JP2579619B2

JP2579619B2 - 組換えリシン毒素フラグメント

Info

Publication number: JP2579619B2
Application number: JP61072408A
Authority: JP
Inventors: トーマスホーングレン; ピアタツク，ジユニアマイケル
Original assignee: Cetus Oncology Corp
Current assignee: Cetus Oncology Corp
Priority date: 1985-03-29
Filing date: 1986-03-29
Publication date: 1997-02-05
Anticipated expiration: 2012-02-05
Also published as: JPH0848700A; JPS61293916A; JP2574142B2; EP0196762A1

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕この発明は組換え技法を用いる毒素フラグメントの産
生に関する。さらに具体的には、この発明は組換え方法
を用いてリシン毒素のＢフラグメントを産出することに
関する。

〔従来の技術〕

リシン毒素（RT又はリシン）は、酵素的に活性で、細
胞毒性の“A"アミノ酸配列、及び“B"配列から成る天然
に存在する毒素であり、そしてこの“B"配列は、殺され
るべき標的細胞に“A"配列を付着せしめること、及び細
胞質内へのＡフラグメントの移動を促進することの両者
を担当すると思われる。そのような毒素の他の例は、ジ
フテリアトキシン及び緑膿菌（Pseudomonas aeruginos
a）からのエキソトキシンを含む。たとえば、他の毒素
タンパク質、たとえばアメリカヤマゴボウ（Phytolacca
americana）（PAPI,PAPII,及びPAP−Ｓ）及びゲロニン
（gelonin）に由来するものは、上記の毒素の“A"配列
に相当する活性をin vitroにおいて示すが、しかし多分
“B"鎖が存在しないためin vivoにおいては不活性であ
る。

この発明の“リシン”ペプチドはトウゴマとして通常
知られている、ヒマ（Ricinus communis）の種子に由来
する。２つの類似するタンパク質（しばしばレクチンと
呼ばれる）、すなわち上記のリシン及びリシンコムニス
アグルチニン（Ricin communis agglutinin）（RCA）が
これらの種子から抽出できる。両タンパク質は、Ａ及び
Ｂ部分を含むが、しかしながらこのＡ及びＢ部分は、単
一のペプチドを構成しない。これらの成分のＡ部分はin
vitroにおいてリボソームのラージサブユニットを触媒
的に不活性化することができ、そしてin vivoにおける
細胞毒性についてのリシンの機構は、リポソームの不活
性化のための能力にあると思われる。リシン及びRCAは
ひじょうに相同であるように思える〔Cawley,D,B.,な
ど、Arch.Biochem.Biophys．（1978）190:744〕がしか
し相違点も存在する。RCAは劇的に少ない毒性であり、
そしてリシンの二量体について予想される特性に相当す
る特性を示すように思える。

リシン及びRCAの成分は抽出された物質に基いて十分
に特徴づけられそして配列決定された〔Funatsu,G.,な
ど、Agric.Biol.Chem．（1979）43:2221〕。リシンは5
8,000ダルトンの見掛分子量を有し、そして32,000ダル
トンの分子量を有するＡ鎖及び34,700ダルトンの分子量
のＢ鎖から成る。RCAは、おのおのの分子量が32,000ダ
ルトンの２つのＡサブユニット、及びおのおのの分子量
が36,000ダルトンの２つのＢサブユニットを有する四量
体である。それらの本来の環境において、Ｂ鎖は一般的
にグリコシル化される。リシン及びRCAの両者のＡ及び
Ｂサブユニットは単一のジスルフィド結合によってのみ
結合され、そしてたとえば、単鎖ペプチドとして存在す
るジフテリア毒素と違ってペプチド結合〔Funatsu,G.,
など、Agri.Biol.Chem．（1977）41:1211〕によって結
合されていない。リシン及びRCAの両者は、Ａ及びＢ部
分のために別々のペプチドを有するけれども、おのおの
の場合、単鎖前駆体に由来することもまた知られている
〔Butlerworth,H,E.,など、Eur.J.Biochem（1983）137:
57）。この発明に関する研究の結果として、単鎖前駆体
はＡ鎖配列（アミノ末端）及びＢ鎖配列の間に12個のア
ミノ酸の配列を含むらしいことが示された。12量体の介
在ペプチドの切り出し後、Ａ及びＢ鎖は単一のジスルフ
ィド結合を介して結合し続けると推定される。

この発明は、組換え体技法を用いてリシンのＢ鎖を得
るための手段を提供し、従って完全なアミノ酸配列をひ
じょうに正確に提供し、そしてその活性のために要求さ
れる構造的特徴の探究を可能にする。この発明の技法及
び材料は、さらにＢ鎖のアミノ酸配列の選択的修飾を可
能にし、そして従って、リシン又は他の毒素及びその誘
導体の細胞毒素性を高めることができる特性を提供する
操作を可能にする。さらに指図された修飾を可能にす
る、予測でき、有効な、そして経済的な方法を用いて、
リシンのＢ鎖の産生を可能にすることによって、この発
明は、今まで不可能であった、実際的な及び改良された
方法においてＢ鎖の使用を可能にする。

〔発明の開示〕

１つの観点においては、この発明は組換え技法を用い
て調製されるリシンＢに関する。所望によりリシンＢの
アミノ酸配列はトウゴマの種子から抽出されるリシンＢ
のアミノ酸配列と完全に同一であることができるが、し
かし組換え体生成物はその生産環境により必然的にいく
分変形され、そしてアミノ酸配列又はグリコシル化のレ
ベルでの変更を含むように製造者の意志でさらに変形さ
れ得る。従って、この発明の１つの観点は、組換え技法
によるリシンＢの産生方法、及びそのようにして産生さ
れたリシンＢである。

他の観点においては、この発明は、リシンＢ鎖の発現
をもたらすことができる発現ベクター、そのようなベク
ターにより形質転換された宿主細胞、及びそれの培養に
向けられる。

新規の一連の反応を用いてリシンＢタンパク質のため
のコード配列の調製を完結することが可能であった。リ
シンＢをコードする配列の実質的な部分を含むクローニ
ングベクターは、このクローニングベクター中における
cDNA挿入部の５′末端に近い方の制限部位での消化、次
に、場合によっては必要であるかもしれないが、cDNA挿
入部の開始部の前に介在するヌクレオチドを取り除くた
めに十分なヌクレアーゼS1による消化、及び５′付着端
を得るためのエキソヌクレアーゼIIIによる処理によっ
て変形された。次に、この付着端ベクターは、２つのオ
リゴヌクレオチドの混合物と共に処理され、このおのお
ののオリゴヌクレオチドは目的とするリシンＢタンパク
質のＮ−末端のためのコード配列を完結するために必要
とされる配列の一部を含み、そしてこのおのおののオリ
ゴヌクレオチドは、お互いに関して、及びcDNA配列の
５′付着端及び切断されたベクター配列の５′付着端に
関してオーバラップする十分な領域を有し、大部分が単
鎖配列であるタンデムリッヂを形成した、DNAポリマラ
ーゼＩ（Klenow大フラグメント）の作用によって二重鎖
を形成し、そしてリガーゼにより処理した場合、これら
のオリゴヌクレオチド及びエキソヌクレアーゼIIIによ
り処理されたベクターは、開始コドンの５′の便利な制
限部位を一緒に、目的のタンパク質のための完全なコー
ド配列を提供するように、cDNA挿入部の欠損部分を再生
し、そしてベクターを再連結した。

この方法は目的のDNA配列を完結するための又は一般
的に目的のDNA生成物を得るために変形、削除し又は二
重鎖DNAに配列を付与するための、広く適用できる方法
を提供する。それは、制限酵素によりベクターのDNA配
列を消化し、望ましくないヌクレオチドを取り除き、
５′付着端を形成するためにエキソヌクレアーゼIIIに
より前記の切断されたベクターを処理し、このようにし
て処理されたベクターと偶数個の単鎖ヌクレオチドとを
混合し（これらのヌクレオチドは生成物DNA中の目的と
する配列をコードするか又はそれに対して相補的である
交互のセンス鎖及びアンチセンス鎖から成り、そしてこ
れらの単鎖ヌクレオチドは隣接するオリゴヌクレオチド
の末端及び／又は開裂されたベクターの５′付着端とオ
ーバラップしそしてそれに対して相補的であり、その結
果、もとの開裂部位の上流の５′付着端ともとの開裂部
位の下流の５′付着端との間にタンデムリッジを形成す
る）、そして前記混合物をDNAポリマラーゼＩ（Klenow
フラグメント）及びリガーゼにより処理することを含ん
で成る。目的とする生成物DNA配列を得るための二重鎖D
NA配列の変形のためのこの一般化された方法はまた、こ
の明細書に開示されている発明の１つの観点である。

さらにもう１つの観点においては、この発明は、リシ
ンＢをコードするメッセンジャーRNAを調製する場合に
使用される方法に適用されるメッセンジャーRNAの製造
方法における改良に関する。１つのそのような改良法
は、植物組織からのmRNAの単離のために特異的である。
なぜならば植物抽出物は、次の酵素的操作たとえばin v
itroにおける翻訳及び逆転写を抑制する酸化フェノール
類を伴うからである。それらは、Sephadex G−100によ
り調製物を処理することによって取り除かれ得る。すべ
てのmRNA製造に一般的なさらに進んだ改良法は、リボソ
ームRNAからmRNAを常用のdTアフィニティーカラムによ
り分離する前に、変性剤によりその調製物を処理するこ
とを含んで成る。

〔発明を実施するための態様〕

A.定義この明細書に用いられる場合、“リシンB"なる用語は
アミノ酸配列がトウゴマ（Castor beans）の種子から抽
出できるリシンＢペプチドの配列と実質的に類似するタ
ンパク質を意味する。トウゴマからのリシンＢは、長さ
にしておよそ260個のアミノ酸であり、そしておよそ34,
700ダルトンの分子量を有する。しかしながら、正確な
配列は種々のトウゴマに依存して変わることが知られて
いる。

“実質的に類似する”なる用語は、問題のタンパク質
がおよそ同じ長さ（任意に約10％以内）であるべきであ
るがしかし、さらに重要なことには、関連する毒素分子
の細胞内取り込みを促進するリシンＢ鎖の能力を保持す
べきであること意味する。タンパク質配列中のある小さ
な変化をタンパク質分子の機能性を妨げないで実施でき
るが、但し、他の変形は完全に破壊的であることがよく
知られている。特定の変化が属するであろうカテゴリー
を確信をもって予測することは今のところ不可能であ
る。この明細書における定義は第１のカテゴリーにある
いずれの変形をも含む。そのような変化は遺伝子配列中
の偶然の突然変異又はそれの意図的な変化から生じる。
さらに、よく知られているように、タンパク質配列は、
他の分子、たとえばグリコシド、脂質、又は無機イオ
ン、たとえばリン酸塩によって変形され得る。イオン化
状態もまた、培地のpH又は単離形態の結晶化もしくは沈
澱が生じるpHに依存して変化するであろう。さらに空気
の存在が不安定基、たとえば−SHの酸化を引き起こすこ
とができる。特定の一次構造の変化、すなわち、たとえ
ば、グリコシル化された形及びグリコシル化されていな
い形の両者、中和形、酸性塩及び塩基性塩、脂質又は他
のものと会合したペプチド形、酸化又は誘導体化による
側鎖の変化、及び同じ遺伝子コドン配列によってコード
されたアミノ酸配列の他のそのような変化がリシンＢの
定義内のものと意図される。

この発明の方法によって製造されるリシンＢを記載に
用いる場合、“不純物”なる用語は、トウゴマの種子内
に産生される場合、リシンＢに通常伴う物質を意味し、
そしてこれは上記のタンパク質の変形の中に含まれな
い。従って、“不純物”なる用語は、リシンＡ及びアグ
ルチニン並びに通常リシンＢに非特異的に関連する他の
トウゴマ種子の細胞物質を意味する。

DNA配列の記載に用いられる場合“作用可能的に結合
した”なる用語は、配列の機能が保持されるような態様
における並置を意味する。従って、たとえばプロモータ
ーに“作用可能的に結合した”コード配列は、そのプロ
モーターがコード配列の発現をもたらすことができるよ
うに位置する。

“制御”配列とは、転写及び翻訳の開始及び終結を制
御するDNA配列に関する。たとえば、原核系において
は、制御配列はプロモーター又はプロモーター／オペレ
ーター及びリボソーム結合部位をコードするヌクレオチ
ドを包含する。

“組換え体宿主細胞”なる用語は、組換え技法によっ
て構成されたDNA配列により形質転換された細胞を意味
する。そのような言及は、たとえば過によって分離さ
れた場合の細胞又は遠心分離によるペレットとしての細
胞、及びこれらの細胞の培養物のいずれをも含む。実際
に、文脈が許す場合、“細胞”及び“細胞培養物”なる
用語はこの明細書においては交換可能的に用いられる。

“上流の切断末端”及び“下流の切断末端”なる用語
は、二重鎖DNAが制限酵素により切断される場合に得ら
れるDNA配列の末端を意味する。使用される酵素に依存
して、その末端は付着端又は平滑末端であることができ
る。普通の方法を用いれば、“上流の末端”に関して
は、センス鎖は３′で終わり、そしてアンチ−センス鎖
は５′で終わる。“下流の末端”に関しては、逆が真で
ある。

一連の単鎖オリゴヌクレオチドを記載するのに用いら
れる場合、“センス配列及びアンチ−センス配列から交
互になる”ということは、“おおよそ”端と端をつない
で配列される場合、オリゴヌクレオチドが一緒になっ
て、センス−／アンチ−センス／センス／アンチ−セン
ス、等、すなわちと次々に連なるおのおののオリゴヌクレオチド配列によ
り完全な配列を提供するであろうことを意味する。前述
の項における“おおよそ”とは、オリゴヌクレオチドが
それらの長さの89％以上でオーバラップせず、その結果
ハイブリダイゼーションが末端で、すなわちのように生じることができることを意味する。

DNA配列の関係を記載するために用いられる場合、
“〜と連なる”なる用語は、１つの配列が他の配列の継
続であり、又は他の配列の継続に対して相補的あるよう
な関係を意味する。しかしながら、継続性は前のパラグ
ラフの意味では“おおよそ”であろう。

B.リシンＢコード配列のクローニング及び発現組換え体リシンＢを得るための次のアプローチは要約
すれば次のとおりである：すなわち、 1.天然に存在するリシンＢについて公表された配列は、
最小のコドンの冗長性に関連するアミノ酸配列、すなわ
ちTrp−Met−Phe−Lys−Asn−Asp−Gly（第２図を参照
のこと）の存在を示した。この配列をコードするすべて
のオリゴヌクレオチド配列の混合物をプローブとして構
成した。

2.一般的に通常の方法によってトウゴマの種子からmRNA
を単離し、そして対応するcDNAを調製することによって
cDNAライブラリィを構成した。しかしながら、その構成
の間、EcoRI/SalI部位を提結する挿入部を得るためにcD
NAの末端に適切なリンカーを連結した。次にEcoRI/SalI
挿入部をクローニングベクター、すなわちpUC13中に連
結し、そしてE.coli中に形質転換した。前記プローブと
共にハイブリッド形成することができる好結果の形質転
換体を選択し、そして配列決定した。

3.大部分のリシンＢ配列及びアグルチニンＢ配列を含み
コロニーを得た。さらに、RCA及びリシンの両者の一部
の推定されるペプチド前駆体（従ってこのコロニーは12
個のアミノ酸の架橋ペプチドを含む）のための配列を含
むコロニーが得られることが示された。cDNA挿入部は、
Ａ部分中で始まりそしておのおののＢ領域中にオーバラ
ップする配列を含んでいた。前述のコロニーに由来する
プラスミドは、この明細書においてそれぞれpRTB5.pRTB
4、及びpRTA115と命名される。

4.完全なリシンＢ鎖（但し11N−末端アミノ酸を除く）
のためのコード配列を含む、pRTB5中のcDNA挿入部を切
り出し、そしてpUC8中に挿入することによって1acプロ
モーターに関して正しい方向に配置し、pRTB151を得
た。pRTB151を下記のＣ項に記載されている方法によっ
て変形し、適切なコード配列、開始コドン、及び都合良
く配置された上流のHindIII部位を付加し、pRTB601を得
た。cDNAライブラリーを得るために用いられるクローニ
ングベクターは、ベクター中に連結のために用いられる
SalI部位のすぐ下流にHindIIIを含み、そして従って、
開始コドンを含む完全なコード配列は、変形されたベク
ターのHindIIIによる処理によって切り出すことができ
る。

5.pRTB151中のdes−Ｎ−末端リシンＢのコード配列を、
lacプロモーターと正しく読み枠が整合するように配置
し、pRTB236を得た。この得られる融合タンパク質につ
いて中程度の発現を得ることができた。

6.pRTB601からHindIIIカセットとしてコード配列を取り
出しそして再連結しそれをtrpプロモーター（pRTB514）
の制御下に置くことによって改良された発現を得た。温
度感受性“P_L”プロモーター（pRTB704）を使用しそし
て高いコピー数プラスミド（pRTB907）を用いることに
よって発現の程度になお一層の改良を得ることができ
た。

7.この得られる発現ベクター、すなわちpRTB236、pRTB5
14、pRTB704、及びpRTB904により形質転換された組換え
体細胞によって産生されたタンパク質は、ウェスターン
法によって所望のリシンＢであることが示された。

この項に記載されている詳細な方策は、下記のＣ〜Ｈ
のパラグラフに示される。

C.タンデムブリッヂングによる遺伝子再構成追加の開始コドンを含む、リシンＢのための完全なコ
ード配列を得るために、一般的に有用な新規なアプロー
チを用いた。この技法は、この特定のタンパク質のため
の適正な配列の再構成するように工夫されていると同時
に、cDNAライブラリー構成物がコード配列の不完全なコ
ピーをもたらすいづれの場合にも適用できる。それらは
また、入手可能なプラスミド配列の修飾によって、ベク
ター中における所望の二重鎖配列の生成物の構成に一層
一般的に適用することができる。

この方法は、特に、cDNAの５′末端から欠損した配列
を完結することに関して例示する。もちろん、所望の配
列を遺伝子中に挿入し、又は他の種種の修飾反応を実施
することが、いづれか一方の末端又は両末端を完結する
ために用いられ得るであろう。

たとえば、要約すれば、所望のcDNA挿入部を含むクロ
ーニングベクターを、得られたコード配列にすぐ先行す
る制限部位で消化する。まず第１に、適切なリンカーを
用いて、cDNAフラグメントを挿入する場合、もちろんそ
のように制限部位が存在するであろう。この制限部位と
コード配列の起源との間に介在する余分の塩基が存在す
る場合、S1ヌクレアーゼにより処理することによってこ
れを取り除く。次に、この得られる消化されたベクター
は、上流及び下流の切断末端、すなわち前記コード配列
の５′末端である下流末端及び切断前に、切断部位のす
ぐ上流に存在した、ベクターからの配列である上流の切
断末端を有する。

次に切断されたベクターの２つの末端をエキソヌクレ
アーゼIIIにより消化する。エキソヌクレアーゼIIIは、
二重鎖状態にあるヌクレオチド配列を、おのおのの鎖の
３′末端で始まる後方への消化によって加水分解する。
従って、エキソヌクレアーゼIIIにより消化されたクロ
ーニングベクターの処理は、フラグメントの１つの端で
コード配列の露出された５′付着端及び他端でcDNA配列
の上流で連結されたベクターの露出された５′付着端を
もたらすであろう。付着端がcDNAフラグメント又はベク
ターフラグメント中を後方にどの程度延びるべきかは臨
界的でないが、しかし100個の塩基又はそれよりも多く
の塩基の単鎖フラグメント部分が取扱いやすい。次に、
少なくとも２つの、但しいずれにしても偶数の単鎖オリ
ゴヌクレオチドを供給する。これらのヌクレオチドのう
ち１番目は、ほとんどの場合、cDNAコドンの５′末端に
すぐ先行するであろうコドンに相補的であり、但し挿入
部の露出された５′末端中の塩基に相補的な追加の塩基
も含む。好ましくは、供給されたオリゴヌクレオチド
は、少なくとも約８個のヌクレオチドと対合するように
cDNAの５′末端を越えて十分な延長部分を含むべきであ
る。

供給される第２のヌクレオチドは、第１のヌクレオチ
ドがそれに対して相補的であるコドンに先行するセンス
鎖中の追加コドンを含むべきである。しかしながら、や
はり第１のオリゴヌクレオチドの３′末端への第２のオ
リゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを保証する
ために、いくらかのオーバラップ領域が与えられなけれ
ばならない。必要であれば、オーバラップ領域を伴う交
互する追加の相補的領域及びコード鎖を提供する単鎖オ
リゴヌクレオチドを供給することもできる。

その方法は、第１図に描かれているように図的に最も
理解される。第１図が示すように、一連のオリゴヌクレ
オチドをタンデムにブリッヂングすることによってcDNA
を延長し、相補性が対応する末端、すなわち５′と５′
及び３′と３′との間にハイブリダイゼイションを確保
し、そして最後のオリゴヌクレオチドがクローニングベ
クターの５′付着端とブリッヂを形成する。

必要とするオリゴヌクレオチドの数は、再構成される
べき配列の長さに依存する。おのおのの単鎖オリゴヌク
レオチドは、長さにして約18bpよりも長く、そしておの
おのの末端で少なくとも約8bpの重複の領域を有する。
このオリゴヌクレオチドは相補するオーバラップ領域が
対合する場合、少なくとも２つの塩基がその鎖中に末対
として残るような長さ以上に十分に長くなければならな
い。上に例示されるように、再構成部分がＮ−末端をコ
ードする配列である場合、目的とする配列のコドンのす
ぐ先のATG開始コドンを含み、そして場合によっては便
宜上、得られる遺伝子の操作を容易にするために前記AT
Gに先行して制限部位を含むべきである。置き換えるべ
きコドンがＣ−末端にある場合、停止コドンを、適切に
読み枠を合わせて含むべきであり、そして次に都合のよ
い制限部位配列を便宜上含むことができる。

次に、エキソヌクレアーゼIIIによって処理されたベ
クターを適切なオリゴヌクレオチドと共に混合し、そし
てこの混合物を相補的鎖をフィルインするためのDNAポ
リマラーゼＩ（Klenow）及びその構成体を完成するため
のE.コリのリガーゼ又は他のリガーゼの両者により処理
する。所望により、今、このベクターは、制限部位によ
って先行される、完全な配列を含む延長されたcDNA挿入
部を含む。

このタンデムブリッヂング技法はすべての所望の配列
を環状ベクター中に挿入するために有用であることが前
述の記載から明らかであろう。もとの切断部位に隣接す
るヌクレオチドもまた取り除くことができるので、最終
結果は変形及び挿入をもたらすことができる。

D.mRNAの精製における改良法リシンＢをコードするmRNA、及びその関連タンパク質
の製造において、Belamy,A,R.,など、Methods in Enzym
olyy（1966）104:156の方法が改良をもたらすいくらか
の変更を伴って使用された。これらの改良及び変更は標
準的方法のある不利な点を克服する。そのような１つの
改良が、植物組織源からのmRNAの調製において、ある問
題を構成する調製物由来の酸化されたフェノール化合物
を取り除くことに成功する。他の改良は、すべてのmRNA
調製に固有の問題、すなわちmRNAがリボソームRNAに結
合する傾向を解決するために一層一般的に適用される。
この結合が従来のdTアフィニティーカラムへの調製物の
適用の前に破壊され得る場合、溶出のための要求は一層
少なくてすむ。

酸化されたフェノールを除去するために、調製物をSe
phadex G−100により処理する。そのゲルは酸化された
フェノールを保持し、そしてボイドボリウムとしてmRNA
を通過せしめる。（ポリフェノール化合物及び転移RNA
の両者は遅れる。）これは、従来使用された解決法より
も簡単な解決法、を提供し、この方法においては、RNA
抽出を実施する前に、リボソーム又は他の半細胞成分を
前もって単離する。

複合するリボソームRNAを除去するために、前述のＧ
−100カラム（そのようなカラムが用いられる場合）か
ら出て来るRNAの懸濁液と変性剤とを反応せしめるよう
に、又はdTアフィニティーカラムに調製物を適用する前
にいずれにしてもそれをそのように反応せしめるように
この方法を修飾する。調製物は、最小量の従来の変性
剤、たとえば加熱されたホルムアミド、又は水酸化メチ
ル水銀により、好ましくはホルムアミドにより変性され
得る。この変性剤はリボソームRNA及びmRNAのポリＡ部
分の間の結合を分解し、そして従ってメッセンジャーRN
Aがより効果的にカラムに付着するのを可能にする。

E.ベクター及び宿主細胞下に記載されている特定の態様は、原核生物と適合す
るベクターを構成するための、及びそのようなベクター
をこれらの宿主細胞中に形質転換するための方法を示
す。E.coli:K12菌株MM294及びE.coli MC1000株の入溶原
株を特に記載する。しかしながら、他の微生物株、たと
えばバシルス、たとえばバシルス・スブチリス（Bacill
us subtilis）、種々のシュードモナス（Pseudomona
s）、又は他の細菌株もまた使用される。そのような原
核系においては、宿主と適合する種に由来する複製部位
及び制御配列を含むプラスミドベクターを使用する。た
とえば、E.coliは、pBR322、すなわちBolivar、など、G
eme（1977）2:95によるE.coli種に由来するプラスミド
の誘導体を用いて典型的には形質転換される。pBR322は
アンピシリン耐性及びテトラサイクリン耐性のための遺
伝子を含み、そして従って目的のベクターを構成する場
合に保持されるか又は破壊されるかいづれかであること
ができるマーカーを提供する。転写開始、場合によって
はオペレーター、リボソーム結合部位配列を含むことを
この明細書に定義されている普通に使用される原核生物
の制御配列は、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）プ
ロモーター系及びラクトーズ（1ac）プロモーター系〔C
hang、など.,Nature（1977）198.1056〕及びトリプトフ
ァン（trp）プロモーター系〔Goeddel、など.,Nucleic
Acids Res.（1980）8:4057〕並びにλ由来のP_Lプロモー
ターのごとき普通に用いられるプロモーター及びＮ−遺
伝子のリボソーム結合部位〔Shimatake、など.,Nature
（1981）292:128〕を含む。しかしながら、原核生物と
適合する入手可能な任意のプロモーター系が使用され得
る。

細菌の他に、真核微生物、たとえば酵母もまた使用す
ることができる。多くの他の菌株が通常利用できるが、
サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces Cerevisi
ae）、すなわちパン酵母が最も普通に使用される。酵母
発現に適切な多くのプラスミドベクターもまた知られて
いる。〔たとえばStinchcomb、など.,Nature（1979）28
2:39、及びTschempe、など.,Gene（1980）10.157を参照
のこと〕。酵母ベクターのためのプロモーターは、解糖
酵素の合成のためのプロモーターを含む〔Hess、など.,
J.Adv.Enzyme Reg．（1968）7.149及びHolland、など.,
Biochemistry（1978）17:4900〕。酵母に適合するプロ
モーター、複製の起源及び他の制御配列を含むいづれか
のベクターが適切である。

最近になって、多細胞生物に由来する真核生物宿主の
細胞培養物中でポリペプチドをコードする遺伝子を発現
することができることが見出された〔たとえばTissue C
ultures,Academic Press,編集者Cruz及びPatterson（19
73）を参照のこと〕。有用な宿主細胞系は、VERO及びHe
La細胞、並びにChineseハムスターの卵巣（CHO）細胞を
含む。たとえば、そのような細胞のための発現ベクター
は、通常、哺乳類細胞に適合するプロモーター、たとえ
ば普通使用されるシミアンウィルス40（SV40）からの前
期及び後期プロモーターを含む〔Fiers、など.,Nature
（1978）273:113〕。

使用される宿主細胞に依存して、原核生物又は実質的
な細胞壁障壁を含む他の細胞、又はそのような細胞壁を
有しない哺乳類細胞のための形質転換を、Cohen,S.N.,P
roc.Natl.Acad.Sci。（USA）（1972）69:2110によって記
載されているように、塩化カルシウムを使用するカルシ
ウム処理法、すなわちGraham及びVan der Eb,Virology
（1978）52:546のリン酸カルシウム沈殿法を用いて行な
う。

この発明によって達成される好結果をもたらす発現
は、所望の毒素フラグメンドの発現を調節する適切な制
御配列の正しい使用に依存する。従って、宿主が何であ
ろうと、その宿主に適合しそして適切な制御配列は、目
的の配列の５′末端に正しく配置された“開始”コドン
を用いるそのコード配列に対して作用可能的に配置され
る。すべての“天然の”制御配列は除去される。この発
明のベクターは、所望のリシンＢペプチドフラグメント
のためのコード配列、それにすぐ先行するATG開始コド
ン、及びその上流に、特定の宿主に適合するように選択
された制御系を配置する。

目的のフラグメントの良好な生産性を得るためには、
宿主細胞に対するすべての致死的効果を最小にするよう
に生産の“時間”を調節することがまた重要である。さ
らに典型的には、これは、実質的な増殖が起こるまでリ
シンＢ配列の発現を遅らせることによって行なわれる。
従って、環境条件に支配されている制御配列を使用する
ことが好ましい。増殖期の間発現を抑制する条件を維持
し、そして次に、所望の時に発現を可能にする条件に転
換することによって、すべての潜在的な致死効果の負の
局面を最小にすることができる。

特に好ましい２つのアプローチにおいては、これらの
調節可能な制御配列が原核宿主に適合性である。trpプ
ロモーターは、作用可能的に結合した配列の発現を培地
中のトリプトファンのレベルによって制御することがで
きる調節可能なプロモーターである。増殖の間トリプト
ファンを高レベルに維持することによって発現が抑制さ
れる。トリプトファンの消耗又は競争阻害がプロモータ
ーに作用し、そして発現を可能にする。

λファージに由来するP_Lプロモーターがさらに一層好
ましい。このプロモーターは、温度感受性であることが
できるタンパク質によって制御される。（野性型リプレ
ッサーの変異体形、たとえば当業界に知られているこの
特性を有するCI₈₇₅が存在する。）この変異体形のリプ
レッサーを合成することができる宿主（たとえば、λフ
ァージN₇N₅₃CI₈₅₇SusP₈₀に対して溶原性のE.コリK12株M
C1000）において使用される場合、P_Lプロモーターは、
温度が上昇する場合にスイッチ−オンされるであろう。
なぜならば高温により変異体のCIリプレッサーが不活性
化するからである。従って、宿主細胞は外来性タンパク
質の生産を伴わないで低温で増殖することができる。次
に、増殖が達成され、そしてリシンＢの生産量が好まし
い場合、温度が上昇せしめられる。

必ずしも独立的でないもう１つのアプローチは、温度
感受性のコピー数制御を有するプラスミドの使用を含
み、その結果細胞が低温で増殖する場合、プラスミド中
に含まれるコード配列が低レベルで複製される。高温で
は、そのようなコピー数が増加される。従って、生産さ
れるタンパク質の量は、そのコード配列の有効なコピー
数を制御することによって直接的に管理される。

両者のアプローチが同時的に用いられる場合、温度の
上昇は、コピー数の増加及びプロモーターの抑制解除の
両者をもたらし、そうでなければ抑制されたであろう遺
伝子生成物の実質的な合成を導く。

F.使用される方法目的のコード配列を含んで成るmRNAフラグメントの単
離はこの下に詳しく記載される。polyARNAを鋳型として
用い、当業界において現在十分に理解されている方法に
よってcDNAライブラリィを構成する。そのような方法の
詳細は、Maniatis,E.F.など.,Molecular Cloning,Cold
Spring Harbor Laboratory（1982）を参照することによ
って得ることができる。cDNAライブラリィを、Grnnstei
n及びHogness,Proc.Natl.Acad.Sci.（1975）72:3961の
方法を用いることにより、目的の配列について探査す
る。

ベクターの構成は、当業界において既知の連結及び制
限技法を使用する。有用なDNAの量は、目的のフラグメ
ントをクローニングすることによって、すなわち適切な
クローニングビヒクル、たとえばpBR322、pUC13又はpUC
8中に挿入し、E.コリ中に形質転換し、そして複製せし
め、そして場合によっては、クロラムフェニコール増幅
を介してさらに増やすことによって、又はファージ複製
によって増加され得る。次に、所望のフラグメントをク
ローニングベクター又はファージから取り出し、そして
遺伝子の発現に使用される予定の宿主と適合する適切な
プロモーターに連結する。次に、そのような宿主をこれ
らの発現ベクターにより形質転換し、そしてプラスミド
の安定化及び目的の毒素フラグメントの確実な生産を与
える条件下で培養する。そのような条件は、対数増殖期
がほとんど完結するまでの制御プロモーターの抑制を含
み、そして次に、ペプチドの合成を与えるような条件に
変えることができる。ペプチドが合成された時、細胞は
破壊され、そして所望のフラグメントがその破壊物から
回収される。

目的のコード配列及び制御配列を含む適切なベクター
の構成は、当業界において十分に知られている標準的な
連結及び制限技法を用いる。単離されたプラスミド、DN
A配列、又は合成されたオリゴヌクレオチドを、切断
し、調整し、そして所望の形に再連結する。

部位特異的DNA切断を、当業界において一般的に知ら
れている条件下で適切な制限酵素（又は酵素）により処
理することによって実施し、そしてこの条件は、商業的
に入手できるこれらの制限酵素の製造業者によって詳細
に記載されている。たとえば、ニューイングランドバイ
オラボの製品カタログを参照のこと。一般的に、約１μ
ｇのプラスミド又はDNA配列を、約20μｌの緩衝溶液中
で１ユニットの酵素によって切断する。この明細書にお
ける例においては、典型的には、過剰の制限酵素を使用
し、DNA基質の完全な消化を確保する。約37℃で約１〜
２時間のインキュベーション時間が適切である。しかし
変更することもできる。おのおののインキュベーション
の後、タンパク質を、フェノール／クロロホルムによる
抽出によって、次にエーテルによる抽出によって取り除
き、そして核酸を、エタノールによる沈殿によって、次
にSephadex G−50スピンカラムに通すことによって水性
画分から回収する。所望により、切断されたフラグメン
トのサイズによる分離を、標準的技法を用いてポリアク
リルアミドゲル電気泳動によって実施することができ
る。サイズによる分離の一般的な説明は、Methods in
Enzymology（1980）65:499〜560に見い出される。

制限酵素反応により切断されたフラグメントを、pHの
7.6の50mMのTris,50mMのNaCl,6mMのMgCl₂,6mMのDTT及び
0.1mMのdNTP中において、20〜25℃で約15〜25分のイン
キュベーション時間を用いて、４種のヌクレオチドトリ
ホスフェート（dNTP）の存在下においてＥ．coliのDNA
ポリマラーゼＩの大フラグメント（Klenow）により処理
することによって平滑末端化することができる。このKl
enowフラグメントは、単一鎖を５′付着末端でフィルイ
ンし、たとえ４種のdNTPが存在しても、３′付着末端で
チューバックする。所望により、付着末端の性質によっ
て指令される限界内でdNTPの１つのみを、又は選択され
たdNTPsを供給することによって選択的修復を実施する
ことができる。Klenowによる処理後、その混合物をフェ
ノール／クロロホルムによって抽出し、そしてエタノー
ルにより沈殿せしめ、次にSephadex G−50スピンカラム
に通す。

他の２つのヌクレアーゼ酵素、すなわちS1ヌクレアー
ゼ及びエキソヌクレアーゼIIIは、下記に示される方法
により使用する。

適切な条件下でのS1ヌクレアーゼによる処理は、DNA
のいずれかの単一鎖部分の急速な加水分解及び末端で始
まる二重鎖部分のおそい加水分解をもたらす。S1ヌクレ
アーゼによる加水分解を、１μｌ当り200ユニットのS1
ヌクレアーゼを用いて、15mMの酢酸ナトリウム、200mM
のNaCl、及び1mMのZnSO₄を含むpH4.5の緩衝液中におい
て行なう。通常、5000ユニットのS1ヌクレアーゼを用い
て、おおよそ10μｇのDNAを加水分解する。

エキソヌクレアーゼIIIは二重鎖DNAを攻撃し、そして
ヌクレオチド配列の３′末端で加水分解し始める。従っ
て、二重鎖DNAの消化は２つの突起する５′付着末端を
もたらす。加水分解を、１μｌ当りおよそ2000ユニット
のエキソヌクレアーゼIIIを用いて、5mMのTris,10mMのN
aCl,1mMのMgCl₂，及び0.1mMのDTTを含むpH8の緩衝液中
において実施する。通常、150ユニットのエキソヌクレ
アーズIIIを用いて、10μｇのDNAと反応せしめる。

合成オリゴヌクレオチドを、Matleucci、など、J.Am.
Chem.Soc.（1981）103:3185〜3191のトリエステル法に
よって製造する。アニーリング前の又はラベル化のため
の単一鎖のキナーゼ処理は、過剰の、たとえば1nモルの
基質に対しておおよそ10ユニットのポリヌクレオチドキ
ナーゼを用いて、50mMのTris,pH7.6,10mMのMgCl₂,5mMの
ジチオエリトリトール、１〜2mMのATP、1.7ピコモルの
γ−³²P−ATP（2.9mCi/ミリモル）、0.1mMのスペルミジ
ン、及び0.1mMのEDTAの存在下で、達成される。

正しいマッチングを提供するために適切に適合され
た、およそ等モル量の所望のDNAフラグメント（但しリ
ンカー又は小オリゴマーの場合は２〜10倍の過剰量）を
用いて、過剰の、すなわち典型的な15〜30μｌ反応にお
いては、0.4〜4WeissユニットのT4のDNAリガーゼ及び、
平滑末端の連結が関与する場合、0.4〜１ユニットのRNA
リガーゼによる処理によって、連結反応を行なう。連結
反応混合物を、平滑末端の連結又は付着末端の連結のい
ずれかのために、5mMのマグネシウムイオン、5mMのジチ
オエリトリトール、1mMのATP、及び0.1mg/mlのBSAと一
緒に66mMのTrisを用いて、おおよそpH7.6で緩衝する。
インキュベーションをおおよそ14〜25℃で１晩実施す
る。

“ベクターフラグメント”を用いるベクターの構成に
おいては、５′リン酸を取り除きそしてベクターの再連
結を妨ぐために、ベクターフラグメントを、時には、細
菌性アルカリホスファターゼ（BAP）により処理する。
このBAP消化を、ベクターの１μｇ当り約１ユニットのB
APを用いて、60℃で約１時間、Na⁺及びMg²⁺の存在下
で、おおよそ50mMのTris中においてpH＝8.3で行なう。
核酸フラグメントを回収するために、調製物を、フェノ
ール／クロロホルムにより抽出しそしてエタノールによ
り沈殿せしめ、そしてSephadex G−50スピンカラムに適
用することによって脱塩する。一方、望ましくないフラ
グメントの途分な制限酵素による切断によって二重に消
化されたベクター中において再連結を妨ぐことができ
る。

下記に示される構成法においては、プラスミドの構成
のための正しい連結は、E.コリGenetic Stock Centerか
ら得られたE.コリMM294株（CGSC＃6135）を又は他の適
切な宿主を連結混合物により形質転換することによって
確かにされる。好結果をもたらす形質転換体を、当業界
において知られているように、アンピシリン耐性、テト
ラサイクリン耐性又は他の抗生物質耐性によって、又は
プラスミド構成の方法に依存する他のマーカーを用いて
選択する。次に、形質転換体からのプラスミドを、クロ
ラムフェニコールによる増幅〔Clewell,D.B.,J.Bacteri
ol。（1972）110:667の後、Clewell,D.B.,など，Proc.N
atl.Acad.Sci。（1969）62:1159〕の方法に従って調製
し、そして制限酵素反応によって分析しそして／又はMe
ssing,など，Nucleic Acids Res。（1981）9:309の方法
によって、又はMaxam,など，Methods in Enzymology（1
980）65:499の方法によって配列決定する。

下記の例においては、Cohen,S.N.,など，Proc.Natl.A
cad.Sci.(USA)（1972）69:2110によって記載されている
塩化カルシウム法を用いて形質転換を実施した。

２つの宿主菌株を、下記に示されているプラスミドの
クローニング及び発現に使用した。

特に、クローニング及び配列決定のためには、E.coli
菌株MM294（前記）〔Talmadge,K.,など，Gene（1980）1
2:235及びMeselson,M.,など，Nature（1968）217:111
0〕を宿主として使用した。しかしながら、発現がP_Lプ
ロモーター及びN_RBSの制御下にある場合、発現宿主とし
てE.coli菌株MC1000λN₇N₅₃CI₈₅₇SusP₈₀（1983年12月21
日に寄託されたATCC＃39531）を使用した。この後、こ
の菌株をMC1000−39531と称する。この菌株は30〜32℃
の許容温度で活性な温度感受性C_Iリプレッサーをコード
するλプロファージを含む。しかしながら、36〜48℃の
非許容温度で、このリプレッサーは不活性であ、そして
P_Lプロモーターからの転写を進行することができる。こ
のプロファージは高温で誘導できないということがこの
菌株の他の特徴である。

次の例は、原核生物中でのリシンＢフラグメントの生
成のために適切な発現ベクターの生成を記載することに
よってこの発明を例示する。しかしながら、この発明の
リシンＢは他の宿主類のために適切な種々のベクター中
に連結され得る。

Ｇ。mRNAの単離法及びcDNAライブラリィの調製法 G.1ヒマの種子からのmRNAの単離法ヒマ〔リシナスコムニス（Ricinus communis）〕の種
子50gを、100mlの均質緩衝液（150mMのNaCl,50mMのTri
s,pH8.3,5mMのEDTA及び新たに添加された50mMのβ−メ
ルカプトエタノール）中に置き、それに、0.2Mバナジウ
ム−リボヌクレオチド複合体12ml^☆，プロティナーゼK3
0mg,及び20％SDS15mlを添加した。この混合物をWaring
ブレンダー中で３〜４分間高速で混合することによって
均質化し、そして次に時折混合しながら室温で２〜３時
間培養した。

☆バナジウム−リボヌクレオチド溶液を次のようにして
調製する。すなわち、893mgのVOSO₄・3H₂Oを水2ml中に
添加し、そしてその混合物を煮沸し、バナジウム塩を溶
解した。４種のリボヌクレオチドを含む溶液を、水17ml
中にアデノシン、シチジン、グアノシン、及びウリジン
のそれぞれを1mモリ溶解することによって調製した。次
にそれを加熱した。次に前述のVOSO₄溶液の1mlを、その
リボヌクレオチド溶液に添加し、そしてその得られた混
合溶液を、熱湯浴中において攪拌しながら、1ONのNaOH
によりpH＝6.5に、そして1NのNaOHにより最終的にpH＝
７に滴定した。複合体の形成は明るい青から緑黒色に変
化することによって示される。この溶液を最終的に水に
より20mlに希釈した。

前記懸濁液を５℃で15分間、8000×ｇで遠心分離し、
そしてペレットを廃棄した。上清液をチーズクロスを通
して過し、脂質を取り除き、そして液を、１％ヒド
ロキシ−キノリンを含む、フェノールTE:HCl₃：イソシ
アミルのが24:24:1の比で含まれる溶液により十分に抽
出し、バナジウム塩及びタンパク質を取り除き、そして
その水性相を、NaClにより0.4Mに、そしてEDTAにより10
mMにした。2.5×体積の無水エタノールを添加し、核酸
を沈殿せしめ、そしてその混合物を−20℃で１晩保存し
た。

前記沈殿物を、２℃で15分間、7000×ｇで遠心分離
し、そして0.025MのNaCl,0.025MのTrisを含むpH8の水溶
液9.5ml＋9.5mlのリン酸緩衝液（2.5Mの合計リン酸塩、
すなわち20:1のK₂HPO₄:33％のH₃PO₄）＋２−メトキシエ
タノール9.5mlの溶液中にペレットを再懸濁した。この
混合物を振盪し、そして時折混合しながら３〜５分間氷
上で冷却し、そして次に２℃で５分間、2000×ｇで遠心
分離した。上相を取り出し、そしてこれに0.2Mの酢酸ナ
トリウム10ml及び１％セチルトリメチルアンモニウムブ
ロマイド（CTAB）5mlを添加し、そしてこの混合物を10
分間氷上で冷却した。得られた白色の沈殿物を２℃で10
分間、2000×ｇで遠心分離することによって収得した。
この沈殿物を0.1Mの酢酸ナトリウム中70％エタノールの
添加によって洗浄し、そして４℃で10分間、2500×ｇで
再び遠心分離した。

上清液の除去の後、そのペレットを2mlのＧ−100カラ
ム開始緩衝液（20mMのTris,pH8,1mMのEDTA,及び0.5％SD
S）中に再懸濁し、そして次に0.5MのNaClを含むように
調整した。室温で５分間、2000×ｇで遠心分離すること
によって、固体を取り除き、そして上清液をSephadex G
−100カラム（1.5cm×40cm）に適用し、そしてカラムに
適用された緩衝液（但しSDSが欠けている）に類似する
緩衝液を用いて、そのカラムを溶出した。この溶出液
を、OD₂₆₀によりモニターすることによって検定した。
植物抽出物中に存在する酸化されたフェノール化合物を
残して、目的のmRNAを流過液中に得た。（これらのフェ
ノール化合物は、dTカラム上でpolyA RNAに類似の挙動
を示し、タンパク質合成を阻害し、そして従ってmRNAに
ついての検定を妨げることが知られている。） mRNAを含む初期のピークを、ホルムアミド、すなわち
変性剤により処理し、複合するリボソームRNAを破壊し
た。これを行なうことによって、mRNAを含有する画分を
プールし、エタノールにより沈殿せしめ、そしてこの沈
殿物を最小体積の水中に再溶解した。この溶液に、6.5
〜7.0のpHの20mMのPIPES〔ピペラジン−N,N−ビス（２
−エタンスルホン酸）〕を含む脱イオン化されたホルム
アミド９体積を添加した。

次に、この混合物を５分間37℃に加熱し、そしてdTカ
ラム緩衝液（0.5MのNaCl,10mMのTris,pH＝7.5,及び1mM
のEDTA）10体積を添加した。ホルムアミドの存在は、存
在するすべてのリボソームRNAからpolyA RNAを解離せし
める。

次に、変性された混合物を、当業界において十分に確
立した方法に従って、オリゴdTカラムにかけ、そしてお
およそ100μｇのpolyA RNAを溶出後回収した。

G.2 cDNAライブラリーの形成法前項のようにして製造されたpolyA mRNAを用いて、Ma
niatis,など（前記）の方法に従って、cDNAライブラリ
ーを得た。要約すれば、polyA RNAの部分を、適切な緩
衝液条件下で、逆転写酵素により処理し、そして次に塩
基により処理し、残存するmRNAを破壊する。その得られ
る単一鎖cDNAを、４種のdNTPの存在下において、E.coli
ポリマラーゼＩ（Klenowフラグメント）を用いて修復
し、そして次に得られる“ヘアピン”をSal Iリンカー
（ニューイングランドバイオラボラトリイから得られ
た）にT4リガーゼを用いて連結する。S1ヌクレアーゼに
よる処理、及びKlenowによる修復の後、平滑末端を、T4
リガーゼを用いてEcoRIリンカーに連結した。次に、Eco
RI及びSalIによる消化の後、得られる二重鎖のcDNAフラ
グメント（EcoRI及びSalIの制限部位によって結合され
る）を、EcoRI/SalIにより消化されそしてBAPにより処
理されたpUC13（J.Messing,the University of Minneso
taから得られそして自由に入手可能な）の調製物中に連
結した。pUC13は、Amp耐性（Amp^R）を付与することがで
きるpBR322の変形体であり、そしてこれは、挿入におい
て使用されるSalI部位から下流にPstI部位を含む便利な
制限部位を担持するリンカーを含む。この得られる連結
混合物を使用して、E.coli MM294、及び選択されたAmp^R
菌株を形質転換せしめる。

好結果をもたらすコロニイをニトロセルロースプレー
ト上に移し、そしてGrunstein及びHogness（前記）の方
法を用いて、₃₂Pと共にキナーゼ処理された16個の合成
オリゴヌクレオチド、すなわちの混合物をプローブした。この混合物は、アミノ酸配
列、すなわちTrp−Met−Phe−Lys−Asn−Asp−Glyのた
めのコドンに相補的なアンチ−センス鎖を表わす。プロ
ーブされた約5000コロニーのうち１％がプローブにハイ
ブリダイズしたことが見出された。これらのコロニーの
いくつかの代表からプラスミドを単離し、そして制限分
析法及びMaxam−Cilbert配列決定法によって分析した。
３つのプラスミド、すなわちpRTB4,pRTB5,及びpRTA115
を挿入領域において配列決定した。

第３図及び第４図はこの配列決定の結果を示す。第３
図はpRTB5中の挿入部の配列を示す。第３図中のライン
１は、Funatsu（前記）によって決定されたリシンＢの
アミノ酸配列を示す。第二ラインはpRTB5の塩基配列か
ら推定されるアミノ酸配列を示す。推定される配列の検
査は、いくらかの不一致が存在するが、高いレベルでの
一致を示す。これらは、公表された配列における誤り及
び代表されるリシンＢタンパク質における種々の相違に
よるものである。ライン３は単離されたcDNAの塩基配列
である。リシンＢのための完全なコード配列が存在する
が但し、始めの11個のアミノ酸についてのコドンのため
のコドンは存在しない。（５′末端での小文字のコドン
は、プラスミド中にcDNA挿入部を連結するために使用さ
れるEcoRIリンカーを表わす。）pRTB5は、発現ベクター
中において大部分のコード配列の源として使用された。

第４図はpRTB4及びpRTB5における配列の比較を示す。
pRTB4はRCAのＢ鎖のためのコードを表わすと思われる。
第４図はまたpRTA115及びpRTB5間の重複を示し、このこ
とはRTA115挿入部がリシンＢ遺伝子の上流のコード領域
を含むことを示す。pRTA115は前駆体タンパク質と関連
すると思われるが、pRTA115から推定されるRCAのアミノ
酸配列は、Ｎ−末端を完結するのに必要な11個のアミノ
酸のためのリシンＢのアミノ酸配列に匹敵する。従っ
て、欠けている11個のＮ−末端コドンをコードするオリ
ゴメクレオチドの構成のためのモデルとしてこれらの配
列を使用し、そしてまたRCAのそしてまたおそらくリシ
ンＡ及びＢの単一のペプチド前駆体中の12個のアミノ酸
のペプチドのアミノ酸配列の推定を可能にする。

pRTBらのコード配列を、pUC13中に挿入する場合、1ac
プロモーターの制御下で発現できないように配置した。
従って、pRTB5をEcoRI及びPstIにより切断し、そしてベ
クターをBstNIによりいくつかのフラグメントに切断し
た。挿入フラグメントと、T4リガーゼを用いて標準的条
件下でpUC8,すなわちUniversity of MinnesotaのMessin
g,J.から得られそして自由に入手できるもう一つの変形
されたpBR322ベクター、のEcoRI/PstI消化物とを連結し
た。pUC8は、β−ガラクトシダーゼの最初の５〜８個の
アミノ酸を含む融合タンパク質としてlacプロモーター
制御下にEcoRI/PstI挿入部を配置するEcoRI部位及びPst
I部位を有する。それはまたPstI部位からすぐに下流にH
indIII部位を含む。連結混合物をE.coli MM294中に形質
転換し、そして形質転換体をアンピシリン耐性について
選択した。プラスミドDNAをいくつかのコロニー中の好
結果をもたらす形質転換体から単離し、そして制限部位
マップングによって分析した。適切な制限パターンを示
すコロニーを選択した。pRTB151と命名された１つのコ
ロニーを、融合タンパク質のための遺伝子の発現につい
て試験した。ウェスターン法に基づいて公差タンパク質
が生成されたが、目的の分子量に対応するタンパク質帯
は見い出されなかった。読み枠が不適切であると推定さ
れた。なぜならばこのプラスミドは、異なった相におい
てβ−ガラクトシダーゼ及びリシンＢ配列を有するよう
に計画されたからである。

H.HindIII−カセットとしてのリシンＢコード配列の構
成法−pRTB601 この構成法は第６図に略図されている。

10μｇのpRTB151DNAをEcoRIにより完全に消化し、60
μｌのS1緩衝液中に溶解し、そして１分ごとにデュプレ
ックスDNAの約１塩基対を取り除く条件下で４分間室温
で消化した。前述の緩衝液から回収されたDNAを60μｌ
のエキソヌクレアーゼIII緩衝液中に溶解し、そして室
温で４分間消化した。この後の分析は、プラスミドDNA
がおのおのの３′末端からおおよそ120bpを失い、そし
てハイブリダイゼイションのために使用できる５′末端
を残したことを示した。エキソヌクレアーゼIII緩衝液
から回収されたDNAを50μｌの水中に溶解し、そしてそ
の20μｌを下の連結／修復反応に使用した。

すなわち、20μｌのサンプル（２ピコモル）と20ピコ
モルのおのおのの合成オリゴヌクレオチド（下に示され
るように相補的配列を有する）：すなわち〔ここで、Oligo−２は第5a図に示されるようにATG開始
コドンの上流にHindIII部位をコードする〕とを混合し
た。Oligo−１の５′末端は、そこに示されるようにpRT
B151のcDNA配列の５′末端の15個の塩基に相補的であ
り、そしてリシンＢ配列の隣接する欠失コドンに相補的
である。Oligo−２の５′末端は、エキソヌクレアーゼI
IIにより処理されたpRTB151のベクター残基の５′付着
末端に相補的である。

前記混合物を、単一鎖、DNAの相補性を完全に変性す
るために５分間60℃に加熱し、５分間37℃に冷却し、相
補的鎖をハイブリダイズせしめ、そして次に氷上で冷却
した。溶液をポリマラーゼＩ（Klenow）緩衝液条件に導
き、そしておのおの50μＭの４種のdNTP、0.1mMのNAD、
0.3ユニット／μｌのKlenow、及び0.08ユニット／μｌ
のE.coliのDNAリガーゼの存在下において12℃で２時間
反応せしめた。連結混合物を用いて、コンピテントE.co
li MM294を直接的に形質転換し、そして数千個のAmp^Rコ
ロニーを見出した。これらの数百個をレプリカし、ニト
ロセルロースフィルター上で増殖せしめ、そしてプロー
ブとしてp³²と共にキナーゼ処理されたOligo−２を用い
て標準的コロニーハイブリダイゼイションにゆだねた。
プローブとハイブリダイズした２つのコロニーを制限酵
素反応分析によって分析し、そして配列決定し、そして
正しい構成体をpRTB601と命名した。従ってpRTB601は、
HindIIIカセットとしてリシンＢのコード配列を含む。
上流のHindIII部位をOligo−２中のATGコドンのすぐ上
流に導入する。下流のHindIII部位はpUC8ベクタープラ
スミドから生じる。

I.リシンＢのための発現ベクターの構成法 I.1 pRTB236の構成法 pRTB236は、β−カラクトシダーゼのアミノ末端の始
めの５個の残基、次にpRTB151中のcDNA挿入部によって
コードされたペプチドを含む融合タンパク質を生成する
ように正しく読み枠を合せて、lacZプロモーターの制御
下にpRTB5のコドンを配置している。従って、得られる
タンパク質は、β−ガラクトシダーゼのＮ−末端に始ま
り、そして初めの11個のアミノ酸を欠くリシンＢの部分
をもって完結する配列である。

pRTB236を構成するために、pRTB151を次のようにして
正しい読み枠に変性した。すなわち、pRTB151をEcoRIに
より消化し、そしてS1ヌクレアーゼにより処理し、EcoR
Iの突起する末端を除いた。次に、反応混合物を、T4のD
NAリガーゼを用いて再連結し、そしてE.coli MM294中に
形質転換した。Amp^Rコロニーを選択し、そして多くのコ
ロニーを配列決定した。pRTB236は、正しく読み枠を合
せていることが見出され（決定された適切な配列は第5b
図に示されている）、そしてこの形質転換された菌株
は、ウエスターン法によって示されるようにリシンＢタ
ンパク質を生成することができる。

第８図は、pRTB236,pRTB151,及びpUC8により形質転換
された細胞からの抽出物をErlich,H.A.,など〔Infect I
mmunol．（1983）41:683〕方法の従って、実施したウエ
スターン法の結果を示す。公差反応物質はRTB配列を含
むすべてのクローン中に見られるが、pRTB236からの抽
出物のみが適切な大きさのポリペプチドを有する。

I.2〜I.4項に記載されているプラスミドpRTB514、pRT
B704及びpRTB907の構成法は、第７図に示される。

I.2 pRTB514の構成法 pRTB514は、trpプロモーター／オペレーター系の制御
下でのATG開始コドンに先行されるリシンＢの完全なコ
ード配列を含む。このtrpプロモーター／オペレーター
系は、下にさらに記載されているプラスミドpDG141に由
来する。

３μｇのpRTB601をHindIIIにより消化し、リシンＢコ
ード配列を切り出した。制限反応消化物をFnuDIIにより
処理し、ベクターの残りの部分のAmp^R領域を破壊し、そ
してT4のDNAリガーゼを用いて、１μｇのpDG141のHindI
IIの消化物と連結した。この連結混合物をE.コリMM294中
に形成転換し、そしてAmp^Rコロニーを選択した。所望の
プラスミドpRTB514を１つのコロニーから単離し、そし
てその正しい構成をMaxam−Gilbert塩基配列決定法によ
って確かめた。適切な配列を第5c図に示す。

I.2.a pDG141の調製 pDG141は、ATG開始コドンからすぐ上流に制御配列を
含む。それを1984年１月24日ATCCに寄託し、そして寄託
番号39588を得た。ATGの上流の配列は、リボソーム結合
部位のすぐ下流を切断するHindIII切断部位を提供す
る。pDG141の構成においては、pBR322の誘導体を用い
て、trp（PstI/HindIII）カセットを得、そしてpBWを用
いて、ATG及びその下流のSacI部位を得る。

PstI及びHindIIIにより制限処理された12μｇのpBR32
2−Trp3と、同様に制限処理された1.34μｇのpBW20とを
連結した。次にこの連結混合物をBamHIにり消化し、pBR
322−Trp3からの、HindIII/PstIによる望ましくないベ
クターフラグメントを含むすべての連結生成物を線状に
する。この連結混合物を用いて、E.coli MM294を形質転
換し、そして500μｇのトリプトファンにより事前に分
散された50μg/mlのアンピシリンを含むＬ−Brothプレ
ート上で所望のコロニーを選択した。正しい構成物を配
列決定法によって確めた。

I.2.a.1 pBR322−Trp3の調製アテニュエーター領域を欠く、Trpプロモーター／オ
ペレーター／リボソーム結合部位の配列を、スタンフォ
ード大学のC.Yanofskyから得られたpVH153から得た。Tr
p配列は、当業界において既知の種々のプラスミドに利
用できる。Klenowにより平滑末端化されたpVH153を、Hh
aI（露出された３′付着末端を残して、Trpプロモータ
ーのちょうど５′を切る）により処理して、そしてTaqI
により部分的に消化した。TaqI部位での制限に対応する
99bpのフラグメント、すなわち、TrpリーダーのATG開始
コドンに先行する６ヌクレオチドを単離し、そして次に
EcoRI（修復）/Cla±により消化されたpBR322に連結
し、pBR322−Trp3を得た。前述のTaqI部位は５′の半分
のClaI部位をコードし、従って３′の半分のClaI部位
（pBR322からの）への連結は機能的なClaI部位を再生成
するであろう。さらに、pBR322のCla部位からすぐ下流
のHindIII部位は、EcoRI/HindIIIカセットとして所望の
Trpフラグメントの切り出しを可能にする。pBR322−Trp
3をpTRP3としてATCCに寄託し、そして寄託番号39946を
得た。

I.2.a.2 pBW20の構成法 pBW20は、pBR322からのHindIII/PvuIIベクターフラグ
メント中にクローン化された、合成ATG−含有ドデカマ
ーを含む。そのドデカマー、すなわちTATGAGCTCATAは、
SatI（又はSacI）部位を含む。

pBR322をHindIIIにより消化し、Klenow及び４種のdNT
Pにより修復し、そして次にPvuIIにより消化した。ベク
ターフラグメントを自己相補性ドデカマーと連結し、E.
coli MM294中に形質転換し、そして、正しい構成体を、
プラスミドの単離及び配列決定によって確めた。

I.3 pRTB704の構成法 pRTB704はpRTB514に類似する。但しそのコード配列が
P_L−N_RBSの制御下にある点で異なる。構成法はpRTB514
についてのI.2項において示された構成法と同一であ
る。但しpDG141ではなくpFC5が、プロモーター／オペレ
ーター及びリボソーム結合部位をコードする配列をもた
らす、HindIIIにより消化されたプラスミドの源として
用いられる。pRTB704を1984年９月14日ATCCに寄託し、
そして寄託番号39865を得た。

一方、pFC5ではなくｐP_L322又はｐP_LKanもまた、用い
ることができる。これらのプロモーターを提供するプラ
スミドの構成法は、次のように記載される。

これらのおのおののプラスミドのために、P_Lλファー
ジプロモーター及びＮ−遺伝子（N_RBS）のためのリボソ
ーム結合部位を含むDNA配列を、Shinatake及びRosenber
g、Nature（1981）292:128によって記載されたpKC30の
誘導体から得る。pKC30は、pBR322からのHindIII/BamHI
ベクターフラグメント中にクローン化されたλファージ
からの2.34kbフラグメントを含む。P_Lプロモーター及び
N_RBSは、pKC30中BglII及びHpaI部位の間セグメントを占
める。pKC30の誘導体はEcoRI部位へ転換されたBglII部
位を有する。

P_Lプロモーターにすぐ先行するBglII部位を次のよう
にしてEcoRI部位に転換する。すなわち、pKC30をBglII
により消化し、Klenow及びdNTPにより修復しそしてT4リ
ガーゼによりEcoRIリンカー（New England Biolabsから
入手できる）へ連結し、そしてE.coli K12菌株MM294λ
^＋中に形質転換した。プラスミドをAmp^RTet^S形質転換体
から単離し、そして所望の配列を制限分析及び配列決定
によって確めた。得られるプラスミド、すなわちpFC3
を、PvuI及びHpaIにより二重消化し、所望の配列を構成
するおよそ540bpフラグメントを得た。このフラグメン
トをHinfIにより部分的に消化し、そして424bpフラグメ
ントを単離し、そしてKlenow及びdATP、次にS1ヌクレア
ーゼにより処理し、３′末端配列−AGGAGAA（この−AGG
AGA部分はN_RBSである）を有する平滑末端フラグメント
を生成した。このフラグメントをEcoRIにより制限処理
し、５′−EcoRI（付着）末端及びHinfI（一部修復のS1
平滑）−３′末端を有する347個の塩基対のDNAフラグメ
ントを得た。

I.3.a pFC5の調製法 1984年１月13日に寄託されたATCC番号39578のｐβＩ
−Z15を、ATG＋lacZに融合した140bpのβ−IFNを含む配
列をpBR322中に融合することによって調製した。ｐβＩ
−Z15においては、pBR322のEcoRI部位を保持し、そして
挿入部はβ−IFNのATG開始コドンにすぐ先行するHindII
I部位を含む。ｐβＩ−Z15をHindIIIにより制限処理
し、Klenow及びdNTPにより修復し、そして次にEcoRIに
より消化した。得られるEcoRI/HindIII（修復された）
ベクターフラグメントと、上のEcoRI/HinfI（修復され
た）フラグメントとを連結し、そしてこの連結混合物を
用いてMC1000−39531を形質転換せしめた。好結果をも
たらす構成体を含む形質転換を、ラクトーズ最小プレー
ト上で30℃ではなく34℃で増殖する能力によって固定し
た。（形質転換体を30℃及び34℃でＸ−gal−Ampプレー
ト並びに30℃及び34℃で最小ラクトーズプレート上に置
いた。適切な構成体を有する形質転換体は、両方の温度
でＸ−gal−Ampプレート上で青色を示すが、しかし最小
ラクトーズプート上では34℃でのみ増殖した。）この好
結果をもたらす構成体をpFCと名づけた。このpFCを1984
年９月14日ATCCに寄託し、そして継続番号39864を得
た。

I.3.b ｐP_L322の調製法一方において、pBR322をまた、所望のEcoRI/HindIII
P_L−N_RBSカセットを担持するクローニングベクターとし
て使用することができる。pBR322をHindIIIにより消化
し、Klenow及びdNTPにより修復し、そして次にEcoRIに
よりさらに消化した。次に、ベクターフラグメントと上
で調製したEcoRI/HinfI（修得）フラグメントとを連結
し、そしてこの連結混合物をMC1000−39531中に形質転
換せしめた。良好な結果をもたらす形質転換体を、Amp^R
Tet^Sコロニィーとして同定した。プラスミドを良好な結
果の形質転換体から単離し、そして良好な結果をもたら
す連結体を配列決定することによって確かめ、そしてｐ
P_L322と名づけた。

I.3.c ｐP_LKanの調製法カセットを得るために使用された３番目の宿主プラス
ミドベクターはpDG144であり、1984年１月13日に寄託さ
れ、ATCC番号39579を得た。pDG144は他の出願に広範囲
に記載され、そしてこの発明の一部ではない。それは、
無傷のAmp^R遺伝子、及びカナマイシン（Kan^R）耐性を付
与することができるタンパク質のためのコード配列を含
む変形されたpBR322である。Kan^Rコード配列に先行して
合成ポリリンカーが存在する。pDG144はコード配列に先
行するプロモーター及びリボソーム結合部位のいずれも
含まないので、Kan^Rは発現されず、そしてpDG144を含む
細胞は、カナマイシンに対して及び構造的に類似する抗
生物質に対して感受性である。カナマイシン遺伝子のた
めのATG開始コドンにすぐ先行するポリリンカー配列
を、EcoRI及びHindIIIにより消化することによって取り
除き、そしてP_LN_RBSを挿入することができる。

従って、pDG144をHindIIIにより消化し、Klenow及びd
NTPにより平滑末端にし、そして次にEcoRIにより消化し
た。ベクターフラグメントと上で調製したEcoRI/HinfI
（修復された）フラグメントとを連結し、そしてMC1000
−39531中に形質転換せしめた。Amp^RKan^Rコロニィーを
選択し、プラスミドを単離し、そして正しい配列の構成
体を制限分析及び配列決定によって確かめた。正しい配
列を含む１つのプラスミドをｐP_LKanと名づけた。

I.4 pRTB907の構成法 pRTB907はpRTB704に類似する。但しそのプラスミドベ
クターは、温度感受性の高いコピー数プラスミドであ
る。pRTB907は、pRTB704からEcoRI/SalIによる消化物と
して制御配列及びコード配列を切り出し、HhaIによりpR
TB704のベクター部分を切断し、そしてこのセグメント
を下に記載されている、EcoRI/SalIにより消化されたpC
S3中に連結することによって誘導される。次に、この連
結混合物を用いてMC1000−39531を形質転換し、そして
形質転換体をAmp^Rによって選択した。所望のプラスミド
の正しい構成体を制御分析によって確認した。

I.4.a 高い複写機プラスミド、pCS3−Ａの構成法 pCS3は、前述のすべてのdT発現ベクターのために、高
いコピー数を保証する複製起源を提供する。この構成法
は、1983年12月12日に出願されたヨーロッパ出願番号第
0096586中に広範囲に記載されている。このプラスミド
を1982年６月３日ACTTに寄託し、そして、ATCC番号第39
142を得た。

pCS3は、pEW27及びpOP9に由来する。pEW27は、E.M.Wo
ng,Proc.Natl.Acad.Sci．（USA）（1982）79:3570によ
って記載されている。それは、コピー数の温度調節をも
たらす突然変異を、その複製起源近くに含む。これらの
突然変異の結果として、複製が高温において高いコピー
数で起こるが、但し低温では低いコピー数で起こる。

pOP9は、ColEIタイプのプラスミドpOPからのEcoRI/Pv
uII起点を含むフラグメントを、pBR322中に挿入するこ
とによって構成された、すべての温度で高いコピー数を
示すプラスミドである〔Gelfand,D.,など、Proc.Natl.A
cad.Sci.(USA)（1978）75:5869〕。挿入前に、このフラ
グメントを次のようにして変形した、すなわち、50μｇ
のpOP6を、20ユニットずつのBamHI及びSatIにより完全
に消化した。SstIの３′突出末端及び“フィルイン”側
のBamHIの５′末端を除去するために、消化されたpOP6D
NAを、E.コリDNAポリマラーゼＩ（Klenow）により、２
つの段階の反応（まず、20℃でSstIの３′突出末端の除
去のために、そして次に９℃で５′末端を修復のため
に）において処理した。平滑末端のフラグメントを消化
し、そしてその0.02ピコモルを用いて、コンピテントDG
75を形質転換せしめた〔Ｏ′Farrell,P.,など、J.Bacte
riologg（1978）134:645〜654〕。形質転換体を、50μg
/mlのアンピシリンを含むＬ−プレート上で選択し、そ
して3.3kbの欠失、SstI部位の損失、及び新しく形成さ
れたBamHI部位の存在についてスクリーンした。

pOP7と名付けられた１つの候補体を選択し、そして20
ユニットのBamHIにより25μｇのpOP7を消化し、E.coli
のDNAポリマラーゼＩフラグメント（Klenow）により修
復し、そしてT4DNAリガーゼにより再連結することによ
ってBamHI部位を削除した。コンピテントDG75を、0.1μ
ｇの前記DNAにより処理し、そして形質転換体を、50μg
/mlのアンピシリンを含むＬ−プレート上で選択した。
候補体を、BamHI制限部位の消失についてスクリーンし
た。pOP8を選択した。pOP9を得るために、pBR322からの
AvaI（修復された）/EcoRI Tet^Rフラグメントを調製
し、そして単離し、そしてpOP8からの、PvuII（一部
の）/EcoRIによる3560bpの単離されたフラグメントに連
結した。

1.42kbのEcoRI/AvaI（修復）Tet^R（フラグメントＡ）
と3.56kbのEcoRI/PvuII Amp^R（フラグメントＢ）との連
結は、EcoRI末端の分子間連結を助けるために２つの段
階の反応において、0.5μｇのフラグメントＢと4.5μｇ
のフラグメントＡとを使用した。

コンピテントDG75を、連結混合物５μｌにより形質転
換せしめ、そして形質転換体をアンピシリン（50μg/m
l）含有のプレート上で選択した。Amp^RTet^R形質転換か
ら単離されたpOP9は、高いコピー数、コリシン耐性、Ec
oRI、BamHI、PvuII、及びHindIIIのための単一の制限部
位、HindIIのための２つの制限部位を、適切なサイズ及
びHaeIII消化パターンを示した。

pCS3を得るために、pEW27 DNA50μｇをPvuII及び次に
EcoRIにより完全に消化した。同様に、50μｇのpOP9をP
vuII及びEcoRIにより完全に消化し、そして3.3kbのフラ
グメントを単離した。

pEW27フラグメント0.36μｇ（0.327ピコモル）とpOP9
フラグメント0.35μｇ（0.16ピコモル）とを連結し、そ
してそれを用いてE.coli MM294を形質転換せしめた。Am
p^RTet^R形質転換体を選択した。好結果のコロニーを、最
初に30℃及び41℃でβ−ラクタマーゼアッセイプレート
上で、そして次に、30℃及び41℃での増殖の後のプラス
ミドDNAレベルについてスクリーニングした。pCS3と称
する好結果をもたらす候補体を、配列決定することによ
って確認した。

J.リシンＢの製造プラスミド、すなわちpRTB704及びpRTB907のいずれか
により形質転換されたE.coli MC1000−39531を、30℃
で、アンピリシン100μg/mlを含むTYE培地（バクトトリ
プトン15g/l、酵母抽出物10g/l、及び1mMのCaCl₂により
補填されたNaCl5g/l）中において増殖せしめた。対数増
殖期にある間、温度を42℃に高め、そして1.5時間後、
細胞を遠心分離し、そしてSDSにより抽出した。この抽
出物を、上に記載したようにしてウエスターン法によっ
て検定した。結果を第８図に示し、そして類似するpRTB
514（trpプロモーターを用いる）によりそして前駆体プ
ラスミド及び制御プラスミドにより得られた結果と対照
した。描写されたレーンは、次のとおりである：すなわ
ち、レーン１は、“天然”のリシンＢであり、レーン２
〜９は、それぞれpUC8、pRTB5、pRTB151、pRTB221（変
形されたpRTB151）、pRTB236、pRTB514、pRTB704、及び
pRTB907による形質転換体の抽出物である。

下に挙げられたものを、Rockville,MD,USAのアメリカ
ンタイプカルチャーコレクション（ATCC）に寄託した。
この寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に
関するブタペスト条約及びそれに基ずく規則（ブタペス
ト条約）に基いて行なわれた。生存している培養菌の保
存は、寄託の日から30年間保証される。微生物はブタペ
スト条約のもとで、そして適切なアメリカ特許の発行後
には無制限の入手可能性を保証する出願人とATCCの間の
契約に基いて、寄託された菌株はATCCにより入手可能に
されるであろう。特許法に従っていずれかの政府の権威
下で与えられた権利に反してこの発明を実施する許諾で
あると解釈してはならない。

【図面の簡単な説明】

第１図は単鎖オリゴヌクレオチドのタンデムブリッヂを
用いて、単離されたcDNAのコード配列を完結するための
略図的表示法である。第２図はFunatsu（前記）によって開示され、そして抽
出されたタンパク質から得られたリシンＢのタンパク質
配列を示す。第３図はリシンＢ鎖の一部のコード配列に対応するプラ
スミドpRTB5のcDNA挿入部のヌクレオチド配列及びそれ
から推定されるアミノ酸配列を示す。また、Funatsuに
よって抽出されたタンパク質から決定されるリシンＢの
配列を比較のために示す。第4a図及び第4b図はRCAのＢ部分の配列の大部分をコー
ドするプラスミドpRTB4のcDNA挿入部と前述のcDNA挿入
部の塩基（4a）配列及びタンパク質（4b）配列との比較
を示す。またpRTB5配列の一部をオーバラップするpRTA1
15の配列が示される。第5a図はpRTB5に由来するリシンＢのコード配列を完結
するために使用される合成オリゴヌクレオチドの配列を
示す。第5b図はβ−ガラクトシダーゼとリシンＢとの融合を示
すpRTB236の配列決定された部分を示す。第5c図はpDG141のリボソーム結合部位とpRTB601からの
コード配列との間の結合を含むpRTB514の配列決定され
た部分を示す。第６図はpRTB601の構成を略図的に示す。第７図はpRTB514、pRTB701、及びpRTB907の構成を示
す。第８図はリシンＢと比較して、この発明のプラスミドに
より形質転換されたE.coli MM294からの抽出物のウエス
ターンブロットを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献特開昭60−102188（ＪＰ，Ａ) 特開昭61−108388（ＪＰ，Ａ) Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．, Ｖｏｌ．43，Ｎｏ．10（1979）Ｐ．2221 −2224

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】以下のヌクレオチド配列を有するリシンＢ
をコードするDNA配列：
【請求項２】組換宿主細胞に適合する制御配列に作用可
能的に結合される以下のヌクレオチド配列を有するリシ
ンＢをコードする配列を有するDNA配列を含む発現ベク
ター：
【請求項３】前記制御配列がプラスミドpDG141由来であ
る、請求項２に記載の発現ベクター。
【請求項４】前記制御配列がプラスミドpTRP3由来であ
る、請求項２に記載の発現ベクター。
【請求項５】前記ベクターがpRTB704である、請求項２
に記載の発現ベクター。
【請求項６】前記ベクターが高コピー数プラスミドpRTB
907である、請求項２に記載の発現ベクター。
【請求項７】組換体宿主細胞に適合する制御配列に作用
可能的に連結される以下のヌクレオチド配列を有するリ
シンＢをコードする配列を有するDNA配列を含む発現ベ
クターにより形質転換された大腸菌（E.coli）または酵
母（Saccharomyces cerevisiea）