JPH0257192A - モチリン様ポリペプチドの製法並びにそのための組換えｄｎａ及び発現用プラスミド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はモチリン様ポリペプチドの製法並びにそのため
の組換えＤＮＡ及び発現用プラスミドに係る。

本発明によるポリペプチドは医薬として、殊に胃腸障害
の治療に用いることができる。

（従来の技術） モチリンは、ブラウン等によりブタの上部小腸粘膜から
初めて単離され、構造の決定された物質であり、ペプチ
ドホルモンの一種である［　”　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅ
ｒｏｌｏｇｙ”第６２巻第４０１−４０４頁（１９７２
年）及び”Ｃａｎ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、”第５２
巻第７−１Ｏ頁（１９７４年）１゜このブタモチリンは
、２２個のアミノ酸から構成されており、分子量は約２
７００である。

一方、ヒト由来のモチリンについては、本発明者等によ
ってそのｃＤＮＡクローンが単離されると共に構造決定
がなされ、その結果、そのアミノ酸配列はブタ由来のも
のと同一であることが明らかにされた（特願昭６２−１
０９７５７）。

モチリンの生理作用としては消化管運動亢進作用及び消
化管平滑筋収縮作用が良く知られている。これらの作用
の内で、消化管運動亢進作用に関しては、例えば胃にお
ける排出時間を短縮する作用が報告されており　［”　
Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ”第８０巻第４５６
−４６０頁（１９８１年））、又消化管平滑筋収縮作用
に関してはウサギやヒトの両前庭部及び十二指腸に対し
て神経経路に依存せずに強い収縮をもたらすことが知ら
れている。従って、モチリンは胃腸運動を充進させ、然
かも格別の副作用が報告されていないので、術後等にお
ける胃腸障害の治療や胃腸障害の診断に有効なものと考
えられてきた（因に、術後における腸管麻痺等の治療に
はプロスタ−グランジン等が用いられているが、副作用
が強い点に問題がある）。

尚、モチリンのアミノ酸配列における　１３位はメチオ
ニンであるが、これをロイシン又はノルロイシンに変換
したアミノ酸構造を有する化学合成ポリペプチドもモチ
リンと同様な生理活性を示すことが報告されており　［
”５ｃａｎｄ、　Ｊ、　Ｇａｓｔｒｏ−ｅｎｔｅｒｏｌ
ｏｇｙ”第１１巻第１１９−２０３頁（１９７６年）等
１．１３位のメチオニンは活性に及ぼす影響が殆どない
ものと考えられている。

（発明が解決しようとする課題及び発明の目的）慣用技
術によれば、モチリンは一般にブタ由来のものであって
、抽出により得られており、従って大量生産が極めて困
難であった。一方、化学合成法を利用する場合にも、モ
チリンはアミノ酸数が２２のポリペプチドであるために
、大量に且つ廉価に得ることが困難であった。即ち、モ
チリンは胃腸障害の治療等における有効性が期待されて
いるにも拘らず、その生産性がネックとなって臨床治療
に汎く利用されるには至っていなかったのである。

それ故に、所謂「バイオテクノロジー」を応用してモチ
リン様活性を有するポリペプチドを廉価に製造するため
の研究が重ねられてきた（特開昭６３−７１１９５公報
及び本発明者等が開発の特願昭６２−２５８３５３明細
書に記載の方法等）。

本発明は、最近開発されたこれらの方法を踏まえた上で
なされたものであり、その本質的目的はモチリン様ポリ
ペプチドを更に容易に製造する方法を提供することにあ
る。

本発明の付随的な、但し重要な目的はモチリン様ポリペ
プチドを極めて効率的に製造する方法を提供することに
ある。

本発明の他の目的は、上記の製造方法を実施するために
用いられる新規な組換えＤＮＡを提供することにある。

本発明の更に他の目的は、上記の組換えＤＮＡを組込ん
だ発現用プラスミドを提供することにある。

（課題を解決し、目的を達成する手段および作用） 本発明によれば、上記の課題は、式（１）％式％ （式中ＸはＭｅｔ及びＡｓｐ以外のアミノ酸残基を意味
する） にて示されるモチリン様ポリペプチドの製法であって、
非電荷極性アミノ酸を少なくとも６残基有しており且つ
末尾にメチオニンを有している一本鎖ＤＮＡと、上記の
式（１）にて示されるアミノ酸配列をコードしている一
本鎖ＤＮＡと、これらの−重鎖ＤＮＡにおける塩基配列
と相補的な塩基配列を有している各−重鎖ＤＮＡとをそ
れぞれ合成し、これらの合成−重鎖ＤＮＡを用いて上記
の非電荷極性アミノ酸をリーダー配列としてコードして
いる二本鎖ＤＮＡを作成し、この二本鎖ＤＮＡの末端に
それぞれ特定の制限酵素認識部位を付加し、一方他の蛋
白質遺伝情報が組み込まれたプラスミドを上記の両制限
酵素と同種の制限酵素で切断し、その断点に上記の制限
酵素認識部位付き合成二本鎖ＤＮＡを付加してプラスミ
ドを再構築し、この再構築プラスミドを微生物に取り込
ませて形質転換させると共に培養して上記の式（１）に
て示されるアミノ酸配列を包含するポリペプチドを融合
蛋白の一部として産生させ、次いで微生物を破壊させた
後にブロムシアン及びエンドペプチダーゼにより処理す
ることにより融合蛋白から上記の式（１）にて示される
ポリペプチドを分離させ、その後に分画処理により該ポ
リペプチドを単離することを特徴とする、モチリン様ポ
リペプチドの製法により解決されると共に、上記の主目
的が達成される。

本発明方法により製造されるモチリン様ポリペプチドを
示す式（１）において、１３位のアミノ酸残基であるＸ
がＭｅｔ及びＡｓｐ以外のアミノ酸残基とされているの
は、この部位がＭｅｔであると、後の工程、即ち産生さ
れた融合蛋白をブロムシアンで処理する場合に１３位の
Ｍｅｔの部位においても切断が生じるためにモチリン様
活性を有する所望のポリペプチドが得られないためであ
り、又本発明方法では合成の都合上、式（１）にて示さ
れるポリペプチドに相当する一本鎖ＤＮＡを分割合成す
るに際して、そのＣ末端側のアミノ酸配列であるー−−
Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎの後にはＡｓｐをコードするコ
ドン（ＧＡＣ）があり、後の工程で、即ちエンドペプチ
ダーゼにより処理することにより、このＡｓｐ以降の余
分なアミノ酸を切断分離しようとする際に、上記のよう
に１３位がＡｓｐであると、この部位においても切断が
生じて１〇− モチリン様活性を有する所望のポリペプチドが得られな
いためである。尚、本発明方法により得られるポリペプ
チドはＸが意味するアミノ酸残基の種類により活性に程
度の差を生じるが、すべてモチリン様の生理活性を有し
ている。但し、１３位のアミノ酸残基としてはロイシン
（Ｌｅｕ）やバリン（Ｖａｌ）等が好ましく、グリシン
（Ｇｌｙ）やプロリン（Ｐｒｏ）を意味するポリペプチ
ドは、これらの立体構造から判断されるように活性が低
い。非電荷極性アミノ酸としては、種々検討の結果、ア
スパラギン（＾ｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、スレオ
ニン（Ｔｂｒ）及びセリン（Ｓｅｒ）が発現率の向上を
もたらす点で適していることが判明した。

本発明において、このリーダー配列ペプチドにおける末
尾のアミノ酸がメチオニン（Ｍｅｔ）で構成されている
のは、後の工程で、即ちブロムシアンで処理することに
より、リーダー配列部分を容易に切断除去し得るように
なすためであり、又式（１）にて示される一本鎖ＤＮＡ
については分割して合成することができ、これによって
合成を容易ならしめることができる。

本発明方法において、合成二本鎖ＤＮＡの組込まれたプ
ラスミドを二種類の制限酵素で処理して１３位変換モチ
リン遺伝子部分の上流域とベクター内の１ケ所で切断し
て得たフラグメントを回収し、一方上記の合成二本鎖Ｄ
ＮＡの組込まれた同種の再構築プラスミドを二種類の制
限酵素で、即ち一種類はベクター内で切断するために用
いた上記と同一の制限酵素で、更にもう一種類は１３位
変換モチリン遺伝子部分の下流域が上記の上流域の断点
と共通となるような上記とは別の制限酵素を採用して切
断し、その断点に上記の切断回収されたフラグメントを
ＤＮＡリガーゼによりタンデムに接合してプラスミドを
再構築し、必要に応じ、このような操作を繰り返せば１
３位変換モチリン遺伝子を２つ又はそれ以上をタンデム
に組込んだプラスミドを構築することができ、このプラ
スミドを微生物に取込ませて培養すれば、モチリン様活
性を有する所望のポリペプチドの産出量が増加するので
収率が高まり、従って既述の付随的目的が達成される。

この場合に、１３位変換モチリン遺伝子部分間は例えば
Ａｓｐ−Ｇｌｙ−１１ｅ−ＰｈｅＭｅｔからなるペプチ
ドで連結するのが有利である。何故ならば、このような
ペプチドで連結しておけば、産生された融合蛋白から１
３位変換モチリンを分離させる工程でブロムシアンを作
用させればＭｅｔ部分で切断が生じ、又エンドペプチダ
ーゼＡｓｐ−Ｎを作用させればＡｓｐのＮ末端部分で切
断が生じ、１３位変換モチリンが純粋な形で得られるか
らである。

本発明による組換えＤＮＡは、上記の説明から明らかな
ように、非電荷極性アミノ酸を少なくとも６残基有して
いるリーダー配列ポリペプチドと、このリーダー配列ポ
リペプチドのＣ末端側にメチオニンを介して連結されて
おり且つ１３位がメチオニン及びアスパラギン酸以外の
アミノ酸残基である　１３位変換モチリンに相当するポ
リペプチドが連結されていることを特徴としている。

この場合にも、１３位変換モチリンに相当するポリペプ
チドが複数個タンデムに接合されているのが有利であり
、このポリペプチドの相互間はＡｓｐ−Ｇｌｙ−１１ｅ
−Ｐｈｅ−Ｍｅｔからなるペプチドで連結されているの
が有利である。

一方、本発明による発現用プラスミドは、上記のような
組換えＤＮＡが組込まれていることを特徴としている。

（実施例等） 次に、製造例及び薬理活性試験例に関連して本発明を更
に詳細に説明する。尚、以下においてはモチリンの１３
位がロイシンに変換されたモチリン様ポリペプチドの製
造に関して説明するが、メチオニン及びアスパラギン酸
以外のアミノ酸残基であれば、同様にして他のモチリン
様ポリペプチドを製造し得ることに留意されたい。

１１匠」 （１）モチリン様生理活性ポリペプチドをコードしてい
るＤＮＡの合成 ヒトモチリンは下記の通りのアミノ酸配列を有Ｐｈｅ−
Ｖａｌ−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−０Ｉｎ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｇｌ
ｎ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ
Ｇｌｙ−Ｇｌｎ 更に、１３位のＭｅｔは、既述のように、モチリンの活
性に影響を殆ど及ぼさないことが知られている。

従って、モチリンのアミノ酸配列における　１３位がロ
イシンに変換したアミノ酸配列をコードする塩基配列を
包含し、そのＮ末端側にはメチオニンを介して多数の非
電荷極性アミノ酸残基を有するリーダーペプチド（Ｍｅ
ｔ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−１１ｅ−Ｔｈｒ＾５ｎ−Ｓｅ　ｒ
−Ａｓｎ−Ｇｌ　ｎ−Ａｓ　ｎ−Ｇ　Ｉｎ−Ａｓｎ−Ｇ
　ｌ　ｎ−Ａｓｎ　−Ｇ　Ｉｎ−Ａｓ　ｎ−Ｇｌｎ−＾
ｓｎ−Ｇｌｎ−１１ｅ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ）をコードする
塩基配列を有し且つＣ末端側にはアミノ酸配列（Ａｓｐ
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ）からなるペプチドをコードす
る塩基配列を有する下記の式（２）にて示される二本鎖
ＤＮＡ断片を製造した。

式（２） ％式％ この式（２）にて示される二本鎖ＤＮＡは次のようにし
て合成された。

先ず、ファルマシア社製のＨＩＡ合成装Ｗ、［シーンア
センブラ−」を用いて、次の塩基配列を有する６種類の
一本鎖ＤＮＡを合成した。これらの内で、式（３）と（
８）、（４）と（７）及び（５）と　（６）は末端の一
部分を除き互いに相補的な１１ＮＡである。

式（３） ％式％ 式（４） ５’−ＧＡＴＣＴＴＣＡＴＧＴＴＣＧＴＴＣＣＧＡＴＣ
ＴＴＣＡεＣＴＡｅＧＧＣＧ＾ＡＣＴＧＣＡＧ 式（５） ％式％ 式（６） ５”−ＡＧＣＴＴＡＴＣＡＣＡＧＧＡＴＣＣＣＧＴＣＣ
ＴＧＧＣＣＴＴＴＧＴＴＧＧＧＣＴＣＴＴＴＴＴＣＴＴ
Ｇ 式（７） ％式％ 式（１） ５′−ＧＡＴＣＴＧＧＴＴＴＴＧＧＴＴＴＴＧＧＴＴＴ
ＴＧＧＴＴＴＴＧＧＴＴＴＴＧＧＴＴＴＧＡＧＴＴＣＧ
ＴＡＡＴＣＡＴＧＧＴＣＡＴＧ式（３）　−（８）　　
にて示されている一本鎖ＤＮＡをポリヌクレオチドキナ
ーゼでそれぞれ処理して５′末端を燐酸化した後に、相
補的ＤＮＡ対である式（３）と（８）、（４）と（７）
及び（５）と（６）をそれぞれアニールさせて形成され
た３本の二本鎖ＤＮＡをＤＮＡリガーゼによりタンデム
に接合することにより式（２）にて示される　ＤＮＡ断
片が得られた。

（２）発現ベクターへの組込み 上記の第（１）項で得た合成りＮＡ断片を、発現ベクタ
ーに組込む操作について、殊に第１図を参照しつつ説明
する。

大腸菌での発現に用いられる市販のベクター（ファルマ
シア社製のプラスミド、ｐ■２２３−３）に制限酵素Ｈ
ｉｎｄｌｌｌ及びＥｃｏＲＩを作用させて切断し、その
断点に、上記の第（１）項で得た合成りＮＡ断片をＤＮ
Ａリガーゼにより接合してプラスミドを再構築した。こ
の再構築プラスミドはｐＫＭＯｌ　と命名されており、
Ｔａｃプロモーターの下流域においてＳＤ配列からｌＯ
残基離れた位置から蛋白質合成が開始されるように設計
されている。従って、大腸菌等に導入した場合には、イ
ソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴ
Ｇ）等での蛋白質の誘導が可能である。

尚、上記の再構築ベクターは制限酵素１ｇ１ｌｌ及びＢ
ａｍＨＩの認識部位を有している。

（３）　１３−ロイシン−モチリン遺伝子を２つ又はそ
れ以上包有している発現用プラスミドの造成 これについては第２図を参照されたい。先ず、上記の第
（２）項で得たプラスミド（ｐＫＭＯｌ）を制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ及び［ｌａｍＨＩにより処理して１３−ロイシ
ン−モチリン遺伝子部分の上流域とベクター内の１ケ所
で切断してフラグメントを回収した。次に、上記の第（
２）項で得たプラスミドであって、切断処理した上記プ
ラスミドとは別のプラスミド（ｐＫＭＯｌ）を制限酵素
ＥｃｏＲＩ及びＢｇｌｌＴにより処理してベクター内の
上記箇所と同一の箇所及び１３−ロイシン−モチリン遺
伝子部分の下流域が上記の上流域の断点と共通となるよ
うに切断し、その断点に上記の切断回収されたフラグメ
ントをＤＮＡリガーゼにより接合してプラスミドを再構
築すれば、１３−ロイシン−モチリン遺伝子を２つ包有
している発現用プラスミド（ｐＫＭＯ２）が得られる。

この場合に１３−ロイシンモチリン遺伝子相互間はＡｓ
ｐ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔのペプチドで連結
されている。

尚、上記の場合に、制限酵素ＢａｍＨＩによる断点と制
限酵素Ｂｇｌｌｌによる断点とがＤＮＡリガーゼにより
接合されるが、この接合部位はこれら両酵素の切断認識
部位ではなくなってしまう。従って、上記の切断及び接
合操作を繰り返すことにより、１３−ロイシン−モチリ
ン遺伝子がタンデムに任意数結合され、その上流にメチ
オニンを介してリーダーペプチド配列を有しているプラ
スミドを得ることができる。

（４）　１３−ロイシン−モチリン含有融合蛋白の産生 上記の第（３）項に記載のようにして調製され、タンデ
ムに４つ連結されている　１３−ロイシン−モチリン遺
伝子を包有しているプラスミド（ｐＫＭＯ４）を大腸菌
（ＪＭ１０５）に取込ませ、この形質変換菌をアンピシ
リン５０μｇ／ｍｌ含有培養液（例えば、Ｍ９培地に０
．５％カザアミノ酸を添加したもの）により且つエイプ
ル社製のＤ型ファーメンタ−を用いて３０℃において通
気培養した。Ａ６６０が０．６−０．８になった時点で
イソプロピルチオ−β−ローガラクトピラノシド（ＩＰ
ＴＧ）を添加し、最終濃度を１．５ｍＭになした。

その後、１６時間培養を継続し、次いで遠心分離（８０
００ｒｐｍ、４℃、５分間）により菌体を回収した。こ
の菌体の一部を採取してＳＯＳポリアクリルアミドゲル
電気泳動（１５％）にかけて分析した処、所望の融合蛋
白は全蛋白の約３０％に達していた。これは、プラスミ
ドに組込まれた合成りＮＡにおけるリーダーペプチド配
列部分が極めて効率良く顆粒球の形成を促し、又プロテ
アーゼによる分解を殆ど受けないためであると推定され
た。

（５）　１３−ロイシン−モチリンの分離精製上記の第
（４）項で得られたペースト状菌体（１００ｍｌ相当）
を１０ｍＭ　ＰＢＳ−ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）　３０
＋ｎｌ中に懸濁させ、超音波処理し菌体を破壊した。菌
体残渣を１８０００ｒｐｍで３０分間遠４：、、　９↓
理してペレット化させた。このペレットはリーダーペプ
チドと　１３−ロイシン−モチリン４量体の融合蛋白を
包有している。

従って、このベレット　（蛋白量的１００ｍｇ）を７０
％蟻酸溶液３０ｍ１に溶解させ、この溶液にブロムシア
ン３０ｍｇを添加し、３７℃以下の温度条件下において
一晩反応させた。その後、蒸留水２００ｍ１を添加し、
凍結乾燥することにより蟻酸及びブロムシアンを除去し
た。残渣を０．１％トリフルオロ酢酸に溶解させ、次い
で不溶性物質を除去した後に下記の条件でＨＰＬＣにか
けた。

カラム：　マイクロボンダスフェアＣ−１８（３，９ｍ
ｍ　ｘ　１５ｃｍ）（ウォーターズ社製） 流速　：　　０．８ｍｌ／ｗｉｎ 溶出液：０．１％トリフルオロ酢酸中５％から７０％迄
のアセトニトリルの直線勾 配、４０分間） ＨＰＬＣによるメインピーク部分を回収して凍結乾燥さ
せ、その一部（１００μｇ）を採取して５０ｍＭ燐酸緩
衝液（ｐＨ８，０，１００μ＋）に溶解させ、エンドプ
ロテアーゼＡｓｐ−Ｎ　（ベーリンガーマンハイム社製
）を０．１μｇ添加し、３７℃の温度条件下で１６時間
反応させた後に、上記と同様の条件でＨＰＬＣにかけ、
メインビーク部分として所望の１３−ロイシン−モチリ
ンを得た。この１３−ロイシン−モチリンのペプチド配
列をアプライドバイオシステムズ社製のベプチドシーク
エンサーにより調べた処、正しい配列を有していること
が確認された。

上記のように操作を行うことにより、大腸菌１リツトル
の培養で所望のモチリン様物質を４００５００ｍｇ得る
ことができた。

生　’−−（腸管収縮活性の測定） 上記の製造例で得られた１３−ロイシン−モチリンを被
験物質とし、抽出法により得られた純モチリンを対照物
質とし、ウサギ十二指腸を用いるマグヌス法［”Ｊ、　
Ｐｈａｒｍ、Ｐｈａｒｍａｃ、”第２８巻第６５０−６
５１頁（１９７６年）１に従い腸管収縮活性を測定した
結果は第３図に示される通りであった。

この図から明らかなように、アセチルコリンｔ （１０Ｍ）による収縮を１００％とした場合に、本発明
により得られた１３−ロイシン−モチリンが示す腸管収
縮活性は純モチリンと同程度のレベルであることが確認
された。

（発明の効果） 本発明によれば、モチリン様遺伝子のアミノ酸配列をコ
ードする塩基配列を包含するＤＮＡ断片が、分割して化
学合成され、次いで結合させることにより、所望のもの
として形成されるので、このＤＮＡ断片の合成が比較的
容易である。このＤＮＡ断片においてモチリン様遺伝子
をコードするアミノ酸配列のＮ末端側にはメヂオニンを
介してリーダーペプチド配列が存在し、このモチリン様
遺伝子含有ＤＮＡ断片ををベクターとしてのプラスミド
に組込み且つ該プラスミドを微生物に取込ませて培養す
る場合に、上記のリーダーペプチドがモチリン様活性物
質の産生を促進するので生産効率が上昇する。

尚、上記のリーダーペプチド配列の後には、モチリン様
遺伝子をタンデムに複数個連結させることができ、この
ようにモチリン様遺伝子を複数個包有しているＤＮＡを
プラスミドに組込み且つ該プラスミドを微生物に取込ま
せて培養すれば、当然のことながらモチリン様活性物質
の発現率を著しく向上させることができる。

しかも、本発明方法によれば、精製処理がブロムシアン
による処理と酵素による　ｌステップ処理であるために
極めて簡便であり、しかも産生された融合蛋白をブロム
シアンで処理することにより上流側のリーダーペプチド
部分が切断除去され、又酵素処理することにより下流側
のペプチド部分が切断除去されるので、モチリン様活性
物質のみが極めて純粋な形で得られると云う利点がもた
らされる。

従って、本発明はモチリン様生理活性物質を廉価に且つ
大量に生産することを可能にするものであり、術後にお
ける患者の腸管麻痺等に現在用いられており副作用が強
いプロスタ−グランジン等に代わるべき安全な医薬品を
提供するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明方法の要部を構成する、モチリン様遺伝
子１つを包有する遺伝子組換えプラスミドの構築態様を
示す説明図；第２図は第１図と同様の、但しモチリン様
遺伝子を２つタンデムに包有する遺伝子組換えプラスミ
ドの構築態様を示す説明図、第３図は本発明方法により
製造された１３−ロイシン−モチリンと従来法により得
られた純モチリンの腸管収縮活性をマグナス法により測
定した結果を示すグラフである。 特許出願人　株式会社三和化学研究所

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）式（１） 【遺伝子配列が有ります】 （式中ＸはＭｅｔ及びＡｓｐ以外のアミノ酸残基を意味
   する） にて示されるモチリン様ポリペプチドの製法であって、
   非電荷極性アミノ酸を少なくとも６残基有しており且つ
   末尾にメチオニンを有しているペプチドをコードしてい
   る一本鎖ＤＮＡと、上記の式（１）にて示されるアミノ
   酸配列をコードしている一本鎖ＤＮＡと、これらの一本
   鎖ＤＮＡにおける塩基配列と相補的な塩基配列を有して
   いる各一本鎖ＤＮＡとをそれぞれ合成し、これらの合成
   一本鎖ＤＮＡを用いて上記の非電荷極性アミノ酸をリー
   ダー配列としてコードしている二本鎖ＤＮＡを作成し、
   この二本鎖ＤＮＡの末端にそれぞれ特定の制限酵素認識
   部位を付加し、一方他の蛋白質遺伝情報が組み込まれた
   プラスミドを上記の両制限酵素と同種の制限酵素で切断
   し、その断点に上記の制限酵素認識部位付き合成二本鎖
   ＤＮＡを付加してプラスミドを再構築し、この再構築プ
   ラスミドを微生物に取り込ませて形質転換させると共に
   培養して上記の式（１）にて示されるアミノ酸配列を包
   含するポリペプチドを融合蛋白の一部として産生させ、
   次いで微生物を破壊させた後にブロムシアン及びエンド
   ペプチダーゼにより処理することにより融合蛋白から上
   記の式（１）にて示されるポリペプチドを分離させ、そ
   の後に分画処理により該ポリペプチドを単離することを
   特徴とする、モチリン様ポリペプチドの製法。
2. （２）非電荷極性アミノ酸がアスパラギン、グルタミン
   、スレオニン及びセリンから選ばれたものであることを
   特徴とする、請求項（１）に記載のモチリン様ポリペプ
   チドの製法。
3. （３）合成二本鎖ＤＮＡの組込まれた再構築プラスミド
   を二種類の制限酵素で処理して１３位変換モチリン遺伝
   子部分の上流域とベクター内の１ヶ所で切断して得たフ
   ラグメントを回収し、一方上記の合成二本鎖ＤＮＡの組
   込まれた同種の再構築プラスミドを二種類の制限酵素で
   、即ち一種類はベクター内で切断するために用いた上記
   と同一の制限酵素で、更にもう一種類は１３位変換モチ
   リン遺伝子部分の下流域が上記の上流域の断点と共通と
   なるような上記とは別の制限酵素を採用して切断し、そ
   の断点に上記の切断回収されたフラグメントをＤＮＡリ
   ガーゼによりタンデムに接合してプラスミドを再構築し
   、必要に応じてこのような操作を繰り返して１３位変換
   モチリン遺伝子を２つ又はそれ以上組込んだプラスミド
   を構築し、このプラスミドを微生物に取込ませて培養す
   ることを特徴とする、請求項（１）又は（２）に記載の
   モチリン様ポリペプチドの製法。
4. （４）非電荷極性アミノ酸を少なくとも６残基有してい
   るリーダー配列ポリペプチドと、このリーダー配列ポリ
   ペプチドの下流にメチオニンを介して連結されており且
   つ１３位がメチオニン及びアスパラギン酸以外のアミノ
   酸の残基である１３位変換モチリンに相当するポリペプ
   チドが連結されていることを特徴とする、モチリン様ポ
   リペプチド製造用の組換えＤＮＡ。
5. （５）非電荷極性アミノ酸を少なくとも６残基有してい
   るリーダー配列ポリペプチドと、このリーダー配列ポリ
   ペプチドの下流にメチオニンを介して連結されており且
   つ１３位がメチオニン及びアスパラギン酸以外のアミノ
   酸の残基である１３位変換モチリンに相当するポリペプ
   チドが連結されている組換えＤＮＡが組込まれているこ
   とを特徴とする、モチリン様ポリペプチド製造用の発現
   用プラスミド。