KR960011525B1 - 모티린형 폴리펩티드의 제조방법 및 그것의 발현 - Google Patents

모티린형 폴리펩티드의 제조방법 및 그것의 발현 Download PDF

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Abstract

내용없음.

Description

모티린형 폴리펩티드의 제조방법 및 그것의 발현
제1도는, 본 발명의 방법의 요부를 구성하는, 모티린형 유전자 하나를 포함하고 있는 재조합 DNA를 갖는 플라스미드의 제조과정을 나타내는 설명도.
제2도는, 제1도에서와 같으나, 단, 2개의 모티린형 유전자를 텐덤으로 포함하는 플라스미스의 제조과정을 나타내는 설명도.
제3도는, 본 발명의 방법으로 제조된 13-루이신-모티린(이하[루이신13]-모티린으로 포기함)과 종래 방법으로 얻은 순수 모티린의 장관(intestinal canal) 수축 활성을 마그너스법으로 측정한 결과를 나타내는 그래프.
본 발명은 모티린(motilin)형 폴리펩티드의 제조방법, 그것을 위한 재조합 DNA 및 재조합 DNA가 조립(insert)된 발현용 플라스미드에 관한 것이다.
본 발명에 의한 폴리펩티드는 의약으로서, 특히 위장장애의 치료제로서 사용할 수 있다.
모티린은, 브라운(Brown J.C.)등에 의해 돼지의 상부 소장 점막으로부터 분리되고, 그것의 아미노산 결합 서열이 결정된 펩티드 호르몬의 1종이다(가스트로엔터롤러지(Gastroenterology), 62권, 401-404쪽(1972) 및, 캐나디언 저널 오브 바이오 케미스트리(Can. J. Biochem.), 52권, 7-10쪽(1974)). 돼지의 모티린은, 22개의 아미노산으로 이루어져 있고, 분자량은 약 2,700이다.
한편, 인간에게서의 모티린에 대하여는, 본 발명자들에 의해, 그것의 cDNA 클로운(clone)이 분리됨과 동시에 구조의 결정이 되고, 그 결과, 그것의 아미노산 결합 서열은 돼지에게서의 그것과 동일하다는 것이 밝혀진바 있다(일본국 특허 제276489(A)/1988호, 이에 상응한 미합중국 특허출원 제07/190849호 및 유럽 특허출원 제88107108.8호).
모티린의 생리작용으로서는, 소화관의 운동기능항진 작용 및 소화관 평활근 수축작용이 잘 알려져 있다.
이들 작용가운데, 소화관의 운동기능항진 작용에 대하여는, 예를 들면 위장에 있어서의 배출시간을 단축시키는 작용이 보고되어 있고(가스트로엔터롤러지, 80권, 456-460쪽(1981)), 또, 소화관 평활군 수축작용에 대하여는, 토끼와 인간의 위장관에 대하여 신경경로에 의존하지 않고 강한 수축을 초래하는 것이 알려져 있고, 어떤 특정적인 부작용에 대해서는 보고되어 있지 않다. 따라서, 모티린은 수술후에 있어서의 위장장애의 치료 및 진단에 유용한 것으로 고려되고 있다.
이러한 점에 비추어, 수술후에 있어서의 장관마비등의 치료에 프로스타그랜딘(prostaglandin)등이 사용되고 있으나, 부작용이 강하는 점에 문제가 있다.
또한, 모티린의 아미노산 결합 서열의 13위치는 메티왠이다. 이것을 루이신 또는 노르루이신(norleucine)으로 변환시킨 아미노산 구조를 갖는 화학합성된 것도 모티린과 동일한 생리활성을 나타낸다는 것이 보고되어 있고(Scand. J. Gastroenterology, 제11권, 119-203쪽(1976)등), 13위치의 메티오닌은 모티린의 활동에 거의 영향을 끼치지 않는 것으로 고려되고 있다.
널리 받아들여지고 있는 관용 기술에 따르면, 모티린은 일반적으로 돼지의 기관조직으로부터 얻는 것이어서, 대량생산이 극히 곤란하다.
한편, 화학합성법을 이용하는 경우에도, 모티린은 아미노산 수가 22인 폴리펩티드이기 때문에, 대량생산이 어렵다.
즉, 모티린은 위장장애의 치료등에 있어서 유효성이 기대되고 있음에도 불구하고, 생산성이 낮기 때문에 임상치료에 널리 이용되는데는 이르지 못하고 있다.
따라서, 소위 바이오-테크놀러지를 응용하여 모티린형 활성을 갖는 폴리펩티드를 염가로 제조하기 위한 다양한 연구가 거듭되고 있다(일본국 특허 제71195(A)/1988호 및 제102096(A)/1989호).
본 발명의 기본적인 목적은, 종전의 공정보다 쉬운, 모티린형 폴리펩티드의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 중요한 목적은, 모티린형 폴리펩티드를 극히 효율적으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기의 제조방법을 실시하는데 사용되는 새로운 재조합 DNA를 제공하는 것이다.
본 발명의 나머지 목적은, 상기의 재조합 DNA를 조립시킨 발현용 플라스미드를 제공하는 것이다.
본 발명에 따르면, 상기의 목적은, 식(1)
Figure kpo00001
(상기 식에서, X는 Met 및 Asp 이외의 아미노산 잔기를 의미함)로 표시되는 모티린형 폴리펩티드의 제조방법으로부터 달성되는데, 비전하 극성 아미노산 잔기를 적어도 6개 갖고 있고, 말단 위치에 메티오닌을 갖고 있는 단사 DNA와, 상기 식(1)에 나타난 아미노산 결합 서열을 코우드(Code)한 단사 DNA와, 그리고, 이들 단사 DNA에 있어서의 염기 배열과 상보적인 염기 배열을 갖는 각 단사 DNA를 각각 합성하고, 이들 합성 단사 DNA를 사용하여 상기한 비전하 극성 아미노산 전기를 리이더(leader) 배열로서 코우드되어 있는 2중사 DNA를 만들고, 이 2중사 DNA의 말단에 각각 특정의 제한효소 인식부위를 부가하고, 다른 단백질 유전정보를 갖는 플라미스드를 상기한 제한효소로 절단하고, 절단된 플라스미드의 각 절단부위에 상기 2중사 DNA를 결찰시켜 재조합 DNA를 갖는 플라스미드로 재구성(re-construction)하고, 재구성된 플라스미드를 사용하여 미생물을 형질전환시킴과 동시에 배양하여 상기 식(1)로 나타난 아미노산 결합 서열을 포함하는 폴리펩티드를 융합 단백질(fused protein)의 일부로서 생산시키고, 그다음 미생물을 파괴시킨후에 시아노겐 브로마이드와 펩티드 중간분해효소(endopeptidase)로 처리하여 융합 단백질로부터 상기 식(1)로 표시된 폴리펩티드를 분리해내고, 분획처리하여 그 폴리펩티드를 정제하는 것을 특징으로 하는, 모티린형 폴리펩티드의 제조방법으로부터 상기의 주목적이 달성된다.
본 발명의 방법으로 제조되는 모티린형 폴리펩티드를 나타내는 식(1)에 있어서, 13위치의 아미노산 잔기인 X가 Met 및 Asp 이외의 아미노산 잔기로 되어 있는 것은, 그 부위가 Met이면, 다음 공정 즉, 생산된 융합 단백질을 시아노겐 브로마이드로 처리하는 경우에 13위치의 Met 부위에 있어서도 절단이 생기기 때문에 모티린형 활성을 갖는 원하는 폴리펩티드를 얻을 수 없으며, 또한, 본 발명의 방법에서는 합성의 형편상, 식(1)로 표시된 폴리펩티드에 상당하는 단자 DNA를 분할합성하는데 있어서, 그 C말단 위치의 아미노산 결합 서열인 Lys-Gly-Glu의 다음에는 Asp를 코우드한 코돈(GAC)가 있고, 후공정에서, 즉, 펩티드 중간분해효소로 처리하여, 여분의 아미노산을 분리하도록 요구되는 때에, 상기와 같은 13위치가 Asp이면, 그 부위에 있어서도 절단이 생겨 모티린형 활성을 갖는 원하는 폴리펩티드를 얻을 수 없다.
또한, 본 발명의 방법으로 얻어지는 폴리펩티드는, X가 의미하는 아미노산 잔기의 종류에 따라 활성에 정도의 차를 보이나, 모티린형의 생리활성을 갖고 있다. 단, 13위치의 아미노산 잔기로서는 루이신(Leu), 발린(Val)등이 바람직하다. 13위치의 아미노산 잔기가 글리신(Gly) 또는 프롤린(Pro)인 폴리펩티드는, 입체구조로부터 판단되는 바와 같이 상대적으로 활성이 낮기 때문에 바람직스럽지 못하다.
비전하 극성 아미노산으로서는, 여러가지 검토결과, 아스파라진(Asn), 글루타민(Gen), 트레오닌(Thr) 및 세린(Ser)이 발현율의 향상을 초래하는 점에서 적합한 것으로 판명되었다.
리이터 배열 펩티드에 있어서의 말단 아미노산 잔기가 메티오닌(Met)로 구성되어 있는 것은, 다음 공정, 즉 시아노겐 브로마이드로 처리하여 리이더 배열부분을 용이하게 절단, 제거할 수 있도록 하기 위한 것이다.
본 발명에 따르면, 식(1)로 표시되는 단사 DNA는 분할하여 합성할 수 있고, 그렇게 하여 합성을 용이하게 할 수 있다. 13위치에 변환된 모티린형 유전자를 코우드한 합성된 2중사 DNA는, 전통적인 방법, 예를 들면 대장균(E. Coli)으로부터 플라스미드를 꺼내어 정제하고, 제한효소로 처리하여 절단하고, DNA 리가아제로 절단된 플라스미드의 절단부위에 2중사 DNA를 결찰시켜 재조합 DNA의 플라스미드를 재구성하는 등의 방법으로 플라스미드등의 벡터로 조립시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 방법에 따르면, 2종류의 제한효소로 처리하여 13위치가 변환된 모티린형 유전자 부분의 상류(upperstream) 부위와 플라스미드의 다른 부위에서 플라스미드를 절단하여 단편(fragment)를 회수하고, 상기 재조합 DNA를 갖는 동종의 플라스미드를 한 종류는 첫번째 플라스미드를 내부에서 절단하는데 사용된 것과 동일한 제한효소로, 다른 한 종류는 13위치가 변환된 모티린 유전자 부분의 하류부위가 상기한 상류부위의 절단부위와 공통되도록 상기한 것과는 다른 제한효소를 사용하여 절단하고, 그 절단부위에 상기의 회수된 단편을 DNA 리가아제로 텐덤(tandem)으로 접합시켜 플라스미드를 재구성하고, 필요에 따라 이러한 조작을 반복하여 13위치가 변환된 모티린형 유전자를 2개 또는 그 이상으 텐덤으로 조립시킨 플라스미드를 구성할 수가 있다.
이 경우에, 13위치가 변환된 모티린형 유전자 부분 사이는, 예를 들면 Asp-Gey-Ile-Phe-Met로 된 펩티드로 연결하는 것이 유리한데, 그 이유는, 이러한 펩티드로 연결하여 놓으면, 생산된 융합 단백질로부터 13위치가 변환된 모티린형 폴리펩티드를 분리시키는 공정에서 시아노겐 브로마이드를 작용시키면 Met 부분에서 절단이 일어나고, 또 펩티드 중간효소(Asp-N)을 작용시키면 Asp의 N말단부분에서 또 다른 절단이 생겨, 13위치가 변환된 모티린형 폴리펩티드가 과잉의 펩티드 잔기를 갖지 않는 순수한 형태로 얻어지기 때문이다.
하나 또는 그 이상의 모티린형 유전자가 조립된 플라스미드를 미생물이나 성숙한 세포에 넣어 배양시키면 모티린형 폴리펩티드를 대량으로 얻을 수 있다.
본 발명에 의한 재조합 DNA는, 상술한 설명으로부터 명백한 바와 같이, 비전하 극성 아미노산 잔기를 적어도 6개 갖고 있는 리이더 배열 폴리펩티드가, 이 리이더 배열 폴리펩티드의 C말단 부위의 메티오닌과 연결되어 있고, 또, 13위치가 메티오닌 및 아스파르트산 이외의 아미노산 잔기인 13위치가 변환된 모티린의 메티오닌 다음에 연결되어 있는 것을 특징으로 한다. 이경우, 13위치가 변환된 모티린에 상당한 폴리펩티드가 여러개, 그리고 텐덤으로 접합되어 있는 것이 유리하고, 이 폴리펩티드의 상호간의 Asp-Gly-Ile-Phe-Met로 된 펩티드로 연결되어 있는 것이 유리하다.
한편, 본 발명에 의한 발현용 플라스미드는, 상기와 같은 재조합 DNA가 조립되어 있는 것이 특징이다.
이제, 제조예 및 약리활성 시험예에 관련하여 본 발명을 좀더 상세히 설명하고자 한다.
또한, 아래에서는, 모티린의 13위치가 루이신으로 변환된 모티린형 폴리펩티드의 제조방법에 관련된 설명이 있으나, 메티오닌 또는 아스파르트산 이외의 아미노산 잔기이면, 같은 방법으로 13위치가 변환된 다른 모티린형 폴리펩티드를 제조할 수 있다는 점에 유의할 필요가 있다.
본 발명에 사용된 대장균은 일본국 FRI(Fermentation Research Institute)에 기탁번호 FERM BP-2556으로 기탁되어 있다.
[제조예]
(1) 모티린형 생리활성 폴리펩티드를 코우드한 DNA 합성.
인간의 모티린은 다음과 같은 아미노산 결합 서열을 갖는 것으로 알려져 있다.
Figure kpo00002
또한, 13위치 Met은, 모티린의 활성에 거의 영향을 주지 않는 것으로 알려져 있다.
따라서, [루이신13]-모티린의 아미노산 결합 서열을 코우드한 누클레오티드 배열을 포함하고, 그것의 N말단 위치에는 메티오닌을 통하여 다수의 비전하 극성 아미노산 잔기를 갖는 리이저 펜티드
Figure kpo00003
Figure kpo00004
Figure kpo00005
를 코우드한 또다른 누클레오티드 배열을 갖고, 또, C말단 위치에는 아미노산 결합 서열
Figure kpo00006
Figure kpo00007
로 된 펩티드를 코우드한 누클레오티드 배열을 갖는 하기의 식(2)로 표시되는 2중사 DNA 단편을 제조했다.
Figure kpo00008
상기 식(2)로 표시된 2중사 DNA는 다음과 같이 하여 합성했다.
우선, 파마시아사(스웨덴) 제품의 DNA 합성장치 진 어셈블러(Gene Assembler)를 사용하여, 다음의 누클레오티드 배열을 갖는 6종류의 단사 DNA를 합성했다.
이들 가운데, 식(3)과 (8), (4)와 (7) 및 (5)와 (6)은 말단의 1부분을 제외하고 서로 상보적인 DNA이다.
Figure kpo00009
상기 식(3)-(8)로 표시된 단사 DNA를 폴리누클레오티드 키나아제(Polynuceotide Kinase)로 각각 처리하여 5'-말단을 인산화시킨 다음, 식(3)과 (8), (4)와 (7) 및 (5)와 (6)의 각 상보적 DNA 쌍을 각각 어니일링(annealing)시켜 형성된 3중사 DNA를 DNA 리가아제로 텐덤으로 접합시켜 식(2)로 표시된 단편을 얻었다.
(2) 발현벡터로의 DNA 단편의 조립.
상기한 제(1)항에서 얻은 합성 DNA 단편을, 발현벡터로 조립하는 조작에 대하여, 특히 제1도를 참조해서 설명한다.
대장균에서의 발현에 사용되는, 시판되는 벡터(스웨덴 파마시아사 제품의 플라스미드, pkk 223-3)에 제한효소 HindIII 및 EcoR I를 작용시켜 절단하고, 절단부위에 상기 제(1)항에서 얻은 합성 DNA 단편을 DNA 리가아제로 접합시켜 플라스미드를 재구성했다.
이 재구성된 플라스미드는 pKMO1로 명명되고, Tac 프로모터(promoter)의 하류부위에 있어서 SD 배열로부터 10개의 잔기 다음의 위치에서 단백질 합성이 시작되도록 설계되어 있어서, 대장균등에 도입한 경우에는, 이소프로필티오-β-D-갈락토피라노사이드(IPTG)등의 사용으로 단백질의 생산이 가능하다.
또한, 재구성된 벡터는 제한효소 Bg1II 및 BamH I의 인식부위를 갖고 있다.
(3) [루이신13]-모티린 유전자를 2개 또는 그 이상 갖는 발현용 플라스미드의 조성.
여기에 대하여는 제2도를 참조한다.
우선, 상기의 제(2)항에서 얻은 플라스미드(pKMO1)를 제한효소 EcoR I 및 BamH I로 처리하여 [루이신13]-모티린 유전자 부분의 상류부위와 벡터내의 1부위에서 절단하여 단편을 회수했다.
그런다음, 또다른 플라스미드(pKMO1)을 제한효소 EcoR I 및 Bg1II로 처리하여 벡터내의 상기 부위와 동일한 부위 및 [루이신13]-모티린 유전자 부분의 하류부위가 상기한 상류부위의 절단부위와 공통되도록 절단하고, 그 절단부위에 상기 절단회수된 단편을 DNA 리가아제로 접합시켜 플라스미드를 재구성하면, [루이신13]-모티린 유전자를 2개 갖는 발현용 플라스미드(pKMO2)를 얻을 수 있다.
이 경우에, [루이신13]-모티린 유전자 상호간의 Asp-Gly-Ile-Phe-Met의 아미노산 결합 서열을 코우드한 펩티드로 연결된다.
또한, 제한효소 BamHI에 의한 절단부위와 제한효소 Bg1II에 의한 절단부위가 DNA 리가아제로 접합되었으나, 이 접합부위는 이들 양 효소에 의해 인식될 수 없는 부위로 되고 만다.
따라서, 상기한 절단 및 접합 조작을 반복하여, [루이신13]-모티린 유전자가 텐덤으로 임의의 수로 결합되고, 그 상류에 메티오닌을 통하여 리이더 펩티드 배열을 갖는 재구성된 플라스미드를 얻을 수 있다.
(4) [루이신13]-모티린 함유 융합 단백질의 생산.
텐덤으로 4개 연결된 [루이신13]-모티린 유전자를 함유한 플라스미드(pKMO4)를 대장균(JM105)에 넣고, 그 형질변환균을 배양액(예컨데, M9 배지에 0.5% 카사미노산을 첨가한 것)을 함유한 안피실린 50㎍/ml에서, 그리고 발효조(에이블사 제품, D형)를 사용하여 30℃에서 통기배양했다.
A660이 0.6-0.8로 된 때에, 이소프로필티오-β-D-갈락토피라노사이드(IPTG)를 첨가하고, 최종 농도를 1.5mM로 만들었다.
그후, 16시간 동안 배양을 계속한 다음, 원심분리(8,000rpm, 4℃, 5분간)하여 균체를 회수했다.
이 균체의 1부를 채취하여 SDS 폴리아크릴아미드겔 전기영동(15%)로 분석한바, 원하는 융합 단백질은 전체 단백질의 약 39%에 달했다.
이것은, 플라스미드에 조립된 합성 DNA에 있어서의 리이더 폴리펩티드 배열 부분이 극히 높은 효율로 과립구의 형성을 촉진하고, 또 프로테아제에 매우 안정하기 때문인 것으로 추정된다.
(5) [루이신13]-모티린의 분리 정제.
상기 제(4)항에 얻은 페이스트(paste)형 균체(100ml)를 10mM PBS-EDTA(pH 8.0) 30ml중에 현탁시키고, 초음파 처리하여 균체를 파괴시켰다. 균체의 잔유물을 18,000rpm으로 30분간 원심분리하여 펠릿(pellet)화 했다.
이 펠릿은 리이더 펩티드와 [루이신13]-모티린 4량체의 융합 단백질을 함유하고 있다.
따라서, 이 펠릿(단백질량 : 100mg 정도)을 70% 포름산 용액 30ml에 용해시키고, 이 용액에 시아노겐 브로마이드 30mg를 첨가하고 37℃ 이하의 온도조건하에서 하루저녁 반응시켰다.
그런다음, 증류수 200ml를 첨가하고, 동결건조하여 포름산 및 시아노겐 브로마이드를 제거했다.
잔유물을 0.1% 트리플루오로초산에 용해시킨 다음, 불용성 물질을 제거한 후에 다음 조건으로 HPLC에 걸었다.
컬럼 : 마이크로폰다스페어 C-18(3.9mm×15cm), (위터스사 제품)
유속 : 0.8ml/분
용출액 : 0.1% 트리플루오로초산중 5%-70% 아세토니트릴의 직선구배(40분간)
HPLC에 있어서의 주피크 부분을 회수하여 동결건조시키고, 그 일부(100㎍)을 채취하여 50mM 인산완충액(pH 90,100μl)에 용해시키고, 펩티드 중간분해효소 Asp-N(서독 베링거 만하임사 제품)을 0.1㎍ 첨가하고, 37℃의 온도에서 16시간 동안 반응시켰다.
반응액을 상기와 동일한 조건하에서 HPLC에 걸어, 주피크 부분으로서 원하는 [루이신13]-모티린을 얻었다. 이 [루이신13]-모티린의 배열을 바이오시스템사 제품인 펜티드 시퀀서(sequencer)를 사용하여 조사한바, 우선(right)성을 갖는 것이 확인되었다.
상기와 같이 조작을 하여, 대장균 1ℓ의 배양으로 원하는 모티린형 폴리펩티드를 400-500mg 얻을 수 있었다.
[생리활성 시험예]
(장관 수축 활성의 측정)
상기 제조예에서 얻은 [루이신13]-모티린을 시험물질로 하고, 통상적인 추출법으로 얻은 순수한 모티린을 대조물질로 하여, 토끼의 십이지장을 사용하는 마그너스법(J. Pharm. Pharmac. 제28권, 650-651쪽(1976))에 따라 장관 수축 활성을 측정한 결과는 제3도에 나타낸 바와 같다.
이 도면에서 알 수 있는 바와 같이, 아세틸콜린(10-6M)에 의한 수축을 100%로 놓은 경우에, 본 발명의 방법으로 얻어진 [루이신13]-모티린이 나타내는 장관 수축 활성은 순수 모티린과 같은 정도의 레벨인 것이 판명되었다.

Claims (5)

  1. 식(1)
    Phe-Val-Pro-Ile-Phe-Thr-Tyr-Gly-Glu-Leu-Leu-Gln-Alg-X-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn-Lys-Gly-Gln
    (상기 식에서, X는 Met 및 Asp 이외의 아미노산 잔기를 의미함)로 표시되는 모티린형 폴리펩티드의 제조방법에 있어서, 비전하 극성 아미노산 잔기를 적어도 6개 갖고, 또, 말단 위치에 메티오닌을 갖는 단사 DNA와, 상기 식(1)로 표시된 아미노산 결합 서열을 코우드한 단사 DNA와, 이들 단사 DNA의 상보적인 단사 DNA를 각각 합성하고, 이들 4개의 합성된 단사 DNA 단편과, 비전하 극성 아미노산 잔기를 갖는 DNA 단편과 그것의 상보적인 DNA 단편을 사용하여 리이더 배열로서 2중사 DNA를 만들고, 이 2중사 DNA 단편의 말단에 각각 특정의 제한요소 인식부위를 부가하는 한편, 다른 단백질 유전정보가 조립된 플라스미드를 상기 제한효소로 절단하고, 상기 2중사 DNA 단편을 절단된 플라스미드의 각 절단부위에 부가하여 재조합 DNA를 갖는 플라스미드로서 재구성하고, 이 재구성된 플라스미드를 사용하여 미생물을 형질 변화시킴과 동시에 배양하여 상기 식(1)로 표시된 아미노산 결합 서열을 코우드한 폴리펩티드를 융합 단백질의 일부로 생산하고, 미생물을 파괴한 후에 시아노겐 브로마이드와 펩티드 중간분해효소로 처리하여 상기 식(1)로 표시된 폴리펩티드를 분리해내고, 그다음 분획처리하여 폴리펩티드를 정제하는 것을 특징으로 하는 모티린형 폴리펩티드의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 비전하 극성 아미노산이 아스파라진, 글루타민, 트레오닌 및 세린으로부터 선택된 것인 모티린형 폴리펩티드의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 합성된, 13위치가 변환된 모티린형 유전자가 조립된 재구성 플라스미드를 2종의 제한효소로 처리하여, 13위치가 변환된 모티린형 유전자 부분의 상류부위와 플라스미드의 다른 부위에서 절단하여 얻은 플라스미드 단편을 회수하는 한편, 재구성된 플라스미드를, 한 종류는 첫번째 플라스미드를 내부에서 절단하는데 사용된 것과 동일한 제한효소로, 다른 한 종류는 13위치가 변환된 모티린형 유전자 부분의 하류부위가 상기한 상류부위의 절단부위와 공통되도록 상기한 것과는 다른 제한효소를 사용하여 절단하여 두번째 플라스미드 단편을 얻고, DNA 리가아제를 사용하여 두번째 플라스미드 단편을 첫번째 플라스미드 단편에 텐덤으로 접합시켜 13위치가 변환된 2개의 유전자를 갖는 플라스미드를 재구성하고, 필요에 따라 이러한 절단 및 접합조작을 반복하여 원하는 수만큼의 모티린형 유전자를 조립시키는 것을 특징으로 하는 모티린형 폴리펩티드의 제조방법.
  4. 비전하 극성 아미노산 잔기를 적어도 6개 갖는 리이더 배열 폴리펩티드와, 이 리이더 배열 폴리펩티드의 하류에 메티오닌을 통하여 연결되고, 또 13위치가 메티오닌 및 아스파르트산 이외의 아미노산 잔기로 된 13위치가 변환된 모티린에 상당하는 폴리펩티드가 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 모티린형 폴리펩티드 제조용 재조합 DNA.
  5. 비전하 극성 아미노산 잔기를 적어도 6개 갖는 리이더 배열 폴리펩티드와, 이 리이더 배열 폴리펩티드의 하류에 메티오닌을 통하여 연결되고, 또 13위치가 메티오닌 및 아스파르트산 이외의 아미노산 잔기로 된 13위치가 변환된 모티린에 상당하는 폴리펩티드가 연결되어 있는 재조합 DNA가 조립되어 있는 것을 특징으로 하는 모티린형 폴리펩티드 제조용의 발현용 벡터.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0378078A1 (en) * 1989-01-06 1990-07-18 Sanwa Kagaku Kenkyusho Co., Ltd. Motilin-like polypeptide and use thereof
JPH04299990A (ja) * 1991-03-27 1992-10-23 Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd モチリンアナログの精製方法
US5470830A (en) * 1993-08-06 1995-11-28 Ohmeda Pharmaceutical Products Division Inc. Motilin-like polypeptides that inhibit gastrointestinal motor activity
US5422341A (en) * 1993-08-06 1995-06-06 Ohmeda Pharmaceutical Products Division Inc. Motilin-like polypeptides with gastrointestinal motor stimulating activity
JPH083196A (ja) 1994-06-21 1996-01-09 Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd カルシトニン誘導体及びその用途
DE69935857T2 (de) * 1998-07-10 2008-01-10 Calgene Llc, Davis Expression eukarotischer peptide in pflanzenplastiden
RU2209244C2 (ru) * 2001-04-28 2003-07-27 Закрытое акционерное общество "АСГЛ-Фармацевтические Инновации" Нуклеиновая кислота, кодирующая лидерную последовательность (варианты), вектор на основе плазмиды р6803-platform (варианты), лидерный пептид (варианты) и способ получения белков
WO2011013728A1 (ja) * 2009-07-29 2011-02-03 第一三共株式会社 経粘膜吸収性を付与したモチリン類似ペプチド化合物

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3328793A1 (de) * 1983-08-10 1985-02-28 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Herstellung von sekretin
JPS6078595A (ja) * 1983-10-04 1985-05-04 Wakunaga Seiyaku Kk ２７−デスアミドセクレチンの精製法
JPS62135500A (ja) * 1985-06-20 1987-06-18 モンサント　コンパニ− ポリペプチドからのペプチドの放出
JP2862870B2 (ja) * 1986-09-12 1999-03-03 協和醗酵工業株式会社 新規ペプチド
JP2575022B2 (ja) * 1987-05-07 1997-01-22 株式会社 三和化学研究所 ヒトモチリン前駆体、該前駆体含有クローン化ｄｎａ、その調製法並びに該クローン化ｄｎａが組込まれたプラスミド

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