JPS59130186A - ｒｅｃＡオペレ−タ−依存性ポリペプチドの産生 - Google Patents
ｒｅｃＡオペレ−タ−依存性ポリペプチドの産生Info
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- JPS59130186A JPS59130186A JP19895283A JP19895283A JPS59130186A JP S59130186 A JPS59130186 A JP S59130186A JP 19895283 A JP19895283 A JP 19895283A JP 19895283 A JP19895283 A JP 19895283A JP S59130186 A JPS59130186 A JP S59130186A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は遺伝子操作技術の分野に属し、＠乳類タンパク
のバクテリアによる表現に関する。
のバクテリアによる表現に関する。
遺伝子操作技術によって宿主細胞に異むポリペプチド、
すなわちその細胞種によって天然には製造されないボリ
ペフ０チドな耗生させることか可能なことはよく知られ
ている。従来、多種の哨乳類ボリペフ０チドが大腸菌細
胞内で製造されている。
すなわちその細胞種によって天然には製造されないボリ
ペフ０チドな耗生させることか可能なことはよく知られ
ている。従来、多種の哨乳類ボリペフ０チドが大腸菌細
胞内で製造されている。
たとえばソマトスタチンはＩｔａｋｕｒａら（５ｃｉｅ
ｎｃｅ。
ｎｃｅ。
１９８：１０５，１９７７）、ヒトインシュリンのＡお
よびＢ鎖はＧｏｅｄｄｅｌら（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ。
よびＢ鎖はＧｏｅｄｄｅｌら（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、ＵＳＡ、 ７６ ： １０６． １９７９ ）
、ヒト生長ホルモンはＧｏｅｄｃｌｅｌら（Ｎａｔｕｒ
ｅ、 ２８１ ： ５４４゜１９７９）、ヒト白血球イ
ンターフェロンは（）ｏｅｄｄｅｌら（Ｎａｔｕｒｅ、
２８７ ： ４１１．１９８０）、ヒト線維芽細胞イ
ンターフェロンはＧｏｅｄｄｅｌ ラ（Ｎｕｃ、１ｅｉ
ｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、、 ８ （１８） ： ４０
５７ 。
、ヒト生長ホルモンはＧｏｅｄｃｌｅｌら（Ｎａｔｕｒ
ｅ、 ２８１ ： ５４４゜１９７９）、ヒト白血球イ
ンターフェロンは（）ｏｅｄｄｅｌら（Ｎａｔｕｒｅ、
２８７ ： ４１１．１９８０）、ヒト線維芽細胞イ
ンターフェロンはＧｏｅｄｄｅｌ ラ（Ｎｕｃ、１ｅｉ
ｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、、 ８ （１８） ： ４０
５７ 。
１９８０）、ヒト血清アルブミンはＬａｗｎら（Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、、 ９ （２２） ：
６１０３ ＋１９８１）によってその製造方法が開示
されている。
ｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、、 ９ （２２） ：
６１０３ ＋１９８１）によってその製造方法が開示
されている。
宿主細胞に異ｍポリペプチドを産生させるには、ポリペ
プチドの構造配列（暗号配列ともいう）を、その構造配
列をメツセンジャーＲＮＡ （ｍＲＮＡ’）に転写する
プロモーター配列の近くに、通常、位置させる。大腸菌
中のキメラ遺伝子の表現を促進する各種のプロモーター
配列が使用されていて、たとえば、ｌａｃプロモーター
（Ｂｅｃｋｍａｎ ＆ Ｐｔａｓｈｎｅ：Ｃｅ１１．１
ろ：６５，１９７８）、ｔｒｐプロモーター （Ｈａｌ
ｌｅｗｅｌｌ ＆ Ｅｍｔａｇｅ ： Ｇｅｎｅ、
９ ： ２７＋１９８０）、ファージｌａｍｂ
ｄａ ＰＬプロモーター（Ｂｅｒｎａ、ｒｄら：ｏｅｎ
ｅ、５：５９．１９７９）などがある。
プチドの構造配列（暗号配列ともいう）を、その構造配
列をメツセンジャーＲＮＡ （ｍＲＮＡ’）に転写する
プロモーター配列の近くに、通常、位置させる。大腸菌
中のキメラ遺伝子の表現を促進する各種のプロモーター
配列が使用されていて、たとえば、ｌａｃプロモーター
（Ｂｅｃｋｍａｎ ＆ Ｐｔａｓｈｎｅ：Ｃｅ１１．１
ろ：６５，１９７８）、ｔｒｐプロモーター （Ｈａｌ
ｌｅｗｅｌｌ ＆ Ｅｍｔａｇｅ ： Ｇｅｎｅ、
９ ： ２７＋１９８０）、ファージｌａｍｂ
ｄａ ＰＬプロモーター（Ｂｅｒｎａ、ｒｄら：ｏｅｎ
ｅ、５：５９．１９７９）などがある。
各種の遺伝子プロモーター／オペレーター系が誘導でき
るが、それはある種の物質や条件を組み合わせることに
よって活性を適宜変えることができるからである。たと
えば大腸菌のｌａｃゾロモークー系は乳糖のような特定
の楯分子が存在しないと比較的低い活性しか示さない。
るが、それはある種の物質や条件を組み合わせることに
よって活性を適宜変えることができるからである。たと
えば大腸菌のｌａｃゾロモークー系は乳糖のような特定
の楯分子が存在しないと比較的低い活性しか示さない。
しかしながら、乳糖の存在下には（大腸菌細胞を含む培
地に乳糖を加えたとぎには）ｌａ−ｃフ０ロモーター系
の活性は著しく上昇し、プロモーターに近いＤＮＡの商
レベルでの転写が起こる（たとえはＪ 、 Ｍｊ、１１
ｅｒ ＆ Ｗ。
地に乳糖を加えたとぎには）ｌａ−ｃフ０ロモーター系
の活性は著しく上昇し、プロモーターに近いＤＮＡの商
レベルでの転写が起こる（たとえはＪ 、 Ｍｊ、１１
ｅｒ ＆ Ｗ。
Ｒｅｚｎｉ、ｋｏｆｆ ： Ｔｈｅ ０ｐｅｒｏｎ、
２版、 Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｓ、Ｎ、Ｙ、＋ １９８２参照）。ほかに誘導でき
る７０ロモーター糸にはｔｒｐプロモーター（過剰のト
リプトファンが存在すると比較的低い活性しか示さない
が、トリプトファンの低濃度または６Ｂ−インｒ−ルア
クリル酸が存在すると高い活性を示す。Ｈａｌｌｅｗｅ
ｌｌ ＆ Ｅｍｔａｇｅ ：前出、参照）やファージｌ
ａｍｂｄａ ７’ロモーター（６７°Ｃでは比較的低い
活性しか示さないが、熱感受性突然変異株ｌａｍｂｄａ
’Ｊデレッサーの存在下４２°Ｃで高い活性を示す）
がある。
２版、 Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｓ、Ｎ、Ｙ、＋ １９８２参照）。ほかに誘導でき
る７０ロモーター糸にはｔｒｐプロモーター（過剰のト
リプトファンが存在すると比較的低い活性しか示さない
が、トリプトファンの低濃度または６Ｂ−インｒ−ルア
クリル酸が存在すると高い活性を示す。Ｈａｌｌｅｗｅ
ｌｌ ＆ Ｅｍｔａｇｅ ：前出、参照）やファージｌ
ａｍｂｄａ ７’ロモーター（６７°Ｃでは比較的低い
活性しか示さないが、熱感受性突然変異株ｌａｍｂｄａ
’Ｊデレッサーの存在下４２°Ｃで高い活性を示す）
がある。
大腸菌のｒｅｃＡ遺伝子はクローン化され、そのヌクレ
オチド配列も報告されている（Ｔ、Ｈｏｒｉｉら： ”
Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃ
Ａ ｇｅｎｅ ｏｆ、 Ｅ。
オチド配列も報告されている（Ｔ、Ｈｏｒｉｉら： ”
Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃ
Ａ ｇｅｎｅ ｏｆ、 Ｅ。
ｃｏｌｉ ”、 Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、ＵＳＡ、 ７７
： ３１３． １９８０およびＡ、 ５ａｎｃａｒら：
“５ｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃ Ａｇｅ
ｎｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ” 、 Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ
、ＵＳＡ、 ７７ ： ２６１１゜１９８０参照）。ｒ
ｅｃ Ａポリポペデチドは遺伝子組換や細胞がある釉の
ストレスに暴されたときに起こる”ｓｏｓ”機能と呼ば
れるある種の機能など、多くの機能に関与している。ｒ
ｅｃ Ａポリペブチ−はＰ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓ、 Ｉｎｃ、 （Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、 Ｗｉｓ−
ｃｏｎｓｉｎ ）から市販されている。ｒｅｃ Ａの表
現は多くの物質たとえばナルジキシ酸およびマイトマイ
シンＣにより、また各種のストレス条件たとえば紫外線
照射により誘発できる（ Ｅ’、 Ｍ、 Ｗｌｔｋｉｎ
。
： ３１３． １９８０およびＡ、 ５ａｎｃａｒら：
“５ｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃ Ａｇｅ
ｎｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ” 、 Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ
、ＵＳＡ、 ７７ ： ２６１１゜１９８０参照）。ｒ
ｅｃ Ａポリポペデチドは遺伝子組換や細胞がある釉の
ストレスに暴されたときに起こる”ｓｏｓ”機能と呼ば
れるある種の機能など、多くの機能に関与している。ｒ
ｅｃ Ａポリペブチ−はＰ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓ、 Ｉｎｃ、 （Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、 Ｗｉｓ−
ｃｏｎｓｉｎ ）から市販されている。ｒｅｃ Ａの表
現は多くの物質たとえばナルジキシ酸およびマイトマイ
シンＣにより、また各種のストレス条件たとえば紫外線
照射により誘発できる（ Ｅ’、 Ｍ、 Ｗｌｔｋｉｎ
。
” Ｕｌｔｒａ−ｖｉｏｌｅｔ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉ
ｓ ａｎｄ １ｎｄｕｃｉｂｌｅＤＮＡ ｒｅｐａｉｒ
ｉｎ Ｅ、 ｃｏｌｉ ”、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、
Ｒｅｖ、 。
ｓ ａｎｄ １ｎｄｕｃｉｂｌｅＤＮＡ ｒｅｐａｉｒ
ｉｎ Ｅ、 ｃｏｌｉ ”、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、
Ｒｅｖ、 。
４０ ： ８６９，１９７．６参照）。もし適尚な突然
変異株宿主細胞を用いれば、ついである釉のストレスた
とえば高温またはチミン飢餓によってｒｅｃ Ａポリペ
プチドの表現を誘発できる。
変異株宿主細胞を用いれば、ついである釉のストレスた
とえば高温またはチミン飢餓によってｒｅｃ Ａポリペ
プチドの表現を誘発できる。
本願出願前に、ヒトキメラ遺伝子にｒｅＣＡプロモータ
ーを用いた報告は２報発表されている。第１０卒ｌ、１
告」ま１’、Ｍｉｋｉら： ” Ｃｏｎ５ｔｒｕｃｔ１
ｏｎ ｏｆ ａｆｕｓｅｄ ０ｐｅｒｏｎ ｃｏｎｓｉ
ｓｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃＡ ａｎｄ ｋａｎ
（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ） 、
ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａ−ｔｉｏｎ ｏｆ
ｉｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ １ｅｘ
Ａ ｇｅｎｅ ” 。
ーを用いた報告は２報発表されている。第１０卒ｌ、１
告」ま１’、Ｍｉｋｉら： ” Ｃｏｎ５ｔｒｕｃｔ１
ｏｎ ｏｆ ａｆｕｓｅｄ ０ｐｅｒｏｎ ｃｏｎｓｉ
ｓｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃＡ ａｎｄ ｋａｎ
（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ） 、
ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａ−ｔｉｏｎ ｏｆ
ｉｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ １ｅｘ
Ａ ｇｅｎｅ ” 。
Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、、 １８３ ： ２５
−５１．１９８１で、酵素、カナマイシンホスホトラン
スフェラーゼ（ＫＰＴ ）に翻訳された構造配列の転写
促進にｒｅｃＡ７０ロモーターを利用することについて
述べられている。ＫＰＴは大腸菌細胞に対して毒性を示
す抗生物質、カナマイシンを不活性化する。ＫＰＴはお
る棟のプラスミドまたはトランスポソンを含有する大腸
菌の多くの菌株に天然に存在し、カナマイシンの存在下
にはＫＰＴ遺伝子は選択標識として利用できる。Ｍｌｋ
ｉらによって報告された研究の目的はｒｅｃ Ａ遺伝子
と、ｒｅＣＡ遺伝子の転写を抑制する］、ｅｘＡと呼ば
れるタンパクを派生ずる’Ｊ−ｅｘ Ａ遺伝子という名
称の別の遺伝子との関係を明らかにすることにあった。
−５１．１９８１で、酵素、カナマイシンホスホトラン
スフェラーゼ（ＫＰＴ ）に翻訳された構造配列の転写
促進にｒｅｃＡ７０ロモーターを利用することについて
述べられている。ＫＰＴは大腸菌細胞に対して毒性を示
す抗生物質、カナマイシンを不活性化する。ＫＰＴはお
る棟のプラスミドまたはトランスポソンを含有する大腸
菌の多くの菌株に天然に存在し、カナマイシンの存在下
にはＫＰＴ遺伝子は選択標識として利用できる。Ｍｌｋ
ｉらによって報告された研究の目的はｒｅｃ Ａ遺伝子
と、ｒｅＣＡ遺伝子の転写を抑制する］、ｅｘＡと呼ば
れるタンパクを派生ずる’Ｊ−ｅｘ Ａ遺伝子という名
称の別の遺伝子との関係を明らかにすることにあった。
第２の報告は、Ｓ、 Ｃａｓａｒｅｇｏｌａ Ｔ；）：
”Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｅｖａｌｕａｔｉ ○ｎ
ｏｆ ｒｅｃＡ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ ｉｎ Ｅ。
”Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｅｖａｌｕａｔｉ ○ｎ
ｏｆ ｒｅｃＡ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ ｉｎ Ｅ。
ｃｏｌｉ”、 Ｍｏ１．Ｇｅｎ、（）ｅｎｅｔ、、 １
８５ ： ４５０−４３９゜１９８２で、ｒｅｃ Ａ
： ｌａｃキメラ遺伝子に関するものである。ｒｅｃ
Ａタンパクの酵素活性の測定が困難なところから、Ｃａ
ｓａｒｅｇｏｌａらはβ−ガラクトシ〃゛−ゼ（β−ｇ
ａ、１ ）に翻訳されろ構造配列からなり、ｒｅＣＡプ
ロモーターによって支配されるキメラ遺伝子を作製した
。β−ｇａｌ ｋ’！−Ｅ、 ｃｏｌｉの多くの菌株に
天然に存在する酵素である。
８５ ： ４５０−４３９゜１９８２で、ｒｅｃ Ａ
： ｌａｃキメラ遺伝子に関するものである。ｒｅｃ
Ａタンパクの酵素活性の測定が困難なところから、Ｃａ
ｓａｒｅｇｏｌａらはβ−ガラクトシ〃゛−ゼ（β−ｇ
ａ、１ ）に翻訳されろ構造配列からなり、ｒｅＣＡプ
ロモーターによって支配されるキメラ遺伝子を作製した
。β−ｇａｌ ｋ’！−Ｅ、 ｃｏｌｉの多くの菌株に
天然に存在する酵素である。
さらに、本願出願後に、１報の報告がある。これはＳ、
：Ｌ 、 Ｆｅ１．ｎＳ ｊｅｌｎらによりＮｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、、 １１ （９） ：２９
２７−２９４１．１９８３に発表されたものでヒトイン
ターフェロン３Ｎ 伝子のＥ、ｃｏ］、ｉ内での表現に
ｒｅｃ Ａプロモーターを使用することが述べられてい
る。
：Ｌ 、 Ｆｅ１．ｎＳ ｊｅｌｎらによりＮｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、、 １１ （９） ：２９
２７−２９４１．１９８３に発表されたものでヒトイン
ターフェロン３Ｎ 伝子のＥ、ｃｏ］、ｉ内での表現に
ｒｅｃ Ａプロモーターを使用することが述べられてい
る。
本明細書において、［内因性のポリペプチド」の語は、
宿主細胞のある釉の属または種が天然にもっているポリ
ペプチドを意味する。たとえばＥ。
宿主細胞のある釉の属または種が天然にもっているポリ
ペプチドを意味する。たとえばＥ。
ｃｏｌｉ の天然の一部の菌株はカナマイシンホスホ
キナーゼ（ＫＰＴ）をもっている。したがって、Ｅ。
キナーゼ（ＫＰＴ）をもっている。したがって、Ｅ。
ｃｏｌｉの全菌株がＫＰＴをもっていなくても、Ｅ。
ｃｏ］−１種の細胞に関してはＫＰＴは内因性と考えて
よい。一方、本明細書に用いられる「異種ポリペプチド
」の飴は宿主細胞の属または種には天然に存在しないポ
リペプチドを指す。たとえば哺乳類または植物ポリペプ
チドはＥ、 ｃｏｌｉおよびその他のバクテリア細胞に
ついては異種である。
よい。一方、本明細書に用いられる「異種ポリペプチド
」の飴は宿主細胞の属または種には天然に存在しないポ
リペプチドを指す。たとえば哺乳類または植物ポリペプ
チドはＥ、 ｃｏｌｉおよびその他のバクテリア細胞に
ついては異種である。
ある種のバクテリア宿主細胞において内因性のポリペプ
チド（たとえばＥ、 ｃｏｌｉの一部の菌株の細胞に天
然に存在するＫＰＴまたはβ−ガラクトシダーゼ等）の
キメラ遺伝子による表現は、バクテリア宿主細胞に異種
ポリペプチド、たとえばインターフェロンまたはソマト
スタチンを表現させるよりもはるかに容易である。これ
は、まだ完全には解明されていない多くの複雑な過程に
よる。宿主細胞における異種ポリペプチドの表現または
蓄積を妨害すると考えられる原因には次のようなものが
ある。
チド（たとえばＥ、 ｃｏｌｉの一部の菌株の細胞に天
然に存在するＫＰＴまたはβ−ガラクトシダーゼ等）の
キメラ遺伝子による表現は、バクテリア宿主細胞に異種
ポリペプチド、たとえばインターフェロンまたはソマト
スタチンを表現させるよりもはるかに容易である。これ
は、まだ完全には解明されていない多くの複雑な過程に
よる。宿主細胞における異種ポリペプチドの表現または
蓄積を妨害すると考えられる原因には次のようなものが
ある。
王 異種ポリペブチ１は宿主細胞によって分解される。
２、異種ポリペブチ１は、細胞の機能に必須の天然のタ
ンパクまたは他の物ａの１種または２種以上と相互作用
して、宿主細胞に毒性効果を発現する。
ンパクまたは他の物ａの１種または２種以上と相互作用
して、宿主細胞に毒性効果を発現する。
分解の問題は大きな異種ポリペプチドチりも小さな異種
ポリペプチドの場合の方が重大であろうと思われる。ア
ミノ酸残基約１００以上の異種ボリペフ０チドは多数、
Ｅ、ｃｏｌｉ中で表現されてきたか、アミノ酸残基約５
０以ドの異種ポリペブチＩＳは多くの試みかなされてい
るにもかかわらず、これまでにＥ、ｃｏｌｉ中で表現さ
れたものはわずかしかない。
ポリペプチドの場合の方が重大であろうと思われる。ア
ミノ酸残基約１００以上の異種ボリペフ０チドは多数、
Ｅ、ｃｏｌｉ中で表現されてきたか、アミノ酸残基約５
０以ドの異種ポリペブチＩＳは多くの試みかなされてい
るにもかかわらず、これまでにＥ、ｃｏｌｉ中で表現さ
れたものはわずかしかない。
バクテリア細胞中で異種ポリペブチげを表現させる場合
の問題を克服するために融合ポリペブチｒが使用されて
きた。融合ポリペプチドは通常、天然に存在するＥ、
ｃｏｌｉポリペブチｒの部分（キャリヤーポリペプチド
と呼ばれることが多い）を選択されたポリペブチ１に結
合させる。この種の融合ポリペプチドは通常、選択され
た大腸菌遺伝子の構造配列に異種構造配列を挿入するこ
とによって製造させる。挿入された構造配列は、Ｅ、
ｃｏｌｉ遺伝子のプロモーター／オペレーター配列の制
御下にキメラｍＲＮＡに転写され、キメラｍＲＮ Ａは
Ｅ、 ｃｏ上ｉ遺伝子の５′非翻訳領域とＡＵＧ開始暗
号の制御下にポリペプチドに翻訳される。融合ポリベラ
０チドでは、挿入された構造配列がＥ、 ｃｏｌｉ遺伝
子のＡＵ＋）開始暗号に対して適当な解読わく内になけ
ればならない（Ｇｏｅｄｄｅｌら： Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、
、 １９７９前出、Ｉｔａｋｕｒａ ＆ Ｒｉｇｇｓ
：英国特許出願ＧＢ２．００７，６７６Ａ、、１９７９
公開、参照）。
の問題を克服するために融合ポリペブチｒが使用されて
きた。融合ポリペプチドは通常、天然に存在するＥ、
ｃｏｌｉポリペブチｒの部分（キャリヤーポリペプチド
と呼ばれることが多い）を選択されたポリペブチ１に結
合させる。この種の融合ポリペプチドは通常、選択され
た大腸菌遺伝子の構造配列に異種構造配列を挿入するこ
とによって製造させる。挿入された構造配列は、Ｅ、
ｃｏｌｉ遺伝子のプロモーター／オペレーター配列の制
御下にキメラｍＲＮＡに転写され、キメラｍＲＮ Ａは
Ｅ、 ｃｏ上ｉ遺伝子の５′非翻訳領域とＡＵＧ開始暗
号の制御下にポリペプチドに翻訳される。融合ポリベラ
０チドでは、挿入された構造配列がＥ、 ｃｏｌｉ遺伝
子のＡＵ＋）開始暗号に対して適当な解読わく内になけ
ればならない（Ｇｏｅｄｄｅｌら： Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、
、 １９７９前出、Ｉｔａｋｕｒａ ＆ Ｒｉｇｇｓ
：英国特許出願ＧＢ２．００７，６７６Ａ、、１９７９
公開、参照）。
このように技術的進歩は著しいが、ある種の異種ポリペ
プチド、たとえはソマトスタチンを表現するのに大腸菌
細胞を用いるには、多くの問題があってその利用範囲や
実用性には限界がある。たとえば、 １、 異種ポリペブチＶの表現はｊロモーターを用いて
も抑制される。表現は遅くなり、生育相でより有用な他
の代謝または増殖過程に向けられてしまいやすい。また
一定時間内に生育できる宿主細胞の数または生存性が低
下ｌ〜、したがって限られた時間の発酵サイクル内に細
胞によって表現され、蓄積される異種ポリペラ０チドの
量は低下する。
プチド、たとえはソマトスタチンを表現するのに大腸菌
細胞を用いるには、多くの問題があってその利用範囲や
実用性には限界がある。たとえば、 １、 異種ポリペブチＶの表現はｊロモーターを用いて
も抑制される。表現は遅くなり、生育相でより有用な他
の代謝または増殖過程に向けられてしまいやすい。また
一定時間内に生育できる宿主細胞の数または生存性が低
下ｌ〜、したがって限られた時間の発酵サイクル内に細
胞によって表現され、蓄積される異種ポリペラ０チドの
量は低下する。
２ プロモーター／オペレーター系の制御には適当な融
通性がない。公知の大部分のプロモーター／オペレータ
ー系は１種または２．６種の公知物質または条件によっ
てのみ効果的に誘発される。しかしながら、どの誘発物
質も条件も特定の宿主細胞また特定の代謝反応に有害な
作用を及ぼす。したがって広範囲の物質または条件で誘
発できるプロモーター系の存在が好まｌ−い。
通性がない。公知の大部分のプロモーター／オペレータ
ー系は１種または２．６種の公知物質または条件によっ
てのみ効果的に誘発される。しかしながら、どの誘発物
質も条件も特定の宿主細胞また特定の代謝反応に有害な
作用を及ぼす。したがって広範囲の物質または条件で誘
発できるプロモーター系の存在が好まｌ−い。
６ まだ不明の理由により、ある種の異種ポリペプチド
は細胞にとって不利益な影響を与える。
は細胞にとって不利益な影響を与える。
これが次のような結果として表れてくる。
ａ０％定のＤＮＡから生じることカζ期待されるプラス
ミドを含む細胞を単離することが困難−Ｃ１操作に熟練
を敬する。
ミドを含む細胞を単離することが困難−Ｃ１操作に熟練
を敬する。
ｂ、プラスミドの不安定性。たとえばＩｔａｋｕ、ｒａ
らは、キメラβ−ｇｅｌ ／ソマトスタチン遺伝子を含
ム彼らが作製したフ０ラスミドはかなり不安定であった
と述べている（ 工ｔａｋｕｒａ ｌ；） ： ５ｃｉ
ｅｎｃｅ。
らは、キメラβ−ｇｅｌ ／ソマトスタチン遺伝子を含
ム彼らが作製したフ０ラスミドはかなり不安定であった
と述べている（ 工ｔａｋｕｒａ ｌ；） ： ５ｃｉ
ｅｎｃｅ。
１９８：１０５６〜１［１６２，１９７７参照）。
１０」代にもわたって表現を続けるとプラスミドの安定
性が低いため、細胞の大部分が所望のポリペプチドを表
現しなくなり、ポリペプチドを除いて増殖を促進させて
も表現はみられなくなる。
性が低いため、細胞の大部分が所望のポリペプチドを表
現しなくなり、ポリペプチドを除いて増殖を促進させて
も表現はみられなくなる。
Ｉｔａｋｕ、ｒａらは前出の文献でツマ１〜スクチンを
Ｅ。
Ｅ。
ｃｏｌｉからのβ−ｇａｌ ポリペプチドの部分と結合
させた融合ポリペプチドの表現を報告して℃・るカー、
プラスミドの不安定性と細胞内への蓄積カーわず力・で
あることを含め、Ｅ、ｃｏｌｉ内でのこの融合ボ１ｊペ
プチドの効率よい表現には限界？３′−あると論じてい
る。ＭＯｎＳａｎｔＯの研究者達も類似のプラスミＶの
作製に努力し、同じ問題が、Ｅ、ｃｏｌｉ中でのβ−ｇ
ａｌ ／ソマトスタチン融合ポリペプチドの所望濃度の
蓄積を妨げることを確認している。
させた融合ポリペプチドの表現を報告して℃・るカー、
プラスミドの不安定性と細胞内への蓄積カーわず力・で
あることを含め、Ｅ、ｃｏｌｉ内でのこの融合ボ１ｊペ
プチドの効率よい表現には限界？３′−あると論じてい
る。ＭＯｎＳａｎｔＯの研究者達も類似のプラスミＶの
作製に努力し、同じ問題が、Ｅ、ｃｏｌｉ中でのβ−ｇ
ａｌ ／ソマトスタチン融合ポリペプチドの所望濃度の
蓄積を妨げることを確認している。
本発明はバクテリア細胞内で、’ ｒｅｃ Ａプロモー
ター／オペレーター領域の制御下に表現される異種ポリ
ペプチド（すなわちＥ、 ｃｏｌｉ細胞内に天然には存
在しないポリペブチｌ−”）を表現、＠積させる方法に
関する。
ター／オペレーター領域の制御下に表現される異種ポリ
ペプチド（すなわちＥ、 ｃｏｌｉ細胞内に天然には存
在しないポリペブチｌ−”）を表現、＠積させる方法に
関する。
本発明はまたｒｅｃ Ａプロモーター／オペレーター領
域に用いられるキメラ遺伝子およびクローニングベクタ
ー、および本発明の方法によって産生された異種ポリペ
プチドに関する。この種の異種ポリペプチドのひとつに
は、そのアミン末端にはｒｅｃ Ａポリペプチドとアミ
ノ酸配列、そのカルボキシ末端にはソマトスタチン配列
を有する融合ポリペプチドがある。この融合ポリペプチ
ドは、報告されている唯一のソマトスタチン含有融合ポ
リペプチド、β−ガラクトシダーゼ／ソマトスタチン融
合に比し、はるかに容易にまた効果的に表現され、蓄積
されることが明らかになった。
域に用いられるキメラ遺伝子およびクローニングベクタ
ー、および本発明の方法によって産生された異種ポリペ
プチドに関する。この種の異種ポリペプチドのひとつに
は、そのアミン末端にはｒｅｃ Ａポリペプチドとアミ
ノ酸配列、そのカルボキシ末端にはソマトスタチン配列
を有する融合ポリペプチドがある。この融合ポリペプチ
ドは、報告されている唯一のソマトスタチン含有融合ポ
リペプチド、β−ガラクトシダーゼ／ソマトスタチン融
合に比し、はるかに容易にまた効果的に表現され、蓄積
されることが明らかになった。
本発明はまた、各種の化学物質および他の条件によって
異種ポリペプチドの表現の抑制および誘発のｉ＋制御方
法を開示するものである。実験の結果、ｒｅｃ Ａ系の
制御Ｆの異種ポリペプチドの表現はナルジキシ酸、マイ
トマイシンＣおよび紫外線によって誘発された。またこ
の表現は適幽な宿主細胞中、ＤＮＡの複製を妨害する多
くの他の条件たとえば高温およびチミン飢餓によっても
誘発できる。
異種ポリペプチドの表現の抑制および誘発のｉ＋制御方
法を開示するものである。実験の結果、ｒｅｃ Ａ系の
制御Ｆの異種ポリペプチドの表現はナルジキシ酸、マイ
トマイシンＣおよび紫外線によって誘発された。またこ
の表現は適幽な宿主細胞中、ＤＮＡの複製を妨害する多
くの他の条件たとえば高温およびチミン飢餓によっても
誘発できる。
多くの物質および条件があることは細胞に異種ポリペプ
チドを表現させ蓄積させる場合、いくつかの利点がある
。
チドを表現させ蓄積させる場合、いくつかの利点がある
。
本発明はｒｅｃ Ａフ０ロモー汐−／オペレーター領域
の制御下のバクテリア細胞中での異種ポリペプチドの表
現および蓄積に関する。この雅のポリペラ０チドのひと
つとしてはｒｅＣＡ／ンマトスクチン融合ポリペプチド
がある。この融合ポリペプチドは他の゛ノマトスタチン
含有融合ポリペプチドよりもはるかに効率よく表現され
、蓄積させる。さらに、ｒｅｃＡゾロモークー／オペレ
ーターの使用は他の誘発性プロモーター系よりも融通性
の高い誘発性を示す。
の制御下のバクテリア細胞中での異種ポリペプチドの表
現および蓄積に関する。この雅のポリペラ０チドのひと
つとしてはｒｅＣＡ／ンマトスクチン融合ポリペプチド
がある。この融合ポリペプチドは他の゛ノマトスタチン
含有融合ポリペプチドよりもはるかに効率よく表現され
、蓄積させる。さらに、ｒｅｃＡゾロモークー／オペレ
ーターの使用は他の誘発性プロモーター系よりも融通性
の高い誘発性を示す。
本発明の一実施態様によれば、ＥｃｏＲＩ末端、１５個
のアミノ酸（メチオニンおよび天然ソマトスタチンの１
４種のアミノ酸）のコードンおよびＳａｌ Ｉ末端を含
む第１１ゴヌクレオチＶが合成された。このオリゴヌク
レオチドはフ０ラスミドｐＢＲ６２７（関連プラスミド
の表示方法については実施例に述べろ）に挿入され、こ
れはＥｃｏＲＩおよびＳａｌ Ｉで切断するとプラスミ
ドｐＭＯＮ １００４が得られた。次にこのフ０ラスミ
ドをＳａｌ Ｉに独特の切断部位へのオリゴヌクレオチ
ドの挿入によって改良し、Ｓａ１丁部位の隣に新しいＢ
ａｍＨＩ切断部位を作る。得られたプラスミドは第１図
に示すようにｐＭＯＮ ２００ろと命名された。この操
作はさらに詳細に例２に記述する。
のアミノ酸（メチオニンおよび天然ソマトスタチンの１
４種のアミノ酸）のコードンおよびＳａｌ Ｉ末端を含
む第１１ゴヌクレオチＶが合成された。このオリゴヌク
レオチドはフ０ラスミドｐＢＲ６２７（関連プラスミド
の表示方法については実施例に述べろ）に挿入され、こ
れはＥｃｏＲＩおよびＳａｌ Ｉで切断するとプラスミ
ドｐＭＯＮ １００４が得られた。次にこのフ０ラスミ
ドをＳａｌ Ｉに独特の切断部位へのオリゴヌクレオチ
ドの挿入によって改良し、Ｓａ１丁部位の隣に新しいＢ
ａｍＨＩ切断部位を作る。得られたプラスミドは第１図
に示すようにｐＭＯＮ ２００ろと命名された。この操
作はさらに詳細に例２に記述する。
全ｒｅｃ Ａ遺伝子を含むプラスミドＴ）ＤＲ１４５ろ
はエール大学医学部のＷ、 Ｄｅａｎ Ｒｕｐｐ博士か
ら意力されたものである。このプラスミドは２種のエン
ドヌクレアーゼ、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化し、線
型化遺伝子断片を得た。この断片は（感覚鎖上５′から
６′に） ＢａｍＨ工末端、ｒｅｃ Ａプロモーター／
オペレーター領域、５′非翻訳領域（これはリボ・アー
ム結合サイトを含む）、ｒｅｃＡ構造配列の部分（ＡＴ
（）開始コードンを含む）、およびＥｃｏＲＩ末端を含
有する。この断片を、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消
化したプラスミドｐＢＲ３２２に挿入し、第２図に示し
たようにプラスミドｐＤＲ１４６１を得た。この操作は
さらに詳細に例ろに記述する。
はエール大学医学部のＷ、 Ｄｅａｎ Ｒｕｐｐ博士か
ら意力されたものである。このプラスミドは２種のエン
ドヌクレアーゼ、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化し、線
型化遺伝子断片を得た。この断片は（感覚鎖上５′から
６′に） ＢａｍＨ工末端、ｒｅｃ Ａプロモーター／
オペレーター領域、５′非翻訳領域（これはリボ・アー
ム結合サイトを含む）、ｒｅｃＡ構造配列の部分（ＡＴ
（）開始コードンを含む）、およびＥｃｏＲＩ末端を含
有する。この断片を、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消
化したプラスミドｐＢＲ３２２に挿入し、第２図に示し
たようにプラスミドｐＤＲ１４６１を得た。この操作は
さらに詳細に例ろに記述する。
ついでフ０ラスミドｐＤＲ１４６１およびｐ ｌ！ Ｏ
Ｎ２００３を混合し、各フ０ラスミドをＥｃｏＲＩで切
断してＭ型化した。ＥｃｏＲＩヌクレアーセ゛を加熱し
て不活性化し、混合物にＴ４ＤＮＡＩＪガーゼを離別し
た。
Ｎ２００３を混合し、各フ０ラスミドをＥｃｏＲＩで切
断してＭ型化した。ＥｃｏＲＩヌクレアーセ゛を加熱し
て不活性化し、混合物にＴ４ＤＮＡＩＪガーゼを離別し
た。
各プラスミドはそれ自体に再すケゝ−トすることも可能
であるが、少なくとも一部のｐＤＲ１４６１プラスミド
は所望のオリエンテーションでｐＭＯＮ２００３にリケ
ゞ−トし、ｐＭＯＮ ２００ろからのメチオニンおよび
ソマトスタチンのツー１ンをｐＤＲ１４６１からのｒｅ
ｃ Ａコードンと同じ解読わくに、第１表に示すように
配置させるものと思われる。
であるが、少なくとも一部のｐＤＲ１４６１プラスミド
は所望のオリエンテーションでｐＭＯＮ２００３にリケ
ゞ−トし、ｐＭＯＮ ２００ろからのメチオニンおよび
ソマトスタチンのツー１ンをｐＤＲ１４６１からのｒｅ
ｃ Ａコードンと同じ解読わくに、第１表に示すように
配置させるものと思われる。
第１表に示すように、メチオニンのＡＴＧコードンはｒ
ｅｃ Ａの２６０番目のコードン（フェニルアラニンの
暗号であるＴＴＣ）とソマトスタチン構造配列の第１番
目のコードン（アラニンの暗号であるＯＣＴ ）との間
に含まれている。これは所望により、適当な条件下に融
合ポリペブチｒをシアノｒ紹１表 タンパク−０１Ｊｕ Ａ、／？ａ Ｇｌｕ
Ｐｈｅｌｊ ＭｅｔＧＣＴ Ｇ（）ＣＴＧＴ
ＡＡＣ） ＡＡＣＡｌａ Ｇａｙ ＣＶ
Ｓ ＬＹＳ ＡｓｎＴＴＣＴＴＣＴ（）Ｇ
ＡＡＡ ＡＣＣＰｈｅ Ｐｈｅ Ｔｒｐ
Ｌｙｓ ＴｈｒＴＴＴ ＡＣＣＴＣＴ
Ｔｉｃ ’］”ＡＡＰｈｅ Ｔｈｒ ’Ｓ
ｅｒ Ｃｙｓ 停止浮止 ＊ Ｐｈｅはｒｅｃ Ａタンパクの２６０４拌目のアミ
ノ酸である。
ｅｃ Ａの２６０番目のコードン（フェニルアラニンの
暗号であるＴＴＣ）とソマトスタチン構造配列の第１番
目のコードン（アラニンの暗号であるＯＣＴ ）との間
に含まれている。これは所望により、適当な条件下に融
合ポリペブチｒをシアノｒ紹１表 タンパク−０１Ｊｕ Ａ、／？ａ Ｇｌｕ
Ｐｈｅｌｊ ＭｅｔＧＣＴ Ｇ（）ＣＴＧＴ
ＡＡＣ） ＡＡＣＡｌａ Ｇａｙ ＣＶ
Ｓ ＬＹＳ ＡｓｎＴＴＣＴＴＣＴ（）Ｇ
ＡＡＡ ＡＣＣＰｈｅ Ｐｈｅ Ｔｒｐ
Ｌｙｓ ＴｈｒＴＴＴ ＡＣＣＴＣＴ
Ｔｉｃ ’］”ＡＡＰｈｅ Ｔｈｒ ’Ｓ
ｅｒ Ｃｙｓ 停止浮止 ＊ Ｐｈｅはｒｅｃ Ａタンパクの２６０４拌目のアミ
ノ酸である。
’−Ａ７！ａはソマトスタチンの最初のアミノ酸である
。
。
ンデロミドで処理して、ソマトスタチンポリペプチドを
ｒｅｃＡポリペプチドから分離することができるためで
ある。
ｒｅｃＡポリペプチドから分離することができるためで
ある。
キャリアーポリペプチドから異種ポリペプチドを切断で
きるように、他の各種の所望のアミノ酸またはアミノ酸
配列を設けることができる。たとえば、異種ポリペプチ
ドが内部にメチオニン残基を含んでいる場合はギ酸中Ｃ
ＮＢ ｒでポリペプチドを切断すると異種ポリペプチド
が切断されてしまって望ましくない。これを回避するた
め、キメラ遺伝子の適当な場所にＵ（）（）コードンを
挿入することにより、キャリアーポリペプチドと異種ポ
リペプチドの間にトリプトファン残基を挿入することも
できる。適当な条件下にＣＮＢｒで処理してポリペプチ
ドをトリプトファン残基で（大部分のメチオニン残基は
影響を受けない）切断することができる（ Ｈ，Ｖ、
Ｈｕａｎｇら： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ。
きるように、他の各種の所望のアミノ酸またはアミノ酸
配列を設けることができる。たとえば、異種ポリペプチ
ドが内部にメチオニン残基を含んでいる場合はギ酸中Ｃ
ＮＢ ｒでポリペプチドを切断すると異種ポリペプチド
が切断されてしまって望ましくない。これを回避するた
め、キメラ遺伝子の適当な場所にＵ（）（）コードンを
挿入することにより、キャリアーポリペプチドと異種ポ
リペプチドの間にトリプトファン残基を挿入することも
できる。適当な条件下にＣＮＢｒで処理してポリペプチ
ドをトリプトファン残基で（大部分のメチオニン残基は
影響を受けない）切断することができる（ Ｈ，Ｖ、
Ｈｕａｎｇら： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ。
９１ ：３１８，１９８３参照）。別法として、タンパ
ク分解酵素たとえばトリプシン（リジンまたはアルギニ
ン残基のいずれかで切断）、キモ） ＩＪプシン（トリ
フ０トフアン、フェニルアラニンまたはチロシン残基で
切断）、コラーケゞナーゼ（Ｐｒｏ−χ−〇１ｙ−Ｐｒ
ｏ配列を切断）またはトロンビン（−７゜ロリン−アル
ギニン配列を切断）が認識、切断できるアミノ酸残基ま
たは配列を与える１種または２種以上のアミノ酸残基を
挿入することも可能である。
ク分解酵素たとえばトリプシン（リジンまたはアルギニ
ン残基のいずれかで切断）、キモ） ＩＪプシン（トリ
フ０トフアン、フェニルアラニンまたはチロシン残基で
切断）、コラーケゞナーゼ（Ｐｒｏ−χ−〇１ｙ−Ｐｒ
ｏ配列を切断）またはトロンビン（−７゜ロリン−アル
ギニン配列を切断）が認識、切断できるアミノ酸残基ま
たは配列を与える１種または２種以上のアミノ酸残基を
挿入することも可能である。
異種ポリペラ０チＲの１種または２種以上のアミノ酸を
除去してもポリペプチドの所望の性質に著しい悪影響を
与えない場合は切断のための残基または配列を異積ボリ
ペフ０チド内に置くこともできる。
除去してもポリペプチドの所望の性質に著しい悪影響を
与えない場合は切断のための残基または配列を異積ボリ
ペフ０チド内に置くこともできる。
ｐＤＲ１４６１およびｐＭＯＮ ２００３断片のりガー
ゼ処理混合物をＢａｍＨＩで消化し、あらかじめＢａｍ
ＨＩで消化したＭ１３ファージでリケゝ−トした。
ゼ処理混合物をＢａｍＨＩで消化し、あらかじめＢａｍ
ＨＩで消化したＭ１３ファージでリケゝ−トした。
Ｍ１３ファージは増殖ザイクルで単一鎖と二重鎖の両段
階を経過するウィルスで、ある種のＤＮＡ操作に有用で
ある。エンドヌクレアーゼ切断サイトを有する多くのＭ
１６種がこれまでに得られていて、たとえば独特のＢａ
ｍＨＩサイト（および数種の他の特定サイト）を有する
Ｍ１３ｍｐ８がある。
階を経過するウィルスで、ある種のＤＮＡ操作に有用で
ある。エンドヌクレアーゼ切断サイトを有する多くのＭ
１６種がこれまでに得られていて、たとえば独特のＢａ
ｍＨＩサイト（および数種の他の特定サイト）を有する
Ｍ１３ｍｐ８がある。
多くのＭ １３ ｍｐ ８ ファージが得られた力ｔ
１ これらをＢａｍＨＩ末端に１．８キロベース（Ｋｌ
））挿入体を含むＭ１３複製型（ＲＦ ） ＤＮＡ の
存在についてスクリーニングした。このようなりローン
のコロニー５種が同定され、さらにＢａｍＨＩ挿入部の
オリエンテーションを決定するために解析した。オリエ
ンテーションの異なる２種のコロニーからのプラスミｒ
を第６図に示すようにｐＭＯＮ ２００４および１）Ｍ
ＯＮ ２００５と命名した。この操作は例４にさらに詳
細に述べる。
１ これらをＢａｍＨＩ末端に１．８キロベース（Ｋｌ
））挿入体を含むＭ１３複製型（ＲＦ ） ＤＮＡ の
存在についてスクリーニングした。このようなりローン
のコロニー５種が同定され、さらにＢａｍＨＩ挿入部の
オリエンテーションを決定するために解析した。オリエ
ンテーションの異なる２種のコロニーからのプラスミｒ
を第６図に示すようにｐＭＯＮ ２００４および１）Ｍ
ＯＮ ２００５と命名した。この操作は例４にさらに詳
細に述べる。
ついでｐＭＯＮ ２００５をＢａｍＨＩで消化し、１．
８Ｋｂ 断片を精製し、あらかじめＢａｍＨＩで消化し
た別のプラスミ）ｌ’、ｐＭＯＢ４５とリグ９−トした
。プラスミドｐＭＯＢ ４５は細胞あたりのプラスミド
模写数を増加させることができる熱感受性リプリコンと
、２個の選択可能な標識遺伝子（クロラムフェニコール
抵抗性ｃｍ とアトフサイクリン抵抗性ＴＣＲ）を有
する。ＴｃＲ遺伝子はＢａｍＨＩ切断部位にＤＮＡを挿
入して分断される。
８Ｋｂ 断片を精製し、あらかじめＢａｍＨＩで消化し
た別のプラスミ）ｌ’、ｐＭＯＢ４５とリグ９−トした
。プラスミドｐＭＯＢ ４５は細胞あたりのプラスミド
模写数を増加させることができる熱感受性リプリコンと
、２個の選択可能な標識遺伝子（クロラムフェニコール
抵抗性ｃｍ とアトフサイクリン抵抗性ＴＣＲ）を有
する。ＴｃＲ遺伝子はＢａｍＨＩ切断部位にＤＮＡを挿
入して分断される。
ｒｅｃ Ａ ／ ’ノマトスクチン断片が両方向でｐＭ
ＯＢ４５に挿入されたプラスミドが単離された。これら
のプラスミドは第４図に示すようにｐＭＯＮ２５０５お
よびｐＭＯＮ ２５０６と命名された。この操作は例５
に詳述する。
ＯＢ４５に挿入されたプラスミドが単離された。これら
のプラスミドは第４図に示すようにｐＭＯＮ２５０５お
よびｐＭＯＮ ２５０６と命名された。この操作は例５
に詳述する。
プラスミドｐＫｏ −１はプロモーターのない遺伝子（
すなわち、開始および停止コードンと６′非翻訳領域）
を含む゛。この遺伝子をｍＲＮＡに転写すると、このｍ
ＲＮＡはガラクトキナーゼ（ｇａｌ−Ｋ ）に翻訳され
、この酵素は容易に定量できろ。フ０ロモーターをもつ
キメラ遺伝子をプラスミド１）ＫＯ−１のｇａｐ −Ｋ
構造配列の近くに、同じオリエンテーションで挿入する
と、ｇａｌ−にの表現はキメラ遺伝子の転写とかくして
作製されたｍＲＮＡの安定性に関する情報を与える。
すなわち、開始および停止コードンと６′非翻訳領域）
を含む゛。この遺伝子をｍＲＮＡに転写すると、このｍ
ＲＮＡはガラクトキナーゼ（ｇａｌ−Ｋ ）に翻訳され
、この酵素は容易に定量できろ。フ０ロモーターをもつ
キメラ遺伝子をプラスミド１）ＫＯ−１のｇａｐ −Ｋ
構造配列の近くに、同じオリエンテーションで挿入する
と、ｇａｌ−にの表現はキメラ遺伝子の転写とかくして
作製されたｍＲＮＡの安定性に関する情報を与える。
プラスミドｐＫ○−１Ｍは、ｐＫｏ −１のｇａ／＜
−Ｋ構造配列の近くのＳｍａ Ｘ切断部位を除去し、Ｅ
ｃｏＲＩ切断部位で置換することによりｐＫｏ −１を
改良して作製した。このプラスミドをＢａｍＨＩで消化
し、消化ｐｘｏ −Ｉ Ｍと１．８Ｋｂ ｒｅｃ八／
八ツソマトスタチン断片１６プラスミ’ｆ、ｐＭＯＮ２
００５をＢａ、ｍＨＩで消化して得られる）をリゾート
した。得られたプラスミドは第５図に示すように両オリ
エンテーションでｒｅｃ Ａ ／ソマトスタチンが挿入
されていて、ｐＭＯＮ ２５０７およびｐＭＯＮ ２５
０８と命名された。この操作およびｐＫｏ −Ｉ Ｍの
作製は例乙に詳述する。プラスミドＴＩＩＭＯＮ ２５
０７はｇａｌＪ″−（ＭａｃＣｏｎｋｅｙ指示板に赤色
のコロニーを作る）で、これは挿入されたｒｅｃ Ａ
／ンマトスタチン遺伝子のオリエンテーションがｐＭＯ
Ｎ ２５０７中のプロモーターのないガラクトキナーゼ
遺伝子のオリエンテーションと同じことから確認された
３、フ０ラスミドｐＭＯＮ ２５ Ｄ ８は、挿入遺伝
子のオリエンテーションがガラクトキナーゼ遺伝子のオ
リエンテーションとは逆であることからｇａｌ−である
。
−Ｋ構造配列の近くのＳｍａ Ｘ切断部位を除去し、Ｅ
ｃｏＲＩ切断部位で置換することによりｐＫｏ −１を
改良して作製した。このプラスミドをＢａｍＨＩで消化
し、消化ｐｘｏ −Ｉ Ｍと１．８Ｋｂ ｒｅｃ八／
八ツソマトスタチン断片１６プラスミ’ｆ、ｐＭＯＮ２
００５をＢａ、ｍＨＩで消化して得られる）をリゾート
した。得られたプラスミドは第５図に示すように両オリ
エンテーションでｒｅｃ Ａ ／ソマトスタチンが挿入
されていて、ｐＭＯＮ ２５０７およびｐＭＯＮ ２５
０８と命名された。この操作およびｐＫｏ −Ｉ Ｍの
作製は例乙に詳述する。プラスミドＴＩＩＭＯＮ ２５
０７はｇａｌＪ″−（ＭａｃＣｏｎｋｅｙ指示板に赤色
のコロニーを作る）で、これは挿入されたｒｅｃ Ａ
／ンマトスタチン遺伝子のオリエンテーションがｐＭＯ
Ｎ ２５０７中のプロモーターのないガラクトキナーゼ
遺伝子のオリエンテーションと同じことから確認された
３、フ０ラスミドｐＭＯＮ ２５ Ｄ ８は、挿入遺伝
子のオリエンテーションがガラクトキナーゼ遺伝子のオ
リエンテーションとは逆であることからｇａｌ−である
。
多くのプラスミーについて、ｒｅｃＡ／ンマトスクチン
融合ポリペプチドの表現を試験した。結果は例７に示す
。
融合ポリペプチドの表現を試験した。結果は例７に示す
。
ソマトスタチン表現の他の方法を試験するためにさらに
６種のプラスミドを作製した。例８に記載した１組のシ
ラスミドは、４８から３３０までの範囲の数の異なるコ
ードンをもったｒｅｃ Ａコードンの構造配列をもって
いる。２６０と３３０ｒｅｃ Ａアミノ酸（それと１４
個のンマトスタチンアミノ酸）をもった融合ポリペブチ
Ｐが高レベルに表現され、一方４８個のｒｅｃ Ａアミ
ジ酸をもった融合ポリペブチ１では表現のレベルががな
り低ドすることが明らかにされた。これらの結果に基い
て、かなり長い内因性ボリペフ０チド（約１５０個また
はそれ以上のアミノ酸残基）がキャリアーポリペフ０チ
ドとして短い内因性ポリペプチドより好ましいと考えら
れる。特定の異種ポリペプチドを表現するための特定の
キャリャーポリペブチ１の好ましい長さは本技術分野の
熟練者は通常の実験に基づいて決定できるものである。
６種のプラスミドを作製した。例８に記載した１組のシ
ラスミドは、４８から３３０までの範囲の数の異なるコ
ードンをもったｒｅｃ Ａコードンの構造配列をもって
いる。２６０と３３０ｒｅｃ Ａアミノ酸（それと１４
個のンマトスタチンアミノ酸）をもった融合ポリペブチ
Ｐが高レベルに表現され、一方４８個のｒｅｃ Ａアミ
ジ酸をもった融合ポリペブチ１では表現のレベルががな
り低ドすることが明らかにされた。これらの結果に基い
て、かなり長い内因性ボリペフ０チド（約１５０個また
はそれ以上のアミノ酸残基）がキャリアーポリペフ０チ
ドとして短い内因性ポリペプチドより好ましいと考えら
れる。特定の異種ポリペプチドを表現するための特定の
キャリャーポリペブチ１の好ましい長さは本技術分野の
熟練者は通常の実験に基づいて決定できるものである。
例９に述べた第２組のプラスミドはソマトスタチン構造
配列がβ−ｇａｌ遺伝子（誘発）０ロモーター、翻訳開
始コードンおよび各種の長さのβ−ｇａｌコーＶンヲ含
ム）とクロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼ（ＣＡＴ ）遺伝子に融合したキメラ遺伝子を含有す
る。これらのプラスミＶはβ−ｇａｌ／ソマトスタチン
融合ポリペプチドが低レベルでしか表現されないことを
示している。これらのデラスミｖによる表現レベルはｒ
ｅｃ Ａ ／ソマトスタチンポリペブチｒで得られた表
現よりも明らかに低レベルであった。さうＫ、ＣＡＴ／
７７トスクチンの表現はいかに努力しても検出されなか
った。
配列がβ−ｇａｌ遺伝子（誘発）０ロモーター、翻訳開
始コードンおよび各種の長さのβ−ｇａｌコーＶンヲ含
ム）とクロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼ（ＣＡＴ ）遺伝子に融合したキメラ遺伝子を含有す
る。これらのプラスミＶはβ−ｇａｌ／ソマトスタチン
融合ポリペプチドが低レベルでしか表現されないことを
示している。これらのデラスミｖによる表現レベルはｒ
ｅｃ Ａ ／ソマトスタチンポリペブチｒで得られた表
現よりも明らかに低レベルであった。さうＫ、ＣＡＴ／
７７トスクチンの表現はいかに努力しても検出されなか
った。
例１０に述べた第３組のデラスミＩ：ハｒｅｃ Ａ ｙ
’” −夕ｚ ｒｅＣＡ構造配列の部分、およびソマ
トスタチンの各種類縁体の構造配列でソマトスタチンの
アミノ酸配列とは異なるアミノ酸に翻訳さレルコードン
をもっキメラ遺伝子を宮む。ソマトスタチンの他の生物
学的機能類縁体およびこの種の類縁体の製造方法につい
ては本技術分野の熟練者には公知である。たとえば米国
特許第づ、９０４，５９４号（Ｇｕｉｌｅｍｉｃら、１
９７５）、第４，２６１．８８５号（５ａｋａｋ、１ｂ
ａｒａら、１９８１ ）、第４．３０２，３８６号（５
ｔｅＶｅｎｓら、１９８１）、第４．０６１，０６７号
（５ｈｉｅｌｄｓ、 １９７７ ）、第４．０６１，６
０８号（５ａｒａｎｔａｋｉｓ、 １９７７ ）、第４
．１４６，６１２号（’ ｖｅｂｅｒ、 １９７９ ）
、第４．１８９，４２６号（Ｌｌ、１９８０）および第
４．３１６，８９１号ＣＢｏｈｌｅｎら、１９８２）に
記載されている。この釉の類縁体は本発明の方法におけ
るｒｅＣＡプロモーター／オペレーター領域を用い、こ
れを本発明技術分野の熟練者には公知の他の方法および
物質を組み合わせて製造できる。
’” −夕ｚ ｒｅＣＡ構造配列の部分、およびソマ
トスタチンの各種類縁体の構造配列でソマトスタチンの
アミノ酸配列とは異なるアミノ酸に翻訳さレルコードン
をもっキメラ遺伝子を宮む。ソマトスタチンの他の生物
学的機能類縁体およびこの種の類縁体の製造方法につい
ては本技術分野の熟練者には公知である。たとえば米国
特許第づ、９０４，５９４号（Ｇｕｉｌｅｍｉｃら、１
９７５）、第４，２６１．８８５号（５ａｋａｋ、１ｂ
ａｒａら、１９８１ ）、第４．３０２，３８６号（５
ｔｅＶｅｎｓら、１９８１）、第４．０６１，０６７号
（５ｈｉｅｌｄｓ、 １９７７ ）、第４．０６１，６
０８号（５ａｒａｎｔａｋｉｓ、 １９７７ ）、第４
．１４６，６１２号（’ ｖｅｂｅｒ、 １９７９ ）
、第４．１８９，４２６号（Ｌｌ、１９８０）および第
４．３１６，８９１号ＣＢｏｈｌｅｎら、１９８２）に
記載されている。この釉の類縁体は本発明の方法におけ
るｒｅＣＡプロモーター／オペレーター領域を用い、こ
れを本発明技術分野の熟練者には公知の他の方法および
物質を組み合わせて製造できる。
本明細書に述べたキメラｒｅｃ Ａ ／ンマトスタチン
遺伝子、および他の遺伝子に用いられるｒｅｃ Ａ／プ
ロモーター／オペレーター系は各種の宿主細胞に応用す
るのに適している。適当な宿主細胞としてＡｍｅｒｉｃ
ａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕ、ｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉ
ｏｎ（ＡＴＣＣ）。
遺伝子、および他の遺伝子に用いられるｒｅｃ Ａ／プ
ロモーター／オペレーター系は各種の宿主細胞に応用す
るのに適している。適当な宿主細胞としてＡｍｅｒｉｃ
ａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕ、ｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉ
ｏｎ（ＡＴＣＣ）。
Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、 ＭａｒｙｌａｎｄにＡＴＣＣ寄
託番号第１３７０６号としてを此され、利用できる肌ｃ
Ｏｌ ｉ菌株Ｃがある。そのほか、ＡＴＣＣ寄託番号
第３１４４６号のＥ、ｃｏｌｉ Ｋ −１２菌株２９４
も宿主バクテリアとして適当である。ｒｅｃ Ａおよび
ｒｅｘ Ａポリペプチドの両者がｒｅｃ Ａプロモータ
ーの抑制および誘発に関与しているので、適当な宿主細
胞はｒｅｃ Ａ陽性でかっｒｅｘＡ陽性でなければなら
ない。
託番号第１３７０６号としてを此され、利用できる肌ｃ
Ｏｌ ｉ菌株Ｃがある。そのほか、ＡＴＣＣ寄託番号
第３１４４６号のＥ、ｃｏｌｉ Ｋ −１２菌株２９４
も宿主バクテリアとして適当である。ｒｅｃ Ａおよび
ｒｅｘ Ａポリペプチドの両者がｒｅｃ Ａプロモータ
ーの抑制および誘発に関与しているので、適当な宿主細
胞はｒｅｃ Ａ陽性でかっｒｅｘＡ陽性でなければなら
ない。
ｒｅｃＡ７°ロモーター／オペレーター系およびその系
を使用するキメラ遺伝子の宿主細胞として適当なバクテ
リアはほかにも広範にある。たとえばＥ、 ｃｏｌｉの
ｒｅｃ Ａ遺伝子はｐｒｏｔｅｕｓ ｍ１ｒａｂｉ、ｌ
ｊ、ｓ中でも機能することが知られている（ Ｅｉｔｎ
ｅｒら：Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、＋ １８５
： ４８１．１９８２参照）。本発明の宿主細胞として
有用な他のバクテリアとしてＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉａｃｅａｌ、 Ｅｒｗｉｎｉａ。
を使用するキメラ遺伝子の宿主細胞として適当なバクテ
リアはほかにも広範にある。たとえばＥ、 ｃｏｌｉの
ｒｅｃ Ａ遺伝子はｐｒｏｔｅｕｓ ｍ１ｒａｂｉ、ｌ
ｊ、ｓ中でも機能することが知られている（ Ｅｉｔｎ
ｅｒら：Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、＋ １８５
： ４８１．１９８２参照）。本発明の宿主細胞として
有用な他のバクテリアとしてＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉａｃｅａｌ、 Ｅｒｗｉｎｉａ。
Ｓｈｊｇｅｌｌａ、 ＳａｌｍｏｎｅｌｌａおよびＫｌ
ｅｂｓｉｅｌｌａ属のバクテリアを挙げることかできる
。％定の宿主細胞か本発明での使用に適しているがどう
がは、本技術分野の熟練者は通常の実験で決定できる。
ｅｂｓｉｅｌｌａ属のバクテリアを挙げることかできる
。％定の宿主細胞か本発明での使用に適しているがどう
がは、本技術分野の熟練者は通常の実験で決定できる。
ｒｅｃ Ａ ／ソマトスタナンプラスミド７）ＭＯＮ２
５Ｄ６およびｐＭ○Ｎ ２５０７を含む培養Ｅ、 ｃｏ
ｌｊ菌株に一１２ＤＢ１４４３については前述したかそ
れぞれＡＴＣＣ寄託番号第３９２１２号および第３９２
１１号として寄託され相当する性質を有する内機生物が
請求されている。本明細書において用いられる培養細胞
の「相当する性質」の語は記載された情報により開示さ
れ、示唆されまたは可能になった使用に適した性質に限
定されるものである。多くの性質が本技術分野の熟練者
に公知の技術によって改変可能であり、たとえば特定の
プラスミ１または遺伝子の挿入によって特定の抗生物質
に対する抵抗性を細胞に付与したり、またｒｅｃ Ａ
／ソマトスクチンフ０ラスミＶを指定の細胞から分離し
、異なる菌株の細胞に挿入する等の改変が考える。多く
の研究者がこれらの培養細胞を使用すればこのような変
化が起こることは倣いなく、またそれによって改良かも
たらされる場合さえ考えられるが、この種の改変は本発
明の範囲に包含されるものである。
５Ｄ６およびｐＭ○Ｎ ２５０７を含む培養Ｅ、 ｃｏ
ｌｊ菌株に一１２ＤＢ１４４３については前述したかそ
れぞれＡＴＣＣ寄託番号第３９２１２号および第３９２
１１号として寄託され相当する性質を有する内機生物が
請求されている。本明細書において用いられる培養細胞
の「相当する性質」の語は記載された情報により開示さ
れ、示唆されまたは可能になった使用に適した性質に限
定されるものである。多くの性質が本技術分野の熟練者
に公知の技術によって改変可能であり、たとえば特定の
プラスミ１または遺伝子の挿入によって特定の抗生物質
に対する抵抗性を細胞に付与したり、またｒｅｃ Ａ
／ソマトスクチンフ０ラスミＶを指定の細胞から分離し
、異なる菌株の細胞に挿入する等の改変が考える。多く
の研究者がこれらの培養細胞を使用すればこのような変
化が起こることは倣いなく、またそれによって改良かも
たらされる場合さえ考えられるが、この種の改変は本発
明の範囲に包含されるものである。
ｒｅｃ Ａ ／オペレークー領域しま、本技術分野の熟
練者には公知で容易に利用できる方法および物質を用い
、１柚または２種以上のＩｊｌｊ御または他の遺伝子か
ら選択された構造配列を抱合させて使用することも可能
である。たとえば（１） ｒｅｃ Ａプロモーター／オ
ペレーター領域、（２）第２の遺伝子、たとえば５ｃｈ
ｅｒｅｒら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、、
８（１７） ：ろ８９５，１９８０）によって記載さ
れたＥ、ｃｏ］、ｉコンセンサス配列に由来する５′非
翻訳領域、（３）開始コードンと、たとえば酵素の所望
の性質を損わないでカルボキシ末端を改変できる選択可
能なまたは染色体標識酵素からとり出した部分暗号配列
、（４）ソマトスタチンに結合させるキャリヤーポリペ
ブチドの暗号である配列のような所望の構造配列、（５
）所望の遺伝子からのダ非翻訳領域および（６）所望に
より転写ターミネータ−からなるキメラ遺伝子を作製す
ることも可能である。
練者には公知で容易に利用できる方法および物質を用い
、１柚または２種以上のＩｊｌｊ御または他の遺伝子か
ら選択された構造配列を抱合させて使用することも可能
である。たとえば（１） ｒｅｃ Ａプロモーター／オ
ペレーター領域、（２）第２の遺伝子、たとえば５ｃｈ
ｅｒｅｒら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、、
８（１７） ：ろ８９５，１９８０）によって記載さ
れたＥ、ｃｏ］、ｉコンセンサス配列に由来する５′非
翻訳領域、（３）開始コードンと、たとえば酵素の所望
の性質を損わないでカルボキシ末端を改変できる選択可
能なまたは染色体標識酵素からとり出した部分暗号配列
、（４）ソマトスタチンに結合させるキャリヤーポリペ
ブチドの暗号である配列のような所望の構造配列、（５
）所望の遺伝子からのダ非翻訳領域および（６）所望に
より転写ターミネータ−からなるキメラ遺伝子を作製す
ることも可能である。
さらに異オルポリペプチドとキャリヤーポリペブチげの
相対位置を改変することも可能である。たとえばソマト
スタチン配列をアミン末端の近くにまたは２個のキャリ
ヤー断片の間に融合含有するような暗号の構造配列は本
技術分野の熟練者には公知の方法を用いて作製できる。
相対位置を改変することも可能である。たとえばソマト
スタチン配列をアミン末端の近くにまたは２個のキャリ
ヤー断片の間に融合含有するような暗号の構造配列は本
技術分野の熟練者には公知の方法を用いて作製できる。
この種の構造配列は本発明の方法を用いて、’ｒｅｃＡ
プロモーター／オペレーター領域の制御ＦＫ置くことが
できる。
プロモーター／オペレーター領域の制御ＦＫ置くことが
できる。
本発明は融合ポリペプチドの裏布に限定されない。本発
明の方法により、異種＆ リペプチｒの全暗号配列をそ
の開始および停止コードンとともにｒｅｃ Ａ、 ７°
ロモーター／オペレーター領域の制御下に置くことがで
きる。この棟の遺伝子によって／々クチリア細胞内で表
現されるポリペプチドに′！、本発明の範囲内に包含さ
れる。
明の方法により、異種＆ リペプチｒの全暗号配列をそ
の開始および停止コードンとともにｒｅｃ Ａ、 ７°
ロモーター／オペレーター領域の制御下に置くことがで
きる。この棟の遺伝子によって／々クチリア細胞内で表
現されるポリペプチドに′！、本発明の範囲内に包含さ
れる。
本明細１で用いたｒｒｅｃＡプロモーター／オペレータ
ー領域１Ｉ（ｒｅＣＡプロモーターまたｒｅＣＡ系とも
呼ぶ）の語は一連の塩基、（１）前出のＨｏｒｉｉらお
よび／または５ａｎｃａｒらの文献に記載されたと実質
的に同一の塩基、または（２） ｒｅｃ Ａ構造配列の
上流近位にあるプロモーター領域からＥ、 ｃｏｌｉ細
胞内で誘導された塩基またはその部分もしＱ主突然変異
誘導体で、適当な宿主細胞中にお〜・て１種または２種
以上の適当な薬剤たとえばナルジキシ酸、マイトマイシ
ンＣ１あるいは紫外線照射、高温またはチミン飢餓の存
在下にＤ Ｎ Ａの近位分節の転写促進能を示す一連の
塩基を有するＤＮＡまた（′！。
ー領域１Ｉ（ｒｅＣＡプロモーターまたｒｅＣＡ系とも
呼ぶ）の語は一連の塩基、（１）前出のＨｏｒｉｉらお
よび／または５ａｎｃａｒらの文献に記載されたと実質
的に同一の塩基、または（２） ｒｅｃ Ａ構造配列の
上流近位にあるプロモーター領域からＥ、 ｃｏｌｉ細
胞内で誘導された塩基またはその部分もしＱ主突然変異
誘導体で、適当な宿主細胞中にお〜・て１種または２種
以上の適当な薬剤たとえばナルジキシ酸、マイトマイシ
ンＣ１あるいは紫外線照射、高温またはチミン飢餓の存
在下にＤ Ｎ Ａの近位分節の転写促進能を示す一連の
塩基を有するＤＮＡまた（′！。
ＲＮ Ａの単一鎖または二重鎖分節と定義できる。イ吏
用時の要求に応じてｒｅＣ八プへモーター（１５′非翻
訳領域および／またはｒｅｃ’ Ａ遺伝子もしくは他の
任意の所望の遺伝子から誘導される翻訳開始コーデンを
もっていてもよい。ｒｅＣＡ〕０ロモーター系は、公に
オリ用できるデラスミｖと複製、公知σつ方法によるＥ
、ｃｏ］、ｉ細胞からのｒｅｃ Ａ遺伝子の単離、また
は発表されている配列に基づくポリヌクレオチ１合成を
含めた各種の方法で得られる。
用時の要求に応じてｒｅＣ八プへモーター（１５′非翻
訳領域および／またはｒｅｃ’ Ａ遺伝子もしくは他の
任意の所望の遺伝子から誘導される翻訳開始コーデンを
もっていてもよい。ｒｅＣＡ〕０ロモーター系は、公に
オリ用できるデラスミｖと複製、公知σつ方法によるＥ
、ｃｏ］、ｉ細胞からのｒｅｃ Ａ遺伝子の単離、また
は発表されている配列に基づくポリヌクレオチ１合成を
含めた各種の方法で得られる。
異種ポリペプチド、ｒｅＣＡゾロモークー／オペレータ
ーおよび本明細徊において使用されたその他の飴につい
てさらに情報および説明が望まれろ場合は本分野で認め
られている参考書および総説、たとえばＷａｔｓｏｎ
： Ｔｈｅ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂｊ、ｏｌｏ、ｑｙ
ｏｆｔｈｅ Ｇｅｎｅ、 ３版（Ｗ、 Ａ、 Ｂｅｎ
ｊａｍｉ、ｎ、 Ｉｎｃ、＋１ ９ ７ ６ ）
、 Ｒ，Ｅ、 （）ｌａＳｓ ： （）
ｅｎｅ Ｆ’ｕｎｃｔｉｏｎ ：Ｅ、 Ｃｏ１１
ａｎｄ ｉｔｓ ｈｅｒｉｔａｂｌｅ ｅｌｅｍｅｎ
ｔ、ｓ （Ｕ、Ｃａ１ｉｆ。
ーおよび本明細徊において使用されたその他の飴につい
てさらに情報および説明が望まれろ場合は本分野で認め
られている参考書および総説、たとえばＷａｔｓｏｎ
： Ｔｈｅ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂｊ、ｏｌｏ、ｑｙ
ｏｆｔｈｅ Ｇｅｎｅ、 ３版（Ｗ、 Ａ、 Ｂｅｎ
ｊａｍｉ、ｎ、 Ｉｎｃ、＋１ ９ ７ ６ ）
、 Ｒ，Ｅ、 （）ｌａＳｓ ： （）
ｅｎｅ Ｆ’ｕｎｃｔｉｏｎ ：Ｅ、 Ｃｏ１１
ａｎｄ ｉｔｓ ｈｅｒｉｔａｂｌｅ ｅｌｅｍｅｎ
ｔ、ｓ （Ｕ、Ｃａ１ｉｆ。
Ｐｒｅｓｓ、 １９８２ ）および前出のＭｉｌｌ’
ｅｒ ＆Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆの著書を参照されたし・。
ｅｒ ＆Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆの著書を参照されたし・。
他にも広範囲の異種ポリペプチド、たとえ（子インシュ
リンＡおよびＢ鎖、成長ホルモノ、インターフェロン、
血清アルブミンおよび他の血液タンバク、エンドルフィ
ンおよび他の神経ペプチド、チモシンα 、アンギオテ
ンシン■、プラジキニン、ノイロテンシン、メラノサイ
ト阻止因子（ＭＩＦ）、メラノサイト刺激因子（ＭＳＦ
）、副甲状腺ホルモン、サイロトロピン放出ホルモン
（ＴＲＨ）、黄体ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、
ならびに（Ｔｙｒ）、（Ｔｙｒｌｌ ）、（Ａｄａ ５
）および（Ｖａ１１′。）類縁体ようなソマトスタチ
ン類縁体などを、本発明の方法にしたがい、本明細書に
記述した方法により、また本技術分野の熟練者に公知の
他の方法を組み合わせて、ｒｅｃ Ａプロモーター／オ
ペレーター領域を使用しバクテリアによって表現させる
ことができる。
リンＡおよびＢ鎖、成長ホルモノ、インターフェロン、
血清アルブミンおよび他の血液タンバク、エンドルフィ
ンおよび他の神経ペプチド、チモシンα 、アンギオテ
ンシン■、プラジキニン、ノイロテンシン、メラノサイ
ト阻止因子（ＭＩＦ）、メラノサイト刺激因子（ＭＳＦ
）、副甲状腺ホルモン、サイロトロピン放出ホルモン
（ＴＲＨ）、黄体ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、
ならびに（Ｔｙｒ）、（Ｔｙｒｌｌ ）、（Ａｄａ ５
）および（Ｖａ１１′。）類縁体ようなソマトスタチ
ン類縁体などを、本発明の方法にしたがい、本明細書に
記述した方法により、また本技術分野の熟練者に公知の
他の方法を組み合わせて、ｒｅｃ Ａプロモーター／オ
ペレーター領域を使用しバクテリアによって表現させる
ことができる。
例１
材料と操作
制限エンドヌクレアーゼはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｃｌ
Ｂｌｏ−１ａｂｓ、 Ｉｎｃ、、 Ｂｅｖｅｒｌｙ、
Ｍａｓｓ、およびＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｌｅｓ、 Ｒｏｃｋｖｌｌｌｅ、
Ｍｄ、から購入した。
Ｂｌｏ−１ａｂｓ、 Ｉｎｃ、、 Ｂｅｖｅｒｌｙ、
Ｍａｓｓ、およびＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｌｅｓ、 Ｒｏｃｋｖｌｌｌｅ、
Ｍｄ、から購入した。
オリゴヌクレオチドリンカーはＣｏ１１ａ、ｂｏｒａｔ
：ｉ、ｖｅＲｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ、、 Ｗａｌｔｈ
ａｍ、 Ｍａｓｓ、から購入した。
：ｉ、ｖｅＲｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ、、 Ｗａｌｔｈ
ａｍ、 Ｍａｓｓ、から購入した。
バクテリオファージＴ、 ＤＮＡポリメラーゼはＣ２Ｆ
、 ＭｏｒｒｉｓおよびＮ、 Ｋ、 ５ｉｎｈａから恵
与された。
、 ＭｏｒｒｉｓおよびＮ、 Ｋ、 ５ｉｎｈａから恵
与された。
その製法はＭＯｒｒｉＳら： Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｊ、。
Ａｃａｄ、 Ｓｃｊ、。
ＵＳＡ、２５４：６７８７−６７９６＜１９７９）に記
載されている。
載されている。
バクテリオファージＴ４ＤＮＡりが−ゼはＭｕｒｒｙら
の方法（Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、、 １３２ ：
４９３−５０５゜１９７９）にほぼ従って製造した。
の方法（Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、、 １３２ ：
４９３−５０５゜１９７９）にほぼ従って製造した。
プラスミドｐＢＲ３２７（５ｏｂｅｒｏｎら’、 Ｇｅ
ｎｅ＋９：２８７−３０５．１９８０）はＭｅｘｉ ｃ
ｏ犬学のＰａｃｏ Ｂｏｌｉｖａｒ 博士から入手し
た。これは研究室で一般に使用されるプラスミドで、Ｅ
、ｃｏｌｉレプリコン、アンピシリン（Ａｐ）およびテ
トラサイクリン（Ｔｃ）抵抗性遺伝子と多くの独特の切
断部位を有する。
ｎｅ＋９：２８７−３０５．１９８０）はＭｅｘｉ ｃ
ｏ犬学のＰａｃｏ Ｂｏｌｉｖａｒ 博士から入手し
た。これは研究室で一般に使用されるプラスミドで、Ｅ
、ｃｏｌｉレプリコン、アンピシリン（Ａｐ）およびテ
トラサイクリン（Ｔｃ）抵抗性遺伝子と多くの独特の切
断部位を有する。
６種の他のプラスミげ（＋）ＤＲ１４５ろ、ｐＭＯＢ４
５およびｐＫｏ −１）はその他の外部から入手したが
、以下の例中に記述する。その他の多くのプラスミドや
宿主細胞は種々の起源のものを入手したが、第２表に示
した。とくに記載のない限り１、Ｂ、ｃｏｌ−ｉはすべ
ｒｅｃ Ａ＋およびｒｅｘＡ＋である。
５およびｐＫｏ −１）はその他の外部から入手したが
、以下の例中に記述する。その他の多くのプラスミドや
宿主細胞は種々の起源のものを入手したが、第２表に示
した。とくに記載のない限り１、Ｂ、ｃｏｌ−ｉはすべ
ｒｅｃ Ａ＋およびｒｅｘＡ＋である。
第２表
Ｅ、 ｃｏｌｉ、 ＪＭｌｏｌ （Ｊ、Ｍｅｓｓｉｎｇ
ら： （／ａｃ 、Ｐｒｏ ）。
ら： （／ａｃ 、Ｐｒｏ ）。
Ｎｕｃｌ＋〕ｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、９：５０９＋
Ｆ”６ａｃｌＱＺＭ１５゜１９８１ ）
ｔｒａＤ 、ｐｒ
ｏＣ＋Ｅ、 ｃｏｌｉ、 Ｉ）１３１４４３ （ＡＴＣ
Ｃ＃ ｃ６００ 、ｈｓｄＲ３９２１１としてｐＭ
ＯＮ ２０５７と寄託）Ｅ、 ｃｏｌｌ、 Ｎ Ｉ Ｄ
ＤＫ−（Ｎ工ｓのＭ、 ｒｅｃＡ 、ｇａ
ｌｌＫ−Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇから入手） Ｅ、 ｃｏｉｉ 、 １ｔ １８２ （Ｍ、 Ｃａ５ａ
ｄａｂａｎ （Ａａｃ ＩＰＯＺＹ ）Ｘ７４１
ら：Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏ１．，１３８：１７９．１９８
０） ｇａｌＫ、ｇａｌＵ、５ｔｒＡＥ、ｃｏｌｉ、５
Ｒ２（たとえばＣ，Ｙａｎｏｆｓｋｙ ＹｍｅｌＳｕ
ｐ Ｆら：Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏ１．２１：３１３．１９
６６）Ｅ、ｃｏ１ｊ２９４（ＡＴＣＣ＃５１４４６）
ｅｎｄＡ、ｔｈｉ、ｈｓｒ。
Ｆ”６ａｃｌＱＺＭ１５゜１９８１ ）
ｔｒａＤ 、ｐｒ
ｏＣ＋Ｅ、 ｃｏｌｉ、 Ｉ）１３１４４３ （ＡＴＣ
Ｃ＃ ｃ６００ 、ｈｓｄＲ３９２１１としてｐＭ
ＯＮ ２０５７と寄託）Ｅ、 ｃｏｌｌ、 Ｎ Ｉ Ｄ
ＤＫ−（Ｎ工ｓのＭ、 ｒｅｃＡ 、ｇａ
ｌｌＫ−Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇから入手） Ｅ、 ｃｏｉｉ 、 １ｔ １８２ （Ｍ、 Ｃａ５ａ
ｄａｂａｎ （Ａａｃ ＩＰＯＺＹ ）Ｘ７４１
ら：Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏ１．，１３８：１７９．１９８
０） ｇａｌＫ、ｇａｌＵ、５ｔｒＡＥ、ｃｏｌｉ、５
Ｒ２（たとえばＣ，Ｙａｎｏｆｓｋｙ ＹｍｅｌＳｕ
ｐ Ｆら：Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏ１．２１：３１３．１９
６６）Ｅ、ｃｏ１ｊ２９４（ＡＴＣＣ＃５１４４６）
ｅｎｄＡ、ｔｈｉ、ｈｓｒ。
ｈｓｍ十著しく形質転換性
ベクター／プラスミド
Ｍ １３ ｍｐ８ （Ｊ 、 Ｍｅｓｓｉｎｇ ： Ｔ
ｈ１ｒｄ ７ａｃオペロンの変換Ｃ１ｅｖｅｌ
ａｎｄ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ 分節
含有Ｍ１３Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ：Ｒｅｃｏ
ｍｂｉｎａｎｔＤＮＡ、 ｅｄ、Ａ、Ｗａｌｔｏｎ、Ｅ
ｌｓｅｖｉｅｒ。
ｈ１ｒｄ ７ａｃオペロンの変換Ｃ１ｅｖｅｌ
ａｎｄ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ 分節
含有Ｍ１３Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ：Ｒｅｃｏ
ｍｂｉｎａｎｔＤＮＡ、 ｅｄ、Ａ、Ｗａｌｔｏｎ、Ｅ
ｌｓｅｖｉｅｒ。
Ａ、ｍｓｔｅｒｄａｍ、 ｐｐ １４３−１５３．１９
８１ ）λｐｌａｃ ５ （Ｊ 、 Ｍｉ １ｌｅｒ
： Ｅｘｐｅｒ ｉｍｅｎｔｓ β−ガラクトシダー
ゼｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ｔ）ｅｎｅｔｉｃｓ、
Ｃｏ１ｄ プロモーター、オペレＳｐｒｉｎｇＨａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｓ、 １９７２） −ターお
よび構造遺伝子含有特殊化λ−形質導 入ファージ ２ＸＹＴ培地とＬｕｒｉａアガールをＭｉｌｌｅｒの方
法（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、 ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ。
８１ ）λｐｌａｃ ５ （Ｊ 、 Ｍｉ １ｌｅｒ
： Ｅｘｐｅｒ ｉｍｅｎｔｓ β−ガラクトシダー
ゼｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ｔ）ｅｎｅｔｉｃｓ、
Ｃｏ１ｄ プロモーター、オペレＳｐｒｉｎｇＨａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｓ、 １９７２） −ターお
よび構造遺伝子含有特殊化λ−形質導 入ファージ ２ＸＹＴ培地とＬｕｒｉａアガールをＭｉｌｌｅｒの方
法（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、 ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ。
Ｎ、Ｙ、、 ｐｐ ４３１−４３５． １９７２ ）
に従って製造し、必要によりアンピシリン（２００μ７
肩）、テトラサイタリン（１０ｐ９／ｍｅ ）またはク
ロラム７Ｘ二Ｄ−／ｌ／ （１００μｙ７ｍ１．）を添
刀口した。
に従って製造し、必要によりアンピシリン（２００μ７
肩）、テトラサイタリン（１０ｐ９／ｍｅ ）またはク
ロラム７Ｘ二Ｄ−／ｌ／ （１００μｙ７ｍ１．）を添
刀口した。
Ｇａ１ａｃｔｏｓｅ ＭａｃＣｏｎｋｅｙアガールはＤ
ｉｆｃｏ乾燥ＭａｃＣｏｎｋｅｙアガールから調製し、
ついでアンピシリン（２００ｐ？／ｍｌ ）を加えた。
ｉｆｃｏ乾燥ＭａｃＣｏｎｋｅｙアガールから調製し、
ついでアンピシリン（２００ｐ？／ｍｌ ）を加えた。
ＨＯｒＯＷｉＣＺおよびＢｕｒｋｅ （Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、。
Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、。
９：２９８９−２９９８．１９８１ ）のアルカリミニ
スクリーン法を用いて少量のＤＮＡを製造した。
スクリーン法を用いて少量のＤＮＡを製造した。
大量のＤＮＡは改良アルカリ分解（Ｈｏｒｏｗｉｃｚ
およびＢｕｒｋｅの前出文献参照）で製造し、ついで
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーに付した（
Ｃｏｌｅｍａｎら： Ｅｕｒ、 Ｊ、 Ｂｉｏｃｂｅｍ
、、 ９１ ：ろＣ６−３１０，１９７８参照）。限定
消化によって生成したＤＮＡ断片をアガロースまたはポ
リアクリルアミドダル中、 トリス−アセテート（Ｈａ
ｙｗａｒｄ ＆Ｓｍ１ｔｈ ：Ｊ、Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ
、、６３ ： ３８５−３９５゜１９７２）またはト
リスボレート緩衝系（Ｍａｎｉａｔｉｓら：Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、 １４：３７８７−３７９４゜１９７５）のい
ずれかを用いて分離した。ＤＮＡ断片の大きさは、ファ
ージ ＤＮＡ Ｏ） Ｈｉｎｄ ＩＩＩ制限断片および
二重鎖φＸ １７４ ＤＮＡのＨａｅｌｌｌ制限断片の
可動性に基ついて計測した。純粋な断片は１：５希釈電
気泳動緩衝液に潰した透析袋中にｒルスライスからＤＮ
Ａを電気溶出させて、ゲルから回収した。
およびＢｕｒｋｅの前出文献参照）で製造し、ついで
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーに付した（
Ｃｏｌｅｍａｎら： Ｅｕｒ、 Ｊ、 Ｂｉｏｃｂｅｍ
、、 ９１ ：ろＣ６−３１０，１９７８参照）。限定
消化によって生成したＤＮＡ断片をアガロースまたはポ
リアクリルアミドダル中、 トリス−アセテート（Ｈａ
ｙｗａｒｄ ＆Ｓｍ１ｔｈ ：Ｊ、Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ
、、６３ ： ３８５−３９５゜１９７２）またはト
リスボレート緩衝系（Ｍａｎｉａｔｉｓら：Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、 １４：３７８７−３７９４゜１９７５）のい
ずれかを用いて分離した。ＤＮＡ断片の大きさは、ファ
ージ ＤＮＡ Ｏ） Ｈｉｎｄ ＩＩＩ制限断片および
二重鎖φＸ １７４ ＤＮＡのＨａｅｌｌｌ制限断片の
可動性に基ついて計測した。純粋な断片は１：５希釈電
気泳動緩衝液に潰した透析袋中にｒルスライスからＤＮ
Ａを電気溶出させて、ゲルから回収した。
制限消化はＨ５０緩衝液（６−６ｍＭトリス−ＨＣＪ、
、ｐＨ８，０，６，６ｍＭ Ｍｇ（４２，５０ｍＭ Ｎ
ａ（Ｊ、 ５ｍＭ ジチオスレイトール）中、６７℃
で、インキュベーション時間の半分で完全な消化が起こ
るだけの酵素により実施した。１〜５μ２０ベクターＤ
ＮＡをクロマトグラフィーでＮ製したウシ腸アルカリホ
スファターゼ（ＣＡＰ ） ０．２単位で、Ｅｆｓｔｒ
ａｔｉａｄｉｓらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ
Ｒｅｓ、。
、ｐＨ８，０，６，６ｍＭ Ｍｇ（４２，５０ｍＭ Ｎ
ａ（Ｊ、 ５ｍＭ ジチオスレイトール）中、６７℃
で、インキュベーション時間の半分で完全な消化が起こ
るだけの酵素により実施した。１〜５μ２０ベクターＤ
ＮＡをクロマトグラフィーでＮ製したウシ腸アルカリホ
スファターゼ（ＣＡＰ ） ０．２単位で、Ｅｆｓｔｒ
ａｔｉａｄｉｓらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ
Ｒｅｓ、。
４：４１６５−４１７４．１９７７）に従い、６７°Ｃ
で３０分処理して制限消化した。７０’Ｏで３０分イン
キュベートしてホスファターゼ活性を消失させ、ついで
エタノールで沈殿させた。ＣＡＰを用いない場合、エン
ドヌクレアーゼは５分間７０℃でインキュベートした。
で３０分処理して制限消化した。７０’Ｏで３０分イン
キュベートしてホスファターゼ活性を消失させ、ついで
エタノールで沈殿させた。ＣＡＰを用いない場合、エン
ドヌクレアーゼは５分間７０℃でインキュベートした。
結合端から平滑端へのヌクレオチＶの飽加は１００μＭ
のｄＡＴＰ 、、 ｄＧＴＰ 、 ｄｃＴＰおよびｄＴ
ＴＰ と１００倍過剰のＴ４ＤＮＡポリメラーゼを補充
したＨ５０緩衝液中３７°ＣでＤＮＡをインキュベート
した。ＤＮＡのりガーゼ処理は２５ ｍＭ トリス−Ｈ
（４（ｐｔ（８，０）、１０ ｍＭ ＭｇＣＪｌｐ、１
０ ｍＭ ジチオスレイトール、０．２ｍｕ スペル
ミジントリクロリド、５００μＭ ＡＴＰ中、室温で、
処理可能な全末端の９５チを共有結合に変換できる量の
酵素によって実施例 Ｅ、 ｃｏｌｉ ＪＭ Ｉ Ｄ １のＭ １３ ＤＮＡ
との形質転換はｃｏｈｅｎらの方法（Ｐｒｏｃ、 Ｎａ
ｔｌ、 Ａｃａｄ、、 Ｓｃｉ、。
のｄＡＴＰ 、、 ｄＧＴＰ 、 ｄｃＴＰおよびｄＴ
ＴＰ と１００倍過剰のＴ４ＤＮＡポリメラーゼを補充
したＨ５０緩衝液中３７°ＣでＤＮＡをインキュベート
した。ＤＮＡのりガーゼ処理は２５ ｍＭ トリス−Ｈ
（４（ｐｔ（８，０）、１０ ｍＭ ＭｇＣＪｌｐ、１
０ ｍＭ ジチオスレイトール、０．２ｍｕ スペル
ミジントリクロリド、５００μＭ ＡＴＰ中、室温で、
処理可能な全末端の９５チを共有結合に変換できる量の
酵素によって実施例 Ｅ、 ｃｏｌｉ ＪＭ Ｉ Ｄ １のＭ １３ ＤＮＡ
との形質転換はｃｏｈｅｎらの方法（Ｐｒｏｃ、 Ｎａ
ｔｌ、 Ａｃａｄ、、 Ｓｃｉ、。
ＵＳＡ、６９：２１１Ｄ−２１１４，１９７２）に従っ
てＣａＣｆ２／熱シヨツク法を用いて行った。他のすべ
ての形質転換はＨａｎａｈａｎの細胞形質転換操作（Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 ｐｐ ２５４−
２５５ 。
てＣａＣｆ２／熱シヨツク法を用いて行った。他のすべ
ての形質転換はＨａｎａｈａｎの細胞形質転換操作（Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 ｐｐ ２５４−
２５５ 。
Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ、 １９８２ ）に実施例 ポリペブチ１の分析には遠心分離によって１−の細胞サ
ンプルを収穫し、５０ ｍＭ トｌｌス−Ｈ（Ｊ（ｐＨ
８，ＯＬ、 １００ ｍＭＮａＣＪの１ｍｌで洗浄し
、７０係だ酸１−中シアノデンプロミｈ” ５ ｍｙ
／−とともに再懸濁した。シアノデンプロミドによる切
断（ポリペブチ１をメチオニン残基で切断する）は−夜
室温で進行させた。サンプルを凍結乾燥し、ついで放射
免疫法（ＲＩＡ ）で定量した。
ｔｏｒｙ、 １９８２ ）に実施例 ポリペブチ１の分析には遠心分離によって１−の細胞サ
ンプルを収穫し、５０ ｍＭ トｌｌス−Ｈ（Ｊ（ｐＨ
８，ＯＬ、 １００ ｍＭＮａＣＪの１ｍｌで洗浄し
、７０係だ酸１−中シアノデンプロミｈ” ５ ｍｙ
／−とともに再懸濁した。シアノデンプロミドによる切
断（ポリペブチ１をメチオニン残基で切断する）は−夜
室温で進行させた。サンプルを凍結乾燥し、ついで放射
免疫法（ＲＩＡ ）で定量した。
Ｔｙｒ−ツマスタチンは工１２５でヨード化した。
ｌ１２５− ｔｙｒｌ−８３はＰａｔｅｌとＲｅ１ｃｈ
ｌｉｎの方法（，１ｖｉｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｈｏｒ
ｍｏｎｅ ＲＩＡ、ｅｄ、Ｊａｆｆｅ ａｎｄＢｅ
ｈｒｍｅｎ、 Ａｃａａｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、 Ｎ、
Ｙ、＋ １９７９ ）に従って精製した。各ヨード化
とも２．５μ２のｔｙｒｌ−８Ｓ ｆ ｉ ｍＣｉのＮ
ａ１１２５（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏ、、 ＩＩＩ ）
と反応させ、５ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ −２５（極微末）
カラムを通過させた。ｔｙｒｌ−８Ｓのモノヨード化型
に相当する分画を集め、−２０’Ｃに保存した。この物
質はンマトスクチン抗体への結合能を６週後まで保持し
た。
ｌｉｎの方法（，１ｖｉｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｈｏｒ
ｍｏｎｅ ＲＩＡ、ｅｄ、Ｊａｆｆｅ ａｎｄＢｅ
ｈｒｍｅｎ、 Ａｃａａｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、 Ｎ、
Ｙ、＋ １９７９ ）に従って精製した。各ヨード化
とも２．５μ２のｔｙｒｌ−８Ｓ ｆ ｉ ｍＣｉのＮ
ａ１１２５（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏ、、 ＩＩＩ ）
と反応させ、５ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ −２５（極微末）
カラムを通過させた。ｔｙｒｌ−８Ｓのモノヨード化型
に相当する分画を集め、−２０’Ｃに保存した。この物
質はンマトスクチン抗体への結合能を６週後まで保持し
た。
ソマトスタチンの競合的放射免疫定量はＩｍｍｕ−ｎｏ
ｎｕｃｌｅａｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ （Ｓｔｉｌ
ｌｗａｔｅｒ、Ｍｉｎｅｓｏｔａ。
ｎｕｃｌｅａｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ （Ｓｔｉｌ
ｌｗａｔｅｒ、Ｍｉｎｅｓｏｔａ。
ロット＃６２１０１）から得られたウサギ抗゛ノマトス
クチン抗体（抗−ＳＳ ）を用いて実施した。すべての
試薬はボレート−ＢＳＡ組衝液（０，１Ｍボレート、ｐ
Ｈ８，４，１％ ＢＳＡ ）で希釈し、１．５ｍ／！の
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中に以Ｆの順序で、１００Ｉｌｔ
緩衝液、１００μｔ標準ソマトスタチン希釈液または未
知サンプル、１００μｔの抗−ＳＳ （最終管内濃度１
：６００．０００）によび１〔］０μｔの■１２．５−
ｔｙｓ −ＳＳ （１０，０００ｃｐｍ／管）を力１１
工て最終容量４００ μｔとした。内容を穏やかに混合
し、−夜４℃でインキュベートした。翌日アガロースに
結合したヤギ抗−ウサｅ工ｇｏ抗体（Ｍｉｌｅｓ Ｌａ
ｂｏ −ｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｅｌｋｈａｒｔ、 工ｎ
ｄｉａｎａ ） ２０μｔを各管に加え、管を室温で２
時間回転させた。管をＥｐｐｅｎｄｏｒｔ遠心分離器で
１５分間遠心分離し、上澄液を捨てた。ペレットをボレ
ート緩衝液１−に再懸濁し、再び遠心分離した。得られ
たペレットの放射能をＢｅｃｋｍａｎ ” （）ａｍｍ
ａ ８０００ ” カウンターで測定した。この定量
条件では、添加ソマトスタチンがない場合、１２５工（
ｙｒｌ−８８の６０〜４０チがウサギ抗体によって沈殿
した。結合放射能の最大手置換は定量液４００ ｐｔ中
、約１５ｐ２のソマトスタチンで生じる。゛ソマトスタ
チンの最小検知量は約２ ｐ？である。高濃度のソマト
スタチンが期待される実験では、感度の低いヤギ抗ソマ
トスタチン抗体を用いた。この場合、アガロース結合ウ
サギ−抗ヤヤエｇ（）を第２の抗体として用いた。
クチン抗体（抗−ＳＳ ）を用いて実施した。すべての
試薬はボレート−ＢＳＡ組衝液（０，１Ｍボレート、ｐ
Ｈ８，４，１％ ＢＳＡ ）で希釈し、１．５ｍ／！の
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中に以Ｆの順序で、１００Ｉｌｔ
緩衝液、１００μｔ標準ソマトスタチン希釈液または未
知サンプル、１００μｔの抗−ＳＳ （最終管内濃度１
：６００．０００）によび１〔］０μｔの■１２．５−
ｔｙｓ −ＳＳ （１０，０００ｃｐｍ／管）を力１１
工て最終容量４００ μｔとした。内容を穏やかに混合
し、−夜４℃でインキュベートした。翌日アガロースに
結合したヤギ抗−ウサｅ工ｇｏ抗体（Ｍｉｌｅｓ Ｌａ
ｂｏ −ｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｅｌｋｈａｒｔ、 工ｎ
ｄｉａｎａ ） ２０μｔを各管に加え、管を室温で２
時間回転させた。管をＥｐｐｅｎｄｏｒｔ遠心分離器で
１５分間遠心分離し、上澄液を捨てた。ペレットをボレ
ート緩衝液１−に再懸濁し、再び遠心分離した。得られ
たペレットの放射能をＢｅｃｋｍａｎ ” （）ａｍｍ
ａ ８０００ ” カウンターで測定した。この定量
条件では、添加ソマトスタチンがない場合、１２５工（
ｙｒｌ−８８の６０〜４０チがウサギ抗体によって沈殿
した。結合放射能の最大手置換は定量液４００ ｐｔ中
、約１５ｐ２のソマトスタチンで生じる。゛ソマトスタ
チンの最小検知量は約２ ｐ？である。高濃度のソマト
スタチンが期待される実験では、感度の低いヤギ抗ソマ
トスタチン抗体を用いた。この場合、アガロース結合ウ
サギ−抗ヤヤエｇ（）を第２の抗体として用いた。
例２
プラスミｒｐＭＯＮＩＤＯ４は２種のポリヌクレオチド
を合成し、この２種のポリヌクレオチドを以下に示すよ
うに互いに反応させて作製した。
を合成し、この２種のポリヌクレオチドを以下に示すよ
うに互いに反応させて作製した。
ＥｃｏＲＩ
５′ ：ＡＡＴＴＣＡＴ（）（）ＣＴＧＧＣＴ（）ＡＡ
ＧＡＡＣ・６′ ： （）ＴＡＣＣ（）ＡＣＣ
ＧＡＣＴＴＣＴＴＯ・・・ＴＴＣＴＴＣＴ（）ＧＡＡＡ
ＡＣＣＴＴＴＡＣＣ’ｌ”ＣＴ・・ＡＡＧＡＡ（）ＡＣ
ＣＴＴＴＴＧＧＡＡＡＴ（）（）Ａ（）Ａ・・ＴＣ（）
ＴＡＡＴＡ（） −３’Ａ（）ＣＡＴＴＡＴＣ
Ａ（）ＣＴ −５′ａｌＩ これらのポリヌクレオチドはＳ、 Ｌ、 Ｂｅａｕｃａ
ｇｅとＭ、 Ｈ，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ （Ｔｅｔ、 Ｌ
ｅｔｔｓ、 ２２ ： １８５９ ＋１９８１）のホス
ファイト法のＳ、 Ｐ、 Ａｄａ、ｍｓら（Ｊ、 Ａｍ
、 Ｃｈｅｍ、 Ｓｏｃ、 １０””５ ： ６６
１． １９８ろ）の改良法によって合成した。１００
’Ｃから室温まで徐々に冷却してやき戻しを行った。
ＧＡＡＣ・６′ ： （）ＴＡＣＣ（）ＡＣＣ
ＧＡＣＴＴＣＴＴＯ・・・ＴＴＣＴＴＣＴ（）ＧＡＡＡ
ＡＣＣＴＴＴＡＣＣ’ｌ”ＣＴ・・ＡＡＧＡＡ（）ＡＣ
ＣＴＴＴＴＧＧＡＡＡＴ（）（）Ａ（）Ａ・・ＴＣ（）
ＴＡＡＴＡ（） −３’Ａ（）ＣＡＴＴＡＴＣ
Ａ（）ＣＴ −５′ａｌＩ これらのポリヌクレオチドはＳ、 Ｌ、 Ｂｅａｕｃａ
ｇｅとＭ、 Ｈ，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ （Ｔｅｔ、 Ｌ
ｅｔｔｓ、 ２２ ： １８５９ ＋１９８１）のホス
ファイト法のＳ、 Ｐ、 Ａｄａ、ｍｓら（Ｊ、 Ａｍ
、 Ｃｈｅｍ、 Ｓｏｃ、 １０””５ ： ６６
１． １９８ろ）の改良法によって合成した。１００
’Ｃから室温まで徐々に冷却してやき戻しを行った。
フ０ラスミドｐＢＲろ２７はＥｃｏＲＩおよびＳａｌ■
で消化し、ＣＡＰで処理した。ＣＡＰは７０℃でろ
０分間、熱不活性化し、得られた混合物をやき戻しポリ
ヌクレオチド混合物と混合した。この混合物をＴ４１）
ＮＡリガーゼと６７°Ｃで８時間リゾートした。
で消化し、ＣＡＰで処理した。ＣＡＰは７０℃でろ
０分間、熱不活性化し、得られた混合物をやき戻しポリ
ヌクレオチド混合物と混合した。この混合物をＴ４１）
ＮＡリガーゼと６７°Ｃで８時間リゾートした。
得られたフ０ラスミドはＥ、Ｃｏ１１ ＳＲ２菌株の形
質転換に使用した。アンピシリン耐性、テトラサイクリ
ン感受性細胞を選択し、ＥｃｏＲＩおよび５ａｌＩ消化
で分析して所望の挿入体の存在を確認した。所望のソマ
トスタチン暗号挿入体を有するフ０ラスミドをｐＭＯ＋
Ｎ １００４と命名した。
質転換に使用した。アンピシリン耐性、テトラサイクリ
ン感受性細胞を選択し、ＥｃｏＲＩおよび５ａｌＩ消化
で分析して所望の挿入体の存在を確認した。所望のソマ
トスタチン暗号挿入体を有するフ０ラスミドをｐＭＯ＋
Ｎ １００４と命名した。
５ ｐｍｏｌのプラスミ’ｒ： ｐＭＯＮ １００４を
エンｒヌクレアーゼ５ａｌＩで消化し、得られた結合末
端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑端に変換した。この
物価はエタノールで沈殿させ、平滑端にＢａｍ旧制限認
識部位（ｃｌｃｃＧ（）ＡＴＣＣ（）Ｇ ）を有する二
重鎖オリゴヌクレオチ１リンカ−がフ０ラスミドＤＮＡ
へ反応液２０μを中でＩＪ ｒ” −トされた。反応混
合物２μＬを用いてＥ、 ｃｏｌｉ Ｋ、 −’Ｉ ２
鴫株５Ｒ２０を拮抗細胞に形質転換した（ Ｂａ１ｅら
： Ｍｕｔａｔｊ、ｏｎ Ｒｅｓ、、 ５９ ：１５７
−１６５．１９７９．０Ｍ４２と命名されてイル）。２
０棟のアンピシリン■性細胞を、約６７個のヌクレオチ
ドの長さを有するｇｃｏＲＩ −ＢａｍＨＩ制限断片含
有プラスミドに対してスクリーニングした。第１図に示
す構造のプラスミドが単離させ、ｐＭＯＮ ２０ ’０
３と命名された。
エンｒヌクレアーゼ５ａｌＩで消化し、得られた結合末
端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑端に変換した。この
物価はエタノールで沈殿させ、平滑端にＢａｍ旧制限認
識部位（ｃｌｃｃＧ（）ＡＴＣＣ（）Ｇ ）を有する二
重鎖オリゴヌクレオチ１リンカ−がフ０ラスミドＤＮＡ
へ反応液２０μを中でＩＪ ｒ” −トされた。反応混
合物２μＬを用いてＥ、 ｃｏｌｉ Ｋ、 −’Ｉ ２
鴫株５Ｒ２０を拮抗細胞に形質転換した（ Ｂａ１ｅら
： Ｍｕｔａｔｊ、ｏｎ Ｒｅｓ、、 ５９ ：１５７
−１６５．１９７９．０Ｍ４２と命名されてイル）。２
０棟のアンピシリン■性細胞を、約６７個のヌクレオチ
ドの長さを有するｇｃｏＲＩ −ＢａｍＨＩ制限断片含
有プラスミドに対してスクリーニングした。第１図に示
す構造のプラスミドが単離させ、ｐＭＯＮ ２０ ’０
３と命名された。
例６
プラスミドｐＤＲ１４５３はクローン化ｒｅｃＡ遺伝子
を含有するｐＢＲ３２２の誘導体である。分子長は約１
３ｋｂ、その製法は５ａｎｃｅｒ 、！！ｃ ＲＬＩＴ
）Ｔ） ：Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、１． Ａｃａｄ、 ５ｃ
ｉ−＋ ７６ （７） ： ３１４４−３１４８（１９
７９）に記載されている。これはエール大学医学部のＷ
、 Ｄ、 Ｒｕｐｐ より恵与された。
を含有するｐＢＲ３２２の誘導体である。分子長は約１
３ｋｂ、その製法は５ａｎｃｅｒ 、！！ｃ ＲＬＩＴ
）Ｔ） ：Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、１． Ａｃａｄ、 ５ｃ
ｉ−＋ ７６ （７） ： ３１４４−３１４８（１９
７９）に記載されている。これはエール大学医学部のＷ
、 Ｄ、 Ｒｕｐｐ より恵与された。
プラスミドＴ）ＤＲ１４５ろはＥｃｏＲＩおよびＢａｍ
ＨＩで消化した。ｒｅｃＡプロモーター／オペレーター
系とｒｅｃ Ａ構造配列の最初の２６０のコードンをも
つＬ８に、ｂの断片を含む２種の断片が得られた。
ＨＩで消化した。ｒｅｃＡプロモーター／オペレーター
系とｒｅｃ Ａ構造配列の最初の２６０のコードンをも
つＬ８に、ｂの断片を含む２種の断片が得られた。
得られた混合物５ Ｑ ｆｍｏｌをＥｃｏＲＩ、Ｂａｍ
Ｈ１消化、ＣＡＰ処理フ０ラスミドｐＢＲ３２２の３．
５ ｆｍｏｌ に反応液１５μを中でリグ８−トした
。反応り、５μｔをとり、Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ−１２菌株
ＤＢ １４４３細胞をＬｕｒｊａ培地上にアンピシリン
とともに置いて形質転換した。アンピシリン耐性コロニ
ーをテトラサイクリン耐性コロニーから分離した。Ｔｃ
Ｓ、ＡｐＲＱ） ２棟のコロニーを１ 、Ｆ３ ｋｂ
ＢａｍＨＩ −ＥｃｏＲＩ ｒｅｃ Ａ断片を含むプラ
スミーに対してスクリーニングした。第２図に示す構造
のプラスミドが得られ、ｐＤＲ１４６１と命名された。
Ｈ１消化、ＣＡＰ処理フ０ラスミドｐＢＲ３２２の３．
５ ｆｍｏｌ に反応液１５μを中でリグ８−トした
。反応り、５μｔをとり、Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ−１２菌株
ＤＢ １４４３細胞をＬｕｒｊａ培地上にアンピシリン
とともに置いて形質転換した。アンピシリン耐性コロニ
ーをテトラサイクリン耐性コロニーから分離した。Ｔｃ
Ｓ、ＡｐＲＱ） ２棟のコロニーを１ 、Ｆ３ ｋｂ
ＢａｍＨＩ −ＥｃｏＲＩ ｒｅｃ Ａ断片を含むプラ
スミーに対してスクリーニングした。第２図に示す構造
のプラスミドが得られ、ｐＤＲ１４６１と命名された。
シラスミＹ ｐＤＲ１４６１の構造は５ａｎｃａｒ ＆
Ｒｕｐｐの上記報告（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃ
ａｄ、 Ｓｃｉ、、 ７６ （７） ： ３１４４−３
１４８．１９７９）と一致じた。
Ｒｕｐｐの上記報告（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃ
ａｄ、 Ｓｃｉ、、 ７６ （７） ： ３１４４−３
１４８．１９７９）と一致じた。
例４
プラスミド１）ＤＲ１４６１の０．６ ｐｍｏｌを６．
５ｐｍｏｌのプラスミドＩ）ＭＯＮ ２００３と混合し
た。この混合物をＥｃｏＲＩで切断し、加熱してエンド
ヌクレアーゼを不活性化し、エタノールで沈殿させた。
５ｐｍｏｌのプラスミドＩ）ＭＯＮ ２００３と混合し
た。この混合物をＥｃｏＲＩで切断し、加熱してエンド
ヌクレアーゼを不活性化し、エタノールで沈殿させた。
沈殿を再懸濁し、容量２０μを中で’ｌ”４ＤＮＡとｌ
ｒ−トシた。この方法で第１表に示すようなメチオニ
ン結合を有するキメラｒｅｃＡ／ソマトスクチン遺伝子
が得られた。熱不活化（７０°（，５分間）によってＩ
Ｊ ｒ−ジョンを停止させ、ＮａＣＪ、を５０ｍＭ に
なるように加え、反応生成物をＢａｍＨＩエンＶヌクレ
アーゼで切断した。混合物を熱不活化し、エタノールで
沈殿させ、１０ｍＭトリス−ＨＣｆｆｌ（ｐ）（８，０
）、１ ｍＭＦＤ’ｌ’Ａ ２ Ｏｐｔ中に再懸濁した
。この混合物５／ＩｔをＢａｍＨＩ消化ＣＡ、Ｐ処理Ｍ
１ろｍｐ８ＤＮＡ ２０ ｆｍｏｌに、容量１５μを中
でリゾートさせた。得られた混合物５μｔをとり、Ｅ、
ｃｏｌｉ菌株ＪＭ １０１の形質転換に用いた。形質転
換する細胞はＴＰＴＧ （イソプロピル−Ｄ−チオガラ
クトピラノシド）およびｘ−Ｇａｌ（５−プロモー４−
クロロ−５−インＶリルーβ−がラクトピラノシＶ）を
含むアガール上に置き、Ｊ、 ＭｅＳＳｉｎｇ の方
法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５１９ ： ３
０９−３２１ ＋１９８１）に従って操作し、クローン
化Ｄ ＮＡ挿入体を含むファージを検知した。１．８ｋ
ｂのＢａｍＨＩ挿入体を含むＭ１３複写形（ＲＦ ）Ｄ
ＮＡが収容された細胞の存在を２４個の大きな無色プラ
ークについてスクリーニングした。この種のクローン５
個が回収され、１．８ｋｂ挿人体のオリエンテーション
かＥｃｏＲＩによる消化で決定された。第６図に示すよ
うな各オリエンテーションのプラスミド（Ｍ１３ＲＦ″
ＤＮＡ ）としてｐＭＯＮ ２００４およびｐＭＯＮ
２００５が得られた。他の６種のクローンを分離し、同
じ方法で製造されるｐＭＯＮ ２００６．２００７およ
び２００８が得られた。ｒｅｃ Ａ ／ソマトスタチン
融合ポリペプチドのこれらのプラスミドによる表現は以
下の例７に述べる。
ｒ−トシた。この方法で第１表に示すようなメチオニ
ン結合を有するキメラｒｅｃＡ／ソマトスクチン遺伝子
が得られた。熱不活化（７０°（，５分間）によってＩ
Ｊ ｒ−ジョンを停止させ、ＮａＣＪ、を５０ｍＭ に
なるように加え、反応生成物をＢａｍＨＩエンＶヌクレ
アーゼで切断した。混合物を熱不活化し、エタノールで
沈殿させ、１０ｍＭトリス−ＨＣｆｆｌ（ｐ）（８，０
）、１ ｍＭＦＤ’ｌ’Ａ ２ Ｏｐｔ中に再懸濁した
。この混合物５／ＩｔをＢａｍＨＩ消化ＣＡ、Ｐ処理Ｍ
１ろｍｐ８ＤＮＡ ２０ ｆｍｏｌに、容量１５μを中
でリゾートさせた。得られた混合物５μｔをとり、Ｅ、
ｃｏｌｉ菌株ＪＭ １０１の形質転換に用いた。形質転
換する細胞はＴＰＴＧ （イソプロピル−Ｄ−チオガラ
クトピラノシド）およびｘ−Ｇａｌ（５−プロモー４−
クロロ−５−インＶリルーβ−がラクトピラノシＶ）を
含むアガール上に置き、Ｊ、 ＭｅＳＳｉｎｇ の方
法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５１９ ： ３
０９−３２１ ＋１９８１）に従って操作し、クローン
化Ｄ ＮＡ挿入体を含むファージを検知した。１．８ｋ
ｂのＢａｍＨＩ挿入体を含むＭ１３複写形（ＲＦ ）Ｄ
ＮＡが収容された細胞の存在を２４個の大きな無色プラ
ークについてスクリーニングした。この種のクローン５
個が回収され、１．８ｋｂ挿人体のオリエンテーション
かＥｃｏＲＩによる消化で決定された。第６図に示すよ
うな各オリエンテーションのプラスミド（Ｍ１３ＲＦ″
ＤＮＡ ）としてｐＭＯＮ ２００４およびｐＭＯＮ
２００５が得られた。他の６種のクローンを分離し、同
じ方法で製造されるｐＭＯＮ ２００６．２００７およ
び２００８が得られた。ｒｅｃ Ａ ／ソマトスタチン
融合ポリペプチドのこれらのプラスミドによる表現は以
下の例７に述べる。
例５
ｐＭＯＮ ２５０６および２５０５の作製プラスミドｐ
ＭＯＢ ４５は制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ、Ｂ
ａｍＨＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩに対して制限部位を有
する１ ０．５ ｋｂ のプラスミドである。それは
温度感受性レプリコン、とテトラサイクリン耐性（Ｔｃ
Ｒ）およびクロラムフェニコール耐性（ＣｍＲ） ｍ伝
子を含む。その構造はＢｉｔｔｎｅｒ ＆’Ｖａ、ｐｎ
ｅｋ （（）ｅｎｅ、 １５：３１９−３２９．１９８
１）によって発表されている。
ＭＯＢ ４５は制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ、Ｂ
ａｍＨＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩに対して制限部位を有
する１ ０．５ ｋｂ のプラスミドである。それは
温度感受性レプリコン、とテトラサイクリン耐性（Ｔｃ
Ｒ）およびクロラムフェニコール耐性（ＣｍＲ） ｍ伝
子を含む。その構造はＢｉｔｔｎｅｒ ＆’Ｖａ、ｐｎ
ｅｋ （（）ｅｎｅ、 １５：３１９−３２９．１９８
１）によって発表されている。
プラスミドｐＭＯＮ ２００５０１．７ ｐｍｏｌをＢ
ａｍＨＩで消化し、反応生成物を５チポリアクリルアミ
ドデル上で分離した。１．８ｋｂ断片を電気溶出により
回収した。回収断片（１７０ｆｍｏｌ；）の１０％を、
あらかじめＢａｍＨＩで消化し、反応液１５μを中でＣ
ＡＰにより処理したプラスミドｐＭＯＢ ４５からのＤ
ＮＡ １５ ｆｍｏｌとりデートした。反応液７．５μ
ｔをとり、Ｅ、 ｃｏｌｉ菌株ＤＢ １４４３の形質転
換に用い、形質変換混合物をクロラムフエニコ工ル含有
Ｌｕｒｉａ板上に置いた。６個のＣｍＲコロニーについ
て１．８ ｋｂ ＢａｍＨＩ挿入体を含むシラスミ１を
スクリーニングした。第４図に示すよう１よ各オリエン
テーションの挿入体を有するプラスミドをｐＭＯＮ２５
０５、ｐＭＯＮ ２５ Ｄ ６と命名した。ｒｅｃ Ａ
／ソマトスフチン融合ポリペプチドのこれらのフ０ラ
スミｒによる表現については以下の例７に述べる。
ａｍＨＩで消化し、反応生成物を５チポリアクリルアミ
ドデル上で分離した。１．８ｋｂ断片を電気溶出により
回収した。回収断片（１７０ｆｍｏｌ；）の１０％を、
あらかじめＢａｍＨＩで消化し、反応液１５μを中でＣ
ＡＰにより処理したプラスミドｐＭＯＢ ４５からのＤ
ＮＡ １５ ｆｍｏｌとりデートした。反応液７．５μ
ｔをとり、Ｅ、 ｃｏｌｉ菌株ＤＢ １４４３の形質転
換に用い、形質変換混合物をクロラムフエニコ工ル含有
Ｌｕｒｉａ板上に置いた。６個のＣｍＲコロニーについ
て１．８ ｋｂ ＢａｍＨＩ挿入体を含むシラスミ１を
スクリーニングした。第４図に示すよう１よ各オリエン
テーションの挿入体を有するプラスミドをｐＭＯＮ２５
０５、ｐＭＯＮ ２５ Ｄ ６と命名した。ｒｅｃ Ａ
／ソマトスフチン融合ポリペプチドのこれらのフ０ラ
スミｒによる表現については以下の例７に述べる。
例６
ｐＭＯＮ ２５０７およびＩ）ＭＯＮ ２５０８の作製
ＭｃＫｅｎｎｅｙら（（）ｅｎｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙ−ｓｉｓ、 Ｖｏｌ Ｉ
Ｉ、 Ｃｈｉｒｋｊｉａｎ ＆ Ｐａｐａｓ ｅｄｓ、
、 Ｅｌｓｅｖｉｅｒｐｕｂｘ、、 ｌ ９８１ ）に
よって報告されたプラスミドｐＫｏ −１はＮ工ＨのＭ
、 Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇより恵与された。このプラスミ
ドはｐＢＲ３２２の訪擲体で独特のＢａｍＨ工切断部位
の近くにプロモーターのないガラクトキナーゼ（ｇａｎ
−Ｋ ）遺伝子がある。
ＭｃＫｅｎｎｅｙら（（）ｅｎｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙ−ｓｉｓ、 Ｖｏｌ Ｉ
Ｉ、 Ｃｈｉｒｋｊｉａｎ ＆ Ｐａｐａｓ ｅｄｓ、
、 Ｅｌｓｅｖｉｅｒｐｕｂｘ、、 ｌ ９８１ ）に
よって報告されたプラスミドｐＫｏ −１はＮ工ＨのＭ
、 Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇより恵与された。このプラスミ
ドはｐＢＲ３２２の訪擲体で独特のＢａｍＨ工切断部位
の近くにプロモーターのないガラクトキナーゼ（ｇａｎ
−Ｋ ）遺伝子がある。
プラスミドｐＫｏ −Ｉ Ｍは以下の工程によって製造
した。まずそのシラスミｒの単−ＥｃｏＲＩ部位をシラ
スミげのＥｃｏＲＩエンげヌクレアーゼ消化によって切
断し、ついでその結合しやすい末端をバクテリオファー
ジＴ４’ＤＮＡポリメラーゼと全４種のデオキシヌクレ
オチドトリホスフェートを用いてふさぎ、ついで−緒す
デートして平滑端を作った。
した。まずそのシラスミｒの単−ＥｃｏＲＩ部位をシラ
スミげのＥｃｏＲＩエンげヌクレアーゼ消化によって切
断し、ついでその結合しやすい末端をバクテリオファー
ジＴ４’ＤＮＡポリメラーゼと全４種のデオキシヌクレ
オチドトリホスフェートを用いてふさぎ、ついで−緒す
デートして平滑端を作った。
この操作で得られたプラスミドはｐＫＯ−Ｉ Ｍ １と
呼ばれている。このプラスミドをヌクレアーゼＳｍａ
工で切断し、ＥｃＯＲ工切断部位をもつオリゴヌクレオ
チＶリンカ−（’Ｇ（）ＡＡＴＴＣＣ）をＳｍａ 工部
位に挿入し、シラスミＦｐｘｏ−ＩＭ２を形成させた。
呼ばれている。このプラスミドをヌクレアーゼＳｍａ
工で切断し、ＥｃＯＲ工切断部位をもつオリゴヌクレオ
チＶリンカ−（’Ｇ（）ＡＡＴＴＣＣ）をＳｍａ 工部
位に挿入し、シラスミＦｐｘｏ−ＩＭ２を形成させた。
このプラスミドをついでＥｃｏＲＩで消化し、ファージ
Ｍ １３ ｍｐＦからのＥｃｏＲＩ末端をもつ多制限部
位リンカ−を挿入してプラスミドｐＫｏ −Ｉ Ｍを製
造した。
Ｍ １３ ｍｐＦからのＥｃｏＲＩ末端をもつ多制限部
位リンカ−を挿入してプラスミドｐＫｏ −Ｉ Ｍを製
造した。
ｒｅｃ Ａ ／ソマトスタチン遺伝子融合を含むｐＭＯ
Ｎ ２００５の１．８ ｋｂ ＢａｍＨ工断片約１７０
ｆｍｏｌを、プラスミドｐＫｏ −Ｉ ＭからのＢａ
ｍＨＩ消化、ＣＡＰ処理ＤＮＡ ４０ ｆｍｏｌにリゾ
ートさせた。リゾ−ジョン混合物７．５ ｐｉをとり、
前出のＭｃＫｅｎｎｅｙの文献に記載された方法にした
がって、Ｅ、Ｃ０１ｉ菌株Ｎ１０ＤＫ−の形質転換に用
いた。形質転換した細胞をアンピシリン含有ガラ〃ドー
スＭａｃＣｏｎｋｅｙアガール上に置いた。赤色および
白色のＡｐＲコロニーについて、母体プラスミド中の１
．８ ｋｂ ＢａｍＨＩ挿入体の存在なスクリーニング
した。赤色コロニーがｇａｌ＋でｐＭＯＮ ２５０７の
構造を有し、白色コロニーはｇａｐ−でＴ）ＭＯＮ ２
５０８の構造を有する（第５図参照）。これらのポリペ
ブチｒによるｒｅｃ Ａ ／ソマトスタチン融合ボリペ
フ０チドの表現については以下の例７に述べる。
Ｎ ２００５の１．８ ｋｂ ＢａｍＨ工断片約１７０
ｆｍｏｌを、プラスミドｐＫｏ −Ｉ ＭからのＢａ
ｍＨＩ消化、ＣＡＰ処理ＤＮＡ ４０ ｆｍｏｌにリゾ
ートさせた。リゾ−ジョン混合物７．５ ｐｉをとり、
前出のＭｃＫｅｎｎｅｙの文献に記載された方法にした
がって、Ｅ、Ｃ０１ｉ菌株Ｎ１０ＤＫ−の形質転換に用
いた。形質転換した細胞をアンピシリン含有ガラ〃ドー
スＭａｃＣｏｎｋｅｙアガール上に置いた。赤色および
白色のＡｐＲコロニーについて、母体プラスミド中の１
．８ ｋｂ ＢａｍＨＩ挿入体の存在なスクリーニング
した。赤色コロニーがｇａｌ＋でｐＭＯＮ ２５０７の
構造を有し、白色コロニーはｇａｐ−でＴ）ＭＯＮ ２
５０８の構造を有する（第５図参照）。これらのポリペ
ブチｒによるｒｅｃ Ａ ／ソマトスタチン融合ボリペ
フ０チドの表現については以下の例７に述べる。
例７
各種ベクターによるｒｅｃ Ａ ／ソマトスタチンの表
現 １）ＭＯＮ ２００４から２００８までの５種のクロー
ン単離プラスミド（例４および第６図に示したようにし
てｒｅｃ Ａ ／ソマトスタチン キメラ遺伝子を挿入
して改良したＭ ’ｌ ３ ｍｐ ８ＤＮＡ ）につい
て、ナルジキシ酸の存在下または非存在下にソマトスタ
チンの製造を試験した。対照細胞は非改良Ｍ１３ベクタ
ーで感染させた。Ｅ、 ｃｏｌｉ細胞、菌株ＪＭ １０
６は２ＸＹＴ培地中、６７℃でＫｌｅｔｔｌ ００ （
Ｋｌｅｔｔ −Ｓｕｍｍｅｒｓｏｎ Ｃｏｌｏｒｉｍｅ
ｔｅｒ緑色フィルター）まで成育させた。培地を２つに
分け、その一方には新たに調製したナルジキシ酸（１０
ｍ？ ／ ｍｌ １０ ［１ｍＭ ＮａＯＨ）を最終
濃度が５０μ２／−になるように添加した。両培地を６
７°Ｃで１時間生育させ、ついで遠心分離で収穫し、７
０％ギ酸中ｃＮＢｒ５Ｔｎ９／ｍｌ！の溶液（これはｒ
ｅｃ Ａ ／ソマトスタチンポリペプチドを第１表に示
すようにメチオニンで切断し、ｒｅｃＡポリベフ０チＰ
からソマトスタチン配列を分離する）に再懸濁し、つい
で放射免疫法でソマトスタチンの存在を試験した。結果
は第６表に示すとおりである。５種の培地のうち４稗で
ソマトスタチンの産生が認められ、それはナルジキシ酸
誘発によって著しく上昇した。
現 １）ＭＯＮ ２００４から２００８までの５種のクロー
ン単離プラスミド（例４および第６図に示したようにし
てｒｅｃ Ａ ／ソマトスタチン キメラ遺伝子を挿入
して改良したＭ ’ｌ ３ ｍｐ ８ＤＮＡ ）につい
て、ナルジキシ酸の存在下または非存在下にソマトスタ
チンの製造を試験した。対照細胞は非改良Ｍ１３ベクタ
ーで感染させた。Ｅ、 ｃｏｌｉ細胞、菌株ＪＭ １０
６は２ＸＹＴ培地中、６７℃でＫｌｅｔｔｌ ００ （
Ｋｌｅｔｔ −Ｓｕｍｍｅｒｓｏｎ Ｃｏｌｏｒｉｍｅ
ｔｅｒ緑色フィルター）まで成育させた。培地を２つに
分け、その一方には新たに調製したナルジキシ酸（１０
ｍ？ ／ ｍｌ １０ ［１ｍＭ ＮａＯＨ）を最終
濃度が５０μ２／−になるように添加した。両培地を６
７°Ｃで１時間生育させ、ついで遠心分離で収穫し、７
０％ギ酸中ｃＮＢｒ５Ｔｎ９／ｍｌ！の溶液（これはｒ
ｅｃ Ａ ／ソマトスタチンポリペプチドを第１表に示
すようにメチオニンで切断し、ｒｅｃＡポリベフ０チＰ
からソマトスタチン配列を分離する）に再懸濁し、つい
で放射免疫法でソマトスタチンの存在を試験した。結果
は第６表に示すとおりである。５種の培地のうち４稗で
ソマトスタチンの産生が認められ、それはナルジキシ酸
誘発によって著しく上昇した。
Ｔ）ＭＯＮ ２００７ではソマトスタチン第６表
培地中の゛ソマトスタチン（ｎｆ／ｍｌ ）ＭＯＮ
ベクター ２００４ ２００５ ２００６ ２００７
２００８ ｍｐ８誘 発 １５ １１．５
１１ ０．１６ １ろ、８ ０．１７非誘発 ろ１０
２５５ ３１０ ０．２２ ２９５ ０．２８５の表
現が認められなかったが、これは結合した分節の間で適
当な相が欠落した結果と考えられる。
２００８ ｍｐ８誘 発 １５ １１．５
１１ ０．１６ １ろ、８ ０．１７非誘発 ろ１０
２５５ ３１０ ０．２２ ２９５ ０．２８５の表
現が認められなかったが、これは結合した分節の間で適
当な相が欠落した結果と考えられる。
プラスミドｐＭＯＮ ２５０６または２５０５ （例５
および第４図に記載）を営むＥ、 ｃｏｌｉ細胞（菌株
ＤＢ１４４３）を２ＸＹＴ培地中、室温チー夜培養した
。この接種材料を新たな２ Ｘ ＹＴ培地で１［Ｉ Ｋ
ｌｅｔｔに希釈し、４０°Ｃで６時間培養し、高いシラ
スミド模写数を誘発した。培養をついでナルジキシ酸で
上述のように、２〜６時間誘発した。
および第４図に記載）を営むＥ、 ｃｏｌｉ細胞（菌株
ＤＢ１４４３）を２ＸＹＴ培地中、室温チー夜培養した
。この接種材料を新たな２ Ｘ ＹＴ培地で１［Ｉ Ｋ
ｌｅｔｔに希釈し、４０°Ｃで６時間培養し、高いシラ
スミド模写数を誘発した。培養をついでナルジキシ酸で
上述のように、２〜６時間誘発した。
細胞を遠心分離で収穫し、ギ酸中ＣＮＢｒで処理し７た
のち、放射免疫法でソマトスタチンの存在を試験した。
のち、放射免疫法でソマトスタチンの存在を試験した。
結果は第４表に示すとおりである。゛ソマトスタチンの
生成はＭｌろベクターから誘導されたｒｅｃ Ａプラス
ミドによる場合より２〜６倍多く、■ｔａｋｕｒａら（
Ｓｃｉｅｎｃｅ、 １９８：１０５６゜１９７７）の
報告によるβ−ガラクトシダーゼプロモーター／オペレ
ーター系の制御下のソマトスタチンの表現に比べて約１
００倍多い。
生成はＭｌろベクターから誘導されたｒｅｃ Ａプラス
ミドによる場合より２〜６倍多く、■ｔａｋｕｒａら（
Ｓｃｉｅｎｃｅ、 １９８：１０５６゜１９７７）の
報告によるβ−ガラクトシダーゼプロモーター／オペレ
ーター系の制御下のソマトスタチンの表現に比べて約１
００倍多い。
第４表
１時間誘発 ２４５ ２９０
＜５２２時間誘 ５１０ ５２０
＜３プラスミドルＭＯＮ２５０７（例６および第５図
に記載）を含有するＥ、 ｃｏｌｉ菌株Ｎ１０ＯＫ−（
ｒｅｃＡ）は２ＸＹＴ培地中１５０ Ｋｌｅｔｔまで生
胃させ、ついで培地を２分した。一方の培地Ｇ末ナルジ
キシ酸を加えて１時間誘発した。各培地の一部をとり、
遠心分離で細胞を収穫いギ酸中ＣＮＢｒで処理いついで
放射免疫法でソマトスタチンを定量した。結果は第５表
に示す。キメラ遺伝子のの表現はｒｅｃ Ａ＋宿主細胞
では著しく誘発されたが、ｒｅｃＡ−宿主細胞ではわず
かに誘発されたのみであった。
＜５２２時間誘 ５１０ ５２０
＜３プラスミドルＭＯＮ２５０７（例６および第５図
に記載）を含有するＥ、 ｃｏｌｉ菌株Ｎ１０ＯＫ−（
ｒｅｃＡ）は２ＸＹＴ培地中１５０ Ｋｌｅｔｔまで生
胃させ、ついで培地を２分した。一方の培地Ｇ末ナルジ
キシ酸を加えて１時間誘発した。各培地の一部をとり、
遠心分離で細胞を収穫いギ酸中ＣＮＢｒで処理いついで
放射免疫法でソマトスタチンを定量した。結果は第５表
に示す。キメラ遺伝子のの表現はｒｅｃ Ａ＋宿主細胞
では著しく誘発されたが、ｒｅｃＡ−宿主細胞ではわず
かに誘発されたのみであった。
第５表
培地中のソマトスタチン（ｎｆ／／ｍｌ！ ）Ｒ工Ａで
定量 宿 主 細 胞 誘発 非誘発ＤＢ
１４４３ （ｒｅｃＡ ）
９５０ １７．５Ｎ１００Ｋ （ｒｅｃＡ
） ＜６＜３ＤＪ３１４４３
（ｒｓｃ Ａ−’−）−７’ラスミドＴ）’ＫＯ−ＩＭ
＜ １ ＜ ｌＮ１０［］Ｋ （ｒｅ
ｃ Ａ ）７０ラスミドｐＫ○−ＩＭ ＜１
＜１ｐＭＯＮ ２５０７をもつｒｅｃ Ａ Ｅ
、 ｃｏｌｉ、またはｒｅｃ Ａ ／ソマトスタチン構
造配列の転写を妨害するｒｅｃＡ転写ターミネータ−を
挿入したｐＭＯＮ２５０７をもつｒｅｃ Ａ＋Ｅ、 ｃ
ｏｌｉにおけるガラクトキナーゼ濃度を比較した。結果
を第６表に示す。
定量 宿 主 細 胞 誘発 非誘発ＤＢ
１４４３ （ｒｅｃＡ ）
９５０ １７．５Ｎ１００Ｋ （ｒｅｃＡ
） ＜６＜３ＤＪ３１４４３
（ｒｓｃ Ａ−’−）−７’ラスミドＴ）’ＫＯ−ＩＭ
＜ １ ＜ ｌＮ１０［］Ｋ （ｒｅ
ｃ Ａ ）７０ラスミドｐＫ○−ＩＭ ＜１
＜１ｐＭＯＮ ２５０７をもつｒｅｃ Ａ Ｅ
、 ｃｏｌｉ、またはｒｅｃ Ａ ／ソマトスタチン構
造配列の転写を妨害するｒｅｃＡ転写ターミネータ−を
挿入したｐＭＯＮ２５０７をもつｒｅｃ Ａ＋Ｅ、 ｃ
ｏｌｉにおけるガラクトキナーゼ濃度を比較した。結果
を第６表に示す。
第６表
構 造 がラクトキナーゼの特異活性
９をもつ１）ＭＯＮ２５０７ 誘発
〈６＊生成がラクトースホスフェートｐｍｏｌ／分／ｐ
ｆ抽出物／ ｍｅ 例８ 長さの異なるｒｅｃ Ａ配列をもつ融合ポリペプチド ｒｅｃ Ａ ／ソマトスタチン融合ポリペゾチげの表現
および蓄積がポリペプチドの長さによって変化するかど
うかを調べるため、長さの異なる６種の融合ｒｅｃ Ａ
／メチオニン／ソマトスフチン構造配列を有するプラ
スミドを製造した。いずれもｒｅｃＡプロモーター／オ
ペレーター領域および５′非翻訳領域の制御下にあった
。６種のプラスミドはそれぞれのｒｅｃ Ａ配列の長さ
と、それによって発現したソマトスタチン量を第７表に
示す。
９をもつ１）ＭＯＮ２５０７ 誘発
〈６＊生成がラクトースホスフェートｐｍｏｌ／分／ｐ
ｆ抽出物／ ｍｅ 例８ 長さの異なるｒｅｃ Ａ配列をもつ融合ポリペプチド ｒｅｃ Ａ ／ソマトスタチン融合ポリペゾチげの表現
および蓄積がポリペプチドの長さによって変化するかど
うかを調べるため、長さの異なる６種の融合ｒｅｃ Ａ
／メチオニン／ソマトスフチン構造配列を有するプラ
スミドを製造した。いずれもｒｅｃＡプロモーター／オ
ペレーター領域および５′非翻訳領域の制御下にあった
。６種のプラスミドはそれぞれのｒｅｃ Ａ配列の長さ
と、それによって発現したソマトスタチン量を第７表に
示す。
第７表
ｐＭＯＮ ２５４４ ４８ ３７−５ ０．
０５ｐＭＯＮ ２５３９ ２６０ ５６２．５
’＋ 、２６Ｔ）ＭＯＮ ２５４０ ３３
０ ５３７．５ ０．７０Ｔ）ＭＯＮ ２５
４４ （ｒｅｃ Ａポリペブチにの４８個のアミノ酸の
コーデンと、さらに２ ａｔのコーヂンすなわち、Ｅｃ
ｏＲ■制限部位を与えるメチオニン接合コーヂンとソマ
トスタチンのコーヂンを有する）の製造には、まず、８
００ ｂｐ ＢａｍＨＩからＳｓｔ ｌｌＤＮＡ断片ま
でのｒｅｃ Ａプロモーターに先行する断片を除去した
Ｔ）ＤＲ１４６１の誘導体を製造した２、第６図に示す
ように、プラスミドｐＤＲ１４６１は５Ｓｔｌｌで制限
され、Ｂ ａｍＨＩアダフ０クーとリケゞ−トされた。
０５ｐＭＯＮ ２５３９ ２６０ ５６２．５
’＋ 、２６Ｔ）ＭＯＮ ２５４０ ３３
０ ５３７．５ ０．７０Ｔ）ＭＯＮ ２５
４４ （ｒｅｃ Ａポリペブチにの４８個のアミノ酸の
コーデンと、さらに２ ａｔのコーヂンすなわち、Ｅｃ
ｏＲ■制限部位を与えるメチオニン接合コーヂンとソマ
トスタチンのコーヂンを有する）の製造には、まず、８
００ ｂｐ ＢａｍＨＩからＳｓｔ ｌｌＤＮＡ断片ま
でのｒｅｃ Ａプロモーターに先行する断片を除去した
Ｔ）ＤＲ１４６１の誘導体を製造した２、第６図に示す
ように、プラスミドｐＤＲ１４６１は５Ｓｔｌｌで制限
され、Ｂ ａｍＨＩアダフ０クーとリケゞ−トされた。
このフ０ラスミドをＢ ａｍＨＩで消化し、小さな断片
を除去するために希釈し、リケゞ−トするとプラスミド
ｐＭＯＮ ２５３７が生成した。このプラスミＶをＥ
ｃｏＲＩで切断し、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシ
ヌクレオチドで処理してＥ、 ｃｏｌｉ中の結合しやす
い末端を満たし、ついでＥｃｏＲＶで制限し、ヌクレア
ーゼＳ１で処理し、生じた単一鎖をＥ ｃ ＯＲＶ ｔ
ｔｉｌＪ限部位で除去した。ベクター断片をｒル精製し
、それ自体にリケゞ−トさせて、ｒｅｃＡ遺伝子の４９
番目のアミノ酸に対する暗号配列のＥｃｏＲＶ部位とｐ
ＢＲ２３２ベクターのＥｃｏＲＩ部位の間にＥｃｏＲＩ
結合を生成させた。これらの操作は第４９番目のアミノ
酸の暗号配列におけるＥｃｏＲＶ部位をＥｃｏＲ工部位
に変換させる効果をもち、適当な相で合成ソマトスタチ
ン暗号配列と融合させるこめに使用できる。この先端を
切断されたｒｅｃ Ａ断片（ＢａｍＨＩからＥｃｏＲＩ
まで）をついで、（１）例２に記載したプラスミドｐＭ
ＯＮ ２ Ｄ Ｏ３からのＥｃｏＦｔＩ−ＢａｍＨＩ
゛ノマトスクチン断片、および（２） ＢａｍＨ工切断
プラスミドｐＫＯ−１Ｍの両者とリケゝ−トすることに
よってソマトスタチン表現ベクターの構成に使用した。
を除去するために希釈し、リケゞ−トするとプラスミド
ｐＭＯＮ ２５３７が生成した。このプラスミＶをＥ
ｃｏＲＩで切断し、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシ
ヌクレオチドで処理してＥ、 ｃｏｌｉ中の結合しやす
い末端を満たし、ついでＥｃｏＲＶで制限し、ヌクレア
ーゼＳ１で処理し、生じた単一鎖をＥ ｃ ＯＲＶ ｔ
ｔｉｌＪ限部位で除去した。ベクター断片をｒル精製し
、それ自体にリケゞ−トさせて、ｒｅｃＡ遺伝子の４９
番目のアミノ酸に対する暗号配列のＥｃｏＲＶ部位とｐ
ＢＲ２３２ベクターのＥｃｏＲＩ部位の間にＥｃｏＲＩ
結合を生成させた。これらの操作は第４９番目のアミノ
酸の暗号配列におけるＥｃｏＲＶ部位をＥｃｏＲ工部位
に変換させる効果をもち、適当な相で合成ソマトスタチ
ン暗号配列と融合させるこめに使用できる。この先端を
切断されたｒｅｃ Ａ断片（ＢａｍＨＩからＥｃｏＲＩ
まで）をついで、（１）例２に記載したプラスミドｐＭ
ＯＮ ２ Ｄ Ｏ３からのＥｃｏＦｔＩ−ＢａｍＨＩ
゛ノマトスクチン断片、および（２） ＢａｍＨ工切断
プラスミドｐＫＯ−１Ｍの両者とリケゝ−トすることに
よってソマトスタチン表現ベクターの構成に使用した。
形貴転換Ｅ、 ｃｏｌｉ Ｎ １ ［１０ｇａＡ’Ｋを
ｇａｌｌ Ｋ＋に表現型を変えることができる。このリ
ケゞ−ジョンの生成物は第６図のｐＭＯＮ ２５４４の
構造を示した。これらのプラスミドは第６図に示したｒ
ｅｃ Ａ：ソマトスタチン遺伝暗号接合を有する。
ｇａｌｌ Ｋ＋に表現型を変えることができる。このリ
ケゞ−ジョンの生成物は第６図のｐＭＯＮ ２５４４の
構造を示した。これらのプラスミドは第６図に示したｒ
ｅｃ Ａ：ソマトスタチン遺伝暗号接合を有する。
）０ラスミｒｐＭｏＮ２５３９（メチオニンコーヂンに
続く２６０個のｒｅｃ Ａコーヂンとソマトスタチンコ
ーデンを有する）を製造するには、ｒｅｃＡ／ソマトス
タヂンキメラ遺伝子を含む１．８ ｋｂ ＢａｍＨＩ断
片をプラスミドｐＭＯＮ ２００４がら単離した（例４
に記載）。この断片をｐＢＲ６２２誘導体、はじめのＥ
ｃｏＲＩ部位か除去されたｐＭＯＮ ２５６８に挿入す
るとプラスミドｐＭＯＮ ２５３９が第７図に示すよう
に生成した。３３１］個のｒｅｃ Ａコーデンを有し、
それに続いてさらに２種のコーチ゛ンすなわちＥＣ０Ｒ
Ｔ制限部位、メチオニンコーヂンとンマトスクチンコー
デンを含むプラスミドがｐＭＯＮ２５４０である。この
デラスミＰを得るには、ｒｅｃ Ａコーデン２６０から
３．５０までを含むＤＮＡ断片をプラスミドｐＭＯＮ
２５３９のＥｃｏＲＩ部位に挿入した。この断片はプラ
スミドｐＤＲ１４５６（例ろ参照）のＥｃｏＰ、■およ
びＤｄｅＩによる消化で得られた。オリゴヌクレオチー
リンカ−（ｄ−Ｔ（）ＡＧＣ（）ＡＡＴ’ｌ’ＣＧＣ）
をやき戻しして、この断片にリゾ−１−シ、％られた混
合物をＥｃｏＲＩで切断し、ＤｃｌｅＩ末端なりｃｏＲ
Ｉ末端に変換する。得られた断片をＴＩＭＯＮ ２５３
９のＥｃｏＲ工部位に“挿入した。適当なオリエンテー
シヨンをもつ挿入体を肩するプラスミドを挿入断片内の
非対称ＢｉｎｄｌＩ制限４ノーイトを用いて同定した。
続く２６０個のｒｅｃ Ａコーヂンとソマトスタチンコ
ーデンを有する）を製造するには、ｒｅｃＡ／ソマトス
タヂンキメラ遺伝子を含む１．８ ｋｂ ＢａｍＨＩ断
片をプラスミドｐＭＯＮ ２００４がら単離した（例４
に記載）。この断片をｐＢＲ６２２誘導体、はじめのＥ
ｃｏＲＩ部位か除去されたｐＭＯＮ ２５６８に挿入す
るとプラスミドｐＭＯＮ ２５３９が第７図に示すよう
に生成した。３３１］個のｒｅｃ Ａコーデンを有し、
それに続いてさらに２種のコーチ゛ンすなわちＥＣ０Ｒ
Ｔ制限部位、メチオニンコーヂンとンマトスクチンコー
デンを含むプラスミドがｐＭＯＮ２５４０である。この
デラスミＰを得るには、ｒｅｃ Ａコーデン２６０から
３．５０までを含むＤＮＡ断片をプラスミドｐＭＯＮ
２５３９のＥｃｏＲＩ部位に挿入した。この断片はプラ
スミドｐＤＲ１４５６（例ろ参照）のＥｃｏＰ、■およ
びＤｄｅＩによる消化で得られた。オリゴヌクレオチー
リンカ−（ｄ−Ｔ（）ＡＧＣ（）ＡＡＴ’ｌ’ＣＧＣ）
をやき戻しして、この断片にリゾ−１−シ、％られた混
合物をＥｃｏＲＩで切断し、ＤｃｌｅＩ末端なりｃｏＲ
Ｉ末端に変換する。得られた断片をＴＩＭＯＮ ２５３
９のＥｃｏＲ工部位に“挿入した。適当なオリエンテー
シヨンをもつ挿入体を肩するプラスミドを挿入断片内の
非対称ＢｉｎｄｌＩ制限４ノーイトを用いて同定した。
このプラスミドは第７図に示すようにｐＭＯＮ ２５４
０と命名された。
０と命名された。
各種ｒｅｃＡ／ソマトスタチン融合ポリペプチドの発現
を試験するには、プラスミドｐＭＯＮ ２５４４．２５
６９または２５４０をもつＥ、 ｃｏｌｉ ＤＢ １４
３３菌株を培養し、５０μＩのナルジキシ酸で２時間性
発し、収穫し、ＣＮＢｒ処理し、ＲＩＡで定量した。
を試験するには、プラスミドｐＭＯＮ ２５４４．２５
６９または２５４０をもつＥ、 ｃｏｌｉ ＤＢ １４
３３菌株を培養し、５０μＩのナルジキシ酸で２時間性
発し、収穫し、ＣＮＢｒ処理し、ＲＩＡで定量した。
結果は第７表に示したように、比較的高レベルのソマト
スタチンは大きな（２６０および２６０のアミノ酸のキ
ャリヤー）融合ポリペラ０チドで表現され、一方、比較
的低レベルの表現は小さな（４９のアミノ酸キャリヤー
）融合ポリペラ０チドでみられた。
スタチンは大きな（２６０および２６０のアミノ酸のキ
ャリヤー）融合ポリペラ０チドで表現され、一方、比較
的低レベルの表現は小さな（４９のアミノ酸キャリヤー
）融合ポリペラ０チドでみられた。
例？
ｒｅｃ Ａおよびβ−ｇａｌキャリヤーポリペプチドの
比較 前述のように、■ｔａｋ、ｕｒａらはソマトスタチン配
列なβ−ｇａｅポリペプチドの部分と結合させた融合ポ
リペプチドによる表現を先に報告している（ ５ｃｉｅ
ｎｃｅ、 １９８ ： １０５６ 、 １９７７ ）。
比較 前述のように、■ｔａｋ、ｕｒａらはソマトスタチン配
列なβ−ｇａｅポリペプチドの部分と結合させた融合ポ
リペプチドによる表現を先に報告している（ ５ｃｉｅ
ｎｃｅ、 １９８ ： １０５６ 、 １９７７ ）。
この報告ではプラスミドの不安定性などのために、β−
ｇａ／Ｊ ／ソマトスフチンプラスミドを含むＥ、ｃｏ
ｌｉ細胞によって表現され、蓄積される゛ソマトスタチ
ンの量には限界かある前述べられている。これと類似の
プラスミドについて、（１）問題の程度を知るため、（
２）β−ｇａｌプロモーター／オペレーター系とｒｅｃ
Ａプロモーター／オペレーター系を比較するため、（
３）ソマトスタチンのキャリヤータンパクとしてβ−ｇ
ａｌとｒｅｃ Ａを比較するため、０６つの理由で製造
を試みた。結果は以下に述べるように、ｒｅｃＡ／ソマ
トスタチンキメラ遺伝子はβ−ｇａｇ ／ソマトスタチ
ンキメラ遺伝子に比し、Ｂ、 ｃｏｌｊ によるソマト
スタチン含肩融合ポリペプチドの表現のために著しく優
れていることが明らかになった。
ｇａ／Ｊ ／ソマトスフチンプラスミドを含むＥ、ｃｏ
ｌｉ細胞によって表現され、蓄積される゛ソマトスタチ
ンの量には限界かある前述べられている。これと類似の
プラスミドについて、（１）問題の程度を知るため、（
２）β−ｇａｌプロモーター／オペレーター系とｒｅｃ
Ａプロモーター／オペレーター系を比較するため、（
３）ソマトスタチンのキャリヤータンパクとしてβ−ｇ
ａｌとｒｅｃ Ａを比較するため、０６つの理由で製造
を試みた。結果は以下に述べるように、ｒｅｃＡ／ソマ
トスタチンキメラ遺伝子はβ−ｇａｇ ／ソマトスタチ
ンキメラ遺伝子に比し、Ｂ、 ｃｏｌｊ によるソマト
スタチン含肩融合ポリペプチドの表現のために著しく優
れていることが明らかになった。
β−ｇａｌ／ンマトスタチン遺伝子融合の作成には、β
−ｇａｌとその制御因子の遺伝子を含むファージノプラ
ーク５のＥｃｏＲＩ断片を、第２図に示すように、ｐＭ
ＯＮ １ ［］ ０４の独特のＥｃｏＲＩサイトに挿入
した。β−ｇａｄは計１０２１のアミノ酸を含有し、Ｎ
末端１００５のアミノ酸のコーデンはＤＮＡ断片上に存
在する。Ｃ末端領域（アミノ酸１００６〜１０２１）の
欠失は酵素活性の消失を生じる。λプラークＥｃｏＲ工
断片をＥｃｏＲＩ消化、ＣＡ、Ｐ 処ｆＭ ｐＭＯＮ
１００４ ニリｒ−トさせ、生成物を１ａｃＺ＋７ｆＪ
ｊ株ＳＲ２の形質転換に用いた。ファージ断片挿入体を
含むコロニーはアンピシリンと色原性β−ｇａｌ基質、
Ｘ −ｇａｌを含むＬＢ板上で青色コロニーを形成する
能力によって同定された。
−ｇａｌとその制御因子の遺伝子を含むファージノプラ
ーク５のＥｃｏＲＩ断片を、第２図に示すように、ｐＭ
ＯＮ １ ［］ ０４の独特のＥｃｏＲＩサイトに挿入
した。β−ｇａｄは計１０２１のアミノ酸を含有し、Ｎ
末端１００５のアミノ酸のコーデンはＤＮＡ断片上に存
在する。Ｃ末端領域（アミノ酸１００６〜１０２１）の
欠失は酵素活性の消失を生じる。λプラークＥｃｏＲ工
断片をＥｃｏＲＩ消化、ＣＡ、Ｐ 処ｆＭ ｐＭＯＮ
１００４ ニリｒ−トさせ、生成物を１ａｃＺ＋７ｆＪ
ｊ株ＳＲ２の形質転換に用いた。ファージ断片挿入体を
含むコロニーはアンピシリンと色原性β−ｇａｌ基質、
Ｘ −ｇａｌを含むＬＢ板上で青色コロニーを形成する
能力によって同定された。
菌株ＳＲ２のｐＭＯＮ １００４−λプラーク１）ｆ−
ジョン混合による形質転換でＸ’ −ｇａｌを含む板上
に高率に青色コロニーを生じた。しかしながらコロニー
は小さかった。これりのコロニーから生育した培養物中
にプラスミドの存在を明らかにする試みは１回を除いて
成功しなかった。いずれのオリエンテーションでも高頻
度にλプラーク挿入体の検知が失敗する理由はβ−ｇａ
ｌ／ソマトスクチン遺伝子含有プラスミドの不安定性に
よるものと思われる。
ジョン混合による形質転換でＸ’ −ｇａｌを含む板上
に高率に青色コロニーを生じた。しかしながらコロニー
は小さかった。これりのコロニーから生育した培養物中
にプラスミドの存在を明らかにする試みは１回を除いて
成功しなかった。いずれのオリエンテーションでも高頻
度にλプラーク挿入体の検知が失敗する理由はβ−ｇａ
ｌ／ソマトスクチン遺伝子含有プラスミドの不安定性に
よるものと思われる。
この遺伝子をもつプラスミドが不安定な理由は明らかで
はない。ひとつの可能性としては、リフ０レツザーカ価
によって生じる融合生成物の低レベルの構成表現が細胞
に悪影響を与えることか考えられる。それが事実とすれ
ば細胞内リプレッサー濃度の上昇でフ０ラスミドの安定
性が増すはずである。この可能性を試験するために、ｐ
ＭＯＮ １００４−λプラーク５のりｒ−ジョン混合物
を、ｌａＣリップレッサーの１ｑ対立遺伝子を含むＥ、
ｃｏｌｉ ＪＭ１０１細胞の形質転換に使用した。工
Ｑ突然変異株はリプレッサーの過剰合成により、ｌａｃ
ＩＪデレッサー濃度の１０倍もの上昇を生じた。プラ
ーク挿入体を含むコロニーはＸ ｇａｌおよびＩＰＴＯ
を含むＩｗｕ １７ ］−ａアガール板上に置くと青色
を呈することによって同定した。
はない。ひとつの可能性としては、リフ０レツザーカ価
によって生じる融合生成物の低レベルの構成表現が細胞
に悪影響を与えることか考えられる。それが事実とすれ
ば細胞内リプレッサー濃度の上昇でフ０ラスミドの安定
性が増すはずである。この可能性を試験するために、ｐ
ＭＯＮ １００４−λプラーク５のりｒ−ジョン混合物
を、ｌａＣリップレッサーの１ｑ対立遺伝子を含むＥ、
ｃｏｌｉ ＪＭ１０１細胞の形質転換に使用した。工
Ｑ突然変異株はリプレッサーの過剰合成により、ｌａｃ
ＩＪデレッサー濃度の１０倍もの上昇を生じた。プラ
ーク挿入体を含むコロニーはＸ ｇａｌおよびＩＰＴＯ
を含むＩｗｕ １７ ］−ａアガール板上に置くと青色
を呈することによって同定した。
ＳＲ２菌株の場合に得られた結果とは反対に、ＪＭ １
０１の形質転換ではすべて安定なプラスミドの存在を示
した。これらの単離体中のプラーク挿入体のオリエンテ
ーションはプラスミドのアンピシリン耐性遺伝子からプ
ラーク断片中の独特なＨｉｎｄ ＩＩＩ サイトまでの
距離を測定して決定された。
０１の形質転換ではすべて安定なプラスミドの存在を示
した。これらの単離体中のプラーク挿入体のオリエンテ
ーションはプラスミドのアンピシリン耐性遺伝子からプ
ラーク断片中の独特なＨｉｎｄ ＩＩＩ サイトまでの
距離を測定して決定された。
２５個の単離体の大部分は第８図の１０ラスミドＡに示
したオリエンテーションでプラーク断片が導入されてい
た。β−ｙ、ａｌがソマトスタチンと反対に読まれる第
８図の所望のＢ型の単離体は認められなかったが、Ｃに
よって示される構造のダイマープラスミドはみられ、β
−ｇａｐ ／ソマトスタチンの表現はなかった。ダイマ
ープラスミド（４分子のリクーションを要する）が生成
する条件下に七ツマープラスミド（Ｂ型構造）が存在し
ないことは、β−ｇａｌｌ ／ソマトスタチンを表現す
るプラスミドを含む細胞に対する強い選択性を示すもの
である。正しいβ−ｇａＡ！ ／ソマトスフチン融合を
示した唯一の単離体は第８＠に示すようにダイマ−のｐ
ＭＯＮ １００９であった。このプラスミドは頭から尾
へのオリエンテーションで２個のプラーク挿入体を有し
、これは互いに頭対頭のオリエンテーションの２個のｐ
ＢＲ３２７の２．７ ｋｂ断片に分離された。このプラ
スミドの中のβ−がラクトシダーゼ遺伝子のひとつはソ
マトスフチン遺伝子と逆の方向に読められる。その後の
すべての実験ではβ−ｇａｌ／ソマトスタチン融合ポリ
ペゾチドの原料としてｐＭＯＮ Ｉ Ｄ Ｄ ９を用い
た。
したオリエンテーションでプラーク断片が導入されてい
た。β−ｙ、ａｌがソマトスタチンと反対に読まれる第
８図の所望のＢ型の単離体は認められなかったが、Ｃに
よって示される構造のダイマープラスミドはみられ、β
−ｇａｐ ／ソマトスタチンの表現はなかった。ダイマ
ープラスミド（４分子のリクーションを要する）が生成
する条件下に七ツマープラスミド（Ｂ型構造）が存在し
ないことは、β−ｇａｌｌ ／ソマトスタチンを表現す
るプラスミドを含む細胞に対する強い選択性を示すもの
である。正しいβ−ｇａＡ！ ／ソマトスフチン融合を
示した唯一の単離体は第８＠に示すようにダイマ−のｐ
ＭＯＮ １００９であった。このプラスミドは頭から尾
へのオリエンテーションで２個のプラーク挿入体を有し
、これは互いに頭対頭のオリエンテーションの２個のｐ
ＢＲ３２７の２．７ ｋｂ断片に分離された。このプラ
スミドの中のβ−がラクトシダーゼ遺伝子のひとつはソ
マトスフチン遺伝子と逆の方向に読められる。その後の
すべての実験ではβ−ｇａｌ／ソマトスタチン融合ポリ
ペゾチドの原料としてｐＭＯＮ Ｉ Ｄ Ｄ ９を用い
た。
フ０ラスミドＡ１ ＣおよびｐＭＯＮ １００９ （第
８図に示した）を含むＪＭ １０１培養の対数的生育は
０．５ ｍＭ ＩＰＴＯで誘発しく対照は誘発しなかっ
た）、上述のようにＣＮＢｒ切断後のソマトスタチンの
存在を定量した。これらの実験の結果は第８表に示す。
８図に示した）を含むＪＭ １０１培養の対数的生育は
０．５ ｍＭ ＩＰＴＯで誘発しく対照は誘発しなかっ
た）、上述のようにＣＮＢｒ切断後のソマトスタチンの
存在を定量した。これらの実験の結果は第８表に示す。
第８表
１）ＭＯＮ１００４ ０．２
０．２６Ｘ Ｏ，２０，２ ７ｘ Ｏ，２０，２ ｐＭＯＮ １００９ ０．３０
２．５０．３５ ３．
１０．２０ ２．７０．２５
２．５ｐＭＯＮ １００９で産生し
、ＲＩＡで測定したソマトスタチンの非誘発レベルは、
ソマトスタチン構造配列を含み、プロモーターのない、
プラスミドｐＭＯＮ １００４で形質転換したＪＭ１０
１細胞における値よりわずかに高いのみであった。ｐＭ
ＯＮ１００９培養でのソマトスタチンのレベルはＩＰＴ
Ｇ ７８発で８〜１０倍に上昇したがプラスミドｐＭＯ
Ｎ１０Ｄ４、ＡまたはＣで形質転換した細胞では上昇は
みられなかった。この結果ｐＭｏｌｏ０９形質転換ＪＭ
１ （］ １培地中にみられたソマトスタチンハｐＭ
ＯＮ １００９中のβ−ｇａｌ／ソマトスタチンキメラ
遺伝子のｌａｃプロモーターからの転写によって生じた
ものでないことを示している。
０．２６Ｘ Ｏ，２０，２ ７ｘ Ｏ，２０，２ ｐＭＯＮ １００９ ０．３０
２．５０．３５ ３．
１０．２０ ２．７０．２５
２．５ｐＭＯＮ １００９で産生し
、ＲＩＡで測定したソマトスタチンの非誘発レベルは、
ソマトスタチン構造配列を含み、プロモーターのない、
プラスミドｐＭＯＮ １００４で形質転換したＪＭ１０
１細胞における値よりわずかに高いのみであった。ｐＭ
ＯＮ１００９培養でのソマトスタチンのレベルはＩＰＴ
Ｇ ７８発で８〜１０倍に上昇したがプラスミドｐＭＯ
Ｎ１０Ｄ４、ＡまたはＣで形質転換した細胞では上昇は
みられなかった。この結果ｐＭｏｌｏ０９形質転換ＪＭ
１ （］ １培地中にみられたソマトスタチンハｐＭ
ＯＮ １００９中のβ−ｇａｌ／ソマトスタチンキメラ
遺伝子のｌａｃプロモーターからの転写によって生じた
ものでないことを示している。
ｐＭ ｆ ００９はＪＭ １０１中ではかなり高い安定
性゛を維持し、精製ｐＭｏＮ１００９で形質転換したＪ
Ｍ１０１細胞中で細胞−ベルのソマトスフチン生成がみ
られた。
性゛を維持し、精製ｐＭｏＮ１００９で形質転換したＪ
Ｍ１０１細胞中で細胞−ベルのソマトスフチン生成がみ
られた。
β−ｇｅ＞１１ ／ ’ノマトスクチン融合遺伝子ｐＭ
ＯＮ１００９をＨｉｎｄ Ｉ■ および５ａｌＩ消化で
処理し、ｐＢＲ３２７ｆ：たはＴ）ＢＲ３２２に挿入す
ると、得られたデラスミ１はソマトスタチンをｐｍｏＮ
１００９に匹敵するレベルで願主する。しかしながら、
β−ｇａｌ／ソマトスタチンペプナドのＩＰＴ（）によ
る誘発はケゝル上で認められなかった。さらにｐＭＯＮ
１［］Ｄ９中でβ−ｇａ、ｌｌ遺伝子の５．９ ｋｂ
ＥｃｏＲＩ −［（ｉｎｄ ｆｌｌ ｆａｒ片をそのＥ
ｃｏＲＩとＨｉｎｄｎｌサイトの間でｐＢＲ３２７中に
クローン化すると第８図のプラスミドＡＫ類似のプラス
ミドが生成する。ソマトスタチン配列を除去したにもか
かわらす、この単離体によってはβ−ｇａｌの大きさの
タンパクの高レベルの誘発は起こらなかった。これらの
結果はＴ）ＭＯＮ １ ［Ｊ ０９ 中のβ−ｇａｌ／
ソマトスタチン遺伝子は正常なβ−ガラクトシダーゼ遺
伝子よりはるかに低速度で転写されろことをを示してい
る。
ＯＮ１００９をＨｉｎｄ Ｉ■ および５ａｌＩ消化で
処理し、ｐＢＲ３２７ｆ：たはＴ）ＢＲ３２２に挿入す
ると、得られたデラスミ１はソマトスタチンをｐｍｏＮ
１００９に匹敵するレベルで願主する。しかしながら、
β−ｇａｌ／ソマトスタチンペプナドのＩＰＴ（）によ
る誘発はケゝル上で認められなかった。さらにｐＭＯＮ
１［］Ｄ９中でβ−ｇａ、ｌｌ遺伝子の５．９ ｋｂ
ＥｃｏＲＩ −［（ｉｎｄ ｆｌｌ ｆａｒ片をそのＥ
ｃｏＲＩとＨｉｎｄｎｌサイトの間でｐＢＲ３２７中に
クローン化すると第８図のプラスミドＡＫ類似のプラス
ミドが生成する。ソマトスタチン配列を除去したにもか
かわらす、この単離体によってはβ−ｇａｌの大きさの
タンパクの高レベルの誘発は起こらなかった。これらの
結果はＴ）ＭＯＮ １ ［Ｊ ０９ 中のβ−ｇａｌ／
ソマトスタチン遺伝子は正常なβ−ガラクトシダーゼ遺
伝子よりはるかに低速度で転写されろことをを示してい
る。
β−ｇａｌ／ソマトスタチン融合ポリペブチ−を生成さ
せるために最善の努力を払ったか、得られたソマトスタ
チンの最高レベルは培地１ ｍｌｌ中ソ２５ｎ５’のソ
マトスタチンにすぎなかった。これはタンパク１ ｍｙ
あたり約４ｎｆ’のソマトスタチンに相当する。これに
対し、本発明の方法におけるｒｅＣＡ／゛ノマトスタチ
ンキメラ遺伝子では培地１ｍｌあたり９０口ｎ２のソマ
トスタチンが表現され、これはタンパク１■あたり約２
０００ｎｆのソマトスタチンに相当する。
せるために最善の努力を払ったか、得られたソマトスタ
チンの最高レベルは培地１ ｍｌｌ中ソ２５ｎ５’のソ
マトスタチンにすぎなかった。これはタンパク１ ｍｙ
あたり約４ｎｆ’のソマトスタチンに相当する。これに
対し、本発明の方法におけるｒｅＣＡ／゛ノマトスタチ
ンキメラ遺伝子では培地１ｍｌあたり９０口ｎ２のソマ
トスタチンが表現され、これはタンパク１■あたり約２
０００ｎｆのソマトスタチンに相当する。
クロラムフェニコールアセチルトランスフエラーｆ（Ｃ
ＡＴ）ンマトスタチン融合ペプチげを生成させる試みは
次の方法で行われた。ＥｃｏＲＩサイトは１）ＭＯＮ
２００３からのＥｃｏＲＩ −ＢａｍＨＩソマトスタチ
ン断片のＢａｍＨＩサイトの近くに、ＢａｍＨＩ切断で
生成した結合しやすい末端を満たし、ＥｃｏＲエサイト
に対する暗号のオリゴヌクレオチドＣＣＧＧＡＡＴＴＣ
ＣＧＧのりｒ−ジョンを行って平滑端に導く方法で導入
した。これによりＥＣ０ＲＩ末端によって結合されたソ
マトスタチン断片が得られた。この断片ヲＥＣ０ＲＩ
切断ｐＭＯＢ ４５ Ｋすｒ−トさせると、これは、Ｅ
Ｃ０ＲＩ断片かデラスミｒＫ適当なオリエンテーション
で入ると、ＣＡＴ遺伝子に対するわく内融合を起こすこ
とになる。ＥｃｏＲＩサイトに挿入されたソマトスタチ
ンをもつ２４個の独立の単離体についてオリエンテーシ
ョンを検査しく非対称５ａｌＩ→ブーイトによる）、所
望のオリエンテーションをもつ挿入体は全（ないことが
確認された。２４個すべての挿入体が所望されないオリ
エンテーションに挿入される確率は小さいので、所望の
オリエンテーションで挿入が起こるプラスミドを含む細
胞を強く拒否する代謝過程が働いているものと考えられ
る。
ＡＴ）ンマトスタチン融合ペプチげを生成させる試みは
次の方法で行われた。ＥｃｏＲＩサイトは１）ＭＯＮ
２００３からのＥｃｏＲＩ −ＢａｍＨＩソマトスタチ
ン断片のＢａｍＨＩサイトの近くに、ＢａｍＨＩ切断で
生成した結合しやすい末端を満たし、ＥｃｏＲエサイト
に対する暗号のオリゴヌクレオチドＣＣＧＧＡＡＴＴＣ
ＣＧＧのりｒ−ジョンを行って平滑端に導く方法で導入
した。これによりＥＣ０ＲＩ末端によって結合されたソ
マトスタチン断片が得られた。この断片ヲＥＣ０ＲＩ
切断ｐＭＯＢ ４５ Ｋすｒ−トさせると、これは、Ｅ
Ｃ０ＲＩ断片かデラスミｒＫ適当なオリエンテーション
で入ると、ＣＡＴ遺伝子に対するわく内融合を起こすこ
とになる。ＥｃｏＲＩサイトに挿入されたソマトスタチ
ンをもつ２４個の独立の単離体についてオリエンテーシ
ョンを検査しく非対称５ａｌＩ→ブーイトによる）、所
望のオリエンテーションをもつ挿入体は全（ないことが
確認された。２４個すべての挿入体が所望されないオリ
エンテーションに挿入される確率は小さいので、所望の
オリエンテーションで挿入が起こるプラスミドを含む細
胞を強く拒否する代謝過程が働いているものと考えられ
る。
例１０ ソマトスタチン類縁体
ｒｅｃ Ａプロモーター／オペレーター系をバクテリア
における異種ポリペプチドの生成に第１」用する例をさ
らに示すため、ソマトスタチン類縁体に対する一連の暗
号分節を製造し、上述の天然ソマトスタチンの場合と同
様にしてｒｅｃ Ａに融合させた。
における異種ポリペプチドの生成に第１」用する例をさ
らに示すため、ソマトスタチン類縁体に対する一連の暗
号分節を製造し、上述の天然ソマトスタチンの場合と同
様にしてｒｅｃ Ａに融合させた。
この種の類縁体はいずれも１個のアミノ酸がソマトスタ
チンと異なるものである。
チンと異なるものである。
Φ
かくして製造したソマトスタチン類縁体は以のアミノ酸
が置換されている。
が置換されている。
残基Ｎｌ 類縁体 天然体９ アラニ
ン リ ジ ン ９ アルギニン リ ジ ン ７ アラニン フェニルアラニン試験結果は第９
表に示す。
ン リ ジ ン ９ アルギニン リ ジ ン ７ アラニン フェニルアラニン試験結果は第９
表に示す。
第９表
融合（ｒｅｃＡ：ｐｐ ） 培地中のソマ
トスタチンｎｆ／ｍ１（ＲＩＡ法） 天然ソマトスタチ７ ８００
ソマトスタチン類縁体アラニン９ １６０
ソマトスタチン類縁体アルギニン９ ６００
ソマトスタチン類縁体アラニン７２ 対照（）０ラスミＰなし） ２ｐｐ
−ボリペフ０チＰ暗号分節 （１）フ０ラスミドなし、（２） Ｔ）ＭＯＮ ２５０
７、（３）ｐＤＲ１４６１または（４） ｐＭＯＮ ２
０１２のいずれかのＥ、 ｃｏｌｉ ＤＢ １４４ろを
２ＸＹＴ培地で１５０ Ｋｌｅｔｔまで生育させた。培
地を２分した。各部分に１■／ゴのマイトマイシンＣか
５０■／ ｍｅのナルジキシ酸を添加した。これを３７
′Ｃで２時間インキュベートした。
トスタチンｎｆ／ｍ１（ＲＩＡ法） 天然ソマトスタチ７ ８００
ソマトスタチン類縁体アラニン９ １６０
ソマトスタチン類縁体アルギニン９ ６００
ソマトスタチン類縁体アラニン７２ 対照（）０ラスミＰなし） ２ｐｐ
−ボリペフ０チＰ暗号分節 （１）フ０ラスミドなし、（２） Ｔ）ＭＯＮ ２５０
７、（３）ｐＤＲ１４６１または（４） ｐＭＯＮ ２
０１２のいずれかのＥ、 ｃｏｌｉ ＤＢ １４４ろを
２ＸＹＴ培地で１５０ Ｋｌｅｔｔまで生育させた。培
地を２分した。各部分に１■／ゴのマイトマイシンＣか
５０■／ ｍｅのナルジキシ酸を添加した。これを３７
′Ｃで２時間インキュベートした。
サンプル１ｍｌをとり、１００ ｍＭ ＮａＣＪＶ、お
よび５０ ｍＭ ）リス−ＨＣ１，１ｍｌで洗浄し、再
びペレットとした。サンプルを一夜、７０ｍ１ギ酸１
ｍｅ中５■／ｍｌのＣＮＢｒで加水分解し、ついで凍結
乾燥して放射免疫法で分析した。
よび５０ ｍＭ ）リス−ＨＣ１，１ｍｌで洗浄し、再
びペレットとした。サンプルを一夜、７０ｍ１ギ酸１
ｍｅ中５■／ｍｌのＣＮＢｒで加水分解し、ついで凍結
乾燥して放射免疫法で分析した。
（１）プラスミドなし、（２） ｐＭＯＮ ２５０７、
または（３） ｐＤＲ４６１のいずれかを含むＥ、 ｃ
ｏｌｉ Ｂ／ｒ細胞を０．２％グルコースのＭ９の最小
限の培地でＫｌｅｔｔ １５０まで生育させた。培地を
２分し、半分にはナルジキシ酸５０’ｉ２／ｌｎｌを加
えた。他の半分はプラスチックのペトリ皿に置き１０秒
間１Ｊ／ｍ”／ｓｅｃ の紫外線照射を行った。培地
を６７℃で２時間インキュベートした。サンプルは上と
同様に処理し分析した。
または（３） ｐＤＲ４６１のいずれかを含むＥ、 ｃ
ｏｌｉ Ｂ／ｒ細胞を０．２％グルコースのＭ９の最小
限の培地でＫｌｅｔｔ １５０まで生育させた。培地を
２分し、半分にはナルジキシ酸５０’ｉ２／ｌｎｌを加
えた。他の半分はプラスチックのペトリ皿に置き１０秒
間１Ｊ／ｍ”／ｓｅｃ の紫外線照射を行った。培地
を６７℃で２時間インキュベートした。サンプルは上と
同様に処理し分析した。
各処理のサンプル１−を上述のように処理し、標準とし
てウシ血清アルブミン（ＢＳＡ ）を用い、７ろＱ ｎ
ｍの吸収に半るＬｏｗｒｙ法にしたがって総タンパク含
量を分析した。結果は第１０表に示すようにＲＩＡ活性
と相関した。
てウシ血清アルブミン（ＢＳＡ ）を用い、７ろＱ ｎ
ｍの吸収に半るＬｏｗｒｙ法にしたがって総タンパク含
量を分析した。結果は第１０表に示すようにＲＩＡ活性
と相関した。
第１０表
対照培地 ４
ＤＢ１４４３ （ｐＭＯＮ２５０７ ）非誘発
７０ ０．１５ナルジキシ酸
１７５０ ３．９３マイトマイシ
ンＣ２５０［］ ７．６２ＤＢ１４４ろ（
ｐＭｏＮ２０１２ ） 非誘発 ６２．５ １１．１４
ナルジキシ酸 １３００ ５
．６７マイトマイシンｃ ２１５０
７．５７Ｂ／ｒ （ｐＭＯＮ２５０７ ） 非誘発 ３７．５ ０．０１
４ナルジキシ酸 ３６２．５
１．０５紫外線 ４００ １
．２９本発明の技術分野における熟練者は、上述の本発
明の特定態様と均等の数多くの態様を、通常の実験にす
ぎない作業で確認できることは明白である。これらの均
等物、均等方法は本発明の範囲に包含されるものである
。
７０ ０．１５ナルジキシ酸
１７５０ ３．９３マイトマイシ
ンＣ２５０［］ ７．６２ＤＢ１４４ろ（
ｐＭｏＮ２０１２ ） 非誘発 ６２．５ １１．１４
ナルジキシ酸 １３００ ５
．６７マイトマイシンｃ ２１５０
７．５７Ｂ／ｒ （ｐＭＯＮ２５０７ ） 非誘発 ３７．５ ０．０１
４ナルジキシ酸 ３６２．５
１．０５紫外線 ４００ １
．２９本発明の技術分野における熟練者は、上述の本発
明の特定態様と均等の数多くの態様を、通常の実験にす
ぎない作業で確認できることは明白である。これらの均
等物、均等方法は本発明の範囲に包含されるものである
。
第１図はＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ切断サイトが結合した
ソマトスタチンの構造配列を含むプラスミドｐＭＯＮ
２００３の構成を例示したものであり、第２図はＥｃｏ
ＲＩおよびＢａｍＨＩ切断サイドが結合したｒｅｃ Ａ
プロモーター／オペレーター領域を含むプラスミドｐＤ
Ｒ１４６１の構成を例示したものであり、第６図はｒｅ
ｃ Ａプロモーター／オペレーターおよび部分構造配列
のソマトスタチン構造配列のリケゞ−ジョンによるキメ
ラ遺伝子の形成の例示である。キメラｒｅｃＡ／ソマト
スタチン遺伝子はＢａｍＨＩ断片上に単離され、断片は
Ｍｌろファージ（オリエンテーションが相違する２オホ
）に挿入し、プラスミドｐＭＯＮ ２０ Ｄ ５および
ｐＭＯＮ ２００４を生成させる。第４図はｒｅｃＡ／
ソマトスタチンキメラ遺伝子をｐＭＯＢ ４、．５ （
オリエンテーションが相違する２種）へ挿入し、プラス
ミドｐＭＯＮ ２５０６およびＴ）ＭＯＮ ２５０５の
生成を例示し、第５図はｒｅｃＡ／ソマトスタチンキメ
ラ遺伝子をｐＫｏ −ＩＭ（オリエンテンションの相違
する２種へ挿入しデラスミＰ ｐＭＯＮ ２５０８およ
び２５０７の生成を例示し、第６図はｒｅｃ Ａの４８
個のアミノ酸の暗号をもつｒｅｃ Ａ ／ソマトスフチ
ン遺伝子を含むｐＭＯＮ ２５５４の構成を例示し、第
７図はそれぞれｒｅｃ Ａの２６０および６６０のアミ
ノ酸の暗号をもつｒｅｃ Ａ ／ソマトスタチン遺伝子
を含むｐＭＯＮ ２５３９およびｐＭＯＮ ２５４０の
構成を例示し、第８図はβ−ｇａｌソマトスタチン融合
ポリペプチドを生成させる試みのために製造した各種）
０ラスミドを例示する。第１図〜第５図中に示したプラ
スミドの矢印は翻訳方向を示すものである。 代理人 棧 村 皓 図面の浄；（内容に変更なし） ｃｏＲ１ Ｅ（−ｏＲＩ
ＥｃｏＲ１￥Ｚ図 ＥｃｏＲＩ ＥｃｏＲ１￥ ４−
Ｅｌ てケ凰 手続補正書（自発） 昭和５８年１２月 ７日 特許庁長官殿 １、事件の表示 ヨゎ５８工特４カｉ １９８９’、５２ ｒｑ万 ３、補正をする者 事１′１；との関係 持ｒ「出願人 任 所 氏名 モンサント コンパニー （名 称） ４、代理人 ５、補正命令の日刊 昭和 年 月 １」６、補正により
増加する発明の数 ７、補正の対象 明細書 ８、補正の内容 別紙のとおり 明細書の浄書 （内容に変更なし） 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和 ５８ 年特許願第 １９８９５２ 号２、発
明の名称 ｒｅＣＡ −４へ・レータ−＆６１’Ｌｄ、’９ へ’
４’ｒ 障１１３、補正をする者 事件との関係 持、ｉ′］出願人 住 所 ４、代理人 昭和５９年 １月 ３１日 ６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象 図面の浄り （内で７に変更なし） ８、補正の内容 別紙のとおり
ソマトスタチンの構造配列を含むプラスミドｐＭＯＮ
２００３の構成を例示したものであり、第２図はＥｃｏ
ＲＩおよびＢａｍＨＩ切断サイドが結合したｒｅｃ Ａ
プロモーター／オペレーター領域を含むプラスミドｐＤ
Ｒ１４６１の構成を例示したものであり、第６図はｒｅ
ｃ Ａプロモーター／オペレーターおよび部分構造配列
のソマトスタチン構造配列のリケゞ−ジョンによるキメ
ラ遺伝子の形成の例示である。キメラｒｅｃＡ／ソマト
スタチン遺伝子はＢａｍＨＩ断片上に単離され、断片は
Ｍｌろファージ（オリエンテーションが相違する２オホ
）に挿入し、プラスミドｐＭＯＮ ２０ Ｄ ５および
ｐＭＯＮ ２００４を生成させる。第４図はｒｅｃＡ／
ソマトスタチンキメラ遺伝子をｐＭＯＢ ４、．５ （
オリエンテーションが相違する２種）へ挿入し、プラス
ミドｐＭＯＮ ２５０６およびＴ）ＭＯＮ ２５０５の
生成を例示し、第５図はｒｅｃＡ／ソマトスタチンキメ
ラ遺伝子をｐＫｏ −ＩＭ（オリエンテンションの相違
する２種へ挿入しデラスミＰ ｐＭＯＮ ２５０８およ
び２５０７の生成を例示し、第６図はｒｅｃ Ａの４８
個のアミノ酸の暗号をもつｒｅｃ Ａ ／ソマトスフチ
ン遺伝子を含むｐＭＯＮ ２５５４の構成を例示し、第
７図はそれぞれｒｅｃ Ａの２６０および６６０のアミ
ノ酸の暗号をもつｒｅｃ Ａ ／ソマトスタチン遺伝子
を含むｐＭＯＮ ２５３９およびｐＭＯＮ ２５４０の
構成を例示し、第８図はβ−ｇａｌソマトスタチン融合
ポリペプチドを生成させる試みのために製造した各種）
０ラスミドを例示する。第１図〜第５図中に示したプラ
スミドの矢印は翻訳方向を示すものである。 代理人 棧 村 皓 図面の浄；（内容に変更なし） ｃｏＲ１ Ｅ（−ｏＲＩ
ＥｃｏＲ１￥Ｚ図 ＥｃｏＲＩ ＥｃｏＲ１￥ ４−
Ｅｌ てケ凰 手続補正書（自発） 昭和５８年１２月 ７日 特許庁長官殿 １、事件の表示 ヨゎ５８工特４カｉ １９８９’、５２ ｒｑ万 ３、補正をする者 事１′１；との関係 持ｒ「出願人 任 所 氏名 モンサント コンパニー （名 称） ４、代理人 ５、補正命令の日刊 昭和 年 月 １」６、補正により
増加する発明の数 ７、補正の対象 明細書 ８、補正の内容 別紙のとおり 明細書の浄書 （内容に変更なし） 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和 ５８ 年特許願第 １９８９５２ 号２、発
明の名称 ｒｅＣＡ −４へ・レータ−＆６１’Ｌｄ、’９ へ’
４’ｒ 障１１３、補正をする者 事件との関係 持、ｉ′］出願人 住 所 ４、代理人 昭和５９年 １月 ３１日 ６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象 図面の浄り （内で７に変更なし） ８、補正の内容 別紙のとおり
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）異種ポリペプチドの表現に有利な適当条件下に、
ｒｅｃＡフ０ロモーター／オペレータ一部分とバクテリ
アによって異種ポリペプチドに翻訳用能な構造配列とか
らなる遺伝子の１種または２種板」二の模写を含有する
適当なバクテリア宿主細胞を培査することを％僧とする
バクテリア中に異種ボリペフ０チドを産生させる方法 （２）異種ポリペプチドの表現に有利な適当条件は宿主
細胞を以下の物ηまたは条件、すなわちナルジキシ酸、
マイトマイシンｃ１紫外線照射、高温およびチミン飢餓
の１ ｆｊｆまたは２種以上への暴露である特許請求の
範囲第１項記載の方法（３）異種ポリペプチドは融合ポ
リペプチドの部分として産生される特許請求の範囲第１
項記載の方法 （４）融合フ」セリペデチ団は大腸菌のｒｅｃ Ａポリ
ペプチドまたはその部分である特許請求の範囲第６項記
載の方法 （５） さらに融合ポリペプチドを選択されたアミノ
酸残基または配列において異種ポリペプチドに切断する
特許請求の範囲第６頂記載の方法（６）異種ポリペプチ
ドはソマトスタチンのアミノ酸配列である特許請求の範
囲第６項記載の方法（７）異種ポリペプチドはソマトス
タチンの生物学的機能類縁体または断片のアミノ酸配列
またはその誘碑値である特許請求の範囲第３項記載の方
法（８） ｒｅｃ Ａポリペプチドの部分は約１５０
個以上のアミノ酸残基を含有する特許請求の範囲第４項
記載の方法 （９） ｒｅｃＡポリペプチドの断片はａ）ポリペプ
チドを所望の場所で切断するための適当な部位を提供す
る選択されたアミノ酸残基または配列、およびｂ）ソマ
トスタチンのアミノ酸配列またはソマトスタチンの生物
学的機能類縁体または断片からなるポリペプチド鎖に続
く特許請求の範囲第８項記載の方法 θ０ 感覚鎖の第１の５′末端から第２の６′末端に至
る相に ａ）ｒｅｃＡプロモーター／オペレーター領域
、ｂ）宿主細胞内で構造遺伝子の翻訳を増強するのに適
当なりボゾーム結合部位を含んだ５′−非翻訳領域、ｃ
）宿主細胞内で選択された異種ポリペプチドに翻訳可能
な構造配列を有する２木調Ｄ Ｎ Ａクローニングベク
ター Ｏυ 異種ポリペプチドの暗号であるＤＮＡ配列を宿主
細胞に関して内因性のポリペブチＰの暗号であるＤＮＡ
配列と融合させた特許請求の範囲第１０項記載のクロー
ニングベクター ＠ 内因性のポリペプチドはｒｅｃ Ａポリペプチドま
たはその部分である特許請求の範囲第１１順記載のクロ
ーニングベクター ｕ４ 異種ポリペプチドはソマトスタチンまたはその
生物学的機能類縁体もしくはその断片である特許請求の
範囲第１１項記載のりｌコーニングベクタＱ４） ａ
） ｒｅＣＡプロモーター／オペレーター領域および
ｂ）ｒｅｃＡ遺伝子以外の１棟もしくは２棟以上の遺伝
子に由来する５′−非翻訳領域からなる２本鎖ＤＮＡク
ローニングベクター ００ 第４図の制限マツプに示されたプラスミドｐＭ
、ＯＮ ２５０６ ｑＱ 第５図の制限マツプ０に示されたプラスミＰｐ
ＭＯＮ ２５０７ αη ＡＴＣＣ寄託番号第６９２１１号の培養細胞に相
当する性質を有する培養細胞 αＱ ＡＴＣＣ寄託番号第３９２１２号の培養細胞に
相当する性質を有する培養細胞 （１’Ｊ ＡＴＣＣ寄託番号第５９２１１号の培養細
胞から複製または誘導された培養細胞 （４） ＡＴＣＣ寄託番号第３９２１２号の培養細胞か
ら複製または誘導された培養細胞 Ｉ２、特許請求の範囲第１項記載の方法で製造されたポ
リペプチド （ハ）特許請求の範囲第４項記載の方法で製造されたポ
リペブチ１ （イ）特許請求の範囲第５項記載の方法で製造されたポ
リペプチド （ハ）特許請求の範囲第９項記載の方法で製造されたポ
リペブチに （ハ） ａ） ｒｅｃ Ａまたはその部分もしくは誘
導体のアミノ酸配列およびｂ）ソマトスタチンまたはそ
の生物学的機能類縁体もしくはその断片からなるポリペ
プチド （イ） ｒｅｃ Ａのアミノ酸配列のアミノ酸残基約１
５０個以上を含有する特許請求の範囲第２５項記載のボ
リペフ０チド （２）所望の位置でポリペプチドを切断する方法を与え
る選択されたアミノ酸残基または配列を含有する特許請
求の範囲第２６項記載のポリペプチＰ
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US43620982A | 1982-10-25 | 1982-10-25 | |
| US436209 | 1982-10-25 | ||
| US523254 | 1983-08-15 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59130186A true JPS59130186A (ja) | 1984-07-26 |
Family
ID=23731552
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19895283A Pending JPS59130186A (ja) | 1982-10-25 | 1983-10-24 | ｒｅｃＡオペレ−タ−依存性ポリペプチドの産生 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59130186A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62135500A (ja) * | 1985-06-20 | 1987-06-18 | モンサント コンパニ− | ポリペプチドからのペプチドの放出 |
-
1983
- 1983-10-24 JP JP19895283A patent/JPS59130186A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62135500A (ja) * | 1985-06-20 | 1987-06-18 | モンサント コンパニ− | ポリペプチドからのペプチドの放出 |
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