットによってその特異性につきテストされた。そのテ ストされた免疫血清は、ＴＧＦ−Ｂ　（ウェスタンプロット分析では精製ＴＧＦ −Ｂの５０ｎｇまで）またはＥＧＦのような他の単離された成長因子と交差反応 を少しも示さなかった。ＰＤＧＦのＡ　（９２−１１９）ペプチドおよびＰＤＧ ＦのＢ　（７９−１０７）ペプチドに対して生成された免疫血清は、免疫ドツト プロットにより配列特異的であることが証明され、ＰＤＧＦのＡ鎖またはＰＤＧ ＦのＢ鎖分子の残りのアミノ酸配列を有するペプチドと交差反応しなかった。免 疫血清のＩｇＧ断片がＤＥＡＥ　Ａｆ　ｆ　ｉゲルブルーセファ０−スに単離さ れた（Ｂｉｏｒａｄ、　Ｒｉｃｈ［１ｏｎｄ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ、　０． ０２　ＮａＣ１，０，０２Ｔｒｉｓ　ｐＨ８，０に平衡させられた）。

総合試薬 リポポリサッカライド（ＬＰＳ、ε、ｃｏｌｉ　０１２７：Ｂ８）をＳｉｇｕｔ ｎａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　Ｍｉｓｓｏｕｒｉ から購入し、ＦＭｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ　（ＮＬＰ）をＰｅｎ１ｎｓｕｌａ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｓｕｎ　Ｃａｒｌｏｓ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａか ら購入し、免疫複合物をＣｏｏｐｅｒ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、　Ｍａｌｖｅｒ ｎ、　Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａｎｉａから購入した。

Ｆｌｙｐａｑｕｅ−Ｆｉｃｏｌｌの密度勾配遠心法を用いて新鮮な全血液からヒ ト末端血液単球を単離した。１　ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およ びゲンタマイシン（５０μｇ／ｎｌ）を含む１０６細胞／ｍｌの濃度のＲＰＭＩ 　１６４０培地で、９５％の空気と５％の炭酸ガスの雰囲気中に３７℃で１８時 間、１μｇ／ｇ＋Ｉ　ＬＰＳ、免疫複合物（０゜５　ｍｇ／ｎｌ）またはｆｍｅ ｔ−１ｅｕ−ｐｈｅ　（１０−６Ｍ）の存在下または不存在下で付着細胞（〉８ ５％単球）を培養した。一定条件下の培地を除去し付着した細胞をリン酸緩衝の 生理食塩水中で掻き落とし１０分間２０００　Ｘ　ｇで遠心分離した。培地およ び細胞粒の両者からＲｏｂｅｒｔｓらが記載（１９８０）のアシド−エタノール 抽出法とエーテル沈降法によってペプチドを抽出した。簡単に言うと活性または 不活性細胞から得た一定条件下の培地または細胞粒の１　ｖｏｌを４°Ｃで一晩 ２ｖｏｌのアシド／エタノール（ｌｖｏ１１５１ｖｏ１）で抽出した。６００　 Ｘ　ｇで３０分間遠心分離後、表面物を４°Ｃで一晩４　ｖｏｌの無水エチルエ ーテルで沈降させた。沈降物をＩＮの酢酸で再抽出し、凍結乾燥し、平滑筋細胞 走化性分析またはウェスタンプロットでテストした。場合によっては一定条件下 の培地を走化性活性につき直接テストするか、または凍結乾燥し、サンプル緩衝 液（Ｔｒｉｓ、　ＳＤＳ、　グリセロール）中で再懸濁しウェスタンプロットで テストした。

ＬＤＧＦの特性 活性化した単球の条件設定培地からのＬＤＧＦの部分的精製は、ｐＨ７、サイズ 排除クロマトグラフィ　（ＩＮの酢酸または０．５Ｎの酢酸アンモニウム中で発 生させたＨ　Ｐ　Ｌ　Ｃ，ＴＳＫ−２０００）　、０゜１〜ＩＮの酢酸アンモニ ウムの勾配、で溶出させたヘパリンセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｐｉ ｓｃａｔａｗａｙ、　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ）にアフィニティクロマトグラフィ で行った。部分的に精製した物質はＨｅ１ｄｉｎら記載（１９８６）のようにブ ロモシアンおよびギ酸の消化を使ってさらに詳しく特徴つけられた。分別部分［ ａｌｉｑｕｏｔ］を３７℃、４８時間、７０％のギ酸単独中、またはブロモシア ン含有の７０％ギ酸（ｇ　ＣＮＢｒ／ｇ全タンパク質）中でインキュベートした 。次にサンプルを凍結乾燥し、５ｍＭＨＣｌ中で再溶解し、走化性につきテスト しウェスタンプロットした。

上述したようにウシ大動脈平滑筋細胞につき走化性活性をボイデンチェンバーに よる走化性分析で測定した（Ｇｒｏｔｅｎｄｏｒｓｔら、１９８１）。サンプル をデュプリケートにしてテストし、各結果は３回の実験の平均標準偏差を示すも のとした。走化性活性は既に詳述したように（Ｇｒｏｔｅｎｄｏｒｓｔ、　１９ ８７）　、応答細胞から抽出されたスティンのミリアブソーバンスユニット［ａ ＋１ｌｌｉａｂｓ。

ｒｂａｎｃｅ　ｕｎｉｔ］として発現される。６　ｎｇ／ｎｌ濃度の純粋なヒト ＰＤＧＦはＡ、、ｏｏｎｍて３５０　ｍＡＵの値を出す走化性応答を引き出す。

ＣＮＢ　ｒおよびギ酸で処理された材料を除き、各サンプルの電気泳動を１２％ または１５％のポリアクリルアミドケルて行い、ＣＮＢｒおよびギ酸て処理され た物質についてはＬａｅｍｍｌｉ　（１９７０）に記載されている通りドデシル 硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）含有の１８％ゲルで分析した。Ｋｙｈｓｅ−Ａｎｄｅ ｒｓｅｎ（１９８４）が記載するように、電気プロッティングによってタンパク 質をニトロセルロースに移動した。タンパク質のフィルタへの非特異的結合を阻 止するため、移動後、プロットを２．５　ｍｇ／ｎｌの無脂肪粉カーネーション 牛乳（ＴＢＳ−ｍｉｌｋ）を含むＴｒｉｓ緩衝の生理食塩水（ＴＢＳ）　（１０ ０ａ＋Ｍ　ＮａＣ１，５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ７，４）中で、４時間インキ ュベートした。次にこのフィルタをＴＢＳ−ｍｉｌｋ中に希釈された１５μｇ／ ｍｌの抗ヒトＰＤＧＦＩｇＧの存在下で一晩インキユベートした。それからＴＢ Ｓ−！ｌ１ｌｋ中で５回洗浄しく各５分間）、ＴＢＳ−＋ｎ１ｌｋ中で９０分間 、アルカリフォスファターゼ抱合のアフィニティ精製されたウサギ抗ヤギＩ　ｇ 　Ｇ　（１：１００Ｑ希釈度）でインキュベートした。ＴＢＳ−ｔ＋ｉｌｋで５ 回洗浄後、アルカリフォスファターゼ基質キット（ＫＰＬ、　Ｇａｉｔｈｅｒｓ ｂｕｒｇ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ）を使って抗原を検出した。この方法によりウェ スタンプロット中の０．３ｎｇという小さなＰＤＧＦをも検出することができる 。

不活性化単球はＰＤＧＦ様の 生物学的、免疫学的活性を有する 活性化された末端血液単球からの一定条件培地は平滑筋細胞走化性を濃度依存的 に引き出したが、不活性化細胞から集めた一定条件培地は少しも測定可能な走化 性活性を示さなかった。

かえって活性化細胞および不活性化細胞の両者から得られた細胞抽出物は、この 物質が不活性化細胞中に存在することを示唆するようなほぼ同量の生物学的活性 を示した。この物質の濃度は時間依存性であることか報告されており（Ｍａｒｔ ｉｎｅｔら、１９８６）、１８時間後に最高濃度に達し、応答は活性に使われた 全試剤につき同してあったとされる（すなわちＬＰＳ、免疫複合物）。

また、前に報告された通りに（Ｓｈｉｍｏｋａｄｏら、１９８５；　Ｍａｒｔｉ ｎｅｔら、１９８６）　、一定条件培地を３ｅｕｇの抗ヒトＰＤＧＦヤギＩｇＧ でブレインキュベーションすると生物学的活性を完全に消したが、非免疫ヤギＩ ｇＧはこの物質の生物学的活性に何の影響も示さなかった。

末端血液単球により産生された物質をより詳しく特徴つけるため、不活性化、活 性化細胞両者からの細胞抽出物および一定条件培地を、抗ヒトＰＤＧＦ　ＩｇＧ を使ってウェスタンプロットトランスファ分析で検査した。不活性化単球からの 抽出物は、５６．４５．３１．２５および１６ｋＤの明確な分子量を有する少な くとも５つの主たる免疫反応性ペプチドを露出した。これとは対照的に、活性化 単球は活性化細胞からの分泌産生物の分子量と同じ１６ｋＤのたった１つの主た る免疫反応性ペプチドしか持っていなかった。不活性化細胞からの一定条件培地 は免疫反応性物質を少しも持っていなかった。プレイミューンＩｇＧは、細胞抽 出物あるいは一定条件培地のいずれにおいてもどんなペプチドにも反応しなかっ た。

ＬＤＣＦのマイトジェン分析 ＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５８）をＤｕｌｂｅｃｃｏ修正Ｅａｇ ｌｅ−ト中にＩ　Ｘ　１０　’／ｃｍ２濃度でプレートし、集密［ｃｏｎｆｌｕ ｅｎｅｅ］になるまで成長させ３〜４日後に分析に使った。成長因子を直接に添 加し、１８時間後に３Ｈ−チミジン（２ｕＣｉ／ｍｌ）　（Ａｍｅｒｓｈａａ＋ 。

＾ｒｌｉｎｇｔｏｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ、　ｌ１ｌｉｎｏｉｓ）を添加した。細胞 をさらに２時間インキュベートし、４°Ｃで３回、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢ Ｓ）で、また５％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で５回、洗浄した。ＴＣＡに不溶性 の物質を０．　Ｉ　Ｎ　Ｎａ０Ｂ１０．１％ＳＤＳで溶解し、混合した３Ｈ−チ ミジン量をｆｓｅｃｋｎａｎ液体シンチレーションカウンタで測定した。

ＬＤＧＦを活性化単球から通常の方法で精製した。ＰＤＧＦをＧｒｏｔｅｎｄｏ ｒｓｔ、　Ｃｅ１ｌ　３６：２７９−２８５．１９８４に記載の通りに単離した 。

Ｐ　Ｄ　Ｇ　Ｆ　２０　ｎｇ／ｍｌ　７１．０００　Ｃ１）ＥＩＰ　Ｄ　Ｇ　Ｆ 　１０　ｎｇ／ｆｆ１１　５１．０００　ｃｐｍＬＤＧＦ　１００ｕｌ（サンプ ルの）　５９．０００　ＣｐＥｌ　約１４　ｎｇ／ｍ１ＬＤＧＦ　５０ｕｌ（サ ンプルの）　４５．０００　ｃｐｆＩ　約７　ｎｇ／ｍ＋ＩＬＤＧＦ　２５ｕｌ （サンプルの）　２８．０００　ｃｐｅ　約３　ｎｇ／ｍｌ負の対照　２．５０ ０　ｃｐ幻 ＬＤＧＦは、ジスルフィド架橋に欠けるに単量体である複数の研究所におけるこ れまでの研究は２量体形式のＰＤＧＦだけが生物学的に活性であることを示唆し てきた（Ａｎｔｏｎｉａｄｅｓら、１９７９；　Ｈｅ１ｄｉｎら、１９８１；　 Ｇｒｏｔｅｎｄｏｒｓｔら、１９８１）　、しかし上述のようにマクロファージ から分泌された主要な免疫反応性ペプチドの分子量は１６ｋＤで、血小板放出の ＰＤＧＦが３１ｋＤであることに比べると、単球分泌物質のＰＤＧＦとの関係に つき疑問が生ずる。活性化マクロファージから分泌された物質をウェスタンプロ ット分析するとＳＤＳゲルに１６ｋＤのダブレットを露出した。これら物質をジ チオトレイトールで還元してもペプチドの電気泳動移動度は不変であったので、 ジスルフィド架橋は存在しないことを示唆する。これに対して対照的に、血小板 から単離されたオーセンンティックヒトＰＤＧＦの同一ゲルの電気泳動は、非還 元状態の３１ｋＤ（これは前述の通り（Ｊｏｂｎｓｓｏｎら、１９８２；　Ａｎ ｔｏｎｉａｄｅｓら、１９７９；　Ｈｅ１ｄｉｎら、１９８２）還元後１８ｋＤ にシフトする）でダブレットを発現した。単球から分泌される免疫反応性ペプチ ドの相対的豊富さと分子量は、細胞の活性を刺激するため使われる試剤には依存 していなかった（ＬＰＳ、免疫複合物、またはＦＭＬＰ；データは不知）。これ らのデータは、ＬＤＧＦの主要な分泌形式が変性条件下ではＳＤＳゲル電気泳動 で１６ｋＤの単量体タンパク質として挙動することを示している。

この物質の分子量を非変性条件下で検査した。ＨＰＬＣにゲル濾過クロマトグラ フィを使って、ＩＮの酢酸または０．５Ｎの酢酸アンモニウムｐＨ７中に発生さ せたＴＳＩＣ−２０００カラムにヒトＰＤＧＦの溶離位置［ｅｌｕｔｉｏｎ　ｐ ｏｓｉｔｉｏｎ］と単球ＰＤＧＦ様因子（ＬＤＣＦ）のそれとを比較した。酸性 条件下ではＰＤＧＦの溶離回数とＬ　Ｄ　Ｇ　Ｆはほぼ同して、ＬＤＧＦはこの 条件下では３０ｋＤの二量体として挙動することを示唆した。しかし走化性活性 は、０．５Ｎの酢酸アンモニウムを１８ｋＤのペプチドとして溶離した。生物学 的に活性な部分［ｆｒａｃｔｉｏｎ］のウェスタンプロット分析は１６ｋＤの免 疫反応性ペプチドかこのカラムからの生物学的活性と共溶離することを示した。

追加的なメチオニン残基は、ＰＤＧＦ　Ａ錫分子またはＢ銅分子に比し、ＬＤＧ Ｆ中に存在することの証明ヒトＰＤＧＦのＡ錫分子とＢ銅分子は、ＬＤＧＦの関 係をこれらペプチドに比較するためのタンパク質化学工学により開発てきる特徴 的な一次構造を持っている（Ｈｅｌｄｉｎら、１９８６）。例えばＰＤＧＦ　Ａ 錫分子の成熟形はメチオニン残基を何も含んでいない（Ｂｅｔｓｈｏｌｔｚら、 １９８６；　Ｗａｔｅｒｆｉｅｌら、１９８３）　、加えて、処理したＡ鎖は、 ギ酸消化による切断［ｃｌｅａｖａｇｅ］に感受性あるアスパラギン酸−プロリ ン結合を持っている。Ｂ銅分子の成熟形こうした結合のどれも持っていない（Ｄ ｏｏｌｉｔｔｌｅら、１９８３：　Ｖａｔｅｒｆｉｅｌら、１９８３）。このよ うにＢ銅分子はギ酸との切断に耐性を有しているが、ＣＮＢ　ｒが添加されると 位置１１で切断され、減少された分子量のペプチドをもたらす（Ｈｅｌｄｉｏら 、１９８６）。逆にＡ錫分子はギ酸消化に感受性があり、ＣＮＢ　ｒはＡ鎖ペプ チドのフラグメンテーション［ｆｒａｇＩｏｅｎｔａｔｉｏｎ］に何ら効果を持 たない（Ｈｅｌｄｉｎら、１９８６）　。Ｌ　Ｄ　Ｇ　Ｆは次にギ酸単独、また はＣＮＢｒ存在下に処理され、その処理した分子の生物学的特性および電気泳動 特性の両者につき分析した。ＰＤＧＦのＡ錫分子の切断をもたらす一定条件下で のＬＤＧＦのギ酸処理は、平滑筋細胞走化性分析において決定されたような生物 学的活性も、ウェスタンプロットでの主要な免疫反応性ペプチドの電気泳動移動 度にも、何ら効果を示さなかった。しかし本物質のＣＮＢ　ｒ消化は、生物学的 活性の完全な喪失をもたらすと共に、ウェスタンプロットでの免疫反応性物質の 破壊を完成させた。逆に、ＳＳＶ／ＮＲＫから単離された部分的精製のＰＤＧＦ 　Ｂ銅分子は、抗ＰＤＧＦ　ＩｇＧを使ってウェスタンプロット分析でＣＮＢ　 ｒ消化の前後に容易に検出された。

ＬＤＧＦは、ＰＤＧＦのＡ鎖または Ｂ鎖のアミノ末端に免疫学的に明確である。

ＬＤＧＦのＰＤＧＦ　Ａ鎖またはＢ鎖との関係をより詳しく決定するために、分 泌ＰＤＧＦ　Ａ　（アミノ酸９２−１１９）またはＢ（アミノ酸７９−１０７） 鎖のＮ末端配列を有する合成ペプチドに対して抗体を起こしてみた。ＬＤＧＦを 分析し、還元ＰＤＧＦＡホモダイマーおよびＢホモダイマーと比べてみたとき、 Ａ鎖のアミン末端ペプチドに対する抗体は還元ＰＤＧＦ　Ａホモダイマーを認識 したが、還元ＬＤＧＦまたは還元ＰＤＧＦ　Ｂホモダイマーには反応しなかった 。Ｂ鎖のアミノ末端ペプチドに対する抗体は還元ＰＤＧＦ　Ｂホモダイマーと免 疫反応したが、還元ＰＤＧＦ　ＡホモダイマーまたはＬＤＧＦとは交差反応しな かった（図５）。

ここに提出されたデータは、ただ一つの大きさクラスである活性化したヒト末端 単球が約１６ｋＤの分子量の生物学的に活性なペプチドを大量に分泌することを 示している。これらのペプチドはまた、抗ヒトＰＤＧＦ抗体により完全に中和さ れる平滑筋細胞走化性活性も示す。これらペプチドは全く細胞内で活性刺激によ り処理されるようであり、ちょうど活性化細胞の抽出物が分泌ペプチドの電気泳 動移動度と同し移動度をもつペプチドだけを含み、また新たに単離されたかまた は不活性化された細胞が大きい分子量（５４，４５，３１，２５，１６ｋＤ）の 免疫反応性ペプチドを含むのと同じである。より高い分子量のＰＤＧＦ関連ペプ チドは、サル肉腫ウィルス［５ｉＩＩｉａｎ　ｓａｒｃｏｍａ　ｖｉｒｕｓ］で 形質転換されたマーモセット系などの種々の細胞系において記述されており、追 加的なＮ末端およびＣ末端アミノ酸を有する成熟細胞の前駆体フオームを表すも のと考えられている（Ｒｏｂｂｉｎｓら１９８３）。ＬＤＧＦは非変性条件下で 二量体として存在するか、ジスルフィド架橋を持たない。このことはＬＤＧＦと ＰＤＧＦのＨＰＬＣゲル濾過クロマトグラフィで酸性状態に共溶出［ｃｏｅｌｕ ｔｅ］するが、ＳＯＳゲルには異なる電気泳動移動度を示すという我々の観察か ら支持されている。ＰＤＧＦとは逆に、ＳＤＳゲル中のＬＤＧＦの移動度は還元 剤の添加によって影響を受けない。

Ｇｉｅｓｅらの最近の研究は（１９８７）、ｖ−ｓｉｓ＠瘍遺伝子のＰＤＧＦ関 連ドメイン中の８つの保存されたシスティン残基のいずれかに部位指向性突然変 異生成による修飾がジスルフィド架橋を欠いたｖ−ｓｉｓ遺伝子生成物（ＰＤＧ ＦのＢ鎖）の形式の合成をもたらすことを示している。しがし位置１５４．１６ ３．１６４および２１０のシスティン残基の修飾はｖ−ｓｉｓ遺伝子の形質転換 活性を変化しなかったのであり、このことはジスルフィド架橋を欠＜　ｖ−ｓｉ ｓ遺伝子生成物のある種の形式が生物学的活性を保持していることを示している 。ＰＤＧＦのＡ鎖ペプチドまたはＢ鎖ペプチドとは異なり、ＬＤＧＦの免疫反応 性はブロモシアンで処理することにより完全に破壊されたのであって、これは追 加的なメチオニン残基が存在することを示唆している。またＰＤＧＦのＡ鎖およ びＢ鎖のアミノ末端配列を特異的に認識する抗体はＬＤＧＦに反応しなかったの であり、これはそのようなアミノ酸配列がＬＤＧＦ中に存在しないこと、または そのようなアミノ酸配列か有意に変化させられたかその抗体の届かないところに あるか、を示すもので、さらにＬＤＧＦとＰＤＧＦの構造的相違を支持するもの である。

要するにこれらのデータは、ＬＤＧＦ構造というものが、今日まで特徴であると されてきたＰＤＧＦの形式のいずれからも区別できることを示している。この物 質は、結合組繊細胞の化学誘因物質およびマイトジェンとしての挙動、ならびに ［＋２５７　］ＰＤＧＦの細胞表面受容体に結合するための［”５Ｉ］ＰＤＧＦ とのコンビティジョンを含むＰＤＧＦ様生物学的活性の全てを発現する。しかし その分子組織は、ＰＤＧＦの公知形式の分子組織とは、それがジスルフィド交差 結合した二量体ではないという点で、また、ギ酸またはＣＮＢ　ｒによる切断に 、処理されたＰＤＧＦのＡ鎖またはＢ鎖ペプチドのいずれかにつき見られるもの とは異なる感受性を示す点で、異なっていると思われる（Ｈｅｌｄｉｎら、１９ ８６）。

精製された物質は、１０−９Ｍレンジの濃度である濃度１０〜４０ｎｇ／ｍｌで 生物学的活性を持つよってある。これは同しような生物学的活性につき要求され るＰＤＧＦのモル温間に比較できる。

例２　ヒト創傷液中のＰＤＧＦ関連ペプチドの免疫検出性方法および物質 細胞　ＮｒＨ／３Ｔ３細胞は、Ｓ、　Ａａｒｏｎｓｏｎ　（Ｎａｔｉｏｎａｌ　 １ｎｓｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｆｌｅａｌｔｈ）から初期の継代て得ることがて きた。細胞は１０％ウシ胎児血清とゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を補充さ れたＤＭＥＭ中で成長され、９０％雰囲気／１０％Ｃ○２中で３７℃に維持され た。培養細胞か集密的になった直債に濃度抑制された培養細胞を使って全てのマ イトジェン分析および走化性分析か行われた。

ヒト創傷液　ヒト創傷液を、腫瘍（直径＜１．５ＣＤ＋）除去の目的で全面乳腺 切除を受けた６人の女性患者から毎日集めた。

液は通常の方法として手術中の排水用に挿入された吸入管を介して集められた。

これら患者の誰も血液学的あるいは細胞性免疫学的な異常な変化を示さなかった 。手術後の通常の管理は、抗生物質およびビタミン剤、および、アドレノクロム やトレネキサム酸のような止血剤の点滴である。抗癌剤は創傷液回収中は少しも 投与されなかった。創傷液は遠心分離（５０００ｘｇ）により組織破片から分離 され、２０°Ｃで貯蔵された。

成長因子　遺伝学的に生成されたＰＤＧＦ　ＡＡホモダイマー、ＢＢホモダイマ ー、ＡＢヘテロダイマー、およびヒト上皮成長因子は、Ｃｒｅａｔｉｖｅ　Ｂｉ ｏＭｏｌｅｃｕｌｅｓ（Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、　ＭＡ）から供給された。濃度お よび純麿はアミノ酸配列分析によって決定された。ヒト形質転換成長因子β型（ ＴＧＦ−β）はＲｅ５ｅａｒｃｈ　＆　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｅ　Ｓｙｓｔｅｍｓ 　（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、　ＭＮ）で購入した。酸性の繊維芽細胞成長因子 細胞はＳｉｇｍａから購入した。いくつかの実験では既述の通り、（Ｇｒｏｔｅ ｎｄｏｒｓｔ、　１９８４）血小板から純化されたＰＤＧＦが基準および免疫原 として使用された。マクロファージ由来の成長因子が、既に報告したように（Ｐ ｅｎｃｅｖ　ａｎｄ　Ｇｒｏｔｅｎｄ。

ｒｓｔ、　１９８８）活性化ヒトマクロファージの培養浮遊物からＨＰＬＣによ って純化された。

抗体　抗ヒトＰＤＧＦおよびＰＤＧＦのＡ鎖およびＢ鎖成分の抗合成ペプチドか 使われた。ヤギ抗ヒトＰＤＧＦ抗体を血小板からの精製ＰＤＧＦに対して起こし た（Ｇｒｏｔｅｎｄｏｒｓｔ、　１９８４）。

このヤギ抗ＰＤＧＦ抗体はＰＤＧＦの生物学的活性を特異的に中和することがで きる（Ｇｒｏｔｅｎｄｏｒｓｔら、　１９８８）。

抗Ａ鎖または抗Ｂ鎖特異性抗体を、ＰＤＧＦ　Ａ鎖（アミノ酸９２−１１９）お よびＰＤＧＦ　Ｂ鎖（アミノ酸７９−１０７）のアミノ末端配列を有する合成ペ プチドを免疫原として使って調整した。ＰＤ　Ｇ　Ｆ　Ａ　（９２−１１９）お よびＢ　（７９−１０７）ペプチドに対する免疫血清は、イムノドツトプロット によって決定された配列特異的なものであって、ＰＤＧＦ　Ａ鎖またはＢ鎖分子 の残りのアミノ酸配列を有するペプチドと交差反応しなかった。さらに、抗血清 は鎖特異性で、各々、ＰＤＧＦ　Ａ鎖またはＢ鎖ペプチドとだけしか反応しない 。

ヒト創傷液中のＰＤＧＦ関連ペプチドの精製　タンパク質の高濃度ゆえに、創傷 液サンプルまたは酸抽出されたサンプルはウェスタンプロット（免疫学的）技術 では分析できない、したがってヒト創傷液中のＰＤＧＦ関連ペプチドは抗ＰＤＣ ；Ｆイムノアフィニティ技術により精製した。ヤギ多りローン抗ＰＤＧＦ　Ｉｇ Ｇは、メーカーのプロトコルに示されるようにＡｆｆｉ−Ｇｅｌ−１０（Ｂｉｏ −Ｒａｄ）に接合した。ＰＤＧＦ関連ペプチドは、凍結ストックから新たに解凍 した創傷液ＩＩ＋１を、抗ＰＤＧＦ　ＩｇＧと接合したＡｆｆｉ−Ｇｅｌ−１０ の２００ｇ１で４℃、２４時間、インキュベーションして単離した。創傷液のイ ンキュベーション後、そのマトリックスを０．１Ｍへペス、ｐＥＩ７．４．１ｍ ｌで５回洗浄した。

特異的結合のペプチドをＩＭの酢酸で２４時間処理することにより放出させた。

そのマトリックスを遠心分離して表面物を回収し、１．０Ｍの酢酸に対してダイ アライズし、分析する前に一２０℃で貯蔵した。同量の創傷液とアフィニティマ トリックスとを使ってＰＤＧＦ関連ペプチドを各サンプルがら単離した。準備的 な研究は、この量のアフィニティマトリックスが、創傷液サンプル中の全ＰＤＧ Ｆ関連ペプチドを回収することにつき〉１０倍であることを示した。一部の実験 では、ＤｅＬａｒｃｏ　ａｎｄ　Ｔｏｄａｒｏ　（１９７８）が記載するように 、ヒト創傷液はアシドエタノール沈降によって処理した。

ウェスタンプロット分析　ヒト創傷エタノール物質をウェスタンプロフト分析で 分析した。抗ペプチド抗体がＳＤＳ含有の１５％ポリアクリルアミドゲル中に使 われている場合を除いて、サンプルを非還元下に電気泳動させ、次にサンプルを 前述の通りニトロセルロースに電気プロット［ｅｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔ］させた （Ｉ、ｅｉｂｏｖｉｃｈ　ａｎｄ　Ｒｏｓｓ、　１９７６；　Ｔａｋｅｈａｒａ ら、１９８７）。免疫反応性ＰＤＧＦペプチドを抗ヒトＰＤＧＦ　ＩｇＧとアル カリホスファートとが接合したウサギ抗ヤギＩｇＧで検出した。

マイトジェン分析と走化性分析・　精製した創傷液サンプルのマイトジェン活性 を次のようにして決定した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞（Ｇｒｏｔｅｎｄｏｒｓｔ、　１ ９８４）を集密になるまで１０％０％ウシ胎清でＤＭＥＭの４８個のウェルプレ ート（Ｃｏｓｔａｒ）中で培養し、その培地を２．５％ウシ胎児血清で使用１２ 時間前にＤｉｌＥＩＩに変えた。

ＤＭＥＭ中のサンプルを各ウェルに加え、ＤＮＡ合成につき１６時間後にトリク ロロ酢酸沈降物質中へ［３Ｈ］チミジンを組み入れて測定した。

コラーゲンでコーティングしたポリカーボネートフィルタ（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ ；　８−μｍ一孔径）を使って、前述したように（Ｇｒｏｔｅｎｄｏｒｓｔ。

１９８７）変形ボイデンチェンバー中で走化性分析を行った。分析は４時間無血 清のＤＭＥＭ含有ウシ血清アルブミン中で２　、０　ＩｌＩｇ／ｍｌで行った。

フィルタを通って移動した細胞がら抽出したスティンの６００　ｎｍの吸光度を 測定することで走化性応答について測量した。

結果 ヒト創傷液中のＰＤＧＦ関連ペプチド ヒト創傷液中のＰＤＧＦ関連ペプチドをウェスタンプロット分析すると、２つの 異なる分子塊種［ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｓｓ　５ｐｅｃｉｅｓ］（１６１７ ｋＤａと３４−３６　ｋＤａ）を露出させた。このウェスタンプロットは１６− ｋＤａおよび１７−ｋＤａのペプチドが手術後の第１日目の液中て最も高濃度で あるか、手術後７日で減少することを示している。逆に、高分子量塊ペプチド（ ３４−３６ｋＤａ）は僅看、創傷治癒の初期段階にあるが、４日および５日後に 増加し、７日までに減少する。こうした知見は創傷液を検査された６人の患者各 々に本質的に同様であった。１５−ｋＤａから１７−ｋＤａの産生物は、活性化 マクロファージから標準精製されたマクロファージ由来の成長因子（Ｐｅｎｃｅ ｖとＧｒｏｔｅｎｄｏｒｓｔ、　１９８８）と共に移動するので、マクロファー ジから来るもののようである。３４−から３６−ｋＤａの産生物はＰＤＧＦと共 に移動しないのであって、我々はこのペプチドがどこに由来するのか不明である 。

多クローン抗ヒトＰＤＧＦの特異性は、組換えヒトＡＢ　ＰＤＧＦとの抗体の阻 止［ｂｌｏｃｋ］の研究から明らかにされる。ＡＢヘテロダイマーの５０ｎｇを 持つ第一抗体のブレインキュベーションは、創傷液中のＰＤＧＦ関連ペプチドに その抗体が結合することを完全に阻止する。この現象はＡＡまたはＢＢホモダイ マーを遮断薬［ｂｌｏｃｋｅｒ］として使っても同様に見られた。非免疫ＩｇＧ はこの分析系ではどのペプチドも検出しなかった。さらに、この多クローン抗ヒ トＰＤＧＦはＰＤＧＦに特異性でＴＧＦ−β（１００ｎｇ）、ヒト上皮成長因子 （１００ｎｇ）、または酸性繊維芽細胞成長因子（１００ｎｇ）に反応しない。

創傷液は回収後最初の３日間は赤色で、出血および凝固が創傷部位で起こってい ることを示した。驚くべきことに、創傷部位での血小板作用があるにも拘わらず 、検査した６組の創傷液サンプルのどれひとつにもオーセンティックな３Ｏ−ｋ Ｄａ　Ｐ　Ｄ　Ｇ　Ｆを検出できなかった。

抗ＰＤＧＦイムノアフィニティ精製の有効性オーセンティック３Ｏ−ｋＤａ　Ｐ 　Ｄ　Ｇ　Ｆの回収不能性を説明するいくつかのものは、（１）３０−ｋＤａ　 Ｐ　Ｄ　Ｇ　Ｆが酵素消化により分解された、（２）イムノアフィニティ精製過 程はタンパク質に富む創傷液から抗原を拾い出すのに効果的なものではない、（ ３）３０−ｋＤａＰＤＧＦはキャリヤタンパク質に結合しているから抗体に近づ くことかできない、というものである。これらの疑問によく注意してみると、既 知量のＰ　Ｄ　Ｇ　Ｆ　（２０ｎｇ／ｌ１１）が創傷液中に添加されている。そ のサンプルは２４時間室温でインキュベーションされ、ＰＤＧＦ関連ペプチドが 前述のイムノアフィニティ過程を経て精製された。外来的に添加されたＰＤＧＦ の回収は〉９０％で、創傷液中に存在する免疫反応性ペプチドの量は、オーセン ティックＰＤＧＦを追加するかしないかにより違ってこない。こうした結果は、 創傷液中に存在するＰＤＧＦが、この単離過程で回収できるものなのか、また、 創傷液サンプル中のＰＤＧＦ抗原量を２倍にすることは、ウェスタンプロット分 析で判定されるＰＤＧＦまたはＰＤＧＦ関連ペプチドの回収に影響を及ぼさない のであるから、使われたマトリックス量は十分なのかといった点を激しく問題に する。

ヒト創傷液中のＡ鎖ペプチドおよびＢ鎖ペプチドの欠乏創傷液中のＰＤＧＦ関連 ペプチドがＰＤＧＦ　Ａ鎖またはＢ鎖からなるのかどうかを検査するため、第１ ８目の創傷液がら得た精製ＰＤＧＦ関連ペプチドの大部分を、ＰＤＧＦ　Ａ鎖ま たはＢ鎖に対する抗血清特異性を用いて分析した。これら血清は、成熟Ａ鎖分子 または成熟Ｂ鎖分子のいずれかのＮ末端配列に対応する３０−ｍｅｒ合成ペプチ ドに対して産生じたものである。

これらの抗血清は鎖特異性で、手をっけていないＡ鎖またはＢ鎖ペプチドいずれ かのＪ−ないし２ｎｇという微量でも検出できる。

いずれの抗血清も、ＰＤＧＦの生物学的活性の２０ｎｇに等しい量を含有する第 −日月の創傷液サンプル中に、Ａ鎖またはＢ鎖ペプチドを何も検出しなかった。

こうした結果は、ＰＤＧＦのＡ鎖またはＢ鎖ペプチドは創傷液中に＜　２　ｎｇ ／ｍｌの濃度で存在しなければならないこと、また、主要なＰＤＧＦ関連の生物 学的活性は創傷液中のＡ鎖またはＢ鎖分子に原因をめることはできないこと、を 示唆している。

ヒト創傷液中のＰＤＧＦ関連ペプチドの生物学的活性ＰＤＧＦ関連ペプチドの量 は、ウェスタンペプチドプロットのデンシトメータースキャニングおよび生物学 的分析の両者を使って決定した。１６−ないし１７−ｋＤａおよび３４−ないし ３６−ｋＤａ産生物の現出と不現出の速度論［ｋｉｎｅｔｉｃｓ］は各々非依存 的であった。

１６−ないし１７−ｋＤａペプチドのレベルは手術後筒１臼目にピークに達し、 ７日目までに殆ど検出不能な程度にまで指数的に減少した。これと対照的に、３ ４−ないし３６−ｋＤａの産生物は最初低レベルで存在するだけであったか、そ の後増加し、手術後５日および６日目にピークに達した。

全創傷液およびイムノアブソーブ［ｉｍｍｕｎｏａｂｓｏｒｂ］された小片の走 化性活性とマイトジェン活性が検査された。イムノアフィニティ精製した小片の マイトジェン活性は第１８目に最高で、手術後第４日目後は検出できないレベル へと減少した。これらのキネティックス［ｋｉｎｅｔｉｃｓ］は、ウェスタンプ ロット分析で検査された１６−ないし１７−ｋＤａペプチドのそれと同一であっ た。全創傷液のマイトジェン活性はイムノアフィニティ精製した小片のそれとは 異なるものであった。この活性は第５日月にピークに達し、その時の全マイトジ ェン活性はイムノアフィニティ精製された物質のそれより大きかった。このよう に多様なマイトジェン活性が創傷液に存在し、そのうち一部だけが免疫学的にＰ ＤＧＦに関係しているにすぎない。

全創傷液とイムノアフィニティ精製された小片の走化性活性も検査された。マイ トジェン活性同様、イムノアフィニティ精製された小片の走化性活性量は、ウェ スタンプロット分析で測定した１６−ないし１７−ｋＤａペプチドの日毎の変化 に関連していた。

この活性は第１８目にピークに達し、その後減少した。

創傷液からの精製ＰＤＧＦ関連ペプチドの走化性活性は、コンペティティブアッ セイにおいて組換えＰＤＧＦで処理された（表１）。第１８目の創傷液からのＰ ＤＧＦ関連ペプチドは、上室中で組換えＰＤＧＦ　ＢＢホモダイマーのないＮＩ Ｈ３Ｔ３細胞に・より強い走化性応答を引き出した。しかし、ＰＤＧＦ　ＢＢホ モダイマー２５ｎｇ／ｍｌか上室に加えられると、化学誘引物質の濃度勾配を減 少させ、免疫精製因子に応答して下室へと移動する細胞はなかった。こうしたデ ータは、免疫精製された走化性因子かおそらくはＰＤＧＦ受容体に活動している ことを示唆した。

創傷液のアジドエタノール抽出物中に存在の活性は、手術後第４５目に活性はピ ークに達し、イムノアフィニチイ精製ＰＤＧＦ関連ペプチドのものとは異なるキ ネティックスを見せた。

このようにマイトジェン活性と同様、多様な走化性活性があるよってあり、ある ものはＰＤＧＦ様で、他のものはそうでない。

ＰＤＧＦ様走化性活性とマイトジェン活性は、オーセンティック血小板Ｐ　Ｄ　 Ｇ　Ｆ　（ＰｅｎｃｅｖとＧｒｏｔｅｎｄｏｒｓｔ、　１９８８）由来ではなく 、マクロファージ由来のＰＤＧＦ関連ペプチドに類似の因子により主として仲介 されるよってある。この因子がマクロファージによって独占的に産生されるのか どうかについては未だ明確でない。我々の研究所での最近の研究は、好中球が同 様の因子を産生ずることができることを発見している。もっともマクロファージ 由来の成長因子とこの因子との関係は現在の所未だ不明である。それにも拘わら すマクロファージは、創傷治癒応答を制御するのに中心的役割を演すると長い間 考えられてきたのであり（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｃｈ　Ｒｏｓｓ、　１９７５；　Ｄ ｉｅｇｅｌｍａｎｎら、１９８０）　、創傷液中に見た所マクロファージ関連産 生物らしきものか高レベルに見つかることは予想できないことではない。創傷液 中にオーセンティックＰＤＧＦペプチドか何も存在しないことは驚くべきことで あった。こうしたペプチドが分析感受性以下の量しかないのか、あるいは痕跡程 度の量はあるのかは明らかでない。

もしオーセンティックＰＤＧＦペプチドか創傷液中に低レベルで存在するなら、 全ＰＤＧＦ関連生物学的活性の＜１０％であることを説明するにちがいない。オ ーセンティックＰＤＧＦがある方法でマスクされているか、または上記の単離過 程で分解［ｄｅｇｒａｄｅ］　してしまうのかは、加えられるＰＤＧＦが創傷液 サンプルから〉９０％の効率で回収されるのであるから、考えにくい所である。

おそら＜ＰＤＧＦのＡ鎖ペプチドとＢ鎖ペプチドは、細胞外マトリックスまたは フィブリン凝固物と支配的に関連しており、したがって溶解が簡単でないのであ ろう。あるいは、オーセンティックＰＤＧＦか組織エレメントにより組織修復部 位で急速に消費されるとも考え得る。

修復応答の後期期間中に集められた創傷液における走化性活性とマイトジェン活 性の有意的比率は、ＰＤＧＦ関連ペプチドのイムノアブソープション［１ａｏｎ ｕｎｏａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ］による枯渇後に維持された。互いに類似関係にあ る未処理創傷液またはアンドエタノール抽出物におけるマイトジェン活性と走化 性活性は、イムノアフィニティ精製物質の活性とは異なる外観上の時間経過を見 せる。これらの活性は１６−ないし１７−ｋＤａのＰＤＧＦ関連ペプチドのレベ ルが減少する後期の日々にピークレベルに達するもので、それらの因子かおそら く、ＰＤＧＦ関連ペプチドを産生ずるものとは異なる細胞型によって産生されて いることをぷＣミ、ろイ　ΣのようにＰＤＧＦとは顕著に異なるマイトンエン因 子と走化性因子が創傷液中にも存在し、修復過程の俊期制御に本質的役割を演じ ていると思われる。

以上の結果は、ヒトの通常の創傷治癒部位にＰＤＧＦ関連ペプチドが存在するこ とを示している。類似するペプチドが、腹水液および慢性アルコール性肝硬変の 患者がら得た肝臓生検組織の両者に見つかった。この障害［ｄｉｓｏｒｄｅｒｌ は肝臓の慢性的炎症とこの部位における単核細胞の大きな蓄積物に特徴つけられ るので、マクロファージ由来の成長因子もフィブロティック症状初期の原因成分 であろうと考えられる。このように、マクロファージのような細胞型は、通常の 修復期間中および外傷後の組織再生期間中におけるＰＤＧＦ関連成長因子の産生 に重要に関わっており、また類似の因子がアテローム性動脈硬化、関節炎、肺繊 維症および肝硬変のようなフィブロティック障害中の結合組織形成を刺激してい るように考えられる。

例３・　ＬＤＣＦ関連ｃＤＮＡの単離と特性活性化した（Ｌ　Ｐ　Ｓ処理［１／ ｕｇ／ｍｌ］２４時間）ヒト末梢血液単球から得た全ＲＮＡをＣｈｕｇａｕｉｎ らの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；　１８：５２９４−５２９９；　１９７ ９）て調製した。ポリＡ＋を有するｍＲＮＡをオリゴディティ［ｏｌｉｇｏ　ｄ ｔ］セルロースクロマトグラフィで単離した。

存在する全てのｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーをＰｂａｒｍａｃｉａがら購入のｃＤ ＮＡライブラリ構築キットを使って構築した。次にそのｃＤＮＡをプラントエン ドし、そのエンドにＥｃｏＲ１アダプターを付加させた。ｃＤＮＡを低溶解アガ ロース電気泳動で串離し、長さか８００塩基対より長いｃＤＮＡを低溶解アカロ ース電気泳動て集め、ラムダｇｔ　１１発現ベクターにパッケージした。この遺 伝子ベクターは、それがβガラクトシダーセプロモーターに制御され、適当な刺 激が細菌培蓋培地に加えられたさきは、このプロモーターがβガラクトシダーゼ のＮ末端を含む融合タンパク質の合成を活性化し、ｃＤＮＡでコードされたその タンパク質配列のＣ末端かそのファージゲノム中にパッケージされるように、ｃ ＤＮＡ挿入物を適切な部位にパッケージする。ファージゲノムにつきただ一つの ｃＤＮＡ配列だけがパッケージされる。

次に発現ライブラリを我々がヤギで調製した抗ＰＤＧＦ抗体でスクリーンし、一 定条件培地でＬＤＧＦを同定するため使用した。全部で８００．０００の組換え ファージをスクリーンしたが、ただ一つのファージがその抗体に反応する融合タ ンパク質を産生じた。このファージをプラーク精製し、挿入物をＥｃｏＲ１制限 エンドヌクレアーゼを使って切断した。我々の制限断片がらして、挿入物が約３ ００塩基でＥｃｏＲ１リンカ−の一つがら内ＥｃｏＲ１部位を有することが明ら かである。

次に、ＥｃｏＲｌによる部分消化を使い、その手をつけていない挿入物の多数の 組換え体をスクリーンして、Ｍ１３中に手をでつけていない挿入物をサブクロー ンした。デオキシ法を使って、いくつかのプラークを１本鎖ＤＮＡ配列をさせる ため採取した。ＤＮＡ配列分析は、３８４塩基（図１）の単一の読み取り枠を有 する６７５塩基対の挿入物および予想された内部ＥｃｏＲ１部位を露呈した。こ の配列かあるＧｅｎｂａｎｋライブラリのサーチは、これか特殊な配列であるこ とを示し、成長遺伝子によりコートされるタンパク質に４０％の相同性を示した （図２）。このことはｃＤＮＡがＣＴＡＰ−ＩＩ［遺伝子ファミリーに関係して いることを示している。上記読み取り枠をＰＣ−ＧＥＮＥプログラムで翻訳し、 データベース中の配列と比較した。そのタンパク質配列は３つの既知のタンパク 質、すなわち血小板ベースのタンパク質（ＰＢＰ）　、ＣＴＡＰ−ＩＩＩまたは ＬＡ−ＰＦ４およびβトロンボグロブリン（βＴＧ）と同一の領域を示した。し かし予想されたＬＤＧＦ配列は、付加的な３４アミノ酸をＰＢＰ関連配列のＮ末 端に有していた。ＣＴＡＰ−Ｉ［ＩとβＴＧは、ＰＢＰのタンパク質分解産生物 であると考えられている。実際、βトロンボグロブリンは古くなった血小板のマ ーカーとして使われている。我々のテストによれば、ＰＢＰ、ＬＡ−ＰＦ４、β ＴＧのいずれも生物学的活性または免疫学的活性を少しも見せなかった。このよ うにＬＤＧＦンパク質のＮ末端にある付加的なアミノ酸は、その生物学的活性に とって必須なもののようである。マイクロコンピュータプログラム（ＧＥＮＥＰ ＲＯ，Ｒｉｖｅｒｓｉｄｅ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使ったとき、もし分子構 造に中性な一定のアミノ酸の代替物を含ましめるなら、ＬＤＧＦとＰＤＧＦのＢ 鎖分子の領域との間には２５％の相同性かあることか示されている（図３）。重 要なことは、ＬＤＧＦ配列中の５つのシスティン残基のうち３つはＰＤＧＦのＢ 鎖タンパク質中のシスティンと並んでいることである。さらに、ＬＤＧＦとＰＤ ＧＦ−８鎖の親水１バ４或ならひに疎水性領域を反映する水治療法スロットの比 較は、手をつけていないＬＤＧＦ分子が、ＰＤＧＦにつき見られる縦断面図［ｐ ｒｏｆｉｌｅｌと非常に類似したものをもっていることを示している。こうした 類似性は抗体と受容体との結合交差反応性についての説明的根拠となり得るもの で、構造上の同一領域を共有する分子ループかあることを示唆している。

ＬＤＧＦは共に活性化されたマクロファージと好中球によって産生される。さら に、ひとの治癒過程にある外科的創傷部位から集めた液を分析したとき、ＬＤＧ Ｆか創傷液中の主要なＰＤＧＦ様因子であること、およびオーセンティックＰＤ ＧＦは存在しないことか発見された（例２）。ＬＤＣＦは、皮膚創傷および整形 外科的創傷（骨融合［ｂｏｎｅ　ｆｕｓｉｏｎ］）などの通常の創傷が治癒過程 にあるときどんな型のものでも存在する。

重要なことは、糖尿病患者、ステロイド処！されたリューマチ患者、および末梢 循環系疾患の患者に生ずる非治癒皮膚潰瘍から集めた創傷液が分析されたか、今 日まで検査されたすへての場合に、通常の治癒過程にある患者につきテストした ものと同し量を使ったサンプル中にはＰＤＧＦ様生物学的活性もＬＤＧＦ免疫反 応性も検出されなかったことである。こうした結果は、治癒阻害の患者の損傷部 位にＬＤＧＦが欠乏していることを暗示している。この物質は、慢性アルコール 性肝硬変の患者の肝臓組織に存在するものであるか、正常な肝臓組織または肝細 胞層のようなフィブロティック複合物を生成しない病変肝臓組織には存在しない 。

讐考文献 ＾耐ｏｎｉａｄｅｓ、　Ｈ，Ｎ、、　５ｃｈｅｒ、　Ｃ，Ｄ、、　５ｔｉｌｅｓ 、　Ｃ，Ｄ、（１９７９）、ヒト血小板由来成長因子の精製。Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）。

７６１８０９−１８１３゜ Ｂａ１ｒｄ、　Ａ、。Ｍｏｒｎｅｄｅ、　Ｐ、、　Ｂｏｈｌｅｎ、　Ｐ、　（１ ９８５）、腹腔滲出細胞中の免疫反応性繊維芽細胞成長因子は、マクロファージ 由来の成長因子との同一性を示唆する。ＢｉｏｃｈｅＩＩｌ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ 、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｉ＋ｍｕｎ、、　１２６．３５８−３６４゜Ｂａｒｒｅｔ、 　Ｔ、Ｂ、、　Ｇａｊｄｕｓｅｋ、　Ｃ，Ｍ、、　Ｓｃｈｗａｒｔｚ、　Ｓ、Ｍ 、、　ＭｅＤｏｕｇａｌｌ、　Ｊ、に、　＆　Ｂｅｎｄｉｔｔ、　Ｅ、Ｐ、（１ ９８４）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）、　８１ ．６７７２−６７７４゜Ｂｅｔｓｈｏｌｔｚ、Ｃ，、Ｊｏｈｎｓｓｏｎ、Ａ、、 Ｈｅ１ｄｉｎ、Ｃ，Ｈ，、Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｋ。

Ｂ、、　Ｌｉｎｄ、　Ｐ、、　Ｕｒｄｅａ、　Ｍ、Ｓ７、Ｅｄｄｙ、　Ｒ，、Ｓ ｈｏｗｓ、　Ｔ、Ｂ、、　Ｐｈ１ｌｐｏｔｔ、　Ｋ、、　Ｍｅｌｌｏｒ、　Ａ、 Ｌ、、　Ｋｎｏｔｔ、　ＴＪ、、　５ｃｏｔｔ、　Ｊ、　（１９８６）。

ｅＤＮＡ配列とヒト血小板由来成長因子Ａ鎖の染色体局在化、およびその腫瘍細 胞系における発現。Ｎａｔｕｒｅ、　３２０．６９５−６９９゜８ｉｔｔｅｒａ ＋ａｎｎ、　Ｐ、Ｂ、、　Ｒｅｎｎａｒｄ、　Ｓ、１．、　Ｈｕｎｎｉｎｇｈａ ｋｅ、　Ｇ、Ｗ、、　Ｃｒｙｓｔａｌ、　Ｒ，Ｇ、（１９８２）、繊維芽細胞の ためのヒト胞状マクロファージ成長因子・制御法および一邪的特徴。Ｊ、　Ｃｌ １ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、。

７０、８０６−８２２゜ Ｃｏ１１ｉｎｓ、　Ｔ、、　Ｂｏｎｔｈｒｏｎ、　Ｄ、Ｔ、、　０ｒｋｉｎ、　 Ｓ、Ｈ，（１９８７）、代替的ＲＮＡのスプライソングは、コードされた血小板 由来成長因子Ａ鎖の機能に影響する。Ｎａｔｕｒｅ、　３２８．６２１−６２４ ゜ＤｅＬａｒｅｏ、　Ｊ、Ｅ、　＆　Ｔｏｄａｒｏ、　ＧＪ、（１９７８）、　 Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）、乃、４００１−４０ ０５゜ＤｅＬｕｓｔｒｏ、Ｆ、、５ｈｅｒｅｒ、Ｓ、に９．　ａｎｄ　ＬｅＲｏ ｙ、Ｅ、Ｃ，、（１９８０）。

溶解性仲介物による繊維芽細胞のヒト１１球刺激。Ｊ、　Ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎ ｄｏｅｔｈｅｌ、　Ｓｏｃ、、　２８：　５１９−５３２Ｄｉｅｇｅ１ｍａｎｎ 、Ｒ，Ｅ、、Ｃｏｈｅｎ、１．に、＆　Ｋａｐｌａｎ、Ａ、Ｍ、　（１９８０） Ｐｌａｓｔｉｃ　Ｒｅｃｏｎｓｔｒ、　Ｓｕｒｇ、、　６８．１０７−１１３゜ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、　Ｒ，Ｆ、、　Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ、　Ｍ、Ｗ、、　 Ｈｏｏｄ、　Ｌ、Ｅ、、　Ｄｅｖａｒｅ。

Ｓ、Ｇ、、Ｒｏｂｂｉｎｓ、Ｋ、Ｃ，、Ａａｒｏｎｓｏｎ、Ｓ、Ａ、、ａｎｄ　 Ａｎｔｏｎｉａｄｅｓ、Ｈ。

Ｎ、　（１９８３）、サル肉腫ウィルス腫瘍遺伝子、ｖ−ｓｉｓは、血小板歯Ｄ ｏｕｇｌａｓｓ、Ｊ、、Ｃ１ｒｅｌｌｉ、Ｏ，、ａｎｄ　Ｈｅｒｂｅｒｔ、Ｄ、 　（１９８４）、　タンパク質遺伝子の発現５神経分泌ペプチドの分化生成。Ａ ｎｎｕ。

Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｅｈｅｍ、、　５３．６６５−６７１゜Ｅｓｔｅｓ、　Ｊ、Ｅ 、、　Ｐｌｅｄｇｅｒ、　ＷＪ、、　ａｎｄ　Ｇ１１ｌｅｓｐｉｅ、　Ｇ、Ｙ、 　（１９８４）。

マクロファージ由来の成長因子とインターロイキン１は別個の存在である。Ｊ、 　Ｌｅｕｋ、　Ｂｉｏｌ、、３５．１１５−１２９゜Ｇｉｅｓｅ、　Ｎ、Ａ、、 　Ｒｏｂｂｉｎｓ、　ＬＣ，、ａｎｄ　Ａａｒｏｎｓｏｎ、　Ｓ、Ａ、　（１９ ８７）ｖ−ｓｉｓ遺伝子産生物の構造と機能における個々のシスティン残基の役 割。５ｃｉｅｎｃｅ　２３６．１３１５−１３１８゜Ｇｌｅｎｎ、　Ｋ、、　ａ ｎｄ　Ｒｏｓｓ、　Ｒ，（１９８１）、間棄細胞のヒト単球由来成長因子　内毒 素とコンカナバリンＡによる分泌の活性化。Ｃｅ１１、層、　６０３−６１５゜ Ｇｒｏｔｅｎｄｏｒｓｔ、　Ｇ、Ｒ，、Ｐｅｎｃｅｖ、　Ｄ、、　Ｍａｒｔｉｎ 、　Ｇ、Ｒ１＆　５ｏｄｅｋ、　Ｊｒ。

（１’Ａ８．１）硬軟組織の修復、　Ｈｕｎｔ、　Ｔ、に、、　Ｈｅｐｐｅｎｓ ｔａｌｌ、　Ｒ，Ｂ、、　Ｐｉｎｅｓ　Ｅ、　＆　Ｒｏｖｅｅ、　Ｄ、　（Ｐｒ ａｅｇｅｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）、　ｐｐ、　２０−４４゜Ｇｒｏｔｅｎｄｏ ｒｓｔ、　Ｇ、　Ｒ，（１９８４）、Ｎ　Ｉ　Ｈ／　３　Ｔ　３細胞のＰＤＧＦ に対する走化性応答の成長因子、形質転換および肺癌プロモーターによる変更。

Ｃｅ１１．３６．２７９−２８５゜Ｇｒｏｔｅｎｄｏｒｓｔ、　Ｇ、Ｒ，（１９ ８７）、ホイデンチェンハー走化性分析における細胞移動量の分光光度計による 分析。Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍ。

１、、１４７．１４４−１５２゜ Ｇｒｏｔｅｎｄｏｒｓｔ、　Ｇ、Ｒ，、Ｈａｒｖｅｙ、　Ａ、に、、　Ｎａｇａ ｒａｊａｎ、　Ｌ、、　ＡｎｄｅｒｓＧｒｏｔｅｎｄｏｒｓｔ、　Ｇ、Ｒ，、５ ｅｐｐａ、　Ｈ，Ｅ、、　Ｋｌｅｉｎｍａｎ、　Ｈ，に、、　ａｎｄ　Ｍａｒｔ ｉｎ、　Ｇ、Ｒ，（１９８１）平滑筋細胞のコラーゲンへの付着および該細胞の 血小板由来成長因子への移動。Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃｄ、　Ｓｃｉ。

（ＵＳＡ）、　７８．３６６９−３６７２゜Ｇｒｏｔｅｎｄｏｒｓｔ、　Ｇ、Ｒ ，、Ｃｈａｎｇ、　Ｔ、、５ｅｐｐａ、　Ｅｉ、Ｅ、、　Ｋ１ｅｉｒ＋ｍａｎ。

Ｈ，に、、　ａｎｄ　１ｌａｒｔｉｎ、　Ｇ、Ｒ，（１９８２）、血小板由来成 長因子は、血Ｇｒｏｔｅｎｄｏｒｓｔ、　Ｇ、Ｒ，、５ｅｐｐａ、　Ｈ，Ｅ、、 　ＫｌｅｉｎＩＩＩａｎ、　Ｈ，に、、　＆　Ｍａｒｔｉｎ、Ｇ、Ｒ，（１９８ １）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）、７８．　３６６ ９−３６７２゜ Ｈｅ１ｄｉｎ、　Ｃ，Ｈ，、Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｋ、　Ｂ、、　ａｎｄ　ｆａｓ ｔｅｓｏｎ、　Ａ、　（１９８１）。

血小板由来成長因子　大規模工程による単離法とサブユニット成分の分析。Ｂｉ ｏｃｈｅｍ、　Ｊ、、　１９３．９０７−９１３゜Ｈｅ１ｄｉｎ、Ｃ，Ｈ，、Ｊ ｏｈｎｓｓｏｎ、Ａ、、Ｗｅｎｎｅｇｒｅｎ、Ｓ、、Ｗｅｒｎｓｔｅｄｔ。

Ｃ，、Ｂｅｔｓｈｏｌｔｚ、　Ｃ，、ａｎｄ　Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｋ　Ｂ、　（ １９８６）、ヒト骨肉腫細胞ラインはＰＤＧＦ　Ａ鎖のホモダイマーに構造的に 関係している成長因子を分泌する。Ｎａｔｕｒｅ、　３１９．５１１−５１４゜ Ｊｏｂｎｓｓｏｎ、　Ａ、、　Ｈｅ１ｄｉｎ、　Ｃｈ、Ｈ，、Ｗｅｓｔｅｒｍａ ｒｋ、　Ｂ、、　ａｎｄ　Ｗａｓｔｅｓｏｎ、　Ａ、　（１９８２）、血小板由 来成長因子　構造ポリペプチド鎖の同定。Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、 　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、、　１０４．６６−７４゜Ｋｙｈｓｅ−Ａｎｄｅｒ ｓｅｎ、　Ｊ、（１９８４）、多様なゲルの電気プロッティング　ポリアクリル アミドからニトロセルロースへのタンパク質の急速なトランスファーのためのバ ッファタンクなしの単一機器。Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｍ ｅｔｈｏｄｓ、　１０．２０３−２０９゜Ｌａｅｆｆｌｍｌｉ、　Ｕ、に、（１ ９７０）、バクテリオファージＴ４のヘッドの分析中における構造タンパク質の 切断。Ｎａｔｕｒｅ、　２２７．６８０−６８５゜Ｌａｗｒｅｎｃｅ　Ｗ、Ｔ、 、　５ｐｏｒｎ、　Ｍ、Ｂ、、　Ｇｏｒｓｈｂｏｔｈ、　Ｃ，、Ｎｏｒｔｏｎ、 　Ｊ、Ａ。

＆　Ｇｒｏｔｅｎｄｏｒｓｔ、　Ｇ、Ｒ，（１９８６）　Ａｎｎ、　Ｓｕｒｇ、 　２０３．１４２−１４７゜Ｌｅｉｂｏｖｉｃｈ、　Ｓ、Ｊ、、　ａｎｄ　Ｒｏ ｓｓ、　Ｒ，（１９７６）、インヴイトロでの繊維芽細胞の増殖を刺激するマク ロファージ依存性因子。Ａｌｌ。

Ｊ、　Ｐａｔｈｏｌ、、　８４．５０１−５５４゜Ｍａｒｔｉｎｅｔ、　Ｙ、、 　ＢｉｔｔｅｒＩＩＩａｎ、　Ｐ、Ｂ、、　１ｌｏｒｎｅｘ、　Ｊ、−Ｆ、　Ｇ ｒｏｔｅｎｄｏｒｓｔ、　Ｇ、Ｒ，＆　Ｃｒｙｓｔａｌ、　Ｒ，Ｇ、（１９８６ ）、活性化されたヒト単球はｃ−ｓｉｓの主要な腫瘍遺伝子を発現し、ＰＤＧＦ 様活性を示す仲介物を放出する。Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）、　３１９． １５８−１６０゜Ｍｏｒｎｅｘ、Ｊ、−Ｆ、、Ｍａｒｔｉｎｅｔ、Ｙ、Ｙａｍａ ｕｃｈｉ、Ｋ、、Ｂｉｔｔｅｒｍａｎ、Ｐ。

Ｂ、、Ｇｒｏｔｅｎｄｏｒｓｔ、Ｇ、Ｒ，、Ｃｈｙｔｉｌ−Ｗｅｉｒ、Ａ、、ｌ １ｌａｒｔｉｎ、Ｇ、Ｒ，、ａｎｄ　Ｃｒｙｓｔａｌ、　ｆ？、Ｇ、　（１９８ ６）、ヒト肺胞マクロファージによるｃ−ｓｉｓ遺伝子の自然発現と、血小板由 来成長因子様分子の放出。Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、、７８．　６１−６ ６゜Ｐｅｎｃｅｖ、　Ｄ、　＆　Ｇｒｏｔｅｎｄｏｒｓｔ、　Ｇ、Ｒ，（１９８ ８）　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　Ｒｅｓ、、　３゜３３３−３４２゜ Ｐｌｅｄｇｅｒ、　ＷＪ、、　５ｔｉｌｅｓ、　Ｃ，Ｄ、、　Ａｎｔｏｎｉａｄ ｅｓ、　Ｈ，Ｎ、　＆　５ｃｈｅｒ。

Ｃ，Ｄ、　（１９７７）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ ＵＳＡ）、　７４．４４８１−４４８５゜Ｒｏｂｅｒｔｓ、　Ａ、Ｂ、、　Ｌａ ｍｂ、　Ｌ、Ｃ，、Ｎｅｗｔｏｎ、　Ｄ、Ｌ、、　５ｐｏｒｎ、　Ｍ、Ｂ、。

ＤｅＬａｒｃｏ、　Ｊ、Ｅ、、　ａｎｄ　Ｔｏｄａｒｏ、　ＧＪ、　（１９８０ ）　成長因子の形質転換　ウィルス的、化学的に形質転換した細胞からポリペプ チドをアシド／エタノーツ抽出物で単離すること。Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）、　７７、３４９４−３４９８゜Ｒｏｂｂｉｎｓ 、　Ｋ、Ｃ，、Ａｎｔｏｎｉａｄｅｓ、　Ｈ，Ｎ、、　Ｄｅｖａｒｅ、　Ｓ、Ｇ 、、　Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ、　Ｍ、Ｗ、、　ａｎｄ　Ａａｒｏｎｓｏｎ、　 Ｓ、Ａ、（１９８３）、サル肉腫ウィルス遺伝子産生物と、ヒト血小板由来成長 因子との間の構造的、免疫学的類似性。Ｎａｔｕｒｅ、　３０５．６０５−６０ ８゜Ｒｏｓｓ、　Ｒ，、＆　Ｂｅｎｄｉｒ、　Ｅ、Ｐ、　（１９６１）　Ｊ、　 Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｂｉｏｃｈｅａ＋。

Ｃｙｔｏｌ、、　１１．６６５−６７７゜５ｃｈＩＩＩｉｄｔ、　Ｊ、Ａ、、　 Ｍｉｚｅｌ、　Ｓ、Ｂ、、　Ｃｏｈｅｎ、　Ｄ、、　ａｎｄ　Ｇｒｅｅｎ　１． 　（１９８２）、繊維芽細胞増殖のポテンシャルレギュレータであるインターロ イキン１゜Ｊ、ＩＩＩｌｍｕｎｏｌ、、１２８．２１７７−２１８２゜５ｅｐｐ ａ、Ｈ，Ｅ、、Ｇｒｏｔｅｎｄｏｒｓｔ、Ｇ、Ｒ，、５ｅｐｐａ、Ｓ、、Ｓｃｈ ｉｆｆｍａｎｎ。

Ｅ、　＆　Ｍａｒｔｉｎ、　Ｇ、Ｒ，（１９８２）　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｒｉａｌ 、、　９２．５８４−５８８゜Ｓｈｉｍｏｋａｄｏ、Ｋ、、Ｐａ１ｎｅｓ、Ｅ、 Ｗ、、Ｍａｄｔｅｓ、Ｄ、に、、Ｂａｒｒｅｔｔ、Ｔ。

Ｂ、、　Ｂｅｎｄｉｔｔ、　Ｅ、Ｐ、、　ａｎｄ　Ｒｏｓｓ、　Ｒ，（１９８５ ）、マクロファージ由来成長因子の重要部分はＰＤＧＦの少なくとも２つのフオ ームからなっている。Ｃｅ１１．４３．２７７−２８６゜Ｔａｋｅｈａｒａ、　 Ｋ、、　Ｇｒｏｔｅｎｄｏｒｓｔ、　Ｇ、Ｒ，、５ｉｌｖｅｒ、　Ｒ，＆　Ｌｅ ｒｏｙ、　Ｅ。

Ｃ，（１９８７）　Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、ヱ、１ｌ５２−１５８ Ｔｏｎ、　Ｂ、Ｄ、、　Ａｕｅｒ、　Ｄ、Ｅ、、　Ｊａｙｅ、　Ｍ、　Ｋａｐｌ ｏｗ、　Ｊ、Ｍ、、　Ｐｉｃｃａ。

Ｇ、、　ＭｃＣｏｎａｔｈｙ、　Ｅ、、　Ｄｒｏｈａｎ、　Ｗ、、　ａｎｄ　Ｄ ｅｕｅｌ、　Ｔ、Ｆ、　（１９８７）。

ｃＤＮＡクローンはヒトグリア細胞とヒト内皮細胞の血小板由来成長因子Ａ銅量 の相違を露呈する。Ｎａｔｕｒｅ、変、　６１９−６２１゜Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ 、Ｙ、、Ｈｅ１ｓｅｌ、Ｗ、Ｅ、、ａｎｄ　１ａｈ１．　Ｓ、Ｍ、（１９８２） フィブロネクチンのマクロファージ生成、繊維芽細胞の化学誘因物質。Ｊ、　Ｉ ｍｍｕｎｏｌ、、　１２７．６７３−６７８Ｖｏｇｅ１．　Ａ、Ｅ、、　Ｒａ１ ｎｅｓ、　Ｅ、、　Ｋａｒｉｙａ、　Ｂ、、　Ｒｉｖｅｓｔ、　Ｍ、−Ｊ、　＆ 　Ｒｏｓｓ、　Ｒ，（１９７８）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、　（ＵＳＡ）、　７５．２８１０−２８１４゜ Ｗａｔｅｒｆｉｅｌｄ、　Ｍ、Ｄｌ、　５ｃｒａｃｅ、　Ｇ、Ｔ、、　Ｗｈｉｔ ｔｌｅ、　Ｎ、、　５ｔｒｏｏｂａｎｔ。

Ｐ、、　Ｊｏｈｎｓｓｏｎ、　Ａ、、　Ｗａｓｔｅｓｏｎ、　Ａ、、　ｆｅｓｔ ｅｒｍａｒｋ、　Ｂ、、°Ｈｅ１ｄｉｎ。

Ｃ，Ｈ，、Ｈｕａｎｇ、　Ｊ、Ｓ、、　ａｎｄ　Ｄｅｕｅｌ、　Ｔ、Ｆ、　（１ ９８３）、血小板由来成長因子は、サル肉腫ウィルスの推定上の形質転換タンパ ク質ｐ２８ｓｉｓに構造的に関係している。Ｎａｔｕｒｅ、　３０４．３５−３ ９゜表１　組換えＰＤＧＦ　ＢＢホモダイマーによる創傷液の走化性活性阻止 因子　細胞移動の刺激 下室　上室　倍 ＰＤＧＦ　ＢＢ　（１０口ｇ／ＩＩ＋１）　なし　３．７アフイニテイ精製され た １８目の創傷液　なし　３，８ ＰＤＧＦ　ＢＢ　（１０ｎｇ／ｌｌｌ１）　ＰＤＧＦ　ＢＢ　（２５ｎｇ／ｍｌ ）　０．９アフイニテイ精製された １８目の創傷ｄ　ＰＤＧＦＢＢ　Ｏ，９ＰＤＧＦ　ＢＢ　（１０ｎｇ／ｍｌ）　 ＥＧＦ　（２５ｎｇ／ｍｌ）　３．５ＰＤＧＦ　ＢＢ　（１０ｎｇ／ｍｌ）　Ｆ ＧＦ　（２５ｎｇ／ｍｌ）　３．３ＰＤＧＦ　ＢＢ　（１０ｎｇ／ｍｌ）　ＴＧ Ｆ−β（２５ｎｇ／＋＋１）　３．９なし　なし　１．０ 走化性は上記の通りに分析された。正ＰＤＧＦの中和、すなわちＰＤＧＦを上室 へ加えることによる創傷液因子濃度の下室への傾斜は、王室への細胞移動を阻止 した。濃度２５ｎｇ／ｍｌまでの上皮成長因子（ＥＧＦ）、酸性繊維芽細胞成長 因子（ＦＧＦ）、ＴＧＦ−βなどの他の成長因子は細胞のＰＤＧＦへの移動を阻 止しながった。

表２　成長遺伝子産生物のＬＤＧＦとの相同性ＬＮＳＤＬｉＮ　１０フ 列１１９、マツチ４８、ミスマツチ７１、相同性４０％表３：　ＰＤＧＦ　Ｂ鎖 成熟タンパク質のＬＤＧＦとの相同性列７８、マツチ１２、ミスマツチ６６、相 同性１５％Ｇ　ＡＧＧ　（、ｕ　ＣＴＣλＣＣＣＴＣ入ＣＴＣλＧλ（：Ｇ　Ｔ ＣＴ　ＴＣＴ　（：Ｇ’Ｔ　：１４τＣＣＣλＧＣλＡ　ＧＣＧ　ＴＡＧ　ＡＡ Ｔ　Ｔ！’Ｔ　Ｃλ入λＣＣτＴＧλＴ］ＴｒＣτ入ＧλＧＴτＣＴ　５２９Ｃ 入ｒ！Ｔ入ＴτＣλＧＧ　入τλ　ＣＣＴ　λ！τ　Ｃ：τλＣで　ＧＴ入τフ λ入λ入ｆｆ１ＧＧλτ入τ　５フ４ＣテＧＴＴフＣ入！　ＴＣで　ＧＴＣＴＣ 入　入入＾入τＣλＣ入τＴτ　τ入ττＣで　ＧλＧＧλλ　ＧＧで　６１９ τＧＧττλ入入五〇λｌ’　ＧＧＣ入Ｇ入λ入Ｇ　ＡＡＧ　ＡＴＧ　λ入入入 τλλ入でＡＡＧ　ＣＣＴ　ＧＧで　６６４ττＣＡＡＣＣＣＣＴＣ６フ５ 図面の簡単な説明 およびβ−ＴＧは、ＬＤＧＦに対して異なるＮ末端と一つの共通したＣ末端とを 持つ。これら関連するタンパク質のＮ末端がマークされている。

図２はＬＤＣＦの親水性および疎水性領域のマツプであり、（ａ）Ｋｙｌｅ　ａ ｎｄ　Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、窓７、および（ｂ）Ｈｏｏｐ　ａｎｄ　Ｗｏｏｄｓ 、窓６の方式で親水性領域は表面に張られる傾向があるから、それにより抗原的 である。

図３は（ａ）αヘリックス、（ｂ）βシート、および（ｃ）逆回転が、Ｃｈｏｕ 　ａｎｄ　Ｆａｓｍａｎのアルゴリズムを使ってＬＤＧＦ配列を横切るポテンシ ャＡｔを調査したものである。

図４は１０の残基の各窓につきＬＤＧＦのネットチャージを示すものである。

図５はＴリンパ球抗原決定基である両親媒性αヘリックス（窓１１、関数１００ ）を示す。

図６は培地におけるＰＤＧＦ様走化快走化性活性び不活性化、ＬＰＳ活性化ヒト 末端血液単球の細胞抽出物を示す。

図１ 水治療法（ＸｙｔｅとＤｏｏｌｉｔｔｌｅ）ＤＧＦ 窓７ 図２Ａ 免疫原性（ＦＩｏｐｐｈ　Ｗｏｏｄｓ）ＤＧＦ 窓６ 図２Ｂ α−ヘリックスポテンシャル（ＣｈｏｕとＦａｓ嘗ａｎ）ＤＧＦ 窓６ 図３Ａ βシートポテンシャル（ＣｈｏｕとＦａｓ■ａ口）ＭＤＧＦ 窓６ βターンポテンシャル（ＣｈｏｕとＦａｓＵｎ）ＭＤＧＦ 窓６ 図３Ｃ ネットチャージ ＭＤＧＦ 図４ 両親媒性 ＭＤＧＦ 窓１１、度数１００ 図５ 図６ ＝］ 国際調査報告 ＵＳ　９１００７１０ ＳＡ　４４６４３ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，”　識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　５／１０ Ｃ１２Ｐ　２１１０２　Ｋ　８２１４−４Ｂ（Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：９１） Ｉ

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．走化性活性および／またはマイトジエン活性を持ち、かつ、ＰＤＧＦ、ＰＢ Ｐ、ＣＴＡＰ…ＩＩＩまたはβ−ＴＧよりＬＤＧＦによりょく相同であるＬＤＧ Ｆの非自然発生ポリペプチド類似体。
2. ２．繊維芽細胞に対する走化性活性および／またはマイトジェン活性を持ち、か つ、次の配列と実質的に相同なアミノ酸配列を持つポリペプチドをコードするｃ ＤＮＡ。 【配列があります】
3. ３．繊維芽細胞に対する走化性活性および／またはマイトジェン活性を持ち、か つ、次の配列と実質的に相同なアミノ酸配列を持つ、ポリペプチドをコードする 構造遺伝子を有する組換えＤＮＡ分子、及びその構造遺伝子に操作可能に結合し たプロモーター。 【配列があります】
4. ４．プロモーターが構造遺伝子と自然関連したものでない請求項３の分子。
5. ５．請求項３の組換えＤＮＡ分子で形質転換された細胞培養組織。
6. ６．走化性活性および／またはマイトジェン活性を持つポリペプチドの産生方法 であって、該ポリペプチドの発現をもたらす条件下に請求項５の形質転換細胞培 養組織を培養することを特徴とするもの。
7. ７．１ｍｇ／ｍｌ以下の濃度で走化性活性および／またはマイトジェン活性を持 つことを特徴とする請求項１のポリペプチド。
8. ８．ブロモシアンに感受性を持ちギ酸に影響されないことを特徴とするポリペプ チド。
9. ９．請求項１のポリペプチドと、薬学許容的キャリヤとを有する創傷治癒組成物 。
10. １０．生ＬＤＧＦよりタンパク質分解に感受性の少ないポリペプチドを与えるよ うにプロテアーゼ切断部位を変更した点で少なくとも生ＬＤＧＦから区別される 請求項１のポリペプチド。
11. １１．生ＬＤＧＦの位置３５および３６のセリンが突然変異されている請求項１ ０のポリペプチド。
12. １２．生ＬＤＧＦの位置４４のアスパラギンが突然変異されている請求項１０の ポリペプチド。
13. １３．請求項１のポリペプチド類似体をコードする可発現遺伝子を有する組換え ＤＮＡ分子。
14. １４．走化性活性および／またはマイトジェン活性を持つポリペプチドの産生方 法であって、該ポリペプチドの発現をもたらす条件下に請求項１３の組換えＤＮ Ａ分子で形質転換された細胞培養組織を培養することを特徴とするもの。
15. １５．ポリペプチドか、図１に挙げたＬＤＧＦ配列に実質的に相同なアミノ酸配 列を有する請求項６の方法。