KR870000701B1 - 인체 성장 호르몬의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

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Description

인체 성장 호르몬의 제조방법
제1도는 개시 시그널 ATG 및 링커(linker)와 함께 인체 성장 호르몬의 처음 24개 아미노산을 코드화하는 유전자 단편을 작제하는 방법의 개략도.
제2도는 제1도의 유전자 단편을 형성하는“U” 및“L”올리고뉴클레오타이드의 결합체(joinder)와 이를 플라스미드 클로닝 비히클내에 삽입시키는 방법을 나타내는 도.
제3도는 코드화된 인체 성장 호르몬의 아미노산에 번호를 매기고 뇌하수체 mRNA 전사물의 Hae Ⅲ 제한 효소 단편의 DNA 서열(코드화 스트랜드만)을 나타낸 도.
제4도는 합성에 의해 유도되지 않은 인체 성장 호르몬의 아미노산에 대해 코드화된 유전자 단편에 대한 클로닝 비히클의 작제방법 및 mRNA로부터 역전사에 의한 cDNA 유전자 단편의 작제방법을 나타내는 도.
제5도는 제2도 및 3도의 플라스미드로 시작하여, 박테리아내에서 인체 성장 호르몬을 발현시킬 수 있는 플라스미드의 작제를 나타내는 도.
본 발명은 인체 성장 호르몬을 제조하는 신규하며 개선된 방법에 관한 것이다.
유전자를 구성하는 DNA(데옥시리보핵산, deoxyribonucleic acid)는 단백질-코드화 유전자 또는 구조 유전자와, RNA 폴리머라제 결합부위의 제공에 의한 정보, 리보좀 결합부위에 대한 정보 등의 발현을 중재하는 조절영역으로 이루어진다. 코드화 단백질은 유기체내에서 다음과 같은 다단계 과정에 의해 이의 상응하는 DNA로부터 발현된다 :
1. 효소 RNA 폴리머라제를 조절영역(이하에서는“프로모터(promotor)”라 칭한다)에서 활성화시키고, 코드화된 정보를 전사시키는 구조 유전자와 함께 하나 이상의“정지”코돈에서 전사가 종결될 때까지 메신져(messenger) 리보핵산(mRNA)에 이입시킨다.
2. mRNA 메시지(message)를 리보좀에서, 대부분 통상적으로 ATG(이는 “f-메티오닌”으로 해독된다)인 해독“개시”시그날에서 시작하여, 단백질(이 단백질의 아미노산 서열에 대해 유전자는 코드화된다)로 해독시킨다.
유전자 코드에 따라, DNA는 각기 아데노신, 티미딘, 시티딘 및 구아닌 또는 본 명세서에서 사용된 것으로서 A, T, C 및 G로부터 선택된 세개의 인접한 뉴클레오타이드로 이루어진 코돈 또는 3원체(triplet)에 의해 각각의 아미노산을 지정한다. 이들은 2본쇄(“duplex”) DNA의 코드화 스트랜드(coding strand) 또는 코드화 서열에서 나타나는데, 이들의 나머지 또는 상보적(complementary) 스트랜드는 코드화 스트랜드중의 이들의 상보체에 수소결합되어 있는 뉴클레오타이드(“염기”)로 이루어져 있다. A는 T와 상보적이며 C는 G와 상보적이다. 이와 같은 본 발명의 배경과 관련되는 이러한 내용 및 다른 내용에 관해 하기 참조문헌에 상세히 기술하였으며 이들은 본원에 참고로 인용되었다[참조 : Benjamin Lewin, Gene Expression 1,2(1974) 및 3(1977), John Wiley and Sons, N.Y.]
DNA 재조합에는 여러가지 기술들이 이용되고 있으며, 이러한 기술에 따라 개개의 DNA 단편들의 인접말단을 한가지 방법이나 또다른 방법으로 말단부가하여 연결(ligation)을 용이하게 해준다. 연결이란 용어는, 가장 통상적으로는 효소 T4DNA 리가아제(ligase)의 작용에 의해 인접 뉴클레오타이드들 사이에서 포스포디에스테르 결합을 형성시키는 것을 의미한다. 따라서, 평활말단(blunt end)은 직접 연결될 수 있다. 또한, 이들의 인접말단에 상보적 1본쇄를 함유하는 단편은 후속 연결반응을 위한 개개말단에 수소결합이 존재하므로 유리하다. 접착말단(cohesive termini)으로 불리는 이러한 1본쇄는 말단전이효소(terminal transferase)를 사용하여 평활말단에 뉴클레오타이드를 부가함으로써 형성시킬 수 있으며, 때때로 평활말단중 한개의 스트랜드를 λ-액소뉴클레아제와 같은 효소를 사용하여 역으로 절단하여 간단히 형성시킬 수도 있다. 또한, 가장 빈번하게는, 약 4 내지 6개의 염기쌍 길이를 갖는 뉴클레오타이드의 특정 서열(제한 부위)에서 포스포디에스테르 결합을 절단하는 제한 엔도뉴클레아제(이하에서는“제한효소”라 칭한다)를 사용할 수도 있다. 여러 종류의 제한효소 및 그들의 인식부위가 알려져 있다.[참조 : R.J.Roberts, CRC Critical Reviews in Biochemis try, 123(Nov. 1976)]. 다수의 이러한 제한효소는 엇갈린 절단부(staggered cut)를 만들어 2본쇄 단편들의 말단에 짧은 상보적 1본쇄 서열을 생성시킨다. 돌출말단 또는 “접착”말단은 상보적 서열로 염기쌍을 형성시킴으로써 재조합시킬 수 있다. 두개의 상이한 분자가 이 효소로 절단되는 경우에는, 상보적 1본쇄들의 교차된 염기쌍이 형성되어 새로운 DNA 분자가 생성되며, 이는 리가아제를 사용하여 아닐링(annealing) 지점에 남아있는 1본쇄의 틈을 메꾸어 줌으로써 공유합체(covalent integrity)를 수득할 수 있다. 또한, 절단된 2본쇄 DNA 상에 공말단(coterminal) 또는 평활말단을 남기는 제한 효소는, 예를들어 T4리가아제를 사용하여, 다른 평활말단을 갖는 서열과 재조합 시킬 수 있다.
본 발명에 있어서,“클로닝 비히클(cloning vehicle)”은 비히클이 형질전환 방법에 의해 단세포 유기체(“microbe”)내에 이입되었을 경우에 복제될 수 있도록 완전 레플리콘(intact replicon)을 함유하는 2본쇄 DNA의 비염색체성 부분이다. 이렇게 형질전환된 유기체는“형질 전환체(transformant)”라 한다. 최근에, 통상적으로 사용되는 클로닝 비히클은 바이러스 및 박테리아로부터 유도되며, 가장 통상적으로는“플라스미드”라 불리우는 박테리아 DNA의 루프(loop)가 사용된다.
최근 수년동안 생화학 분야의 발전으로, 예를들면 플라스미드가 외래성 DNA를 함유하도록 제조된“재조합”클로닝 비히클을 작제하게 되었다. 특별한 경우에 재조합체는“이종(heterologous)”DNA를 포함할 수 있으며, 이종 DNA는 재조합 비히클에 의해 형질전환될 수 있는 유기체에 의해서 통상적으로 생성되지 않는 폴리펩타이드에 대해 코드화된 DNA를 의미한다. 따라서, 플라스미드를 제한 효소로 절단하여 연결가능한 말단을 갖는 선형 DNA를 수득한다. 이들을 연결가능한 말단을 갖는 외래성 유전자에 결합시켜, 완전 레플리콘, 및 형질전환체를 선별하는데 유용한 표현형적 특성을 갖는 생물학적으로 작용성있는 부위를 얻는다. 외래성 유전자의 카피(copy)를 함유하는 거대 개체군을 수득할 목적으로, 특별한 경우에 유전자가 코드화된 단백질을 발현시키고자 하는 또다른 목적으로, 이 재조합부위를 형질전환 방법에 의해 미생물에 이입시키고 형질전환체를 분리하여 클로운화시킨다. 이와 관련된 기술공학 및 이의 응용분야는 문헌에 상세히 기술되어 있다[참조 : Miles International Symposium Series 10 : Recombinant Mole-cules : Impact on Science and Society, Beers and Bosseff, eds., Raven Press, N.Y.(1977)].
클로닝 비히클을 사용하여 복제에 의한 유전자의 공급을 증가시키는 것 외에도, 유전자가 코드화된 단백질을 실질적으로 발현시키려는 시도가 이루어졌고, 이중 몇가지는 성공적이었다. 이러한 예의 첫번째로 lac 프로모터(lac promoter)의 영향하에서 뇌 호르몬 소마토스태틴에 대한 유전자를 이. 콜라이 박테리아 내에서 발현시키게 되었다[참조 : K. Itakura 등의 Science 198, 1056(1977)]. 더욱 최근에는, 인체 인슐린의 A 및 B쇄를 동일한 방법으로 발현시키고 조합하여 호르몬을 생성시키게 되었다[참조 : D.V.Goeddel et al., Proc. Nat′l. Acad. Sci., USA 76, 106 (1979)]. 각 경우에 있어서, 유전자는 그의 전부를 합성법에 의해 제조하였다. 각 경우에, 세포내의 단백질분해 효소는 목적 생성물을 분해시키므로, 목적 생성물은 복합된 형태로, 즉 그를 구획화하여 보호하고 세포외에서 절단되어 의도하는 생성물을 제공할 수 있는 다른 단백질과의 종렬형(tandem)으로 제조하지 않을 수 없다. 이러한 조작은 본건 출원인의 다음과 같은 영국 특허 명세서에 기술되어 있다[참조 : 영국 특허 제2007675A호, 제20076 70A호, 제2007676A호 및 제2008123A호].
합성 유전자 연구가 여태까지 논의된 여러 경우 유용한 것으로 입증되었지만, 실제로 어려운 점은 그의 유전자가 상당히 더 복잡하고 용이하게 합성할 수 없는, 성장 호르몬, 인터페론 등의 훨씬 거대한 단백질 생성물의 경우에 야기된다. 동시에, 복합 단백질이 수반되지 않는 그러한 생성물을 발현시키는 것이 바람직하며, 이의 발현에는 목적 생성물의 작제에 보다 적합하도록 유기체내의 자원을 전환시키는 것이 필요하다.
다른 연구자들에 의해, 조직으로부터 정제된 상응하는 메신져 RNA로부터 유기 합성에 의해서가 아니라 오히려 역 전사에 의해 유도권 유전자를 발현시키고자 하는 시도가 이루어졌다. 이 연구 방법에는 2가지 문제점이 수반된다. 우선, 역전사 효소는 목적하는 전(全) 아미노산 서열에 대한 cDNA를 완성시키기 전에 mRNA로 부터의 전사를 정지시킬 수 있다. 즉, 예를들어 빌라-코마로프 등(Villa-Komaroff et al.)은 인슐린 전구체의 처음 세개의 아미노산에 대한 코돈이 부족한 래트의 프로인슐린에 대한 cDNA를 수득하였다[참조 : Proc. Nat′l. Acad. Sci., USA 75 3727(1978)]. 또한, 전구체 형태로 발현되는 폴리펩티드에 대한 mRNA의 역 전사로, 진핵세포내에서 리더 서열(leader sequence)을 효소적으로 제거하는 경우에 수득되는 생물활성 단백질이 아닌 전구체 형태에 대한 cDNA가 수득된다. 따라서, 박테리아 세포는 이러한 능력을 갖고 있지 않는 것으로 알려져 있으므로, mRNA 전사물은 생성활성 단백질 그 자체가 아닌, 전구체 형태의 리더서열을 함유하는 발현 생성물을 생성한다[참조 : 상기의 Villa -Komaroff 등에 의한 문헌(래트의 프로인슐린) 및 P.H. Seeburg et al., Nature 276, 795(1978)(래트의 전성장호르몬)].
최종적으로, mRNA 전사물로부터 박테리아에 의해 인체 호르몬(또는 이의 전구체)을 발현시키고자 하는 종래의 시도에 의해서는, 때때로 세포 외적으로 절단할 수 없는 복합 단백질만이 제조되었다[참조 : Villa-Komaroff 등의 상기 문헌(penicillinase -proinsulin) ; Seeburg 등의 상기 문헌(beta-lactamase-pregrowth hormone)].
인체 성장 호르몬(“HGH”)은 인체의 뇌하수체에서 분비된다. 이 호르몬은 191개의 아미노산으로 이루어져 있으며 그의 분자량은 약 21,500으로 인슐린보다 3배 이상 크다. 본 발명이 이루어지기 전까지, 인체 성장호르몬은 제한된 공급원인 해부용 사체의 뇌하수체로부터 실험적으로 추출하는 방법에 의해서만 얻을 수 있었다. 따라서, 이 물질의 부족으로 인하여 이의 사용은 뇌하수체 기능저하성 왜소증의 치료에만 한정되었고, 믿을만한 조사에 의하면, 인체에서 유도된 HGH는 치료대상자의 약 50% 이하에게 제공될 정도의 양만을 이용할 수 있다.
요약하면, HGH 및 그외의 플리펩타이드 생성물을 다량 제조하는 신규의 방법이 요구되어 왔으며, 이러한 필요성은, 너무 거대하여 유기합성법으로 취급하기 어렵거나 완전 합성 유전자로부터 미생물적 발현이 어려운 폴리펩타이드의 경우에 특히 절실한 것이었다. mRNA 전사물로부터 포유동물 호르몬을 발현시키는 데는 합성에 부수적으로 수반되는 몇가지 난점들이 있지만, 현재까지는 목적하는 호르몬이 이로부터 실질적으로 절단될 수 없는 생체-불활성 복합체의 미생물학적 생성만이 가능하였다.
본 발명은 힘드는 완전합성법에 의하지 않고 역전사에 의해 코드화 서열의 상당 부분, 바람직하게는 대부분을 공제하는 한편, 코드화 서열의 나머지 부분은 합성하여 생체-불활성화 리더 서열이나 다른 외래성 단백질이 수반되지 않는 목적 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있는 완전 유전자를 제공하는, 유사-합성 유전자 발현 방법 및 수단을 제공한다. 한편, 합성적 잔여부분은 외래성 단백질을 세포-외 절단하여 생물 활성형이 수득될 수 있도록 처리된 단백질 분해-내성 복합체를 생성시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 현재까지 조직으로부터 경비가 비싼 추출법에 의해 단지 한정된 양으로만 생산되어온 여러가지 물질 및 이전에 공업적으로 제조할 수 없었던 다른 물질들을 미생물적으로 제조하는 유용한 방법 및 수단을 제공한다. 가장 바람직한 태양에 있어서, 본 발명은 세포내에서의 단백질 분해를 방지하고 세포외에서 절단하는 동안 외래성 단백질내에서 생물활성형을 구획화해야 하는 필요성을 피하면서, 의학적으로 중요한 폴리펩타이드 호르몬(인체 성장 호르몬)을 세균학적으로 발현시키는 첫번째 경우를 나타낸다. 본 발명에 의해 유용하게 제조된 인체 성장 호르몬의 미생물 공급원은 처음으로, 확산성 위출혈, 가관절중, 화상치료, 창상치유, 발육이상 및 골절유착을 포함한, 조직에서 유도된 호르몬 공급원의 용량을 초과하는 지금까지의 다른 용도와 함께 뇌하수체 기능 저하성 왜소증의 치료용 호르몬의 충분한 양을 제공한다.
본 발명의 상기와 같은 목적 및 그외의 목적과 잇점을 얻을 수 있는 방법을 하기에서 기술하는 상세한 설명 및 본 발명의 바람직한 태양에 관한 첨부된 도면으로부터 보다 상세히 알 수 있을 것이며, 이 도면들을 상세히 설명하면 하기와 같다 :
제1도는 클로닝(cloning)에 사용된 링커(linker) 및 개시 시그날 ATG와 함께, 인체 성장호르몬의 처음 24개 아미노산을 코드화하는 유전자 단편을 작제하는 합성방법의 개략도이다. 이 도면에서 코드화 스트랜드 또는 상부 스트랜드(“U”)및 상보적 스트랜드 또는 하부 스트랜드(“L”)에 표시된 화살표는 도시된 단편을 형성시키기 위해 결합된 올리고뉴클레오타이드를 나타낸다.
제2도는 제1도의 유전자 단편을 형성하는“U”및“L”올리고뉴클레오타이드의 결합체(joinder)와 이를 플라스미드 클로닝 비히클 내에 삽입시키는 방법을 도시한 도면이다.
제3도는 코드화한 인체 성장 호르몬의 아미노산에 번호를 매기고, 뇌하수체 mRNA 전사물의 Hae Ⅲ 제한 효소 단편의 DNA서열(코드화스트랜드만)을 도시한 도면이다. 비해독 mRNA에 대한 DNA(“정지”다음에 위치한)에서와 같이 주 제한부위 (Key restriction site)를 나타내었다.
제4도는 합성에 의해 유도되지 않은 인체 성장 호르몬의 아미노산에 대해 코드화된 유전자 단편에 대한 클로닝 비히클의 작제방법 및 인체의 뇌하수체 공급원으로부터 분리된 mRNA로부터의 역전사에 의해 상보적 DNA로서의 유전자단편의 작제방법을 나타낸 것이다.
제5도는 제2도 및 제3도의 플라스미드로 시작하여 박테리아내에서 인체 성장 호르몬을 발현시킬 수 있는 플라스미드의 제작하는 방법을 설명하는 것이다.
본 발명의 일반적인 방법에는 조합시 목적 생성물을 발현시키기 위하여 코드화한 다수의 유전자 단편들을 단일 클로닝 비히클내에 조합시키는 방법이 포함된다. 다수의 유전자 단편중 적어도 하나는, 에이. 울리히 등의 문헌[참조 : A. Ullrich et al., Science 196, 1313(1977)]에 기술된 방법과 같이 조직으로부터 분리된 mRNA로부터 역전사에 의해 유도된 cDNA 단편이다. 이 cDNA는 목적 생성물에 대한 코돈의 상당 부분, 바람직하게는 적어도 대부분을 제공하는 한편, 유전자의 나머지 부분은 합성에 의해 보충된다. 합성단편 및 mRNA 전사 단편들은 별도로 클론화되어 다음의 조합단계에서 사용하기에 충분한 양을 제공한다.
여러가지 사항이 합성 물질과 cDNA 사이에서 최종생성물, 더욱 특히 맥샘 및 길버트의 방법[Maxam and Gilbert, Proc. Nat′l Acad. Sci. USA 74, 560(1977)]에 의해 측정된 상보적 DNA의 DNA 서열에 대한 코돈의 분포에 영향을 미친다. 역 전사에 의해 수득된 상보적 DNA는 목적 생성물의 적어도 하나의 카복시 말단부위(term inal portion)에 대한 코돈 및 카복시 말단에 인접한 해독 정지시그날의 하부에 위치한 비해독 mRNA에 대한 다른 코돈들을 일정하게 함유한다. 비해독 RNA에 대한 DNA의 존재는, 비록 그러한 종류의 과도하게 긴 서열을 제한 효소 절단에 의해 제거하여 목적 생성물에 대한 DNA를 복제 및 발현시키는데 사용되는 세포정 자원을 보존시킬 수는 있지만, 크게 상관은 없다. 특별한 경우에 있어서, cDNA는 목적하는 전체 아미노산 서열에 대한 코돈 뿐만 아니라, 목적하는 생성물의 아미노 말단으로부터 상부에 위치한 외래성 코돈들을 함유한다. 예를들어, 모두는 아니더라도 대부분의 폴리펩타이드 호르몬은, 예를들어 세포막에 대한 수송에 관여하는 단백질의 리더 서열 또는 시그날 서열을 갖는 전구체 형태로 발현된다. 진핵 세포로부터의 발현시에 이들 서열은, 호르몬이 그의 유리된 생물활성 형으로 외질부에 들어가도록, 효소적으로 제거한다. 그러나, 미생물 세포가 이러한 기능을 수행하는 것으로 기대할 수 없으며, 따라서 mRNA 전사물로부터 이러한 시그날 또는 리더 서열에 대한 코드화 서열을 제거하는 것이 바람직하다. 이러한 제거과정에서는, 해독 개시 시그날도 또한 유실되며, 목적 생성물에 대한 몇몇 코돈도 또한 거의 일정하게 제거된다. 본 발명에 따르는 유사-합성 유전자 생성물의 합성 성분은 이들 후자의 코돈을 복원시킬 뿐 아니라. 하이브리드 유전자(hybrid gene)가 궁극적으로 배치될 비히클에 적절하게 위치한 개시부가 없는 경우에 해독개시 시그날을 새로이 공급한다.
전성장 호르몬(pregrowth hormone) cDNA로부터 리더 서열을 제거하는 것은 유전자의 성장 호르몬 코드화 부분내의 제한부위를 이용할 수 있으므로 유리하다. 그럼에도 불구하고, 본 발명은 mRNA로부터 유도되지 않는 유전자 성분을 대규모로 합성할 필요가 없도록, 이러한 부위의 유용성에 관계없이, 또는 여하튼 목적하는 폴리펩타이드의 아미노 말단에 충분히 까까이 있는 제한부위의 유용성에 관계없이 실시할 수 있다. 따라서, 목적 폴리펩타이드 및 리더 또는 다른 생체 불활성화 서열에 대한 코드화 DNA 서열에서 리더 또는 다른 생체 불활성 서열의 코돈과 성숙 폴리펩타이드의 코돈들 사이의 경계는 성숙 폴리펩타이드의 아미노산 서열에서 나타난다. 한가지 방법으로 간단히 분해시킴으로써 원치않는 리더 서열 또는 다른 서열을 제거하여 선택된 펩타이드를 코드화한 유전자를 수득할 수 있다. 즉, 예를들어 하기와 같은 cDNA(여기에서 분해 종말점은 화살표로 표시된다)을 제공하고, 상부 서열“a” 및“ b”가 제거되도록 엑소뉴클레아제 분해의 반응 조건을 선택한 후, Sl 뉴클레아제 분해에 의해 자동적으로 하부 서열“c” 및“d”를 제거한다 :
Figure kpo00001
한편, 보다 정확하게 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트(“d(A,T,C,G) TP”)의 존재하에서 DNA 폴리머라제 분해법을 사용할 수도 있다. 즉, 상기한 예에서 dGTP의 존재하에서 DNA 폴리머라제는 서열“c”를 제거(“G”에서 정지)하고, 그 다음에 Sl 뉴클레아제가 서열“a”를 분해시키고 ; dTTP 존재하에 DNA 폴리머라제는 서열“d”를 제거(“T”에서 정지)한 다음 Sl 뉴클레아제가“b”를 절단한다[참조예 : A. Kornberg, DNA Synthesis, pp. 87∼88, W.H. Freeman and Co., San Francisco (1974)].
더욱 바람직하게는, 에이. 라진 등이 문헌[A. Razin et al., Proc. Nat′l Acad. Sci. USA 75,4268 (1978)]에 기술한 잘못 짝 지워진 쌍의 보수 합성법(mismatch repair synthesis technique)을 적용하여 목적 생성물에 대해 코드화된 cDNA 부분내에서 편리한 지점에 제한 부위를 간단히 작제할 수 있다. 이러한 기술에 의해, 잘못 짝지워진 치환체를 함유하는 프라이머(primer)를 사용하여 존재하는 DNA 서열내에서 하나 또는 그 이상의 염기를 치환시킬 수 있다. 적어도 7개의 희귀성(palindromic) 4-염기쌍 서열이 유일하게 공지의 제한효소에 의해 인식되는데, 즉 다음과 같은 서열이다. : AGCT(Alu I), CCGG(Hpa Ⅱ), CGCG(Tha I), GATC(Sau 3A), GCGC(Hha), GGCC(Hae Ⅲ), 및 TCGA(Taq I), cDNA 서열이 단일 염기에서 그러한 부위 하나가 다른 서열을 함유하는 경우(통계적으로 빈도가 높다), 보수 합성법에 의해 적절한 치환제 염기 및 따라서 목적하는 제한부위를 함유하는 복제 cDNA를 얻는다. 절단방법에 의해 원치않는 리더에 대한 DNA를 제거한 다음, 합성법에 의해 완전 폴리펩타이드를 발현시키는 필요한 코돈을 대체시킨다. 이의 예를 들면 하기와 같다 :
Figure kpo00002
물론, 필요에 따라서는 보다 긴 제한부위를 마찬가지로 삽입시킬 수 있거나, 연속적인 보수합성법에 의해 4-염기쌍 제한부위들을 생성시킬 수도 있는데, 이 경우에 목적하는 위치에서는 그 부위에 대해 공통되는 단지 2개의 염기만이 나타난다.
목적하는 생성물의 아미노산 서열뿐만 아니라, 일정량의 특이하게 작제된 외래성 단백질을 발현시키는 것이 바람직한 적용분야가 나타날 것이다. 이러한 적용의 예로써 네가지를 들 수 있다. 첫째, 유사-합성 유전자는, 백신이 제조되도록 부가 단백질에 접합 시킴으로써 면역성이 부여되는 합텐(hapten)이나 그외의 면역학적 결정자를 나타낼 수 있다[참조 : 영국 특허 명세서 제2008123A호]. 둘째, 생체-안정성의 이유로, 생체-안정성의 이유로, 목적 생성물을 세포외 절단에 의해 활성형을 제공하도록 고안된 다른 생체-불활성 단백질과의 복합체로서 발현시키는 것이 바람직할 수 있다. 셋째, 시그널 펩타이드를 다음에 절단할 수 있기만 하다면, 목적 생성물이 세포막을 통한 배출에 의해 생성될 수 있도록 이송 시그널 폴리펩타이드를 목적 생성물의 앞에 위치시키는 방법도 있다. 마지막으로 세포외에서 특이적으로 절단할 수 있도록 고안된 외래성 복합체를 사용하여 목적 생성물을 분획화할 수 있는데, 이렇게 하지 않으면 목적 생성물은 미생물 숙주에 대한 내인성 프로테아제에 의해 분해되기 쉽다. 적어도 후자의 3가지 적용방법에 있어서는, mRNA 전사물의 코드화 서열을 완성시키는데 사용된 합성어댑터( adaptor) 분자는 추가로 효소 작용 등에 의해서 특이적으로 절단될 수 있는 아미노산 서열에 대한 코돈을 이입시킬 수 있다. 예를들면, 트립신이나 키모트립신은 arg-arg 또는 lys-lys 등에서 특이하게 절단한다[참조 : 상기 인용된 영국 특허 명세서 제2008 123A호].
상기 설명으로부터, 본 발명은 그의 가장 광범한 관점에서 여러가지로 응용할 수 있음을 알 수 있으며, 각각은 통상적으로 다음과 같은 특징을 갖는다 : 목적 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 상당한 부분에 대해서 코드화하지만, 단독으로 발현시키면 목적 생성물보다 더 작거나 더 큰 상이한 폴리펩타이드를 생성하는 mRNA 전사물을 사용하고; 목적 생성물내에 함유된 것 이외의 아미노산 서열에 대한 단백질-코드화 코돈들이 있다면 이들을 제거하며 ; 유기 합성법에 의해 목적 서열의 나머지 부분에 대해 코드화된 단편(들)을 수득하고 ; mRNA 전사물과 합성 단편(들)을 조합하여, 외래성 접합 단백질이 없는 목적 생성물 또는 접합되어 있기는 하나 외래성 단백질로부터 특이적으로 절단할 수 있는 목적 생성물을 복제 및 발현 시키기 위해 프로모터-함유 클로닝 비히클내에 배열한다.
물론, 모든 경우에 있어서 발현 생성물은 해독 개시 시그날에 의해 코드화된 아미노산(ATG의 경우에는 f-메티오닌)으로 시작된다. 이 경우에, 상기 아미노산은 세포내에서 제거되거나, 어쨌든 최종 생성물의 생체 활성은 거의 영향을 받지 않은 채로 남게 된다.
본 발명은 항체 및 효소 등을 포함한 유용한 단백질 제조시의 일반적인 적용방법을 제공하지만, 본 발명은 특히, 의학적 용도를 갖는 포유동물의 폴리펩타이드 호르몬 및 그외의 물질들, 예를들면 글루카곤, 위장관 억제 폴리펩타이드, 췌장 폴리펩타이드, 아드레노코티코트로핀, 베타-엔드르핀, 인터페론, 유로키나제, 응혈인자 및 인체 알부민 등을 발현시키는데 적절하다. 본 발명의 바람직한 태양에 대한 설명은 하기에 보다 상세히 기술하였으며, 여기에서는 인체성장 호르몬에 대해 코드화된 유사-합성 유전자를 작제하여 클로운화하고 미생물적으로 발현시키는 방법이 설명되어 있다.
인체성장 호르몬에 대한 클로닝비히클의 작제 및 발현
1. mRNA 전사물의 Hae Ⅲ 단편의 클로닝(제3도 및 제4도 참조)
뇌하수체 성장 호르몬-생성 조양으로부터 에이. 울리히 등의 방법[참조 : A. Ullrich et al. Science 196. 1313(1977)]에 의해 인체 성장 호르몬(HGH)에 대한 폴리아데닐화 mRNA를 제조하고, 이 RNA 5㎍으로부터 본질적으로 위킨스 등에 의해 문헌[Wickens et al., J, Biol chem., 253, 2483(1978)]에 기술된 바와 같이 2본쇄( “ds”) cDNA 1.5㎍을 제조하는데, 단 제2스트랜드의 합성시에 DNA 폴리머라제 I 대신 RNA 폴리머라제인“클레나우(Klenow)단편”[H. Knenow, Proc. Nat′l Aci. USA., 65, 168 (1970)]을 사용한다. HGH의 제한 패턴(pattern)은 제3도에 도시된 바와 같이, Hae III 제한부위가 3′-비코드화 영역과 HGH의 아미노산 23 및 24에 대한 코드화 서열내에 존재하도록 되어 있다. ds HGH cDNA를 Hae III로 처리하여 HG H의 아미노산 24부터 191까지에 대해 코드화된 551개의 염기쌍(“bp”)의 DNA 단편을 수득한다. 즉 cDNA 90ng을 Hae Ⅲ로 처리한 후 8% 폴리아크릴아미드겔상에서 전기 영동하여 550b.p.의 영역을 용출시켜 약 1ng의 cDNA를 수득한다.
에프. 볼리바르 등의 문헌[F. Bolivar et al., Gene, 2(1977) 95-113]에 기술된 바와 같이 제조된 PBR 322를 cDNA의 클로닝 비히클로 선택한다. PBR 322는 제이. 지. 수트클리프의 문헌[J.G Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposium, 43,70(1978)]에 상세히 설명되어 있으며, 암피실린 및 테트라사이클린 내성에 상응하는 유전자들(제4도에서, 각각“ApR” 및“TcR”)이 포함되어 있기 때문에 암피실린 및 테트라사이클린 내성을 모두 나타내고, 제4도에 도시된 바와같이 제한 효소 Pst I, Eco RI 및 Hind Ⅲ에 대한 인식부위를 함유하는 다중 복제성 플라스미드(multicopy replicating plasmid)이다.
Hae Ⅲ과 Pst I 둘다의 절단 생성물은 평활말단을 갖는다. 따라서, 창. 에이. 시. 와이 등의 GC 말단부가법[참조 : Chang. A.C.Y. et al., Nature 275 617(1978 )]을 사용하여, cDNA 상에 Hae Ⅲ 제한부위(GG↓CC)가 복구되도록 하는 방법으로 cDNA 단편을 pBR 322의 Pst I 부위에 삽입시키는 한편, 삽입물의 각 말단에 Pst I 제한부위(CTGCA↓G)를 복구시킴으로써, pBR 322의 Pst I 절단에 의한 평활말단 생성물과 mRNA 전사물의 Hae Ⅲ 분해에 의한 평활말단 생성물을 결합시킬 수 있다.
즉, 상기의 창. 에이. 시. 와이. (Chang. A.C.Y.)에 의해 기술된 바와 같이, 말단 데옥시 뉴클레오티딜 전이효소(terminal deoxynucleotidyl transferase: TdT)를 사용하여 3′-말단당 대략 20dc의 잔기를 부가한다. 마찬가지로, 60ng의 Pst I-처리된 pBR 322의 말단에 3′말단당 약 10dG의 잔기를 가한다 dc-말단부가된 ds cDNA를 130㎕의 10mM 트리스-HCl (pH 7.5), 100mM NaCl 및 0.25mM EDTA 중에서 dG-말단부가된 벡터 DNA와 아닐링시킨다. 이 혼합물을 70℃로 가열한 후, 37℃까지 서서히 냉각시키고(12시간), 다시 20℃로 냉각하여(6시간), 이. 콜라이×1776 (E. coli×1776)을 형질전환시키는데 사용한다. 맥샘과 길버트의 방법[참조 : Maxam and Gilbert, Proc. Nat′l Acad. Sci. USA 74, 560(1977)]에 의해, ×1776 내에서 클로닝된 플라스미드 pHGH 31의 DNA 서열을 분석한 결과, 제3도에 도시된 바와 같이 HGH의 아미노산 24부터 191까지에 대한 코돈이 확인되었다.
이. 콜라이 K-12 균주 ×1776은 하기와 같은 유전자형을 갖는다 : F-tonA53 dap D8 minAl supE42 △40 [gal-uvrB] λ-minB2 rfb-2 nalA25 oms-2 thy A57*metC 65 oms-1 △29 [bioH-asd] cycB2 cycAl hsdR2. 균주 ×1776은 국립보건원(the Netional Institute of Health)에 의해 EK 2 숙주 벡터계로 확인되었다.
×1776은 디아미노피멜산(DAP)을 절대적으로 필요로 하며, 뮤코다당류 콜란산을 합성할 수 없다. 그러므로, 이 균주는 세포대사 및 성장을 유지시키는데 충분한 영양소가 존재하지만, DAP는 제한된 모든 환경 조건하에서 DAP의 결핍으로 죽게 된다. 균주 ×1776은 티민 또는 티미딘을 필요로 하기 때문에, 대사활성을 유지시키는데 충분한 영양소는 존재하지만 티민과 티미딘이 존재하지 않는 환경하에서는 DNA가 분해되면서 티민 결핍으로 죽게 된다. 또한, ×1776은 담즙에 매우 민감하므로 래트의 장관을 통과하는 경우에 생존할 수 없다. 균주 ×1776은 또한 세제, 항생제, 약제 및 화학물질에 대해 매우 민감하다. 균주 ×1776은 UV-유도된 손상의 암회복(dark repair) 또는 광희복(photo repair)을 행할 수 없으며, 따라서 이 콜라이의 양생형 균주보다 햇빛에 대해 몇배 더 감수성 있는 중요한 몇가지 종류이다. 균주 ×1776은 여러 종류의 변환 파지(transducing pharge)에 저항성이 있으며 다양한 돌연변이의 발생으로 인해 여러가지 상이한 형태의 접합 플라스미드의 유전질이 부족한 접합체이다. 균주 ×1776은 또한 날리딕산, 시클로세린 및 트리메토프림에 대해 저항성이 있으며, 따라서 이들 약제를 배지에 가하여 균주를 모니터하고 형질전환시키는 동안 오염물의 형질전환을 방지할 수 있다.
균주 ×1776은, 100㎍ DAP/㎖ 및 4㎍티미딘/㎖가 보충된 L 육즙이나 페나세이육즙(penassay broth)에서 약 50분의 세대시간(generation time)으로 성장하며, 정지기에는 최종 밀도 8 내지 10×108세포/㎖에 도달한다. 다음에는 1 내지 2분간 휘젓고 앞뒤로 진탕시켜 온화하고 교반하여 100% 생존율을 유지시키면서 세포를 적절히 현탁시킨다. 균주 ×1776에 대한 그밖의 상세한 설명은 문헌[참조 : R. Curtis et al., Molecular cloning of Recombinant DNA, 99-177, Scott and Werner, eds., Acad emic Press(N.Y. 1977)]에 기술되어 있다. 균주 ×1776은 ATCC 기탁번호 제315 37호로 기탁되어 있다[기탁기관 : American Type Culture Collection, 기탁일 : 1979년 7월 3일]
2. 합성유전자 단편의 작제 및 클로닝(제1도 및 제2도 참조)
HGH 유사-합성 유전자의 제조방법에는, 단편이 mRNA 전사물에 결합되는 지점에 인접한 평할-말단 제한 절단부위를 함유하는 합성 단편을 작제하는 방법이 포함된다. 즉, 제1도에 도시된 바와 같이, HGH의 처음 24개 아미노산에 대한 합성 유전자에는 23번째 아미노산 다음에 Hae Ⅲ 절단부위가 존재한다. 이 합성 단편의 원위말단에는, mRNA 전사물과 합성 단편이 궁극적으로 결합될 플라스미드에서의 제한절단에 의해 생성되는 1본쇄 말단에 아닐링될 수 있도록 하는“링커”가 존재한다.
제1도에 도시된 바와 같이, 2본쇄 단편의 5′ 말단에는 플라스미드의 작제를 용이하게 하는, Eco RI와 Hind Ⅲ 제한 엔도뉴클레아제에 대한 1본쇄 접착 말단이 있다. 왼쪽 말단의 메티오닌 코돈은 해독개시부 위를 제공한다. 11합체 내지 16합체의 다양한 크기를 갖는 12개의 상이한 올리고 뉴클레오타이드는 하기 문헌에 기술된 개량된 포스포트리에스테르 방법에 의해 합성된다[참조 : Crea, R. Proc. Nat′l Acad. Sci. USA 75, 5765(1978)]. 이들 올리고뉴클레오타이드, U1내지 U6및 L1내지 L6는 화살표로 나타내었다.
10㎍의 U2내지 U6및 L2내지 L6를 문헌[참조 : Goeddel, D.V. et al., Proc. Nat′l Acad. Sci. USA 76, 106(1979)]에 기술된 방법에 의해 T4폴리뉴클레오타이드 키나아제 및 (γ32-p) ATP를 사용하여 포스포릴화시킨다.
3가지 별개의 T4리가아제 촉매화된 반응이 수행된다 : 10㎍의 5′-OH 단편 U1을 포스포릴화된 U2, L5및 L6와 결합시키고; 포스포릴화된 U3, U4, L3및 L4를 결합시키고; 10㎍의 5′-OH 단편 L1을 포스포릴화된 L2, U5및 U6와 결합시킨다. 이들 연결반응은 100유니트의 T4리가아제를 사용하여 300㎕의 200mM 트리스-HCl (pH7. 5), mM MgCl2, 10mM 디티오스레이톨 및 0.5mM ATP 중 4℃에서 6시간 동안 수행한다. 그후 이들 세가지 연결반응 혼합물들을 합하여 100유니트의 T4리가아제를 첨가하고, 반응을 20℃에서 12시간동안 진행시킨다. 이 혼합물을 에탄올로 침전시키고 10% 폴리아크릴아미드겔상에서 전기영등한다. 84 염기쌍 부위에서 이동하는 밴드를 겔로부터 떼어내어 용출시킨다. pBR 322(1㎍)를 Eco RI 및 Hind Ⅲ로 처리하고, 겔전기영등법에 의해 큰 단편을 분리하여 합성 DNA에 연결시킨다. 이 혼합물을 사용하여 이. 콜라이 K-12균주 294(end A, thi-, hsr-, hsmK +)를 형질전환시킨다. 균주 294는 1978년 10월 30일자, 기탁번호 ATCC No. 31446으로 어떠한 제한없이 기탁되었다[기탁기관 : American Type Culture Collection]. 하나의 형질전환체의 플라스미드 pHGH3으로 부터 EcoRI-Hind III 삽입물에 대하여, 상기 언급한 맥샘과 길버트의 방법으로 서열을 분석한 결과, 제1도에 도시된 서열이 확인되었다.
3. HGH의 박테리아성 발현을 위한 플라스미드의 작제(제5도 참조)
제5도에서 도시된 바와 같이, pHGH3 내의 합성단편 및 pHGH31 내의 mRNA 전사물과 함께 발현 플라스미드 pGH 6을 사용하여 이들 두 단편을 함유하는 복제가능한 플라스미드를 작제한다. 종결 lac 프로모터를 함유하는 발현 플라스미드는 먼저 다음과 같이 작제한다. : 95 염기쌍의 이종 DNA 단편에 의해 분리된 95 염기쌍 UV5 lac 프로모터 단편 2개를 함유하는 285 염기쌍의 Eco RI 단편을 플라스미드 pKB 268로부터 분리한다[참조 : K. Beckman, et al., Cell, Vol, 13, 65-71(1978)]. 이 285 염기쌍(b.p.) 단편을 pBR 322의 EcoRI 부위에 삽입하고 테트라사이클린 내성 유전자를 향하여 적절한 판독상에 배열된 프로모터를 갖는 클로운 pGH 1를 분리한다. 테트라사이클린 내성 유전자에 대해 원위에 있는 EcoRI 부위를 EcoRI로 부분적으로 분해하여 파괴시키고, 테트라사이클린 내성 유전자에 대해 원위에 있는 EcoRI 부위를 EcoRI로 부분적으로 분해하여 파괴시키고, 생성된 1본쇄 EcoRI 말단을 DNA 폴리머라제 I으로 복구시킨 다음, 평활-말단 연결법에 의해 플라스미드를 다시 환상으로 만든다. 생성된 플라스미드 pGH 6은 HGH에 대한 완전 유전자가 삽입될 수 있는 프로모터 계에 대해 적절하게 위치하는 단일 EcoRI 부위를 함유한다.
RNA 전사물과 조합하기 위한 합성단편을 제조하기 위하여, 10㎍의 pHGH 3을 EcoRI 및 Hae III 제한 엔도뉴클레아제로 절단하고, HGH 아미노산 1 내지 23에 대한 코드화 서열을 함유하는 77염기쌍의 단편을 8% 폴리아크릴아미드 겔로부터 분리시킨다.
그후, 이 플라스미드 pHGH31(5㎍)을 Hae Ⅲ으로 절단한다. pBR 322의 함께 이동하는 540bp Hae Ⅲ 단편 및 551bp HGH 서열을 겔 전기영동법으로 정제한다. 이어서 HGH 서열만을 Xam I로 처리하여 절단하고 3′비코드화 영역으로부터 39 염기쌍을 제거한다.
생성된 512bp 단편을, 6% 폴리아크릴아미드겔 상에서 전기영동시킴으로써 540bp pBR 322 Hae Ⅲ 편으로부터 분리한다. 0.3㎍의 77bp EcoRI-Hae Ⅲ 단편을 16㎕의 반응액중, 4℃에서 14시간 동안 T4리가아제를 사용하여 폴리머화한다. 이 혼합물을 70℃로 5초동안 가열하여 리가아제를 불활성시킨 후, Eco RI(이들의 Eco RI 부위를 통하여 이합화하는 단편들을 절단하기 위하여) 및 Sma I (Xma I 이합체를 절단하기 위하여)로 처리하여 EcoRI“접착”말단과 Sam“평활”말단을 갖는 591bp 단편을 수득한다. 6% 플리아크릴아미드 겔상에서 정제한 후 대략 30ng의 단편을 수득한다. 이때, 발현 플라스미드 pGH 6가 Xma I 인식부위를 함유하지 않음을 주지하여야 한다. 그러나, Sam I은 Xam I과 동일한 부위를 인식하지만, 이 부위의 한가운데를 통과하여 절단하므로 평활말단이 수득된다. 따라서, gHGH 31로부터 유도된 단편의 Sma-절단 말단들은 pGH 6에 연결된 평활말단일 수 있다.
종렬의 lac UV5 프로모터들을 함유하는 발현 플라스미드 pGH6을 연속해서 Hind Ⅲ, 뉴클레아제 S1 및 EcoRI로 처리한 후, 겔 전기영동법으로 정제한다. 이렇게 하여 수득한, 한개의 EcoRI 접착말단과 하나의 평활말단을 갖는 벡터 50ng를 10ng의 591bp HGH DNA에 연결시킨다. 이 연결혼합물을 사용하여 이. 콜라이 ×1776을 형질전환시킨다. 테트라사이클린(12.5㎍/㎖)상에서 성장시키기 위한 콜로니(colony)를 선별한다. 하이브리드 HGH 유전자를 pGH 6에 삽입시킴으로써 테트라사이클린 내성유전자에 대한 프로모터는 파괴되지만, 종려의 lac 프로모터로 테트라사이클린 내성 구조 유전자를 해독할 수 있으므로 이 선별특성이 유지된다. 이렇게 하여 대략 400개의형질전환체가 수득된다. 문헌[참조 : Grunstein-Hogness Procedure, Proc. Nat′l Acad. Sci. USA. 72, 3961(1975)]에 기술된 방법에 의해 필터 하이브리드화시켜 HGH 서열을 함유하는 12개의 콜로니를 확인한다. 이들 콜로니중 세개의 콜로니로 분리된 플라스미드는 Hae Ⅲ, Pvu Ⅱ 및 Pst I으로 절단한 경우에 예상한 제한패턴을 나타낸다. 하나의 클로운 pHGH 107의 DNA 서열이 결정된다.
형질전환체에 의해 발현된 인체 성장 호르몬은, 파데바스(Phadebas) HGH PRIST Kit (Farmacia)를 사용하여, 용균 세포 상등액의 일련의 희석액에 대해 수행된 직접 방사선 면역 검정법(radioimmunoassay)에 의해 쉽게 검출된다.
HGH 발현이 lac 프로모터의 조절하에 있음을 입증하기 위하여, pHGH 107을 이. 콜라이 균주 D 1210 lac+(iQ0+Zty+), lac 리프레서 오버프로듀서(lac repressor overproducer)로 형질전환시킨다. 유의적인 HGH 발현되는 인듀서 IPTG(이소프로필티오갈락토사이드)를 가할 때까지는 검출될 수 없다.
pGH 107에서 EcrRI 부위를 제거하면, lac 프로모터의 리보좀 결합부위 코돈으로부터, β-갈락토시다제에 대한 개시 시그날과 리보좀 결합부위의 코돈사이에서 자연적으로 일어나는 것과 동일한 거리에 ATG 개시 시그날이 남게 된다. 이러한 자연적인 간격을 모조해 냄으로써 발현이 증가되었는지 여부를 측정하기 위하여, pGH 107을 EcoRI으로 개환시키고, 생성된 1본쇄 말단을 S1엔도뉴클레아제로 분해시킨 다음, T4리가아제를 사용하여 평활말단을 연결시켜 재 환화시킴으로써, pGH 107을 pGH 107-1로 전환시킨다. 생성된 플라스미드가 마찬가지로 HGH를 발현시킬 수 있음이 입증되었지만, 놀라웁게도 pGH 107-1은 직접 방사선 면역 검정법에 의해 밝혀진 바와 같이, pGH 107보다 더 적은 정도로 발현시켰다.
본 발명이 상기 언급한 바람직한 실시 태양으로 제한되는 것은 아니라 오히려 첨부된 청구범위의 합법적인 범위로만 한정되는 것은 분 분야의 기술자에게 명백해 질 것이다. 본원에서 기술한 것 이외에도, 프로모터계, 모 플라스미드, 또는 목적 폴리펩타이드 생성물 등의 선택에 있어서 어떠한 변형이 이루어질 수 있음은 명백하다. 예를들면, 본 발명에 적용할 수있는 기타 프로모터 계로는 람다 프로모터, 아라비노즈 오페론(phi 80 d ara) 또는 콜리신 E1, 갈락토즈, 알칼리성 포스파타제, 또는 트립토판 프로모터계 등이 있다. 박테리아성 발현용 숙주 미생물은, 예를들면, 에쉐리키아 콜리(Escherichi acoli) 및 살모넬라(Salmonella)의 균주 등과 같은 엔테로박테리아세(Enterobacteri aceae) ; 바실러스 서브틸리스(Bacillussubtilis)와 같은 바실라세(Bacillaceae) ; 뉴모코커스(Pneumococcus) ; 스트렙토코커스( Streptococcus) ; 및 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 중에서 선택될 수 있다. 물론, 이러한 유기체의 선택에 따라, 재조합 DNA에 대한 국립보건원의 지침[참조 : National Institutes of Health Guidelines for Recombinant DNA, 43 Fed. Reg. 60,080(1978)]에 준하여 실시되어야 하는 클로닝 및 발현에 있어서 물리적 봉쇄(Physical containment) 정도가 조절된다.
이. 콜라이 ×1776은, 본 발명을 실험실-규모(bench-scale)로 수행하는데 바람직하지만, 생체안정성의 이유로 그 내부에 의도적으로 이입된 취약성 때문에, 대규모 제조시의 실용성은 제한됨을 증명하였다. 적절한 정도의, 생물학적이라기보다는, 물리적인 봉쇄를 하여, 이. 콜라이 X-12 균주 294(상기 참조) 및 이. 콜라이 균주 RRI, (유전형 : Pro-Leu-Thi-RB -recA+StrrLacy-)과 같은 유기체를 대 규모조작에 사용할 수 있다. 이 콜라이 RR1은 이. 콜라이 HB 101[참조 : H.W. Boyer et al., J. Mol. Bio. (1969) 41 459 내지 472]로부터, Hfr 공여체(donor)로서 이. 콜라이 K12 균주 KL 16과 매치시킴으로써 유도된다[참조 : J.H.Miller, Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor, New York, 1972)]. 이. 콜라이 RR1 균주의 배양물은 1978년 10월 30일자로 분양에 제한없이 ATCC에 기탁되어 있다[기탁기관 : American Type culture Collection, ATCC 기탁번호 : 제31343호]. 이와 마찬가지로, ×1776의 배양물도 1979년 7월 3일자로 기탁되어 있다[기탁기관 : American Type Culture Collection, ATCC 기탁번호 : 제31537호]. 다음과 같은 기탁물들도 1979년 7월 3일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁되어 있다 : 플라스미드 pHGH 107(ATCC No. 40011); 플라스미드 pGH 6(ATCC No. 40012); pHGH 107로 형질전환시킨 ×1776 균주(ATCC No. 31538) 및 pGH 6으로 형질전환시킨 이. 콜라이 K 12 균주 294(ATCC No. 31539).
본 발명에 따라 수득된 유기체를 인체 성장 호르몬의 대규모 발효생산에 사용하여 여태까지는 얻기 힘들었던 양과 용도를 갖는 생성물을 수득할 수있다. 예를들면, 형질 전환체 이. 콜라이 배양물을 강철 또는 그 이외의 발효용기내에서, 통상적으로 통기시키면서 교반하면서 탄수화물 또는 글리세롤, 질소공급원(예, 황산 암모늄), 칼늄 공급원(예, 인산 칼륨), 미량원소, 황산 마그네슘 등과 같은 적절한 영양분이 보충된 약 37℃, 거의 중성 pH(예, pH7+0.3)의 수성 배지중에서 성장시킬 수 있다. 형질전환유기체는 바람직하게는, 항생물질 내성과 같은 선별 특성 하나 이상을 나타내므로, 야생형 이. 콜라이의 상경적 성장을 방해하는데 이러한 특성을 사용할 수 있다. 에를들면, 앰피실린이나 테트라사이클린-내성 유기체의 경우에는, 항생물질을 발효배치내에 첨가하여 이러한 내성 특성이 없는 야생형 유기체들을 선별해 낼 수 있다.
발효가 완결되면, 박테리아 현탁액을 원심분리하거나, 달리 육즙으로부터 세포질 고형물을 모은 다음, 물리적 또는 화학적 방법으로 용해시킨다. 세포 잔해물을 상등액으로부터 제거하고 가용성 성장호르몬을 분리하여 정제한다.
인체 성장 호르몬은
(1) 폴리에틸렌이민 분별법 ;
(2) 세파크릴(Sephacryl) S-200 상에서의 겔 여과 크로마토그래피법 ;
(3) 바이오렉스(Biorex)-70 수지 또는 CM 세파덱스(Sephadex) 상에서의 이온 교환 크로마토그래피법 ; (4) 황산암모늄 및/도는 pH 분별법 ; 및 (5) 면역감작된 동물이나 하이브리도마(hybridoma)로부터 분리된 항-HGH IgG로부터 제조한 항체 수지를 사용한 친화성 크로마토그래피법중의 하나 또는 이들을 조합해서 사용하여 박테리아 추출물로부터 정제하고, 산성 또는 약한 변성조건하에서 탈착시킬 수 있다.

Claims (1)

  1. 박테리아 형질전환체내에서 외래성 접합 단백질을 수반하지 않는 인체 성장 호르몬을 발현시킬 수 있는 복제가능한 박테리아성 플라스미드를 함유하는 박테리아 형질전환체의 생배양물을, 통기 및 교반장치를 포함하는 발효기내에서 영양소-함유 수성 발효 육즙중에 넣고 ; 배양물을, 왕성한 성장을 유지시키기 위한 필요에 따라 추가량의 영양소를 공급하면서, 통기 및 교반하에 성장시키고 ; 발효육즙으로부터 생성된 세포매스를 분리한 후 ; 세포를 용해시켜 그의 내용물을 유리시키고 ; 상등액으로부터 세포잔사를 분리시킨 다음 ; 상등액에 함유된 인체 성장 호르몬을 분리하여 정제시킴을 특징으로 하여 인체 성장 호르몬을 제조하는 방법.
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