JPH05503505A - 高分子量ヒト血管形成因子 - Google Patents
高分子量ヒト血管形成因子Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
高分子量ヒト血管形成因子
発明の背景
血管形成過程は、(1)静止内皮細胞の“活性化”、(2)基底膜および隣接組
織への血管内皮細胞の侵入、(3)毛細血管形成を包含する生物学的機能の複雑
な相互作用、を包含する。これらの現象は数多くの種々の血管形成因子により刺
激されうる。しかしながら、血管形成因子は新しい毛細血管形成に必要な2つの
重要な現象である、毛細血管内皮細胞の移動および増殖、に“インビトロ”で全
く異なる作用をおよぼす。いくつかの血管形成因子は内皮細胞の移動または増殖
、またはその両方を刺激する。対照的に、他は“インビトロ“で内皮細胞増殖に
全く影響を及ぼさないかまたは阻害する。これらの所見は、種々の血管形成因子
が、それらの標的と見られるものにより評価された場合、直接的または間接的の
いずれかで働きうろことを示唆している。
ヒト塩基性繊維芽細胞成長因子(bFGF)は“直接”血管形成因子として分類
される。胎盤から精製されたヒトbFGF分子(“胎盤bFGF”)は、(a)
毛細血管内皮細胞の増殖を刺激し、(b)毛細血管内皮細胞の化学走性を刺激し
、そして(C)これら同じ細胞を刺激してプラスミノーゲン活性化因子および潜
在性コラゲナーゼを産生ずる、ことが示された。Mo5catelliら、Pr
oc、 Natl、 Acad、 Sci、 USA。
1986、 Vol、 83. p、2091を参照。 “インビポ−テ、プラ
スミノーゲン活性化因子は酵素前駆体であるプラスミノーゲンを広い特異性を有
するプロテアーゼである活性プラスミンに変換しうる。次にこのプラスミンが潜
在性コラゲナーゼを活性コラゲナーゼに変換しうる。
したがって、胎盤bFGFの影響下毛細血管内皮細胞は周辺組織中の大部分のタ
ンパク質を分解できる2種のプロテアーゼを生成でき、このことにより内皮細胞
が組織に侵入するのが可能となる。
事実、精製胎盤bFGFタンパク質は“インビボ”で血管形成性であることが示
された。上記Mo5catel Ii参照; 5quiresら、J、 Bio
。
Chem、 、 1988.印刷中(1988年12月り版予定)。ヒト胎盤b
FGFの単離、構造および性質は、Mo5catell iらの米国特許出願N
(L163,142に記載されており、これは参考文献としてその全部がここに
とり込まれる。
純粋な形態の血管形成性タンパク質、例えば上記した胎盤bFGF分子は治療上
価値のある物質に開発することができる。胎盤bFGFの生物学的性質ゆえに、
このタンパク質は適切に投与された場合、創傷および骨の欠損の治癒、心臓血管
損傷の修復、動脈硬化病変の修復および合成血管移植片の内皮化に有益な作用を
有しつる。
また、胎盤bFGFは神経栄養性の性質を有することが示されており、このこと
は種々の原因による神経障害の治療に有益であろう。
“血管形成因子”と呼ばれるいくつかのタンパク質が同定されている。これらの
タンパク質の多くはヒト以外の供給源から単離された。ヒト以外の供給源から単
離された血管形成因子は外来タンパク質に応答して不都合な免疫学的反応を行う
可能性があるので、ヒトへの治療剤として使用するには適さないと考えられる。
ヒトbFGFタンパク質をコードするcDNAのヌクレオチド配列はAbrah
amによりはじめて発表された。Abrahamら、EMBo、 1986.
V。
1.5. pp、2523−28参照。cDNAの1個の推定上の開始メチオニ
ンコドンの位置に基づき、これらの著者はbFGF遺伝子産物が154個のアミ
ノ酸から成るタンパク質(“bFGF−18”)であろうと予測した。
しかしながらSommerおよび共同研究者らは、ヒト胎盤から単離されたbF
GF調製物は、AbrahamらによりbFGF cDNAから予測された遺伝
子産物に比較して、N末端が伸長されたbFGF種を含有することを示している
。Sommerら、 Biochem、 Biophys、 Res、 Com
mun、。
1987、 Vol、 144. pp、543−550参照。
これらの知見により、未だ記載されていないヒトbFGF血管形成因子の複数の
形態の存在が示唆された。
研究のこの観点に基づき、本発明者らは、それらのキロダルトン(kD)でのお
よその分子の大きさによりbFGF−22、bFGF−23およびbFGF−2
4としてここに分類されるヒトbFGFの3種の新しい分子形態を探求し発見し
た。総称的に、3種の新しいタンパク質は、先に特性決定され文献に記載された
約18kDの分子量のbFGF分子(bFGF−18)およびメチオニンで開始
されるbFGF−18のN末端にさらに2個のアミノ酸を含有する胎盤bFGF
種と対比して、高分子量bFGF (hmwbFGF)と呼ばれよう。
hmwbFGFは、ヒト肝癌細胞系5K−HEP−1から単離できるものと実質
的に相同であり、そしてマイトジェン活性、化学走性活性、血管形成活性、プロ
テアーゼ合成刺激能およびそれらの組み合わせたものから成る群から選択される
活性を有する、少なくとも1つの活性部位を有する。
b+nwbFGFの発見に加え、本発明者らは、インビボで非ATGコドンでタ
ンパク質合成を開始する正常動物細胞遺伝子の最初の例も発見している。非AT
G開始は原核生物細胞遺伝子においては記載されているが、この挙動を示す動物
細胞遺伝子についての先行報告はただ一つあるだけである。Hannら、Ce1
l、 1988. Vol、 52 pp、 185−189を参照。Hann
はインビトロ翻訳を用いて、cMYcプロト腫瘍遺伝子も翻訳開始に非ATGコ
ドンを利用していると思われると報告している。
翻訳が非ATGコドンで開始される、比較的高分子量形態のbFGFの存在によ
り、同様の高分子量種が治療上価値がある他のヒトタンパク質にも存在しうるこ
とが示唆される。これら比較的高分子量形態のタンパク質は親タンパク質と比べ
て同様か、増強されるかまたは新しくさえある治療上の性質を有しつる。翻訳開
始が同定された推定上の(ATG)イニシエーターより前にある非ATGコドン
でも始まりうると認識することは、研究者が多くのタンパク質のより高い分子量
形態物を探求することを可能にしよう。おそらく、活性タンパク質のより高い分
子量形態物が、もしあるとすれば、同様の治療活性を有し、一方で未知の付加的
な利益または性質も有しよう。付加されたアミノ末端ペプチドセグメントは、タ
ンパク質の種々の活性部位を改変または遮断するのに、またはタンパク質の移動
の制御を、または細胞の内部へのまたは外部へのその位置の指向を助けるのに有
益でありうる。本発明はhmwbFGFの詳細な例の他に、インビボで非ATG
コドンからの翻訳開始により合成される治療用タンパク質の高分子量形態物を包
含する。
本発明による好ましいhmwbFGF血管形成因子は以下に示されるbFGF−
18コアアミノ酸配列を有する:M−A−^−〇−5(−T−T−L−P−人−
L−P−E−D−G−G−5<−A−F−P−P−G−H−F−に−D−P−に
−R−L−Y−C−に−H−C−(、−F−F−L−R−Z−H−P−D−G−
R−V−D−G−V−R−E−に−5−D−P−H−I−bF(:、F−18K
−L−Q−L−Q−A−E−E−R−G−V−V−5−I−に−G−V−C−A
−N−R−Y−L−人−M−に−E−D−G−R−L−L−A−5−に−C−V
−T−D−E−C−F−F−F−E−R−L−E−5−N−N−Y−N−T−Y
−R−5−R−に−Y−T−5−W−Y−V−A−L−に−R−T−G−Q−Y
−に−L−G−5−に−T−G−P−G−Q−に−A(−L−F−L−P−M−
5−A−に−5゜さらに配列:
L−G−G−R−G−R<−R−人−P−E−R−V−G−G−R−に−R<−
R−G−T−A−A−P−R−八−^−P−A−人−R−G−5−R−P−G−
P−Am〇−TL−P−G−G−R−L−に−G−R−G−R−G−R−A−P
−E−R−V−G−1ニーR−G−R−G−R−G−T−A−人−P−R−人一
人−P−人−人−R−G−5−R−L−G−人−R−G−R−A−L−P−G−
G−R−L<−1:、−R−C,−R<−R−A−P−E−R−V−G−G−R
−G−R−C;−R−G−T−A−A−P−R−A−人−P−人一人−R−G−
5−R−P−G−P−A−G−Tを有するペプチドがコア配列の外側にあるポリ
ペプチド中に存在する。特に好ましいhmwbFGF血管形成因子には以下の配
列があげられる:
L−G−G−R−G−R−G−R−人−P−E−R−V−G−G−R<−R−G
−R−G−T−人一へ−P−R−A−人−P−A−A−R<−5−R−P−G−
P−AmG−T−bFGF−18
L−P−G−G−R−L−G−G−R−G−R−G−R−八−P−E−R−V−
G−C,−R−G−R−G−R−G−T−人〜入−P−R−へ−へ−P−人−A
−R−C,−5−R−P−G−P−Am〇−T−bF(、F−LE+L−G−八
−R−G−R−人−L−P−G−G−R−L−G−G−R−G−R−G−R−A
−P−E−R−V−G−G−R−G−R−に−R−G−T−A−A−P−R−^
−八−P−A−人−R−G−5−R−P−G−P−A−G−T−bFGF−18
前記略号により示されるアミノ酸は下記好ましい態様の記載中に示される。
翻訳によりt+mwbFGFおよびbFGF−18因子を生成するためのRNA
の生成に用いられるcDNAクローンの関連するヌクレオチド配列は次のとおり
である:
CGG CCG AGC(、GCTCG 入GG q GGG GkCCGCG
GG CGCGGCCGCCCG q工Ω CCC(、GCGf:、G 人CG
ロー〇G(、GGCCGG に(、CCGG (、GCCGT CCCCCCG
入G CGG GTCGGA GGCCGG GにCCにG GGCCGG入c
c w cc入 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−TG^bF(、F−
18
bFGF−18ポリペプチドはATG365て開始されるが、先に記載されるよ
うに胎盤bFGFはATGイニシェークーにより形成されるメチオニンに2個の
アミノ酸のアミノ末端伸長を有する。ヌクレオチド番号付けはbFGF血管形成
因子を発現することが同定されているcDNAクローンの最初の核酸から始まる
。bFGF−18因子を生ずる翻訳のためのRNAを生成させるのに用いられる
cDNAクローンのヌクレオチド配列は以下のとおりである:
(本頁以下余白)
L 好ましいhmwbFGFはATG365より前のコドンで始まる翻訳開始に
より生産される。特に好ましイhmwbFGFハCTG201. CTG228
オヨびCTG243での翻訳開始により生産される。前記略号により示されるD
核酸は下記好ましい態様の記載において示される。
さらに、本発明に従い、活性成分の少なくとも1つとして、ここに記載される本
発明による血管形成因子を含有する医薬組成物を開示する。
前述の一般的記載および以下の詳細な記載は共に単なる例示であって、特許請求
されている本発明を制限するものではない。
好ましい実施態様の記載
本発明の原理は、以下の実施例と共に好ましい態様のこの詳細な記載により説明
されよう。
本発明は標準的な実験室技術により単離および分離できる治療上のタンパク質に
関する。特に、本発明は単離および分離されそしてウェスタンプロット分析によ
り同定された血管形成因子に関する。好ましくは、本発明の血管形成因子はヒト
肝癌細胞系5K−HHP−1から単離できる天然型血管形成因子と実質的に相同
で、免疫学的に等価であり、そしてもっとも好ましくは生物学的に等価である単
一ポリペプチド鎖タンパク質である。ヒト肝癌細胞系5K−)fHP−1は当業
者によく知られ、種々の生化学供給業者から入手できるヒト細胞組織の普通に使
われている株である。本明細書および請求の範囲を通して用いられている“生物
学的に等価”とは、本発明の組成物が天然型血管形成因子と同じ様式であるが必
ずしも同程度ではないマイトジェン性、化学走性、プロテアーゼ合成刺激、血管
形成性または他の性質を有することを意味する。
以下の明細書および請求の範囲を通して用いられそして任意のタンパク質につい
て言及する場合“実質的に相同の”とは、以前に報告され、精製された、実質的
に相同の血管形成因子または治療用タンパク質組成物により示される相同度を越
えた、天然型血管形成因子または治療用タンパク質に対する相同度を意味する。
好ましくは、相同度は50%好ましくは60%、さらに好ましくは75%以上、
特に好ましいタンパク質は天然型タンパク質と85%または90%以上相同であ
る。前記した相同度は、参考文献としてここに詳細にとり込まれるDayhof
f、 M、0. in At1as of Protein 5equence
s and 5tructure、 Vol、5. page 124 (19
72)、 National !3io−chemical Re5earch
Foundation、 Washington、 D、C,、に記載されて
いるように、100アミノ酸の鎖長中に4個のギャップを導入して整合を補助し
た場合に、比較すべき配列において同じアミノ酸残基と整合する、2本の配列の
小さい方に存在するアミノ酸残基の%として計算される。
以下の明細書および請求の範囲を通して用いられそして任意のオリゴヌクレオチ
ド配列について言及する場合の“実質的に相同”とは、その配列から翻訳された
タンパク質が天然型核酸配列により生産されたタンパク質と実質的に相同である
ような、天然型核酸配列に対する相同度を意味する。ここに記載する本発明の血
管形成因子および治療用タンパク質はヒト供給源から単離されるかまたは合成ポ
リペプチドである。 ′合成”ポリペプチドなる用語は、実質的に精製された形
態で自然界からこれまでに単離れていないアミノ酸配列を意味するものである。
この定義には、特に組換えDNA法によるかまたはインビトロで全部または一部
を合成により生成されたポリペプチドが包含される。特に、以下に示される最も
好ましいアミノ酸配列が1個から数個のアミノ酸で逸脱している合成ポリペプチ
ドが意図される。
以下の明細書および請求の範囲を通して用いられている“治療用タンパク質“と
は、単一ポリペプチド鎖から成り、そして疾患の治療または予防医学に有用であ
りうる価値ある生物学的性質を有する、任意の天然に存在するヒトタンパク質を
意味する。この発明は、非ATGコドンでのインビボ翻訳開始により形成される
前記治療用タンパク質の全ての高分子量形態物およびその単離法に関する。
本発明の好ましい血管形成因子はヒト肝癌細胞系5K−)IEP−1抽出物中に
発見され、初めてbFGF−18タンパク質からおよび互いから分離された。本
出願の目的にとって、ここに開示される任意の血管形成因子について言及するの
に用いられる場合の“純粋形態”または“精製された形態”とは血管形成因子で
ない他のヒトタンパク質を実質的に含まないことを意味する。好ましくは、本発
明の血管形成因子は少なくとも50%純粋、より好ましくは70%純粋そしてさ
らにより好ましくは80%または90%純粋である。
本発明の血管形成因子はヒト肝癌細胞系5K−HEP−1から、(alヒト細胞
系5K−HEP−1細胞を溶解させ、(bl混合物中のタンパク性物質を分画す
ることにより血管形成因子を単離し、(e)胎盤bFGF免疫交差反応性を有し
かつbFGF−18血管形成因子を全く含有しない画分を同定し、そして(d)
その両分を濃縮する、ことを含んでなる方法により単離できる。
好ましい態様においては5K−1(EP−1細胞を数ある中でも1%NP40を
包含する緩衝液中で溶解させる。NP40はフェノール1モル当りエチレンオキ
シドを平均9モル含有するオクチルフェノール−エチレンオキシド縮金物からな
る、微生物学的調製物に普通に用いられる界面活性剤であり、Sigma Ch
emical Companyから入手できる。細胞中に存在するタンパク性物
質を分画する前に、全ての核および細胞破片を遠心分離により取り除く。5K−
HEP−1細胞中に存在するタンパク性物質を当業者によく知られている慣用の
クロマトグラフィー法を用いて分画する。1つの態様においては、タンパク性物
質をヘパリン−セファロースアフィニティークロマトグラフィーを用いて分画し
、さらにゲル電気泳動により分離する。
上記分画法によって得られた画分を胎盤bFGF免疫交差反応性に関してスクリ
ーンする。ゲル電気泳動を利用する場合は、電気泳動は12%5DS−PAGE
(ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動)を用いて実施し
、そしてタンパク質をニトロセルロースにウェスタンプロットして抗胎盤FGF
抗体で検出する。
この方法により、hmwbFGFが互いから、およびbFGF−18因子から分
離でき、そして抗胎盤FGF抗体と反応する22kD、23kD、および24k
D分子量タンパク質の存在が示される。
本発明者らは、精製された形態の、そして血管形成因子でないヒトタンパク質を
実質的に含まない形態のhmwbFGFをはじめて同定し単離した。ヘパリン−
セファロースクロマトグラフィーおよびゲル電気泳動によるタンパク質の単離お
よび分離は、hmwbFGFの配列を確立するのに欠くことのでない段階であっ
た。この情報は、上記cDNAの一次構造の知識および非ATG翻訳イニシェー
ターの存在を確立する実験と一緒になって、本発明者らが各hmwbFGFの配
列を確立するのを可能にした。
本発明の好ましい血管形成因子として特定される構造はcDNAヌクレオチド配
列の既知の構造から推測することにより決定される。
しかしながら、示されるアミノ酸配列への翻訳後修飾が行われる可能性はかなり
高い。はじめに翻訳されたタンパク質に翻訳後修飾が存在することは、ヒト肝癌
細胞系5K−1(EP−1から単離できるhmwbFGFタンパク質が以下に示
す配列と実質的に相同であるが、かならずしも同一ではないことを意味する。
本発明のhmwbFGF血管形成因子は下記bFGF−18コア配列を有する:
と−人−A−G−5−ニー’J’−T−L−P−人−L−P−E−D−G−G−
5<−人−F−P−P−G−H−F−に−D−P−に−R−L−Y−C−に−N
−G−G−F−F−L−R−ニー)1−P−0−G−R−V−D−G−V−R−
E−に−5−D−P−H−ニーbFGF−18K−L−Q−L−Q−人−E−E
−R−G−V−V−5−I−に−G−V−C−人−N−R−Y−L−人−M−に
−E−D−G−R−L−L−人−5−に−C−V−T−C)−E−C−F−P−
F−ε−R−r、−E−5−N−N−Y−N−T−Y−R−S−R−に−Y−T
−5−W−Y−V−人−L−に−R−T−G−Q−Y−に−L−G−5−に−T
−G−P−G−Q−に−人−ニーL−F−L−P−M−5−A−に−5゜さらに
、配列:
L−G−G−R−G−R−G−R−人−P−E−R−V−G−G−R−G−R−
G−R−G−T−へ一人−P−R−人−A−P−A−A−R−G−5−R−P−
G−P−A−G−TL−P−G−G−R−L−G−G−R−G−R−G−R−A
−P−E−R−V−G−G−R−G−R−G−R−G−T−A−A−P−R−人
一人−P−A−人−R−(、−5−R−P−G−P−A−G−T
L−G−A−R−(1,−R−A−L−P−G−G−R−L−G−G−R−G−
R−G−R−A−P−E−R−V−G−G−R−G−R−G−R−G−T−A−
八−P−R−A−AmP−A−A−R−G−5−R−P−G−P−Am〇−Tを
有するペプチドがコア配列のアミノ末端に存在する。特に好ましいhmwbFG
F血管形成因子は下記配列を有する:(本頁以下余白)
D−22
L−G−G−R−G−R−G−R−A−P−E−R−V−G−G−R−G−R−
G−R−G−T−A−A−P−R−A−A−P−A−A−R−G−5−R−P−
G−P−A−G−L−P−G−G−R−L−G−G−R−G−R−G−R−A−
P−E−R−V<−G−R−G−R−G−R−G−T−A−A−P−R−人−^
−P−人一人−R−G−5−R−P−G−P−人〜〇−T−bFGF−18L−
G−人−R−G−R−人−L−P−G−に−R−L−G−G−R−G−R−G−
R−A−P−E−R−V−G−G−R−G−R−G−R−G−T−A−A−P−
R−人一人−P−A−人−R−G−5−R−P−G−P−^−G−T−bFGF
〜18前記略号は例えばBiochemstry by A、 L、 Lehn
inger、第2版、Worth Publishers、 Inc、、 Ne
w York (1975)、p、72に記載されるアミノ酸残基の標準略号に
相当する。
本発明のhmWbFGF血管形成因子はまた、組換えDNA法によりfa)hm
wbFGFの最終翻訳物をコードするDNA配列を単離し、(b)このDNA配
列を宿主微生物で発現可能なベクターに挿入し、(e>所望のpNA配列を含有
するベクターをタンパク質を発現しうる宿主生物にトランスフェクションさせ、
(d)トランスフェクションされた生物からhmwbFGF血管形成因子を発現
させ、そして(e)任意の順序で、所望のタンパク質を単離および精製する、こ
とを含んでなる方法により生産され、そして精製された形態で単離され得る。
好ましい態様においては、宿主生物はCO3−1細胞であり、そして利用される
ベクターはpJc119である。これらは当業者によく知られている普通に用い
られる生物学的物質であり、種々の生化学供給業者から入手できる。さらに、D
NAは下記:TGT TTC’r’IT TTT GAA CGA TTG (
AA TCT AATATG TACAAT ACT TAC((、G TGA
^CC,AAA TACACCACT TGG TAT GTG GCA C
TG 入AA (Gλ 八CTGGG CAG TAT AAA CTT C,
(1,A TCC入人A ACA GGACCT Gll CAG AAA G
CT ATA CTT TTT CTT CCAATG TCT GCT 入^
G AGCTGA TTT T五人と同じかまたは実質的に相同のオリゴヌクレ
オチド配列を含有する。
本発明者らは、提案された開始部位で改変された核酸配列を合成することにより
非ATGコドンでの翻訳開始を確立した。hmwbFGFおよびbFGF−18
タンパク質を翻訳する天然に存在するセグメントと他の全ての点においては同一
であるが、1個の核酸が1個の異なる核酸で置換されたオリゴヌクレオチド配列
を合成することにより、その核酸が存在する3核酸コドンは異なるアミノ酸に翻
訳されよう。もし改変されたコドンが翻訳イニシエーターコドンでない場合、一
般にその核酸セグメントは天然のタンパク質と同一であるが、1個のアミノ酸が
異なるタンパク質(またはこの場合はタンパク質類)を依然として生産しよう。
しかしながら、もしイニシエーターコドンが改変されれば翻訳はその部位からは
起らないであろう。本発明の発明者らがbFGF血管形成因子の活性高分子量形
態物を生ずる非ATGイニシエーターの存在を確立したのはこれらの方法によっ
てである。
IunibFGFおよびbFGF−18因子を生成するオリゴヌクレオチド構造
は次のとおりである・
GGG CGCGGCCGCGCG f;:5 CCG CGCGGG AGG
ACC島GCA −−−−−−−−−−−−−−−−−−−TGAbFGF−1
8
ここで用いられている略号は例えばBiochemistry by A、 L
、 Lehninger、第2版、Worth Publishers、 In
c、、 New York (1975)、 pages 310−318に示
される核酸の省略記号に相当する。
“遮断”イニシエーター法を使用することにより、本発明の発明者らはhmwb
FGFがbFGF−18タンパク質と実質的に同じマイトンエン活性を有するこ
とを示すこともできた。ATG−365コドンを変えて、本発明者らはbFG
F−18の生産を遮断しモしてbFGF−18を含まないhmwbFGFを得た
。相対的濃度に基づいた比較マイトジェン活性研究では、hmwbFGFがbF
GF−18と非常に類似したマイトジェン活性を有することが示された。もちろ
ん、この実験で研究されたhmwbFGFはbFGF−18開始部位のメチオニ
ンがアミノ酸置換されているので、最も好ましい構造の相同物である。
本発明の発明者らは“フレームシフトした″cDNAオリゴヌクレオチドセグメ
ントを合成し翻訳することにより、hmwbFGFのマイトジェン活性がbFG
F−18タンパク質のそれと均等であることも確立している。基本的なりFGF
−18タンパク質を翻訳するセグメントの直前の核酸配列中に1個の付加的な核
酸を加え入れるだけで、それに続く全てのコドンに存在する3アミノ酸組み合せ
物がシフトする。かかる“フレームシフト”は追加した核酸がcDNAに加わる
地点で、オリゴヌクレオチドから翻訳されるタンノずり質を変える。この方法を
通して、本発明の発明者らはhmwbFGFのマイトジェン活性部位がbFGF
−18タンパク質のそれと実質的に等しいことを示すことができた。
本発明の高分子量治療用タンパク質は、それぞれの治療用タンパク質の治療目的
と同様の治療目的が意図される。特に、本発明の血管形成因子およびここで開示
されている類似物はマイトジェン性、化学走性、神経栄養性または血管形成性質
またはプロテアーゼ合成刺激能を有する医薬製剤の形態でヒトおよび家畜用途が
意図される。活性成分の少なくとも1種として本発明の血管形成因子のひとつを
含有する医薬製剤が期待されている。この製剤はまた意図される剤形の如何に応
じ適切な製剤上受容できる担体、希釈剤、充填剤、結合剤および他の賦形剤をも
含有しよう。経口投与には、消化管での活性タンパク質の分解を阻止するための
処置がとられねばならない。したがって腸溶剤形が経口投与に好適なひとつの形
態として意図される。もし非経口投与が選択される場合は、製剤は水または食塩
溶液または他の製剤上受容できる懸濁剤を含有しつる。一般に、非経口投与が意
図される製剤は製剤全体を体液と等張にするのに十分な濃度の塩化ナトリウムま
たはグリセロールを含有することが好ましいであろう。本発明の血管形成因子を
含有する医薬製剤は創傷、外科的切開または皮膚潰瘍の治療に注射または外用に
より局所的に投与されることも意図される。さらに、心筋梗塞後の心臓への血液
供給を再生するためには血管形成因子を徐放性インブラント装置中に組み込んだ
ものを投与することが意図される。
上記障害の治療に適切な用量を決定するのに必要な、そして上記放出法での使用
に適切な計算は特に標準的アッセイおよびここで開示されたアッセイに照らして
当業者により日常的になされ、過度の実験なしに彼らにより日常的に行なわれる
仕事の範囲内にある。これらの用量は適切な用量一応答データに関連して利用さ
れる用量を決定するための確立されたアッセイを用いることにより確認できる。
本発明の教示を特定の問題または環境に適用することは、ここに含有される教示
に照らして当業者の能力の範囲内であることか理解される。本発明の産物の例お
よびそれらの単離、同定および製造の代表的過程は以下の実施例に示される。
実施例1
ヒト肝癌細胞系5K−HEP−1からのhmwbFGFの精製ヒト肝癌5K−H
EP−1細胞を、400mM NaC1,1μM MaCI、 50mM トリ
スpH7,5,1%NP40およびlμM PMSF (フェニルメチルスルホ
ニルフルオライド)を含有する緩衝液中で溶解させた。核および細胞層を遠心分
離により取り除き、続いて細胞抽出物をMOSCatelli (上記(参考文
献としてここにとり込まれる))に記載されるようにしてヘパリン−セファロー
ス(H3)でクロマトグラフィーした。3M NaCl H3溶出物はhmwb
FGFを含有していた。標準手順に従い、集めた両分を12%5DS−PAGE
で分離し、そしてニトロセルロースへのウェスタンブロッティングに続きSze
wcbykらAnalytical Bioch、 1985. Vol、15
0. pgs 403−407 (参考文献としてここにとり込まれる)に記載
されるようにして指示されるアフィニティー精製抗FGF抗体を用いて分析した
。この方法により bFGF−18血管形成因子の他に分子量22kD、23k
Dおよび24kDに相当する3個の別々のhmwbFGFタンパク質の存在が示
された。
実施例2
天然に存在するbFGF cDNAから転写されたRNAのインビトロ翻訳RN
A依存インビトロ翻訳をPelhamらFur、 J、 Biochem、、
1976゜Vol、67、 page247(参考文献としてここにとり込まれ
る)に記載される方法により3S3−メチオニンの存在下小麦胚抽出物中で行い
、それに続く免疫沈降反応をFlorkiewiczら、J、 Ce1l Bi
ology 1983、 Vol、 97.pages1381−1388 (
参考文献としてここにとり込まれる)に記載されているようにして行った。免疫
沈降した試料をプロティン−Aセファロースで溶出し、12%5DS−PAGE
で分解しそしてフルオログラフィーで可視化した。ここでも分子量18.22.
23、および24kDのタンパク質が検出された。この方法により血管形成因子
でないヒトタンパク質を実質的に含まないhmwbFGFが得201位(CTG
からCTT)および365(ATGからGCT)での特定部位のオリゴヌクレオ
チド突然変異を、Kunkelら、Methods in Enzymol。
1987、 Vol、154. pp、367−382(参考文献としてここに
とり込まれる)に記載される方法に従いBiorad mutageneキット
を用いてbFGF cDNAクローンに導入した。243位(CTGからCTT
)での突然変異を含有する核酸配列はヌクレオチド192のXho1部位とヌク
レオチド353のApa1部位との間のDNAフラグメント(4本の重複する合
成オリゴヌクレオチドを用いて)を再合成することにより得た。
ハイブリッド発現ベクターpJc119内に含有される突然変異したcDNAを
Machamerら、Mo1. Ce11. Bio、、1985. Vol、
5. 1)l)、3074−3083(参考文献としてここにとり込まれる)に
記載されるようにしてCO3−1細胞にトランスフェクションさせた。トランス
フェクションして40−48時間後に、細胞を実施例1記載のようにして溶解さ
せ、抽出物を4℃で2時間H5とインキュベートした。HSSリレントを0.5
M NaC1および20mM )リスpH7,5を含有する緩衝液で、続いてI
M NaClおよび20mM )リス pH7,5緩衝液で3回洗浄した。
次にペレットを3MNaC!緩衝液で溶出し、溶出物を5O5−PAGEおよび
アフィニティー精製抗bFGF抗体を用いるウェスタンプロットで分析した。
これら突然変異させたオリゴヌクレオチドから生ずる翻訳により、前記実施例1
に記載されるようにして単離され同定されたタンパク質が生成された。201位
で突然変異したオリゴヌクレオチドはbFGF−18、bFGF−22、および
bFGF−23を生産した。243位に突然変異のあるオリゴヌクレオチドはb
FGF−18、bFGF−23およびbFFGF−24を生産した。そして最後
に、365位に突然変異のあるオリゴヌクレオチドはbFGFを含まない3種の
全てのhmwbFGF、つまりbFGF−22、bFGF−23およびbFGF
−24を生じた。
実施例4
マイトジェン活性部位を決定するためのbFGFクローンのフレームシフト突然
変異
353位と354位(唯一のApa1部位)の間に1個の核酸を効果的に追加す
るフレームシフト突然変異を、標準操作に従いbFGF cDNAクローンをオ
リゴヌクレオチド5’ GGCCTCTAGAGCCGGCC3’で処理するこ
とにより実施する。このオリゴヌクレオチドの翻訳産物を、前記実施例3に記載
のようにしてクローンをCO3−1細胞にトランスフェクションさせることによ
り観察し、生じたタンパク質を実施例1記載のようにして分析した。この突然変
異した配列の翻訳からは抗bFGF抗体に反応するタンパク質は全く検出されな
かった。
実施例3記載のようにして調製され、そして天然に存在するbFGF cDNA
および365位で突然変異したオリゴヌクレオチドでトランスフェクションされ
た細胞からの溶解物を含有するHSペレットを、3MNaClを含有する緩衝液
で溶出した。これら溶出物の一部分をPres taら、Mo1. Ce11.
Biol、、 1986. Vol、6. pp、4060−4066(ここ
に参考文献としてとり込まれる)に記載される3T3細胞マイトジエン性アツセ
イで直接アッセイし、3H−チミジンのTCA沈降可能カウントへのとり込みを
測定した。この実験の結果は、hmwbFGFがbFGF血管形成因子とほとん
ど同一のマイトジェン性質を有することを示した。これらの試料の定量的ウェス
タンプロット分析では3MNaC1溶出物中に1 ng/μlのbFGF濃度が
示された。
手続補正書
平成5年2月22日
Claims (24)
- 1.少なくとも1つの活性部位を有する単一ポリペプチド鎖タンパク質を含む治 療用タンパク質の高分子量形態物であって、ここで該タンパク質のそれぞれは一 部分に該治療用タンパク質のアミノ酸配列を含むものである、高分子量形態物。
- 2.前記タンパク質が非ATGコドンからの翻訳開始によりインビボで合成され る、請求の範囲1記載の治療用タンパク質の高分子量形態物。
- 3.ヒト肝癌細胞系SK−HEP−1から単離できるヒトbFGF−18血管形 成因子の天然型高分子量形態物との実質的相同性を示す、精製されたヒトまたは 合成の単一ポリペプチド鎖タンパク質を含むヒトbFGF−18血管形成因子の 該高分子量形態物であって、ここでヒトbFGF−18血管形成因子の該高分子 量形態物のそれぞれは、血管形成活性、マイトジェン活性、化学走性活性、神経 栄養活性、プロテアーゼ合成刺激能、およびそれらの組合せからなる群から選択 される活性を有する少なくとも1つの活性部位を有するものである、高分子量形 態物。
- 4.それぞれがマイトジェン性、血管形成性、神経栄養性および化学走性活性お よびプロテアーゼ合成刺激能を有する少なくとも1つの活性部位を有する精製さ れた単一ポリペプチド鎖タンパク質を含むヒトbFGF血管形成因子の高分子量 形態物であって、ここで該タンパク質はヒト肝癌細胞系SK−HEP−1から単 離できるヒトbFGF−18血管形成因子の天然型高分子量形態物と実質的な相 同性を示すものである、高分子量形態物。
- 5.前記形態物がマイトジェン活性を有する少なくとも1つの活性部位を有する 、請求の範囲3記載のヒトbFGF−18血管形成因子の高分子量系形態物。
- 6.前記形態物がヒト肝癌細胞系SK−HEP−1から実質的に精製された形態 で単離される、請求の範囲3記載のヒトbFGF−18血管形成因子の高分子量 形態物。
- 7.それぞれがマイトジェン活性を有する少なくとも1つの活性部位を有する、 精製された単一ポリペプチド鎖タンパク質を含むヒトbFGF−18血管形成因 子の高分子量形態物であって、ここで該タンパク質のそれぞれは下記アミノ酸配 列:【配列があります】 を一部分に含むものである、高分子量形態物。
- 8.前記タンパク質が、 【配列があります】 【配列があります】 【配列があります】 から成る群から選択されるアミノ酸配列を一部分に含む、請求の範囲7記載のヒ トbFGF−18血管形成因子の高分子量形態物。
- 9.タンパク質のアミノ酸配列が請求の範囲8記載の配列と2アミノ酸残基だけ 異なる、ヒトbFGF−18血管形成因子の高分子量形態物。
- 10.タンパク質のアミノ酸配列が請求項8記載の配列と6アミノ酸残基だけ異 なる、ヒトbFGF−18血管形成因子の高分子量形態物。
- 11.翻訳後修飾がアミノ酸配列に対してなされている、請求の範囲8記載のヒ トbFGF−18血管形成因子の高分子量形態物。
- 12.マイトジェン活性を有する少なくとも1つの活性部位を有する精製された 単一ポリペプチド鎖タンパク質を含む血管形成因子であって、該タンパク質は非 ATGコドンの翻訳開始によりインビボで合成されるものである、血管形成因子 。
- 13.前記タンパク質のそれぞれがアミノ酸配列:【配列があります】 を一部分に含む、請求の範囲12記載の血管形成因子。
- 14.前記タンパク質のそれぞれが、 【配列があります】 から成る群から選択されるアミノ酸配列を一部分に含む、請求の範囲13記載の 血管形成因子。
- 15.組織から純粋な形態で治療用タンパク質の高分子量形態物を得る方法であ って、 (a)該形態物を産生できる組織を集め、(b)組織中のタンパク性物質を分画 することにより組織から該形態物を単離し、 (c)治療活性に関わる画分を同定し、(d)該形態物を含有する該画分を該治 療用タンパク質を含有する画分から分離し、そして (e)該形態物を含有する画分を濃縮する、ことを含んでなる方法。
- 16.組織からヒトbFGF−18血管形成因子の高分子量形態物を得る方法で あって、 (a)該形態物を産生できる組織を集め、(b)組織中のタンパク性物質を分画 することにより該形態物を単離し、 (c)血管形成因子活性を有し、ヒトbFGF−18血管形成因子を全く含有し ない画分を同定し、そして (d)該画分を濃縮する、 ことを含んでなり、ここで該画分はマイトジェン活性、化学走性活性、神経栄養 活性、血管形成活性、プロテアーゼ合成刺激能、およびそれらの組み合せから成 る群から選択される活性を有する少なくとも1つの活性部位を有する該形態物を 含有しており、かつヒト肝癌細胞系SK−HEP−1から単離できるヒトbFG F−18血管形成因子の天然型高分子量形態物と実質的相同性を示す単一ポリペ プチド鎖タンパク質を含むものである、方法。
- 17.前記形態物を産生できる組織がヒト肝癌細胞系SK−HEP−1である、 請求の範囲16記載の方法。
- 18.ヒト肝癌細胞系SK−HEP−1から単離できるヒトbFGF−18血管 形成因子の天然型高分子量形態物と実質的な相同性を示す精製された単一ポリペ プチド鎖を含み、かつマイトジェン活性、化学走性活性、血管形成活性、神経栄 養活性、プロテアーゼ合成刺激能、およびそれらの組み合せからなる群から選択 される活性を有する少なくとも1つの活性部位を有する、ヒトbFGF−18血 管形成因子の高分子量形態物を生産する方法であって、(a)該形態物をコード するDNA配列を単離し、(b)このDNA配列を宿主生物において発現可能な ベクターに挿入し、 (c)該形態物を発現しうる宿主生物に前記DNA配列を含有するベクターをト ランスフェクションさせ、 (d)トランスフェクションされた生物から該形態物を発現させ、そして (e)任意の順序で、ヒトbFGF−18血管形成因子の発現された高分子量形 態物を単離し、精製する、 ことを含んでなる方法。
- 19.宿主生物がpJC119でトランスフェクションされる、請求の範囲18 記載の方法。
- 20.宿主生物がCOS−I細胞である、請求の範囲18記載の方法。
- 21.前記DNA配列がアミノ酸配列:【配列があります】 を含有するタンパク質をコードする、請求の範囲18記載の方法。
- 22.前記DNA配列が 【配列があります】 【配列があります】 【配列があります】 から成る群から選択されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする、請 求の範囲19記載の方法。
- 23.前記DNA配列が下記: 【配列があります】 と同じかまたは実質的に相同である核酸配列を含有する、請求の範囲18記載の 方法。
- 24.bFGF−22、bFGF−23およびbFGF−24より成る群から選 ばれる、マイトジェン活性を有する少なくとも1つの活性部位を有するヒトbF GF−18のCTG開始される高分子量形態物を生産する方法であって、 (a)ヒトbFGF−18の高分子量形態物をコードする核酸配列に機能しうる 状態で連結された発現調節配列を含むベクターで形質転換された宿主細胞を、ベ クターを増幅させかつbFGF−18の高分子量形態物を発現させる条件下で培 養し、(b)培地からbFGF−18の高分子量形態物を回収し、そして(c) bFGF−18の他の形態物を実質的に含まない発現されたbFGF−18の高 分子量形態物を精製する、 ことを含んで成り、ただし前記の精製されたbFGF−18の高分子量形態物が bFGF−22、bFGF−23およびbFGF−24より成る群から選ばれる ものである、上記方法。
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