JPH05503505A

JPH05503505A - 高分子量ヒト血管形成因子

Info

Publication number: JPH05503505A
Application number: JP2501201A
Authority: JP
Inventors: フロキウィクツ，ロバート，ゼット; ソマー，アンドレアス
Original assignee: シナージェン，インコーポレーテッド
Priority date: 1988-11-07
Filing date: 1989-11-06
Publication date: 1993-06-10
Anticipated expiration: 2011-07-10
Also published as: CA2002261A1; KR920700668A; JP2515928B2; EP0444149A4; US5332804A; WO1991006568A1; EP0444149A1; AU4667589A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】高分子量ヒト血管形成因子発明の背景血管形成過程は、（１）静止内皮細胞の“活性化”、（２）基底膜および隣接組織への血管内皮細胞の侵入、（３）毛細血管形成を包含する生物学的機能の複雑な相互作用、を包含する。これらの現象は数多くの種々の血管形成因子により刺激されうる。しかしながら、血管形成因子は新しい毛細血管形成に必要な２つの重要な現象である、毛細血管内皮細胞の移動および増殖、に“インビトロ”で全く異なる作用をおよぼす。いくつかの血管形成因子は内皮細胞の移動または増殖、またはその両方を刺激する。対照的に、他は“インビトロ“で内皮細胞増殖に全く影響を及ぼさないかまたは阻害する。これらの所見は、種々の血管形成因子が、それらの標的と見られるものにより評価された場合、直接的または間接的のいずれかで働きうろことを示唆している。

ヒト塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）は“直接”血管形成因子として分類される。胎盤から精製されたヒトｂＦＧＦ分子（“胎盤ｂＦＧＦ”）は、（ａ）毛細血管内皮細胞の増殖を刺激し、（ｂ）毛細血管内皮細胞の化学走性を刺激し、そして（Ｃ）これら同じ細胞を刺激してプラスミノーゲン活性化因子および潜在性コラゲナーゼを産生ずる、ことが示された。Ｍｏ５ｃａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。

１９８６、　Ｖｏｌ、　８３．　ｐ、２０９１を参照。　“インビポ−テ、プラスミノーゲン活性化因子は酵素前駆体であるプラスミノーゲンを広い特異性を有するプロテアーゼである活性プラスミンに変換しうる。次にこのプラスミンが潜在性コラゲナーゼを活性コラゲナーゼに変換しうる。

したがって、胎盤ｂＦＧＦの影響下毛細血管内皮細胞は周辺組織中の大部分のタンパク質を分解できる２種のプロテアーゼを生成でき、このことにより内皮細胞が組織に侵入するのが可能となる。

事実、精製胎盤ｂＦＧＦタンパク質は“インビボ”で血管形成性であることが示された。上記Ｍｏ５ｃａｔｅｌ　Ｉｉ参照；　５ｑｕｉｒｅｓら、Ｊ、　Ｂｉｏ。

Ｃｈｅｍ、　、　１９８８．印刷中（１９８８年１２月り版予定）。ヒト胎盤ｂＦＧＦの単離、構造および性質は、Ｍｏ５ｃａｔｅｌｌ　ｉらの米国特許出願Ｎ（Ｌ１６３，１４２に記載されており、これは参考文献としてその全部がここにとり込まれる。

純粋な形態の血管形成性タンパク質、例えば上記した胎盤ｂＦＧＦ分子は治療上価値のある物質に開発することができる。胎盤ｂＦＧＦの生物学的性質ゆえに、このタンパク質は適切に投与された場合、創傷および骨の欠損の治癒、心臓血管損傷の修復、動脈硬化病変の修復および合成血管移植片の内皮化に有益な作用を有しつる。

また、胎盤ｂＦＧＦは神経栄養性の性質を有することが示されており、このことは種々の原因による神経障害の治療に有益であろう。

“血管形成因子”と呼ばれるいくつかのタンパク質が同定されている。これらのタンパク質の多くはヒト以外の供給源から単離された。ヒト以外の供給源から単離された血管形成因子は外来タンパク質に応答して不都合な免疫学的反応を行う可能性があるので、ヒトへの治療剤として使用するには適さないと考えられる。

ヒトｂＦＧＦタンパク質をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列はＡｂｒａｈａｍによりはじめて発表された。Ａｂｒａｈａｍら、ＥＭＢｏ、　１９８６．　Ｖ。

１．５．　ｐｐ、２５２３−２８参照。ｃＤＮＡの１個の推定上の開始メチオニンコドンの位置に基づき、これらの著者はｂＦＧＦ遺伝子産物が１５４個のアミノ酸から成るタンパク質（“ｂＦＧＦ−１８”）であろうと予測した。

しかしながらＳｏｍｍｅｒおよび共同研究者らは、ヒト胎盤から単離されたｂＦＧＦ調製物は、ＡｂｒａｈａｍらによりｂＦＧＦ　ｃＤＮＡから予測された遺伝子産物に比較して、Ｎ末端が伸長されたｂＦＧＦ種を含有することを示している。Ｓｏｍｍｅｒら、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、。

１９８７、　Ｖｏｌ、　１４４．　ｐｐ、５４３−５５０参照。

これらの知見により、未だ記載されていないヒトｂＦＧＦ血管形成因子の複数の形態の存在が示唆された。

研究のこの観点に基づき、本発明者らは、それらのキロダルトン（ｋＤ）でのおよその分子の大きさによりｂＦＧＦ−２２、ｂＦＧＦ−２３およびｂＦＧＦ−２４としてここに分類されるヒトｂＦＧＦの３種の新しい分子形態を探求し発見した。総称的に、３種の新しいタンパク質は、先に特性決定され文献に記載された約１８ｋＤの分子量のｂＦＧＦ分子（ｂＦＧＦ−１８）およびメチオニンで開始されるｂＦＧＦ−１８のＮ末端にさらに２個のアミノ酸を含有する胎盤ｂＦＧＦ種と対比して、高分子量ｂＦＧＦ　（ｈｍｗｂＦＧＦ）と呼ばれよう。

ｈｍｗｂＦＧＦは、ヒト肝癌細胞系５Ｋ−ＨＥＰ−１から単離できるものと実質的に相同であり、そしてマイトジェン活性、化学走性活性、血管形成活性、プロテアーゼ合成刺激能およびそれらの組み合わせたものから成る群から選択される活性を有する、少なくとも１つの活性部位を有する。

ｂ＋ｎｗｂＦＧＦの発見に加え、本発明者らは、インビボで非ＡＴＧコドンでタンパク質合成を開始する正常動物細胞遺伝子の最初の例も発見している。非ＡＴＧ開始は原核生物細胞遺伝子においては記載されているが、この挙動を示す動物細胞遺伝子についての先行報告はただ一つあるだけである。Ｈａｎｎら、Ｃｅ１ｌ、　１９８８．　Ｖｏｌ、　５２　ｐｐ、　１８５−１８９を参照。Ｈａｎｎはインビトロ翻訳を用いて、ｃＭＹｃプロト腫瘍遺伝子も翻訳開始に非ＡＴＧコドンを利用していると思われると報告している。

翻訳が非ＡＴＧコドンで開始される、比較的高分子量形態のｂＦＧＦの存在により、同様の高分子量種が治療上価値がある他のヒトタンパク質にも存在しうることが示唆される。これら比較的高分子量形態のタンパク質は親タンパク質と比べて同様か、増強されるかまたは新しくさえある治療上の性質を有しつる。翻訳開始が同定された推定上の（ＡＴＧ）イニシエーターより前にある非ＡＴＧコドンでも始まりうると認識することは、研究者が多くのタンパク質のより高い分子量形態物を探求することを可能にしよう。おそらく、活性タンパク質のより高い分子量形態物が、もしあるとすれば、同様の治療活性を有し、一方で未知の付加的な利益または性質も有しよう。付加されたアミノ末端ペプチドセグメントは、タンパク質の種々の活性部位を改変または遮断するのに、またはタンパク質の移動の制御を、または細胞の内部へのまたは外部へのその位置の指向を助けるのに有益でありうる。本発明はｈｍｗｂＦＧＦの詳細な例の他に、インビボで非ＡＴＧコドンからの翻訳開始により合成される治療用タンパク質の高分子量形態物を包含する。

本発明による好ましいｈｍｗｂＦＧＦ血管形成因子は以下に示されるｂＦＧＦ− １８コアアミノ酸配列を有する：Ｍ−Ａ−＾−〇−５（−Ｔ−Ｔ−Ｌ−Ｐ−人− Ｌ−Ｐ−Ｅ−Ｄ−Ｇ−Ｇ−５＜−Ａ−Ｆ−Ｐ−Ｐ−Ｇ−Ｈ−Ｆ−に−Ｄ−Ｐ−に −Ｒ−Ｌ−Ｙ−Ｃ−に−Ｈ−Ｃ−（、−Ｆ−Ｆ−Ｌ−Ｒ−Ｚ−Ｈ−Ｐ−Ｄ−Ｇ− Ｒ−Ｖ−Ｄ−Ｇ−Ｖ−Ｒ−Ｅ−に−５−Ｄ−Ｐ−Ｈ−Ｉ−ｂＦ（：、Ｆ−１８Ｋ −Ｌ−Ｑ−Ｌ−Ｑ−Ａ−Ｅ−Ｅ−Ｒ−Ｇ−Ｖ−Ｖ−５−Ｉ−に−Ｇ−Ｖ−Ｃ−Ａ −Ｎ−Ｒ−Ｙ−Ｌ−人−Ｍ−に−Ｅ−Ｄ−Ｇ−Ｒ−Ｌ−Ｌ−Ａ−５−に−Ｃ−Ｖ −Ｔ−Ｄ−Ｅ−Ｃ−Ｆ−Ｆ−Ｆ−Ｅ−Ｒ−Ｌ−Ｅ−５−Ｎ−Ｎ−Ｙ−Ｎ−Ｔ−Ｙ −Ｒ−５−Ｒ−に−Ｙ−Ｔ−５−Ｗ−Ｙ−Ｖ−Ａ−Ｌ−に−Ｒ−Ｔ−Ｇ−Ｑ−Ｙ −に−Ｌ−Ｇ−５−に−Ｔ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｑ−に−Ａ（−Ｌ−Ｆ−Ｌ−Ｐ−Ｍ− ５−Ａ−に−５゜さらに配列：Ｌ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｇ−Ｒ＜−Ｒ−人−Ｐ−Ｅ−Ｒ−Ｖ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−に−Ｒ＜− Ｒ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｐ−Ｒ−八−＾−Ｐ−Ａ−人−Ｒ−Ｇ−５−Ｒ−Ｐ−Ｇ− Ｐ−Ａｍ〇−ＴＬ−Ｐ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｌ−に−Ｇ−Ｒ−Ｇ−Ｒ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｐ −Ｅ−Ｒ−Ｖ−Ｇ−１ニーＲ−Ｇ−Ｒ−Ｇ−Ｒ−Ｇ−Ｔ−Ａ−人−Ｐ−Ｒ−人一人−Ｐ−人−人−Ｒ−Ｇ−５−Ｒ−Ｌ−Ｇ−人−Ｒ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｌ−Ｐ−Ｇ− Ｇ−Ｒ−Ｌ＜−１：、−Ｒ−Ｃ，−Ｒ＜−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｅ−Ｒ−Ｖ−Ｇ−Ｇ−Ｒ −Ｇ−Ｒ−Ｃ；−Ｒ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ａ−人−Ｐ−人一人−Ｒ−Ｇ− ５−Ｒ−Ｐ−Ｇ−Ｐ−Ａ−Ｇ−Ｔを有するペプチドがコア配列の外側にあるポリペプチド中に存在する。特に好ましいｈｍｗｂＦＧＦ血管形成因子には以下の配列があげられる：Ｌ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｇ−Ｒ−Ｇ−Ｒ−人−Ｐ−Ｅ−Ｒ−Ｖ−Ｇ−Ｇ−Ｒ＜−Ｒ−Ｇ −Ｒ−Ｇ−Ｔ−人一へ−Ｐ−Ｒ−Ａ−人−Ｐ−Ａ−Ａ−Ｒ＜−５−Ｒ−Ｐ−Ｇ− Ｐ−ＡｍＧ−Ｔ−ｂＦＧＦ−１８Ｌ−Ｐ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｌ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｇ−Ｒ−Ｇ−Ｒ−八−Ｐ−Ｅ−Ｒ−Ｖ− Ｇ−Ｃ，−Ｒ−Ｇ−Ｒ−Ｇ−Ｒ−Ｇ−Ｔ−人〜入−Ｐ−Ｒ−へ−へ−Ｐ−人−Ａ −Ｒ−Ｃ，−５−Ｒ−Ｐ−Ｇ−Ｐ−Ａｍ〇−Ｔ−ｂＦ（、Ｆ−ＬＥ＋Ｌ−Ｇ−八 −Ｒ−Ｇ−Ｒ−人−Ｌ−Ｐ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｌ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｇ−Ｒ−Ｇ−Ｒ−Ａ −Ｐ−Ｅ−Ｒ−Ｖ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｇ−Ｒ−に−Ｒ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｐ−Ｒ−＾ −八−Ｐ−Ａ−人−Ｒ−Ｇ−５−Ｒ−Ｐ−Ｇ−Ｐ−Ａ−Ｇ−Ｔ−ｂＦＧＦ−１８前記略号により示されるアミノ酸は下記好ましい態様の記載中に示される。

翻訳によりｔ＋ｍｗｂＦＧＦおよびｂＦＧＦ−１８因子を生成するためのＲＮＡの生成に用いられるｃＤＮＡクローンの関連するヌクレオチド配列は次のとおりである：ＣＧＧ　ＣＣＧ　ＡＧＣ（、ＧＣＴＣＧ　入ＧＧ　ｑ　ＧＧＧ　ＧｋＣＣＧＣＧＧＧ　ＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧ　ｑ工Ω　ＣＣＣ（、ＧＣＧｆ：、Ｇ　人ＣＧロー〇Ｇ（、ＧＧＣＣＧＧ　に（、ＣＣＧＧ　（、ＧＣＣＧＴ　ＣＣＣＣＣＣＧ入Ｇ　ＣＧＧ　ＧＴＣＧＧＡ　ＧＧＣＣＧＧ　ＧにＣＣにＧ　ＧＧＣＣＧＧ入ｃｃ　ｗ　ｃｃ入　−−−−−−−−−−−−−−−−−−−ＴＧ＾ｂＦ（、Ｆ− １８ｂＦＧＦ−１８ポリペプチドはＡＴＧ３６５て開始されるが、先に記載されるように胎盤ｂＦＧＦはＡＴＧイニシェークーにより形成されるメチオニンに２個のアミノ酸のアミノ末端伸長を有する。ヌクレオチド番号付けはｂＦＧＦ血管形成因子を発現することが同定されているｃＤＮＡクローンの最初の核酸から始まる。ｂＦＧＦ−１８因子を生ずる翻訳のためのＲＮＡを生成させるのに用いられるｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列は以下のとおりである：（本頁以下余白）Ｌ　好ましいｈｍｗｂＦＧＦはＡＴＧ３６５より前のコドンで始まる翻訳開始により生産される。特に好ましイｈｍｗｂＦＧＦハＣＴＧ２０１．　ＣＴＧ２２８オヨびＣＴＧ２４３での翻訳開始により生産される。前記略号により示されるＤ　核酸は下記好ましい態様の記載において示される。

さらに、本発明に従い、活性成分の少なくとも１つとして、ここに記載される本発明による血管形成因子を含有する医薬組成物を開示する。

前述の一般的記載および以下の詳細な記載は共に単なる例示であって、特許請求されている本発明を制限するものではない。

好ましい実施態様の記載本発明の原理は、以下の実施例と共に好ましい態様のこの詳細な記載により説明されよう。

本発明は標準的な実験室技術により単離および分離できる治療上のタンパク質に関する。特に、本発明は単離および分離されそしてウェスタンプロット分析により同定された血管形成因子に関する。好ましくは、本発明の血管形成因子はヒト肝癌細胞系５Ｋ−ＨＨＰ−１から単離できる天然型血管形成因子と実質的に相同で、免疫学的に等価であり、そしてもっとも好ましくは生物学的に等価である単一ポリペプチド鎖タンパク質である。ヒト肝癌細胞系５Ｋ−）ｆＨＰ−１は当業者によく知られ、種々の生化学供給業者から入手できるヒト細胞組織の普通に使われている株である。本明細書および請求の範囲を通して用いられている“生物学的に等価”とは、本発明の組成物が天然型血管形成因子と同じ様式であるが必ずしも同程度ではないマイトジェン性、化学走性、プロテアーゼ合成刺激、血管形成性または他の性質を有することを意味する。

以下の明細書および請求の範囲を通して用いられそして任意のタンパク質について言及する場合“実質的に相同の”とは、以前に報告され、精製された、実質的に相同の血管形成因子または治療用タンパク質組成物により示される相同度を越えた、天然型血管形成因子または治療用タンパク質に対する相同度を意味する。

好ましくは、相同度は５０％好ましくは６０％、さらに好ましくは７５％以上、特に好ましいタンパク質は天然型タンパク質と８５％または９０％以上相同である。前記した相同度は、参考文献としてここに詳細にとり込まれるＤａｙｈｏｆｆ、　Ｍ、０．　ｉｎ　Ａｔ１ａｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ａｎｄ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ、　Ｖｏｌ、５．　ｐａｇｅ　１２４　（１９７２）、　Ｎａｔｉｏｎａｌ　！３ｉｏ−ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　Ｄ、Ｃ，、に記載されているように、１００アミノ酸の鎖長中に４個のギャップを導入して整合を補助した場合に、比較すべき配列において同じアミノ酸残基と整合する、２本の配列の小さい方に存在するアミノ酸残基の％として計算される。

以下の明細書および請求の範囲を通して用いられそして任意のオリゴヌクレオチド配列について言及する場合の“実質的に相同”とは、その配列から翻訳されたタンパク質が天然型核酸配列により生産されたタンパク質と実質的に相同であるような、天然型核酸配列に対する相同度を意味する。ここに記載する本発明の血管形成因子および治療用タンパク質はヒト供給源から単離されるかまたは合成ポリペプチドである。　′合成”ポリペプチドなる用語は、実質的に精製された形態で自然界からこれまでに単離れていないアミノ酸配列を意味するものである。

この定義には、特に組換えＤＮＡ法によるかまたはインビトロで全部または一部を合成により生成されたポリペプチドが包含される。特に、以下に示される最も好ましいアミノ酸配列が１個から数個のアミノ酸で逸脱している合成ポリペプチドが意図される。

以下の明細書および請求の範囲を通して用いられている“治療用タンパク質“とは、単一ポリペプチド鎖から成り、そして疾患の治療または予防医学に有用でありうる価値ある生物学的性質を有する、任意の天然に存在するヒトタンパク質を意味する。この発明は、非ＡＴＧコドンでのインビボ翻訳開始により形成される前記治療用タンパク質の全ての高分子量形態物およびその単離法に関する。

本発明の好ましい血管形成因子はヒト肝癌細胞系５Ｋ−）ＩＥＰ−１抽出物中に発見され、初めてｂＦＧＦ−１８タンパク質からおよび互いから分離された。本出願の目的にとって、ここに開示される任意の血管形成因子について言及するのに用いられる場合の“純粋形態”または“精製された形態”とは血管形成因子でない他のヒトタンパク質を実質的に含まないことを意味する。好ましくは、本発明の血管形成因子は少なくとも５０％純粋、より好ましくは７０％純粋そしてさらにより好ましくは８０％または９０％純粋である。

本発明の血管形成因子はヒト肝癌細胞系５Ｋ−ＨＥＰ−１から、（ａｌヒト細胞系５Ｋ−ＨＥＰ−１細胞を溶解させ、（ｂｌ混合物中のタンパク性物質を分画することにより血管形成因子を単離し、（ｅ）胎盤ｂＦＧＦ免疫交差反応性を有しかつｂＦＧＦ−１８血管形成因子を全く含有しない画分を同定し、そして（ｄ）その両分を濃縮する、ことを含んでなる方法により単離できる。

好ましい態様においては５Ｋ−１（ＥＰ−１細胞を数ある中でも１％ＮＰ４０を包含する緩衝液中で溶解させる。ＮＰ４０はフェノール１モル当りエチレンオキシドを平均９モル含有するオクチルフェノール−エチレンオキシド縮金物からなる、微生物学的調製物に普通に用いられる界面活性剤であり、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙから入手できる。細胞中に存在するタンパク性物質を分画する前に、全ての核および細胞破片を遠心分離により取り除く。５Ｋ− ＨＥＰ−１細胞中に存在するタンパク性物質を当業者によく知られている慣用のクロマトグラフィー法を用いて分画する。１つの態様においては、タンパク性物質をヘパリン−セファロースアフィニティークロマトグラフィーを用いて分画し、さらにゲル電気泳動により分離する。

上記分画法によって得られた画分を胎盤ｂＦＧＦ免疫交差反応性に関してスクリーンする。ゲル電気泳動を利用する場合は、電気泳動は１２％５ＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）を用いて実施し、そしてタンパク質をニトロセルロースにウェスタンプロットして抗胎盤ＦＧＦ抗体で検出する。

この方法により、ｈｍｗｂＦＧＦが互いから、およびｂＦＧＦ−１８因子から分離でき、そして抗胎盤ＦＧＦ抗体と反応する２２ｋＤ、２３ｋＤ、および２４ｋＤ分子量タンパク質の存在が示される。

本発明者らは、精製された形態の、そして血管形成因子でないヒトタンパク質を実質的に含まない形態のｈｍｗｂＦＧＦをはじめて同定し単離した。ヘパリン− セファロースクロマトグラフィーおよびゲル電気泳動によるタンパク質の単離および分離は、ｈｍｗｂＦＧＦの配列を確立するのに欠くことのでない段階であった。この情報は、上記ｃＤＮＡの一次構造の知識および非ＡＴＧ翻訳イニシェーターの存在を確立する実験と一緒になって、本発明者らが各ｈｍｗｂＦＧＦの配列を確立するのを可能にした。

本発明の好ましい血管形成因子として特定される構造はｃＤＮＡヌクレオチド配列の既知の構造から推測することにより決定される。

しかしながら、示されるアミノ酸配列への翻訳後修飾が行われる可能性はかなり高い。はじめに翻訳されたタンパク質に翻訳後修飾が存在することは、ヒト肝癌細胞系５Ｋ−１（ＥＰ−１から単離できるｈｍｗｂＦＧＦタンパク質が以下に示す配列と実質的に相同であるが、かならずしも同一ではないことを意味する。

本発明のｈｍｗｂＦＧＦ血管形成因子は下記ｂＦＧＦ−１８コア配列を有する：と−人−Ａ−Ｇ−５−ニー’Ｊ’−Ｔ−Ｌ−Ｐ−人−Ｌ−Ｐ−Ｅ−Ｄ−Ｇ−Ｇ− ５＜−人−Ｆ−Ｐ−Ｐ−Ｇ−Ｈ−Ｆ−に−Ｄ−Ｐ−に−Ｒ−Ｌ−Ｙ−Ｃ−に−Ｎ −Ｇ−Ｇ−Ｆ−Ｆ−Ｌ−Ｒ−ニー）１−Ｐ−０−Ｇ−Ｒ−Ｖ−Ｄ−Ｇ−Ｖ−Ｒ− Ｅ−に−５−Ｄ−Ｐ−Ｈ−ニーｂＦＧＦ−１８Ｋ−Ｌ−Ｑ−Ｌ−Ｑ−人−Ｅ−Ｅ −Ｒ−Ｇ−Ｖ−Ｖ−５−Ｉ−に−Ｇ−Ｖ−Ｃ−人−Ｎ−Ｒ−Ｙ−Ｌ−人−Ｍ−に −Ｅ−Ｄ−Ｇ−Ｒ−Ｌ−Ｌ−人−５−に−Ｃ−Ｖ−Ｔ−Ｃ）−Ｅ−Ｃ−Ｆ−Ｐ− Ｆ−ε−Ｒ−ｒ、−Ｅ−５−Ｎ−Ｎ−Ｙ−Ｎ−Ｔ−Ｙ−Ｒ−Ｓ−Ｒ−に−Ｙ−Ｔ −５−Ｗ−Ｙ−Ｖ−人−Ｌ−に−Ｒ−Ｔ−Ｇ−Ｑ−Ｙ−に−Ｌ−Ｇ−５−に−Ｔ −Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｑ−に−人−ニーＬ−Ｆ−Ｌ−Ｐ−Ｍ−５−Ａ−に−５゜さらに、配列：Ｌ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｇ−Ｒ−Ｇ−Ｒ−人−Ｐ−Ｅ−Ｒ−Ｖ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｇ−Ｒ− Ｇ−Ｒ−Ｇ−Ｔ−へ一人−Ｐ−Ｒ−人−Ａ−Ｐ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｇ−５−Ｒ−Ｐ− Ｇ−Ｐ−Ａ−Ｇ−ＴＬ−Ｐ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｌ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｇ−Ｒ−Ｇ−Ｒ−Ａ −Ｐ−Ｅ−Ｒ−Ｖ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｇ−Ｒ−Ｇ−Ｒ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｐ−Ｒ−人一人−Ｐ−Ａ−人−Ｒ−（、−５−Ｒ−Ｐ−Ｇ−Ｐ−Ａ−Ｇ−ＴＬ−Ｇ−Ａ−Ｒ−（１，−Ｒ−Ａ−Ｌ−Ｐ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｌ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｇ− Ｒ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｅ−Ｒ−Ｖ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｇ−Ｒ−Ｇ−Ｒ−Ｇ−Ｔ−Ａ− 八−Ｐ−Ｒ−Ａ−ＡｍＰ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｇ−５−Ｒ−Ｐ−Ｇ−Ｐ−Ａｍ〇−Ｔを有するペプチドがコア配列のアミノ末端に存在する。特に好ましいｈｍｗｂＦＧＦ血管形成因子は下記配列を有する：（本頁以下余白）Ｄ−２２Ｌ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｇ−Ｒ−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｅ−Ｒ−Ｖ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｇ−Ｒ− Ｇ−Ｒ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｐ−Ｒ−Ａ−Ａ−Ｐ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｇ−５−Ｒ−Ｐ− Ｇ−Ｐ−Ａ−Ｇ−Ｌ−Ｐ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｌ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｇ−Ｒ−Ｇ−Ｒ−Ａ− Ｐ−Ｅ−Ｒ−Ｖ＜−Ｇ−Ｒ−Ｇ−Ｒ−Ｇ−Ｒ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｐ−Ｒ−人−＾ −Ｐ−人一人−Ｒ−Ｇ−５−Ｒ−Ｐ−Ｇ−Ｐ−人〜〇−Ｔ−ｂＦＧＦ−１８Ｌ− Ｇ−人−Ｒ−Ｇ−Ｒ−人−Ｌ−Ｐ−Ｇ−に−Ｒ−Ｌ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｇ−Ｒ−Ｇ− Ｒ−Ａ−Ｐ−Ｅ−Ｒ−Ｖ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｇ−Ｒ−Ｇ−Ｒ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｐ− Ｒ−人一人−Ｐ−Ａ−人−Ｒ−Ｇ−５−Ｒ−Ｐ−Ｇ−Ｐ−＾−Ｇ−Ｔ−ｂＦＧＦ〜１８前記略号は例えばＢｉｏｃｈｅｍｓｔｒｙ　ｂｙ　Ａ、　Ｌ、　Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、第２版、Ｗｏｒｔｈ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９７５）、ｐ、７２に記載されるアミノ酸残基の標準略号に相当する。

本発明のｈｍＷｂＦＧＦ血管形成因子はまた、組換えＤＮＡ法によりｆａ）ｈｍｗｂＦＧＦの最終翻訳物をコードするＤＮＡ配列を単離し、（ｂ）このＤＮＡ配列を宿主微生物で発現可能なベクターに挿入し、（ｅ＞所望のｐＮＡ配列を含有するベクターをタンパク質を発現しうる宿主生物にトランスフェクションさせ、（ｄ）トランスフェクションされた生物からｈｍｗｂＦＧＦ血管形成因子を発現させ、そして（ｅ）任意の順序で、所望のタンパク質を単離および精製する、ことを含んでなる方法により生産され、そして精製された形態で単離され得る。

好ましい態様においては、宿主生物はＣＯ３−１細胞であり、そして利用されるベクターはｐＪｃ１１９である。これらは当業者によく知られている普通に用いられる生物学的物質であり、種々の生化学供給業者から入手できる。さらに、ＤＮＡは下記：ＴＧＴ　ＴＴＣ’ｒ’ＩＴ　ＴＴＴ　ＧＡＡ　ＣＧＡ　ＴＴＧ　（ＡＡ　ＴＣＴ　ＡＡＴＡＴＧ　ＴＡＣＡＡＴ　ＡＣＴ　ＴＡＣ（（、Ｇ　ＴＧＡ　＾ＣＣ，ＡＡＡ　ＴＡＣＡＣＣＡＣＴ　ＴＧＧ　ＴＡＴ　ＧＴＧ　ＧＣＡ　ＣＴＧ　入ＡＡ　（Ｇλ　八ＣＴＧＧＧ　ＣＡＧ　ＴＡＴ　ＡＡＡ　ＣＴＴ　Ｃ，（１，Ａ　ＴＣＣ入人Ａ　ＡＣＡ　ＧＧＡＣＣＴ　Ｇｌｌ　ＣＡＧ　ＡＡＡ　ＧＣＴ　ＡＴＡ　ＣＴＴ　ＴＴＴ　ＣＴＴ　ＣＣＡＡＴＧ　ＴＣＴ　ＧＣＴ　入＾Ｇ　ＡＧＣＴＧＡ　ＴＴＴ　Ｔ五人と同じかまたは実質的に相同のオリゴヌクレオチド配列を含有する。

本発明者らは、提案された開始部位で改変された核酸配列を合成することにより非ＡＴＧコドンでの翻訳開始を確立した。ｈｍｗｂＦＧＦおよびｂＦＧＦ−１８タンパク質を翻訳する天然に存在するセグメントと他の全ての点においては同一であるが、１個の核酸が１個の異なる核酸で置換されたオリゴヌクレオチド配列を合成することにより、その核酸が存在する３核酸コドンは異なるアミノ酸に翻訳されよう。もし改変されたコドンが翻訳イニシエーターコドンでない場合、一般にその核酸セグメントは天然のタンパク質と同一であるが、１個のアミノ酸が異なるタンパク質（またはこの場合はタンパク質類）を依然として生産しよう。

しかしながら、もしイニシエーターコドンが改変されれば翻訳はその部位からは起らないであろう。本発明の発明者らがｂＦＧＦ血管形成因子の活性高分子量形態物を生ずる非ＡＴＧイニシエーターの存在を確立したのはこれらの方法によってである。

ＩｕｎｉｂＦＧＦおよびｂＦＧＦ−１８因子を生成するオリゴヌクレオチド構造は次のとおりである・ＧＧＧ　ＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＧ　ｆ；：５　ＣＣＧ　ＣＧＣＧＧＧ　ＡＧＧＡＣＣ島ＧＣＡ　−−−−−−−−−−−−−−−−−−−ＴＧＡｂＦＧＦ−１８ここで用いられている略号は例えばＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｂｙ　Ａ、　Ｌ、　Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、第２版、Ｗｏｒｔｈ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９７５）、　ｐａｇｅｓ　３１０−３１８に示される核酸の省略記号に相当する。

“遮断”イニシエーター法を使用することにより、本発明の発明者らはｈｍｗｂＦＧＦがｂＦＧＦ−１８タンパク質と実質的に同じマイトンエン活性を有することを示すこともできた。ＡＴＧ−３６５コドンを変えて、本発明者らはｂＦＧ　Ｆ−１８の生産を遮断しモしてｂＦＧＦ−１８を含まないｈｍｗｂＦＧＦを得た。相対的濃度に基づいた比較マイトジェン活性研究では、ｈｍｗｂＦＧＦがｂＦＧＦ−１８と非常に類似したマイトジェン活性を有することが示された。もちろん、この実験で研究されたｈｍｗｂＦＧＦはｂＦＧＦ−１８開始部位のメチオニンがアミノ酸置換されているので、最も好ましい構造の相同物である。

本発明の発明者らは“フレームシフトした″ｃＤＮＡオリゴヌクレオチドセグメントを合成し翻訳することにより、ｈｍｗｂＦＧＦのマイトジェン活性がｂＦＧＦ−１８タンパク質のそれと均等であることも確立している。基本的なりＦＧＦ −１８タンパク質を翻訳するセグメントの直前の核酸配列中に１個の付加的な核酸を加え入れるだけで、それに続く全てのコドンに存在する３アミノ酸組み合せ物がシフトする。かかる“フレームシフト”は追加した核酸がｃＤＮＡに加わる地点で、オリゴヌクレオチドから翻訳されるタンノずり質を変える。この方法を通して、本発明の発明者らはｈｍｗｂＦＧＦのマイトジェン活性部位がｂＦＧＦ −１８タンパク質のそれと実質的に等しいことを示すことができた。

本発明の高分子量治療用タンパク質は、それぞれの治療用タンパク質の治療目的と同様の治療目的が意図される。特に、本発明の血管形成因子およびここで開示されている類似物はマイトジェン性、化学走性、神経栄養性または血管形成性質またはプロテアーゼ合成刺激能を有する医薬製剤の形態でヒトおよび家畜用途が意図される。活性成分の少なくとも１種として本発明の血管形成因子のひとつを含有する医薬製剤が期待されている。この製剤はまた意図される剤形の如何に応じ適切な製剤上受容できる担体、希釈剤、充填剤、結合剤および他の賦形剤をも含有しよう。経口投与には、消化管での活性タンパク質の分解を阻止するための処置がとられねばならない。したがって腸溶剤形が経口投与に好適なひとつの形態として意図される。もし非経口投与が選択される場合は、製剤は水または食塩溶液または他の製剤上受容できる懸濁剤を含有しつる。一般に、非経口投与が意図される製剤は製剤全体を体液と等張にするのに十分な濃度の塩化ナトリウムまたはグリセロールを含有することが好ましいであろう。本発明の血管形成因子を含有する医薬製剤は創傷、外科的切開または皮膚潰瘍の治療に注射または外用により局所的に投与されることも意図される。さらに、心筋梗塞後の心臓への血液供給を再生するためには血管形成因子を徐放性インブラント装置中に組み込んだものを投与することが意図される。

上記障害の治療に適切な用量を決定するのに必要な、そして上記放出法での使用に適切な計算は特に標準的アッセイおよびここで開示されたアッセイに照らして当業者により日常的になされ、過度の実験なしに彼らにより日常的に行なわれる仕事の範囲内にある。これらの用量は適切な用量一応答データに関連して利用される用量を決定するための確立されたアッセイを用いることにより確認できる。

本発明の教示を特定の問題または環境に適用することは、ここに含有される教示に照らして当業者の能力の範囲内であることか理解される。本発明の産物の例およびそれらの単離、同定および製造の代表的過程は以下の実施例に示される。

実施例１ヒト肝癌細胞系５Ｋ−ＨＥＰ−１からのｈｍｗｂＦＧＦの精製ヒト肝癌５Ｋ−ＨＥＰ−１細胞を、４００ｍＭ　ＮａＣ１，１μＭ　ＭａＣＩ、　５０ｍＭ　トリスｐＨ７，５，１％ＮＰ４０およびｌμＭ　ＰＭＳＦ　（フェニルメチルスルホニルフルオライド）を含有する緩衝液中で溶解させた。核および細胞層を遠心分離により取り除き、続いて細胞抽出物をＭＯＳＣａｔｅｌｌｉ　（上記（参考文献としてここにとり込まれる））に記載されるようにしてヘパリン−セファロース（Ｈ３）でクロマトグラフィーした。３Ｍ　ＮａＣｌ　Ｈ３溶出物はｈｍｗｂＦＧＦを含有していた。標準手順に従い、集めた両分を１２％５ＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、そしてニトロセルロースへのウェスタンブロッティングに続きＳｚｅｗｃｂｙｋらＡｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈ、　１９８５．　Ｖｏｌ、１５０．　ｐｇｓ　４０３−４０７　（参考文献としてここにとり込まれる）に記載されるようにして指示されるアフィニティー精製抗ＦＧＦ抗体を用いて分析した。この方法により　ｂＦＧＦ−１８血管形成因子の他に分子量２２ｋＤ、２３ｋＤおよび２４ｋＤに相当する３個の別々のｈｍｗｂＦＧＦタンパク質の存在が示された。

実施例２天然に存在するｂＦＧＦ　ｃＤＮＡから転写されたＲＮＡのインビトロ翻訳ＲＮＡ依存インビトロ翻訳をＰｅｌｈａｍらＦｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１９７６゜Ｖｏｌ、６７、　ｐａｇｅ２４７（参考文献としてここにとり込まれる）に記載される方法により３Ｓ３−メチオニンの存在下小麦胚抽出物中で行い、それに続く免疫沈降反応をＦｌｏｒｋｉｅｗｉｃｚら、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　１９８３、　Ｖｏｌ、　９７．ｐａｇｅｓ１３８１−１３８８　（参考文献としてここにとり込まれる）に記載されているようにして行った。免疫沈降した試料をプロティン−Ａセファロースで溶出し、１２％５ＤＳ−ＰＡＧＥで分解しそしてフルオログラフィーで可視化した。ここでも分子量１８．２２．２３、および２４ｋＤのタンパク質が検出された。この方法により血管形成因子でないヒトタンパク質を実質的に含まないｈｍｗｂＦＧＦが得２０１位（ＣＴＧからＣＴＴ）および３６５（ＡＴＧからＧＣＴ）での特定部位のオリゴヌクレオチド突然変異を、Ｋｕｎｋｅｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ。

１９８７、　Ｖｏｌ、１５４．　ｐｐ、３６７−３８２（参考文献としてここにとり込まれる）に記載される方法に従いＢｉｏｒａｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅキットを用いてｂＦＧＦ　ｃＤＮＡクローンに導入した。２４３位（ＣＴＧからＣＴＴ）での突然変異を含有する核酸配列はヌクレオチド１９２のＸｈｏ１部位とヌクレオチド３５３のＡｐａ１部位との間のＤＮＡフラグメント（４本の重複する合成オリゴヌクレオチドを用いて）を再合成することにより得た。

ハイブリッド発現ベクターｐＪｃ１１９内に含有される突然変異したｃＤＮＡをＭａｃｈａｍｅｒら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏ、、１９８５．　Ｖｏｌ、５．　１）ｌ）、３０７４−３０８３（参考文献としてここにとり込まれる）に記載されるようにしてＣＯ３−１細胞にトランスフェクションさせた。トランスフェクションして４０−４８時間後に、細胞を実施例１記載のようにして溶解させ、抽出物を４℃で２時間Ｈ５とインキュベートした。ＨＳＳリレントを０．５Ｍ　ＮａＣ１および２０ｍＭ　）リスｐＨ７，５を含有する緩衝液で、続いてＩ　Ｍ　ＮａＣｌおよび２０ｍＭ　）リス　ｐＨ７，５緩衝液で３回洗浄した。

次にペレットを３ＭＮａＣ！緩衝液で溶出し、溶出物を５Ｏ５−ＰＡＧＥおよびアフィニティー精製抗ｂＦＧＦ抗体を用いるウェスタンプロットで分析した。

これら突然変異させたオリゴヌクレオチドから生ずる翻訳により、前記実施例１に記載されるようにして単離され同定されたタンパク質が生成された。２０１位で突然変異したオリゴヌクレオチドはｂＦＧＦ−１８、ｂＦＧＦ−２２、およびｂＦＧＦ−２３を生産した。２４３位に突然変異のあるオリゴヌクレオチドはｂＦＧＦ−１８、ｂＦＧＦ−２３およびｂＦＦＧＦ−２４を生産した。そして最後に、３６５位に突然変異のあるオリゴヌクレオチドはｂＦＧＦを含まない３種の全てのｈｍｗｂＦＧＦ、つまりｂＦＧＦ−２２、ｂＦＧＦ−２３およびｂＦＧＦ −２４を生じた。

実施例４マイトジェン活性部位を決定するためのｂＦＧＦクローンのフレームシフト突然変異３５３位と３５４位（唯一のＡｐａ１部位）の間に１個の核酸を効果的に追加するフレームシフト突然変異を、標準操作に従いｂＦＧＦ　ｃＤＮＡクローンをオリゴヌクレオチド５’　ＧＧＣＣＴＣＴＡＧＡＧＣＣＧＧＣＣ３’で処理することにより実施する。このオリゴヌクレオチドの翻訳産物を、前記実施例３に記載のようにしてクローンをＣＯ３−１細胞にトランスフェクションさせることにより観察し、生じたタンパク質を実施例１記載のようにして分析した。この突然変異した配列の翻訳からは抗ｂＦＧＦ抗体に反応するタンパク質は全く検出されなかった。

実施例３記載のようにして調製され、そして天然に存在するｂＦＧＦ　ｃＤＮＡおよび３６５位で突然変異したオリゴヌクレオチドでトランスフェクションされた細胞からの溶解物を含有するＨＳペレットを、３ＭＮａＣｌを含有する緩衝液で溶出した。これら溶出物の一部分をＰｒｅｓ　ｔａら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、　１９８６．　Ｖｏｌ、６．　ｐｐ、４０６０−４０６６（ここに参考文献としてとり込まれる）に記載される３Ｔ３細胞マイトジエン性アツセイで直接アッセイし、３Ｈ−チミジンのＴＣＡ沈降可能カウントへのとり込みを測定した。この実験の結果は、ｈｍｗｂＦＧＦがｂＦＧＦ血管形成因子とほとんど同一のマイトジェン性質を有することを示した。これらの試料の定量的ウェスタンプロット分析では３ＭＮａＣ１溶出物中に１　ｎｇ／μｌのｂＦＧＦ濃度が示された。

手続補正書平成５年２月２２日

Claims

【特許請求の範囲】

１．少なくとも１つの活性部位を有する単一ポリペプチド鎖タンパク質を含む治療用タンパク質の高分子量形態物であって、ここで該タンパク質のそれぞれは一部分に該治療用タンパク質のアミノ酸配列を含むものである、高分子量形態物。
２．前記タンパク質が非ＡＴＧコドンからの翻訳開始によりインビボで合成される、請求の範囲１記載の治療用タンパク質の高分子量形態物。
３．ヒト肝癌細胞系ＳＫ−ＨＥＰ−１から単離できるヒトｂＦＧＦ−１８血管形成因子の天然型高分子量形態物との実質的相同性を示す、精製されたヒトまたは合成の単一ポリペプチド鎖タンパク質を含むヒトｂＦＧＦ−１８血管形成因子の該高分子量形態物であって、ここでヒトｂＦＧＦ−１８血管形成因子の該高分子量形態物のそれぞれは、血管形成活性、マイトジェン活性、化学走性活性、神経栄養活性、プロテアーゼ合成刺激能、およびそれらの組合せからなる群から選択される活性を有する少なくとも１つの活性部位を有するものである、高分子量形態物。
４．それぞれがマイトジェン性、血管形成性、神経栄養性および化学走性活性およびプロテアーゼ合成刺激能を有する少なくとも１つの活性部位を有する精製された単一ポリペプチド鎖タンパク質を含むヒトｂＦＧＦ血管形成因子の高分子量形態物であって、ここで該タンパク質はヒト肝癌細胞系ＳＫ−ＨＥＰ−１から単離できるヒトｂＦＧＦ−１８血管形成因子の天然型高分子量形態物と実質的な相同性を示すものである、高分子量形態物。
５．前記形態物がマイトジェン活性を有する少なくとも１つの活性部位を有する、請求の範囲３記載のヒトｂＦＧＦ−１８血管形成因子の高分子量系形態物。
６．前記形態物がヒト肝癌細胞系ＳＫ−ＨＥＰ−１から実質的に精製された形態で単離される、請求の範囲３記載のヒトｂＦＧＦ−１８血管形成因子の高分子量形態物。
７．それぞれがマイトジェン活性を有する少なくとも１つの活性部位を有する、精製された単一ポリペプチド鎖タンパク質を含むヒトｂＦＧＦ−１８血管形成因子の高分子量形態物であって、ここで該タンパク質のそれぞれは下記アミノ酸配列：【配列があります】を一部分に含むものである、高分子量形態物。
８．前記タンパク質が、【配列があります】【配列があります】【配列があります】から成る群から選択されるアミノ酸配列を一部分に含む、請求の範囲７記載のヒトｂＦＧＦ−１８血管形成因子の高分子量形態物。
９．タンパク質のアミノ酸配列が請求の範囲８記載の配列と２アミノ酸残基だけ異なる、ヒトｂＦＧＦ−１８血管形成因子の高分子量形態物。
１０．タンパク質のアミノ酸配列が請求項８記載の配列と６アミノ酸残基だけ異なる、ヒトｂＦＧＦ−１８血管形成因子の高分子量形態物。
１１．翻訳後修飾がアミノ酸配列に対してなされている、請求の範囲８記載のヒトｂＦＧＦ−１８血管形成因子の高分子量形態物。
１２．マイトジェン活性を有する少なくとも１つの活性部位を有する精製された単一ポリペプチド鎖タンパク質を含む血管形成因子であって、該タンパク質は非ＡＴＧコドンの翻訳開始によりインビボで合成されるものである、血管形成因子。
１３．前記タンパク質のそれぞれがアミノ酸配列：【配列があります】を一部分に含む、請求の範囲１２記載の血管形成因子。
１４．前記タンパク質のそれぞれが、【配列があります】から成る群から選択されるアミノ酸配列を一部分に含む、請求の範囲１３記載の血管形成因子。
１５．組織から純粋な形態で治療用タンパク質の高分子量形態物を得る方法であって、（ａ）該形態物を産生できる組織を集め、（ｂ）組織中のタンパク性物質を分画することにより組織から該形態物を単離し、（ｃ）治療活性に関わる画分を同定し、（ｄ）該形態物を含有する該画分を該治療用タンパク質を含有する画分から分離し、そして（ｅ）該形態物を含有する画分を濃縮する、ことを含んでなる方法。
１６．組織からヒトｂＦＧＦ−１８血管形成因子の高分子量形態物を得る方法であって、（ａ）該形態物を産生できる組織を集め、（ｂ）組織中のタンパク性物質を分画することにより該形態物を単離し、（ｃ）血管形成因子活性を有し、ヒトｂＦＧＦ−１８血管形成因子を全く含有しない画分を同定し、そして（ｄ）該画分を濃縮する、ことを含んでなり、ここで該画分はマイトジェン活性、化学走性活性、神経栄養活性、血管形成活性、プロテアーゼ合成刺激能、およびそれらの組み合せから成る群から選択される活性を有する少なくとも１つの活性部位を有する該形態物を含有しており、かつヒト肝癌細胞系ＳＫ−ＨＥＰ−１から単離できるヒトｂＦＧＦ−１８血管形成因子の天然型高分子量形態物と実質的相同性を示す単一ポリペプチド鎖タンパク質を含むものである、方法。
１７．前記形態物を産生できる組織がヒト肝癌細胞系ＳＫ−ＨＥＰ−１である、請求の範囲１６記載の方法。
１８．ヒト肝癌細胞系ＳＫ−ＨＥＰ−１から単離できるヒトｂＦＧＦ−１８血管形成因子の天然型高分子量形態物と実質的な相同性を示す精製された単一ポリペプチド鎖を含み、かつマイトジェン活性、化学走性活性、血管形成活性、神経栄養活性、プロテアーゼ合成刺激能、およびそれらの組み合せからなる群から選択される活性を有する少なくとも１つの活性部位を有する、ヒトｂＦＧＦ−１８血管形成因子の高分子量形態物を生産する方法であって、（ａ）該形態物をコードするＤＮＡ配列を単離し、（ｂ）このＤＮＡ配列を宿主生物において発現可能なベクターに挿入し、（ｃ）該形態物を発現しうる宿主生物に前記ＤＮＡ配列を含有するベクターをトランスフェクションさせ、（ｄ）トランスフェクションされた生物から該形態物を発現させ、そして（ｅ）任意の順序で、ヒトｂＦＧＦ−１８血管形成因子の発現された高分子量形態物を単離し、精製する、ことを含んでなる方法。
１９．宿主生物がｐＪＣ１１９でトランスフェクションされる、請求の範囲１８記載の方法。
２０．宿主生物がＣＯＳ−Ｉ細胞である、請求の範囲１８記載の方法。
２１．前記ＤＮＡ配列がアミノ酸配列：【配列があります】を含有するタンパク質をコードする、請求の範囲１８記載の方法。
２２．前記ＤＮＡ配列が【配列があります】【配列があります】【配列があります】から成る群から選択されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする、請求の範囲１９記載の方法。
２３．前記ＤＮＡ配列が下記：【配列があります】と同じかまたは実質的に相同である核酸配列を含有する、請求の範囲１８記載の方法。
２４．ｂＦＧＦ−２２、ｂＦＧＦ−２３およびｂＦＧＦ−２４より成る群から選ばれる、マイトジェン活性を有する少なくとも１つの活性部位を有するヒトｂＦＧＦ−１８のＣＴＧ開始される高分子量形態物を生産する方法であって、（ａ）ヒトｂＦＧＦ−１８の高分子量形態物をコードする核酸配列に機能しうる状態で連結された発現調節配列を含むベクターで形質転換された宿主細胞を、ベクターを増幅させかつｂＦＧＦ−１８の高分子量形態物を発現させる条件下で培養し、（ｂ）培地からｂＦＧＦ−１８の高分子量形態物を回収し、そして（ｃ）ｂＦＧＦ−１８の他の形態物を実質的に含まない発現されたｂＦＧＦ−１８の高分子量形態物を精製する、ことを含んで成り、ただし前記の精製されたｂＦＧＦ−１８の高分子量形態物がｂＦＧＦ−２２、ｂＦＧＦ−２３およびｂＦＧＦ−２４より成る群から選ばれるものである、上記方法。