JPS62135500A - ポリペプチドからのペプチドの放出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は融合蛋白ニジ異種ペプチドを得るための方法及
び組成物に関する。１つの重要な態様において本発明は
、２つのベプチｒ（これが−緒になって細菌の産生ずる
融合蛋白となる）の接合部位に、黄色ブドウ球菌（８ｔ
ａｐｈｙｌｏｃｏａａｕｅａｕｒｅｕｓ　）のｖ８プロ
テアーゼ切断に特異的なアミノ酸配列を含有する、細菌
の産生ずる融合蛋白の切断に関する。もう１つの重要な
態様において本発明は、細菌の産生ずる融合蛋白として
の心房性ペプチドの産生、及び本発明の切断法を用いる
その後の心房性ベプチｒの切断に関する。又別の態様に
おいて本発明は、心房性ペプチドの新規なりＮＡコード
配列の作成に関する。

発明の背景 組み換えｒ）ＮＡ核技術進歩によシ、臨床的従って経済
的に重要な真核生物蛋白を細菌内で産生ずることが可能
になった。細菌の細胞を真核生物蛋白産生のための工場
（例えは宿主細胞）として用いることは、入手できる量
が限定される真核生物蛋白を得る方法として特に魅力的
である。入手できる是が限定される例としてはヒトのホ
ルモンがある。組織抽出物のホルモン産生量は極めて少
量なため、組織を得ることの問題点が一層増大する。

現在真核生物蛋白の産生のために細菌を宿主細胞として
使用するには、まず目的のペプチドをコードする遺伝子
又はＤ　ｒｉＡ配列ｉｓ離又は合成し、次にＩ）ＮＡ配
列又は遺伝子の発現と、その結果としての蛋白の産生、
蓄積及び／又は分泌を可能にするような方法で、遺伝子
又はｒｌＮＡｌＮ上宿主細胞のゲノム中に取込ませる。

しかし遺伝子発現や蛋白産生における真核生物と原核生
物の細胞調節の違いのため幾つかの障害が発生した。真
核生物蛋白、ペプチド又はそれらの断片を細菌中で効率
的にしかも商業的に魅力的な規漠で産生ずるには、これ
らの問題を解決しなければならない。

真核生物では多くの成熟蛋白はまずプレー蛋白（すなわ
ちリーダー配列又はシグナル配列に融合し北成熟蛋白の
配列より成るポリペプチド）として翻訳される。真核生
物ｍＲＮＡは全プレー蛋白をコードしており、これは翻
訳後リーダー配列を除くために処理されて成熟蛋白がで
きる。真核生物細胞はこのようなプレー蛋白を成熟蛋白
に処理する機構を備えているが、細菌細胞は普通真核生
物蛋白中に存在する処理シグナルを認識できない。

従って細菌中の発現のためのＤＮＡ配列として、真核生
物ｍＲＮＡの完全な相補的ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ　）転写
体を用いる時は、成熟蛋白ではなくデレー蛋白が得られ
る。シン−蛋白を試験管内（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　）で成
熟蛋白に変換することもできるが、費用がかかる。

ａ菌における成熟蛋白発現のために、成熟蛋白をコード
するＤＮＡ配列を使用する場合、この配列はり−タ゛−
配列のＤＮＡに通常含まれている真核生物翻訳シグナル
及び翻訳後処理シグナルが欠如している。従って細菌系
でクローン化真核生物遺伝子又は他の異種ｒ）ＮＡ配列
を発ＦＡ：ｉるためには、効率の点から及び真核生物シ
グナルは細菌宿主細胞に認識されないかも知れないとい
う点から、細菌の調節系の使用が通していることが証明
されている。

ここで「異種ＤＮＡＪとは、少なくともその１部は普通
宿主細胞のゲノム中に含まれないｒｌＮＡと定義する。

異種ＤＮＡの例としては、ウィルス遺伝子、真核生物遺
伝子、遺伝子断片、対立遺伝子及び合成りＮＡ配列が含
まれるが、これらに限定されない。

「異種蛋白」又は「異種ポリペブチＰ」とは、少なくと
もその１部は普通宿主細胞のゲノム中にコードされてい
ない蛋白又はポリペプチドと定義する。「ゲノム」とは
、特定の細胞中に含まれる全てのＤＮＡ　（染色体内又
は染色体外）である。

細菌の調節シグナルには、転写を開始させるプロモータ
ー、リボゾーム結合部位ニジ成る翻訳調節シグナル、及
び翻訳停止シグナルがある。翻訳停止シグナルを除くこ
れら全てのシグナルは、発現すべき真核生物遺伝子又は
他のｒｌＮＡＯ前になければならない。

当該技術分野では、細菌中で異種ｒ）ＮＡ　（例えば真
核生物遺伝子）を発現するのに幾つかのアブ。

−チがある。１つのアプローチでは、細菌のプロモータ
ーの支配下にある翻１λ開始シグナル（ＡＴＧ）は、異
種（例えば真核生物）蛋白をコードする１’）ＮＡ配列
の直前に位置している。このようなりＮＡ溝成物を発現
させること、ここで「直接」蛋白産生と定δされる内因
性蛋白又はその断片を含まない真核生物蛋白が産生され
る。しかしＡＴＧ開始シグナルは又メチオニンコドンで
あるため、このように産生された蛋白は典型的にはアミ
ン（Ｎ）−末端メチオニンを含有する。ハリス（）ｉａ
ｒｒｉｅ　）、ティー・ジエイ・プール（Ｔ、Ｊ、Ｒ，
）　（１９８５）ｔ”参照。従ってもし目的の成熟蛋白
がメチオニンで始まらなければ、この蛋白はメチオニン
残基の包含によシ変化したＮ−末端を有することになる
。

又直接産生させるという了ブローチは、普通異−（例え
ば真核生物）ペゾチｒへの応用が成功していない（ここ
で「ペプチｒ」とはアミノ酸の数が１００個未満の蛋白
、又は分子量が約ｉ　ｏ、ｏ　ｏ　ｏダルトン未満の蛋
白である。異種ペプチド直接産生の問題点は、細菌（例
えば大腸菌）はここで１生さｎた真核生物ペプチドを異
物として認識しや丁いこと、従ってこのよう々ペプチド
が産生された直後又は暫く佼に分解し始めるということ
である。例えばフレイブ（Ｒ，に、Ｃｒａｉｇ　）とホ
ール（Ｌ、　Ｈａｌｌ　）　（１９８３年）；イタクラ
（Ｉｔａｋｕｒａ　）ら（１９７７年）を参照。さらに
異種蛋白又はペプチド生成物をコードする核酸（ＤＮＡ
又はＲｈＩＡ　）配列に固有の構造的特徴が、細菌中で
の異種蛋白又はベプチｒの動車的な産生（すなわち翻訳
）としばしば妨害する。従って真核生物ペゾチｔホルモ
ンのような異種ペプチド産生のために別のアプローチが
開始されている。

別のアプローチの１つとしては、目的の蛋白又はペプチ
ドをコードするＤＮＡ断片を、細菌のプロモーターの調
節下にある細菌蛋白の全て又は一部をコードする内因性
１’）ＮＡ　Ｋ結合させる方法がある。

この内因性細ｉ　ＤＮＡは必ずリボゾーム結合部位や翻
訳開始シグナルを有しているう結合時に、目的の蛋白又
はペプチドをコーＰするＤＮＡは、内因性転写及び翻訳
調節シグナル、及び内因性ＤＮＡコード配列と共に同じ
配向でＤＮＡフレーム中に挿ズされる必要がある。結合
したｆ’）ＮＡ　ｆ：発現させることにより、細菌性蛋
白の全て又は一部に結合（例えば融合）した異種蛋白又
はペプチドより成る融合蛋白が得られる。理想的にはこ
の様な融合構成物は、細菌宿主細胞中で、比較的高い及
び／又は安定な量の融合蛋白の蓄積があシ、及び／又は
宿主細胞による高いレベルの分泌があることが望ましい
。

異種蛋白及びペプチドの細菌中での産生は、目的の異洩
精製ペゾチド又は蛋白を内因性蛋白又はその断片に融合
させることにより補助されると報告されている。例えば
、内因性蛋白は転写及び／又は翻訳を増強させた勺（フ
レイブ（Ｃｒａｉｇ）とホール（Ｈａｌｌ　）　（１９
８３年））、又は目的の産物の精製を補助したりするこ
とがある。セセンフエルト（５ｅａｓｅｎｆｅｌａ、　
Ｈ，Ｍ、　）とブルーワー（Ｂｒｅｗｅｒ、　Ｓ、Ｊ、
　）　（１９８４年）（イオン交換カラムへのポリアル
ギニン結合の利用）；ゲルミノ（Ｇｅｒｍｉｎｏ、Ｊ　
、　）とバスチア（Ｂａ５ｔｉａ、ｒ）、　）（１９８
４年）（β−ガラクシダーゼアフイニティカラム）ｆｔ
参照。さらに特にパシルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）や
酵母系で目的の蛋白又はペプチドを内因性に分泌される
蛋白又はシグナルペプチドに融合させると、宿主増殖培
地中へ、細胞内蛋白や内因性蛋白配列を含まない成熟蛋
白産物が分泌されることがある。

さらに融合蛋白アプローチは、外来蛋白やペプチド産物
を細胞内分解から保護するのに有用である。イタクラ（
Ｉｔａｋｕｒａ、　Ｋ、　）ら（１９７７年）、及びフ
レイブフレイブ（Ｃｒａｉｇ、　Ｒ，に、　）とホール
（Ｌ、Ｈａｌｌ）　（１９８３年）を参照。保ａを目的
として作成した融合蛋白は、異種ペプチドのアミノ末端
又はカルボキシ末端のいずれかで内因性ポリペプチド配
列を利用することができる。

いずれにしても細菌の産生ずる真核生物ペプチドを最終
的に単離するには、内因性ペプチド−真核生物ペプチド
融合部位（ここでは「接合部位」という）で部位特異的
酵素的又は化学的切断、又は内因性ポリペプチド配列の
選択的分解が必要である。この接合部位は異種（例えば
真核生物）ペプチドと内因性蛋白を結合させる１つのペ
プチド結合、又は異種ポリペプチドと内因性蛋白を結合
させる一連のペプチド結合を持っていても良い。

一般的には細菌の産生ずる融合蛋白は、内因性ペプチド
又はその断片が、Ｃ−末端部分エシ成る異種ペプチドを
有する融合蛋白のＮ−末端部分工夛成る二うに作成され
る。このような構成体にＬす。

接合部位での切断後に内因性ペゾチｒ／蛋白とＮ−末端
メチオニンの同時放出が可能になる。

化学的手段による細菌の産生ずる融合蛋白からの真核生
物ペプチドの部位特異的放出の例としては、以、下のも
のがあるニスチフィエン（５ｔｓｐｈｉｅｎ　）ら（１
９８３年）（酵母ガラクトキナーゼに融合したプロイン
スリン）：タナカ（Ｔａｎａｋａ　）ら（１９８２年）
（大腸菌β−ガラクシダーゼに融合したα−ネオエンド
ルフィン）；ゲデル（Ｇｏｅｄｄｓｌ　）ら（１９７９
年）（大腸菌β−ガラクシダーゼに融合したインスリン
Ａ＃１４とＢｅ）；イタクラ（工ｔａｋｕｒａ　）ら（
１９７７年）（大腸菌β−ガラクシダーゼに融合したソ
マトスタチン）。

これら全ての例で融合蛋白を切断し目的のペプチドを放
出させるのに臭化シアンが用いられた。ここで蛋白又は
ポリペプチドの切断とは、蛋白又はポリペプチド中のペ
プチド結合の加水分解と定義する。臭イしη′ンは酸性
条件において、メチオニン残基のカルボキシ部位でペプ
チド結合を加水分解する。従って融合蛋白の部位特異的
切断には、目的のペプチドのＮ−末端アミノ酸のすぐ上
流に及び隣接してメチオニン残基が存在し、且つ目的の
ベプチｒの内部アミノ酸配列中にメチオニン残基が存在
しないことが必要である。

化学的加水分解の欠点は、切断の起きやすい苛酷な条件
を使用することであり、そのため生成ペデチげに好まし
くない変化を引き起こす可能性があり、内部切断部位’
を確認するために生成ペプチげのアミノ酸配列を知る必
要があり、又幾つかの化学的切断の特異性は、切断され
る結合に隣接するアミノ酸の種類により大きく異なるこ
とである。

細菌の産生ずる融合蛋白からの目的のベデチＰ産物を放
出させるために化学的手段に代るものとして、何人かの
研究者は酵素（ペプチダーゼ）の使用を報告している。

一般的にペプチダーゼとはペプチド結合の加水分解（切
断）を触媒する酵素と定義される。

これまで用いられてきに１特定のクラスのペプチダーゼ
はエンドペプチダーゼである。このペプチダーゼは、融
合蛋白のＮ−末端と目的のペプチドのＣ−末端から、内
因性（担体）蛋白工＃）成る融合蛋白から目的のペプチ
ドを放出させるのに特に通している。エンドペプチダー
ゼは、ポリペプチドの内部アミノ酸配列中の特異的な（
単一の又は複数の）アミノ酸を認識し、特定のアミノ酸
のカルボヤシ側でペプチド結合を優先的に切断する。

ここである一定のエンドペプチダーゼに特異的に認識さ
れも切断されるアミノ酸又はアミノ酸配列を、以下それ
ぞれ「トリガーアミノ酸」又は「トリガー配列」、又は
まとめて「トリガーシグナル」と定義する。

細菌の産生ずる融合蛋白を切断して目的のペプチドを放
出させるのに用いられてきたエンドペプチダーゼの種々
の例としては以下のものがある：国際特許公報第ｗｏ８
４１００３８０号（１９８４年２月２日公開）（トリシ
トファンプロモーター／オペレータ系からヒトカルシト
ニンを放出させるためのトリプシン）：ヨーロッパ特許
公報第３５．３８４号（１９８１年９月９日頌）（エン
テロキナーゼの使用を示唆）；ナガイ（Ｎｇａｉ　）と
トゲルセン（Ｔｈｏｇｅｒｓｅｎ　）　（１９８４年）
（λＣ１１蛋白からヒトβ−グロビンを放出させるため
の第Ｘａ因子）ニゲルミノ（Ｇｅｒｍｉｎｏ　＋Ｊ、）
とバスチア（Ｂａｇ℃ｉａ、　ｎ、　）　（１９８４年
）（β−ガラクシタゞ−ゼからＦ１６に複製イニシエー
ターを放出させるための微生物コラゲナーゼ）；シャイ
ン（５ｈｉｎｅ　）ら（１９８０年）（β−ガラクシダ
ーゼからβ−エンドルフィンを放出させるためのトリプ
シン）；ルター（Ｒｕｔｔｅｒ）　（１９７９年）（融
合蛋白を放出させるためのエンテロキナーゼの使用を示
唆）：ヨーロッパ特許公報第１６１．９３７号（１９８
５年１１明２１８公８）（λｃｌからβ−グロぎン、Ｃ
ＡＴからヒトカルシトニングリシンそしてλｅｌ［から
ミオシン軽鎖を放出させるための第Ｘａ因子）。

化学切断の場合と同様に、細菌の産生ずる融合蛋白から
成熟ペプチドを放出するには、トリガーシグナルは接合
結合又は接合部位の一部である必ペプチド放出に使用可
能なトリガーシグナルも多くのものが選択できる。

放出に最も通したトリガーシグナル又はエンドペプチダ
ーゼの決定は多くの因子に左右されるが、その多くは融
合蛋白及び目的のペプチドのアミノ酸配列を産生ずるの
に使用する特定の細菌発現系に関係がある。後述するよ
うに当該分野技術においてはかなシ予測不可能なところ
がある。これはある特定のエンげペプチダーゼの選択及
びその後のエンドペプチダーゼによる融合蛋白の切断に
影響する幾つかの因子を考えればよく理解できる。

用いるトリガーシグナル従ってエンドペプチダーゼの選
択に影響を与える大きな因子は、目的のペプチドの完全
なアミノ酸配列が分かっているが否か、そして得られる
融合蛋白は接合部位でエンドペプチダーゼに切断される
が否がである。アミノ酸配列が分かつている場合は、目
的のペプチドに存在しないトリガーシグナルを選ぶこと
が可能であシ、目的のペプチドの不要な加水分解が避け
られる。トリガーシグナルを選択した後、融合蛋白の発
現、産生、蓄積及び／又は精製を有意に妨害しない方法
で、トリガーシグナルをコードするＤＮＡ配列を合成し
接合部位に挿入しなければならない。例えば接合部位に
トリガーシグナルを挿入している場合、その挿入は内部
及び異種ペプチドのコード配列のイン−フレームリーデ
ィングを乱してはならない。エンドペプチダーゼ切断の
ための融合蛋白を調製する場合、目的のペプチドの最適
の切断と放出のためにトリガーシグナルが利用でき露出
していなければならないし、切断のために必要な反応条
件によって目的のペプチドが不可逆に傷つけられること
の無い切断条件でなければならない。さらに内因性蛋白
の中にトリガーシグナルは存在せず、目的のペプチドが
きれいに放出されることが普通好ましい。目的のベプチ
Ｖを商業的に実施可能な８製のために、内因性蛋白の構
造が保持されることがしばしば必要である。

目的のペプチドの正確なアミノ酸配列が不明の場合は、
目的のペプチドの中に類似の配列が含まれる確立を小さ
くするために、トリガーシグナルのアミノ酸配列は十分
複雑でなければならない。

エンドペプチダーゼを使用している場合は、あるエンド
ペプチダーゼについては加水分解部位の近くのアミノ酸
は認識され及び／又は酵素に結合されることが、補足的
にわかった。この「周辺」アミノ酸は、ある場合には酵
素の触媒効率又は結合力を増加させることにニジ、トリ
ガーシグナルを含むペプチドがあるエンドペプチダーゼ
による加水分解を受けやすくする。ページング（Ｂａｈ
ｒｅｎｅ　）とブラウン（Ｂｒｏｗｎ　）　（１９７６
年）；オーステン（Ａｕ５ｔｅｎ　）とスミス（Ｓｍ１
ｔｈ　）（１９７６年）；ホウマード（Ｈｏｕｍａｒａ
　）とドラポー（Ｄｒａｐｅａｕ　）　（１９７２年ａ
）。従って接合部位において又はその近くに周辺アミノ
酸が存在することが明らかな場合は、トリガーシグナル
に対する影響を考慮しなければならない。しかし記載さ
れている多くのエンドペプチダーゼについては、特定の
エンドペプチダーゼ切断に対する周辺アミノ酸の影響は
不明である。従ってエンドペプチダーゼのトリガーシグ
ナルの状況（例えば構造）や内容（例えば−次配列）が
不明なため、融合蛋白からの目的のペプチドの放出がど
の程度うまくいくで）は多くの場合予測できない。

要するに目的のペプチドを部位特異的に放出させるトリ
ガーシグナルを有する特定の融合蛋白の作成には、エン
ドペプチダーゼ切断のみでなくポリペプチド発現、産生
及び蓄積という色々な因子が関与する。広範囲の目的の
ペプチド又は蛋白の産生に、Ｊ用できる、これら全ての
因子を満足する融合蛋白系は現在のところ存在しない。

前記したように本発明の１つの重要な態様は、細菌の産
生ずる融合蛋白としての心房性ペプチドの産生、融合蛋
白の切断及びその生成物の回収に関する。咄乳類の心房
は、Ｉ＃機能や末端の皿管耐件に強い影？！！を与える
ペプチドを含む。元々はラットの心房から抽出され、ナ
トリウム尿排泄作用、利尿作用及び平滑筋弛緩作用（例
えは血管拡張作用）を有するこれらのペプチドは、現在
心房性ペプチドとよばれている。。

ラットの心房抽出物は低分子量画分 （＜１０．０００ダルトン）と高分子量（２０，０００
−３０，０００ダルトン）に分けられ、いずれも試験管
内（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　）で平滑筋を弛緩させ、ラット
に投与しｆｃ場合強力な利尿作用を有していた。キュリ
ー（Ｃｕｒｒｉｅ　）ら（１９８３年）参照。■・リポ
ド（Ｔｒｉｐｐｏｄｏ　）ら（１９８２年）は３．６０
０−４４．００　Ｇダルトンの全分子量画分、３６．０
００−４４．０００ダルトンの高分子量のベプチ１−″
画分及び３．６００−５．５００ダルトンの低分子を画
分にナトリウム尿排泄作用を見出した。

心房性ペプチドを精製し化学的性状解析をするという試
みも、心房ホモジェネートからの利用可能な材料が少な
いこと、そして生物活性因子の不均一性Ｖζより妨害さ
れている。現在では幾つかの心房性ペプチドのアミノ酸
配列がわかつ・ている：例えば米国特許Ｍ　４．４９６
−５４４号：米国特許第４，５０８，７１２号；ヨーロ
ッパ特許公報第１１６，７８４号（１９８４年８月１９
日公開）；セイダ（５６ｉａａｈ、　Ｎ、Ｇ、　）ら（
１９８４年）；デボールド（ａｅＢｏｌａ　）ら（１９
８３年）；デボールド（ａａＢｏｌｉ　）とフリｙ　（
Ｆｌｙｎｎ　）　（１９８３年）を参照。今日までに同
定されている心房性ペプチド多くが低分子ｍ（＜１０．
０００）であるということは、細菌における産生で融合
蛋白７ブローチが必要であることを明白に示している。

従って本発明の１つの目的は、目的の異種ペプチドを放
出するための細菌の産生する融合蛋白切断に最適なエン
ドベゾテタ゛−ゼを与えることである。

本発明の別の目的は、目的の異種ペプチドをその成熟型
で与えるための細菌の産生ずる融合蛋白の切断法を与え
ることである。

本発明の又別の目的は、有用なナトリウム尿排泄作用、
利尿作用及び／又は血管拡張活性を有する心房性ペプチ
ドの細菌での産生法を与えることである。

本発明のさらに別の目的は、有用なナトリウム尿排泄作
用、利尿作用及び／又は血管拡張活性を有する心房性ペ
プチ−を含有する融合蛋白の細菌での産生法を与えるこ
とである。

本発明のさらに別の目的は、融合蛋白から成熟型で醇素
的に放出さｎる心房性ペプチドを含有する融合蛋白の細
菌での産生法を与えることである。

本発明のさらに別の目的は、細菌での心房性ペプチドの
高レベルの産生を可能にし、融合蛋白からの心房性ペプ
チドの部位特異的切断及び放出を可能にする融合蛋白を
与えることである。

発明の要約 不発明は、細菌中で異種ペプチドを泣虫ずる方法を与７
とる。又本発明は、本発明の方法の実施に有用な、異種
ペプチドや種々の遺云子をコードする新規なりＮＡ配列
、ＤＮＡベクター及び形質転換細菌な匈える。１つの方
法では、接合部位で内因性蛋白に結合した異種ペプチげ
（内因性蛋白及び異種ペプチド共にエンド被！チダーゼ
切断部位を有する）より成る融合蛋白をコーゾするｒツ
ムｒ）ＮＡを細菌中で発現させ；融合蛋白を回収し；内
因性蛋白のニンドペフ０チダーぜ切断部位は実デ的に未
変性のまｉｖ：合部位Ｏエンドペプチダーゼ切断部位を
優先的に切断するように、融合蛋白を適当なエンドペゾ
チタ゛−ゼで処理し：そしてそこから目的の異種ペプチ
Ｖを得る。

本発明は又、ｒｅｃＡ蛋白又はその一部、エンドペゾチ
ダーゼ接合部位及び心房性ペゾチ−より成る異１重ポリ
ペブチ１２を与える。

本発明の方法で得られる異種ペプチドは心房法ペプチド
である。新規ＤＮＡ配列は心房性ペプチドをコードする
。

１面の簡単な説明 以下の図において矢印はＤＮＡコー１２配列の５′から
３′の方へ向；と・４つていることを表わす。ヌ関連す
る制限エンドヌクレアーゼ部位も示しである。印をつけ
たＩＪＮＡ領域は図示するだめのものであり、拡大率は
異なっている。

第１図は、ベクターＭ１３ｍｐ９へ挿入するために調製
し７’ＣＡＰ　Ｚをコードする完全なｄｓ　ｒｌＮＡ配
列を、対応−ｊるアミノ酸配列とともに示す。”１″は
成熟ＡＰ　ｌペプチ＋Ｓの開始点を示す。

第２図は、ＡＰ　Ｎ　ＤＮ／、　：＋−ド配列を有する
Ｍｌ　３ｍｐ　９↓シ成るｐｈ　１３　ｓｐ　９　／　
ＡＰ　１の作成法を示−す。斜線をしたところはＡＰＩ
のＤＮＡコード配列を示す。

第３区は、合成２本鎖ＡＰ　ｆｊ　ＤＮＡコード配列を
示す。／・１、ＶＣ記号は結合の存在する場所を示す。

第４図は、Ｅｃｏ　Ｒ工／　Ｂａｍ　Ｈ丁１１；！ｊ　
ｐｆＪ部位に７０％ｒａｃＡ　’：（コードするＤＮＡ
の挿入されｒｃ　ｐＢＲ３２２プラスミドより成る、ｐ
ＭＯｔＪ　１４６１の作成法を示す。

第５図は、ＥｃＯＲＩ　／’　ＳｍａＩ　佃、限部位に
７０−１００％ｒｅｃＡＱコードするｒ）ＮＡの挿入さ
―’Ｌ７’（ｍ１３ｃｏｐ９プラスミドより戊る、ｐＭ
ＯＮ　２５５８の作成法を示す。

第６図は、オリゴスクレオチド゛指令部位特異的突然変
異誌発による、７０−１００　％　ｒｓＣＡ　ＤＮＡコ
ード配タリの６′木端への：５ｃｏ　ＲＩ訃Ｊ限部位の
作成法を示す。

第７図は、Ｅｃｏ　ＲＩ　？ｆｊＪＩＬ’％部位は除９
−　ｎ　、　工４ｉｎｄｉ／ＥｉｍａＩ制限部位にＢａ
ｍ　ＨＩ制限部位を有するり、、ｔ　１３ｍｐ　９リン
カ−の挿入されたｐＫＯ１ベクターより成る、ｐＫＯｌ
（Ｒ１−）　／　′）Ｍｌｌ　３リンカ−Ｃ作成法を示
す。

第８図は、ｉ；ｍａＩ制限部位にＸｂａ　ｒ制限部位の
挿入されたＥＪＫＯｌ（ＲＩ−）７Ｍ１３リンカーベク
ターＬ）成る、ｐＫＯｌ（ＲＩ−）　／　Ｘ’＋ａＩの
作成法を示す。

第９図は、ＡＰ　ＩをコードするＤＮＡ配列がＸｂａＨ
ｊＨＩＨ限部位に挿入さ１５７０’、−＋ｒθｃＡをコ
ードするＤＮＡ配列がＢａｎ＋　Ｈｒ制限部位に挿入さ
れたｐＫＯｌ（ＲＩ−）　／χｂａＩベクターｔ９成る
、ｐ）、■ｏｔｒ　６１５０の作成法を示す。

第１０図は、７０−１００％のｒｅｃＡをコードするＤ
ＮＡ配列が！＋ｉｃｏ　ＲＩ制御５部位に挿入されたｐ
ＭＯＮ　６１５０ベクターよシ成る、ｐＭＯＮ　６１５
２の作成法を示す。

第１１図は、ｒｅｃＡ　−Ｇｌｕ−ＡＰ　Ｉ遺伝子をコ
ードするＤＮＡがＢａｍ　ＨＩ制限部位に挿入されたｐ
Ｕｃ１８ベクターよシ成る、ｐＭＯＮ　６１５４の作成
法を示す。

発明の詳細な説明 本発明は、エンドペプチダーゼによる部位特異的切断に
ニジ融合蛋白から異種ペプチドを得る方法に関する。適
当な異種ペプチドとしては真核生物ホルモンがあり、そ
の１例としては心房性ペプチドがある。適当なエンドペ
プチダーゼとしては以下のものがあるがこれらに限定さ
れるものではないニトリプシン、プラスミン、エンテロ
キナーゼ、カリクレイン、６０キナーゼ、テイツシュプ
ラスミノーゲンアクチベータ、クロストリパイン、キモ
トリジシン、ベゾシン、キモシン、コラゲナーゼ、ラッ
セルクサリヘビ蛇毒、ポストプロリン切断酵素、黄色ブ
ドウ球菌７８株細胞外プロテアーゼ（ここでは「ｖ８プ
ロテアーゼ」と称する）、血液凝固第Ｘａ因子（ここで
は「ｘａ因子」と称すル）及ヒドロンピンである。これ
らのうち好適なエンドペプチダーゼは■８プロテアーゼ
、トロンビン及び第Ｘａ因子である。

ｖ８ゾロテアーゼは、アスパラギン酸（Ａｓｐ　）又は
グルタミン酸（Ｇｌｕ　）残基のカルボキシ末地側でペ
プチド結合を特異的に切断するエンドペプチダーゼであ
る。ホウマード（Ｈｏｕｍａｒａ　）とドラボー（Ｄｒ
ａｐｅａｕ　）　（１９７２年ａ又はｂ）を参九この単
一のアミノ酸に対する特異性のために■８ゾロテアーゼ
はペプチドマツピングに広く用いられてきた。マクウニ
レータ−（ＭｃＷｈｅｒｅｔａｒ　。

Ｃ，Ａ、　）ら（１９８４年）；ノ・ウジンガー（Ｈａ
ｕｓｉｎｇｅｔ　）とホ〜ワード（Ｈｏｗａｒａ　）　
：ジョンソｙ　（Ｊｏｈｎｓｏｎ　Ｊ、Ｓ、　）　（１
９８３年）；クリープランド（Ｃ’１ｅｖｒｌａｎｄ　
）ら（１９７７年）を参゛照。本発明ではｖ８プロテ了
−ゼという言葉は、細菌由来の物、組み換えＤＮＡ　’
ｅもちいる物又は合成された物の全てのｖ８プロテアー
ゼについて用いる。

■８ゾロテアーゼは２つの最適−（４，０と７．８）を
有してお）、尿素及び硫酸ドデシルナトリウム（３１’
）Ｓ　）　（これらは蛋白の可溶化に使用される試薬で
ある）のいずれの中にあっても活性がある。

これらの切断性質のためｖ８プロテアーゼは細菌の産生
ずる融合蛋白の切断に用いるのに魅力的となる。

Ｇｌｕ残基がペプチドのＮ−末端又はＣ−末端に又はそ
の近くにある場合に、ｖ８ゾロテアーゼがＧｌｕ　ｆ切
断する能力に関するオーステン（Ａｕａｔｅｎ　）とス
ミス（Ｓｍ１ｔｈ　）　（１９７６年）の研究は、Ｇｌ
ｕがＮ−末端から２ｇ！Ａの残基以内にある時、又はＣ
−末端から２から３個の残基以内にある時切断は起きな
いことを示していた。この結果は、ペプチドは切断され
る可能性のある結合の両側の数残基にわたって、酵素に
結合していなければならないことを示していると彼らは
解釈した。Ｇｌｕ残基がＮ−末端から２残基以内にある
時のみ、Ｃ）ｌｕで切断が観察される理由は、ペプチド
のＣ−末端にある残基の極性が増加したためであると彼
らは考えた。しかしｖ８ゾロテアーゼ酵素活性は普通、
隣接するアミノ酸残基にプラスにもマイナスにも影響さ
れないと考えられている。ただし、Ａｓｐ　−Ｘ　（Ｘ
は一／スティン酸）とＧｌｕ−Ｘ（Ｘはグルタミン酸又
はゾロリン）は例外であり、■８プびテアーゼによる切
断はまだ観察さ４ていない。ホウマード（Ｈｏｕｍａｒ
ｄ　）とドラポー（Ｄｒａｐａａｕ　）　（１９７２年
ａと１９７２年ｂ）；ベーシング（Ｂｅｈｒｅｎａ　）
とブラウン（Ｂｒｏｗｎ　）（１９７６年）：オーステ
ン（Ａｕｇ：ａｎ　）をスミス（Ｓｍ１ｔｈ　）　（１
９７６年）を参照。

しかし融合蛋白切断系に■８ゾロテアーゼを用いるＫは
、目的のペプチドがトリガーアミノ酸（ここではＧｌｕ
又はＡｓｐ　）を含まないことが必要であシ、及び／又
は便用した切断条件では内部Ｇｌｕ又はＡｓｐ残基はｖ
８プロテ了−ゼが接触できないことが必要である。さら
に内因性蛋白もトリガーアミノ酸を含まず、及び／又は
使用切断条件では内部Ｇｌｕ又はＡｓｐ残基はｖ８ゾロ
テ了−ゼが接触できないことが必要である。

血液凝固第Ｘａ因子はセリンゾロテアーゼ群の１員であ
る。生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ　）でＸａ因子は、ｈｒｇ
、　（２７４）　−Ｔｈｒ　（２７５）とＡｒｇ（３２
３）−１１０（３２４）結合の特異的限定蛋白分解によ
り、プロトロンビンをトロンビンに活性化する。

プロトロンビンには２つの切断部位の前に工１θ−Ｇｌ
ｕ　−Ｇｌｙ　−Ａｒｇがあシ、これがＸａ因子基質認
識の抗原決定基と考えられている。（マグナソン（Ｍａ
ｇｎｕｓｓｏｎ　、　Ｓ、　）ら、１９７５年）　。Ｘ
ａ因子に切断されることが公知のペプチド配列の幾つか
はヨーロッパ特許（ＥＰＡ　）公報第１６１．９３９号
（１９８５年１１月２１日公開）にも記載されている。

Ｘａ因子にＬる認識に必要な構造は、切断部位における
局部配列にニジ決定されると考えられる（ヨーロツノ゛
に特許公報第１６１．９３９号）。

本発明のＤＮＡ配列は、前記の特異的Ｘａ因子切断部位
（すなわちトリガーシグナル）の全てを含むχａ内因子
、Ｌｖ特異的に切断される全ての切断部位全コードする
。１つの好適な態様では新規Ｘａ因子トリガーシグナル
は配列ＮＨ２−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＣＯ
ＯＨより成る。

ｖ８プロテアーゼとトロンビンの場合の様Ｋ（後述）、
ｘＩＬ因子トリガーシグナルを含有する融合蛋白をコー
ドする遺伝子中に存在する特異的ヌクレオチドは、トリ
ガーシグナルのアミノ酸配列とその遺伝子コードによシ
異なる。従つ工遺伝子コードの重複（縮重）を考えると
、単一のトリガーシグナルをコードするのに複数の異な
るｒ）ＮＡ配列が使用できる。宿主コドンの使用に選択
性のあるＤＮＡ配列、及び／又はＤＮＡ操作を促進する
ため（例えば便利な制限エンドヌクレアーゼ部位を与え
るため）の特定のＤＮＡ配列を選択できる。

Ｘａ因子による融合蛋白を含有する蛋白の処理にエリ、
実質的にＸａ因子トリガーシグナルの了ルイニン（Ａｒ
ｇ　）アミノ酸残基の後のペプチド結合でのみ切断が起
き、蛋白断片又は目的のペプチドが本来の形で放出され
る。ここで「天然の形」とは余分のアミノ酸配列（例え
ばＮ−末端メチオニン又はＮ−末端宿主蛋白アミノ酸残
基）を含まない了きノ酸配列より成るポリペプチド又は
ペプチドを意味する。

トロンビンはある種アルギニン及びリジン結合の切断を
触媒するセリンゾロテイナーゼである。

トロンビンは全てのを推動物の血漿に存在し、血液凝固
における重要な酵素である。トロンビンの天然に存在す
る基質はフイブリノーゲンであり、これはトロンビンに
よりアルギニルグリシル結合で切断されフィブリンを形
成する。（マグナソン（Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ　）、１９
７１年）。これまでに同定されたトリが−シグナルには
（）ｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇがある（マグナソ７　（Ｍａ
ｇｎｕｓａｏｎ　）、１９７１年）。

目的のベプチ）４を含有する融合蛋白の細菌による産生
のための遺伝子を作成するのに、どの内因性蛋白配列又
は断片を用いるかは幾つかの因子に左右される。ここで
［遺伝子］とは、発現される蛋白生成物、及びある宿主
細胞中で目的の蛋白生成物を産生ずるための転写と翻訳
調節シグナルをコードするＤＮＡ配列を定義する。こｔ
らの因子には以下のものがあるがこれらに限定されるも
のではない：選択された内部遺伝子配列又はその断片の
入手の可能性、付随するプロモーターの能力、ある宿主
細胞中での遺伝子の誘導の及び／又は調節の容易さ、発
現される内部生成物又はその断片の大ささ、その後の切
断及び目的のペプチドの放出を容易にするために宿主中
で産生される融合蛋白を可溶化する能力、そして内部Ｄ
ＮＡ配列の発現をモニターする能力。さらに選択された
内部蛋白又はその断片は、融合蛋白産生のために結合さ
れた時目的の蛋白又はペプチドの安定で高濃度の蓄積が
なければならない。さらに、目的の蛋白又はペプチドの
その後の部位特異的酵庸的放出を可能にするために、得
られる融合蛋白は可溶性又は可溶化可能でなければなら
ない。

細菌中で容易に高濃度に発現される幾つかの細菌遺伝子
が当業者に公知であり、その例として以下のものがある
がこれに限定されるものではない：クロラムフエニコー
ルアセチルトランスフエラーゼ（ＣＡＴ　）遺伝子、β
−ガラクシダーゼ遺伝子（１ａｃＺ　）及びｒｅｃＡ遺
伝子。このような遺伝子は、目的の蛋白又はペプチＦ産
物を有する融合担体として使用できる内部遺伝子の例で
ある。

１つの態様においては、ｒθｃＡ遺伝子又はその断片は
、心房性ペプチドのようなペプチドの産生のための融合
担体として使用された。ｒｅｃＡ又はその断片工す成る
融合蛋白を用いて心房性ペプチドを産生させるのにｒθ
ｃＡ遺伝子を使用した例はまだ報告されていない。フエ
インスタイン（Ｆｅ１ｎａｔｓｉｎ　、　Ｂ、　）ら（
１９８３年）は、細菌中でヒトインターフェロンを直接
発現させるのにｒｅｃＡプロモーターの使用、細菌中で
ｒａｃＡ−β−インターフェロン「融合様」蛋白を産生
するためＫ　、一部ｒｅｃＡプロモーター、リボゾーム
結合部位及びｒｓｃＡＤＮＡコード配列の最初の３つの
コドンよシ成る遺伝子構成物の便用を記載している。

「融合様」蛋白とは、産生蛋白を含有するβ−インター
フェロン中に存在する限定量のｒｅｃＡ蛋白（例えば３
個の７ミノ酸）を示すのに用いる。ヨーロッパ特許公報
第１０８，０４５号（１９８４年５月９日公開され、モ
ンサント（Ｍｏｎ５ａｎｔｏ　）社に譲渡されている）
は、細菌中でソマトスタチンを直汲発現するのにｒθｃ
Ａプロモーター／オペレーターの使用を記載している。

このヨーロッパ特許は又、７０％又は９０憾のｒ　ｅｃ
Ａ蛋白及び１００％のソマトスタチンペプチドより成る
ｒａｃＡ−ソマトスタチン融合蛋白の細菌での産生を記
載している。この方法にニジ産生される生成物は不溶性
蛋白を産生ずるために目的の心房性ペプチドを放出する
ためのその後の酵素的切断が不可能であるため、細菌中
でのｒｅｃＡ−心房性ペプチド融合蛋白の産生に、７０
％及び９０　％　ｒｓｃＡ融合作成物は作用していない
と、我々は結論した。

科学的及び治療的用途のいずれにおいても先行技術では
、細菌中での心房性ペプチドを大量に産生ずるための経
済的及び効率的方法を記載していない。

ここに記載した融合蛋白系に内部蛋白担体としてｒθｃ
Ａ蛋白を選択したのは、ｒｅｃＡ蛋白の物理的性質に幾
つかの利点があるためである。具体的にはｒθｃＡ蛋白
は強い陰性荷電含有している。このｒｅＱＡ蛋白の強い
電荷は、陰性荷電を有するｒｅｃＡ又はその部分を保持
する細菌の産生ずる融合蛋白のその後のＢ製に非常に有
利である。例えば実質的に他の全ての細菌性蛋白からｒ
ｅｃＡ蛋白を単離するのに、陰イオン交換クロマトグラ
フィーのような通常の方法が使用できる。

１つの態様において、■８プロテアーゼ特異的トリガー
シグナルによシ心房性ベゾチドに結合した細菌の全ｒθ
ＱＡ蛋白よシ成る細菌の産生ずる融合蛋白から、心房性
ペプチドを特異的に放出するために■８プロテアーゼが
選択された。心房性ペプチドはグルタミン酸は含まず、
９位にアスパラギン酸を１１固含有するのみである。米
国特許第４．４９６．５４４号参照。しかしｒ　ｅｃＡ
蛋白は無数の（すなわち約６１個）のグルタミン酸残基
を含有する。

目的のペプチド中に内部Ａｓｐ残基が存在しｒｅｃＡ蛋
白中に無数のＧ’ｌｕ残基が存在するにもかかわらず、
我々は細菌の産生するｒｅａＡ−心房性ペプチド融合蛋
白から心房性ペプチドの具体的放出を賦与た。ここで「
内部」とは、蛋白のＮ−末端又はＣ−末端にないアミノ
酸と定義する。その結果状々は、ｖ８プロテアーゼは接
合部位に存在するＧｌｕ　ト’）ガーシグナルを優先的
に切断するため、ｒａｃＡ蛋日中に存在する内部ｅ１ｕ
残基を切断する前に目的のペプチドの早期放出を促進す
ることを発見した。

この発見によシ接合部位に存在するトリガーシグナル中
のＣ）１ｕ残基を含有するｒｅｃＡ−心房性ペプチド融
合蛋白を特異的に切断する方法が与えられるため、この
発見は重要である。さらに最初ｒａｃＡ蛋白内のＧｌｕ
残基が同時に切断されると予想しておシ、従って目的の
心房性ペプチドの特異的放出を不明にしてしまい、ｒｅ
ｃＡ蛋白又はその断片を実質的に含まない目的の心房性
ペプチドを単離するという面倒な操作を予想していたた
め、前記の融合蛋白から目的のペプチドが早期に放出さ
れるという結果は予想外のものである。もちろんｖ８ゾ
ロテアーゼ切断反応を完、全に進ませると最終的に内部
Ｇｌｕ　（Ｖ　８プロテアーゼ）部位で切断が起きる。

従ってここに記載した方法は、ｒｅｃＡより成る細菌の
産生ずる融合蛋白から心房性ペプチドの工うな目的のペ
プチドを具体的に又は優先的に放出させる方法を与える
。従って内因性蛋白（例えばｒｅｃＡ　）は、融合蛋白
のエンｒペプチダーゼ切断に工９目的の異種ペプチドは
内因性蛋白又はその断片から区別される時、実質的に未
変性のままである物と定義する。

不出願人は以下の作用機構の理論に拘束されることを望
まないが、細菌の産生ずるｒｅａＡ−含有融合蛋白の構
造（コンフォメーション）のため接合部位の■８プロテ
アーゼ）　ＩＪガーシグナルはエンドペゾチダーゼ切断
を受けるが、少なくとも最初は内部トリガーアミノ酸配
列はｖ８ゾロテアーゼによる切断を受けないと考えられ
る。この内部ｒθｃＡ　）・リガーアミノ酸が利用でき
ないということは、立体障害のような構造的特徴及び／
又はｒ８ｃＡ　−−Ｊ　３ノロテア一ゼ相互作用に関連
する動力学的性質に由来すると考えられる。さらに接合
部位で■８プロテ了−ゼトリガー了ミノ醗か選択的に利
用でさないということは、■８プロテアーゼトリガーア
ミノ醒を含有する接合部位のよシーθｃＡ蛋白又はその
断片に融合した異種ペプチドに由来すると考えられる。

好適な態様の１つでは、細菌の産生ずるｒｅｃＡ−含有
融合蛋白から、他の心房性ペプチドを含まない心房性ペ
プチドＩ、！又は■（それぞれＡＰｌ、ＡＰＩ又はＡＰ
　ＩＶ　）　（米国特許２５４．４９６．５４４号及び
ヨーロッパ特許公報第１１６．７８４号を参照）を産生
ずるのに本発明の方法を用いている。単一の心房性ペプ
チドを産生できるということは、この正確な生物反応性
を測定でき、心房性ペプチドが商業的規模で得られるた
め、大きな意味を持っている。さらにこのよ５な心房性
ベプチｌ−′の生物反応性が測定されると、そＣ生物反
応性を増加させるようなペプチドの変［作ることも可能
になると考えられる。そのような変種はここに記載した
方法及び当業者に公知の方法で、ヌクレオチド又はアミ
ノ酸欠失、置換及び／又は付加に＝９作成できる。本発
明の方法による心房外ペプチドの産生は特許請求の範囲
の範囲内にあると考えらハる。

最も広い態様において本発明は、細菌中で異種ペプチド
を産生ずるための組み換えＤＮＡ技術の改良である。従
って本発明の説明にあたっては、ペプチドや蛋白をコー
ドするＤＮＡ配列を単離しクローン化するための組み換
えＤＮＡ技術、クローン化ｒ）ＮＡ配列の再配列又は変
更、及び形質転換微生物中のクローン化又は変更ＤＮＡ
配列の発現に用いる基本的技術の知識はあるものと仮定
している。このような技術は当該技術の範囲内にある。

例えばマニアテイス（Ｍａｎｉａｔｉａ　）ら（１９８
２年）を参照。

異種ＤＮＡの単離と構築 細菌中での異種（例えば真核生物）ペプチドの産生には
、目的のペプチドをコードするＤＮＡ配列の単離と合成
が必要である。ＤＮＡ配列を単離する方法及びＤＮＡ配
列を化学的又は酵素的に合成する方法は当業者には公知
である。

大腸菌と酵母は種々のコドンの選択性があることは知ら
れている。フレイブ（Ｃｒａｉｇ、　Ｐ、に、　）とホ
ール（Ｈａｌｌ、　Ｌ、　）　（１９８３年）；フイア
ーズ（Ｆｉｅｒｓ、　Ｗ、　）ら（１９７６年）；イケ
ムラ（Ｉｋｅｍｕｒａ、　Ｔ、　）　（１９８２年）を
参照。従って異種ｍＲＮＡ配列の最適な翻訳を達成する
ために、用いる宿主の最も好むコドンで代用することが
好ましい。

本発明の好適な態様で、大腸菌と酵母に好適なコドン（
これらはさらにこのＩ’）ＮＡ配列の操作とスクリーニ
ングに有用な制限エンドヌクレアーゼ切断部位の導入を
可能にする）を含有する、ＡＰ　Ｉをコードする新規ｒ
）ＮＡ配列を作成した。簡単にいうと心房性ペプチドＩ
（ＡＰＩ）の２４個の一部７ミノ酸構造をコードする新
規ＤＮＡ配列を合成により産生した（以下に詳述）。７
２塩基対（ｂｐ）の新規ｒｌＮＡコード配列を、大腸菌
と酵母宿主細胞のコドンの選択性を考慮して作成した。

この配列の前にはグルタミン酸のコドンがあり、融合蛋
白からのペプチドのｖ８プロテアーゼのよる切断の認識
部位を供給している。この配列のコード部分の直後には
少なくとも１つの翻訳停止コドンがある。合成りＮＡの
組み換え操作及びその後のモニターを促進するために、
第１図に示した部位でポリヌクレオチド配列に、Ｅｃｏ
　ＲＩ及びＸｂａ工制限エンドヌクレアーゼ認識部位を
導入した。従ってこの部限部位の導入は必須ではない。

同様に代りの及び／又は追加の制限エンｒヌクレアーゼ
部位を導入しても良い。

第１図に示すＡＰＩペゾチドをコードする２本鎖ＤＮＡ
　（ｃｌａ　ＤＮＡ　）断片を組み立てるために、６個
の相補的及び部分的に重複する合成オリゴヌクレオチド
を合成した後、適当な条件下でアニーリングさせて９３
　ｂｐオリゴヌクレオチドを形成させた（下記及び第６
図にさらに詳しく説明）。

目的のポリペプチドのコドンを含有する異種）ＩＮＡ配
列が得られた後、その分子のヌクレオチド配列に幾つか
の変更を加えた方が良いこともある。

例えば、分子が化学合成ではな（ｍＲＮＡ鋳型から逆転
写によシ産生された場合は、しばしばプレ蛋白のリーダ
ー配列をコードするＤＮＡの少なくとも一部を含有して
いるであろう。従って目的の蛋白の最初のコドンの前の
全てのリーダー配列ＤＮＡを除去する必要もあるであろ
う。

停止シグナルが含まれていない場合は、目的のペプチド
のＣ−末端アミノ酸のコドンの後に少なくとも１つの翻
訳停止シグナルが導入される。翻訳停止シグナルの例と
してはデオキシヌクレオチドトリプレット（すなわちコ
ドン）　ＴＡＡ　、　ＴＧＡ及びＴＡＧがある。

後述するように、グルタミン酸コドン、又ハＸａ因子又
はトロンビントリガーシグナルのコドン、目的のペプチ
ドのコげン及び（目的のペプチドのＣ−末端アミノ酸の
コドンに隣接する）少なくとも１つの翻訳停止シグナル
コドンヲ順に含む異種ＤＮＡ配列を作成するのに、組み
換えＤＮＡ技術及び／　　′又は化学合成が用いられた
。

目的の異種Ｉ’）ＮＡコード配列を作成するのに、ある
異ＪＪｆ’）ＮＡ配列中の任意のアミノ酸コドンで欠失
、付加及び／又は置換金することが可能であり、そうす
ることにより「変種」ペプチドが本発明の方法において
発現できる。ここで変種ペプチドとは、あるペプチドの
天然に存在するアミノ酸配列に比較して、１つ又は棲数
の７ミノ酸の欠失、τ換及ペゾテドと同じであるから、
その生物活廿が大幅に低下しているということはない。

変種ペプチドの作成や発現は、融合蛋白の蓄積の増加、
ペプチド及び／又は融合蛋白の安定性の上昇、ペプチド
及び／又は融合蛋白の精製の促進、及び／又は生物活性
の最適化の達成に好ましいこともある。

目的のペプチド全コードするｆ）ＮＡ分子の上記の工う
な変更をするには、当該分野において公知の技術にＬリ
　ｉ、ＩＩ限酵素、エキソヌクレアーゼ１．エンドヌク
レアーゼ等を用いる。マニ了テイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ
　）ら（１９８２年）を参照。ｒ）ＮＡ分子の構造や配
列に上記のような変更を加えるには、オリコ９ヌクレオ
チド指令部位特異的突然変異誘発の一般的な方法を用い
ることも可能であり、これらは当業者には公知である。

例えばシラー（Ｚｏｌｌｅｒ　）とスミス（３ｍｉ℃ｈ
）（１９８２年）；シラー（Ｚｏｌｌｅｒ　）とスミス
（Ｓｍ１ｔｈ　）　（１９８３年）；ノリス（Ｎｏｒｒ
ｉｓ　）ら（１９８３年）を参照。

目的の異ａ　ＤＮＡ配列が得られた後、この配列は目的
の異才ｊペプチドの産生と単ｃＩ（見、下に詳述する）
のため組み換えベクターから除去さ７′Ｌ発現系に挿入
される。これらのｒ）ＮＡ配列を発現ベクターに挿入す
る前に、当業者に公知の方法で、挿入の時及び／又は挿
入後異種ｒｌＮＡ配列を変更することができる。

前記した様に、内因性ＤＮＡ配列とプロモーターが発現
ベクター上にある時細菌性プロモーターの調節下で、四
回性蛋白又はその断片をコードするＤＮＡのすぐ下流に
目的のベプチｒｆ、コードするＤＮＡ配列を部位特異的
に挿入することに工９、細菌に↓る替金蛋白の産生が可
能になる。従って目的の異種遺伝子は、内因性蛋白又は
その断片、エンドペゾチダーゼトリガーシグナル及び目
的の異ｌペプチドをコードするＤＮＡ配列を含有する。

前記したように使用する内因性遺伝子の選択は、目的の
異８ペプチドを結合しに時宿主細胞中で高度に発現され
た可溶性蛋白を産生ずる能力などの、幾つかの因子に左
右される。

本発明の１つの好適な態様では、発現ベクター上の大腸
菌のｒｅｃＡ遺伝子を内因性ＤＮＡ配列として用い、こ
こに目的のベプチｒ　ＤＮＡコード配列が融合された。

この大腸菌のｒｅｃＡ遺伝子は重要な細胞機能（例えば
遺伝子組み換え）、複製後の修復、そして他の多くの細
胞機能（例えば突然変異誘発、ファージ誘導及び細胞分
裂）に関与している。サンカー（５ａｎｃａｒ、　Ａ、
　）とルツゾ（Ｒｕｐｐ。

ｒ）、）（１９７９年）；ウィトキン（Ｗｉ℃ｋｉｎ　
。

Ｅ、Ｍ、　）　（１９７６年）を参照。大腸菌ｒｅｃＡ
蛋白の機能的及び／又は化学的同族体は、以下の他の属
の細菌でも記載されているニブロチウス（Ｐｒｏｔｅｕ
ａ　）属（例えばプロテウスブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕ
ａ　ｖｕ１ｇａｒｉ８））　、了−ライニア（Ｅｒｗｉ
ｎｉａ　）属（例えば了−ウイニアカロトポラ（Ｅｒｗ
ｉｎｉａｃａｒｏ　ｔｏｖｏｒａ）　）及びシデラ（Ｓ
ｈｉｇｅｌｌａ　）　ｒ；ｆ４　（例えばシデラフレク
スネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｆｌｅｘｎｅｒｉ　）　）
。

キーナー（Ｋｅｅｎｅｒ、　Ｓ、　）ら（１９８４年）
参照。

ここでｒｅｃＡ　ｒ同族体」とは、その遺伝子が大腸菌
以外の細菌のｒツム内に含まれており、以下の特徴を有
する蛋白である：　ＤＮＡ修複酵素として働く（例えば
ｒｅＣＡ大腸菌中で紫外線による死滅に対して耐性を回
復する）、及び／又は大腸菌ｒｅｃＡ蛋白と実質的に同
じｒ）ＮＡ又はアミノ酸配列相同性を有する、及び／又
は■８プロテアーゼトリガーシグナルより成る接合部位
での選択的切断を可能にする構造を有する。大腸菌ｒｅ
ｃＡ蛋白と実質的に同じ物理的−化学的及び／又は機能
的性質を有するこれらの同族体は、ここに具体的に記載
した大腸菌ｒｅｃＡ蛋白の同等物を構成すると考えられ
る。（キーナー（Ｋｅｅｎｅｒ　）ら（１９８４年））
。

普通大腸菌のｒｅｃＡ遺伝子は１ｅｘＡ遺伝子産物に抑
制されるが、ナリジキシン酸、マイトマイシンＣ等の物
質による処理又は紫外線照射（これら全てはＤＮＡに障
害を与える）により誘導される。犬１ｉＡ　Ｑをこれら
の物質で処理すると低濃度の残存レベルで存在するｒθ
ｃＡ蛋白を刺微し、そのリプレッサーを切断し、誘導が
始まる。誘導後ｒｅ　ｃＡ蛋白は細胞中の主要な蛋白の
１つとなり、これはｒｅ　ｃＡプロモーターとりボゾー
ム結合部位の組合わせは誘導発現の効率的な組合わせで
ある。フエインシュタイン（Ｆｅｔｎｓｔｅｉｎ、　Ｓ
、　）ら（１９８３年）参照。目的のｒｓｃＡ融合蛋白
の８１製の最適化を目的とする場合、クローン化遺伝子
の高１度での構成的発現は細胞にとシ有害であり好まし
くないため、このｒｅｃＡプロモーターの誘導性は有効
である。

さらにｒａｃＡ＋である全ての細菌株はｒ８ＣＡｌ１１
！ｌ！合蛋白の産生に使用可能である。このような細菌
の例としてはプロテウスミラピリス（Ｐｒｏｔａｕｓｍ
ｉｒａｂｉｌｉｓ　　）　　（エイ　ト１．ナー（Ｅｉ
ｔｎｅｒ　）　　ら、（１９８２年））や大腸菌があり
、好適な宿主微生物は大腸菌である。さらに好ましい大
腸菌株はｒｅｃＡ＋及び１８ｘＡ＋の両方を有するもの
である。

なぜならこれらはｒｅｃＡ随合蛋白産生を誘導的に調節
するからである。この好適な大腸菌の例としては、大腸
菌ＭＭ２９４と大腸菌、ＴＭｌｏｌがあシ、ｒａｃＡ融
合蛋白産住用に最も好適な宿主細胞は大１１ｆｉｉＪＭ
１０１である。両方の株共に７メリカンタイプカルテヤ
ーコレクシヨン（ＡＴＣｅ　）　（、ｌ　！Ｊ−ランド
州クロックビル　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ　）市）よシ入手
できる。受入れ番号はそれぞれ３ろ６２５と３３８７６
である。従ってｒθｃＡ同族体をコードする鵬合蛋白発
現ベクターを使用する場合、例えば以下の工うなｒａ　
ｃＡ同族体の遺伝子を含有するダラム陰性細菌から同等
の宿主細胞を選択できる：エンテロバクテリアツシー（
Ｅｎｔａｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａθ）、アーウイニ
ア（Ｅｒｗｔｎｉａ　）、シデラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）
及びクレブシェラ（Ｋｌθｂａ１θ１１＆）。さらに好
ましい宿主細胞は、ｒ８ＣＡ同族体とｒｅｃＡ同族体リ
プレッサーの機能性遺伝子を含むものであろう。

可溶性ｒｅｃＡ−心房性ペプチド融合蛋白の細菌での産
生には、全（すなわち１００Ｓ　）　ｒａｃＡＤＮＡコ
ード配列の使用が必要であることを我々は見出した。ｒ
ｅｃＡプロモーターとＤＮＡコード配列を用いた先行技
術では、７０係以上のｒＱｃＡ　ＤＮＡコード配列を便
用するとａ菌細胞宿主で不溶性の融合蛋白産物が産生さ
れると示唆されているため、この発見は重要である。Ｅ
ＰＡ第１０８０４５号（１９８４年５月９日公開）を参
照。

本発明の方法（下記に詳述）は、強度のナトリウム尿拝
泄剤及び／又は平滑筋弛緩剤を与えるように精製され得
る、安定に蓄積される異種ペゾテド（例えば心房ロペゾ
チＩＦ　）を、細菌中で高濃度（例えば全細胞蛋白の約
１０から３０係）に産生ずる方法を与える。

異種ＤＮＡのクローニング 岨み換えｒ）ＮＡ技術に工υ目的の異Ｗ　ＤＮＡ配列が
得られると、その配列は適当なりローニングベクター（
これはＤＮＡ配列複製の手段を与える）に挿入される。

任意の適当なりローニングベクター（好ましくはマーカ
ー機能を有する）が使用可能であるが、その例としては
以下のものがある：ｅｏｌＥ　１　、バーシュフィール
ＩＦ　（Ｈｅｒｓｈｆｉａｌｄ　）ら（１９７４年）；
ｐＢＲ３２２、ポリバー（Ｂｏ’１ｉｖａｒ　）ら（１
９７７年）　；　ｐＢ］’（３２５、ソベｏ　７　（５
ｏｂｅｒｏｎ　）ら（１９７８年）：そしてｐｋａ７、
ラオ（Ｒａｏ　）ら（１９７９年）′（ｉ−含む大腸菌
シラスミドベクター；及びシャロン（Ｃｈａｒｏｎ　）
　ＡＬ　４７．１　、レーネン（Ｌｏｅｎｅｎ　）ら（
１９８２年）：そしてＭ１３ｍｐ８とＭ１３ｍｐ９、メ
ツシング（Ｍａｓｓｉｎｇ　）ら（１９８２年）を含む
大腸菌バクテリオファージベクター。上記ＤＮＡ　配列
ｅクローニングベクターに導入し組み換えベクターを作
る一般的技術は当該技術分野の範囲内にある。マニ了テ
イス（Ｍａｎｉａｔｉｓ　）ら（１９８２年）参照。

本発明の方法ではＭ１３ｍｐ８とＭ１３１１）１）９（
メツシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ　）ら（１９８２年））、
そしてｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２７、］）ＢＲ３２２そし
てｐＫｏ　１をクローニングベクターとして選択した。

Ｍ１３ｍｌ）９とＭ１３ｍｐ９ベクターは（以後Ｍ１３
ベクターと称する）は、組み換えベクターを２本通（ａ
Ｓ）すなわちゆ製型（π）と１本鎖（８日）型で単離す
ることを可能にする。ＲＦ　ＤＮＡ組み換えベクターの
単離は、以後の複製された目的のｒ）ＮＡ配列の発現ベ
クターへの挿入を促進する。

又これらの組み換えベクターの１本銭型の単離は、発現
のための５′から６′への正しい配向の目的のＤＮＡ配
列金有する組み換えベクターの単離、オリゴヌクレオチ
Ｐ−指令部位特異的突然変異銹発等によるＤＮＡ配列の
変更を促進し、ＤＮＡ配列解析を促進する。さらにＭ１
３ベクターａａｂｐまでの長さのＤＮＡ断片又は遺伝子
を含有でき、典型的な全真核生物遺伝子配列のクローニ
ングを保証する。

Ｍ１３ベクターに使用されたマーカー機能（メシング（
Ｍｅｓｓｉｎｇ）ら（１９８２年））としては、酵素β
−ガラクシダーゼがある。具体的には目的の異種ＤＮＡ
配列が、Ｍ１３ベクター上のｌａｃ　Ｚ遺伝子断片の萌
のリンカ−中に挿入され、これがＭ１３ベクター上のｘ
ａｃ　ｚ遺伝子と、宿主細胞（例えば大腸菌ＪＭ１０１
）の染色体ＤＮＡ上の部分的１ａｃＺ遺伝子断片との相
補性を破壊し、その結果宿主は細菌増殖培地中のラクト
ースを代謝できなくなる。ベクターの１ａＯＺ遺伝子遺
伝中断外来の遺伝子配列が挿入されていないＭ１３ベク
ターに感染された大腸菌は、細菌増殖培地中のラクトー
スを代謝することが可能であり、０．８％（ｗ／ｖ　）
　）リプトン、０．５係（ｗ／ｖ　）酵母エキス、０．
５係（ｙ／ｖ　）　ＮａＣ１そしてβ−ガラクシダーゼ
の発色指示疵より成るＩＸＹＴ培地を含有する寒天上で
増殖させた時、特徴的な青いプラク（ｐｌａｑｕＡ）　
を示す。Ｍ　１３１ａｃ　Ｚ遺伝子断片中に異柚ｒ）Ｎ
Ａ配列が挿入された紹み換えベクターで感染された大腸
菌は、同じ培地上で増殖させた場合プラクは無色である
。従ってこれらのクローニングベクターに異種ｒ）ＮＡ
配列が挿入さハたが否かは、組み換えベクターで感染さ
れた大腸菌宿主細胞のプラクに色がついているが否かで
判定できるっｐＢＲ３２２，１）ＢＲ３２７、ｐＵｃ　
１８及び］）ＫＯ１クローニングベクターのマーカー機
能は、抗生物質耐性及び／又はコロニー着色（下記に詳
述）で初期スクリーニングされ、次に目的のＤＮＡコー
ド配列のベクター・＼の挿入をＱ認するためのｌｊ限エ
ン−ヌクレアーゼ解析（下記に詳述）に工）同定できる
。

好適な態様では、ｒｅｃＡ蛋白のＣ−末端の７０から１
００％（ここでは７０−１００　％　ｒｅｃＡという）
をコーげするＤＮＡを、第５凹に示すように】Ａ１３ベ
クターのＲＦ　ＤＮＡに挿入して、組み換えクローニン
グベクター１１１Ｍ０Ｎ　２５５８を作成した（実施例
に詳述）。次に第６図に示すようにオリゴヌクレオチｒ
指令部位特異的突然変異誘発（詳１＋ｆｆｌは後述）士
行いｒｅｃＡ　ＤＮＡ　：７−ド配列ノ３′−末端にＥ
ｃｏ　ＲＩ制限部位を導入し、組み換えクローニングベ
クターｐＭＯＮ　３２２８を作成した。この部位は後の
７０−１００％ｒｅｃＡのクローニングを促進し、発現
ベクターｐ奎１ＯＮ６１５２（第９図に示す）を作成す
るために導入した。

ｒｅｃＡプロモーター、リポゾーム結合部位及びｒｅｃ
Ａ遺伝子産物のＮ−末端７０％をコードするＤＮＡ　（
ここではまとめて７０％ｒθｃＡ、という）を第４図に
示すように単離し、ｐＢＲ３２２クローニングベクター
（（クローン化して第４図に示すように組み換えクロー
ニングベクターｐｌ’）Ｒ１４６１を作ＩＪ、’２　し
た（詳細は後述）。

好適な態様において、第１図て示す合成ＡＰＩＤＮＡコ
ー１２配列をＭ　１３　ｔｎｐ　９の唯一のＷｃｏ　Ｒ
１部位に挿入して、第２図に示すＡＰ　ｌ含有組み換え
クローニングベクターを作成した。メシング（Ｍｅａａ
ｉｎｇ　）ら（１９８３年）の記載する方法に従い大腸
ＪＪＭＩＱＩに組み換えクローニングベクターをトラン
スフェクション（ｔｒａｎｓｆａｃ　ｔｉｏｎ　）させ
てＡＰ　ｌ挿入を羅誌し、無色のプラクを選択した後、
メシング（Ｍｅｓａｉｎｇ　）ら（１９８３年）の記載
する方法（この一部はここに記載しである）に従い１本
ｊｄ組み換えファージＤＮＡ　ｉ単離した。

次にブンガー（Ｓａｎｇｅｔ　）ら（１９７７年）のジ
デオキシ鎖停止方法に従い１不鎖フアージＤＮＡの配列
を決足し、完全なＡＰ　Ｉ　ＣＮＡコード配列の挿入を
証明した。

好ましい融合遺伝子の目的部分をコードするＤＮＡ　ｉ
夕ＩＪにクローン化した後、当莱者に公知の方法及び前
記の方法に従い、そｒＬぞれの組み挾えクローニングベ
クターの増殖により、この配列を複製し多くのコピーを
作ることができる。目的の異ｉポリペプチド（例えは融
合蛋白）を細菌中で産生ｊ゛るために、これらの異１４
　ＤＮＡ配列を過当な発現ベクターに挿入できる。

前記したように適当な発現ベクターは、選択された宿主
細胞中で異種蛋白を産生ずるための必要な転与と翻訳シ
グナル、そして目的の異種ＤＮＡ配列が挿入された発現
ベクターを同・定するためのマーカー機能を有していな
ければならない。真核生物発現ベクターを利用して、形
質導入、形質転換又はトランスフェクション（ここでは
これらをまとめて「形質転換」と呼ぶ）によシ、組み換
えｒ）ＮＡ配列を原核生物の遺伝子中に付加することが
可能であり、この原核生物を目的のポリペプチドを産生
させる条件（通常用いるプロモーターと宿主に支配され
る）で培養できる。従って本発明で使用する微生物の［
ゲノムＪ　ＤＮＡは、染色体ＤＮＡ及びエピソームＩ’
）ＮＡ共に含有する。

原核生物宿主細胞中で異種１’）ＮＡ発現及び異種蛋白
産生のための多くの発現ベクターが報告されて２シ、こ
れらは当業者には公矧である。これらの発現ベクターは
、そこに含有されるプロモーターが構成的又は銹導性遺
伝子発現を可能にする様な発現系を含む。

１つの好適な態様では、マーチンローゼンバーグ（Ｍａ
ｒｔｉｎ　Ｒｏａｅｎｂｅｒｇ　）博士（米国国立衛生
研究所、メリーランド州ペセスダ（Ｂｅｔｈｅｅａａ　
）市）より供与され、チリクジアン（Ｃｈｉｒｉｋｊｌ
ａｎ、Ａ、　）とババス（Ｐａｐａｓ　、　Ｔ、　）　
（１９８１年）の報告したｐＫｏ　１ベクターを発現ベ
クターとして使用した。ｐＫｏ　１ベクターは大腸菌ガ
ラクトキナーゼ遺伝子を有するｐＢＦｔ　７°ラスミー
の誘導体である。ガラクトキナーゼ遺伝子（ｇａｌＫ　
）産物は、ｐＫｏ　１プラスミｈ　（ｇａｌＫ遺伝子の
上流にプロモーターが挿入され、多くの測定で形質転換
のマーカーとなる）にニジ形質転換された大腸菌Ｎ１０
０中で容易に発現され安定的に蓄積される。ローゼンバ
ーグ（Ｒｏａｅｎｂｅｒｇ）ら（１，９６８年）参照。

ｐＫ。

１で形質転換された大腸菌はガラクトースマコンキー（
ＭａｃＣｏｎｋｅｙ　）寒天上で赤いコロニーを作り、
形質転換されていないコロニーは白色である。又形質転
換した大腸菌溶解液をポリアクリルアミドデル峨気泳動
（ＰＡＣ）Ｅ）、又はガラクトースのリン酸化測定のた
めに酵素定量分析を行った場合−この遺伝子産物は不連
続なバンドとして同定される。

本発明の実施例においては、第７−１０図に示すように
、完全なｒｓｃＡ遺伝子とＡＰ　Ｉ　ｆ）ＮＡコード配
列を有するｐＫｏ１より成るＩ）ＭＯＮ　６１５２発現
ベクターを作成した。次に大腸菌Ｎ１００のような細菌
ｔ−ｐＭＯＮ６１５２発現ベクターで安定的に形質転換
し、２００μｇ／！！Ｌｔアンピシリン含有ガラクトー
スマコンキー（Ｍａｃｅｏｎｋｅｙ　）寒天上で増殖さ
せて形質転換体全選択した（実施例で詳述）。

次に第１０図に示すように制限酵素切断にニジ、ｒθＣ
Ａ及びＡＰ　Ｉコード配列が５′から３′への正しい配
向にあるか否かについて、形質転換細菌中に含まれる発
現プラスミド全スクリーニングした。

産生された融合蛋白の８製法は、選択した蛋白と宿主に
より異なる。余分の細菌性蛋白を除去して融合蛋白全精
製するには、通常の手段（例えばゲル濾過、イオン交換
クロマトグラフィー、又は蛋白特異的（例えば抗体又は
基質）親和性クロマトグラフィー）を用いれば良い。「
ｒθｅＡ特異的融合ペプチドの抗体精製」という題でク
リビ（Ｇ、Ｇ、　Ｋｒ１ｖｉ　）とビトナー（Ｍ、　Ｌ
、　Ｂｉｔｔｎｅｒ　）が同時に特許として申請した米
国特許 第７４７．１２６号に記載された、ｒｅｃＡ特異的モノ
クローナル抗体を用いるｒｅｃＡ含有異種蛋白の詳細な
精製法を、ここに参考のため記載する。この同時に申請
された米国特許出願と本特許出頭はモンサント（Ｍｏｎ
ａａｎｔｏ　）社に譲渡されている。

さらにｒｅｃＡ蛋白とその断片は陰性荷電が強く、陰イ
オン交換クロマトグラフィー等の方法でｎ　Ｗじやすい
（下ｇｂの実施例に詳述）。

融合蛋白切断 ■プロテアーゼは重炭酸アンモニウム緩衝液（Ｆ）１７
．８）又は酢酸アンモニウム緩衝液（ｐ）１４．０）中
でグル丸イル結合のみを加水分解し、す々緩衝液（ｐ）
１７．８）又は酢酸ナトリウム緩’ｊｉｉ！（ｐＨ４，
０）中でアスパルタモイル結合とクルタモイル結合を加
水分解するという研究者もいるが（ホウマード （Ｈｏｕｍａｒｄ　）とドラポー（Ｄｒａｐｅａｕ　）
　（１９７２年ａとｂ））、他の研究者はアンモニウム
又はリン酸緩衝液を使用する時アスパルタモイル結釡切
断とグルタモイル結合切断の間に差が見られなかったと
している。ベーシング（Ｂｅｈｒｅｎｓ　）とプラウｙ
　（Ｂｒｏｗｎ　）　（１９７６年）；オーステン（Ａ
ｑｓｔｅｎ　）とスミス（Ｓｍ１ｔｈ　）　（１９７６
年）を参照。我々は、合成ＡＰ　ｌの還元型を重炭酸ア
ンモニウム緩衝液（ｐ！−１７，８）中で■８ゾロテア
ーゼ消化させると切断さｎることｔ確定した。ミソノ（
Ｍｉｓｏｎｏ、　ｆ’）、Ｓ、　）ら（１９８４年）は
、ナトリウム尿拝泄活性と平滑筋弛緩活性を有する４個
の異なる心房性ペプチドの、リン酸ナトリウム緩ｉ　液
（ｐ’１７．８　）中でのｖ８フ０ロチアーゼに↓るア
スパルタモイル結合の切断を報告している。

本発明の將に好ましい態様では、ＮＩ＠１された酸化融
合蛋白を重炭酸アンモニウム緩衝液（Ｐ）′１７．８）
中でｖ８プロテアーゼ加水分Ｍを行った（詳細は後述）
。接合グルタモイル結合での部位特異的切断を最適化す
る可能性があると考えてこの緩衝液を違択した。本発明
の方法を用いることにより、細菌の産生ずる融合蛋白か
ら目的の心房性ペプチドの約８０チから９０チの放出が
得られることがわかった。

下記実施例に詳述するように、細菌の産生ずる新規な融
合蛋白からの新規な心房性ペゾチＰの放出を記載するに
あ７’（す、ｖ８ゾロテアーゼは接合部位にあるＧｌｕ
含有トリガーシグナルを優先的に切断することにより、
ｒｅ　（！Ａ蛋白中の内部Ｃ）ｌｕ残基の切断が起きる
前に目的のペプチドの早期放出を促進することを、我々
は見出した。さらに適当な反応条件（詳細は後述）でｒ
ｅｃＡ心房性ベゾチド融合蛋白をｖ８プロテアーゼを用
いて切断すると、グルタミン酸分子によシ心房性ペゾチ
ドに結合したｒａｃＡよシ成る融合蛋白は、目的異植ペ
ゾテドの単一分子としての早期放出を促進することを、
我々は見出した。

融合蛋白はａＳされた後、目的のペプチドを放出するた
めにエンドペゾチダーゼで切断される。

又は目的の融合蛋白を産生ずる細菌からの粗抽出物につ
いてエンドペプチダーゼ切断を行い、次に目的のベプチ
）″を単離し、通常のクロマトグラフィ一手段（例えば
ゲルａ！過、イオン交換クロマトグラフィー又は蛋白特
異的（例えば抗体又は基質）親和性クロマトグラフィー
）によシ精製される。

本発明の特に好ましい態様では、上記したように産生さ
れ単離された心房性ペプチドは、キュリー　（Ｃｕｒｒ
ｉｅ　）ら（１９８３年）の方法（米国特許第４．４９
６．５４４号にも発表されておシ、その一部は参考のた
めここに記載する）で測定する時強い平滑筋弛緩生物活
性を示す。

簡単に説明すると、生理学的に許容される条件下で、兎
の大動脈片又はヒヨコの直腸の断片を用いて、単離した
ペプチドの平滑筋弛緩活性の定量を行った。キュリー（
ｅｕｒｒｉｅ　）ら（１９８３年）及び米国特許題４，
４９６．５４４号を参照。ノルエピネフリンの連続的層
流により緊張を維持した兎の大動脈片は、心房性ペプチ
ドによる弛緩の強度の持続時間を測定するための信頼で
きる高感度の定量＃ＪＡ織である。単離したペプチドの
す）　ＩＪウム尿拝泄活性は、犬の静脈に注射し尿中の
ナトリウムの拝泄率を測定することにニジ求められる。

ホワイト（Ｗｈｉｔｅ　）とサムソン（Ｓａｍａｏｎ　
）（１９５４年）：ビッツ（ｐｉｔｔｓ、　Ｒ，Ｆ　、
　）（１９７４年）参照。

前記したように本発明は又、細菌により融合蛋白として
産生された種々の心労性に７°チｒ１その変・橿及び他
の（デチドの産生と吹出にも関する。

目面のナトリウム頃拝泄及び／又は平滑筋弛緩活性を有
するこのような心房性（デチド及びその変種は、上記の
生物活性でルーチン的に試験することで同定される。

以下の実施例により本発明を説明するが、これらは決し
て本発明の範囲を限定するものではない。

本発明を好適な標様に関して説明するが、本申請８を絖
めば当業者は容易にこの変更を考え得るであろう。

以下の微生物はアメリカンタイプカルチャーコンクジョ
ン（ＡＴＣＣ）　（米国２０８５２メリーラント州ａツ
クビＡ／　（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ　）市、パークローン
ドライブ（Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ　）　１２３
０１　）に寄託し７’ｃ　：　ＡＴＣＣ５５１４７−大
暢浦ＪＭ１０１（ｐＤＲ１４５５）。

本寄託物は、米国特許の認可により一般に利用できるよ
うＫなる。本寄託物は、本出頭の出ｔ１日の利益？有す
る米国特許の有効期間の間人手町詣であろう。しかし寄
託物の入手可能性は、政府に認められる特許権を低下さ
せてまで本発明の実、池の１利を構成するものではない
。さらに寄託した唄様は本発明の具体的な例示の１例を
示すのみであり、本発明は寄託した微生物によりその範
囲が限定されるものではない。

実施例１ 全てのオリゴヌクレオチドは、製１青者アデライドバイ
オシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ、Ｉｎｃ、）（カリフォルニア州フォスターシティ）
の方法に従い、５８０ＡアデライドバイオシステムズＤ
ＮＡシンセサイデーを用いて、モンナント（！Ｖわびａ
ｎｔｏ　）社のバイオロジカルサイエンス部で合成した
◇制限酵素はニューイングランドパイオラボズ仕（ｔＪ
ｅｙｙｔＥｉｘｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　）　（？
サチュウセツツ州ビバリー　（Ｂｅｖｅｒｌｙ　）市）
から購入した。大楊菌ＤＮＡポリメラーゼ１１　フレノ
ウ断片（ＰＯＩ　Ｉ　）為　Ｔ４ＤＮＡキナーゼ及びＴ
　４　ＤＮＡりが一ゼはニューイングラン１ニユクレア
ー社（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）（マ
サチュウセツツ州ボストン市）から購入しｔ。

３２ｐ−傾ｄヌクレオチドはアマ−ジャムｉｔ　（Ａｒ
ｎｅｒ−ｓｈａＵＱ）　（イリノイ州、アーリントンハ
イツ（Ａｒｌｉ−ｎｇｔｏｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ　）市）
から４５人した。

大ｆｋ菌Ｊｕ１０１ｕミネソタ（Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ　
）大学（ミネソタ州セントボール（Ｓｔ、　Ｐａｕｌ　
）市）のメッシング（１，Ｍｅｓｓｉｎｇ　）　ｔ１士
から得たが、アメリカンタイプカルチャーコレクション
（ＡＴＣＣ受きる（受入れ番号３５８７６）。欠場［Ｍ
　Ｍ　２９４：’Ｘ　ＡＴＣＣ受入れ番号３３６２５で
、大・ｌ１１菌Ｎ１００はＡＴＣＣ受入れ番号５３９６
５でＡＴＣＣから入手でキル。Ｃ）Ｍ２Ｓはマサチュウ
セツツ大学医学部（マサチュウセツツ州つオチェスター
市）のマリナス（Ｇ、　Ｍａｒｉｎｕｓ　）　ｔ１士か
ら得た。

制限−−ＪＡ消化、Ｔ４ＤＮＡＩＪが−ゼ反応、及びＤ
ＮＡポリメラーゼ１、フレノウ斯片反ｆ；ｉ’ｒＸ、、
ｄ造業者の指定する方法で実施できる。各制限＃素Ｏ好
ＩＪな緩衝液ぼ、以下の通りである。Ｘｂａ　Ｉ　。

ＢａｍＨＩ　　、　　Ｅｃｏ　　ＲＩ　　、　　Ｐｓｔ
　　Ｉ、　　　Ｈｌｎｃ　　１１％　　　Ｈｉｎｆ　　
ｌ＞’こッＶｓては：　５　Ｑ　ｍＭ　ＮａＣ１，６，
６ｍ４　）リス−ＨＣｌ。

Ｐ’　８−０．６−６　ｍＭ　＋、＜ｇｃ１２．５　ｍ
ｌＪジチオスレイトール（ＤＴＴ　）　。ＳｍａＩ　Ｉ
Ｃついては：　２Ｑ　ｍＭ　ＫＣＩ、６ＩｎＭトリスー
ＨＣｌ、Ｐ）１８．０．６　ｍＭ　Ｊ＜Ｃ１２，７５ｍ
ｒｌβ−メルカプトエタノール。Ｔ　４　ＤＮＡりが−
ゼ父応は、２５ｍＭトリス、Ｐ）（８−０，１０ｍｌＪ
　ＭｇＣｌ２．１０　ｍｕゾチオスレイトール（ＤＴＴ
　）、２　ｍｌＪス４ルミジン及び０．２　ｍＭ　ＡＴ
Ｐを富む緩衝夜中で実施した。大：曲菌ＤＮＡポリメラ
ーゼ１１７７７９４片μ、２０　ｍＭ　）　リス、Ｐ）
Ｉ７．２．１０　ｍＪ　！ＪｇＣ１□、１０ｍｕ　（Ｄ
’ｒＴ　）　、１　ｍＭ　Ａ’ｒｐ、各ｉ　ｍＭのｄＡ
ＴＰ　、　ｄＧｇ？。

ｄＣＴＰ　、　　ｄＴＴＰ　（ｄＮＴＰ　）を含む緩衝
液中で実見した０ＸｂａＩリンカ−はパイオラポズ仕（
Ｂｉｏｌａｂｓ）（マサチュウセツツ州ビパリー（Ｂｅ
ｖｅｒｙ　）市）から得た。折に合成したＤＮＡ９が必
要な場合、アルファー３２Ｐ　−ｄＡＴｐ　（４００ｃ
１／ｍｍｏｌ　）　ｆ：フレノウ反応に重相した。

ガンマ−３２Ｐ　−ＡＴＰ　（比活性５０００　Ｃｉ／
、ｒＬＴＩｏ１以上）と１００　ｍｌＪ　トリス、Ｐ）
１８．０．１Ｑ　ｍＬ（：Ｊｇ：１２、５　ｍＭ　Ｄ’
ｌ’Ｔ中のＴ　ｄ　ＤＮＡキナーゼを用いてオリイヌク
レオチげを標識した。

政色ブドウ球菌Ｖ８プロテアーゼはマイルプサイエンテ
ィフィック社（Ｍｉｌｅｓ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　）
　（イリノイ州ネーパービル（Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ　
）市）から購入した。Ｘａ内因子トロンビンはベーリン
が一マンハイム社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈ
ｅｉｍ　）　（イ／ディア州インディアポリス市）から
購入した。ベクターｐＫＯ１，１）ＵＣｌ　８、ｐＢＲ
３２７、ｐＢＲ３２２、Ｍ１３ｍｐ８及びＭ１３ｍｐ９
Ｕファーマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）　（ニュー
シャーシー州ビス力タウエイ（Ｐｉｓｃａｔａｗ＋ａｙ
　）市）から購入できる。Ｍ１３ｍｐ　８ｕニユ一イン
グラン団バイオラポズ社（ＮｅｙＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉ
ｏｌａｂｓ　）　（マサチュウセツツ州ビバリ−（Ｂｅ
ｖｅｒｌｙ　）市）から購入できる。またｐＫｏ　ｊと
ｐＢＲ５２２ばＡＴＣＣ受入れ番号３７１２６と５７０
１７でＡＴＣＣ’から入手できる。Ｍ１！ｉｍｐ９、Ｍ
１３Ｉ１１ｐ８、及びｐＵＣｌ　８ベクターはミネソタ
（Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ　）大学（ミネソタ州セントポー
ル（ｓｔ、　Ｐａｕｌ　）市）のメツシング（Ｊ、　Ｍ
ｅｓｓｉｎｇ　）博士から得た。ｐＵＣ９とｐＵＣ１３
セベセスダリサ一チラボラトリーズ社（Ｂｅｔｈｅｓｄ
ａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａ−ｔｏｒｉｅｓ、
　Ｉｎｃ、　）　（メリーラｙ　ｆ、”−州ｒチルスプ
ルグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ　）市）から得られる
。全ての微生物増殖培地成分と抗生物質はシグマ社（Ｓ
ｉｇヱ）（ミズーリ州セントルイス市）、又憧ディフコ
ラボラトリーズ社（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ　）　（ミシガン州デトロイト市）から得た。

実施例２ 以下の例は、第１図に示すＡＰ［Ｉ［の２４個のアミノ
酸をコードする合成遺伝子の作成と組み立てを示す。こ
の配列のコード部分の前には、Ｖ８プロテアーゼによる
融合蛋白からのＡ　Ｐ　ＩＩＩ　ｇＪｉｆｒの稔戚部位
を与えるためのグルタミン酸コドンがある。

この配列のツー１部分のすぐ後に翻訳停止コドンが縦に
並んでいる。さらに４１図に示ｆ様に、ポリヌクレオチ
ド配列に幾つかの制限エンドヌクレアーゼの認識部位を
導入した◇ 第１図に示′ｒ２本鎖ＤＮＡ　（ｄｓ　ＤＮＡ　）　断
片ｋｐＴｚ生するために、６つの相補的及び部分的に重
複する第６図に示すオリイヌクレオチｒを合成した。

合５！組オリゴヌクレオチドの一部′ｆｔ：コリアクリ
ルアミドー尿素ｒル（７Ｍ尿素中１６％（Ｗ／Ｖ））戒
気泳劾で精製した。サンが−（Ｓａｎｇｅｔ　）　（１
９７７年）を参照。各Ａ楔物の合成りＮＡの濃度は、が
ンマー”Ｐ　−ＡＴＰ　（比活性ＡＴＰ　ｉモルあたり
２２，０００−２４．［］　００力ウント／秒（ＣＰＭ
　）　）とＴ　ｄ　ＤＮＡキナーゼを用いる定量５′−
末端標識反応により測定した。

欠に以下の方法でオリゴ９ヌクレオチドをアニルリング
させた。各オリゴヌクレオチド５０ピコモル　（ｐｍｏ
ｌｅ　　）　　ｔ　、　　２　５　　ｍｌＪ　　）　　
リ　ス　−　ＨＣＩ　　、　ｒＪ１８．０　．１０　ｍ
Ｍ　ＭｇＣｌ２．１０　［ＩＭじチオスレイトール（Ｄ
ＴＴ　）、Ｑ、２ｒｎＭスペルミジン、（ＤＮＡ　１ｐ
ｍｏｌｅあたり５０００　ｃｐｍのｒ　−”Ｐ　−ＡＴ
Ｐ及び４０単位のＴ４　ＤＮＡキナーゼを含有する最終
反応混合液が２５μｍになるように加えた。３７′Ｃで
３０分反応させた後、２分間沸騰水浴につけ、次に６時
間かけて余々に室温まで冷やした。次にアニーリング反
応の生成物に４車立のＴ　４　ＤＮＡ　ＩＪが一ゼとＡ
ＴＰ（０，４ｒｎＭ１７Ｃなるように）を加え、４°Ｃ
で１６時間インキュベートし結合させた。５分間７（１
１）に加熱し結合反応を停止させ友〇 自己相補的Ｅｃｏ　ＲＥ末端がピリマーを形成した時の
ために、結合生成物をＥｃｏ　ＲＩ制限エンドヌクレア
ーゼで消化し、ＤＮＡＭ片の最大の大きさをモノマーに
した。得られるＤＮＡは、１２％（Ｗ／ｖ）デル、１０
％グリセロール上のポリアクリルアミドデル電気泳動（
ＰＡＧｇ　）で精製し、９３ｂｐの分子量ＤＮＡ全デル
から電気溶出させて断片を得た。その完全なりＮＡ配列
は第１図に示す。

実施例３ 以下の例では、接合部位又は結合にｖ８プロテアーゼ切
断部立を有する融合蛋白を線菌中で発現させる２つの組
み換え発現ベクターの作成と発現につ＾て記載する。具
体的には作成した組み換え発現ベクターの１つに、内因
性蛋白のＤＮＡ　（すなわちｒｅＣＡ　）コード配列の
後に且つＡｐｌ［Ｉ−’ｅデチドの最初のアミノ酸（Ｓ
ｅｔ　）のコード配列の直前に、Ｇ１ｕコード配列を含
有していた。従ってこの融合作成物を以下ｒｅｃＡ−Ｇ
１ｕ−Ａ　Ｐ　Ｕｌと呼ぶ。もう１つの組−７Ａ換え発
現ベクターは、ｒｅｃＡコード配列の後に、そしてＡＰ
ｌ［ベデチｒの最初のアミノ酸（Ｓｅｔ　）のコード配
列の直前に、Ｃ）ｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇコード配列を含
有していた。この融合作成物を以下ｒｅｃＡ−Ｇｌｕ−
Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａ　Ｐ　Ｉ［と呼ぶ。２つの遺伝子作
成物では全（１００％）　ｒｅｃＡコード配列を使用し
た。

Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ接合配列は目的のくゾチｒ（１
つは血液疑固第Ｘａ因子、他の１つはｖ８ゾロテアーゼ
）の切断とその後の放出の機会を与える。

こうして２つの異なる遺伝子作成物（１つはｒｅｃＡ−
Ｇｌｕ−Ａ　Ｐ　ｍ融合蛋白をコードし、もう１つ”１
４　ｒｅｃＡ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａ　Ｐ　ｍ　
４合蛋白をコードする）を得た。適当な宿主を形質転換
させ、この形質転換体を適当な条件で培養し、作成物を
発現させた（下記に詳述）。

ａ、　　７０％ｒｅＣＡ　−Ｂ有りローニングベクター
の作成 第４因に示す様に、テトラサイクリン（ｔｅｔｒ）遺伝
子のかわりに、ｒｅＣＡ７°ａモーター、リボゾーム結
合配列及びｒｅｃＡ　ＤＮＡコード配列の７０％（これ
らをまとめて７０％ｒ＋ｑｃＡと呼ぶ）を有するｐＢＲ
３２２改質プラスミドより戎る徂み喚えりｏ　−ニング
ベクターｐＤＲ１４６１を作成した。

具体的には１サンカー（５ａｎｃａｒ、　Ａ、）ら（１
９８０竿）の記載するｐＤＲ１４５３を、サンカー（Ｓ
ａｎ−ｃａｒ、　Ａ−）とルツデ（Ｒｕｐｐ＋　ｗ、Ｄ
、）　（１９７９年）の方法に従いｐＤＲ１４５３で形
質転換させた犬侍菌ＪＭ１０１から単離した。ｐＤＲ１
４５５で形質転換させた大腸菌Ｊｒ、（１０１はブタ波
スト条約の規定に従いＡＴＣＣに寄託し、ＡＴＣＣ’受
入れ番号第５３１４７を与えられた。

ｐＤＲ１４５３は大腸菌の全ｒｅｃＡ遺伝子をもってい
る。第４図に示す様に７０％ｒｅｃＡをｐＤＲ１４５６
から１８００　ｂｐのＢａｏ＋　ＨＩ　／　ｇｃｏ　Ｒ
Ｉ断片として切断し、０．７％アがａ−スのアガロース
デル・電気泳動（マニアテイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ　）
ら（１９８１年））により精製し、次に電気溶出した。

プラスミドｐＢＲ３２２ｆｔＢａｍ　ＨｒとＥｃｏ　Ｒ
Ｉで切断し、ｔｅｔで遺伝子を有する小さいＢａｍ　Ｈ
Ｉ　／Ｅｃｏ　ＲＩ断片を除いて、線状改質ｐＢＲ３２
２プラスミドを作成した。これを牛小侍アルカリ性ホス
ファターゼ（ＣＡＰ　）で処理し、第４図に示す様にＴ
　ｄ　ＤＮＡりが−ゼの存在下で、Ｂａｍ　ＨＩ　／　
ｇｃｏ　ＲＥｉｉ片を含有する１　８０　［１ｂｐの７
０％ｒｅｃＡ　ｌ：　７Ｍ合した。次にこの混合液ｆｔ
１４℃で一晩インキユベートシた。線状改質ｐＢＲ５２
２プラスミドへの７０％ｒｅＣＡ断片の挿入は、最初ａ
ｍｐｒ「コミニー形成で確認した。７０％ｒｅｃＡの挿
入は、単離した組み侯えプラスミド’に：　Ｂａｍ　Ｈ
ｌ　（！：　Ｅｃｏ　ＲＩ　（挿入配列より成る１ｓｏ
ｏｂｐＦ！ｆｒ片を与える）で切断して確認した（マニ
アテイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ　）ら（１９８２年）参照
）。１８００塩基対断片は、マニアテイス（Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ　）ら（１９８２年）の方法に従い０．７％（Ｗ
／Ｖ）のアがロース上のアガロースデル電気泳効により
同定した。以下全ての・制限断片はこの標準方法で同定
した。得られる岨み換えクローニングベクターをｐＤＲ
１４６１ト呼ぶ（第４図に示す）。

ｂ、７０−１００％ｒｅＣＡ含有クローニングヘりター
の作成 ｒｅｃＡのＣ−末端７０−１００％のＤＮＡ　：Ｉ−）
７配列を有するＭ　１３　ｍｐ　９フアージベクターよ
り成る、組み換えクローニングベクターｐＭＯＮ　３２
２８を′＠５図及び第６図に示す様に作成した。

ｐＤＲ１４５３は上記した様に単離し、Ｐｓｔｌテ切断
した。第５図に示す様に、ｒｅＣＡコード配列のＣ−末
端部分を含有する１８００ｂｐ＃片（第５図に示ｆ）を
単離し、Ｈｉｎｆｌで切断した。この消化したＨｉｎｆ
１断片を適当な反応条件下で（例えば’ｖニアテイス（
Ｍａｎｉａｔｉｓ　’）ら（１９８２年）参照）、大腸
菌ポリメラーゼＴ１　フレノウ断片（ここではＰｏ１Ｉ
と呼ぶ）、デオキシヌクレオチド三リン＠　（ｄＮＴＰ
’ｓ　）と混合して、粘性Ｈｉｎｆ１末４をプラント−
末端（ｂｌｕｎｔ−ｅｎｄ　）に変換し、次にＥｃｏ　
ＲＩで切断した。欠に７０−１００％ｒｅＣＡのＤＮＡ
　：ｌ−ド配列を有する５　６０　ｂｐのＥｃ。

ＲＩ／　Ｈｉｎｆｌ　８片をポリアクリルアミドデル［
気泳動で単離した。あらかじめＥｃｏ　ＲＩとＳｍａＩ
で切断しＣＡＰで処理したＲＦＩＪ　１５　ｍｐ９　Ｄ
ＮＡを、第５図に示す様にＴ　４　ＤＮＡ　Ｕが一ゼの
存在下で７０−１００％ｒｅｃＡ　Ｉ折片と混合し之。

結合混合液は１４℃Ｔ−ＩＩ５１ｕインギュベートした
。最初マニアテイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ　）ら（１９８
２年）の軟寒天重層法を用＾るｌ　ｘ　ＹＴ培地（３ｒ
ｎｌの上層寒天（１０ａＵの１００　ｍＭ　ＩＰＴ（）
　（イソゾａビル−β−Ｄ−チオがラクトピラノシド）
と５Ｑｇｌの２％（Ｗ／　ｖ　）　Ｘ　−（）ＡＬ　（
５−プロモー４−りａロー３−インげリルーβ−Ｄ−が
ラクトピラノシド）を含有）で増殖させた大腸菌ＪＭ１
０１の無色のプラク形成を形成させ、メツシング（Ｍｅ
ｓｓｉｎｇ　）ら（１９８３年）の方法でトランスフェ
クションさせ、メツシング（ｐｌｅｓｓｔｎｇ　）ら（
１９８２年）の方法で組み換えベクターの５ｓＤＮＡ　
ｆ単離して、Ｍｌ　５　ｔｎｐ　９へＤ７０−１００％
ｒｅｃＡ断片の挿入を確認した。欠に徂み喚えＲＦ　Ｄ
ＮＡ　ｔ−Ｅｃｏ　ＲＩとＨｉｎｄ■で消化して（この
操作により第５図に示すように３８０　ｂｐ断片が得ら
れた）、７０−１００％ｒｅＣＡコード配列の挿入を確
認した。こうして得られた７０−１００％ｒｅｃＡのＤ
ＮＡ　：２−　Ｆ配列を有するＭ１５ｍｐ９より成る川
み換えベクターをｐＭＯＮ　２５５８と命名した。

次にｒｅｃＡコード配列のＣ−末端にＥｃｏ　ＲＩ制限
部位を導入した。すなわちメツシング（ｕｅｓｓｌｎｇ
）ら（１９８２年）の方法によりｎＭＯＮ　２５５８の
１本鎖ＤＮＡを単離し、オリイヌクレオチド指令部位特
異的突然変異誘発（基本的に・戸う−（Ｚｏｌｌｅｒ）
とスミス（Ｓ山ｉｔｈ　）　（１９８２年）；・戸う−
（ｚｏｌｌｅｒ　）とスミス（Ｓｍ１ｔｈ　）　（１９
８３年）；ノリス（Ｎｏｒｒｉｓ　）ら（１９８３年）
の方法）■鋳型として使用した。

第６図はｒｅｃＡコード配列のＣ−末端に巳ｃｏ　ＲＩ
制限部位を作成するための突然￥異誘発を図示する。具
体的にはｒｅｃＡアミノ酸残基３５２番のコドンを、ア
スパラギン酸（ＧＡＴ　）からフェニルアラニンＯコー
ド（ＴＴＣ）に変えた。突然変異誘発は以下の様に行っ
た。目的の突然変異の配列を有するオリゴヌクレオチげ
プライマー（第６図に示す）１に用いて、ｓｓ　ＤＮＡ
　ｐＭＯＮ　２５５８鋳型の閉１ＤＮＡコピーの合成を
開始させた。こうして作成した閉Ｅ９Ｊ　ｄｓ　ＤＮＡ
分子を、シラー（Ｚｏｌｌｅｒ　）とスミス（Ｓ＋ｎ１
ｔｈ　）（１９８３年）の方法によりアルカリ性ショ儂
勾配遠心分離により、不完全な及びｓｓ　ＤＮＡ　Ｆｆ
ｆｉから分離する。矢にメツシング（ｖｅｓｓ−ｉｎｇ
　）ら（１９８２年）の方法により、閉ＢｉｄｓＤＮＡ
分子を用いて大腸菌ＪＭ１０１を形質転換させ、得られ
た無色のプラクを採喉してボール（Ｐａ１ｌ　）フィル
ター（−−ルウルトラファインフイルトＶ　−ショア社
（Ｐａ１ｌ　Ｕｌｔｒａｆｌｎｅ　Ｆｉｌ−ｔｒａｔｉ
ｏｎ　Ｃｏｒｐ、　）　（ニュー　：Ｆ　−９州りｖ　
７　ニア　−ブ市））Ｋ移し、部位特異的突然変異誘発
をさせるのく用いるオリデスクレオチドプライマーの３
２ｐ−標識型に対するノ・イブリダイゼーションのスク
リーニングを行った。プラクを採暇する操作は、ボール
フィルター製造業者の方法に従った。

ハイブリダイゼーションＯスクリーニングハ、？−ルウ
ルトラファインフイルトレーション社（Ｐ□１Ｕｌｔｒ
ａｆｉｎｅ　Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　Ｃｏｒｐ、　）の
「ポールバイオダインＡナイロンフィルターへのＤＮＡ
　ＩＪ動のプロトコールガイド（Ｐｒｏｔｏｃｏｌ　（
）ｕｉｄｅ　ｆｏｒ　ＤＮＡ　Ｔｒａｎ−ｓｆｅｒ　ｔ
ｏ　Ｐａ１ｌ　Ｂｉｏｄｙｎｅ′ｒＭＡ　Ｎｙｌｏｎ　
Ｆｉｌｔｅｒｓ　）Ｊに従い、ナイロンパイオダ、イン
フィルターを使用し−ｃ　行ツタ。Ｍｌ　３０）１）９
／７０−１００％ｒｅｃＡファージでづ４製した対照フ
ィルターから標識放射能がなくなるまで温度を上げて、
フィルターを洗滌した。典型的な洗滌操作は、６×５Ｓ
Ｃ（０，９さ肘ＪａＣｌト０．０９　Ｍクエン酸ナトリ
ウム）で室温で１０分洗滌の後ろｘＳＳＣで５（１１）
で５分洗滌し、欠て温度を５　’Ｃ上げて洗滌する。対
照ファージより高い１度で放射標識オリゴヌクレオチド
プライマーとハイブリダイゼーションしたプラクは、Ｃ
−未４Ｅｃｏ　ＲＩ部位コード配列？有する新に作成さ
れた７０−１００％１”ＯＣＡと考え、陽性候補とした
。又Ｄ　５　ｍｌの２　Ｘ　ＹＴ培地（１，６％（Ｗ／
ｖ））リゾタン、１．０％（ｗ／ｖ）酵母工＝２ス、０
．５　％　（ｙ／　ｖ　）　ＮａＣ１）中で、通気しな
がら３７℃で一晩省燗させた大４菌ＴＭ１０１形質転換
体から、各無色のプラクを採喉した。メツシング（Ｍｅ
ｓｓｉｎｇ　）ら（１９８２年）の方法で調製したファ
ージＤＮＡ全ニトロセルロース上にスポットし、放射標
識プライマーとハイブリダイゼーションさせ、上記した
ように温度を上げながら洗滌した。Ｍ　１３　ｐｏｐ９
／７０−１００％ｒｅＣＡ対照プラクより高イ温度でハ
イブリダイゼーションしたファージＤＮＡ’ｔ、同様に
陽性候補とした。両スクリーニング法で得られた陽性候
補プラクを上記した様に増殖させ、これを用いてＳＳフ
ァージＤＮＡを調製し、次にこれをサンガー（Ｓａｎｇ
ｅｒ　）ら（１９７７年）の方法で配列を決定して、こ
れらがｐＭＯＮ　３２２８　ｋ含有する７０−１００％
ｒｅｃＡのニーｒ配列を有シテいることを確認した。ｒ
ｅｃＡのＣ−末端アミノ酸に隣接するＥｃｏ　ＲＩ部位
が付加される頻度は約２−５％であった。

Ｃ，ｒｅｃＡ−Ｇｌｕ−Ａ　Ｐ　ｌｌ［発現ベクターの
作成大腸菌宿主中で適当な条件下でｒｅｃＡ−Ｇｌｕ−
Ａ　ＰｒＪｉ融合蛋白ｔ−産生し得る発現ベクターｐＭ
ＯＮ　６１５２全、第７図から第１０図に示すように作
成した。

簡単に説明すると、第７図に示すように改質ｐＫｏ　ｌ
プラスタげベクター（ｐＫＯｌ　（ＲＩ−）を作成した
。

１）ＫＯｌ　（Ｒｒ−）は、ｐＫｏｌをＥｃｏ　Ｒ１で
消化して前記した様に末端を塞いで粘注末４をプラント
末端に変換し、プラント末端線状化デラスミＦｒＴ４Ｄ
ＮＡ　Ｕが−ゼで１４℃で一晩インキユベートして唯一
のＥｃｏ　ＲＩ　１ｌｊｌ限部位を除いたｐＫＯｉプラ
スミドより成る。次にマニアテイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ
　）ら（１９８２年）の方法で大腸菌ＪＭ１０１をｐｘ
ｏｌ（ＲＩ″″）で形質転換して、チリクジアン（Ｃｈ
ｉｒｉｋｊ　−１ａｎ、　Ａ、　）とババス（Ｐａｐａ
ｓ、　Ｔ、　）　（１９８１＠）方法ｒ　ｐＫＯｌ　（
Ｒｒ−）　を単離Ｌ７’ｃ。ｐＫＯｌ　（ＲＩ−）中の
Ｅｃｏ　ＲＩ部位の欠失は、ベクターのＥｃｏ　ＲＩ切
断に対する耐性を証明することにより確認した。

次にｐＫｏｌ　（ＲＩ−）をＨｉｎｄ　］ｌｌとＳｍａ
ｌで切断して、Ｈｉｎｄ　ｌ［／　Ｓｍａ　Ｉ小断片を
除去しｔ。Ｈｉｎｄ　ｆｆｌ／　５ｃｏａＩ　ｆ除き線
状化したｐＫＯｌ　（Ｒ１−）　ｆ次にＣＡＰで処理し
た。線状化したプラスミドはＢａｍ　ＨＩ制限部位をき
まない。前記したように単離したＲＦＭｌ　３　［Ｄｐ
９　ＤＮＡを、Ｈｉｎｄｕと５ｒｎａ　Ｉで切断した。

内部Ｂａｃｎ　ＨＩ部立を有するＨｉｎｄｌｌ　／　Ｓ
＋ｎａＩ小断片（ここでＵＭ１３リンカ−と称する）を
アクリルアミｒケ９ル゛１気泳動で単離した。第７図に
示すようにン Ｔ　４　ＤＮＡ　Ｕが−ゼの存在下でＭ　１３１７ンカ
ーを線状化し＆　ｐＫＯｌ　（Ｒｒ−）と混合して、１
４°Ｃで一晩インキユベートしてＭｊ３リンガ」を線状
化ｐＫＯ１（Ｒニー）中に挿入し念。欠にマニアティス
（Ｍａｎｉａｔｉｓ　）ら（１９８２竿）の方法に従い
、結合混合液で犬）腸菌ＪＭ１０１を形質転換させた。

最ｇＪ２００μ！？／ｒｎｌアンピシリンを含有するル
リアベルタニ（Ｌｕｒｉａ　Ｂｅｒｔａｎｉ　）プレー
ト上Ｏａ田ｐｒコロニーの増埴により、Ｍ１３ｍｐ９リ
ンカ−のｐＫＯｌ　（ＲＩ″′）への挿入を確認し念。

前記したようにｐＫＯｌ　（ＲＩ−）／Ｍｌ　３リンカ
−を単離し、ＢａｍＨｒで切断してＢａｃｏ　ＨＩ部位
の導入を証明することにより、リンカ−のプラスミドベ
クターへの障入金確認した。

次に第８図に示すように、ｐＫＯｌ（ＲＥ−）／Ｍ１３
リンカーベクター中のＳｍａｒ部立全Ｘｂａ　Ｉ部位に
変換させた。簡単に説明すると、ｐＫＯｌ　（ＲＩ−）
／Ｍ１３リンカーベクターｉｓｍａＩで切断し、ＣＡＰ
で処理し、熱不活性化し、前記した様にＴ　ｄ　ＤＮＡ
すが−ゼの存在下で合成ＸｂａＩ　’）ンヵーと混合し
た。次に前記したように大腸菌ＪＭ１０１を結合混合液
で形質転換させた。ａｍｐｒコａニーからプラスミドを
単離し、そのＸｂａ　Ｉによる切断を証明することによ
り、ＸｂａＩ部位の挿入全スクリーニングした。得られ
たプラスミドを第８図に示す様にｐＫＯｌ　（ＲＩ−）
　／　ＸｂａＩとする。

矢に、ＡｐＨ［と７０％ｒｅｃＡ　ＤＮＡ　＝ｒ−ド配
列を、ＢａｏｏＨＩ部位でｐＫＯｉ　（ＲＩ−）／　Ｘ
ｂａＩに挿入した。

簡単に説明すると、ｐＫＯｌ（ＲＩ−）　ｋ　Ｂａｍ　
ＨＩとＸｂａＩで切断しＢａｍ　ＨＥ　／　ＸｂａＩ小
断片全断片したように除去した。次に、Ｔ４ＤＮＡＩＪ
が−ゼの存在下で、線状化したｐＫＯｌ　（ＲＩ−）　
／　Ｘｂａ［ベクターを、Ａ　Ｐ　ｌｌ［ＤＮＡコード
配列を含有する８　７　ｂｐのＥｃｏ　ＲＩ　／　Ｘｂ
ａＩ　ｆ片、及び７０％ｒｅｃＡ　ＤＮＡ　ニア　−１
配列を含有する１　８００　ｂｐ　Ｄ　Ｂａｍ　ＨＩ　
／　Ｅｃｏ　ＲＩ断片（両断片とも第９図に示すように
単離した）と混合した。２００μｇ／ｍｌのアンピシリ
ンを含有するがラクトースマコンキー（１ｖｆａｃｃｏ
ｎｋｅｙ　）寒天プレート上の赤いａｒｎｐｒコａニー
から単離し、結合混合液で形質転換させたプラスミドを
、１８００ｂｐのｌ３ａｌＤＨＩ　／　Ｅｃｏ　ＲＩ断
片と１８００　ｂｐ　ＯＢａｍＨｌ　／　Ｐｖｕ　ｆＪ
断片（第９図に示す）の存在につＡてスクリーニングし
て、ＡＰ■をニーｒするＤＮＡに融合した７０％ｒｅｃ
ＡをコードするＤＮＡを含有すするｐＭＯＮ　６１５０
ベクターの作成を証明した。

ｒｅｃＡ−Ｇｌｕ−Ａ　Ｐ　ｉｌｌ融合蛋白の発現のた
めの完全な遺伝子を有する発現ベクターりＭＯＮ　６１
５２は、第１０図に示す様に作成した。簡単に説明する
と、第１０図に示す様に、７０−１００％ｒｅ（’Ａを
コードするＤＮＡを含有する２　８０　ｂｐのＥｃｏ　
ＲＩ断片ｔ　ｐＭＯＮ　５２２８から単離し、第１０図
に示す様にｐＭＯＮ　６１５０上のＥｃｏ　ＲＩ部位に
挿入した。

４５０　ｂｐ　Ｈｌｎｃ　［断片の存在を証明すること
により、ＡＰｌ［と７０％ｒｅｃＡ　ＤＮＡコード配列
に関して７０−１００％ｒｅｃＡＤＮＡ　：ｒ−ド配列
の５′カラ６′への正しい配向を確認した。７０−１０
０％ｒｅｃＡ　ＤＮＡコード配列の配向が正しくない場
合、新に作成した組み換え発現ベクターをＨｉｎｃ　Ｈ
で切断すると５２５　ｂｐのＨｉｎｅ　ＩＦ断片が生成
したてあろう。

ｐ、　　ｒｅｃＡ−Ｇｌｕ−Ｃ１ｙ−Ａｒｇ−Ａ　Ｐ　
ｌｌ［発現ベクターの作成 前記のオリゴヌクレオチ１指令部位特異的突然変異誘発
法を用いて、ＡＰｌ［［のＮ−末・瑞セリンコドンの直
前にアミノ酸グリシン（Ｇｌｙ　）とアルギニン（Ａｒ
ｇ　）のコｒンを順番に挿入して、ｒｅｃＡ−Ｇｌｕ−
Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａ　Ｐ　１１　ＤＮＡ　コード配列を
作成した。

簡単に説明すると、ｄａｍ−宿主（例えばＭＡＡメチラ
ーゼ遺伝子産物を発現しな＾宿主）中へ形質転換したｐ
ＭＯＮ　６１５２をＢａｃｏ　ＨＩとＸｂａＩで切断し
、ｒｅｃＡ−Ｇｌｕ−Ａ　Ｐ　ｉ融合遺伝子を有する２
　２００　ｂｐのＢａｎ　Ｈ工／　ＸｂａＩ断片を単離
し、第１１図に示すようにクローニングベクターｐＵＣ
１８のＢａｍ　ＨＩからｘｂａｚ部位に挿入し、ｐＭＯ
Ｎ６１５４Ｔｈ作成した。用いたｄａｔＩ＋″″個主は
０Ｍ４８であった。

次に第１１図に示すように、ｒｅｃＡ−Ｇｌｕ−Ａ　Ｐ
　ｌ［融合遺伝子を有するＢａｍ　ＨＩ　／　Ｈｉｎｄ
　１［［断片ｔ−ｐＭＯＮ６１５４から単離し、Ｍ　１
５　ｍｐ　８　：’）　Ｂａｍ　Ｈｒ部位にｐ　ａ　−
７化し、ｒｅｃＡ−Ｇｌｕ−Ａ　Ｐ　ＩＩＩ遺伝子を有
する１本鎖組み換えＭ　１３　ｍｐ　８　ＤＮＡを単離
した。次に、ＡｐＨ［のＮ−末端セリンコｒンの直前に
目的の突然変異の配列を含有する抗−コード配列５′−
ＧＡＡＣＡＧＣＴＧＧＡＡＣＧＣＣＣＴＴＣ（）ＡＡＴ
ＴＣＣ）ＴＴ　−３’　（すなわちＧ１７とＡｒｇコド
ンの付加）より成るオリゴヌクレオチドプライマーを用
いて、前記したように１本鎖組み換えＭ　１５０１＋１
）　８　ＤＮＡベクターの閉環ＤＮＡコピーの合成を開
始させた。前記した方法に従＾、ｒｅｃＡ−Ｇｌｕ−Ｇ
ｌｙ−Ａｒｇ−Ａ　Ｐ　Ｉｆｆ遺伝子をコードするＤＮ
Ａ配列を作成するための目的のＧｌｙ−Ａｒｇ挿人体を
有するファージＤＮＡを同定した。　　ｒｅｃＡ−Ｇｌ
ｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａ　Ｐ　ｍ遺伝子をコータするＤ
ＮＡ配列の存在は、ＤＮＡ配列決定により確認した。欠
に、陽性単離体を大腸菌ｙＭ１０１中で複製させた後、
ＲＦ組み換えＭ　１３　ｒｎｐ　８　ＤＮＡ　２単離し
、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄ　ｉｌｌで切断し、ｒｅｃＡ−
Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａ　Ｐ　ＩＩ遺伝子を有する
Ｂａｃｎ　ＨＩ　／　Ｈｉｎｄ　ｌ［断片を得た。Ｂａ
ｍＨＩ　／　Ｈｌｎｄ　７５断片を、あらかじめＢａｍ
　ＨＩとＨ１ｎｄ■で切断したｐＢＲ５２７発現ベクタ
ー中に挿入して発現ベクターｐＭＯＮ　６１５９　ｋ作
成した。

Ｅ、　　ｒｅｃＡ−Ｇｌｕ−Ａ　Ｐ　ｍとｒｅｃＡ−Ｇ
ｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ　−ＡＰｌ［の発現 次にマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ　）ら（１９８２
年）のＣａＣ１ｚ法を用いてｐＭＯＮ　６１５２又ｎ　
ｐｌＮ６１５９で、大暴菌Ｊ’Ｍ１０１を形質転換させ
た後、以下の様にして誘導した。ｐｂｌＯＮ　６１５２
又ｕ　ｐＭＯＮ　６１５９　ｋ有する大腸菌Ｊ　ｌｙ（
ｊ　Ｑ　１の単一コロニーを別々に接種し、通気しなが
ら５０°Ｃで一晩増殖させた。この−晩培養液の１プを
、１％（Ｗ／Ｖ）グルコースと０．５％（ｗ／ｖ）のカ
ヂミノ酸を補足した１５ｍ１のＶ９培地に別々に接種し
、６０°Ｃで潰度が１５０クレツト（Ｋｌｅｔｔ　）単
位になるまで増殖させた。次にナリジキシン酸を最終濃
度が５０μ９／ゴになるように添加して細胞を誘導し、
３７℃で四時間インキュベートした。細胞を集める前に
、１０クレツ）　ｎ１分を各誘纏培養液から採喉し、＠
酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ　）−ポリアクリルアミ
ドデル電気泳！Ｉｒｈ緩衝液中でそれぞれ溶解し、リー
ム’）　（Ｌａｅｍｍｌｉ　）（１９７０）の方法に従
いＳＤＳ　−ＰＡＣ）Ｅで分析した。２つの遺伝子作成
物からの大腸菌Ｊｉ、＜１０１に、ｒｅｃＡ　−Ａ　Ｐ
　ｍ　４合蛋白より成る４　１．０００ダルトンの蛋白
が高濃度で存在していた。＠側のｐＢＲ３２７とｐＫｏ
　１プラスミドを有する大腸菌ＪＭ１０１は、４１，０
００ダルトンの蛋白を産生じない。この誘導した形質転
換細胞ｆ：（レットにして集め、凍結（レットとして一
７（１１）で保存した。

実施例４ 本例は、Ｖ８プロテアーゼによるＧｌｕ−８ｅｒとＧｌ
ｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ　トリが−シグナルの切断を示す。

本例では、細菌の産生ずる融合蛋白をまず、免疫アフイ
ニテイ又は陰イオン交換クロマトグラフィーで単離し、
Ｖ８プロテアーゼで切断した後、目的のペプチド（ＡＰ
ＩＩＩ）全精製した。

Ａ、　　ｒｅｃＡ融合蛋白の単離 ｒｅｃＡ−Ｇｌｕ−Ａ　Ｐ　ｌｌ［とｒｅｃＡ−Ｇｌｕ
、−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａ　Ｐ　■はｐＨ７，０から９．
０で陰イオン交換樹脂（例えばＦｒａｃ−七ｏｇｅｌ　
ＴＳＫ　ＤＩＡｌｌｉｌ：　−６５０ｍ　）に結合し、
ｐＨに依存して１００−５１１１３１１ＩＭのＮａＣｌ
で溶出される。

イー−Ｚ　ム’サイエンス社（ＬＭ、　５ｃｉｅｎｃｅ
　）　（ニューシャーシー州ギプスタウン（Ｃ）ｉｂｂ
ｓｔｏｗｎ）　）から得たＦｒａｃｔｏｇｅｌ　ＴＳＫ
　ＤＥｉ；ＡＥ　−６５０ｒｎ　（以下Ｄｌ１ｍＡｇ　
ＴＳＫと称する）陰イオン交換樹脂に、以下の様に調製
した。５００　ｒｎｌＯＤＥＤＡＥ　ＴＳＫカラムを調
製し、１［１［］ｍＭのＮａ１ｌと５３　ｍＭのトリス
−ＨＣｌ、ｐ）１７．５より成る緩衝液で平衡化させた
。

上記の様に単離した細胞く−ストを、８℃で２５０ｍ１
の５０ＩＩＩＭトリスーＨＣｌ　、　ＰＩ−１７，５に
再懸濁させた。５７４インチチップを有するヒートスス
テムズウルトラソニック社（Ｈｅａｔ　Ｓｙｓｔｅｍｓ
−Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ。

Ｉｎｃ　）　にューヨーク州ファーミングデール（Ｆａ
ｒｏｉｎｇｄａｌｅ　）　）　１０−３７５型を用ムて
〜約８６Ｃから約１８℃の範囲で１分ずつ上昇させて合
計６分間、細胞懸濁液を超音波処理した。次に超音波処
理した懸濁液を、２６，０００．９で２０分間遠心分離
した。約５から７グラムの蛋白を含有する上僚液ｆｆｉ
＋ｄ＄４レットからデカントして分離し、約５　ｍｌ　
／　ｍｉｎの流速で８℃で陰イオン交換樹脂の表面に范
加した。約１０Ｑ　ｃｏＭから約３５０　ｍＭまでの範
囲のＮａＣ１の直線浸度勾配ｔカラムに与え、約２５ｒ
ｎｌ’ｒ含む画分を集め、全大腸菌蛋白の約８０％から
融合蛋白を分離した。カラムからの蛋白の溶出は、２８
０ｎｍでの紫外部吸収と電気泳動分析により追跡し、融
合蛋白を含む画分を合せた。この融合尿白く約２８０口
Ｖ　ＮａＣ１で弓出し、この濃度にほとんどの大腸菌蛋
白の溶出【必要な濃度より実質的に高い。又はＮＨ，Ｃ
１金用＾て大腸菌蛋白から融合蛋白を分離した。ＮａＣ
１での溶出と同様に約１００　ｍＭから約５５０　ｍＭ
までの範囲のＦＪＨ，Ｃ１’７）直線濃度勾配をカラム
に与え、全大腸菌蛋白の約８０−８５％から融合蛋白を
分離した。

融合蛋白は約２００　ｍｌ、（から約２５０　ｍＭのＮ
Ｈ、Ｃ１で溶出する。

「ｒｅＣＡ融合蛋白の精製」という題でクリビ（Ｇ。

Ｇ、　Ｋｒ１ｖｉ　）とビトナー（Ｍ、　Ｌ、　Ｂｉｔ
ｔｎｅｒ　）が出願し、同１時にモンケン）　（）ｖｒ
ｏｎｓａｎｔｏ　）社に１利岩Ｉ渡された特許（米国特
奸出願凍７４７，１３６＠に記載のモノクローナル抗体
も又利用して、高度にｓ９Ｍさｔｔ＊’ｒｅｃＡ−Ｇｌ
ｕ−Ａ　Ｐ　Ｉｎ融合蛋白が得られた。

Ｂ、ＶＢプロテアーゼ切断 ｒｅｃＡ−Ｇｌｕ−Ａ　Ｐ　’ＩＩ又はｒｅｃＡ−Ｇｌ
ｕ７＋）ｌｙ−Ａｒｇ−Ａ　ＰＩＩＩｍＩｎ融合蛋白、
ＤＥＡＥＴＳ’に又＋″ｊ：ｒｅｃＡモノクローナル抗
体方ラムからの融合蛋白プールを、５０　ｍＭ　ｆ）　
ＮＨ４ＨＣＯ３で透析した。簡単に説明すると、融合蛋
白を含有する約８００から１００１００Ｏカラム溶出液
を、２４リツトルの５　Ｑ　ｒｎＭ　ＮＨ，ＨＣＯ２（
ｐ）ｌ　７．７−８．３　）で４　’Ｃで６時間透析し
た後、１２．０００−１５，０ＯＯＦで４°Ｃで１０分
間遠心分離した。

約０．３−１．０”９　／　Ｔｎｌの融合蛋白を、５０
ｍＭの罷、ＨＣＯ２（ＰＨ８，０）中、酵素と基質のモ
ル比が１：２０からｉ：１ｏｏｏの範囲で、ｖ８プロテ
アーゼと混合し、３７℃でインキュベートした。酵素と
基質のモル比１：５００を用Ａる典を的な切断反応を、
４時間侵に凍結又は陰イオン交換樹脂（後述する様にｖ
８デａテアーゼて結合する）の奈加により、停止させた
。

ｒｅｃＡ−Ｃ１ｕ−Ａ　Ｐ　［融合蛋白内に含まれるＡ
Ｐ［の約８０％とｒｅｃ’Ａ−Ｇｌｕ−ｏｌｙ−Ａｒｇ
−Ａ　Ｐ　’ｉｆｌ　ａ合蛋白内にオまれるＡＰＩＩＩ
の約５０％が溶出されることが、ヒヨコ直暢の弛緩活性
測定（前述）、及び／又はＨＰＬＣ分析から明らかにな
った。簡単に説明すると、ウォーターズアソーシエー）
　社（ＴｈｔｅｒｓＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ　’）　（マ
サチュウセツツ州ミルフォード（Ｍｉｌｆｏｒｄ　）　
）装置を用＾て１セパレーシヨンズグルーデ（５ｅｐａ
ｒａｔｉｏｎｓ　Ｇｒｏｕｐ　）　（カリフォルニア州
ヘスにリア（Ｈｅ５ｐｅｒｉａ　）　）から入手し念、
１８炭素・鎖誘導体化ピダック（ＶｙｄａｃＴＭ’）　
シＩＪヵ（粒子径５ミクロン）全含有する逆相分析ＨＰ
ＬＣカラムにより、ＡＰＩＩＩを他の切断反応ペプチド
から分離した。この逆相カラムは１０％（Ｖ　／　Ｖ　
）アセトニトリルト０．５％（Ｖ／Ｖ））リフロロ酢ｄ
　（ＴＦＡ　）で、約１　ｒａｌ／　ｍｉｎで平衡化さ
せた。切断生成物をカラムに添カしてから、約１０％（
Ｖ／ｖ）から約５０％（Ｖ／Ｖ　）のアセトニトリル１
度勾配と０．０５％（ｖ　／　ｖ　）　ＴＦＡでベデチ
ｒｔ−分離した。欠に１００％（Ｖ／Ｖ　）までのアセ
トニトリル４度上昇勾配（プラス０．０５％（ｖ／ｖ）
ＴＦＡ）でカラムを洗滌した。ピーク下の面積を、（ニ
ンスララボラトリーズ社（Ｐｅｎ１ｎｓｕｌａ　Ｌａｂ
ｏ−ｒａｔｏｒｉｅｓ　）　（カリフォルニア州すンカ
ルａス（Ｓａｎ　Ｃａｒｌｏｓ　）　）から入手した市
販のＡＰ■標潴品と比較して、逆相カラムから岩田した
Ａ　Ｐ　Ｉｆｆを定量した。

欠に切断反応混合液を凍結乾燥して、アセトニトリル又
Ｕ　ＮＨ４ＨＣＯ３を除去した後、１０％（ｖ／Ｖ）ア
セトニトリルと０．０５％（ｖ／　ｖ　）　ＴＦＡ中に
再懸濁してからＡＰ−１［を精製した。切断反応中に生
成した可能性のある不溶性物質は、１２２口００−１５
，０００　ｇで４°Ｃで１０分間遠心分離して除去した
。

Ｃ，ＡＰｌ［精製 切断反応混合液を、ＤＥ５２セルロース（ワットマン社
（ｖＪｈａｔｍａｎ、　Ｌｉｍ１ｔｅｄ　）　（英国）
）のような陰イオン交換樹脂と混合して、ｒｅＣＡ断片
のほとんどとｖ８プロテアーゼ全除去した。Ｄｇ５２倒
脂は、製造業者の指示に従い室温で５０ｏｏｕＮＨ，Ｈ
ＣＯ３（ｐ）１８．０　）で平衡化させ友。融合蛋白２
．５Ｉｎ９につき約１　ｍｌの樹脂を使用し、樹脂と切
断反応混合液の混合を室滉で１時間攪拌して続けた。

Ａ　Ｐ　Ｉ［ｒｉ”ｌ：ｍ脂に結合せず、混合液４ワツ
トマン濾＃１６１（ワットマン社（Ｗｈａｔｃｏａｎ、
　Ｌｉｔｎｉｔｅｄ　）　、英国）で濾過してＡＰＩｌ
Ｉを樹脂含有混合液から分離したのち、０．４５μ濾過
装置（例えばナルｒ社（Ｎａｌｇｅ　Ｃｏ、）　（ニュ
ーヨーク州ローチェスター（Ｒｏｃｈｅｓｔ、ｅｒ　）
のＬＳ型）で濾過した。

ＡＰｌ［＜デチドをさらに低速逆相り゛ロマトグラフイ
ー装責で精製した。簡単に説明すると、セパレーション
ズブループ（５ｅｐａｒａｔｉｏｎｓ　Ｃ）ｒｏｕｐ　
）　（カリフォルニア州へスペリア（Ｈｅ５ｐｅｒｉａ
　）　）から入手した、１８炭素鎖誘導体化ビダツク（
Ｖｙｄａ−ＣＴＭ）のような中低殿大きさく粒子径１５
−２０ミクロン）シリカの５Ｑｍｌのカラムを使用した
。

試料のｐｌ（をＴＦＡで２．５に調製し、カラムにかけ
る前に試料を脱気した。約５．０％アセトニトリルから
約２０％アセトニトリルまで１分あたり０．２％（Ｖ／
Ｖ　）で上昇させる、０．５％（ｖ　／　ｖ　）　ＴＦ
Ａ中のアセトニトリルの４度勾配を使用してＡＰｌ［か
ら混在するペゾチ「から分離した。ＡＰＩｌ［は約１５
％（Ｖ／Ｖ　）アセトニトリルで溶出し、得られたＡＰ
Ｉｌ［ベデチｒはｆ也の蛋白又は蛋白断片の８０％が除
去されていた。次ｆｃ　ＨＰＬＣを用いて低速逆相ＡＰ
ｌ［［生成物をさらに精製した。

ある＾は、前記■ウォーターガアソーシェード社（Ｗａ
ｔｅｒｓ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ　）　（マサチュウセ
ッッ州ミルフォーｆ’　（Ｍｉｌｆｏｒｄ　）逆相Ｅ（
ＰＬＣ’装置を用い、以下の変更を加えて、ｖ８８プロ
テア一ゼ切断応から直接約０．５　ｒｎ９のＡＰｌ［を
精製した。約１０％（Ｖ／Ｖ　）から約４０％（ｖ　／
　ｖ　）のアセトニド、リル―度勾配と０．０５％（ｖ
　／　ｖ　）　ＴＦＡを１分当たり１．０から２．０％
（Ｖ／Ｖ　）の上昇で、約２−４　ｍｌ　／　Ｃｏ１ｎ
の流速を使用した。Ａｐｌｌは約３０％（Ｖ／Ｖ　）ア
セトニトリルと０．０５％（ｖ　／　ｖ　）で溶出した
。

ｒｅｃＡ−Ｇｌｕ−Ａ　Ｐ　ＩＩＩ　Ｖ　８プロテアー
ゼ切断反りから、ＨＰＬＣにより単一のＡＰＩＩＩビー
クが分離された。融合蛋白から全ＡＰｌ［の８０％を含
有するピークが得られた。ｒｅｃＡ−Ｇｌｕ−Ｃ）ｌｙ
−Ａｒｇ−Ａ　Ｐ　ｉｌｌ　Ｖ　３プロテア一ゼ切断反
応から、融合蛋白から得られる全ＡＰＩＩｌｒの約５０
％を含有する、３つのピークがＨＰＬＣにより分離しｔ
。Ｖ８プロテアーゼによるｒｅＣＡ−Ｃ）ｌｕ−Ａ　Ｐ
　ｉｌｌとｒｅｃＡ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａ　Ｐ
　■融合蛋白の切断から、実質的に未変性の内因性蛋白
が得られ、放出され１ＡＰＩＩ［４デチｒは、切断反応
により生成した全ての断片から明瞭に分離された。

バンカピラー（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌａｒ　）ら（１９８
５年ａ）とバンカピラー（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌａｒ　）
ら（１９８３年ｂ）の方法に従い、アデライドパイオシ
ステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｏｏｓ
、　Ｉｎｃ、　）　（カリフォルニア州フォスターシテ
ィ（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ　）　）蛋白シークエンサ
ー（５ｅｑｕｅｎｃｅｒ　）　４７０　Ａ型を用いて、
ピークペプチドのＮ−末端アミノ酸の配列決定を行った
。

第１表（下記）　４　ｒｅｃＡ−（）ｌｕ−Ａ　Ｐ　ｆ
ｆｉとｒｅｃＡ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａ　Ｐ　ｍ
のｖ８プロテア−ぜ消化物の配列決定の結果を示す。配
列・・・ｓｅｒ−ｇｌｕ−ｇｌｙ−ｖａｌ−ａｌａ−ｇ
ｌｕ−ｔｈｒ−ａｓｎ−ｇｌｕ−ｐｈｅ−ＣＯＯＨを有
する）ｒｅｃＡ蛋白の最＆ＣＣ−末端）の１０＋ｄのア
ミノｅＢ、Ｖ８プロテアーゼによる切断可能な３つの部
位（Ｇｌｕ　）　ｋ含有する。さらにｒｅｃＡ蛋白１は
、ｖ８プロテアーゼにより活発に切断され得る多くの内
部グルタミン酸（Ｃ）ｌｕ　）を有して−る。Ｎ−未４
配列測定の結果（第１表）に示した様に、ｒｅｃＡ−Ｇ
ｌｕ−Ａ　Ｐ　ＩＩＩ融合蛋白のＡＰＩＩＩの８０％が
放出されるまでは、１０個のＣ−末端ｒｅｃＡアミノ酸
配列にｖ８プロテアーゼによる切断が起きた圧部（霊な
い。逆にｒｅＣＡの１０個のＣ−末端アミノ酸内の３つ
の全てのＧｌｕ残基は、接合部位トリが−シグナｈ　（
Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ　）でのｖ８プロテアーゼ切断
と同程度の、ｖ８デａテアーゼ切断を開始させて＾る。

この結果は、この融合蛋白のｖ８ゾクテアーゼによる切
断により、接合部位でトリが−シグナルの好適な切断が
起き、一方内因性蛋白は実質的に未変性であるため、目
的の異４ベデチ１（すなわちＡＰＩＩＩ　）が明瞭に分
離されること全証明してゐる。この結果はさらに、ｒｅ
ｅＡ−Ｇｌｕ−心房性ペブチＩ′融−８−蛋白内の接合
部位Ｇｌｕの壷も好適な切断を証明している。第−表（
下記）に示したように、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇより成
る接合部位を有する融合蛋白は、接合部位グルタミン酸
と内部ｒｅｃＡグルタミン酸結合で切断が起きている。

ｒｅｃＡ−Ｇｌｕ−Ａ　Ｐ　ｉｌｌとｒｅｃＡ−Ｇｌｕ
−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａ　Ｐ　ｆｌ融会蛋白のＶ８プロテ
アーゼ切断により得られる、ＨＰＬＣＴｍ製したＡ　Ｐ
　ＩＩ［４プチドの生物活性は、前記の方法で確認しｆ
ｃ。

第１表 ｖ８プロテアーゼで切断したｒｅｃＡ−Ｇｌｕ−Ａ　Ｐ
　Ｉ［とｒｅｃＡ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａ　Ｐ　
ＩＩＩのＮ−末端配列解析Ｉ　　　　　　　ｎ 試　科　　　　　Ｎ−末端　　Ａｐ　ｍ　ｌ中のｒｅｃ
Ａ−Ｇｌｕ−Ａ　Ｐ　ｉｌｌ　　　５ｅｒ−６ｅｒ　　
　　１［ＩＱ％ｒｅｃＡ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ− Ａ　Ｐ　ｌ［Ｇｌｙ−Ｖａｌ　　　　　５Ｔｈｒ−Ａｓ
ｎ　　　　　１５ Ｐｈｅ−Ｇｌｕ　　　　　　　４０ Ｇｌｙ−Ａｒｇ　　　　　４Ｑ ■の（傭に示したに一末端配列を有する々デチドの昔を
試料中の全ＡＰＩの割合（％）として示しである。

実施例５ 本例はＰｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ　トリが一シグ
ナルでのｎ因子による切断を示す。このトリが−シグナ
ルは、ｒｅＣＡ−心房性（デチド融合蛋白からの心房性
（プチドの部位特異的放出に有効な新規Ｘａ因子認識部
部位ある。本例では、融合蛋白をまず陰イオン交換りａ
マドグラフィーで単離し、Ｘａ因子で切断し、次に目的
′７）（デチド（ＡＰＩＩＩ　’）を精製した。

Ａ、　　ｒｅｃＡ融会物の単離 実施例４に記載した様に、陰イオン文豪クロマドグ５７
　イー　Ｔ　ｒｅｃＡ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａ　
Ｐ　ＩＩＩ融合物をｆＲ４囚した。この融合蛋白は約２
００　ｃｏｄから２３０ｍ’Ｊ　ＮＲ４Ｃ１で溶出した
。

Ｂ、　　Ｘａ因子切断 蛋白涜度約０．３　ｍ９　／　ｍｅの融合蛋白プールを
、５〇−トリス−ＭＣＩ、ｐ）Ｉ　７．５、と２００−
２３００）ＭＮＨ，Ｃ１より成る緩衝液中で酵素と基質
のモル比が約１：２０から約１：１００の範囲で、Ｘａ
因子と混脅した。最終橋度５＋ｎＭ−５Ｑ＋ｎＭの塩化
カルシウムと約２０μＭ（最終潰度）のリン脂質液胞全
添加して切断速度を上げた。液胞す、９０：１のフォル
シュフラクションｌ１ｌ（シグマ社（Ｓｉｇ［ｆｌａＣ
ｈｅｍｉｃａｌ　）　：ミズーリ州セントルイス）トホ
スファチジルイノシトールで調製した。咀脂質をアセト
ンで抽出し、欠にモル比２：１■りａロホルム：メタノ
ールを用いてリン脂質を可Ｇ化し、得られた溶液を窒素
がス気鑞で乾燥させた。このリン脂質をエーテルで２回
洗滌して残存りａａホルムｆｃ除去した。５０＋ｎＭ）
すｘ　−ＨＣＩ　、　ｐＨ８，０緩衝８Ｋを、最終リン
酸塩浸度が２５田Ｍになる様にリン脂質に加えた。次に
この溶液が清澄になるまで水浴中で超音波？かけた。切
１Ｆｆｒ反応液全２５°Ｃで４−２０時間インキュベー
トした後、凍結又は直ちに生成（ブチｒを祠製すること
により反応を停止させ之＠ Ｃ，ＡＰＩｌ［４’＃　製 前記の逆相ＨＰＬＣでｒｅｃＡ断片とＸａ因子を・冷去
しＡＰＩＩＩが均一になるまで「青製した。

実施例４に記・成のヒョコ直楊弛暖活性と分析逆相ＨＰ
ＬＣピーク面積で測定した結果、融合物中のＡＰｌｌｌ
の約８０％が放出された。ＡＰＩＩＩ以外に融合物から
特異的に放出されたペプチド様所片はほとんどなく、融
合物の中で他の主要な切断は起きていなかった。

融合蛋白のＸａ因子切切断より得られたＨＰＬＣ哨裂Ａ
　Ｐ　ｍ　”ブチｒの生物活性は、前記の方法で１認し
た。

実施例６ 本例は、１００％ｒｅｃＡとＡＰＩ又は細菌１００％ｒ
　ｅｃＡとＡＰｆｆ間の接合部位に存在するＣ）ｌｕ−
３ｅｒトリが一シグナルを含有する融合蛋白の、見境と
切ｔｒ全示す。

Ａ０発現ベクターの作成 前記のオリゴヌクレオチド指令部位特異的突然変異誘発
、法を用いて、ｒｅｃＡ−Ｃ１ｕ−Ａ　Ｐ　Ｉ　ＤＮＡ
コード配列を作成した。具体的には、アミノ酸２２から
２４　（Ｐｈｅ、　　ＡｒｇＸＴｙｒ　）のコ）Ｆ　ン
ｆ　Ｇｌｕ　−ＡＰ■遺伝子から除去してＧｌｕ　−Ａ
　Ｐ　Ｉ′ｔ−作成した。

このためにＭ　１５　［Ｄｐ９　／　Ａ　Ｐ　ＩＩＩ　
ｓｓ　ＤＮＡ　（第２図に示ｆ）ｋ、オリゴヌクレオチ
ド指令部位特異的突然変異誘発の鋳型として用いた。目
的の突然変異（例えば停止コドンの直前のＰｈａ　ＸＡ
ｒｇ　ＸＴｈｒコドンの欠失）の配列を有する、コード
配列５′−ＴＴＧ（）ＧＴＧＴＡＡＣＴＣＴＴＴＡＡＴ
Ｃ）ＡＴＣＴＡＧＡＣ）Ａ　−３’より成るオリゴヌク
レオチドプライマーを用いて、１本鎖組み喚えＭ　１３
　ｍｐ　９　ＤＮＡの閉環ＤＮＡ　ニアビーの合成を開
始させた。ＤＮＡ配列決定により、　Ｇｌｕ−ＡＰ　Ｉ
遺伝子をコードするＤＮＡ配列の存在を確認した。矢に
陽注芙然変異ファージを犬楊苗ＪＭ１０１株中で複製し
、２本頭複製型（ＲＦ　）　Ｍ　１３ｍｐ　９突然変異
ＤＮＡを単離し、ＥｃｏＲＩで切断してＧｌｕ　−Ａ　
Ｐ　Ｉａ伝子を有するＥｃｏ　ＲＩ断片金得た。

欠にＥｃｏ　ＲＩ析断片、ｐＵＣ’９発現ベクターであ
るｐＭｃｍ　６０７５中に挿入した。ｐＭＯＮ　６　Ｃ
ｌ３５ばもらかじめｇｃｏ　ＲＩで切断してあり、Ｂａ
ｏ＋　ＨＩ　／　Ｅｃ。

Ｒ１断片上にｒｅｃＡ　ＪＲ伝子をもっており、ｐｕｏ
Ｎ６１５２から得られた。この形質転換から単離された
クローンを、制限酵素ｇｃｏ　ＲＩとＣ１ａ　Ｉで別々
に切断してスクリーニングして、ＡＰＩ遺伝子の存在と
配向を決定した。陽性クローンは、ｒｅｃＡ−Ｇｌｕ−
ＡＰｌより成る見境ベクターｐＭＯＮ　６１５３　ｋ生
成し北。

ＡＰｎ［遺伝子のｇｃｏ　ＲＩ　／　Ｐｖｕ　ＩＮ制限
部位に合成りＮＡ　［片を挿入して、ｒｅｃＡ−Ｇｌｕ
−Ａ　Ｐ　ｍ　ＤＮＡコード配列を作成した（第１図に
示す）。合成りＮＡ断片ｆｄ、ＡＰＩＩＩのセリンコー
ンの直前′／ｃ、１人されるアミノ酸Ｇｌｕ−８ｅｒ−
Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇのコげン？汀していた。この合
成りＮＡ　７：ｌコード配列は以下の通りである： ５’　−ＡＡ　ＴＴＣ’　ＧＡＡ　ＴＣＣＳＴＧ　ＣＧ
ＣＣＧＴ　ＴＣＣＡＧ　−３’Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｃ）ｌ
ｕ−８ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−３ｅｒ−３ｅｒ
発現ベクターｐ；ｘｏｔｖ　６１５９−ｋ　ＥｃＯＲＩ
とＰｖｕｌテ切析し切断きい線状断片を合ｆ’Ｎ、　Ｄ
ＮＡ析片断片せさせ、前記した様に犬Ｉ！ｈ閑ＪＩＪ１
［］１中に挿入（−たつこうしてｒｅｃＡ−Ｘａ−Ａ　
Ｐ　’Ｊｌｌ　ＤＮＡコード・記列全、ｒｅｃＡ−Ｇｌ
ｕ−Ａ　Ｐ　ｆｆ　ＤＮＡコード配列よりなる様に夏化
させ友。この方法で得たクローンｆ　Ｅｃｏ　Ｒｒ／　
ＨｉｎｄＩＩＩで切断して制限解析を行いスクリーニン
グして１２４ｂｐ断片倉得た。又：σＤＮＡ配列決定に
よりＤＮＡコード配列を確認した。具体的には＼調性ク
ローンの遺伝子をＢａｍ　Ｈｒ　／　Ｈｉｎｄ　ｌｌ［
断片上で１あらかじめＢａｍ　ＨＩ　／　Ｈｉｎｄ　Ｉ
ＩＩで切：所したＭｊ３ｍｐ１８ファーゾＲＦ　ＤＮＡ
　ｖｃ移動した。この形質転換で得られた無色のプラク
から１本鎖ＤＮＡを調製し、ジデオキシ配列決定法（サ
ン！　−（Ｓａｎｇｅｒ）ら（１９７７年）参照）の鋳
型として用いた。

ＤＮＡ配列決定で証明した調性クローンは、ｒ６ｃＡ−
Ｕｌｕ−Ａ　Ｐ　ｔｖを含有するｐＢＲ３２７より成る
発現ベクター仝生成した。

Ｂ、　　ｒｅｃＡ−Ｃ）ｌｕ−Ａ　Ｐ　ｌとｒｅｃＡ−
Ｃ）ｌｕ−Ａ　Ｐ　１％＋の発現１、晴楔と切断 前記した様に大４耐ＪＭｉＱｌを、ｐＭＯＮ６１６３又
はｐＭＯＮ　６１６４で形質転換させた。次に前記した
様に培地にナリジキシン酸ｋｍ加して、形質伝ｙ８細胞
をｄ等した。前記した方法で、ｒｅＣｋ−Ｃ）ｌｕ−Ａ
　Ｐ　Ｉ又ｉ　ｒｅＣＡ−Ｇｌｕ−Ａ　Ｐ　■より成る
融合蛋白の高レベル産生（すなわち全宿主蛋白０１〇−
３０％）を確認した。

１００％ｒｅｃＡ−Ｇｌｕ−Ａ　Ｐ　Ｉと１００％ｒｅ
ｃＡ−ＧｌｕＡＰｌ’％’融合蛋白は、封入（すなわち
反射）体中に富まれる凝渠物として産生された。こＯよ
うな蛋白をＪ′ａ菌から精製する例は、米国特許第４，
５１１，５０２号と４，５１１，５０３号に記載されて
ｂる。本例では、８℃で１グラムの細菌（−ストを２３
　ｍｌの蒸留説イオン水に再１！ｉ！４した。ヒートシ
ステムズウルトラソニック社（Ｈｅａｔ　５ｕｓｔｅｒ
ｎｓ−Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ。

Ｉｎｃ、）　にューヨーク州ファーミングデール（Ｆａ
ｒｍｉｎｇｄａｌｅ　）　）　１０−３７５型（１／２
インチチップを有する）で１分間ずつｙａＫＪさせて合
計６分間、この懸濁液を超音波処理した０欠に超音波処
理した懸濁液を５０［］０＆で１０分間遠心分離して、
上澄液全潰て友。

ｒｅｃＡ−Ｇｌｕ−Ａ　Ｐ　Ｉ′ｖ固形（レット′Ｊｔ
８℃で、２０ｒｆＬｔ■５（３ｍｌＪ酢酸ナトリウム、
ｐ）ｉ５．５に再懸濁させた。５　Ｑ　ｍＭ酢峡す）　
ＩＪウム中への懸濁と後の７５００．９でのくレット化
を３回繰り返した。次に最後にベレットを８℃で５４の
９．０Ｍ尿素、５０＋ｎＭ）リス−ＭＣＩ　（ｐ）１７
．５　）に醍解した後、１０．０００　ｇで遠心分離し
て残存する細胞破片を除去した。矢にこの上澄ｆを５０
ｍＭ）リス−ＨＣｌ　　（ＰＨ７，９）で尿素最終１度
が２．０Ｍになる様に布択して、前記の免疫アフイニテ
イクロマトグラフイーを行った。

参考のためここに記載する同時出願米国特許出願第７４
７，１３６号に記載のｒｅｃＡモノクローナル抗体１抗
体１０金！！金ｍＭ）リス−ＨＣｌ、　　１５０ｍｕ　
ＮａＣ１（ｐＨ７−９）で８°Ｃで平衡化させた。融合
蛋白を含有する懸濁液？鑞速約Ｉ　Ｎ　／　ｍｉｎで８
°Ｃでカラムにかけた。全操作の間流速Ｂ　１　ｍｌ　
／　ｆｆ１ｉｎに維持した。約２　ｍｌを含有する両分
を集めた。カラム溶出液は２８０　ｎｍの紫外部吸収と
電気泳動解析で追跡した。融合蛋白の結合し九カラムを
、８℃で２５ｍＭトリス−ＨＣｌ、５０　Ｄ　ｒｎＭＮ
ａＣｌ（ｐ）′ｌ　７．９　）で洗滌した。融合蛋白は
、８℃で２００ｍＭグリシン、１５−、［］　ｍＭ　Ｎ
ａＣ１（ｒｋｌ　２．５．）で溶出した。ここで集めた
両分’ｋＩＭのトリス１００μｌで中和し友。

尿素可溶化及び免疫アフイニテイクロマトグラフィー後
の１００％ｒｅｃＡ−Ｇｌｕ−’Ａ　Ｐ　ＩＹ融合体（
０，５ｒｎｌ）ｋ、４℃で２Ｄ時間、３Ｄｏｙの５０　
ｍ１ＪＮＨ，ＨＣＯ３ｋ　３回交換して透析した後、４
℃で２０時間、５０ωＭ　ＮＨ，ＨＣＯ，（…８．０）
で２リツトルの交換を行って透析した。

透析機融合物を約０．５　ｗ９／−蛋白まで希釈した。

ｖ８プロテアーゼの酵素と基質のモル比１：５００融合
物をインキュベートした。インキュベーションは６７℃
で４時間行い、凍結により反応を停止させた。

前記のウォーターズアソーシエート社（ＷａｔｅｒｓＡ
ｓｓｏｃ工ａｔｅｓ　）　ＨＰＬＣ逆相装置で融合切＠
混合液を分析した。カラムｈ、１０％（Ｖ／Ｖ）アセト
ニトリルと０．０５％（ｖ／ｖ））リフａｒ：１酢岐で
平衡化させた。試料桑引後、０．０５％のトリフＱＯ酢
ｄで１０％から５０％アセトニトリル（Ｖ／Ｖ）の直ｉ
！ｉｔ　６度勾配で１分当たり１％の上昇で、流速１　
ｒｒｌ　／　ｍｉｎを用いて、ｒｅＣＡ　ｌ断片からＡ
ＰＩ又、；ＡｊＩＶを分離した。融合物から放出された
ＡＰＩ又；”ＣＡ　Ｐ　ｌ’％ＴのＨＰＬＣ’面積を、
（ニンシュララぜラトリーイ社（Ｐｅｎ１ｎｓｕｌａ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）　（カリフォルニア州サ
ンカルロス（Ｓａｎ　Ｃａｒｌｏｓ　）　）　’７）市
販ＡＰＩ又はＡＰＮと比較して定量した。４時間以内に
ＡＰＩとＡＰｌ’％＋の理論量の約８０％が放出された
。

Ｃ，ＡＰ）とＡＰＩＶの精製 切断した融合混合ｇを乾燥し、０．０５％（Ｖ／Ｖ）の
トリフロロ酢酸の１０％（Ｖ／Ｖ　）アセトニトリルで
復元した。半調製１０×２５０ｚｍ、５ミクロンＣ−１
８ピダツク（Ｖ’ｙｄａｃ　）カラム（セパレーション
ズブローブ（５ｅｐａｒａｔｉｏｎｓ　Ｇｒｏｕｐ　）
、カリフォルニア州へスベリア（）（６Ｓｐｅｒｉａ　
）　）で、ＡＰＩとＡＰＮを混在する蛋白から分雌した
。流速ｋ　２　ｍｌ　／　ｍ１ｎｎ工上げた以外は、ク
ロマトグラフィー東件は分析クロマトグラフィーと同じ
である。

ＡＰ）又ＨＡＰＩＶの保持時間のピークをカラムから出
る時渠めた。

ＡＰＪとＡＰＩＶ共にヒヨコ直腸弛緩活注測定で生物活
性を有していた。前記した様にＡＰｉとＡＰＩｖアミノ
酸の配列を決定した。

実施例７ 本例は、１００％ｒｅｃＡ、　　）ロンビン切断部位及
び心房性（デチドＡＰＩＩＩ又はＡＰｆｆより成る融合
蛋白をコードする遺伝子が挿入されたｐＢＲろ２７より
成る発現ベクターの作成を示す。

トロンビン切断部位又はトリが−シグナルは、アミノ酸
配列：　ＮＨ２−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａ
ｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＣＯＯＨ又はアミノ酸
配列：　ＮＨ２−Ｃ１ｙ−ＰｒＯ−Ａｒｇ−ＣＯＯＨよ
り成る。以後前者のトロンビントリが−シグナルを、「
伸張トロンビン部位」そして後者を「短縮トロンビン部
位」と呼ぶ。

１００％ｒｅｃＡ、伸張トロンビン部位及びＡＰＮより
成る融合蛋白をコータする遺伝子を含有する発現ベクタ
ーを、以下の様に作成した。坤歩トロンビン部位とＡＰ
Ｉ７の最初の６個のアミノ末端アミノ酸をコードする２
本領ＤＮＡ断片を、上記の方法で合成した。合成りＮＡ
だのツー１鎖は以下Ｏ配列より成っていた： ５’　−ＡＡ　ＴＴＣ！　ＣＧＴ　ＧＣＴ　ＣＴＣＣＴ
Ｇ　Ｃ）ＣＴ　ＧＧＣＣＣＧ　ＣＧｒ　’１ｆｆｌＧｌ
　ｕ−Ｐｈｅ　−Ａｒ　ｇ−Ａｌ　ａ−Ｔ−ｅ　ｕ−Ｌ
ｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−８ｅｔ−Ｃ’
ＴＣ）　ＣＧＣＣＧＴ　ＴＣＣＡＧ−３’Ｌｅｕ−Ａｒ
ｇ−Ａｒｇ−８ｅｔ−８ｅｔ次にあらかじめＥｃｏ　Ｒ
Ｅ　（！−Ｐｖｕ…で切断したｐＭＯＮ６１５９に合成
ｄｓＤＮＡ＠片を挿入した。こうしてｐＭ’ＯＮ　６１
５９内のＸａ因子（Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ　）とＡＰ
ｌ［Ｉコード配列を、伸張トロンビン切断部位とＡＰＩ
ＶをコードするＤＮＡ配列に変換して、新規発現ベクタ
ー（ｐＮ４ＯＮ　６１６０とする）を得た。ｐＭＯＨ６
１６０の作成は、前記の制限エンｒヌクレアーゼ切断解
析とＤＮＡ配列決定により確認した。

１００％ｒｅｃＡ、短不宿トロンビントリが一シグナル
及びＡｐＨ［より成る融合蛋白の遺伝子金含有するｐＢ
Ｒ５２７ゾラスミドより成る発現ベクターに、以下の様
に作成した。前記の方法に従い、以下のコード配列’ｋ
Ｗする断片全化学合成した：５’　−ＡＡ　ＴＴＣＧ（
）Ｇ　ＣＣＧ　ＣＧＴ　ＴＣＣＡＧ−３’Ｇｌｕ−Ｐｈ
ｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ＝Ｓｅｒ−８ｅｔ次にｐＭ
ＯＮ　６１５９のＥｃｏ　Ｒ１／　Ｐｖｕ　ｌ１１７１
ｊ限析片の代りに、ｐｕｏｕ　６１６０内に合成りＮＡ
断片を挿入した。１００％ｒｅｃＡ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−
Ａｒｇ−Ａ　Ｐ　ｌｌ［より成る融合蛋白の遺伝子を含
πする発現ベクター（ｐＭＯＭ　６１６６とする）の作
成は、前記の制限エンドヌクレアーゼ切断とＤＮＡ配列
決定で確認した。

実施例８ 本例は、１００％ｒｅｃＡ、　　トロンビントリが一シ
グナル及びＡＰｌ［又はＡＰＮより成る融合蛋白の細菌
中での発現と、そこからＡｐＨ［又Ｂ　Ａ　Ｐ　ＩＹの
梢製示す。

ｐＭＯｔＪ　６１６０又はｐＭＯＮ　６１６６で大１腸
菌Ｊ　Ｍ１０１細胞企形質転換させ、矢に前記した様に
培地にナリジキシン酸を硲加して誘導させた。

次に１００％ｒｅｃＡ−Ｇｌｕ−Ａ　Ｐ　ｉｌｌで前記
した様に、融会蛋白′ｌｔ！′ｆＩ製した。

約２７５　ｒｎｌイＩ製融合蛋白を、５０ｍＭトリス−
ＨＣｌ　（ｐ）］　７．８　）、５’　ｒｎＭ　ＣａＣ
ｌ２及びＱ、１１ＪＮａＣ１より成る緩衝液１リツトル
で、４℃で約２０時間透析した。ベーリンガーマ□ンハ
イム社（、Ｂ’ｏｅｈｒｎｇｅｒから得た中トロンビン
を用いて酵素と基質のモル比１：１００で、室温（約２
３℃）で融合物をインキュベートした。約４時間後に切
断混合液を凍結してインキュベート全停止させた。ＡＰ
ＩとＡＰＩ′ｖ融合物につ＾で記載した様に、切断混合
液をＣ−１８分析カラムで分析し精製した。トロンビン
切断によりＡＰＩＩＩの理論量の約２５％とＡＰｉｌｒ
の８０％が放出された。前記の様に行ったヒョコ直暢弛
緩活性測定によｉＪ、ＡｐＨ［及びＡＰ■共に生物活性
？：有していた。融合蛋白から放出されたＡＰｌ［とＡ
ＰＩＶのＮ−末端配列は、これらのくデチドの融０蛋白
からの部位特異的放出を証明していた。

又献 １、オーステン（Ａｕ５ｔｅｎ　）とスミス（５ｃｏｉ
ｔｈ　）（１９７６年）バイオケミカルアンドバイオフ
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ｒｏ−ｗｎ）（１９７６年）フエデレーションデロシー
デイングｘ　（Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｃｅｅｄ
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５釘４０、ルター（Ｒｕｔｔｅｒ、　Ｗ、　Ｊ、）　−
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年）プロシーデイングズオブナショナルアカデミーオブ
サイエンシーズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、
　Ｓｃｉ、　）米国４６、サンが＝（Ｓｕｎｇｅｔ　）
ら（１９７７年）プロシーデイングズオプナショナルア
カデミーオデサイエンシーズ（Ｐｒ０ｃ、　Ｎａｔｌ、
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画−第７７巻：　２６１１−２６１５両 ４４、セイダ（５ｅｉｄａｈ、　Ｎ、Ｇ、）ら（１９８
４年）プロシーデイングズオプナショナルアカデミーオ
プサイエンシーズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ　、　Ａｃａ
ｄ、　Ｓｃｉ、）米国、第８１巻：　２４６０−２６４
４頁４５、シャイン（５ｈｉｎｅ　）ら（１９８０年）
ネーチャー第２８５巻：４５６−４６１ぼ ４６、ソベｏ　ｙ　（５ｏｂｅｒｏｎ　）ら（１９７８
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、ステフィｘ　ｙ　（５ｔｅｐｈｉｅｎ　）ら（１９８
５年）ジ’　−ｙ　（Ｇｅｎｅ　）第２４ｔ−：２８９
−２９７釘（竿） ４８、スセンフエルト（５ｕｓｓｅｎｆｅｌｄ、　Ｈ，
Ｍ、）とパスチア（Ｂａ５ｔｉａ、　Ｓ、Ｊ、）（１９
８４年）バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ　）、１月号、７９−８１　釘 ４９　　タナ力（Ｔａｎａｋａ　）ら（１９８２年）ヌ
クレイツクアシッドリサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１
ｄ　Ｒｅｓ、）第１０巻：１７４１−１７５４釘 ５０、トリポ’ｒＦ　（Ｔｒｉｐｐｏｄｏ　）ら（１９
８２年）デｃＩヘクソクエクスピオルメド（Ｐｒｏｃ、
　Ｓｏｃ、ｇｘｐ。

Ｂｉｏｌ、　　　Ｍｅｄ、）　　第　１　７　０　巻　
：　　５　０　２　４　５０８Ｎ５１、ホワイト（Ｗｈ
ｉｔｅ　）とサムソン（５ａｃｏｓｏｎ　）（１９５４
年）ジャーナルオデラゴラトリーアンドクリニカルメデ
イシン（Ｊ、　Ｌａｂ、　Ｃ１１ｎ。

Ｍｅｄ　、　）第４３巻：４７５−４７８Ｎ５２、ウィ
トキン（Ｗｉｔ、ｋｉｎ、　ＬＭ、）　（１９７６年）
バクチリオルレビュー　（Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　Ｒｅ
ｖ、）　第４Ｄ巻：　８６９−０９７は ５６、シラー（Ｚｏｌｌｅｒ　）とスミス（Ｓｍ１ｔｈ
　）（１９８ＳｌｌＥ）ヌクレイツクアシッドリサーチ
（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、）第１０巻：６
４８７−６５００頁 ５４、シラー（Ｚｏｌｌｅｒ　）とスミス（５ｒｎｉｔ
ｈ　）（１９８３年）メンツズインエンヂイモロジー（
１Ｊｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｒｎｏｌ、）　第１００巻：４
６８−５００眞

【図面の簡単な説明】

第１図は、ベクターＭ１３田ｐ９へ挿入するために調製
したＡＰＩＩＩｋコードする完全なｄｓＤＮＡ配列を、
対応するアミノ酸配列とともに示す。 “１”は成熟Ａ　Ｐ　ＩＩＩベゾチドの開始点を示す。 第２図は、Ａｐ　ＩＩＩ　ＤＮＡ　＝ｒ　−’ｔ’配列
を有スルＭ１３　ｍｐ　９より成るＭ１３ｍｐ９／ＡＰ
ｌｆ［の作成法を示す。斜線をしたところはＡｐＨのＤ
ｔＪＡコード配列を示す。 第６図は、合成２本鎖Ａ　Ｐ　ｌ［ＤＮＡコーニー列を
示す。△、Ｖの記号は結合の存在する場所金示す。 第４図ｄ、Ｅｃｏ　ＲＥ　／　Ｂａｎ＞　ＨＩ制制限部
例７０％ｒｅＣＡ　ｉ　コードするＤＮＡの挿入された
ｐＢＲ３２２シラスミにより成る、ｐ！１４ＯＮ　１４
６１の作成法を示す。 第５図は、Ｅｃｏ　ＲＥ　／　５ｒｎａｌ制限部位に７
〇−１００％ｒｅｃＡをコードするＤＮＡの挿入された
の１３田ｐ９プラスミドより成る、ｐ〜ｆｏｔＪ　２５
５８の作成法を示す。 第６図に、オリゴヌクレオチド指令都立特異的突然変異
誘発による、７［］−１００％ｒｅｃＡ　ＤＮＡコード
配列の３′末病へのＥｃｏ　ＲＩ制限部位Ｏ作成ＩＳ！
：全示す。 第７図ｕ、Ｅｃｏ　ＲＩ制限部泣１２除かれ、Ｈｉｎｄ
ｌｌｌ／ＳｍａＩ制限部位にＢａｍ　ＨＩＩ限部位を有
するＭｌ　３　ｍｐ　９　’）ンカーの挿入されたｐＫ
ｏ　ｌベクターより成る、ｐＫｏ１（Ｒｒ−）／Ｍ１３
リンカーの作成法を示す。 第８図は、ＳｍａＩ制限部位にＸｂａ　Ｉ制限部位・の
挿入さｎｆｃ　ｐＫＯｌ　（ＲＩ−）　／　＊　１３す
７　カー　ベクターより成る、ｐＫＯＩ　（ＲＩ−）　
／　ＸｂａＩの作成法全示す。 第９図Ｕ、Ａｐｌｆ［ｉコードするＤＮＡ配列がＸｂａ
ｌ制限部制限挿立され、７０％ｒｅＣＡをコードするＤ
ＭＡ配列がＢａｍ　ＨＩ制限部位に挿入されたｐｘｏｌ
（Ｒニー）　／　ＸｂａＩベクターより成る、ｐＭＯＮ
　６１５　［１の作成法を示す。 第１０図は、７０−１００％のｒｅｃＡ　ｆコードする
ＤＮＡ配列がＥｃｏ　ＲＩ制限部位に挿入されたｐＭＯ
Ｎ　６１５０ベクターより放る、ｐＭＯｒＪ　６１５２
の作成法を示す◇ 第１１図は、ｒｅｃＡ−Ｃ）ｌｕ−Ａ　Ｐ　ｉｌｌｌｌ
遺伝子−コードＤＮＡがＢａｍ　ＨＩ制限部位に挿入さ
れたｐＵｃ１８ベクターより成る、ｐｕｏＮ６１５４の
作成法と示すＯ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）異種ペプチドを産生する方法において、接合部位
   で内因性蛋白に結合した異種ペプチド（内因性蛋白及び
   接合部位共にエンドペプチダーゼ切断部位を有する）よ
   り成る融合蛋白をコードするゲノムＤＮＡを、細菌中で
   発現させる段階；融合蛋白を回収する段階；内因性蛋白
   のエンドペプチダーゼ切断部位は実質的に未変性のまま
   接合部位のエンドペプチダーゼ切断部位を優先的に切断
   するように、融合蛋白を適当なエンドペプチダーゼで処
   理する段階；そしてそこから目的の異種ペプチドを得る
   段階より成る、上記方法。 （２）内因性蛋白はｒｅｃＡ蛋白又はその断片である、
   特許請求の範囲第１項に記載の方法。 （３）異種ペプチドは心房性ペプチドである、特許請求
   の範囲第１項に記載の方法。 （４）心房性ペプチドは心房性ペプチド I 、心房性ペ
   プチドIII及び心房性ペプチドIVより成る群から選ばれ
   る、特許請求の範囲第３項に記載の方法。 （５）エンドペプチダーゼ切断部位はグルタミン酸−Ｘ
   ペプチド結合（Ｘはアラニン、アルギニン、アスパラギ
   ン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グル
   タミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシ
   ン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン
   、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及び
   バリンより成る群から選ばれる）より成る、特許請求の
   範囲第１項に記載の方法。 （６）Ｘはセリンである、特許請求の範囲第５項に記載
   の方法。 （７）エンドペプチダーゼはＶ８プロテアーゼである、
   特許請求の範囲第５項又は第６項に記載の方法。 （８）ＤＮＡはプラスミドに含まれている、特許請求の
   範囲第１項に記載の方法。 （９）プラスミドはｐＭＯＮ６１５２、ｐＭＯＮ６１５
   ４、ｐＭＯＮ６１５９及びそれらの機能的同等物より成
   る群から選ばれる、特許請求の範囲第８項に記載の方法
   。 （１０）異種ペプチドは、基本的に天然に存在する真核
   生物ペプチドと同じアミノ酸配列を有する、特許請求の
   範囲第１項に記載の方法。 （１１）真核生物ペプチドは平滑筋弛緩活性を有する、
   特許請求の範囲第１０項に記載の方法。 （１２）特許請求の範囲第１項に記載の方法により産生
   される異種ペプチド。 （１３）心房性ペプチドより成り、約９０％から約９９
   ．５％個のペプチドと約０．５％から約１０％の細菌由
   来の蛋白を含有する組成物。 （１４）コード鎖は、５′−ＴＣＣＡＧＣＴＧＴＴＴＣ
   ＧＧＣＧＧＧＡＡＴＣＧＡＴＡＧＡＴＣＧＧＣＧＣＣＣ
   ＡＡＴＣＡＧＧＣＣＴＴＧＧＧＴＧＴＡＡＣＴＣＴＴＴ
   ＣＣＧＴＴＡＣ−３′より成る、ＤＮＡ配列又はその断
   片。 （１５）心房性ペプチドを産生する方法において、接合
   部位で内因性蛋白に結合した心房性ペプチド（内因性蛋
   白及び接合部位共にエンドペプチダーゼ切断部位を有す
   る）より成る融合蛋白をコードするゲノムＤＮＡを、細
   菌中で現させる段階；融合蛋白を回収する段階；内因性
   蛋白のエンドペプチダーゼ切断部位は実質的に未変性の
   まま接合部位のエンドペプチダーゼ切断部位を優先的に
   切断するように、融合蛋白を適当なエンドペプチダーゼ
   で処理する段階；そしてそこから目的の心房性ペプチド
   を得る段階より成る、上記方法。 （１６）内因性蛋白はｒｅｃＡ蛋白又はその断片である
   、特許請求の範囲第１５項に記載の方法。 （１７）エンドペプチダーゼ切断部位はグルタミン酸−
   Ｘペプチド結合（Ｘはアラニン、アルギニン、アスパラ
   ギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グ
   ルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイ
   シン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリ
   ン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及
   びバリンより成る群から選ばれる）より成る、特許請求
   の範囲第１５項に記載の方法。 （１８）Ｘはセリンである、特許請求の範囲第１７項に
   記載の方法。 （１９）エンドペプチダーゼはＶ８プロテアーゼである
   、特許請求の範囲第１８項又は第１９項に記載の方法。 （２０）細菌中で機能するプロモーター、リボゾーム結
   合部位、ｒｅｃＡ蛋白又はその断片、Ｖ８プロテアーゼ
   トリガーシグナル、異種ペプチド及び翻訳停止シグナル
   の順にコードしているＤＮＡより成る遺伝子。 （２１）セリンコドンの直前にグルタミン酸コドンがあ
   るＶ８プロテアーゼトリガーシグナルである、特許請求
   の範囲第２０項に記載の遺伝子。 （２２）異種ペプチドは心房性ペプチドである、特許請
   求の範囲第２０項に記載の遺伝子。 （２３）心房性ペプチドは心房性ペプチド I 、心房性
   ペプチドII及び心房性ペプチドIVより成る群から選ばれ
   る、特許請求の範囲第２２項に記載の遺伝子。 （２４）特許請求の範囲第２０項に記載の遺伝子が挿入
   された、細菌性プラスミドとバクテリオファージより成
   る群から選ばれる組み換えベクター。 （２５）ゲノムＤＮＡ中に特許請求の範囲第２０項に記
   載の遺伝子を含有する細菌。 （２６）ｒｅｃＡ蛋白又はその断片、エンドペプチダー
   ゼトリガーシグナルより成る接合部位及び平滑筋弛緩活
   性を有するペプチドより成る、異種ポリペプチド。 （２７）ペプチドは心房性ペプチドである、特許請求の
   範囲第２６項に記載の異種ポリペプチド。 （２８）ｒｅｃＡ蛋白は１００％のｒｅｃＡより成る、
   特許請求の範囲第２６項に記載の異種ポリペプチド。 （２９）細菌はグラム陰性細菌である、特許請求の範囲
   第１項に記載の方法。 （３０）グラム陰性細菌は大腸菌（Ｅ．ｃｏｉｌ）であ
   る、特許請求の範囲第２９項に記載の方法。 （３１）エンドペプチダーゼトリガーシグナルは、Ｖ８
   プロテアーゼ、Ｘａ因子及びトロンビンより成る群から
   選ばれる、特許請求の範囲第２６項に記載の異種ポリペ
   プチド。 （３２）Ｖ８プロテアーゼトリガーシグナルはグルタミ
   ン酸より成る、特許請求の範囲第３１項に記載の異種ポ
   リペプチド。 （３３）Ｖ８プロテアーゼトリガーシグナルはＧｌｕ−
   Ｓｅｒより成る、特許請求の範囲第３１項に記載の異種
   ポリペプチド。 （３４）Ｘａ因子トリガーシグナルはＧｌｕ−Ｇｌｙ−
   Ａｒｇより成る特許請求の範囲第３１項に記載の異種ポ
   リペプチド。 （３５）トロンビン切断部位はＡｒｇ−Ａｌａ−Ｌｅｕ
   −Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇより成る、
   特許請求の範囲第３１項に記載の異種ポリペプチド。 （３６）トロンビン切断部位はＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ
   より成る、、特許請求の範囲第３１項に記載の異種ポリ
   ペプチド。 （３７）心房性ペプチドは、ＡＰ I 、ＡＰIII及びＡＰ
   IVより成る群から選ばれる心房性ペプチドである、特許
   請求の範囲第２７項に記載の異種ポリペプチド。 （３８）ｒｅｃＡ蛋白又はその部分、Ｖ８プロテアーゼ
   トリガーシグナルより成る接合部位及びＡＰIIIより成
   る異種ポリペプチド。 （３９）ｒｅｃＡ蛋白は約１００％のｒｅｃＡより成る
   、特許請求の範囲第３８項に記載の異種ポリペプチド。 （４０）ｒｅｃＡ蛋白又はその部分、Ｘａ因子トリガー
   シグナルより成る接合部位及びＡＰIIIより成る異種ポ
   リペプチド。 （４１）Ｘａ因子トリガーシグナルはＧｌｕ−Ｇｌｙ−
   Ａｒｇより成る、特許請求の範囲第４０項に記載の異種
   ポリペプチド。 （４２）ｒｅｃＡ蛋白又はその部分、トロンビン切断部
   位より成る接合部位及び心房性ペプチドより成る異種ポ
   リペプチド。 （４３）心房性ペプチドはＡＰIIIとＡＰIVより成る群
   から選ばれる、特許請求の範囲第４２項に記載の異種ポ
   リペプチド。 （４４）トロンビントリガーシグナルはＡｒｇ−Ａｌａ
   −Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇ１ｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇよ
   り成る、特許請求の範囲第４２項に記載の異種ポリペプ
   チド。 （４５）トロンビントリガーシグナルはＧｌｙ−Ｐｒｏ
   −Ａｒｇより成る、特許請求の範囲第４２項に記載の異
   種ポリペプチド。 （４６）グラム陰性細菌において心房性ペプチドを産生
   する方法において： ａ、ｒｅｃＡ蛋白又はその部分、エンドヌクレアーゼト
   リガーシグナルより成る接合部位及び心房性ペプチドよ
   り成る融合蛋白を産生させるゲノムＤＮＡを発現させ； ｂ、融合蛋白を単離し； ｃ、融合蛋白をエンドペプチダーゼトリガーシグナルを
   認識するエンドペプチダーゼで切断し；ｄ、そこから心
   房性ペプチドを得ることより成る、上記方法。 （４７）心房性ペプチドはＡＰ I 、ＮＡＰIII及びＡＰ
   IVより成る群から選ばれる、特許請求の範囲第４６項に
   記載の方法。 （４８）エンドペプチダーゼトリガーシグナルは、Ｖ８
   プロテアーゼ、Ｘａ因子及びトロンビントリガーシグナ
   ルより成る群から選ばれる、特許請求の範囲第４６項に
   記載の方法。 （４９）Ｖ８プロテアーゼトリガーシグナルはグルタミ
   ン酸より成る、特許請求の範囲第４６項に記載の方法。 （５０）Ｖ８プロテアーゼトリガーシグナルはＧｌｕ−
   Ｓｅｒより成る、特許請求の範囲第４６項に記載の方法
   。 （５１）Ｘａ因子トリガーシグナルはＧｌｕ−Ｇｌｙ−
   Ａｒｇより成る、特許請求の範囲第４６項に記載の方法
   。 （５２）トロンビントリガーシグナルはＡｒｇ−Ａｌａ
   −Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇよ
   り成る、特許請求の範囲第４６項に記載の異種ポリペプ
   チド。 （５３）トロンビントリガーシグナルはＧｌｙ−Ｐｒｏ
   −Ａｒｇより成る、特許請求の範囲第４６項に記載の異
   種ポリペプチド。 （５４）ｒｅｃＡ蛋白は１００％ｒｅｃＡより成る、特
   許請求の範囲第４６項に記載の方法。 （５５）グラム陰性細菌は大腸菌である、特許請求の範
   囲第４６項に記載の方法。 （５６）ｐＭＯＮ６１６３より成る発現ベクター（５７
   ）ｐＭＯＮ６１６４より成る発現ベクター（５８）ｐＭ
   ＯＮ６１６０より成る発現ベクター（５９）ｐＭＯＮ６
   １６６より成る発現ベクター（６０）ＡＴＣＣ受入れ番
   号が５３１４７である微生物。 （６１）ｐＭＯＮ２７９０より成る発現ベクター