JP2006517995A

JP2006517995A - 活性化されたポリエチレングリコールエステル類

Info

Publication number: JP2006517995A
Application number: JP2006502450A
Authority: JP
Inventors: ツジョエン，フォー・シオン
Original assignee: ファルマシア・コーポレーション
Priority date: 2003-02-19
Filing date: 2004-02-13
Publication date: 2006-08-03
Also published as: WO2004074345A2; TW200426155A; EP1597299A2; BRPI0407511A; WO2004074345A3; CA2515612A1; MXPA05008785A; US20040162388A1; AR043216A1; US7094872B2

Abstract

本発明は、生物学的に活性で薬学的に有用なペプチド及びタンパク質のＰＥＧ化に有用なポリエチレングリコールカーボネート活性化エステル類の調製に関する。本発明は、ポリエチレングリコールを混合したカーボネート活性エステルの形成における活性化オキサレートエステル類の使用と続くリンカーとの反応又は標的ペプチド又はタンパク質との直接的な反応を包含する。特にＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルオキサレート又は１，１’−ビス［６−（トリフルオロメチル）ベンゾトリアゾリル］オキサレートを用いる。

Description

技術分野
本発明は、生物学的に活性で、薬学的に有用なペプチド及びタンパク質のＰＥＧ化（PEGylation）に有用なポリエチレングリコールカーボネート活性化エステル類の製造に関する。本発明は、ポリエチレングリコールを混合したカーボネート活性エステル類（すなわち、これがリンカーと、あるいは直接標的ペプチド又はタンパク質と反応する）の形成における活性化カーボネート及びオキサレートエステル類の使用を包含する。

発明の背景
多くのペプチド及びタンパク質が主に遺伝子工学的手法にて有用な薬剤として開発されてきた。しかしペプチド又はタンパク質としての固有の特性により、治療的な潜在能力（potential）はしばしば非常に限られている。これら分子はプロテアーゼにより直ちに新陳代謝され腎濾過により直ちに排出される。さらに、これらのシーケンスがヒトタンパク質と類似するものであっても、免疫学的反応を生起しうる。したがって生物学的により安定で長期にわたって活性のペプチド−又はタンパク質−ベースの薬剤を化学的修飾により開発することが望ましい。

ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、一般式Ｈ−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎ−ＯＨ（ｎ＞４）の、親水性で、生体適合性の、非毒性の水溶性ポリマーである。分子量は３００〜４０，０００ダルトンにわたる。

ＰＥＧとタンパク質及び／又はペプチドとの接合により生物学的に活性の持続時間が著しく増加することが示されている。ＰＥＧはより安定な立体配座を提供し、そして分子サイズを増大させ、こうして代謝による悪化と腎クリアランスを減少させる。さらにＰＥＧ化は免疫原性を減少させ、ペプチド又はタンパク質の溶解性を向上させることができる。

種々のＰＥＧ−タンパク質接合体がタンパク質分解から保護され、及び／又は減少した免疫原性を有することがわかった（Monfardini,et al., Biocon. Chem., 6, 62-69 (1995)；及びYamsuki et al., Agric. Biol. Chem., 52, 2185-2196 (1988)）。

ＰＥＧ接合体は、ペプチド及びタンパク質の修飾のためのすでに確立された方法論であり、Davis及びAbuchouwskiの研究により最初に開発された（Abuchowski, A. et al., J. Biol. Chem., 252, 3571 (1977)及びJ. Biol. Chem., 252, 3582 (1977)）。ペプチド又はタンパク質へのＰＥＧ接合体は大概ＰＥＧの活性化と、活性ＰＥＧ−中間体（intermediate）と標的タンパク質及び／又はペプチド、あるいはリンカーとの直接カップリングに関連しており、これによって活性化され標的タンパク質及び／又はペプチドにカップリングする。接合体の重要な問題の一つは、使用される活性ＰＥＧ及びＰＥＧ−リンカーの化学的性質であり、すなわちこれによりカップリング能と活性ＰＥＧ又はＰＥＧ−リンカーの標的への特異性を見積もることができる。

例えば、トリクロロトリアジン−活性化ＰＥＧは、毒性で非特異性であると判っているが、後に標的ペプチド又はタンパク質のアミノ基と特異的に反応可能な活性化ＰＥＧ（Benecham C. O. et al, Anal. Biochem., 131, 25 (1983); Veronese, F. M. et al., Appl. Biochem., 11, 141 (1985) ; Zalipsky, S. et al., Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems, adrs 9-110 Symposium Series 469 (1999); Zalipsky, S. et al., Europ. Polym. J., 19, 1177-1183 (1983); Delgado, C. et al., Biotechnology and Applied Biochemistry, 12, 119-128 (1990)）、スルフヒドリル基と反応可能な活性化ＰＥＧ（Sartore, L., et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 27, 45 (1991); およびMorpurgo et al., Biocon. Chem., 7, 363-368 (1996)）あるいはグアニジン残基と反応可能な活性化ＰＥＧ（Pande, C. S. et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 77, 895-899 (1980)）等の種々の活性化ＰＥＧと置き換えられている。タンパク質のＰＥＧ化における他の技術的困難性は、タンパク質又はペプチドがしばしばアミノ、グアニジン、ヒドロキシル又はスルフヒドリルなどの異なる官能基を有するだけでなく、これらの１以上の官能基を有することから生ずる。その結果、生成物はＰＥＧ−タンパク質の化学量論の異なった接合体の混合物を含有する。ＰＥＧの成長ホルモン（ＧＨ）への接合はかかる問題の典型例を呈している（Clark, R. et al., J. Biol. Chem., 36, 21969-21977 (1996)）。これはＧＨのリシン残基がランダムな位置でＰＥＧ化されたからであるとされている。タンパク質の部位特異的なＰＥＧ化は化学的な課題を残している。

カップリング効果を著しく減ずることなくＰＥＧとタンパク質又はペプチドとの特異的なカップリングを促進するために、ＰＥＧ−ペプチド又はＰＥＧ−タンパク質を形成するためにＰＥＧのカーボネートエステルがしばしば用いられている。Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ）はＰＥＧと反応させて活性の混合ＰＥＧ−スクシンイミジルカーボネートを形成するのに用いられ、次いでこれをリンカーの求核基又は標的タンパク質／ペプチドのアミノ基と反応させた（米国特許５，２８１，６９８及び米国特許５，９３２，４６２）。同じタイプの反応では、１，１’−（ジベンゾトリアゾリル）カーボネートとジ−（２−ピリジル）カーボネートをＰＥＧと反応させてＰＥＧ−ベンゾトリアゾリル及びＰＥＧ−ピリジル混合カーボネートをそれぞれ形成した（米国特許５，３８２，６５７）。

しかし、カーボネートエステルは容易には生成できない。一般に良好な収率を得るには、生成に際してしばしばホスゲンを用いる。この試薬は取り扱いが困難で大規模合成には危険である。したがってＰＥＧ混合カーボネート活性エステル類の調製に際しては、他の似たような活性エステル（例えばＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルオキサレートや１，１’−ビス［（トリフルオロメチル）ベンゾ−トリアゾリル］オキサレート、これらはオキサリルクロリドから調製される）を使用することが優れており、かつ安全である。さらにオキサレート活性エステル類はカーボネート活性エステル類よりも経済的に調製することができる。

発明の概要
本発明は、リンカーのある、あるいはない、生物学的活性求核剤への接着のための活性化されたポリマーエステルの製造方法を記載する。より詳細には、本発明は、少なくとも１つのフリーのヒドロキシル基を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を適切な反応条件下でオキサレートエステルと反応させてＰＥＧ活性エステルを形成することを含む、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の活性化エステルの製造方法に関する。本発明で使用されるオキサレートエステル類は、Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルオキサレートと１，１’−ビス[６−（トリフルオロメチル）ベンゾトリアゾリル]オキサレートである。

得られたＰＥＧ活性エステルは適切な条件下で特異的な方法で生物学的活性求核剤と反応するであろうことが示されている（米国特許５，２８１，６９８、米国特許５，６５０，２３４、及び米国特許５，９３２，４６２）。より詳細には、ペプチド又はタンパク質のアミノ基により、ポリマーとペプチド又はタンパク質との間に安定なウレタン結合を形成する。

本発明の他の態様は、本発明に記載した方法により調製されるＰＥＧ混合カーボネート活性エステル類である。好ましくはＰＥＧ混合カーボネートエステル類は、例えばＰＥＧ−スクシンイミジル及びＰＥＧ−６−（トリフルオロメチル）ベンゾトリアゾリル混合カーボネートエステル類である。

本発明の他の態様は、リンカーのある、またはない、ＰＥＧ−生物学的活性求核剤接合体であり、本発明に記載される方法により調製される。好ましくは、ＰＥＧ−生物学的活性求核剤接合体は、リンカーのある、またはない、ＰＥＧ−ペプチド及びＰＥＧ−タンパク質接合体を含む。

本発明の他の態様において、生物学的活性求核剤は好ましくはペプチドまたはタンパク質である。本発明で好ましいタンパク質は、米国特許４，６５８，０２１及び米国特許５，６３３，３５２に開示されるヒトＧＨ及び抗体またはＴＮＦ_αに対する抗体、ヒトＧＨレセプターに対する抗体、Ｃ−Ｍｅｔに対する抗体及びＩＧＦ−１レセプターに対する抗体のようなフラグメントである。

好ましいＴＮＦ_α抗体は、米国特許出願２００２／１５１６８２Ａ１に以前開示されるとおり、ＣＤＲ−グラフト化、ｈＴＮＦ４０−ベースの修飾Ｆａｂである。
本発明の他の態様において、ＰＥＧ活性エステルはまずリンカーと反応させ、次いで生物学的活性求核剤とカップリングさせる。より詳細には、例えば、ＰＥＧ活性エステルを過剰の１，３−ジアミノプロパンと反応させる。得られたＰＥＧ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_３−ＮＨ_２接合体を、次いでＮ−カルボキシメチルマレイミドとカップリングさせる。このＰＥＧ−リンカー接合体をさらに生物学的活性求核剤、より詳細には抗体または抗体フラグメント、例えばＴＮＦ_α修飾Ｆ_ａｂのＣｙｓ残基とカップリングさせ、ＣＤＰ８７０を形成する。ＣＤＰ８７０、ＰＥＧ化、抗ＴＮＦ_α、修飾Ｆ_ａｂは関節リウマチに対する有効な抗体である。

さらなる態様は、本発明に記載される方法で生成されるＰＥＧ−ペプチドまたはＰＥＧ−タンパク質接合体の治療学的有効量を投与することによる、患者の治療方法である。
本発明のオキサレートエステル類は商業的に入手可能であるか、あるいは容易に経済的に調製可能である。その調製はホスゲンの代わりにオキサリルクロリドを使用することを含む。オキサリルクロリドは大スケール合成においてホスゲンより容易に安全に取り扱うことができる。出発物質の低コスト化と高収率化により、オキサレートエステル類は対応するカーボネートエステル類よりもより経済的に調製できる。さらにオキサレートエステル類は一般にカーボネートエステル類よりも安定で、長期間にわたり室温で保存可能であう。さらに上述したようにＰＥＧ活性エステル類はより向上した特異性という優位性を有する。

したがって、これら試薬は、種々の疾患の治療に有効なＰＥＧ化ペプチドまたはタンパク質の、より重要になる調製に、さらなる向上をもたらすに違いない。このＰＥＧ化方法は溶解性を向上させ、免疫原性を低減し、そしてペプチドまたはタンパク質の代謝安定性を向上させる。
発明の詳細な説明
化学
カーボネートエステルと同様に（Takeda, K. et al., Tetrahed. Lett., 24, 4569-4572 (1983)）、Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルオキサレート（Ｉ, DSO）及び１，１’−ビス［６−（トリフルオロメチル）ベンゾトリアゾリル］−オキサレート（ＩＩ)などのオキサレートエステル類はカーバメート誘導体の調製や、ペプチド合成において首尾良く使用されている（Takeda, K. et al., Tetrahed., Lett., 24, 4451-4454 (1983); J. Org. Chem., 50, 273-275 (1985); Ghosh, A. K., Tetrahed. Lett., 33, 2781-2784 (1992)）。しかしかかる試薬がＰＥＧに対して反応し、混合カーボネート活性エステル類を形成することは報告されていない。

本発明は、ＰＥＧ化した生物学的活性求核剤の合成に有用な、より詳細にはＰＥＧ化したペプチドまたはタンパク質の合成に有用な、活性化ＰＥＧカーボネート（ＩＩＩ及びＩＶ）エステル類の調製におけるこれら試薬の使用に関する。この方法は溶解性を向上させ、免疫原性を低減し、そしてペプチドまたはタンパク質の代謝安定性を増加する。

本発明の１の態様において、スキーム１に示すように、方法は、ＰＥＧとＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルオキサレート（Ｉ）とを塩基性触媒の存在下で反応させて化合物ＩＩＩを形成することを含む。この目的及び以降のオキサレートまたはカーボネート活性エステル類との反応のために好適な触媒は、ピリジン及びＮ，Ｎ’−４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）などの有機塩基が挙げられる。

Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルオキサレート（Ｉ）は、スキームＩＩに示すように、K.Takedaが記載する方法により、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドとオキサリルクロリドとからピリジンの存在下で調製することができる（Tetrahed. Lett., 24, 4451-4454 (1983)）。

ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）について言及したとしても、本発明において他の列挙された形態の全てのＰＥＧも用いることができると理解されたい。一般にＰＥＧはポリマー分子の各末端に１つのフリーのヒドロキシル基を有する。好ましくは本発明に使用するＰＥＧは少なくとも１つのフリーの末端ヒドロキシル基を有する。タンパク質またはリンカーのフリーのアミノ基と反応して活性化されるのはこのヒドロキシル基である。この場合ＰＥＧとＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルオキサレートとはＮ，Ｎ’−ジメチルアミノピリジンまたはピリジンの存在下で反応し、比較的安定で活性なＮ−スクシンイミジルカーボネートエステルを形成する。このＰＥＧ活性エステルは、次いで特異的にペプチドまたはタンパク質のアミノ基と反応して安定なウレタン結合を形成する。

あるいはＰＥＧ活性エステルはω，ω−アミノアルカンまたはアミノアルカン酸等のリンカーのアミノ基と反応する。次いでＰＥＧ−リンカー接合体は活性化されるか他の活性化部位と反応し、そしてペプチドまたはタンパク質のアミノ基とカップリングされる。

本発明の他の態様において、スキームＩＩＩに示すように、ＰＥＧと１，１’−ビス［６−（トリフルオロメチル）ベンゾトリアゾリル］オキサレート（ＩＩ）とが塩基の存在下で反応して化合物ＩＶを形成する。

ＰＥＧとＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルオキサレート（Ｉ）との反応と同様に、反応はピリジンまたはＤＭＡＰ等の有機塩基により触媒される。出発物質である１，１’−ビス［６−（トリフルオロメチル）ベンゾトリアゾリル］オキサレート（ＩＩ）は、スキームＩＶに示すように、K. Takedaが記載する２段階法により、４−クロロ−３−ニトロ−α，α，α−トリフルオロトルエンから調製できる（J.Org. Chem., 50, 273-275 (1985)）。

次いでこのＰＥＧ活性エステル中間体を共有結合的にウレタン結合を介して標的ペプチドまたはタンパク質のアミノ基とカップリングさせる。あるいは、スキームＶ、ＶＩ及びＶＩＩに示すように、これら中間体をまずω，ω−アミノアルカン、Ｎ−カルボキシアルキルマレイミドまたはアミノアルカン酸などの１以上のリンカーとカップリングし、そしてさらなる活性化と共に、あるいはなしに、ペプチドまたはタンパク質のアミノ基またはチオール基とカップリングさせる。

タンパク質の合成及び精製
接合体に使用するペプチド及びタンパク質は、当業者においてよく確立された合成技術（組み換え技術及びペプチド合成またはこれらの技術の組合せなど）を含む技術を使って調製されるか、あるいはペプチド又はタンパク質の内因源（endogenous source）から単離することもできる。用いられるペプチド合成として固相ペプチド合成及び古典的な溶液ペプチド合成技術が挙げられる。本発明のある態様において、タンパク質の選択は抗体である。抗体の製造技術は以下の通りである：
ポリクローナル抗体：ポリクローナル抗体は、通常関連する抗原及びアジュバントを皮下（ｓｃ）又は腹腔内（ｉｐ）への複合的注射により、動物で産生する。関連する抗原と免役すべき種の体内で免疫原性のキャリヤータンパク質（例えばキーホールリンペットヘモシアニン、ウシサイログロブリン、血清アルブミン、又は大豆トリプシン阻害物質）とを、二官能性のリンカー（例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル、グルタールアルデヒド、またはコハク酸無水物）を用いて接合させることが有効でありうる。

モノクローナル抗体：モノクローナル抗体は実質的に同質の抗体の個体群、すなわち、少量存在しうる、自然発生的に起こりうる変異以外は同一である個体群を含む個々の抗体から得られる。例えば、モノクローナル抗体はKoehlerら（Nature 256, 495 (1975)）によって始めて記述されたハイブリドーマ技術を用いて調製することができ、あるいは組み換えＤＮＡ法（米国特許4,816,567）により作ることができる。

ハイブリドーマ法では、マウス又は他の適切な動物（例えばハムスターなど）を免疫して、免疫化に使用するタンパク質に特異的に結合する抗体を産生する、あるいはかかる抗体を産生することができるリンパ球を顕在化させる。あるいはリンパ球をin vitroで免役することもできる。次いで好適な融合剤、例えばポリエチレングリコール、を使用してリンパ球をミエローマ細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する（Goding, Monoclonal Antibodies: Principle and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)。

次いで調製したハイブリドーマ細胞を播き、非融合のミエローマ親細胞の成長あるいは生存を阻害するような１以上の物質を含有する好適な培地で培養する。ハイブリドーマ細胞を培養する培地は抗原に対して向けられたモノクローナル抗体の産生のためにアッセイされている。ハイブリドーマ細胞が所望の特異性、アフィニティー及び／又は活性を有する抗体を産生した後、限定された希釈方法によりクローンをサブクローン化し標準法で培養することができる（Goding, Monoclonal Antibodies: Principle and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)。サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体を培地、腹水あるいは血清から従来の免疫グロブリン精製技術（例えばタンパク質Ａ−セファロース、ハイドロキシルアパタイトクロマト−グラフィ、ゲル電気泳動、透析、あるいはアフィニティクロマトグラフィなど）を使って好適に分離する。

ヒト化抗体及びヒト抗体：非ヒト抗体のヒト化方法は当業者に周知である。一般にヒト化抗体は非ヒトである源（source）から導入された１以上のアミノ酸残基を有している。このような非ヒトアミノ酸残基はしばしばインポート残基（import residues）と称され、典型的には「インポート」された可変ドメインから受け継いでいる。ヒト化は本質的に以下のWinter及び共同研究者らの方法（Jones et al., Nature, 321, 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 322, 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239, 1534-1536 (1988)）に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲシーケンスを対応するヒト抗体のシーケンスに置換することにより行う。したがって、このような「ヒト化」抗体はキメラ抗体であり（米国特許４，８１６，５６７）、ここでは実質的に無傷ではないヒト可変ドメイン（less than an intact human variable domain）が対応する非ヒト種からのシーケンスで置換されている。

あるいは、トランスジェニック動物（例えばマウス）を産生することも可能であり、免疫に際して、内生の免疫グロブリンの産生なしにヒト抗体のフルレパートリーを産生することができる。Jakobovits et al., Nature, 362, 255-258 (1993); Brueggermann et al., Year in Immuno., 7, 33 (1993)を参照のこと。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリ（Hoogeboom et al., J. Mol. Biol., 227, 381 (1991); Marks at al., J. Mol. Biol., 222, 81-597）から得ることができる。
配合物
上記の興味のあるペプチド又はタンパク質の調製の後、予備凍結乾燥配合物（pre-lyophilized formulation）を調製する。予備凍結乾燥配合物中に存在するタンパク質の量は、所望の最終投薬体積、投与モードなどを考慮して決定される。タンパク質は一般に溶液中に存在する。

予備凍結乾燥配合物に溶解保護剤（lyoprotectant）を加える。好適な態様において溶解保護剤はショ糖あるいはトレハロースなどの非還元糖である。予備凍結乾燥配合物中の溶解保護剤の量は、一般的に、再溶解して得られる配合物が等張になるような量である。しかし高張の再溶解配合物も好適である。溶解保護剤が糖で、タンパク質が抗体である場合、予備凍結乾燥配合物中の溶解保護剤濃度の例は、約５ｍＭ〜約５００ｍＭ、好ましくは約２０ｍＭ〜約３００ｍＭ、最も好ましくは約４０ｍＭ〜約１００ｍＭである。

タンパク質と溶解保護剤の割合は各タンパク質及び溶解保護剤の組合せに応じて選択する。高タンパク質濃度の等張再溶解配合物を生成するためにタンパク質として抗体、溶解保護剤として糖を用いる場合、溶解保護剤と抗体のモル比は約５０〜約１５００モルの溶解保護剤に対して１モルの抗体、好ましくは約２００〜約１０００モルの溶解保護剤に対して１モルの抗体である。

本発明の他の態様において予備凍結乾燥配合物に界面活性剤を加えることが望ましいことがわかっている。代わりに、あるいは追加で界面活性剤を凍結乾燥配合物及び／又は再溶解配合物に加えることができる。界面活性剤の例として、ポリソルベート、トリトン、ポリクサマー、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。加えられる界面活性剤の量は、再溶解されたタンパク質の凝集を低減させ、再溶解の後の配合物の粒子の形成を最小限にするような量である。

本発明の他の態様において、予備凍結乾燥配合物の調製に溶解保護剤（例えばブドウ糖、フルクトース、ショ糖、マルトース又はトレハロース）の混合物及び充填剤（bulking agent）（例えばマンニトール又はグリシン）の混合物を用いる。

Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に記載されるような他の薬学的に許容可能なキャリヤー、賦形剤または安定剤を、それらが配合物の所望の性質に反対に負の影響を及ぼさない限り予備凍結乾燥配合物に含んでいてもよい。

ここで配合物は取り扱われる特別な意図のために必要な限り、１以上のタンパク質を含有していてもよく、好ましくは他のタンパク質に負の影響を及ぼさない補足的な活性を有するものがよい。In vivo投与で用いられる配合物は無菌でなければならない。これは、凍結乾燥及び再溶解の前あるいは後に、滅菌膜を通して濾過することで直ちに達成することができる。あるいは、混合物全体の無菌性は、タンパク質を除く成分を約１２０℃で約３０分間オートクレーブにかけて達成することができる。

タンパク質、溶解防護剤及び他の追加成分を混合した後、配合物を凍結乾燥する。本目的のために多くの異なる凍結乾燥機を利用可能である。一般にタンパク質配合物はバルクで凍結乾燥される。移送工程を避けるために、タンパク質配合物の再溶解を行うべき容器内でタンパク質配合物を凍結乾燥させることが望ましい場合がある。
凍結乾燥配合物の再溶解
所望のステージで、典型的にはタンパク質を患者に投与する時に、凍結乾燥配合物を希釈剤に再溶解し、再溶解配合物中でのタンパク質濃度を少なくとも３０ｍｇ／ｍＬ、例えば約３０ｍｇ／ｍＬ〜約５００ｍｇ／ｍＬにすることができる。

再溶解は、完全な水和を確実にするために、通常約２５℃の温度の場所で行うが、所望である限り他の温度で行うことができる。再溶解に必要な時間は、例えば希釈剤のタイプ、賦形剤及びタンパク質の量等に依存する。代表的な希釈剤として滅菌生理食塩水、リンガー溶液、又はデキストロース溶液が挙げられる。希釈剤は場合によりベンジルアルコール又はフェノールなどの防腐剤を含有する。用いられる防腐剤の量はタンパク質との相性や防腐剤の効果のテストなどに応じて異なる防腐剤濃度を評価して決定する。
再溶解配合物の投与
再溶解配合物をペプチド又はタンパク質による治療を必要とする哺乳動物、好ましくはヒトに、既知の方法で、例えば静脈内注射、丸薬剤、あるいは規定の時間にわたる連続注入、腹膜内、筋肉内、大脳内、皮下、関節内、滑液内、くも膜下、経口局所あるいは吸入のルートにて投与される。

ある態様において、再溶解配合物は哺乳動物に対し皮下投与にて投与される。この目的のために、シリンジを用いて配合物を注射することができる。しかし配合物の他の投与デバイスも利用可能であり、例えば注射デバイス、注射ペン、針のないデバイス及び皮下パッチ送達システムなどがある。

タンパク質の適切な投薬量は、例えば治療すべき状態、状態の苛烈性や進行性、タンパク質が予防的なあるいは治療的な目的で用いられるのか、過去の治療、患者の臨床歴及びタンパク質への反応、用いるタンパク質のタイプ、及び担当する医師の判断力等に依存する。タンパク質は１回で又は一連の治療にわたって患者に好適に投与され、診断の後にいつでも患者に投与することもできる。タンパク質は単一の治療として、あるいは他の薬剤または問題の状態の治療に有効な治療法との組合せとして投与することができる。タンパク質の選択が抗体の場合、患者への最初の投薬には、約０．１〜２５ｍｇ／ｋｇの抗体を、例えば１回であるいはそれ以上に分けた投与にて患者に投与することが好ましい。しかし他の投薬量も有効である。治療法の改良は、従来の技術によって容易にモニターできる。

本明細書で用いる種々の用語の定義は以下に示す：
ここで「ＰＥＧ」の語は、以下に表される一般式：

（ここでｎは約５〜約１１００でありうる）を有するエチレングリコールの幾つかの縮合ポリマー類のことである。ＰＥＧは平均分子量３００〜６０，０００ダルトンを有する。好ましくは、本発明で用いるＰＥＧは平均分子量２，０００〜４０，０００ダルトンを有する。より好ましくは５，０００〜２０，０００ダルトンである。

「ＰＥＧ」はポリオキシエチレン、ポリグリコール及びポリエーテルグリコールとして周知である。ポリマーはホモポリマー又はブロックコポリマー、直鎖あるいは分岐の、非置換あるいは置換の、好ましくは低級アルキル、低級ヒドロキシアルキル、及び低級アルコキシ基で置換されたものであり得る。

「ＰＥＧ」は、さらに、水溶性ポリオキシエチル化ポリオール、例えばポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロールなどを含む。

ここで「ｍＰＥＧ」の語は、一つの末端をメチル基でキャップしたＰＥＧのことである。ｍＰＥＧは構造的に以下の式：

で表される。
ここで「リンカー」の語は、ＰＥＧと生物学的に活性な求核剤とを結ぶ分子フラグメントのことである。フラグメントは典型的には、もう一つのリンカーと反応して活性化するか、あるいは直接生物学的に活性な求核剤と結合する二つの官能基を有している。例としてω−アミノアルカン酸、例えばリシンが通常用いられる。本発明においてＰＥＧと標的ペプチドまたはタンパク質を結ぶためにマルチプルリンカー、すなわち

を用いることもできる。
ここで「アミノアルカン酸」の語は、１以上のアミノ基を分子骨格に有するカルボキシリック酸のことである。アミノ基は末端の位置に、あるいは内部に、あるいはリシンのようにその両方に存在しうる。

ここで「生物学的に活性な求核剤」の語は、少なくとも１の求核部分を有する化合物のことであり、より詳細には生物学的に活性なペプチド又はタンパク質のことである。
ここで「ペプチド」の語は、約２〜約５０の天然アミノ酸の短鎖の短分子のことである。アミノ酸は非天然アミノ酸、例えばβ−アミノ酸又はＤ―アミノ酸などを含んでいてよい。

ここで「タンパク質」の語は、長鎖のアミノ酸ベースのポリマー（ポリペプチド）のことであり、三次又は四次構造等の高レベル構造を形成するのに充分である。タンパク質は単一の又は複数の、直鎖又は環状の、ホスホリル化又はグリコシル化等のように更に置換されていてもよいポリペプチド鎖から構成されることができる。タンパク質の大きさは約５０〜１００個のアミノ酸の、比較的広い範囲をカバーする。

ここでの定義の範疇に入るペプチド及びタンパク質の例として、哺乳動物ペプチド及びタンパク質、例えばインスリン、グルカゴン、バソプレッシン、カルシトニン、血管活性腸管ペプチド（ＶＩＰ）、α−メラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）、セクレチン、コレシストキニン（ＣＣＫ）、エンドテリン、ソマトスタチン、基質Ｐ、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、オキシトシン、ダイノルフィン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、抗体、成長ホルモン（ＧＨ）（ヒト及びウシ成長ホルモン（ＧＲＦ）等）、成長ホルモンレセプターアンタゴニスト、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、表皮性成長因子（ＥＧＦ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ）α及びβ、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）Ｉ及びＩＩ、インターロイキン類、インターフェロンα、β及びγ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α及びβ、血小板由来成長因子、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポエチン、トロンボポエチン、ＦＬＴ−３、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、抗毒素類、調整タンパク質類、運搬体タンパク質、及び上に列挙したポリペプチド類の生物学的に活性なフラグメント又は変種が挙げられる。

ここで「抗体」の語は、最も広い意味で用いられ、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、及びそれらのフラグメント、例えばＦ_ａｂ、Ｆ_{（ａｂ）２}、Ｆ_ｖ、及び抗原結合機能を有するフラグメント又は親抗体のことである。

ここで「モノクローナル抗体」の語は、均質の抗体群を有する抗体組成物のことである。この語は、免疫グロブリン全体の他、Ｆ_ａｂ、Ｆ_{（ａｂ）２}、Ｆ_ｖ、及び抗原結合機能を有するフラグメント又は親抗体も含む。さらにこの語は重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種又は特定のクラス又はサブクラスに属する種由来の抗体中の対応シーケンスと同一又は同族であるが、残りの鎖が他の種又は他のクラス又はサブクラスに属する種由来の抗体中の対応シーケンスと同一又は同族である「キメラ」抗体、さらに所望の生物学的活性を呈する限りにおいてこれら抗体のフラグメントをも含む。

ここで「ヒト化抗体」の語は、免疫グロブリンのフレームワーク領域の少なくとも一部がヒト免疫グロブリンシーケンス由来のものであることである。
ここで「ＰＥＧ化」あるいは「ＰＥＧ化した」ペプチド／タンパク質の語は、ペプチド又はタンパク質にＰＥＧ分子を共有結合にて結合させてＰＥＧ化ペプチド／タンパク質を形成する工程のことである。

全ての親出願及び参考文献は、全体として参考文献としてここに組み込む。
本発明は、Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルオキサレート又は１，１’−ビス［６−（トリフルオロメチル）−ベンゾトリアゾリル］オキサレートを用いたＰＥＧ活性カーボネートエステル類の製造方法を提供する。得られるＰＥＧ活性エステル類はＰＥＧ−ペプチド又はＰＥＧ−タンパク質接合体の調製に有用である。Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルオキサレートは市販されており、１，１’−ビス［６−（トリフルオロメチル）−ベンゾトリアゾリル］オキサレートは刊行物に記載の方法で調製することができる。

スキームＩ−ＶＩＩに記載する一般的な合成シーケンスは単に本発明を例示することを意味するものであって、その範囲又は精神を限定するものではない。当業者が直ちに理解するであろう、スキーム及び実施例に記載される条件や方法の既知の変更は、本発明でも用いることができる。

Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルオキサレート（５．７ｇ、２０ｍモル）とモノメチルポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ、Ｍ．Ｗ．６，０００；６ｇ、１ｍモル）をジクロロメタン（５０ｍＬ）中、ピリジン（２ｍＬ）の存在下、室温で一昼夜撹拌した。固体を濾過し、濾物をエーテル（６００ｍＬ）で処理した。白色沈殿物を侵しエーテルで完全に洗浄した。沈殿物をジクロロメタン（４０ｍＬ）に再溶解してエーテル（５００ｍＬ）で処理した。この工程をもう一度繰り返し標題の化合物を白色固体物質として得た（５．８５ｇ）。

ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）溶液を、ｐＨ８．５、０．２Ｍホウ酸塩緩衝液中の濃度２ｍｇ／ｍＬで調製した。実施例１の標題の化合物を、このタンパク質溶液に、タンパク質当たりモル比およそ５：１ｍＰＥＧ活性エステルになるように加えた。反応混合物を約２〜３時間撹拌した。ｍＰＥＧ−ｈＧＨ接合体を限外濾過にて精製し、Amicon systemでＰＭ１０膜（カットオフ１０，０００）を用いて濃縮した。この接合体をPharmacia Superose 12 カラムでゲル濾過クロマトグラフィにて、過剰の未反応ｍＰＥＧからさらに精製した。濾物を凍結乾燥し、白色固体生成物を得た。

１−ヒドロキシ−６−（トリフルオロメチル）ベンゾトリアゾール

標題の化合物をK.Takeda (J.Org. Chem., 50, 273, (1985)）に記載の方法に従って調製した。絶対エタノール（７５ｍＬ）中の４−クロロ−３−ニトロ−α，α，α−トリフルオロトルエン（５０．０ｇ、０．２２モル）とヒドラジン水和物（３３．０、０．３３モル）とを２４時間還流した。減圧下溶媒を留去した後、残渣を１０％炭酸ナトリウム水溶液に溶解させた。溶液をエーテルで洗浄して出発物質を除去し、濃ＨＣｌで酸性にして、生成物を沈殿させ、これを水洗して乾燥させると４０．０ｇの標題の化合物を得た。この生成物をエーテルから再結晶させた。

１，１’−ビス［（トリフルオロメチル）−ベンゾトリアゾリル］オキサレート（ＢＴＢＯ）

標題の化合物をK.Takeda（J.Org. Chem., 50, 273 (1985)）に記載の方法に従って調製した。実施例３の化合物（４０．６ｇ、０．２モル）のドライエーテル（６００ｍＬ）溶液をメカニカルオーバーヘッド攪拌機にて激しく撹拌してすぐにオキサリルクロリド（５０．０ｇ、０．４モル）を室温でゆっくり加えた。３時間撹拌後、白色沈殿物を濾過し、ドライエーテルとわずかのドライアセトンで洗浄した。更に再結晶することなく標題の化合物の純結晶（３５．０ｇ）を得た。

１，１’−ビス［（トリフルオロメチル）−ベンゾトリアゾリル］オキサレート（９．２ｇ、２０ｍモル）とモノメチルポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ、Ｍ．Ｗ．６，０００；６．０ｇ，１．０ｍモル）とをジクロロメタン（７０ｍＬ）中、室温で、ピリジン（５ｍＬ）存在下で一昼夜撹拌した。固体を濾過し、濾物を７００ｍＬのエーテルで処理した。白色沈殿物を濾過し、ドライエーテルで完全に洗浄した。沈殿物をジクロロメタン（６０ｍＬ）に再溶解し、エーテル（６００ｍＬ）で処理した。この工程を２回繰り返し標題の化合物を白色固体物質として得た（５．９ｇ）。

実施例５の標題化合物（５．９ｇ、１．０ｍモル）、リシンｔ−ブチルエステル、ＨＣｌ（０．５３ｇ、２．０ｍモル）及びジイソプロピルエチルアミン（０．２６ｇ、２ｍモル）をＤＭＦ／ピリジン（１：１；５０ｍＬ）中で室温で一昼夜撹拌した。エーテル（６００ｍＬ）を反応混合物に加えて沈殿物を濾過した。沈殿物を減圧デシケータ中で乾燥させ、ジクロロメタン（２００ｍＬ）中のトリフルオロ酢酸で３０分間処理した。固体をジクロロメタン（７５ｍＬ）とエーテル（５００ｍＬ）とに加えた。沈殿物を濾過し、エーテルで完全に洗浄した。乾燥した沈殿物はさらなる精製を必要とせずに用いた。

実施例６の標題化合物（３ｇ）とＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ；２．５ｇ、１０ｍモル）とをＤＭＦ（３０ｍＬ）に溶解した。ピリジン（５ｍＬ）を加えた後、反応混合物を室温で一昼夜撹拌した。固体を濾過し、濾物をエーテル（４００ｍＬ）で処理した。白色沈殿物を濾過し、ドライエーテルで完全に洗浄した。沈殿物をジクロロメタン（４０ｍＬ）に再溶解しドライエーテル（４００ｍＬ）で処理した。この工程を２回繰り返し、標題の化合物を白色固体物質として得た（２．９ｇ）。それとは別に、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）溶液を、ｐＨ８．５、０．２Ｍホウ酸塩緩衝液中の濃度２ｍｇ／ｍＬで調製した。ＤＳＣ活性化した実施例６の化合物を、一部このタンパク質溶液にタンパク質当たりモル比およそ５：１ｍＰＥＧ活性エステルになるように加えた。反応混合物を約２〜３時間撹拌した。ｍＰＥＧ−ｈＧＨ接合体を限外濾過にて精製し、Amicon systemにてＰＭ１０膜（カットオフ１０，０００）を用いて濃縮し、反応で生成するＮ−ヒドロキシスクシンイミドを除去した。この接合体を、Pharmacia Superose 12 カラムでゲル濾過クロマトグラフィにて、過剰の未反応ｍＰＥＧからさらに精製した。濾物を凍結乾燥し、生成物を低温室に置いた。

実施例５の標題化合物（５．９ｇ、１．０ｍモル）、１，３−ジアミノプロパン（０．７４ｇ、１０ｍモル）をピリジン（５０ｍＬ）中でチッ素雰囲気下で一昼夜撹拌した。エーテル（５００ｍＬ）を反応混合物に加え、沈殿物を濾過した。固体をジクロロメタン（５０ｍＬ）に再溶解し、エーテル（５００ｍＬ）を加えた。固体を濾過して回収し、減圧にて乾燥して５．８ｇの固体物質を得た。

実施例８の標題化合物（５．８ｇ、０．０９５ｍモル）をＮ−（２−カルボキシエチル）マレイミド（０．３１ｇ、２．０ｍモル）とＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート（０．５２ｇ、２ｍモル）のＤＭＦ／ピリジン（１：１；５０ｍＬ）中混合物に加えた。反応混合物を室温で一昼夜撹拌した。エーテル（６００ｍＬ）をこの混合物に加え、沈殿物を濾過した。この工程を１回繰り返し、固体を濾過した。生成物を減圧で乾燥し、さらなる精製をせずに用いた。

実施例９の標題化合物（５．７ｇ、０．９ｍモル）と還元ＣＤＰ８７０Ｆａｂ’（０．６ｍモル）とをｐＨ４．５の酢酸ナトリウム（２０ｍＭ、６０ｍＬ）中、室温で２時間撹拌した。反応混合物をそのまま一昼夜おき、ｐＨ５．５の酢酸ナトリウム（５０ｍＭ）とＮａＣｌ（１２５ｍＭ）とに対して、１０Ｋｄａ膜を用いて透析した。最終生成物は−７０℃で保存した。

Claims

ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の活性化エステルを製造する方法であって、適切な条件下でＰＥＧをＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルオキサレート又は１，１’−ビス［６−（トリフルオロメチル）ベンゾトリアゾリル］オキサレートで活性化する工程を含む、前記方法。
Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルオキサレート又は１，１’−ビス［６−（トリフルオロメチル）ベンゾトリアゾリル］オキサレートとＰＥＧの割合が３０：１以下である、請求項２に記載の方法。
触媒として有機塩基を用いる、請求項２に記載のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の活性化エステルを製造する方法。
塩基性触媒がピリジン及びＮ，Ｎ’−４−ジメチルアミノピリジンからなる群から選択される、請求項３に記載のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の活性化エステルを製造する方法。
ＰＥＧ−求核剤接合体を製造する方法であって、請求項２に記載のＰＥＧ活性エステルを生物学的活性求核剤と適切な条件下で反応させてＰＥＧ−求核剤接合体を形成する工程を含む、前記方法。
ＰＥＧ−リンカー−求核剤接合体を製造する方法であって、以下の工程：
（ａ）請求項２に記載のＰＥＧ活性エステルをリンカーと反応させ；そして
（ｂ）得られたＰＥＧ−リンカーを生物学的活性求核剤と適切な条件下で反応させてＰＥＧ−リンカー−求核剤接合体を形成する
を含む、前記方法。
前記生物学的活性求核剤がペプチド又はタンパク質である、請求項５又は６に記載の方法。
前記ＰＥＧ活性エステルが、前記ペプチド又はタンパク質と、１〜３０モルの活性エステルと１モルのタンパク質のモル比率で反応するか、あるいは前記リンカーと、１モルの活性エステルと１〜１０モルのリンカーのモル比率で反応する、請求項７に記載の方法。
ＰＥＧ−リンカー接合体がＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルオキサレート又は１，１’−ビス［６−（トリフルオロメチル）ベンゾトリアゾリル］オキサレートで活性化され、次いでペプチド又はタンパク質と、１〜３０モルの活性エステルと１モルのペプチド又はタンパク質のモル比率で反応させてＰＥＧ−リンカーペプチド又はＰＥＧ−リンカータンパク質接合体を形成する、請求項６に記載の方法。
請求項５，６，７，８又は９のいずれかに記載のＰＥＧ−求核剤又はＰＥＧ―リンカー−求核剤接合体であって、前記求核剤がｈＧＨアンタゴニスト又は抗ＴＮＦ_α抗体である、前記接合体。
前記ＴＮＦ_α抗体がＣＤＲ−グラフト化、ｈＴＮＦ４０−ベースの修飾Ｆａｂである、請求項１０に記載の接合体。
請求項９，１０又は１１のいずれかに記載の、リンカーのある又はリンカーのないＰＥＧ−求核剤接合体を含む組成物。
請求項９，１０又は１１のいずれかに記載のＰＥＧ接合体の、成長疾患又は炎症関連疾患の治療のための薬剤の製造のための使用。