JP2574142B2 - 組換えリシン毒素フラグメント - Google Patents

組換えリシン毒素フラグメント

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は組換え技法を用いる
毒素フラグメントの産生に関する。さらに具体的には、
本発明は組換え方法を用いてリシン毒素のＢフラグメン
トを産生する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】リシン毒素（ＲＴ又はリシン）は、酵素
的に活性で、細胞毒性の“Ａ”アミノ酸配列、及び
“Ｂ”配列から成る天然に存在する毒素であり、そして
この“Ｂ”配列は、殺されるべき標的細胞に“Ａ”配列
を付着せしめること、及び細胞質内へのＡフラグメント
の移動を促進することの両者を担当すると思われる。そ
のような毒素の他の例は、ジフテリアトキシン及び緑膿
菌(Pseudomonas aeruginosa)からのエキソトキシンを含
む。たとえば、他の毒素タンパク質、たとえばアメリカ
ヤマゴボウ(Phytolacca americana)(PAPI，PAPII，及び
PAP-S)及びゲロニン(gelonin)に由来するものは、上記
の毒素の“Ａ”配列に相当する活性をin vitroにおいて
示すが、しかし多分“Ｂ”鎖が存在しないためin vivo
においては不活性である。
【０００３】本発明の“リシン”ペプチドはトウゴマと
して通常知られている、ヒマ(Ricinus communis)の種子
に由来する。２つの類似するタンパク質(しばしばレク
チンと呼ばれる)、すなわち上記のリシン及びリシンコ
ムニスアグルチニン(Ricin communis aggulutinin)(Ｒ
ＣＡ)がこれらの種子から抽出できる。両タンパク質
は、Ａ及びＢ部分を含むが、しかしながらこのＡ及びＢ
部分は、単一のペプチドを構成しない。これらの成分の
Ａ部分は、in vitroにおいてリボソームのラージサブユ
ニットを触媒的に不活性化することができ、そしてin v
ivoにおける細胞毒性についてのリシンの機構は、リボ
ソームの不活性化のための能力にあると思われる。リシ
ン及びＲＣＡは非常に相同であるように思える[Cawley,
D. B.,など、Arch. Biochem. Biophys.(1978) 190：74
4] がしかし相違点も存在する。ＲＣＡは劇的に少ない
毒性であり、そしてリシンの二量体について予想される
特性に相当する特性を示すように思える。
【０００４】リシン及びＲＣＡの成分は抽出された物質
に基づいて十分に特徴づけられそして配列決定された[F
unatsu, G.,など、Agric. Biol. Chem.(1979) 43：222
1]。リシンは58,000ダルトンの見掛分子量を有し、そし
て32,000ダルトンの分子量を有するＡ鎖及び34,700ダル
トンの分子量のＢ鎖から成る。ＲＣＡは、おのおのの分
子量が32,000ダルトンの２つのＡサブユニット、及びお
のおのの分子量が36,000ダルトンの２つのＢサブユニッ
トを有する四量体である。それらの本来の環境におい
て、Ｂ鎖は一般的にグリコシル化される。リシン及びＲ
ＣＡの両者のＡ及びＢサブユニットは単一のジスルフィ
ド結合によってのみ結合され、そしてたとえば、単鎖ペ
プチドとして存在するジフテリア毒素と違ってペプチド
結合[Funatsu,G.，など、Agri. Biol. Chem.(1977) 4
1：1211]によって結合されていない。リシン及びＲＣＡ
の両者は、Ａ及びＢ部分のために別々のペプチドを有す
るけれども、おのおのの場合、単鎖前駆体に由来するこ
ともまた知られている[Butlerworth,H.E.，など、Eur.
J. Biochem（1983）137：57] 。この発明に関する研究
の結果として、単鎖前駆体はＡ鎖配列（アミノ末端）及
びＢ鎖配列の間に12個のアミノ酸の配列を含むらしいこ
とが示された。12量体の介在ペプチドの切り出し後、Ａ
及びＢ鎖は単一のジスルフィド結合を介して結合し続け
ると推定される。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、組換え体技
法を用いてリシンのＢ鎖を得るための手段を提供し、従
って完全なアミノ酸配列を非常に正確に提供し、そして
その活性のために要求される構造的特徴の探究を可能に
する。本発明の技法及び材料は、さらにＢ鎖のアミノ酸
配列の選択的修飾を可能にし、そしてそれ故、リシン又
は他の毒素及びその誘導体の細胞毒素性を高めることが
できる特性を提供する操作を可能にする。さらに指図さ
れた修飾を可能にする、予測でき、有効な、そして経済
的な方法を用いて、リシンのＢ鎖の産生を可能にするこ
とによって、本発明は、今まで不可能であった実際的な
及び改良された方法においてＢ鎖の使用を可能にする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】１つの局面においては、
本発明は組換え技法を用いて調製されるリシンＢに関す
る。所望によりリシンＢのアミノ酸配列はトウゴマの種
子から抽出されるリシンＢのアミノ酸配列と完全に同一
であることができるが、しかし組換え体生成物はその生
産環境により必然的にいく分変形され、そしてアミノ酸
配列又はグリコシル化のレベルでの変更を含むように製
造者の意志でさらに変形され得る。従って、本発明の１
つの局面は、組換え技法によるリシンＢの産生方法、及
びそのようてして産生されたリシンＢである。
【０００７】他の局面においては、本発明は、リシンＢ
鎖の発現をもたらすことができる発現ベクター、そのよ
うなベクターにより形質転換された宿主細胞、及びそれ
の培養に向けられる。
【０００８】新規の一連の反応を用いてリシンＢタンパ
ク質のためのコード配列の調製を完結することが可能で
あった。リシンＢをコードする配列の実質的な部分を含
むクローニングベクターは、このクローニングベクター
中におけるｃＤＮＡ挿入部の５'末端に近い方の制限部
位での消化、次に、場合によっては必要であるかもしれ
ないが、ｃＤＮＡ挿入部の開始部の前に介在するヌクレ
オチドを取り除くために十分なヌクレアーゼS1による消
化、及び５'付着端を得るためのエキソヌクレアーゼIII
による処理によって変形された。次に、この付着端ベク
ターは、２つのオリゴヌクレオチドの混合物と共に処理
され、このおのおののオリゴヌクレオチドは目的とする
リシンＢタンパク質のN-末端のためのコード配列を完結
するために必要とされる配列の一部を含み、そしてこの
おのおののオリゴヌクレオチドは、お互いに関して、及
びｃＤＮＡ配列の５'付着端及び切断されたベクター配
列の５'付着端に関してオーバラップする十分な領域を
有し、大部分が単鎖配列であるタンデムブリッヂを形成
した。ＤＮＡポリメラーゼＩ(Klenow大フラグメント)の
作用によって二重鎖を形成し、そしてリガーゼにより処
理した場合、これらのオリゴヌクレオチド及びエキソヌ
クレアーゼIIIにより処理されたベクターは、開始コド
ンの５'の便利な制限部位と一緒に、目的のタンパク質
のための完全なコード配列を提供するようにｃＤＮＡ挿
入部の欠損部分を再生し、そしてベクターを再連結し
た。
【０００９】本発明の方法は目的のＤＮＡ配列を完結す
るための又は一般的に目的のＤＮＡ生成物を得るために
変形、削除し又は二重鎖ＤＮＡに配列を付与するため
の、広く適用できる方法を提供する。それは、制限酵素
によりベクターのＤＮＡ配列を消化し、望ましくないヌ
クレオチドを取り除き、５'付着端を形成するためにエ
キソヌクレアーゼIIIにより前記の切断されたベクター
を処理し、このようにして処理されたベクターと偶数個
の単鎖ヌクレオチドとを混合し(これらのヌクレオチド
は生成物ＤＮＡ中の目的とする配列をコードするか又は
それに対して相補的である交互のセンス鎖及びアンチセ
ンス鎖から成り、そしてこれらの単鎖ヌクレオチドは隣
接するオリゴヌクレオチドの末端及び/又は開裂された
ベクターの５'付着端とオーバラップしそしてそれに対
して相補的であり、その結果、もとの開裂部位の上流の
５'付着端ともとの開裂部位の下流の５'付着端との間に
タンデムブリッジを形成する)、そして前記混合物をＤ
ＮＡポリメラーゼＩ(Klenowフラグメント)及びリガーゼ
により処理することを含んで成る。目的とする生成物Ｄ
ＮＡ配列を得るための二重鎖ＤＮＡ配列の変形のための
この一般化された方法はまた、この明細書に開示されて
いる発明の１つの局面である。
【００１０】さらにもう１つの局面においては、本発明
は、リシンＢをコードするメッセンジャーＲＮＡを調製
する場合に使用される方法に適用されるメッセンジャー
ＲＮＡの製造方法における改良に関する。１つのそのよ
うな改良法は、植物組織からのｍＲＮＡの単離のために
特異的である。なぜならば植物抽出物は、次の酵素的操
作たとえばin vitroにおける翻訳及び逆転写を抑制する
酸化フェノール類を伴うからである。それらは、Sephad
ex Ｇ−100により調製物を処理することによって取り除
かれ得る。すべてのｍＲＮＡ製造に一般的なさらに進ん
だ改良法は、リボソームＲＮＡからｍＲＮＡを常用のdT
アフィニティーカラムにより分離する前に、変性剤によ
りその調製物を処理することを含んで成る。
【００１１】
【発明の実施の形態】Ａ．定義 本明細書で使用される“リシンＢ”なる用語はアミノ酸
配列がトウゴマ(Castor beans)の種子から抽出できるリ
シンＢぺプチドの配列と実質的に類似するタンパク質を
意味する。トウゴマからのリシンＢは、長さにしておよ
そ260個のアミノ酸であり、そしておよそ34,700ダルト
ンの分子量を有する。しかしながら、正確な配列は種々
のトウゴマに依存して変わることが知られている。
【００１２】“実質的に類似する”なる用語は、問題の
タンパク質がおよそ同じ長さ(任意に約10%以内)である
べきであるがしかし、さらに重要なことには、関連する
毒素分子の細胞内取り込みを促進するリシンＢ鎖の能力
を保持すべきであることを意味する。タンパク質配列中
のある小さな変化をタンパク質分子の機能性を妨げない
で実施できるが、但し、他の変形は完全に破壊的である
ことがよく知られている。特定の変化が属するであろう
カテゴリーを確信をもって予測することは今のところ不
可能である。本明細書における定義は第１のカテゴリー
にあるいずれの変形をも含む。そのような変化は遺伝子
配列中の偶然の突然変異又はそれの意図的な変化から生
じる。さらに、よく知られているように、タンパク質配
列は、他の分子、たとえばグリコシド、脂質、又は無機
イオン、たとえばリン酸塩によって変形され得る。イオ
ン化状態もまた、培地のpHまたは単離形態の結晶化もし
くは沈殿が生じるpHに依存して変化するであろう。さら
に空気の存在が不安定基、たとえば、-SHの酸化を引き
起こすことができる。特定の一次構造の変化、すなわ
ち、たとえばグリコシル化された形及びグリコシル化さ
れていない形の両者、中和形、酸性塩及び塩基性塩、脂
質又は他のものと会合したペプチド形、酸化又は誘導体
化による側鎖の変化、及び同じ遺伝子コドン配列によっ
てコードされたアミノ酸配列の他のそのような変化がリ
シンＢの定義内のものと意図される。
【００１３】本発明の方法によって製造されるリシンＢ
を記載に用いる場合、“不純物”なる用語は、トウゴマ
の種子内に産生される場合、リシンＢに通常伴う物質を
意味し、そしてこれは上記のタンパク質の変形の中に含
まれない。従って、“不純物”なる用語は、リシンＡ及
びアグルチニン並びに通常リシンＢに非特異的に関連す
る他のトウゴマ種子の細胞物質を意味する。
【００１４】ＤＮＡ配列の記載に用いられる場合、“作
用可能的に結合した”なる用語は、配列の機能が保持さ
れるような態様における並置を意味する。従って、たと
えばプロモーターに“作用可能的に結合した”コード配
列は、そのプロモーターがコード配列の発現をもたらす
ことができるように位置する。
【００１５】“制御”配列とは、転写及び翻訳の開始及
び終結を制御するＤＮＡ配列に関する。たとえば、原核
系においては、制御配列はプロモーター又はプロモータ
ー／オペレーター及びリボソーム結合部位をコードする
ヌクレオチドを包含する。
【００１６】“組換え体宿主細胞”なる用語は、組換え
技法によって構成されたＤＮＡ配列により形質転換され
た細胞を意味する。そのような言及は、たとえば濾過に
よって分離された場合の細胞又は遠心分離によるペレッ
トとしての細胞、及びこれらの細胞の培養物のいずれを
も含む。実際に、文脈が許す場合、“細胞”及び“細胞
培養物”なる用語はこの明細書においては交換可能的に
用いられる。
【００１７】“上流の切断末端”及び“下流の切断末
端”なる用語は、二重鎖ＤＮＡが制限酵素により切断さ
れる場合に得られるＤＮＡ配列の末端を意味する。使用
される酵素に依存して、その末端は付着端又は平滑末端
であることができる。普通の方法を用いれば、“上流の
末端”に関しては、センス鎖は３'で終わり、そしてア
ンチ−センス鎖は５'で終わる。“下流の末端”に関し
ては、逆が真である。
【００１８】一連の単鎖オリゴヌクレオチドを記載する
のに用いられる場合、“センス配列及びアンチ−センス
配列から交互に成る”ということは、“おおよそ”端と
端をつないで配列される場合、オリゴヌクレオチドが一
緒になって、センス−／アンチ−センス／センス／アン
チ−センス、等、すなわち
【００１９】
【化３】
【００２０】と次々に連なるおのおののオリゴヌクレオ
チド配列により完全な配列を提供するであろうことを意
味する。前述の項における“おおよそ”とは、オリゴヌ
クレオチドがそれらの長さの89%以上でオーバラップせ
ず、その結果ハイブリダイゼーションが末端で、すなわ
ち
【００２１】
【化４】
【００２２】のように生じることができることを意味す
る。
【００２３】ＤＮＡ配列の関係を記載するために用いら
れる場合、“〜と連なる”なる用語は、１つの配列が他
の配列の継続であり、又は他の配列の継続に対して相補
的であるような関係を意味する。しかしながら、継続性
は前のパラグラフの意味では“おおよそ”であろう。
【００２４】Ｂ．リシンＢコード配列のクローニング及
び発現 組換え体リシンＢを得るための次のアプローチは要約す
れば次のとおりである：すなわち、 １．天然に存在するリシンＢについて公表された配列
は、最小のコドンの冗長性に関連するアミノ酸配列、す
なわち Trp-Met-Phe-Lys-Asn-Asp-Gly（図２を参照のこ
と）の存在を示した。この配列をコードするすべてのオ
リゴヌクレオチド配列の混合物をプローブとして構成し
た。
【００２５】２．一般に通常の方法によってトウゴマの
種子からｍＲＮＡを単離し、そして対応するｃＤＮＡを
調製することによってｃＤＮＡライブラリーを構成し
た。しかしながら、その構成の間、EcoRI/SalI部位を提
結する挿入部を得るためにｃＤＮＡの末端に適切なリン
カーを連結した。次にEcoRI/SalI挿入部をクローニング
ベクター、すなわちｐＵＣ１３中に連結し、そしてE.co
li中に形質転換した。前記プローブと共にハイブリッド
形成することができる好結果の形質転換体を選択し、そ
して配列決定した。
【００２６】３．大部分のリシンＢ配列及びアグルチニ
ンＢ配列を含むコロニーを得た。さらに、ＲＣＡ及びリ
シンの両者の一部の推定されるペプチド前駆体(従って
このコロニーは12個のアミノ酸の架橋ペプチドを含む)
のための配列を含むコロニーが得られることが示され
た。ｃＤＮＡ挿入部は、Ａ部分中で始まりそしておのお
ののＢ領域中にオーバラップする配列を含んでいた。前
述のコロニーに由来するプラスミドは、この明細書にお
いてそれぞれｐＲＴＢ５，ｐＲＴＢ４，及びｐＲＴＡ１
１５と命名される。
【００２７】４．完全なリシンＢ鎖（但し１１Ｎ−末端
アミノ酸を除く）のためのコード配列を含む、ｐＲＴＢ
５中のｃＤＮＡ挿入部を切り出し、そしてｐＵＣ８中に
挿入することによって1acプロモーターに関して正しい
方向に配置し、ｐＲＴＢ１５１を得た。ｐＲＴＢ１５１
を下記のＣ項に記載されている方法によって変形し、適
切なコード配列、開始コドン、及び都合よく配置された
上流のHindIII部位を付加し、ｐＲＴＢ６０１を得た。
ｃＤＮＡライブラリーを得るために用いられるクローニ
ングベクターは、ベクター中に連結のために用いられる
SalＩ部位のすぐ下流にHindIIIを含み、そして従って、
開始コドンを含む完全なコード配列は、変形されたベク
ターのHindIIIによる処理によって切り出すことができ
る。
【００２８】５．ｐＲＴＢ１５１中のdes-N-末端リシン
Ｂのコード配列を、1acプロモーターと正しく読み枠が
整合するように配置しｐＲＴＢ２３６を得た。この得ら
れる融合タンパク質について中程度の発現を得ることが
できた。
【００２９】６．ｐＲＴＢ６０１からHindIIIカセット
としてコード配列を取り出しそして再連結しそれをtrp
プロモーター（ｐＲＴＢ５１４）の制御下に置くことに
よって改良された発現を得た。温度感受性“PL”プロモ
ーター（ｐＲＴＢ７０４）を使用しそして高いコピー数
プラスミド（ｐＲＴＢ９０７）を用いることによって発
現の程度になお一層の改良を得ることができた。
【００３０】７．この得られる発現ベクター、すなわち
ｐＲＴＢ２３６、ｐＲＴＢ５１４、ｐＲＴＢ７０４、及
びｐＲＴＢ９０４により形質転換された組換え体細胞に
よって産生されたタンパク質は、ウェスターン法によっ
て所望のリシンＢであることが示された。
【００３１】この項で記載されている詳細な方策は、下
記のＣ〜Ｈのパラグラフに示される。
【００３２】Ｃ．タンデムブリッヂングによる遺伝子再
構成 追加の開始コドンを含む、リシンＢのための完全なコー
ド配列を得るために、一般的に有用な新規なアプローチ
を用いた。この技法は、この特定のタンパク質のための
適正な配列の再構成するように工夫されていると同時
に、ｃＤＮＡライブラリー構成物がコード配列の不完全
なコピーをもたらすいづれの場合にも適用できる。それ
らはまた、入手可能なプラスミド配列の修飾によって、
ベクター中における所望の二重鎖配列の生成物の構成に
一層一般的に適用することができる。
【００３３】この方法は、特に、ｃＤＮＡの５'末端か
ら欠損した配列を完結することに関して例示する。もち
ろん、所望の配列を遺伝子中に挿入し、又は他の種々の
修飾反応を実施することが、いづれか一方の末端又は両
末端を完結するために用いられ得るであろう。
【００３４】たとえば、要約すれば、所望のｃＤＮＡ挿
入部を含むクローニングベクターを、得られたコード配
列にすぐ先行する制限部位で消化する。まず第１に、適
切なリンカーを用いて、ｃＤＮＡフラグメントを挿入す
る場合、もちろんそのように制限部位が存在するであろ
う。この制限部位とコード配列の起源との間に介在する
余分の塩基が存在する場合、S1ヌクレアーゼにより処理
することによってこれを取り除く。次に、この得られる
消化されたベクターは、上流及び下流の切断末端、すな
わち前記コード配列の５'末端である下流末端及び切断
前に、切断部位のすぐ上流に存在した、ベクターからの
配列である上流の切断末端を有する。
【００３５】次に切断されたベクターの２つの末端をエ
キソヌクレアーゼIIIにより消化する。エキソヌクレア
ーゼIIIは、二重鎖状態にあるヌクレオチド配列を、お
のおのの鎖の３'末端で始まる後方への消化によって加
水分解する。従って、エキソヌクレアーゼIIIにより消
化されたクローニングベクターの処理は、フラグメント
の１つの端でコード配列の露出された５'付着端及び他
端でｃＤＮＡ配列の上流で連結されたベクターの露出さ
れた５'付着端をもたらすであろう。付着端がｃＤＮＡ
フラグメント又はべクターフラグメント中を後方にどの
程度延びるべきかは臨界的でないが、しかし100個の塩
基又はそれよりも多くの塩基の単鎖フラグメント部分が
取扱いやすい。次に、少なくとも２つの、但しいずれて
しても偶数の単鎖オリゴヌクレオチドを供給する。これ
らのヌクレオチドのうち１番目は、ほとんどの場合、ｃ
ＤＮＡコドンの５'末端にすぐ先行するであろうコドン
に相補的であり、但し挿入部の露出された５'末端中の
塩基に相補的な追加の塩基も含む。好ましくは、供給さ
れたオリゴヌクレオチドは、少なくとも約８個のヌクレ
オチドと対合するようにｃＤＮＡの５'末端を越えて十
分な延長部分を含むべきである。
【００３６】供給される第２のヌクレオチドは、第１の
ヌクレオチドがそれに対して相補的であるコドンに先行
するセンス鎖中の追加コドンを含むべきである。しかし
ながら、やはり第１のオリゴヌクレオチドの３'末端へ
の第２のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション
を保証するために、いくらかのオーバラップ領域が与え
られなければならない。必要であれば、オーバラップ領
域を伴う交互する追加の相補的領域及びコード鎖を提供
する単鎖オリゴヌクレオチドを供給することもできる。
【００３７】その方法は、図１に描かれているように図
的に最も理解される。図１が示すように、一連のオリゴ
ヌクレオチドをタンデムにブリッヂングすることによっ
てｃＤＮＡを延長し、相補性が対応する末端、すなわち
５'と５'及び３'と３'との間にハイブリダイゼーション
を確保し、そして最後のオリゴヌクレオチドがクローニ
ングベクターの５'付着端とブリッヂを形成する。
【００３８】必要とするオリゴヌクレオチドの数は、再
構成されるべき配列の長さに依存する。おのおのの単鎖
オリゴヌクレオチドは、長さにして約18bpよりも長く、
そしておのおのの末端で少なくとも約8bpの重複の領域
を有する。このオリゴヌクレオチドは相補するオーバラ
ップ領域が対合する場合、少なくとも２つの塩基がその
鎖中に対合しないで残るような長さ以上に十分に長くな
ければならない。上に例示されるように、再構成部分が
Ｎ−末端をコードする配列である場合、目的とする配列
のコドンのすぐ先のATG開始コドンを含み、そして場合
によっては便宜上、得られる遺伝子の操作を容易にする
ために前記ATGに先行して制限部位を含むべきである。
置き換えるべきコドンがＣ−末端にある場合、停止コド
ンを、適切に読み枠を合わせて含むべきであり、そして
次に都合のよい制限部位配列を便宜上含むことができ
る。
【００３９】次に、エキソヌクレアーゼIIIによって処
理されたベクターを適切なオリゴヌクレオチドと共に混
合し、そしてこの混合物を相補的鎖をフィルインするた
めのＤＮＡポリメラーゼＩ(Klenow)及びその構成を完成
するための大腸菌(E.coli)のリガーゼ又は他のリガーゼ
の両者により処理する。所望により、今、このベクター
は、制限部位によって先行される、完全な配列を含む延
長されたｃＤＮＡ挿入部を含む。
【００４０】このタンデムブリッヂング技法はすべての
所望の配列を環状ベクター中に挿入するために有用であ
ることが前述の記載から明らかであろう。もとの切断部
位に隣接するヌクレオチドもまた取り除くことができる
ので、最終結果は変形及び挿入をもたらすことができ
る。
【００４１】Ｄ．ｍＲＮＡの精製における改良法 リシンＢをコードするｍＲＮＡ、及びその関連タンパク
質の製造において、Belamy,A.R.ら、Methods in Enzymo
1ozy（1966）104：156の方法が改良をもたらすいくらか
の変更を伴って使用された。これらの改良及び変更は標
準的方法のある不利な点を克服する。そのような１つの
改良が、植物組織源からのｍＲＮＡの調製において、あ
る問題を構成する調製物由来の酸化されたフェノール化
合物を取り除くことに成功する。他の改良は、すべての
ｍＲＮＡ調製に固有の問題、すなわちｍＲＮＡがリボソ
ームＲＮＡに結合する傾向を解決するために一層一般的
に適用される。この結合が従来のdTアフィニティ−カラ
ムへの調製物の適用の前に破壊され得る場合、溶出のた
めの要求は一層少なくてすむ。
【００４２】酸化されたフェノールを除去するために、
調製物をSephadex G-100により処理する。そのゲルは酸
化されたフェノールを保持し、そしてボイドボリウムと
してｍＲＮＡを通過せしめる(ポリフェノール化合物及
び転移ＲＮＡの両者は遅れる)。これは、従来使用され
た解決法よりも簡単な解決法を提供し、この方法におい
ては、ＲＮＡ抽出を実施する前に、リボソーム又は他の
半細胞成分を前もって単離する。
【００４３】複合するリボソームＲＮＡを除去するため
に、前述のG-100カラム（そのようなカラムが用いられ
る場合）から出て来るＲＮＡの懸濁液と変性剤とを反応
せしめるように、又はdTアフィニティ−カラムに調製物
を適用する前にいずれにしてもそれをそのように反応せ
しめるようにこの方法を修飾する。調製物は、最小量の
従来の変性剤、たとえば加熱されたホルムアミド、又は
水酸化メチル水銀により、好ましくはホルムアミドによ
り変性され得る。この変性剤はリボソームＲＮＡ及びｍ
ＲＮＡのポリＡ部分の間の結合を分解し、そしてそれ故
メッセンジャーＲＮＡがより効果的にカラムに付着する
ことを可能にする。
【００４４】Ｅ．ベクター及び宿主細胞 下に記載されている特定の態様は、原核生物と適合する
ベクターを構成するための、及びそのようなベクターを
これらの宿主細胞中に形質転換するための方法を示す。
E.coli K12菌株 MM294及びE.coli MC1000株の溶原株を
特に記載する。しかしながら、他の微生物株、たとえば
バシルス、たとえばバシルス・ズブチリス(Bacillus su
btilis)、種々のシュードモナス(Pseudomonas)又は他の
細菌株もまた使用される。そのような原核系において
は、宿主と適合する種に由来する複製部位及び制御配列
を含むプラスミドベクターを使用する。たとえば、E.co
liは、pBR322、すなわちBolivarら、Gene(1977) 2：95
によるE.coli種に由来するプラスミドの誘導体を用いて
代表的には形質転換される。pBR322はアンピシリン耐性
及びテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含み、そし
て従って目的のベクターを構成する場合に保持されるか
又は破壊されるかいづれかであることができるマーカー
を提供する。転写開始、場合によってはオペレーター、
リボソーム結合部位配列を含むことをこの明細書で定義
されている普通に使用される原核生物の制御配列は、β
−ラクタマーゼ(ペニシリナーゼ)プロモーター系及びラ
クトース(1ac)プロモーター系[Changら、Nature(1977)
198：1056]及びトリプトファン(trp)プロモーター系[Go
eddelら.，Nucleic Acids Res.（1980）８：4057] 並び
にλ由来のＰLプロモーターのごとき普通に用いられる
プロモーター及びＮ−遺伝子のリボソーム結合部位[Shi
matakeら、Nature(1981) 292：128]を含む。しかしなが
ら、原核生物と適合する入手可能な任意のプロモーター
系が使用され得る。
【００４５】細菌の他に、真核微生物、たとえば酵母も
また使用することができる。多くの他の菌株が通常利用
できるが、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces
cerevisiae)、すなわちパン酵母が最も普通に使用され
る。酵母発現に適切な多くのプラスミドベクターもまた
知られている[たとえば Stinchcombら、Nature(1979)28
2：39、及びTschempeら、Gene(1980) 10：157を参照の
こと]。酵母ベクターのためのプロモーターは、解糖酵
素の合成のためのプロモーターを含む[Hessら、J. Adv.
Enzyme Reg.(1968) 7：149及び Hollandら、Biochemis
try (1978) 17：4900]。酵母に適合するプロモーター、
複製の起源及び他の制御配列を含むいづれかのベクター
が適切である。
【００４６】最近になって、多細胞生物に由来する真核
生物宿主の細胞培養物中でポリペプチドをコードする遺
伝子を発現することができることが見出された[例えば
Tissue Cultures、Academic Press、編集者Cruz及びPat
terson(1973)を参照のこと]。有用な宿主細胞系は、VER
O及びHeLa細胞、並びにChineseハムスターの卵巣(CHO)
細胞を含む。たとえば、そのような細胞のための発現ベ
クターは、通常、哺乳類細胞に適合するプロモーター、
たとえば普通使用されるシミアンウイルス40(SV40)から
の前期及び後期プロモーターを含む[Fiersら、Nature(1
978) 273：113]。 使用される宿主細胞に依存して、原
核生物又は実質的な細胞壁障壁を含む他の細胞、又はそ
のような細胞壁を有しない哺乳類細胞のための形質転換
を、Cohen，S. N.、Proc. Nat1. Acad. Sci.(USA)(197
2) 69：2110によって記載されているように、塩化カル
シウムを使用するカルシウム処理法、すなわち Graham
及びVan der Eb、Virology（1978）52：546のリン酸カ
ルシウム沈殿法を用いて行なう。
【００４７】本発明によって達成される好結果をもたら
す発現は、所望の毒素フラグメントの発現を調節する適
切な制御配列の正しい使用に依存する。従って、宿主が
何であろうと、その宿主に適合しそして適切な制御配列
は、目的の配列の５'末端に正しく配置された“開始”
コドンを用いるそのコード配列に対して作用可能的に配
置される。すべての“天然の”制御配列は除去される。
この発明のべクターは、所望のリシンＢペプチドフラグ
メントのためのコード配列、それにすぐ先行するATG開
始コドン、及びその上流に特定の宿主に適合するように
選択された制御系を配置する。
【００４８】目的のフラグメントの良好な生産性を得る
ためには、宿主細胞に対するすべての致死的効果を最小
にするように生産の“時間”を調節することがまた重要
である。さらに代表的には、これは、実質的な増殖が起
こるまでリシンＢ配列の発現を遅らせることによって行
なわれる。従って、環境条件に支配されている制御配列
を使用することが好ましい。増殖期の間発現を抑制する
条件を維持し、そして次に、所望の時に発現を可能にす
る条件で転換することによって、すべての潜在的な致死
効果の負の局面を最小にすることができる。
【００４９】特に好ましい２つのアプローチにおいて
は、これらの調節可能な制御配列が原核宿主に適合性で
ある。trpプロモーターは、作用可能的に結合した配列
の発現を培地中のトリプトファンのレベルによって制御
することがてきる調節可能なプロモーターである。増殖
の間トリプトファンを高レベルに維持することによって
発現が抑制される。トリプトファンの消耗又は競争阻害
がプロモーターに作用し、そして発現を可能にする。
【００５０】λファージに由来するＰLプロモーターが
さらに一層好ましい。このプロモーターは、温度感受性
であることができるタンパク質によって制御される（野
生型リプレッサーの変異体、たとえば当該技術分野で知
られているこの特性を有するＣＩ857が存在する。この
変異体形のリプレッサーを合成することができる宿主
（例えば、λファージN7N53CI857SusP80に対して溶原性
のE. coli K12株 MC1000)において使用される場合、ＰL
プロモーターは、温度が上昇する場合にスイッチ−オン
されるであろう。なぜならば高温により変異体のCIリプ
レッサーが不活性化するからである。従って、宿主細胞
は外来性タンパク質の生産を伴わないで低温で増殖する
ことができる。次に、増殖が達成され、そしてリシンＢ
の生産量が好ましい場合、温度が上昇せしめられる。
【００５１】必ずしも独立的でないもう１つのアプロー
チは、温度感受性のコピー数制御を有するプラスミドの
使用を含み、その結果細胞が低温で増殖する場合、プラ
スミド中に含まれるコード配列が低レベルで複製され
る。高温では、そのようなコピー数が増加される。従っ
て、生産されるタンパク質の量は、そのコード配列の有
効なコピー数を制御することによって直接的に管理され
る。
【００５２】両者のアプローチが同時的に用いられる場
合、温度の上昇は、コピー数の増加及びプロモーターの
抑制解除の両者をもたらし、そうでなければ抑制された
であろう遺伝子生成物の実質的な合成を導く。
【００５３】Ｆ．使用される方法 目的のコード配列を含んで成るｍＲＮＡフラグメントの
単離はこの下に詳しく記載される。polyAＲＮＡを鋳型
として用い、当該技術分野において現在十分に理解され
ている方法によってｃＤＮＡライブラリーを構成する。
そのような方法の詳細は、Maniatis、E. F.ら、Molecul
ar Cloning、Cold Spring Harbor Laboratory(1982)を
参照することによって得ることができる。ｃＤＮＡライ
ブラリーを、Grnnstein 及び Hogness、Proc. Nat1. Ac
ad. Sci.(1975) 72：3961の方法を用いることにより、
目的の配列について探査する。
【００５４】ベクターの構成は、当業界において既知の
連結及び制限技法を使用する。有用なＤＮＡの量は、目
的のフラグメントをクローニングすることによって、す
なわち適切なクローニングビヒクル、たとえばｐＢＲ３
２２、ｐＵＣ１３又はｐＵＣ８中に挿入し、E.coli中に
形質転換し、そして複製せしめ、そして場合によって
は、クロラムフェニコール増幅を介してさらに増やすこ
とてよって、又はファージ複製によって増加され得る。
次に、所望のフラグメントをクローニングベクター又は
ファージから取り出し、そして遺伝子の発現に使用され
る予定の宿主と適合する適切なプロモーターに連結す
る。次に、そのような宿主をこれらの発現ベクターによ
り形質転換し、そしてプラスミドの安定化及び目的の毒
素フラグメントの確実な生産を与える条件下で培養す
る。そのような条件は、対数増殖期がほとんど完結する
までの制御プロモーターの抑制を含み、そして次に、ペ
プチドの合成を与えるような条件に変えることができ
る。ペプチドが合成された時、細胞は破壊され、そして
所望のフラグメントがその破壊物から回収される。
【００５５】目的のコード配列及び制御配列を含む適切
なベクターの構成は、当該技術分野において十分に知ら
れている標準的な連結及び制限技法を用いる。単離され
たプラスミド、ＤＮＡ配列、又は合成されたオリゴヌク
レオチドを、切断し、調整し、そして所望の形に再連結
する。
【００５６】部位特異的ＤＮＡ切断を、当該技術分野に
おいて一般的に知られている条件下で適切な制限酵素
(又は酵素)により処理することによって実施し、そして
この条件は、商業的に入手できるこれらの制限酵素の製
造業者によって詳細に記載されている。たとえば、ニュ
ーイングランドバイオラボの製品カタログを参照のこ
と。一般的に、約１μｇのプラスミド又はＤＮＡ配列
を、約20μlの緩衝溶液中で１ユニットの酵素によって
切断する。この明細書における例においては、代表的に
は、過剰の制限酵素を使用し、ＤＮＡ基質の完全な消化
を確保する。
【００５７】約37℃で約１〜２時間のインキュベーショ
ン時間が適切である。しかし変更することもできる。お
のおののインキュベーションの後、タンパク質を、フェ
ノール/クロロホルムによる抽出によって、次にエーテ
ルによる抽出によって取り除き、そして核酸を、エタノ
ールによる沈殿によって、次に Sephadex G-50スピンカ
ラムに通すことによって水性画分から回収する。所望に
より、切断されたフラグメントのサイズによる分離を、
標準的技法を用いてポリアクリルアミトゲル電気泳動に
よって実施することができる。サイズによる分離の一般
的な説明は、Methods in Enzymology(1980) 65：499〜5
60に見い出される。
【００５８】制限酵素反応により切断されたフラグメン
トを、pH7.6の50mMのTris、50mMのNaCl、6mMのMgCl2、6
mMのDTT及び0.1mMのdNTP中において、20〜25℃で約15〜
25分のインキュベーション時間を用いて、４種のヌクレ
オチドトリホスフェート(dNTP)の存在下においてE.coli
のＤＮＡポリメラーゼＩの大フラグメント(Klenow)によ
り処理することによって平滑末端化することができる。
このKlenowフラグメントは、単一鎖を５'付着末端でフ
ィルインし、たとえ４種のdNTPが存在しても、３'付着
末端でチューバック(chew back)する。所望により、付
着末端の性質によって指令される限界内でdNTPの１つの
みを、又は選択されたdNTPsを供給することによって選
択的修復を実施することができる。Klenowによる処理
後、その混合物をフェノール/クロロホルムによって抽
出し、そしてエタノールにより沈殿せしめ、次にSephad
ex G-50スピンカラムに通す。
【００５９】他の２つのヌクレアーゼ酵素、すなわちS1
ヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼIIIは、下記に示
される方法により使用する。
【００６０】適切な条件下でのS1ヌクレアーゼによる処
理は、ＤＮＡのいずれかの単一鎖部分の急速な加水分解
及び末端で始まる二重鎖部分のおそい加水分解をもたら
す。S1ヌクレアーゼによる加水分解を、１μl当り200ユ
ニットのS1ヌクレアーゼを用いて、15mMの酢酸ナトリウ
ム、200mMのNaCl、及び1mMのZnSO4を含むpH4.5の緩衝液
中において行なう。通常、5000ユニットのS1ヌクレアー
ゼを用いて、おおよそ10μgのＤＮＡを加水分解する。
【００６１】エキソヌクレアーゼIIIは二重鎖ＤＮＡを
攻撃し、そしてヌクレオチド配列の３'末端で加水分解
し始める。従って、二重鎖ＤＮＡの消化は２つの突起す
る５'付着末端をもたらす。加水分解を、１μl当りおよ
そ2000ユニットのエキソヌクレアーゼIIIを用いて、15m
MのTris、10mMのNaCl、1mMのMgCl2、及び0.lmMのDTTを含
むpH8の緩衝液中において実施する。通常、150ユニット
のエキソヌクレアーゼIIIを用いて、10μgのＤＮＡと反
応せしめる。
【００６２】合成オリゴヌクレオチドを、Matleucci
ら、J. Am. Chem. Soc.(1981) 103：3185〜3191のトリ
エステル法によって製造する。アニーリング前の又はラ
ベル化のための単一鎖のキナーゼ処理は、過剰の、たと
えば１ナノモルの基質に対しておおよそ10ユニットのポ
リヌクレオチドキナーゼを用いて、50mMのTris、pH7.
6、10mMのMgCl2、5mMのジチオエリトリトール、１〜２m
MのATP、1.7ピコモルのγ-32P-ATP(2.9mCi/ミリモル)、
0.1mMのスペルミジン、及び0.1mMのEDTAの存在下で達成
される。
【００６３】正しいマッチングを提供するために適切に
適合された、およそ等モル量の所望のＤＮＡフラグメン
ト(但しリンカー又は小オリゴマーの場合は２〜10倍の
過剰量)を用いて、過剰の、すなわち代表的な15〜30μl
反応においては、0.4〜4 WeissユニットのT4のＤＮＡリ
ガーゼ及び、平滑末端の連結が関与する場合、0.4〜1ユ
ニットのＲＮＡリガーゼによる処理によって、連結反応
を行なう。連結反応混合物を、平滑末端の連結又は付着
末端の連結のいずれかのために、5mMのマグネシウムイ
オン、5mMのジチオエリトリトール、1mMのATP、及び0.1
mg/mlのＢＳＡと一緒に66mMのTrisを用いて、おおよそp
H 7.6で緩衝化する。インキュベーションをおよそ14〜2
5℃で１晩実施する。
【００６４】“ベクターフラグメント”を用いるベクタ
ーの構成においては、５'リン酸を取り除きそしてベク
ターの再連結を防ぐために、ベクターフラグメン卜を、
時には、細菌性アルカリホスファターゼ(BAP)により処
理する。このBAP消化を、ベクターの１μg当り約１ユニ
ットのBAPを用いて、60℃で約１時間、Na+及びMg2+の存
在下で、おおよそ50mMのTris中においてpH 8.3で行な
う。核酸フラグメントを回収するために、調製物を、フ
ェノール/クロロホルムにより抽出しそしてエタノール
により沈殿せしめ、そしてSephadex G-50スピンカラム
に適用することによって脱塩する。一方、望ましくない
フラグメントの途分な制限酵素による切断によって二重
に消化されたベクター中において再連結を防ぐことがで
きる。
【００６５】下記に示される構成法においては、プラス
ミドの構成のための正しい連結は、E.coli Genetic Sto
ck Center から得られたE.coli MM294株(CGSC #6135)を
又は他の適切な宿主を連結混合物により形質転換するこ
とによって確かにされる。好結果をもたらす形質転換体
を、当該技術分野において知られているように、アンピ
シリン耐性、テトラサイクリン耐性又は他の抗生物質耐
性によって又はプラスミド構成の方法に依存する他のマ
ーカーを用いて選択する。次に、形質転換体からのプラ
スミドを、クロラムフェニコールによる増幅[Clewell，
D.B.，J.Bacteriol.(1972) 110：667の後、Clewell，D.
B.ら、Proc. Natl. Acad. Sci.(1969) 62：1159]の方法
に従って調製し、そして制限酵素反応によって分析しそ
して/又は Messingら、Nucleic Acids Res.(1981) 9: 3
09の方法によって、又はMaxamら、Methods in Enzymolo
gy(1980) 65：499の方法によって配列決定する。下記の
例においては、Cohen，S．N.ら、Proc．Natl．Acad．Sc
i．(USA）(1972) 69：2110によって記載されている塩化
カルシウム法を用いて形質転換を実施した。
【００６６】２つの宿主菌株を、下記に示されているプ
ラスミドのクローニング及び発現に使用した。
【００６７】特に、クローニング及び配列決定のために
は、E.coli菌株 MM294(前記)[Talmadge，Kら、Gene(198
0) 12：235及びMeselson,Mら、Nature(1968) 217：111
0]を宿主として使用した。しかしながら、発現がＰLプ
ロモーター及びＮRBSの制御下にある場合、発現宿主と
してE.coli菌株 MC1000λN7N53CI857SusP80（1983年12
月21日に寄託されたATCC＃39531）を使用した。この
後、この菌株をMC1000-39531と称する。この菌株は30〜
32℃の許容温度で活性な温度感受性ＣIリプレッサーを
コードするλプロファージを含む。しかしながら、36〜
48℃の非許容温度で、このリプレッサーは不活性であ
り、そしてＰLプロモーターからの転写を進行すること
ができる。このプロファージは高温で誘導できないとい
うことがこの菌株の他の特徴である。
【００６８】次の例は、原核生物中でのリシンＢフラグ
メントの生成のために適切な発現ベクターの生成を記載
することによってこの発明を例示する。しかしながら、
この発明のリシンＢは他の宿主類のために適切な種々の
ベクター中に連結され得る。 Ｇ．ｍＲＮＡの単離法及びｃＤＮＡライブラリーの調製
法 Ｇ.１ ヒマの種子からのｍＲＮＡの単離法 ヒマ[リシナスコムニス(Ricinus communis)]の種子50ｇ
を、100mlのホモゲナイズ緩衝液(150mMのNaCl、50mMのT
ris、pH8.3、5mMのEDTA及び新たに添加された50mMのβ-
メルカプトエタノール)中に置き、それに、0.2Mバナジ
ウム-リボヌクレオチド複合体12ml、プロティナーゼＫ3
0mg、及び20%SDS 15mlを添加した。この混合物をWaring
ブレンダー中で３〜４分間高速で混合することによって
均質化し、そして次に時折混合しながら室温で２〜３時
間培養した。
【００６９】バナジウム−リボヌクレオチド溶液を次の
ようにして調製する。すなわち、893mgのVOSO4・3H20を
水2ml中に添加し、そしてその混合物を煮沸し、バナジ
ウム塩を溶解した。４種のリボヌクレオチドを含む溶液
を、水17ml中にアデノシン、シチジン、グアノシン、及
びウリジンのそれぞれを１ミリモル溶解することによっ
て調製した。欠にそれを加熱した。欠に前述のVOSO4溶
液の1mlを、そのリボヌクレオチド溶液に添加し、そし
てその得られた混合溶液を、熱湯浴中において攪拌しな
がら、10NのNaOHによりpH 6.5に、そして１NのNaOHによ
り最終的にpH 7に滴定した。複合体の形成は明るい青か
ら緑黒色に変化することによって示される。この溶液を
最終的に水により20mlに希釈した。
【００７０】前記懸濁液を５℃で15分間、8000×gで遠
心分離し、そしてペレットを破棄した。上清液をチーズ
クロスを通して濾過し、脂質を取り除き、そして濾液
を、１%ヒドロキシ−キノリンを含む、フェノール：CHC
l3：イソアミルが24：24:1の比で含まれる溶液により十
分に抽出し、バナジウム塩及びタンパク質を取り除き、
そしてその水性相を、NaClにより0.4Mに、そしてEDTAに
より10mMにした。2.5×体積の無水エタノールを添加
し、核酸を沈殿せしめ、そしてその混合物を−20℃で１
晩保存した。
【００７１】前記沈殿物を、２℃で15分間、7000×gで
遠心分離し、そして0.025MのNaCl、0.025MのTrisを含む
pH8の水溶液9.5ml ＋ 9.5mlのリン酸緩衝液(2.5Mの合計
リン酸塩、すなわち20：１のK2HPO4：33%のH3PO4) ＋ 2
-メトキシエタノール9.5mlの溶液中にペレットを再懸濁
した。この混合物を振盪し、そして時折混合しながら３
〜５分間氷上で冷却し、そして次に２℃で５分間、2000
×gで遠心分離した。上清液を取り出し、そしてこれに
0.2Mの酢酸ナトリウム10ml及び1%セチルトリメチルアン
モニウムブロマイド(CTAB)5mlを添加し、そしてこの混
合物を10分間氷上で冷却した。得られた白色の沈殿物を
２℃で10分間、2000×gで遠心分離することによって収
得した。この沈殿物を0.1Mの酢酸ナトリウム中70%エタ
ノールの添加によって洗浄し、そして４℃で10分間、25
00×gで再び遠心分離した。
【００７２】上清液の除去の後、そのペレットを２mlの
G-100カラム開始緩衝液(20mMのTris、pH8、1mMのEDTA、
及び0.5%SDS)中に再懸濁し、そして次に0.5MのNaClを含
むように調整した。室温で５分間、2000×gで遠心分離
することによって、固体を取り除き、そして上精液をSe
phadex G-100カラム(1.5cm×40cm)に適用し、そしてカ
ラムに適用された緩衝液(但しSDSが欠けている)に類似
する緩衝液を用いて、そのカラムを溶出した。この溶出
液を、OD260によりモニターすることによって検定し
た。植物抽出物中に存在する酸化されたフェノール化合
物を後に残して、目的のｍＲＮＡを流過容量液中に得
た。(これらのフェノール化合物は、dTカラム上でpolyA
ＲＮＡに類似の挙動を示し、タンパク質合成を阻害し、
そして従ってｍＲＮＡについての検定を妨げることが知
られている。）ｍＲＮＡを含む初期のピークを、ホルム
アミド、すなわち変性剤により処理し、複合するリボソ
ームＲＮＡを破壊した。これを行なうことによって、ｍ
ＲＮＡを含有する画分をプールし、エタノールにより沈
殿せしめ、そしてこの沈殿物を最小体積の水中に再溶解
した。この溶液に、6.5〜7.0のpHの20mMのPIPES[ピペラ
ジン−N,N−ビス(２−エタンスルホン酸)]を含む脱イオ
ン化されたホルムアミド９体積を添加した。
【００７３】次に、この混合物を５分間37℃に加熱し、
そしてdTカラム緩衝液(0.5MのNaCl、10mMのTris、pH 7.
5、及び１mMのEDTA)10体積を添加した。ホルムアミドの
存在は、存在するすべてのリボソームＲＮＡからpolyA
ＲＮＡを解離せしめる。
【００７４】次に、変性された混合物を、当該技術分野
において十分に確立した方法に従って、オリゴdTカラム
にかけ、そしておおよそ100μgのpolyAＲＮＡを溶出後
回収した。
【００７５】Ｇ.２ ｃＤＮＡライブラリーの形成法 前項のようにして製造されたpolyAｍＲＮＡを用いて、M
aniatisら(前記)の方法に従って、ｃＤＮＡライブラリ
ーを得た。要約すれば、polyAＲＮＡの部分を、適切な
緩衝液条件下で、逆転写酵素により処理し、そして次に
塩基により処理し、残存するｍＲＮＡを破壊する。この
得られる単一鎖cＤＮＡを、４種のdNTPの存在下におい
て、E.coliポリメラーゼＩ(Klenowフラグメント)を用い
て修復し、そして次に得られる"ヘアピン"をSalIリンカ
ー(ニューイングランドバイオラボラトリーから得られ
た)にT4リガーゼを用いて連結する。S1ヌクレアーゼに
よる処理、及びKlenowによる修復の後、平滑末端を、T4
リガーゼを用いてEcoRIリンカーに連結した。次に、Eco
RI及びSalIによる消化の後、得られる二重鎖のｃＤＮＡ
フラグメント(EcoRI及びSalIの制限部位によって結合さ
れる)を、EcoRI/SalIにより消化されそしてBAPにより処
理されたｐＵＣ１３(J．Messing、the University of M
innesota から得られそして自由に入手可能な)の調製物
中に連結した。ｐＵＣ１３は、Amp耐性(AmpR)を付与す
ることができるｐＢＲ３２２の改変体であり、そしてこ
れは、挿入において使用されるSalI部位から下流にPstI
部位を含む便利な制限部位を担持するリンカーを含む。
この得られる連結混合物を使用して、E.coli MM294、及
び選択されたAmpR菌株を形質転換せしめる。
【００７６】好結果をもたらすコロニーをニトロセルロ
ースプレート上に移し、そしてGrunstein及びHogness
(前記)の方法を用いて、32Pと共にキナーゼ処理された
以下の16個の合成オリゴヌクレオチドの混合物を用いて
プローブした。
【００７７】
【化５】
【００７８】この混合物は、アミノ酸配列、すなわち T
rp-Met-Phe-Lys-Asn-Asp-Gly のためのコドンに相補的
なアンチーセンス鎖を表わす。プローブされた約5000コ
ロニーのうち１%がプローブにハイブリダイズしたこと
が見出された。これらのコロニーのいくつかの代表から
プラスミドを単離し、そして制限分析法及びMaxam-Gilb
ert配列決定法によって分析した。３つのプラスミド、
すなわちｐＲＴＢ４、ｐＲＴＢ５、及びｐＲＴＡ１１５
を挿入領域において配列決定した。
【００７９】図３、図４および図５はこの配列決定の結
果を示す。図３はｐＲＴＢ５中の挿入部の配列を示す。
図３中のライン１は、Funatsu(前記)によって決定され
たリシンＢのアミノ酸配列を示す。第二のラインはｐＲ
ＴＢ５の塩基配列から推定されるアミノ酸配列を示す。
推定される配列の検査は、いくらかの不一致が存在する
が、高いレベルでの一致を示す。これらは、公表された
配列における誤り及び代表されるリシンＢタンパク質に
おける種々の相違によるものである。ライン３は単離さ
れたｃＤＮＡの塩基配列である。リシンＢのための完全
なコード配列が存在するが但し、始めの11個のアミノ酸
についてのコドンのためのコドンは存在しない(５'末端
での小文字のコドンは、プラスミド中にｃＤＮＡ挿入部
を連結するために使用されるEcoRIリンカーを表わす)。
ｐＲＴＢ５は、発現ベクター中において大部分のコード
配列の供給源として使用された。
【００８０】図４はｐＲＴＢ４及びｐＲＴＢ５における
配列の比較を示す。ｐＲＴＢ４はＲＣＡのＢ鎖のための
コードを表わすと思われる。 図４はまたｐＲＴＡ１１
５及びｐＲＴＢ５間の重複を示し、このことはＲＴＡ１
１５挿入部がリシンＢ遺伝子の上流のコード領域を含む
ことを示す。ｐＲＴＡ１１５はRCA前駆体タンパク質と
関連すると思われるが、ｐＲＴＡ１１５から推定される
RCAのアミノ酸配列は、N-末端を完結するのに必要な11
個のアミノ酸のためのリシンＢのアミノ酸配列に匹敵す
る。従って、欠けている11個のＮ−末端コドンをコード
するオリゴヌクレオチドの構成のためのモデルとしてこ
れらの配列を使用し、そしてまたRCAのそしてまたおそ
らくリシンＡ及びＢの単一のペプチド前駆体中の12個の
アミノ酸のペプチドのアミノ酸配列の推定を可能にす
る。
【００８１】ｐＲＴＢ５のコード配列を、ｐＵＣ１３中
に挿入する場合、lacプロモーターの制御下で発現でき
ないように配置した。従って、ｐＲＴＢ５をEcoRI及びP
stIにより切断し、そしてベクターをBstNIによりいくつ
かのフラグメントに切断した。挿入フラグメントと、T4
リガーゼを用いて標準的条件下でｐＵＣ８、すなわち U
niversity of Minnesota の Messing, J．から得られそ
して自由に入手できるもう一つの変形されたｐＢＲ３２
２ベクター、のEcoRI/PstI消化物とを連結した。ｐＵＣ
８は、β−ガラクトシダーゼの最初の５〜８個のアミノ
酸を含む融合タンパク質としてlacプロモーター制御下
にEcoRI/PstI挿入部を配置するEcoRI部位及びPstI部位
を有する。それはまたPstI部位からすぐ下流にHindIII
部位を含む。連結混合物をE.coli MM294中に形質転換
し、そして形質転換体をアンピシリン耐性について選択
した。プラスミドＤＮＡをいくつかのコロニー中の好結
果をもたらす形質転換体から単離し、そして制限部位マ
ッピングによって分析した。適切な制限パターンを示す
コロニーを選択した。ｐＲＴＢ１５１と命名された１つ
のコロニーを、融合タンパク質のための遺伝子の発現に
ついて試験した。ウェスターン法に基づいて交差タンパ
ク質が生成されたが、目的の分子量に対応するタンパク
質帯は見い出されなかった。読み枠が不適切であると推
定された。なぜならばこのプラスミドは、異なった相に
おいてβ−ガラクトシダーゼ及びリシンＢ配列を有する
ように計画されたからである。
【００８２】Ｈ．HindIII-カセットとしてのリシンＢコ
ード配列の構成法-ｐＲＴＢ６０１ この構成法は図７に示されている。10μgのｐＲＴＢ１
５１ＤＮＡをEcoRIにより完全に消化し、60μlのS1緩衝
液中に溶解し、そして１分ごとにデュプレックスＤＮＡ
の約１塩基対を取り除く条件下で４分間室温で消化し
た。前述の緩衝液から回収されたＤＮＡを60μlのエキ
ソヌクレアーゼIII緩衝液中に溶解し、そして室温で４
分間消化した。この後の分析は、プラスミドＤＮＡがお
のおのの３'末端からおおよそ120bpを失い、そしてハイ
ブリダイゼイションのために使用できる５’末端を残し
たことを示した。エキソヌクレアーゼIII緩衝液から回
収されたＤＮＡを50μlの水中に溶解し、そしてその20
μlを下の連結/修復反応に使用した。
【００８３】すなわち、20μlのサンプル(２ピコモル)
を、20ピコモルの各合成オリゴヌクレオチド(以下に示
すような相補的配列を有する)と混合した：
【００８４】
【化６】
【００８５】ここで、Oligo-2は図６(a)に示されるよう
にATG開始コドンの上流にHindIII部位をコードする。Ol
igo-1の５'末端は、そこに示されるようにｐＲＴＢ１５
１のｃＤＮＡ配列の５'末端の15個の塩基に相補的であ
り、そしてリシンＢ配列の隣接する欠失コドンに相補的
である。Oligo-2の５'末端は、エキソヌクレアーゼIII
により処理されたｐＲＴＢ１５１のベクター残基の５'
付着末端に相補的である。
【００８６】前記混合物を、単一鎖、ＤＮＡの相補性を
完全に変性するために５分間60℃に加熱し、５分間37℃
に冷却し、相補的鎖をハイブリダイズせしめ、そして次
に氷上で冷却した。溶液をポリメラーゼＩ(Klenow)緩衝
液条件に導き、そしておのおの50μMの４種のdNTP、0.1
mMのNAD、0.3ユニット/μlのKlenow、及び0.08ユニット
/μlのE.coliのＤＮＡリガーゼの存在下において12℃で
２時間反応せしめた。連結混合物を用いて、コンピテン
トE.coli MM294を直接的に形質転換し、そして数千個の
AmpRコロニーを見出した。これらの数百個をレプリカ
し、ニトロセルロースフィルター上で増殖せしめ、そし
てプローブとしてＰ32と共にキナーゼ処理されたOligo-
2を用いて標準的コロニーハイブリダイゼーションにゆ
だねた。プローブとバイブリダイズした２つのコロニー
を制限酵素反応分析によって分析し、そして配列決定
し、そして正しい構成体をｐＲＴＢ６０１と命名した。
従ってｐＲＴＢ６０１は、HindIIIカセットとしてリシ
ンＢのコード配列を含む。上流のHindIII部位をOligo-2
中のATGコドンのすぐ上流に導入する。下流のHindIII部
位はｐＵＣ８ベクタープラスミドから生じる。
【００８７】Ｉ．リシンＢのための発現ベクターの構成
法 Ｉ．１ ｐＲＴＢ２３６の構成法 ｐＲＴＢ２３６は、β−ガラクトシダーゼのアミノ末端
の始めの５個の残基、次にｐＲＴＢ１５１中のｃＤＮＡ
挿入部によってコードされたペプチドを含む融合タンパ
ク質を生成するように正しく読み枠を合せて、1acZプロ
モーターの制御下にｐＲＴＢ５のコドンを配置してい
る。従って、得られるタンパク質は、β−ガラクトシダ
ーゼのＮ−末端に始まり、そして初めの11個のアミノ酸
を欠くリシンＢの部分をもって完結する配列である。
【００８８】ｐＲＴＢ２３６を構成するために、ｐＲＴ
Ｂ１５１を次のようにして正しい読み枠に改変した。す
なわち、ｐＲＴＢ１５１をEcoRIにより消化し、そしてS
1ヌクレアーゼにより処理し、EcoRIの突起する末端を除
いた。次に、反応混合物を、T4のＤＮＡリガーゼを用い
て再連結し、そしてE.coli MM294中に形質転換した。Am
pRコロニーを選択し、そして多くのコロニーを配列決定
した。ｐＲＴＢ２３６は、正しく読み枠を合せているこ
とが見出され（決定された適切な配列は図６(b)に示さ
れている）、そしてこの形質転換された菌株は、ウエス
ターン法によって示されるようにリシンＢタンパク質を
生成することができる。
【００８９】図９は、ｐＲＴＢ２３６、ｐＲＴＢ１５
１、及びｐＵＣ８により形質転換された細胞からの抽出
物をErlich，H．A.，など[Infect Immunol.（1983）4
1：683]の方法に従って、実施したウエスターン法の結
果を示す。交差反応物質はRTB配列を含むすべてのクロ
ーン中に見られるが、ｐＲＴＢ２３６からの抽出物のみ
が適切な大きさのポリペプチドを有する。
【００９０】Ｉ．２〜Ｉ．４項に記載されているプラス
ミドｐＲＴＢ５１４、ｐＲＴＢ７０４及びｐＲＴＢ９０
７の構成法は、図８に示される。
【００９１】Ｉ．２ ｐＲＴＢ５１４の構成法 ｐＲＴＢ５１４は、trpプロモーター／オペレーター系
の制御下でのATG開始コドンに先行されるリシンＢの完
全なコード配列を含む。このtrpプロモーター／オペレ
ーター系は、下にさらに記載されているプラスミドｐＤ
Ｇ１４１に由来する。
【００９２】３μｇのｐＲＴＢ６０１をHindIIIにより
消化し、リシンＢコード配列を切り出した。制限反応消
化物をFnuDIIにより処理し、ベクターの残りの部分のAm
pR領域を破壊し、そしてT4のＤＮＡリガーゼを用いて、
１μgのｐＤＧ１４１のHindIII消化物と連結した。この
連結混合物をE.coli MM294中に形質転換し、そしてAmpR
コロニーを選択した。所望のプラスミドｐＲＴＢ５１４
を１つのコロニーから単離し、そしてその正しい構成を
Maxam−Gilbert塩基配列決定法によって確かめた。適切
な配列を図６(c)に示す。
【００９３】Ｉ．２．ａ ｐＤＧ１４１の調製 ｐＤＧ１４１は、ATG開始コドンからすぐ上流に制御配
列を含む。それを1984年１月24日ATCCに寄託し、そして
寄託番号39588を得た。ATGの上流の配列は、リボソーム
結合部位のすぐ下流を切断するHindIII切断部位を提供
する。ｐＤＧ１４１の構成においては、ｐＢＲ３２２の
誘導体を用いて、trp(PstI/HindIII)カセットを得、そ
してｐＢＷを用いて、ATG及びその下流のSacI部位を得
る。
【００９４】PstI及びHindIIIにより制限処理された12
μｇのｐＢＲ３２２-Trp3と、同様に制限処理された1.3
4μgのｐＢＷ２０とを連結した。次にこの連結混合物を
BamHIにより消化し、ｐＢＲ３２２−Trp３からの、Hind
III/PstIによる望ましくないベクターフラグメントを含
むすべての連結生成物を線状にする。この連結混合物を
用いて、E.coli MM294を形質転換し、そして500μgのト
リプトファンにより事前に分散された50μg/mlのアンピ
シリンを含むL-Brothプレート上で所望のコロニーを選
択した。正しい構成物を配列決定法によって確めた。
【００９５】Ｉ．２．ａ．１ ｐＢＲ３２２−trp3の調
製 アテニュエーター領域を欠く、trpプロモーター／オペ
レーター／リボソーム結合部位の配列を、スタンフォー
ド大学のC.Yanofskyから得られたｐＶＨ１５３から得
た。Trp配列は、当該技術分野において既知の種々のプ
ラスミドに利用できる。Klenowにより平滑末端化された
ｐＶＨ１５３を、HhaI(露出された３'付着末端を残し
て、trpプロモーターのちょうど５'を切る)により処理
し、そしてTaqIにより部分的に消化した。TaqI部位での
制限に対応する99bpのフラグメント、すなわち、trpリ
ーダーのATG開始コドンに先行する６ヌクレオチドを単
離し、そして次にEcoRI(修復)/ClaIにより消化されたｐ
ＢＲ３２２に連結し、ｐＢＲ３２２-Trp3を得た。前述
のTaqI部位は５'の半分のClaI部位をコードし、従って
３'の半分のClaI部位（ｐＢＲ３２２からの）への連結
は機能的なClaI部位を再生成するであろう。さらに、ｐ
ＢＲ３２２のCla部位からすぐ下流のHindIII部位は、Ec
oRI/HindIIIカセットとして所望のtrpフラグメントの切
り出しを可能にする。ｐＢＲ３２２-Trp3をｐＴＲＰ３
としてATCCに寄託し、そして寄託番号39946を得た。
Ｉ．２．ａ．２. ｐＢＷ２０の構成法 ｐＢＷ２０は、ｐＢＲ３２２からのHindIII/PvuIIベク
ターフラグメント中にクローン化された、合成ATG-含有
ドデカマーを含む。そのドデカマー、すなわちTATGAGCT
CATA は、SstI(又はSacI)部位を含む。
【００９６】ｐＢＲ３２２をHindIIIにより消化し、Kle
now及び４種のdNTPにより修復し、そして次にPvuIIによ
り消化した。ベクターフラグメントを自己相補ドデカマ
ーと連結し、E.coli MM294中に形質転換し、そして、正
しい構成体を、プラスミドの単離及び配列決定によって
確かめた。
【００９７】Ｉ．３ ｐＲＴＢ７０４の構成法 ｐＲＴＢ７０４はｐＲＴＢ５１４に類似する。但しその
コード配列がＰL−ＮR BSの制御下にある点で異なる。構
成法はｐＲＴＢ５１４についてのＩ．２項において示さ
れた構成法と同一である。但しｐＤＧ１４１ではなくｐ
ＦＣ５が、プロモーター／オペレーター及びリボソーム
結合部位をコードする配列をもたらす、HindIIIにより
消化されたプラスミドの供給源として用いられる。ｐＲ
ＴＢ７０４を1984年９月14日ATCCに寄託し、そして寄託
番号39865を得た。
【００９８】一方、ｐＦＣ５ではなくｐＰL３２２又は
ｐＰLＫａｎもまた、用いることができる。これらのプ
ロモーターを提供するプラスミドの構成法は、次のよう
に記載される。
【００９９】これらのおのおののプラスミドのために、
ＰLλファージプロモーター及びN-遺伝子(ＮRBS)のため
のリボソーム結合部位を含むＤＮＡ配列を、Shinatake
及びRosenberg、Nature(1981)292：128によって記載さ
れたｐＫＣ３０の誘導体から得る。ｐＫＣ３０は、ｐＢ
Ｒ３２２からのHindIII/BamHIベクターフラグメント中
にクローン化されたλファージからの2.34kbフラグメン
トを含む。ＰLプロモーター及びＮRBSは、ｐＫＣ３０中
BglII及びHpaI部位の間セグメントを占める。ｐＫＣ３
０の誘導体はEcoRI部位へ転換されたBglII部位を有す
る。
【０１００】ＰLプロモーターにすぐ先行するBglII部位
を次のようにしてEcoRI部位に転換する。すなわち、ｐ
ＫＣ３０をBglIIにより消化し、Klenow及びdNTPにより
修復しそしてT4リガーゼによりEcoRIリンカー(New Engl
and Biolabs から入手できる)へ連結し、そしてE.coli
K12菌株MM294λ+中に形質転換した。プラスミドをAmpRT
etS形質転換体から単離し、そして所望の配列を制限分
析及び配列決定によって確めた。得られるプラスミド、
すなわちｐＦＣ３を、PvuI及びHpaIにより二重消化し、
所望の配列を構成するおよそ540bpフラグメントを得
た。このフラグメントをHinfIにより部分的に消化し、
そして424bpフラグメントを単離し、そしてKlenow及びd
ATP、次にS1ヌクレアーゼにより処理し、３'末端配列-A
GGAGAA(この-AGGAGA部分はＮRBSである)を有する平滑末
端フラグメントを生成した。このフラグメントをEcoRI
により制限処理し、５'-EcoRI(付着)末端及びHinfI(一
部修復のS1平滑)-３’末端を有する347個の塩基対のＤ
ＮＡフラグメントを得た。
【０１０１】Ｉ．３．ａ ｐＦＣ５の調製法 1984年１月13日に寄託されたATCC番号39578のｐβＩ−
Ｚ１５を、ATG＋lacZに融合した140bpのβ-IFNを含む配
列をｐＢＲ３２２中に融合することによって調製した。
ｐβＩ−Ｚ１５においては、ｐＢＲ３２２のEcoRI部位
を保持し、そして挿入部はβ-IFNのATG開始コドンにす
ぐ先行するHindIII部位を含む。ｐβＩ−Ｚ１５をHindI
IIにより制限処理し、Klenow及びdNTPにより修復し、そ
して次にEcoRIにより消化した。得られるEcoRI/HindIII
(修復された)ベクターフラグメントと、上記のEcoRI/Hi
nfI(修復された)フラグメントとを連結し、そしてこの
連結混合物を用いてMC1000-39531を形質転換せしめた。
好結果をもたらす構成体を含む形質転換体を、ラクトー
ス最小プレート上で30℃ではなく34℃で増殖する能力に
よって同定した。(形質転換体を30℃及び34℃でX-gal-A
mpプレート並びに30℃及び34℃で最小ラクトースプレー
ト上に置いた。適切な構成体を有する形質転換体は、両
方の温度でX-gal-Ampプレート上で青色を示すが、しか
し最小ラクトースプレート上では34℃でのみ増殖し
た。)この好結果をもたらす構成体をｐＦＣと名づけ
た。このｐＦＣを1984年９月14日ATCCに寄託し、そして
受託番号39864を得た。
【０１０２】Ｉ．３．ｂ ｐＰL３２２調整法 一方において、ｐＢＲ３２２をまた、所望のEcoRI/Hind
III ＰL−ＮRBSカセットを担持するクローニングベクタ
ーとして使用することができる。ｐＢＲ３２２をHindII
Iにより消化し、Klenow及びdNTPにより修復し、そして
次にEcoRIによりさらに消化した。次に、ベクターフラ
グメントと上記で調製したEcoRI/HinfI(修得)フラグメ
ントとを連結し、そしてこの連結混合物をMC1000-39531
中に形質転換せしめた。良好な結果をもたらす形質転換
体を、AmpRTetSコロニーとして同定した。プラスミドを
良好な結果の形質転換体から単離し、そして良好な結果
をもたらす連結体を配列決定することによって確かめ、
そしてｐＰL３２２と名づけた。
【０１０３】Ｉ．３．ｃ ｐＰLＫａｎの調製法 カセットを得るために使用された３番目の宿主プラスミ
ドベクターはｐＤＧ１４４であり、1984年１月13日に寄
託され、ATCC番号39579を得た。ｐＤＧ１４４は他の出
願に広範囲に記載され、そしてこの発明の一部ではな
い。それは、無傷のAmpR遺伝子、及びカナマイシン(Kan
R)耐性を付与することができるタンパク質のためのコー
ド配列を含む変形されたｐＢＲ３２２である。KanRコー
ド配列に先行して合成ポリリンカーが存在する。ｐＤＧ
１４４はコード配列に先行するプロモーター及びリボソ
ーム結合部位のいずれも含まないので、KanRは発現され
ず、そしてｐＤＧ１４４を含む細胞は、カナマイシンに
対して及び構造的に類似する抗生物質に対して感受性で
ある。カナマイシン遺伝子のためのATG開始コドンにす
ぐ先行するポリリンカー配列を、EcoRI及びHindIIIによ
り消化することによって取り除き、そしてＰLＮRBSを挿
入することができる。
【０１０４】従って、ｐＤＧ１４４をHindIIIにより消
化し、Klenow及びdNTPにより平滑末端にし、そして次に
EcoRIにより消化した。ベクターフラグメントと上記で
調製したEcoRI/HinfI(修復された)フラグメントとを連
結し、そしてMC1000-39531中に形質転換せしめた。AmpR
KanRコロニーを選択し、プラスミドを単離し、そして正
しい配列の構成体を制限分析及び配列決定によって確か
めた。正しい配列を含む１つのプラスミドをｐＰLＫａ
ｎと名づけた。
【０１０５】Ｉ．４ ｐＲＴＢ９０７の構成法 ｐＲＴＢ９０７はｐＲＴＢ７０４に類似する。但しその
プラスミドベクターは、温度感受性の高いコピー数プラ
スミドである。ｐＲＴＢ９０７は、ｐＲＴＢ７０４から
EcoRI/SalIによる消化物として制御配列及びコード配列
を切り出し、HhaIによりｐＲＴＢ７０４のベクター部分
を切断し、そしてこのセグメントを下に記載されてい
る、EcoRI/SalIにより消化されたｐＣＳ３中に連結する
ことによって誘導される。次に、この連結混合物を用い
てMC1000-39531を形質転換し、そして形質転換体をAmpR
によって選択した。所望のプラスミドの正しい構成体を
制限分析によって確認した。
【０１０６】１．４．ａ 高い複写数プラスミド、ｐＣ
Ｓ３−Ａの構成法 ｐＣＳ３は、前述のすべてのdT発現ベクターのために、
高いコピー数を保証する複製起点を提供する。この構成
法は、1983年12月12日に出願されたヨーロッパ出願番号
第0096586号中に広範囲に記載されている。このプラス
ミドを1982年６月３日ACTTに寄託し、そしてATCC番号39
142を得た。
【０１０７】ｐＣＳ３は、ｐＥＷ２７及びｐＯＰ９に由
来する。ｐＥＷ２７は、E. M. Wong, Proc. Natl. Aca
d. Sci.(USA)(1982) 79：3570によって記載されてい
る。それは、コピー数の温度調節をもたらす突然変異
を、その複製起点近くに含む。これらの突然変異の結果
として、複製が高温において高いコピー数で起こるが、
但し低温では低いコピー数で起こる。
【０１０８】ｐＯＰ９は、ColE1タイプのプラスミドｐ
ＯＰ６からのEcoRI/PvuII起点を含むフラグメントを、
ｐＢＲ３２２中に挿入することによって構成された、す
べての温度で高いコピー数を示すプラスミドである[Gel
fand，D.ら、Proc. Natl. Acad.Sci.(USA)(1978) 75：5
869]挿入前に、このフラグメントを次のようにして変形
した。すなわち、50μgのｐＯＰ６を、20ユニットずつ
のBamHI及びSstIにより完全に消化した。SstIの３'突出
末端及び“フィルイン”側のBamHIの５'末端を除去する
ために、消化されたｐＯＰ６ＤＮＡを、E.coliＤＮＡポ
リメラーゼI(Klenow)により、２つの段階の反応(まず、
20℃でSstIの３'突出末端の除去のために、そして次に
９℃で５'末端を修復のために)において処理した。平滑
末端のフラグメントを消化し、そしてその0.02ピコモル
を用いて、コンピテントDG75を形質転換せしめた[O'Far
re11，P.ら、J.Bacteriology(1978) 134：645〜654]。
形質転換体を、50μg/mlのアンピシリンを含むL-プレー
ト上で選択し、そして3.3kbの欠失、SstI部位の損失、
及び新しく形成されたBamHI部位の存在についてスクリ
ーンした。
【０１０９】ｐＯＰ７と名付けられた１つの候補体を選
択し、そして20ユニットのBamHIにより25μｇのｐＯＰ
７を消化し、E.coliのＤＮＡポリメラーゼＩフラグメン
ト(Klenow)により修復し、そしてT4ＤＮＡリガーゼによ
り再連結することによってBamHI部位を削除した。コン
ピテントDG75を、0.1μgの前記ＤＮＡにより処理し、そ
して形質転換体を、50μg/mlのアンピシリンを含むL-プ
レート上で選択した。候補体を、BamHI制限部位の消失
についてスクリーンした。ｐＯＰ８を選択した。ｐＯＰ
９を得るために、ｐＢＲ３２２からのAvaI(修復された)
/EcoRI TetRフラグメントを調製し、そして単離し、そ
してｐＯＰ８からの、PvuII(一部の)/EcoRIによる3560b
pの単離されたフラグメントに連結した。
【０１１０】1.42kbのEcoRI/AvaI(修復)TetR(フラグメ
ントＡ)と3.56kbのEcoRI/PvuII AmpR(フラグメントＢ)
との連結は、EcoRI末端の分子間連結を助けるために２
つの段階の反応において、0.5μgのフラグメントＢと4.
5μgのフラグメントＡとを使用した。
【０１１１】コンピテントDG75を、連結混合物５μlに
より形質転換せしめ、そして形質転換体をアンピシリン
(50μg/ml)含有のプレート上で選択した。AmpRTetR形質
転換体から単離されたｐＯＰ９は、高いコピー数、コリ
シン耐性、EcoRI、BamHI、PvuII、及びHindIIIのための
単一の制限部位、HindIIのための２つの制限部位、適切
なサイズ及びHaeIII消化パターンを示した。
【０１１２】ｐＣＳ３を得るために、ｐＥＷ２７ＤＮＡ
50μgをPvuII及び次にEcoRIにより完全に消化した。同
様に、50μgのｐＯＰ９をPvuII及びEcoRIにより完全に
消化し、そして3.3kbのフラグメントを単離した。
【０１１３】ｐＥＷ２７フラグメント0.36μg(0.327ピ
コモル)とｐＯＰ９フラグメント0.35μg(0.16ピコモル)
とを連結し、そしてそれを用いてE.coli MM294を形質転
換せしめた。AmpRTetR形質転換体を選択した。好結果の
コロニーを、最初に30℃及び41℃でβ−ラクタマーゼア
ッセイプレート上で、そして次に、30℃及び41℃での増
殖の後のプラスミドＤＮＡレベルについてスクリーニン
グした。ｐＣＳ３と称する好結果をもたらす候補体を、
配列決定することによって確認した。
【０１１４】Ｊ. リシンＢの製造 プラスミド、すなわちｐＲＴＢ７０４及びｐＲＴＢ９０
７のいずれかにより形質転換されたE.coli MC1000-3953
1を30℃で、アンピシリン100μg/mlを含むTYE培地(バク
トトリプシン15g/l、酵母抽出10g/l、及び1mMのCaCl2に
より補填されたNaCl 5g/l)中において増殖せしめた。対
数増殖期にある間、温度を42℃に高め、そして1.5時間
後、細胞を遠心分離し、そしてSDSにより抽出した。こ
の抽出物を、上に記載したようにしてウエスターン法に
よって検定した。結果を図９に示し、そして類似するｐ
ＲＴＢ５１４(trpプロモーターを用いる)によりそして
前駆体プラスミド及び制御プラスミドにより得られた結
果と対照した。描写されたレーンは、次のとおりであ
る：すなわち、レーン１は、“天然”のリシンＢであ
り、レーン２〜９は、それぞれｐＵＣ８、ｐＲＴＢ５、
ｐＲＴＢ１５１、ｐＲＴＢ２２１(変形されたｐＲＴＢ
１５１)、ｐＲＴＢ２３６、ｐＲＴＢ５１４、ｐＲＴＢ
７０４、及びｐＲＴＢ９０７による形質転換体の抽出物
である。
【０１１５】下に挙げられたものを、Rockville，MD，U
SAのアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)に
寄託した。この寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国
際的承認に関するブタペスト条約及びそれに基ずく規則
(ブタペスト条約)に基いて行なわれた。生存している培
養菌の保存は、寄託の日から30年間保証される。微生物
はブタペスト条約のもとで、そして適切なアメリカ特許
の発行後には無制限の入手可能性を保証する出願人とAT
CCの間の契約に基いて、寄託された菌株はATCCにより入
手可能にされるであろう。特許法に従っていずれかの政
府の権威下で与えられた権利に反してこの発明を実施す
る許諾であると解釈してはならない。
【０１１６】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【図１】 単離されたｃＤＮＡのコード配列を完結する
ための、単鎖オリゴヌクレオチドのタンデムブリッヂを
示す図である。
【図２】 Funatsu(前記)によって開示され、そして抽
出されたタンパク質から得られたリシンＢのタンパク質
配列を示す図である。
【図３】 リシンＢ鎖の一部のコード配列に対応するプ
ラスミドｐＲＴＢ５のｃＤＮＡ挿入部のヌクレオチド配
列及びそれから推定されるアミノ酸配列を、Funatsuに
よって抽出されたタンパク質から決定されるリシンＢの
配列と比較して示す図である。
【図４】 ＲＣＡのＢ部分の配列の大部分をコードする
プラスミドｐＲＴＢ４のｃＤＮＡ挿入部と、前述のｃＤ
ＮＡ挿入部の塩基配列とを示し、ｐＲＴＡ１１５の配列
は、ｐＲＴＢ５配列部分とオーバラップすることを示す
図である。
【図５】 ＲＣＡのＢ部分の配列の大部分をコードする
プラスミドｐＲＴＢ４のｃＤＮＡ挿入部と、前述のｃＤ
ＮＡ挿入部の推定されるタンパク質配列の比較を示す図
である。
【図６】 ｐＲＴＢ５に由来するリシンＢのコード配列
を完結するために使用される合成オリゴヌクレオチドの
配列、β−ガラクトシダーゼとリシンＢとの融合を示す
ｐＲＴＢ２３６の配列決定された部分、ｐＤＧ１４１の
リボソーム結合部位とｐＲＴＢ６０１からのコード配列
との間の結合を含むｐＲＴＢ５１４の配列決定された部
分をそれぞれ示す図である。
【図７】 ｐＲＴＢ６０１の構成を略図的に示す図であ
る。
【図８】 ｐＲＴＢ５１４、ｐＲＴＢ７０１、及びｐＲ
ＴＢ９０７の構成を示す図である。
【図９】 本発明のプラスミドにより形質転換されたE.
coli MM294からの抽出物のウエスターンブロットを、リ
シンＢと比較して示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (73)特許権者 595118043 4560 Ｈｏｒｔｏｎ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｅ ｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎ ｉａ 94608 Ｕ．Ｓ．Ａ. (72)発明者 マイケル ピアタック，ジュニア アメリカ合衆国，カリフォルニア 94596，ウォールナット クリーク，ア ルフレッド アベニュ 1120 (56)参考文献 特開 昭60−102188（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−108388（ＪＰ，Ａ)

Claims (6)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 トウゴマ細胞物質を含まない組換体リシ
    ンＢであって、以下のアミノ酸配列を有するリシンＢを
    コードするＤＮＡで形質転換される大腸菌(E.coli)また
    は酵母(Saccharomyces cerevisia)により産生されるリ
    シンＢ： 【化１】
  2. 【請求項２】 トウゴマ細胞物質を含まない組換体リシ
    ンＢの製造方法であって、該組換体リシンＢは以下のア
    ミノ酸配列を有するリシンＢをコードするＤＮＡで形質
    転換される大腸菌(E.coli)または酵母(Saccharomyces c
    erevisiae)の組換体タンパク質産物であり： 【化２】 該方法は、(a)該リシンＢをコードするＤＮＡを含む発
    現ベクターで形質転換される大腸菌(E.coli)または酵母
    (Saccharomyces cerevisiae)を培養する工程、および
    (b)得られる培養液からリシンＢを回収する工程を包含
    する。
  3. 【請求項３】 前記発現ベクターがプラスミドｐＤＧ１
    ４１由来である、請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記発現ベクターがプラスミドｐＴＲＰ
    ３由来である、請求項２に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記発現ベクターがｐＲＴＢ７０４であ
    る、請求項２に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記発現ベクターが高コピー数プラスミ
    ドｐＲＴＢ９０７である、請求項２に記載の方法。
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