JP2515928B2 - 高分子量ヒト血管形成因子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 血管形成過程は、（１）静止内皮細胞の“活性化”、
（２）基底膜および隣接組織への血管内皮細胞の侵入、
（３）毛細血管形成を包含する生物学的機能の複雑な相
互作用、を包含する。これらの現象は数多くの種々の血
管形成因子により刺激されうる。しかしながら、血管形
成因子は新しい毛細血管形成に必要な２つの重要な現象
である、毛細血管内皮細胞の移動および増殖、に“イン
ビトロ”で全く異なる作用をおよぼす。いくつかの血管
形成因子は内皮細胞の移動または増殖、またはその両方
を刺激する。対照的に、他は“インビトロ”で内皮細胞
増殖に全く影響を及ぼさないかまたは阻害する。これら
の所見は、種々の血管形成因子が、それらの標的と見ら
れるものにより評価された場合、直接的または間接的の
いずれかで働きうることを示唆している。

ヒト塩基性繊維芽細胞成長因子（bFGF）は“直接”血
管形成因子として分類される。胎盤から精製されたヒト
bFGF分子（“胎盤bFGF"）は、（ａ）毛細血管内皮細胞
の増殖を刺激し、（ｂ）毛細血管内皮細胞の化学走性を
刺激し、そして（ｃ）これら同じ細胞を刺激してプラス
ミノーゲン活性化因子および潜在性コラゲナーゼを生産
する、ことが示された。Moscatelliら、Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA,1986,Vol.83,p.2091を参照。“インビボ”
で、プラスミノーゲン活性化因子は酵素前駆体であるプ
ラスミノーゲンを広い特異性を有するプロテアーゼであ
る活性プラスミンに変換しうる。次にこのプラスミンが
潜在性コラゲナーゼを活性コラゲナーゼに変換しうる。

したがって、胎盤bFGFの影響下毛細血管内皮細胞は周
辺組織中の大部分のタンパク質を分解できる２種のプロ
テアーゼを生成でき、このことにより内皮細胞が組織に
侵入するのが可能となる。事実、精製胎盤bFGFタンパク
質は“インビボ”で血管形成性であることが示された。
上記Moscatelli参照;Squiresら、J.Bio.Chem.,1988,印
刷中（1988年12月出版予定）。ヒト胎盤bFGFの単離、構
造および性質は、Moscatelliらの米国特許出願No.163,1
42に記載されており、これは参考文献としてその全部が
ここにとり込まれる。

純粋な形態の血管形成性タンパク質、例えば上記した
胎盤bFGF分子は治療上価値のある物質に開発することが
できる。胎盤bFGFの生物学的性質ゆえに、このタンパク
質は適切に投与された場合、創傷および骨の欠損の治
癒、心臓血管損傷の修復、動脈硬化病変の修復および合
成血管移植片の内皮化に有益な作用を有しうる。また、
胎盤bFGFは神経栄養性の性質を有することが示されてお
り、このことは種々の原因による神経障害の治療に有益
であろう。

“血管形成因子”と呼ばれるいくつかのタンパク質が
同定されている。これらのタンパク質の多くはヒト以外
の供給源から単離された。ヒト以外の供給源から単離さ
れた血管形成因子は外来タンパク質に応答して不都合な
免疫学的反応を行う可能性があるので、ヒトへの治療剤
として使用するには適さないと考えられる。

ヒトbFGFタンパク質をコードするcDNAのヌクレオチド
配列はAbrahamによりはじめて発表された。Abrahamら、
EMBO,1986,Vol.5,pp.2523−28参照。cDNAの１個の推定
上の開始メチオニンコドンの位置に基づき、これらの著
者はbFGF遺伝子産物が154個のアミノ酸から成るタンパ
ク質（“bFGF−18"）であろうと予測した。しかしなが
らSommerおよび共同研究者らは、ヒト胎盤から単離され
たbFGF調製物は、AbrahamらによりbFGF cDNAから予測さ
れた遺伝子産物に比較して、Ｎ末端が伸長されたbFGF種
を含有することを示している。Sommerら、Biochem.Biop
hys.Res.Commun.,1987,Vol.144,pp.543−550参照。

これらの知見により、未だ記載されていないヒトbFGF
血管形成因子の複数の形態の存在が示唆された。

研究のこの観点に基づき、本発明者らは、それらのキ
ロダルトン（kD）でのおよその分子の大きさによりbFGF
−22、bFGF−23およびbFGF−24としてここに分類される
ヒトbFGFの３種の新しい分子形態を探求し発見した。総
称的に、３種の新しいタンパク質は、先に特性決定され
文献に記載された約18kDの分子量のbFGF分子（bFGF−1
8）およびメチオニンで開始されるbFGF−18のＮ末端に
さらに２個のアミノ酸を含有する胎盤bFGF種と対比し
て、高分子量bFGF（hmwbFGF）と呼ばれよう。

hmwbFGFは、ヒト肝癌細胞系SK−HEP−１から単離でき
るものと実質的に相同であり、そしてマイトジェン活
性、化学走性活性、血管形成活性、プロテアーゼ合成刺
激能およびそれらの組み合わせたものから成る群から選
択される活性を有する、少なくとも１つの活性部位を有
する。

hmwbFGFの発見に加え、本発明者らは、インビボで非A
TGコドンでタンパク質合成を開始する正常動物細胞遺伝
子の最初の例も発見している。非ATG開始は原核生物細
胞遺伝子においては記載されているが、この挙動を示す
動物細胞遺伝子についての先行報告はただ一つあるだけ
である。Hannら、Cell,1988,Vol.52pp.185−189を参
照。Hannはインビトロ翻訳を用いて、cMYCプロト腫瘍遺
伝子も翻訳開始に非ATGコドンを利用していると思われ
ると報告している。

翻訳が非ATGコドンで開始される、比較的高分子量形
態のbFGFの存在により、同様の高分子量種が治療上価値
がある他のヒトタンパク質にも存在しうることが示唆さ
れる。これら比較的高分子量形態のタンパク質は親タン
パク質と比べて同様か、増強されるかまたは新しくさえ
ある治療上の性質を有しうる。翻訳開始が同定された推
定上の（ATG）イニシエーターより前にある非ATGコドン
でも始まりうると認識することは、研究者が多くのタン
パク質のより高い分子量形態物を探求することを可能に
しよう。おそらく、活性タンパク質のより高い分子量形
態物が、もしあるとすれば、同様の治療活性を有し、一
方で未知の付加的な利益または性質も有しよう。付加さ
れたアミノ末端ペプチドセグメントは、タンパク質の種
々の活性部位を改変または遮断するのに、またはタンパ
ク質の移動の制御を、または細胞の内部へのまたは外部
へのその位置の指向を助けるのに有益でありうる。本発
明はhmwbFGFの詳細な例の他に、インビボで非ATGコドン
からの翻訳開始により合成される治療用タンパク質の高
分子量形態物を包含する。

本発明による好ましいhmwbFGF血管形成因子は以下に
示されるbFGF−18コアアミノ酸配列を有する： さらに配列： を有するペプチドがコア配列の外側にあるポリペプチド
中に存在する。特に好ましいhmwbFGF血管形成因子には
以下の配列があげられる： 前記略号により示されるアミノ酸は下記好ましい態様
の記載中に示される。

翻訳によりhmwbFGFおよびbFGF−18因子を生成するた
めのRNAの生成に用いられるcDNAクローンの関連するヌ
クレオチド配列は次のとおりである： bFGF−18ポリペプチドはATG365で開始されるが、先に
記載されるように胎盤bFGFはATGイニシエーターにより
形成されるメチオニンに２個のアミノ酸のアミノ末端伸
長を有する。ヌクレオチド番号付けはbFGF血管形成因子
を発現することが同定されているcDNAクローンの最初の
核酸から始まる。bFGF−18因子を生ずる翻訳のためのRN
Aを生成させるのに用いられるcDNAクローンのヌクレオ
チド配列は以下のとおりである： 好ましいhwmbFGFはATG365より前のコドンで始まる翻
訳開始により生産される。特に好ましいhmwbFGFはCTG20
1,CTG228およびCTG243での翻訳開始により生産される。
前記略号により示される核酸は下記好ましい態様の記載
において示される。

さらに、本発明に従い、活性成分の少なくとも１つと
して、ここに記載される本発明による血管形成因子を含
有する医薬組成物を開示する。

前述の一般的記載および以下の詳細な記載は共に単な
る例示であって、特許請求されている本発明を制限する
ものではない。

好ましい実施態様の記載 本発明の原理は、以下の実施例と共に好ましい態様の
この詳細な記載により説明されよう。

本発明は標準的な実験室技術により単離および分離で
きる治療上のタンパク質に関する。特に、本発明は単離
および分離されそしてウェスタンブロット分析により同
定された血管形成因子に関する。好ましくは、本発明の
血管形成因子はヒト肝癌細胞系SK−HEP−１から単離で
きる天然型血管形成因子と実質的に相同で、免疫学的に
等価であり、そしてもっとも好ましくは生物学的に等価
である単一ポリペプチド鎖タンパク質である。ヒト肝癌
細胞系SK−HEP−１は当業者によく知られ、種々の生化
学供給業者から入手できるヒト細胞組織の普通に使われ
ている株である。本明細書および請求の範囲を通して用
いられている“生物学的に等価”とは、本発明の組成物
が天然型血管形成因子と同じ様式であるが必ずしも同程
度でないマイトジェン性、化学走性、プロテアーゼ合成
刺激、血管形成性または他の性質を有することを意味す
る。

以下の明細書および請求の範囲を通して用いられそし
て任意のタンパク質について言及する場合“実質的に相
同の”とは、以前に報告され、精製された、実質的に相
同の血管形成因子または治療用タンパク質組成物により
示される相同度を越えた、天然型血管形成因子または治
療用タンパク質に対する相同度を意味する。好ましく
は、相同度は50％好ましくは60％、さらに好ましくは75
％以上、特に好ましいタンパク質は天然型タンパク質と
85％または90％以上相同である。前記した相同度は、参
考文献としてここに詳細にとり込まれるDayhoff,M.O.in
Atlas of Protein Sequences and Structure,Vol.5,pa
ge124（1972）,National Biochemical Research Founda
tion,Washington,D.C.,に記載されているように、100ア
ミノ酸の鎖長中に４個のギャップを導入して整合を補助
した場合に、比較すべき配列において同じアミノ酸残基
と整合する、２本の配列の小さい方に存在するアミノ酸
残基の％として計算される。

以下の明細書および請求の範囲を通して用いられそし
て任意のオリゴヌクレオチド配列について言及する場合
の“実質的に相同”とは、その配列から翻訳されたタン
パク質が天然型核酸配列により生産されたタンパク質と
実質的に相同であるような、天然型核酸配列に対する相
同度を意味する。ここに記載する本発明の血管形成因子
および治療用タンパク質はヒト供給源から単離されるか
または合成ポリペプドである。“合成”ポリペプチドな
る用語は、実質的に精製された形態で自然界からこれま
でに単離れていないアミノ酸配列を意味するものであ
る。この定義には、特に組換えDNA法によるかまたはイ
ンビトロで全部または一部を合成により生成されたポリ
ペプチドを包含される。特に、以下に示される最も好ま
しいアミノ酸配列が１個から数個のアミノ酸で逸脱して
いる合成ポリペプチドが意図される。

以下の明細書および請求の範囲を通して用いられてい
る“治療用タンパク質”とは、単一ポリペプチド鎖から
成り、そして疾患の治療または予防医学に有用でありう
る価値ある生物学的性質を有する、任意の天然に存在す
るヒトタンパク質を意味する。この発明は、非ATGコド
ンでのインビボ翻訳開始により形成される前記治療用タ
ンパク質の全ての高分子量形態物およびその単離法に関
する。

本発明の好ましい血管形成因子はヒト肝癌細胞系SK−
HEP−１抽出物中に発見され、初めてbFGF−18タンパク
質からおよび互いから分離された。本出願の目的にとっ
て、ここに開示される任意の血管形成因子について言及
するのに用いられる場合の“純粋形態”または“精製さ
れた形態”とは血管形成因子でない他のヒトタンパク質
を実質的に含まないことを意味する。好ましくは、本発
明の血管形成因子は少なくとも50％純粋、より好ましく
は70％純粋そしてさらにより好ましくは80％または90％
純粋である。

本発明の血管形成因子はヒト肝癌細胞系SK−HEP−１
から、（ａ）ヒト細胞系SK−HEP−１細胞を溶解させ、
（ｂ）混合物中のタンパク性物質を分画することにより
血管形成因子を単離し、（ｃ）胎盤bFGF免疫交差反応性
を有しかつbFGF−18血管形成因子を全く含有しない画分
を同定し、そして（ｄ）その画分を濃縮する、ことを含
んでなる方法により単離できる。

好ましい態様においてはSK−HEP−１細胞を数ある中
でも１％NP40を包含する緩衝液中で溶解させる。NP40は
フェノール１モル当りエチレンオキシドを平均９モル含
有するオクチルフェノール−エチレンオキシド縮合物か
らなる、微生物学的調製物に普通に用いられる界面活性
剤であり、Sigma Chemical Companyから入手できる。細
胞中に存在するタンパク性物質を分画する前に、全ての
核および細胞破片を遠心分離により取り除く。SK−HEP
−１細胞中に存在するタンパク性物質を当業者によく知
られている慣用のクロマトグラフィー法を用いて分画す
る。１つの態様においては、タンパク性物質をヘパリン
−セファロースアフィニティークロマトグラフィーを用
いて分画し、さらにゲル電気泳動により分離する。

上記分画法によって得られた画分を胎盤bFGF免疫交差
反応性に関してスクリーンする。ゲル電気泳動を利用す
る場合は、電気泳動は12％SDS−PAGE（ドデシル硫酸ナ
トリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）を用いて
実施し、そしてタンパク質をニトロセルロースにウェス
タンブロットして抗胎盤FGF抗体で検出する。この方法
により、hmwbFGFが互いから、およびbFGF−18因子から
分離でき、そして抗胎盤FGF抗体と反応する22kD、23k
D、および24kD分子量タンパク質の存在が示される。

本発明者らは、精製された形態の、そして血管形成因
子でないヒトタンパク質を実質的に含まない形態のhmwb
FGFをはじめて同定し単離した。ヘパリン−セファロー
スクロマトグラフィーおよびゲル電気泳動によるタンパ
ク質の単離および分離は、hmwbFGFの配列を確立するの
に欠くことのでない段階であった。この情報は、上記cD
NAの一次構造の知識および非ATG翻訳イニシエーターの
存在を確立する実験と一緒になって、本発明者らが各hm
wbFGFの配列を確立するのを可能にした。

本発明の好ましい血管形成因子として特定される構造
はcDNAヌクレオチド配列の既知の構造から推測すること
により決定される。しかしながら、示されるアミノ酸配
列への翻訳後修飾が行われる可能性はかなり高い。はじ
めに翻訳されたタンパク質に翻訳後修飾が存在すること
は、ヒト肝癌細胞系SK−HEP−１から単離できるhmwbFGF
タンパク質が以下に示す配列と実質的に相同であるが、
かならずしも同一ではないことを意味する。

本発明のhmwbFGF血管形成因子は下記bFGF−18コア配
列を有する： さらに、配列： を有するペプチドがコア配列のアミノ末端に存在する。
特に好ましいhmwbFGF血管形成因子は下記配列を有す
る： 前記略号は例えばBiochemstry by A.L.Lehninger,第
２版、Worth Publishers,Inc.,New York（1975）,p.72
に記載されるアミノ酸残基の標準略号に相当する。

本発明のhwmbFGF血管形成因子はまた、組換えDNA法に
より（ａ）hmwbFGFの最終翻訳物をコードするDNA配列を
単離し、（ｂ）このDNA配列を宿主微生物で発現可能な
ベクターに挿入し、（ｃ）所望のDNA配列を含有するベ
クターをタンパク質を発現しうる宿主生物にトランスフ
ェクションさせ、（ｄ）トランスフェクションされた生
物からhmwbFGF血管形成因子を発現させ、そして（ｅ）
任意の順序で、所望のタンパク質を単離および精製す
る、ことを含んでなる方法により生産され、そして精製
された形態で単離され得る。

好ましい態様においては、宿主生物はCOS−１細胞で
あり、そして利用されるベクターはpJC119である。これ
らは当業者によく知られている普通に用いられる生物学
的物質であり、種々の生化学供給業者から入手できる。
さらに、DNAは下記： と同じかまたは実質的に相同のオリゴヌクレオチド配列
を含有する。

本発明者らは、提案された開始部位で改変された核酸
配列を合成することにより非ATGコドンでの翻訳開始を
確立した。hmwbFGFおよびbFGF−18タンパク質を翻訳す
る天然に存在するセグメントと他の全ての点においては
同一であるが、１個の核酸が１個の異なる核酸で置換さ
れたオリゴヌクレオチド配列を合成することにより、そ
の核酸が存在する３核酸コドンは異なるアミノ酸に翻訳
されよう。もし改変されたコドンが翻訳イニシエーター
コドンでない場合、一般にその核酸セグメントは天然の
タンパク質と同一であるが、１個のアミノ酸が異なるタ
ンパク質（またはこの場合はタンパク質類）を依然とし
て生産しよう。しかしながら、もしイニシエーターコド
ンが改変されれば翻訳はその部位からは起らないであろ
う。本発明の発明者らがbFGF血管形成因子の活性高分子
量形態物を生ずる非ATGイニシエーターの存在を確立し
たのはこれらの方法によってである。

hmwbFGFおよびbFGF−18因子を生成するオリゴヌクレ
オチド構造は次のとおりである： ここで用いられている略号は例えばBiochemistry by
A.L.Lehninger.第２版、Worth Publishers,Inc.New Yor
k（1975）,pages 310−318に示される核酸の省略記号に
相当する。

“遮断”イニシエーター法を使用することにより、本
発明の発明者らはhmwbFGFがbFGF−18タンパク質と実質
的に同じマイトジェン活性を有することを示すこともで
きた。ATG−365コドンを変えて、本発明者らはbFG F−1
8の生産を遮断しそしてbFGF−18を含まないhmwbFGFを得
た。相対的濃度に基づいた比較マイトジェン活性研究で
は、hwmbFGFがbFGF−18と非常に類似したマイトジェン
活性を有することが示された。もちろん、この実験で研
究されたhmwbFGFはbFGF−18開始部位のメチオニンがア
ミノ酸置換されているので、最も好ましい構造の相同物
である。

本発明の発明者らは“フレームシフトした"cDNAオリ
ゴヌクレオチドセグメントを合成し翻訳することによ
り、hmwbFGFのマイトジェン活性がbFGF−18タンパク質
のそれと均等であることも確立している。基本的なbFGF
−18タンパク質を翻訳するセグメントの直前の核酸配列
中に１個の付加的な核酸を加え入れるだけで、それに続
く全くのコドンに存在する３アミノ酸組み合せ物がシフ
トする。かかる“フレームシフト”は追加した核酸がcD
NAに加わる地点で、オリゴヌクレオチドから翻訳される
タンパク質を変える。この方法を通して、本発明の発明
者らはhmwbFGFのマイトジェン活性部位がbFGF−18タン
パク質のそれと実質的に等しいことを示すことができ
た。

本発明の高分子量治療用タンパク質は、それぞれの治
療用タンパク質の治療目的と同様の治療目的が意図され
る。特に、本発明の血管形成因子およびここで開示され
ている類似物はマイトジェン性、化学走性、神経栄養性
または血管形成性質またはプロテアーゼ合成刺激能を有
する医薬製剤の形態でヒトおよび家畜用途が意図され
る。活性成分の少なくとも１種として本発明の血管形成
因子のひとつを含有する医薬製剤が期待されている。こ
の製剤はまた意図される剤形の如何に応じ適切な製剤上
受容できる担体、希釈剤、充填剤、結合剤および他の賦
形剤をも含有しよう。経口投与には、消化管での活性タ
ンパク質の分解を阻止するための処置がとられねばなら
ない。したがって腸溶剤形が経口投与に好適なひとつの
形態として意図される。もし非経口投与が選択される場
合は、製剤は水または食塩溶液または他の製剤上受容で
きる懸濁剤を含有しうる。一般に、非経口投与が意図さ
れる製剤は製剤全体を体液と等張にするのに十分な濃度
の塩化ナトリウムまたはグリセロールを含有することが
好ましいであろう。本発明の血管形成因子を含有する医
薬製剤は創傷、外科的切開または皮膚潰瘍の治療に注射
または外用により局所的に投与されることも意図され
る。さらに、心筋梗塞後の心臓への血液供給を再生する
ためには血管形成因子を徐放性インプラント装置中に組
み込んだものを投与することが意図される。

上記障害の治療に適切な用量を決定するのに必要な、
そして上記放出法での使用に適切な計算は特に標準的ア
ッセイおよびここで開示されたアッセイに照らして当業
者により日常的になされ、過度の実験なしに彼らにより
日常的に行なわれる仕事の範囲内にある。これらの用量
は適切な用量−応答データに関連して利用される用量を
決定するための確立されたアッセイを用いることにより
確認できる。

本発明の教示を特定の問題または環境に適用すること
は、ここに含有される教示に照らして当業者の能力の範
囲内であることが理解される。本発明の産物の例および
それらの単離、同定および製造の代表的過程は以下の実
施例に示される。

実施例１ ヒト肝癌細胞系SK−HEP−１からのhmwbFGFの精製 ヒト肝癌SK−HEP−１細胞を、400mM NaCl,1μM MaCl,
50mMトリスpH7.5,1％NP40および１μM PMSF（フェニル
メチルスルホニルフルオライド）を含有する緩衝液中で
溶解させた。核および細胞屑を遠心分離により取り除
き、続いて細胞抽出物をMoscatelli（上記（参考文献と
してここにとり込まれる））に記載されるようにしてヘ
パリン−セファロース（HS）でクロマトグラフィーし
た。3M NaCl HS溶出物はhmwbFGFを含有していた。標準
手順に従い、集めた画分を12％SDS−PAGEで分離し、そ
してニトロセルロースへのウェスタンブロッティングに
続きSzewcbykらAnalytical Bioch.1985,Vol.150,pgs403
−407（参考文献としてここにとり込まれる）に記載さ
れるようにして指示されるアフィニティー精製抗FGF抗
体を用いて分析した。この方法によりbFGF−18血管形成
因子の他に分子量22kD、23kDおよび24kDに相当する３個
の別々のhmwbFGFタンパク質の存在が示された。

実施例２ 天然に存在するbFGF cDNAから転写されたRNAのインビト
ロ翻訳 RNA依存インビトロ翻訳をPelhamらEur.J.Biochem.,19
76,Vol.67,page247（参考文献としてここにとり込まれ
る）に記載される方法により³⁵S−メチオニンの存在下
小麦胚抽出物中で行い、それに続く免疫沈降反応をFlor
kiewiczら、J.Cell Biology 1983,Vol.97,pages1381−1
388（参考文献としてここにとり込まれる）に記載され
ているようにして行った。免疫沈降した試料をプロテイ
ン−Ａセファロースで溶出し、12％SDS−PAGEで分解し
そしてフルオログラフィーで可視化した。こもでも分子
量18、22、23および24kDのタンパク質が検出された。こ
の方法により血管形成因子でないヒトタンパク質を実質
的に含まないhmwbFGFが得られる。

実施例３ 開始部位を決定するためのbFGF cDNAクローンの突然変
異 201位（CTGからCTT）および365（ATGからGCT）での特
定部位のオリゴヌクレオチド突然変異を、Kunkelら、Me
thods in Enzymol,1987,Vol.154,pp.367−382（参考文
献としてここにとり込まれる）に記載される方法に従い
Biorad mutageneキットを用いてbFGF cDNAクローンに導
入した。243位（CTGからCTT）での突然変異を含有する
核酸配列はヌクレオチド192のXhol部位とヌクレオチド3
53のApal部位との間のDNAフラグメント（４本の重複す
る合成オリゴヌクレオチドを用いて）を再合成すること
により得た。

ハイブリッド発現ベクターpJC119内に含有される突然
変異したcDNAをMachamerら、Mol.Cell.Bio.,1985,Vol.
5,pp.3074−3083（参考文献としてここにとり込まれ
る）に記載されるようにしてCOS−１細胞にトランスフ
ェクションさせた。トランスフェクションして40−48時
間後に、細胞を実施例１記載のようにして溶解させ、抽
出物を４℃で２時間HSとインキュベートした。HSペレッ
トを0.5M NaClおよび20mMトリスpH7.5を含有する緩衝液
で、続いて1M NaClおよび20mMトリスpH7.5緩衝液で３回
洗浄した。次にペレットを3M NaCl緩衝液で溶出し、溶
出物をSDS−PAGEおよびアフィニティー精製抗bFGF抗体
を用いるウェスタンブロットで分析した。

これら突然変異させたオリゴヌクレオチドから生ずる
翻訳により、前記実施例１に記載されるようにして単離
され同定されたタンパク質が生成された。201位で突然
変異したオリゴヌクレオチドはbFGF−18、bFGF−22、お
よびbFGF−23を生産した。243位に突然変異のあるオリ
ゴヌクレオチドはbFGF−18、bFGF−23およびbFFGF−24
を生産した。そして最後に、365位に突然変異のあるオ
リゴヌクレオチドはbFGFを含まない３種の全てのhmwbFG
F、つまりbFGF−22、bFGF−23およびbFGF−24を生じ
た。

実施例４ マイトジェン活性部位を決定するためのbFGFクローンの
フレームシフト突然変異 353位と354位（唯一のApal部位）の間に１個の核酸を
効果的に追加するフレームシフト突然変異を、標準操作
に従いbFGF cDNAクローンをオリゴヌクレオチド５′GGC
CTCTAGAGCCGGCC3′で処理することにより実施する。こ
のオリゴヌクレオチドの翻訳産物を、前記実施例３に記
載のようにしてクローンをCOS−１細胞にトランスフェ
クションさせることにより観察し、生じたタンパク質を
実施例１記載のようにして分析した。この突然変異した
配列の翻訳からは抗bFGF抗体に反応するタンパク質は全
く検出されなかった。

実施例５ hmwbFGFのマイトジェンアッセイ 実施例３記載のようにして調製され、そして天然に存
在するbFGF cDNAおよび365位で突然変異したオリゴヌク
レオチドでトランスフェクションされた細胞からの溶解
物を含有するHSペレットを、3M NaClを含有する緩衝液
で溶出した。これら溶出物の一部分をPrestaら、Mol.Ce
ll.Biol.,1986,Vol.6,pp.4060−4066（ここに参考文献
としてとり込まれる）に記載される3T3細胞マイトジェ
ン性アッセイで直接アッセイし、3H−チミジンのTCA沈
降可能カウントへのとり込みを測定した。この実験の結
果は、hmwbFGFがbFGF血管形成因子とほとんど同一のマ
イトジェン性質を有することを示した。これらの試料の
定量的ウェスタンブロット分析では3M NaCl溶出物中に1
ng/μのbFGF濃度が示された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＮ Ｃ１２Ｒ 1:91） ＡＤＳ (56)参考文献 特表 昭63−501953（ＪＰ，Ａ) Ｃｅｌｌ，52［２］（1988−１−29) Ｐ．185−195 ＦＥＢＳ ＬＥＴＴＥＲＳ，213［１ ］（1987−３．）Ｐ．189−194

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】マイトジェン活性を持つ少なくとも１つの
   活性部位を有する、精製された単一ポリペプチド鎖タン
   パク質を含むヒトbFGF−18血管形成因子の高分子量形態
   物またはその混合物であって、ここで該タンパク質は下
   記bFGF−18コア配列および 下記から成る群より選択される追加のアミノ酸配列を含
   む前記高分子量形態物またはその混合物。
2. 【請求項２】前記タンパク質の追加のアミノ酸配列が請
   求の範囲１記載の追加のアミノ酸配列と２アミノ酸残基
   だけ異なる、ヒトbFGF−18血管形成因子の高分子量形態
   物またはその混合物。
3. 【請求項３】前記タンパク質の追加のアミノ酸配列が請
   求の範囲１記載の追加のアミノ酸配列と６アミノ酸残基
   だけ異なる、ヒトbFGF−18血管形成因子の高分子量形態
   物またはその混合物。
4. 【請求項４】翻訳後修飾が追加のアミノ酸配列に対して
   なされている、請求の範囲１記載のヒトbFGF−18血管形
   成因子の高分子量形態物またはその混合物。
5. 【請求項５】マイトジェン活性を持つ少なくとも１つの
   活性部位を有する、精製された単一ポリペプチド鎖タン
   パク質を含むヒトbFGF−18血管形成因子の高分子量形態
   物またはその混合物を生産する方法であって、ここで該
   タンパク質は下記bFGF−18コア配列および 下記から成る群より選択される追加のアミノ酸配列を含
   む前記高分子量形態物またはその混合物であり、 （ａ） 該形態物をコードするDNA配列を単離し、 （ｂ） このDNA配列を宿主生物において発現可能なベ
   クターに挿入し、 （ｃ） 該形態物を発現しうる宿主生物に前記DNA配列
   を含有するベクターをトランスフェクションさせ、 （ｄ） トランスフェクションされた生物から該形態物
   を発現させ、そして （ｅ） 任意の順序で、ヒトbFGF−18血管形成因子の発
   現された高分子形態物を単離し、精製する、 ことを含んでなる前記方法。
6. 【請求項６】前記DNA配列が下記： と同じかまたは実質的に相同である核酸配列を含有す
   る、請求の範囲５記載の方法。
7. 【請求項７】bFGF−22、bFGF−23およびbFGF24より成る
   群から選ばれる、マイトジェン活性を持つ少なくとも１
   つの活性部位を有するヒトbFGF−18のCTG開始される高
   分子量形態物を生産する方法であって、 （ａ） ヒトbFGF−18の高分子量形態物をコードする核
   酸配列に機能しうる状態で連結された発現調節配列を含
   むベクターで形質転換された宿主細胞を、ベクターを増
   幅させかつbFGF−18の高分子量形態物を発現させる条件
   下で培養し、 （ｂ） 培地からbFGF−18の高分子量形態物を回収し、
   そして （ｃ） bFGF−18の他の形態物を実質的に含まない発現
   されたbFGF−18の高分子量形態物を精製する、 ことを含んで成り、ただし前記の精製されたbFGF−18の
   高分子量形態物がbFGF−22、bFGF−23およびbFGF−24よ
   り成る群から選ばれるものである前記方法。