JPS59106297A - ヒト生長ホルモンのカルボキシ末端遺伝子の合成法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒト生長ホルモンのカルボキシ末端遺伝子の
合成法及びそのクローニングに関するものである。

ヒト生長ホルモンは、アミノ酸／９／個からなる４リベ
プチドであるが、治療用の天然物は少量にしか存在せず
大量入手が極めて困難である。そこで、最近遺伝子工学
により、一部合成遺伝子を用い、一部天然メッセンジャ
ーＲＮ　Ａ　（ｍ　ＲＮＡ　）より酵素的に合成した相
補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を用いてヒト生長ホルモンを合
成する方法が報告されている（　Ｄ、Ｖ、Ｇｏｅｄｄｅ
ｌ　ｅｔ　ａｌ、Ｎａｔ、ｕｒｅ、２　ｇ　／、５ＩＩ
ＩＩＣ／ｑ７９）参照〕。この方法により天然ｍＲＮＡ
を用いて合成したアミノ酸、２４〜／９／に対応する遺
伝子は、ヒトの脳下垂体において使用されている遺伝暗
号（アミノ酸コドン）を含むものであり、従ってこれを
、宿主である大腸菌中でベクターのプラスミドに組込ん
だものからペプチドを合成させる発現方法は最筈のもの
ではない。

本発明者らは、上記の観点から、大腸菌中での発現、に
有利である方法について鋭意研究を行った結果、本発明
を完成したものである。すなわち、本発明のヒト生長ホ
ルモンのカルブキシ末端（アミノ酸７３７〜／ｑ／）に
対応する遺伝子は、大腸菌において高頻就に使われるア
ミノ酸コドンに従って合成した人工遺伝子であり、大腸
菌中での発現に極めて有利であると考えられる。このカ
ルブキシ末端ベグチド（Ｃ末端ＳＳアミノ酸）は、天然
のヒト生長ホルモンを、たんはく分解酵素グラスミンに
より限定分解して得られるＮ末端ペプチド（／〜／３ダ
アミノ酸）と混合することによって活性を示すことが化
学合成アナログを用いた実験（Ｃ，Ｈ，Ｌｌ　ｅｔ　ａ
ｌ、、Ａｒｃｈｌｖ　Ｂｌｏｃｈｅｍ、　Ｂｌｏｐｈｙ
ｓ。

２／／、３３ｇＣ／ヲｇｉ）参照〕から予想される。

以下に本発明を説明する。

ヒト生長ホルモンのカルブキシ末端（アミノ酸／３７〜
／９／）に対応する遺伝子の塩基配列は、次のスキーム
／に示すとおりである。

スキーム／に示されたＵθ〜Ｕ１２、ＬＯ〜Ｌ／／のオ
リゴヌクレオチド２５個をまず合成するが、これは同相
法により行われる。

固相法の担体としては、１％ゾピニルベンゼンを含むＩ
リスチレン樹脂〔に、Ｍｉｙｏｓｈｌ　ｅｔ　ａｌ。

Ｎｕｃｌｅｌｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　ｔ　、　５　
、！；　０り（７９ｇｏ）参照〕又はシリカダルＣＭ、
Ｄ、Ｍａｔｔｅｕｃｃｌ、Ｍ、Ｈ。

Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｊ、＋Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、
、　／θ３．３／ｇ！；Ｃ／’１ｇ／）参照〕が好まし
い。

ダｍ＠のデオキシヌクレオシド、すなわち、デオキシシ
チジン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チ
ミジンを、軍法によりそれぞれ！−コハク酸エステルと
する（　Ｂｒｏｋａ　Ｃ，ｅｔ　ａｌ、Ｎｕｃｌｅｌｃ
Ａｃｌｄｓ　Ｒｅｓ、　Ｉ　　ｊ４Ａ、６／−ｊ！７／
　（／　９１０）参照〕。

これを前記担体のアミノ括と結合したもの（ヌクレオシ
ド担体）を、前記オリゴヌクレオチドの３′末端に用い
る。欠いで、これらの！末端ヌクレオシド担体に、種々
の組合せのジクレオチドを、縮合剤を用いて順次！方向
に結合させる。縮合剤とり、テａ、メシチレンスルホニ
ル−３−ニトロトリアシリ）’（ＭＳＮＴ）１．２．１
Ａ、６−）リイソゾ四ビルベンゼンスルホニル−３−二
）ｔｒ）す７ソｆＪド（ＴＰＳＮＴ）、メチシチレンス
ルホニルーテトラゾリ）’（ＭＳ丁ｅ　）１．２ｔｌＡ
＊６−　）リイソプ四ビルベンゼンスルホニル−テトラ
ゾリド（丁ＰｓＴｏ　）等が適当である。

上記、ゾヌクレオシ）’Ｆｉ、≠種類のヌクレオシｙの
順列により７６種類が必要であるが、その合成法は、例
えば次のス中−ム２に示す方法によることができる。

ただし、ＤＭＴｒ　　は　４４／　、４／−ジメトキシ
トリチル基、Ｂ及びＢ’ｆｌＡ−Ｎ−ベンゾイルアデニ
ン−？−イル基、４４−Ｎ−ベンゾイルシトシン−／−
イル基１．！−Ｎ−イソープチリルグアニ／−９−イル
基、チミン−／−イル基から選ばれ、同−又は異っても
よい。ＭＳＮＴｆｌメジテレ／スルホニル−３−ニトロ
トリアゾリドを示す。

得うれた了−ヌクレオシド担体と各種ジヌクレオチドを
出発物質として、前記オリゴヌクレオチドを合成するが
、オリゴヌクレオチド（Ｕ８）の場合を例にして具体的
に述べる。

（ｄＡＡ心Ｕ飴必り“Ｔ−ｒＣ（ｕ８）の合成例）デオ
キシシチジン担体（前記ポリスチレン樹脂に担持したも
の）をピリジン中室温で放電後、次の操作にニジ反応を
行う。

／）デオキシシチジン担体をジクロロメタン−メタノー
ルで洗浄する。

コ）コチベンゼンスルホン酸（ジクロロメタン−メタノ
ール）溶液を加えた後、同じ溶媒で洗浄し、操作をくシ
返して発色の消えるまで行う。

３）ピリジンで洗浄後、ジヌクレオチドのぎりシン溶液
を加え、減圧溶媒留去し、更にメシチレンスルホニル−
３−ニトロトリアゾリド（縮合剤）のピリジン溶液を加
え放置した便、ピリジンで洗浄する。

’Ｉ）０．７Ｍジメチルアミノピリジン浴欣及び無水酢
酸を加えて放置後ビリジ／によシ洗浄する。

このような操作を、各ジヌクレオチドについて順次操り
返して７回行った後、樹脂を０．３Ｍトリメチルシリル
グアニジウム−ピリジ／−コーアルドオキシメート（Ｃ
，Ｂ、Ｒｅｅｒｅ　ｅｔ　ａｌ、。

ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ、、　　２７．１７　
（／　９　’Ｉｇ　）参照〕のジオキサン−水の溶液中
で振とりする。樹脂をピリジン−水で洗浄し、Ｆ液と洗
液を合わせて減圧濃縮し、残渣に濃アンモニア水を加え
、加温する。アンモニアを留去し、Ｄｏｗｅｘ　３０な
どのピリジニウム型樹脂を加え、樹脂をビリソンー水に
ニジ洗浄し、ＦＷと洗欣を合わせて濃縮する。濃縮液に
少量の水を加え酢酸エチルでオキシムを抽出除去する。

水層を一定量に布釈し、その７部を用いてジメトキシメ
チルトリチル基の足置を行って全体量を拓足する。

次いで、水層を減圧乾固し、残渣にｇθチ酢酸を加えた
後、溶媒留去し、残渣を水と酢酸エチルに溶解し、水層
を濃縮した後、ＤＥＡＥ−）ヨパ−ｈ　（Ｔｏｙｏｐｅ
ａｒｌ　）等を用いてイオン交換クロマトグラフィーを
行う。

適当な緩衝液中、食塩の濃度勾配で溶出し、Ｕ、Ｖ、吸
収によりオリゴヌクレオチドを検出した後、透析脱塩す
る。ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー：Ｃ１８シ
リカゲル相体）及び−次元ホモクロマトグラフィーで単
一であることにより純匿を判定する。

同様の操作全行って、Ｕ　−Ｕ　　　Ｌ　　−Ｌ１１′
）Ｌｌ１２　　′１　　　０ オリゴヌクレオチドを合成する。

コノようにして得られた各オリゴヌクレオチドを三群に
分け、！−酵累的リン酸化とＤ　Ｎ　Ａ　ＩＪガーゼに
よる結合反応を行う。

丁なわち、例えは（ｒ＝Ｐ）ＡＴＰをそれぞれのオリゴ
ヌクレオチド及びポリヌクレオチドキナ２ −ゼと共に、キナーゼ緩衝液中、３７℃でインキュベー
ションする。それから、ＡＴＰ及びキナーゼを加え、更
にインキュベーションを続ける。次いで加熱してキナー
ゼを不活性化する。

上記ｊ’−ＩＪン酸化した後、ＡＴＰ、メルカプトエタ
ノールの濃度を鯛節し、ＤＮＡリガーゼを加えて、３７
℃でインキュベーションする。反応停止後、生成したＤ
ＮＡ断片を、エタノールで沈殿させ、ダル電気泳動を行
って精製する。かくして、のフラグメンを得る。これら
の７２グメントを、再びＤ　Ｎ　Ａ　ＩＪガーゼを用い
て前記と同様に結合させて、本発明のヒト生長ホルモン
のカルがキシ末端遺伝子を得る。この反応では、制限酵
素Ｃ１ａｌｓＳａｌｌ　　を加えて行う。これは必要で
ない両末端部分の塩基配列を取り除くためである。以上
の反応は、第１図に示したように表わすことができる。

次に本発明の遺伝子発現に用いるベクタープラスミドに
ついて説明する。

３ クローニングに用いるベクターは、プラスミドｐＢＲ３
，２２のＥｃｏＲ１部位に、大腸菌のトリグトファ／−
オーＪｏン（ｔｒｐ　−ｏｐａｒｏｎ　）　　の７’ｅ
＋モーター−オペレーターＬ　−Ｅ　（ｐｒｏｍｏｔｏ
ｒ　−ｏｐｅｒａｔｏｒ−Ｌ−Ｅ　）の領域を含んでい
る約５００個の塩基対を通常のｐＢＲ３，２，２の表現
法において時計回り（ｃｌｏｃｋｗｌｓｅ　）方向に挿
入し、更に制限酵素ＢＡＬ　３　／でオイロンの下流側
挿入点よシ処理してｔ　ｒＤＥ　　のＳ、［）、部位（
リテソームが結合し易い部位）の後部に、制限酵素Ｃ１
ａ　ｌリンカ−（１ｉｎｋｅｒ　）を結合したものであ
る。この新規なベクタープラスミドを”　ｐＣＴ　／　
＠と呼称する。

このようなプラスミドｐＣＴ　／を有するようになった
菌株の代表例として、ニジエリチア・コリＣＴ／　（以
下、”　ＣＴ／株１と称する。）を挙げることができる
。

上記の宿主菌株１ｄ　Ｅ、　Ｃｏ１１　Ｋ　／　２の誘
導体ＫＭ７２３　（ｓｔｒ　ｈｌｓ　ｒｅｃ　Ａ／　　
ｓｕｐ＋ｇａｌ　”’）　（Ｊ。

Ｍｏ１．　Ｂｌｏｌ、　（／り７６　）１０２．１Ａ２
７−ＩＡ３？参照）であシ、菌学的性質において大腸菌
Ｅ。

Ｃｏ１１Ｋ１．２株と全く変シがない。上記ＣＴ／株は
、昭和Ｊ’７年！２月６日付にて工業技術院微生物工業
技術研究所に究託され、その受託番号は、微工研菌寄第
６ｒ７７号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−６１ｒ１７）である。

得られたｐＣＴｌグ２スミドを制限酵素Ｃ１ａｌ−５ａ
ｌＴ　　で切断し、前記合成したヒト生長ホルモンカル
がキシ末端遺伝子フラダメントを挿入すると、ヒト生長
ホルモンの３Ａ遺伝子の発現に有用な新規グラスミド　
　　　が得られる。この新規なプラスミドを”　、ＨＧ
ＨＣ／”と略称する。このようなシラスミド　ＨＧ　Ｈ
Ｃ／を有するようになった菌株の代表側としてニジエリ
シア・コリＨＧＨＣ／　（以下、記Ｅ、ｃｏｌｌに１２
株と全く変りがなく、昭和Ｓり年ｌコ月６日付にて、工
業技術院微生物工業技術研究所に寄託され、その受託番
号は、微工研菌第Ａ、！ｉ’／ＡＭ（ＦＥＲＭＰ−乙ｘ
ｉ乙）テアル。

以下に、これらのプラスミドを調製する方法にアン除去
又はインドールアクリル酸（［ＡＡ）添加によって誘導
され、強力にメツセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）合成を
開始する〇 （１）マす、このブロモ−ター領域を、既知のプラスミ
ドｐｔｒｐＥ　Ｃ５−／　（Ｇｅｎｅ　９　．２’７　
（／９１０）参照〕から、制限＃　累Ｈ１ｎｆ　ｌ−Ｈ
ｌｎｆ　Ｉ　Ｔ、約３ｏ。

塩基対をとシ出す（第２図参照）。

第２図にはｐｔｒｐＥ　Ｄ　５−　／のトリプトファン
プロモーター領域のみを示す。ｂ、ｐ、は塩基対を示す
。

（２）　　切り出した３θｏｂ、ｐ、の断片の両末端を
１１ＤＮＡポリメラーゼで修慣した後ＥｃｏＲＩ　　リ
ンカ−を介しプラスミドｐＢＲ３，２２（Ｇｅｎｅ　２
９３（／９７７））のＥｃｏＲｒ　　切断部に挿入する
（第３図参照）、 （３）　　次に第３図の■のＥｃｏＲ１部位のみを切断
し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで修復後、Ｔ４！ＤＮＡリ
ガーゼによシ接漸を行い、ＥｃｏＲＩで切断でをも欠失
させる。このようにして得られるグラスミドを”　ｐｏ
ｅＴ、２−９”と略称する。ｐｏｃＴコープは、’ｌ　
、　Ｊ　Ｋ、ｂ　（Ｋ　ｂａｓｅ　ｆ）ａｉｒ　）　　
ｆ有シ、細胞当りのコピー数は、ａＯ〜３０個／ｃｅｌ
ｌである（第９図参照）。

０部分の（２）から（３）の１）ＯＣＴ２−９を得る工
程は次のとおりである。

■のＥｃｏＲ１部位 一−−−−−ＧＡＡＴＴ　　　Ｃ−−−−−−−−−−
−ＣＴＴＡＡ（、−−−− −−−−−−−Ｇ　Ａ　Ａ　Ｔ　Ｔ　　　　ＡＡＴＴＣ
−−−−−−−−Ｇ　Ａ　Ａ　Ｔ　Ｔ　Ａ　Ａ　Ｔ　Ｔ
　Ｃ−−−−−−−−−−−−−ＣＴ　Ｔ　Ａ　Ａ　Ｔ
　Ｔ　Ａ　Ａ　Ｇ−−一−−（４）　　ｌ）　ＯＣ’ｒ
　２−９においてｔｒｐＥ遺伝子はアミノ酸をコード（
Ｃｏｄｅ）する領域の一部しか持たないので不完全であ
る。

■のｐＢＲ３２コベクターとの接続部をＥｃｏＲｌで切
断する。

次いで、制限酵素ＢＡＩＪ／で３０　ｂ、ｐを除去し、
除去し友部分に化学合成したＣ１ａｌ　　！Ｊンカー閉
棋する（第３図参照）。

ｐＣＴ／　シラスミドのマツ７’　（ｍａｐ　）を第６
図に示す。

以上のようにして得られるプラスミドｐＣＴ／　Ｆｉ、
マキサム＆ギルバート法（Ｍａｘａｍ　＆　Ｇｌ　１ｂ
ｅｒｔ　）法（ＰＮＡＳ　’７ｅ１．５−Ａｏ（／９”
７？））にｚって分析確認する。

得られたプラスミドｐＣＴ／の特長は、次のとおシであ
る。

＋）ｙ、３にｂ　を有し、コピー数はコ。〜３゜ｃｅｌ
ｌ　　である。

Ｉｆ）　　Ｃ１ａ１　部位Ｋ、Ａ　Ｔ　Ｇで始まるヌク
レオチド配列を有するＤＮＡ断片を組み込めば、ＡＴＧ
以下のコドンで指令されるたんはく合成を行う。

生成するたんはくに、単一のたんはくであり、ハイブリ
ッド（ｈｙｂｒｌｄ　）　　たんはくではない。

Ｈリ　その調節は、トリブトファンプロモーターによる
支配を受け、培地からトリプトファンの除去、又はＩＡ
Ａの添加によって強い形質発現ができる。

１リ　ｐＢＲ３２２プラスミド上に元来存在した非テト
ラサイクリン耐性（ＴｃＲ）遺伝子を除去するために、
ＥｃｏＲｌ−ＢａｍＨ１部位の間〔第３図のｐ部分〕を
欠失させる６従ってトリブトファンブロモ−ターからの
強い転写が時計回りの方向に進入してきてもテトラサイ
クリン遺伝子の最大発現による宿主へ悪影神がない。

■）アンピシリン耐性（ＡｐＲ）遺伝子は、そのま大腸
菌体内で安定に保持される。

（５）　　得られたグラスミドｐＣＴ／を、Ｃ１ａｌと
５ａｌｌで切断し、ここで、先に合成した頭部末端がＣ
１ａｌ構造、尾部が５ａｌｌ構造を有するヒト生長ホル
モンのカルゼキシ末端遺伝子断片を挿入し、ＤＮＡリガ
ーゼで接着すると、ヒト生長ホルモンのハ遺伝子の発現
に有用な新規プラスミド９ｐＨＧＨＣ／を得ることがで
きる（第７図参照）。

この１）ＨＧＨＣ／　　は、ダ≠　にｂ　を有し、２０
〜ＪＯ／ｃｅｌｌ　　のコピー数を有する。

次に、これらのプラスミドｐＣＴ／　　あるいはｐＨＧ
ＨＣ／を含む大腸菌を培養し、その培養物よりプラスミ
）”　ＤＮＡを調製する方法について具体的に説明する
。

ｌ）調製法全般について プラスミドＤＮＡを得るためにはできるだけそのＤＮＡ
含量の高い菌体から出発する。菌体を卦だやかに壊して
宿主染色体ＤＮＡ　？残し、細胞質内の物質をヌクレア
ーゼ活性を抑オた条件下で選択的に抽出してから混入す
る蛋白質、ＲＮＡを除去し、次に智主染色体ＤＮＡ断片
を主にＥＢ−ＣｓＣＩ　　遠心で除き、最後にオリゴヌ
クレオチＶなどを除くと分子生物学的実験に使用できる
標品が得られる。

２）培養 プラスミドを保持する大腸菌を例えばＰｅＢ（プリペプ
トンｉｏｇ、肉エキス／　０１　、ＮａＣｌユ、５ｆ、
必要ならイーストエキスニゲを加える；水／ｌ、ｐＨ７
，０）培地ｑ００耐に３７℃で通気培養する。、菌がコ
〜３　Ｘ　／　０８／耐まで生えたところでクロラムフ
ェニコールを最終濃度約７３０μｆ／ｗｔｌになる工う
に加え、そのまま３７Ｃでｇ〜／６時間培養する。集菌
後、数日内に処理するならば菌体をθ〜りＣて保存し、
そうでない場合には一７０℃で凍結保存する。

３）　　）Ｐｉ択抽出 培養液ｔｔｏｏｍｉから来めた菌体（０，５〜／　、、
Ｓｉ’ｆ）を約３０−のＴｒｉｓ−ＮａＣｌに懸濁し、
容１１４’　ＯＷｔｇの冷却遠心機用遠心管に移し、？
　＋　０　（７０ｒｌ）ｍ　％　７分間遠心して沈殿さ
せる。

／θｍｌのＴＥ−蔗糖を加えてＮ濁し、０．θ５耐ＲＮ
ａｓｅ　、　／　ｍｌリゾチームを混ぜ、０℃Ｓ分間放
置する。その後２罰〇〇、　Ｓ　Ｍ　ＥＤＴＡを加え、
さらに０℃、７０分間置く。この処理で懸濁液はやや粘
性をもつ、これに／乙？ａのＬｙｔｌＣＭｉＸｔｕｒｅ
を一気に加え、たたちに遠心管の口を閉じて容器を数回
反転して全体を均一にする。Ｉｔ　Ｍ　ｉは透明で粘性
をもった浴拍液となる。このまま０゜Ｃで／左分間程変
あるいはそれ以上放置後、ＯｏＣで／　５　、０００−
／　８　、０００　ｒｐｍ、　３０分間遠心する１、こ
れでプラスミドＤＮＡが含まれる上清とダル状になった
宿主染色体ＤＮＡや細胞表面物質が含まれる沈殿罠分か
れる。上清を静かに同じ大きさの遠心管に移す。液の重
さを計シ、比重／として体積に概算する。約３０ｔｔｔ
ｌのｃｌｅａｒｅｄ　Ｉｙｓａｔｅ　　がイｎられる。

ダ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）による濃縮お工
びＥＢ−ＣｓＣｌ平衡密度勾配遠心 ｃｌｅａｒｅｄ　１ｙｓａｔｅ　　にその７７１０重量
のＰＥＧ粉末および／／１０容惜の５Ｍ　ＮａＣｌを加
え、マグネチツクスクーラーで完全に溶解させる。マグ
ネットを取り除き０℃で３時間以上７晩程度放置した後
、／θ、θｏｏｒｐｍ、／θ分間遠心するとうす茶色の
粘稠な沈殿が得られる。上清には蛋白質とＲＮＡ断片の
大半が含まれているのでこれを傾けて捨てる。沈殿には
グラスミドＤＮＡが回収される。遠心管の口金下にして
斜めにねかして置き上滑をできるだけ除く、１１００−
培養の標準スケールから調製した場合、この沈殿を３　
ｔｒｔｌのＴＥによく溶かしスピンコのｌＯまたは３０
番の遠心管に移す。さらに少量のＴＥｉ加えて全体を正
確にｑ、り４１（比Ｎ／としてｑ、７乙祷）にする。こ
れに、！；、００９Ｃ５”　、０　、５　ｔｒｔｌ　Ｅ
Ｂ浴溶液加えよく混合する。

多量、たとえばｇｔの培養液から出発した場合、前記処
決に従って３０θｙｔｌのｃｌｅａｒｅｄ　Ｉｙｓａｔ
ｅを調製し、ＰＥＧ″″ｒ　ＤＮＡを沈殿させた段階で
いったんフェノール処理を施した方がよい。このために
沈殿を／３ｒｌｌのＴＥに溶かし、１０ｍ１の水飽和フ
ェノールを加えて乳化後、低速遠心してコ層に分ける。

上にくる水層を回収し、コ容のエタノールを加える。０
℃、２０分後１０．θＯＯｒｐｍで７０分間遠心し、上
清をよく除き（沈殿が流出しないように注意して倒立し
ておくか、あるいはデシケーメー内で脱気によりアルコ
ール分を除けばよい）、沈殿をワＷ１１のＴＥ−Ｓａｒ
ｋ−ｏｓｙｌ　　に工〈溶かし、さらに少量のＴＥ−３
ａｒｋ−ｏｓｙ　ｌ　　で９．！；：１１にｙＡ製する
。これにｌ０ｆＣｓＣ１、／　ＴＷｅＥＢ浴液を混ぜて
ユ本の遠心管で遠心する。

遠心は約コθ℃、３／、１０００「ｐｍで／ｇ〜３６時
間行なう。遠心後ブレーキを使わすに停止させ、遠心管
を静かに取り出す。ＥＢＯ色が遠心管の上部から底にか
けて薄くなっており密度勾配ができていることがわかる
。暗室でブラックランｆ（３乙Ｏｎｍ）で照らすと試料
の下から只の位置にプラスミドｃｃＤＮＡのバンド、上
カらｈの位置にＯＣおよび染色体断片のＤＮＡのバンド
が黄緑体に光って見える（／μＶのＤＮＡがあれば十分
検出できる）３．下のｃｃＤＮＡバンドを注意してなる
べく幅狭く回収する。

３））ｒ”Ａ−濾過法による除ＲＮＡ操作ＴＥＮ　（／
　ＯｍＭ　ＴｒｌＳ−塩酸緩衝液、／ｍＭＥＤＴＡ、　
０　、　／　Ｍ　ＮａＣｌ　、ｐｉｔり、４）Ｔ平衡化
シた５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ−ｌｌＢカラムＣＯ，Ｉ
！；ｘ、２０ｃｍ）を用意する。これＫＥＢ−ＣｓＣｌ
達心で得たｃｃＤＮＡ画分（０、３−０、ｇｒｒＪ）を
そのまま加え、ＴＥＮで自然流出法によりｒル濾過を行
なう。波長、２３ダｎｍにおける吸光度でモニターする
と約ｊ　ｙｔｅのｖｏｌｄ　ｖｏｌｕｎｅが流出したと
ころでＤＮＡ画分が出、遅れてＲＮＡ画分、さらに続い
て、ＥＢ　−？　ＣｓＣｌが出てくる。ＤＮＡ画分に相
当する最初のピークを集めてＴＥ　　に透析するかエタ
ノール沈殿で濃縮するとともにエチジウムブロマイドを
除く。これでプラスミドＤＮＡはほぼ純粋なものとして
扱うことができる。

以下に、本発明を実施例により説明するが、本発明は何
らこれらに限定されるものではない。

実施例／（オリゴヌクレオチド”ａ　””　”１２　、
’＠〜Ｌ＋＋の合成） オリゴヌクレオチドの合成例 ｄ晶醪Ｕ肪仏虹ＴＴＣ（Ｕ８）の合成 次のような操作により縮合反応を行う。用いるジヌクレ
オチドは各コＯＷｌである。最初に用いるのはこの場合
チミジンジヌクレオチド（スキームコ、Ｖｉｌｌ、Ｂ＝
チミン−／−イル）である。！方向に順次鎖を延長する
。

ｍ作／）ジクロロメタン−メタノール（’Ｉ：３、ｖ７
ｖ　）　２ｔｔｔ／、に工り３回洗滌。

λ）コチベンゼンスルホン酸（ジクロロメタン−メチル
アルコール、クー３）浴ｇ、２ｍｌとコ分間処理した後
、同じ混合溶媒で３回洗滌する操作を繰返して発色のな
くなることを確める。

３）ピリジン２１により３回洗滌。

ダ）ジヌクレオチドのピリジン酢液（０，／〜０、．２
ｍ／）を加え溶媒を減圧留去する。

ｓ）　　縮合剤、メシチレンスルホ；ルー３−ニトロト
リアゾリド（コＯｖｙ　）のピリジン＃液（０，２〜０
．３ｍ１）を加え５０分放置する。

６）ビリジンツ罰にエリコ回洗滌。

７）０．１Ｍツメチルアミノピリジンのピリジン溶液（
／０ｇＩＩＬｌ）オよび無水酢ｆｆＪ４（０，，２Ｗｔ
ｌ）を加え１０分間放置する。

ｇ）ピリジ／２罰により３凹洗滌。

以上の操作を各ジヌクレオチドＶＣついて計７回行った
後、樹脂”；ｚｏ、３Ｍト＋）メチルグアニジウムービ
リジンーコブアルドオキシメート（Ｃ，Ｂ。

Ｒｅｅｒｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｎ　
Ｌｅｔｔ、、　、２７．２７（／９７ｇ））のジオキサ
ン−水（７二／）の溶液（／　ｒｔｔｌ　）中３ｇ時間
振とりする。樹脂”＋ｓｏ％ピリジン水により洗滌しＦ
＃と洗液を合せて減圧濃縮し、残渣に濃アンモニア水Ｃ
／５ｔｘｌ）を加え密栓してＳＳＣでＳ時間加温する。

アンモニアを留去し、Ｄｏｗｅｘ　５０ピリジニウム型
樹脂（コブ）を加え、樹脂を５０チビリジン水により洗
滌し、Ｆ液と洸准を合せて濃縮する。＃線数に少量の水
を加え酢酸エチルでオキシムを抽出して除く。水層を一
定量に希釈し、その一部を用いてジメトキシトリチル基
の定量を行い全体の量を推定する。ジメトキシトリチル
基の分子吸光係数ｅ　７／　、　７００とすると７’７
．ｌｌＡユニットから／、θｇμｍｏｌの阻オリゴヌク
レオチドが合成されたことがわかる。

水層を減圧乾固し炊渣にｇｏ％酢酸１０ｍ１を加えコ３
℃、３０分曲保った恢溶媒を留去し、残渣を水と酢酸エ
チルに浴解し、水層を濃縮した後、イオン変換クロマト
グラフィーにかける一イオン交１婁体はＤＥＡＥ−Ｔｏ
ｙｏｐｅａｒｌ　ｌ＞　３０　ｓを用いる。カラム（θ
、’７×２／ｃｍ）につめ７Ｍ尿素１．ｌ　Ｑ　ｒｎＭ
トリス−塩酸縁（ＩＩＴ？代（ｐＨ’７　、　、ｔ　）
中、Ｏ０／〜０．３Ｍの食塩＃度勾配で溶出する。紫外
線吸収によりオリゴヌクレオチドを検出し、中央部をと
りセルロース膜を用いて透析に工り脱塩し、／、２．３
Ａ２６０　　ユニットヲ得る。ＨＰＬＣ（Ｃ，８シリカ
ダル担体）および−次元ホモクロマトグラフィーで単一
であることにエリ純度を判別する。ＨＰＬＣにおけるリ
テンションタイムはｄＡＡＡＧＴＴＧＡＡＡＣＴＴＴＣ
（Ｕ８）の場合は１１７分である。ホモクロマトグラフ
イーノＲｆ　値（Ｒｍ　：色票マーカー、ブロムフェノ
ールブルーの動きに対する相対値）Ｆ′ｉ、０．ｓ／で
ある。

展開浴ｍｕホモミックスＴ　（Ｅ、Ｊａｙ　ｅｔ　ａｌ
、。

ＮｕＨｌｅｌｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　／　、３３
　／　（／　９７　ＩＩ　）　）を使用した。

同様な反応を行ってＵ。−Ｕ１２　（Ｕ５　ｆ＃、＜　
）、Ｌｏ〜１−１．に相当てるオリゴヌクレオチドを合
成した。

ｔＪ　−ＩＪ　　　Ｌ　　−Ｌ　　のリテンションタイ
ムと０　　　　　　１２％　　　　　０　　　　　　１
１Ｒｆ　　値を第１表に示す。

実施例２オリゴヌクレオチドのｙ−酵素的リン酸化とＤ
ＮＡリガーゼによる結合反応 実施例／で得られたオリがヌクレオチドを群に分けて、
それぞれの群につき次の反応を行った。

２００−ｒイクロキユーリ−の（ｒ−３２Ｐ　）　Ａ　
Ｔ　Ｐ（χ’７　Ｑ　００　Ｃ１／ｆｎｍｏｌ　、　Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ　）　オリゴヌク緩衝液（５０ｍＭトリ
ス−＋ｃｚ　％　ｐＨｇ　−０／　／　ＯｍＭＭｇｃｔ
２／　／　ＯｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）／　：
ｌ　ｍ　Ｍスペルミジン１０　、　／　Ｍにａｔ）に溶
解したものを混合し、３７℃で２０分間インキュベート
した。それからＡＴＰ（７７ナノモル）と７９キナーゼ
（／Ｕ）を加え、更に７時間反応させた。

９０℃、Ｓ分間加熱して、キナーゼを失活させた。

暑■■１−■置■■■■■■■■欄■■■傭■−一■■
■これらのフラグメントをアニールするため、透析した
反応混合物を、ＤＴＴを除いた１１ｇａｔｌｏｎ　　ｂ
ｕｆｆｅｒ　　（６６ｍ　　Ｍ　　）　　リ　ス　−　
Ｈα　、　　ｐｎ７、乙／ム乙ｍＭＡＩ５α２／　／　
Ｏｍ　Ｍ　ＤＴＴ　／　０．３　ｍ　ＭＡＴＰ　）中で
、７０℃で２分間加熱し、それからゆっくり室温まで冷
却した。次にＡＴＰとＤＴＴを、それぞれθ４ｔｍＭと
１０ｍＭの濃度で反応混合液に加えた。反応混合液７３
℃に冷却稜、Ｔ４ｔＤＮＡリガーゼ（全酒造■製）１．
２Ｕ）を加え、７５時間同じ温度でインキエペートした
。乙！℃で５分間加熱して反応を停止した。ＤＮＡの７
２グメントをエタノールで沈殿させ、７０％アクリルア
ミドダル電気泳動に付し、その後、グルから抽出を行っ
て精製した。

それぞれ相当する７２グメントが、７２μり（１群）、
′７．２μｇ（１群）、７２μｇ（１群）得られた。た
だし、蓋群の７ラグメントについては、沈殿により精製
品が得られたので、電気泳動は行わなかった。

実施例３ 実施例コで得られたフラグメント（１）　３．ｚμす、
（Ｉ）　３．６μ２及び（船Ｚ２μりを用い、実施例２
と同様にリン酸化反応、結合反応を行った後、制限酵素
Ｃ１ａｌ　　（ヘ−リンガ−・マンハイム社梨）≠ｊユ
ニットを加えて、３７℃で６時間インキエベートした。

次いで、制限酵素５ａｌｌ　　（全酒造（株）製）／２
０−＝ット、ＮａＣｔ／　３　、ｔ　ｍＭ、　Ｄ　Ｔ　
Ｔ　ｊ　ｍＭを加えて３７℃で／ざ時間インキエペート
し、反応停止後、ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、５％
ポリアクリルアミドダル電気泳動に付し、その後グルか
ら抽出を行って精製した。この結果、第１図に示す本発
明のヒト生長ホルモンカル？キシ末端遺伝子Ｏ，Ｓμリ
　を得た。

４ 実施例ｑ （ａ）培養 前記ＣＴ／株（微工研菌寄第Ａｉｒ／７号）をＰＢＢ（
ポリペプトン１０ｆ１肉エキス／　Ｏｆ。

’ＮａＣｌ　　２．！；ｆ、会費ならイーストエキス、
ｉｆを加える；水／　ｔＳｐｉ（’７−０　）培地ａＯ
Ｏ−に３りＣで通気培養する。蘭が一〜！Ｓ×ＩＯ１１
７ｍｌまで生えたところでクロラムフエニコールヲ最終
濃度約／３０μｒ／Ｗｔｌになるように加え、そのまま
３７℃でｇ〜７６時間培養する。

（ｂ）抽出 培讐液４’　００　ｔｘｌから果めた菌体＜Ｏ，Ｓ〜／
、３ｔ）を約３０ｍ／のＴｒｌｓ−ＮａＣＩに懸濁し、
容量ｑＯ−の冷却遠心機用遠心管に移し、７ｍ０００ｒ
−１７分間遠心して沈殿させる。

１０ｒｄのＴＥ−蔗糖を加えて懸濁し、Ｏ，θ５１ＲＮ
ａｓｅ　、　　／　ｍｌリゾチームを混ぜ、ＯＣ，を分
間放置する。その後２ｔｄ（１’）０　、　、Ｓ−Ｍ　
ＥＯＴＡを加え、５ さらに０℃、７０分間置く。この処理で懸濁液はやや粘
性をもつ。これに１６ｍＭのＬｙｔｉｃＭｉｘｔｕｒｅ
を一気に加え、ただちに遠心管の口を閉じて容器を数回
反転して全体を均一にする。

懸濁液は透明で粘性をもつ７′Ｉ：、溶菌液となる。こ
のまま０℃で７．１分間程度あるいはそれ以上放置後、
０℃で／　！ｒ　、　０００−／　ｇ　、　０００　ｒ
ｐｍ。

３０分間遠心する。これでプラスミドＤＮＡが含まれる
上滑とダル状になつ友宿主染色体ＤＮＡや細胞表面物質
が含まれる沈殿に分かれる。上清を静かに同じ大きさの
遠心管に移す。液の重、さを計り、比重／として体積に
概算する。約３０−のｃｌｅａｒｅｄ　＋ｙｓａｔｅ　
　が得られる。

用いた試薬は、それぞれ次のものを示す。

Ｔｒｉｓ−ＮａＣＩ　：　１０ｍＭ　Ｔｒｌｓ−塩酸緩
衝液、ｏ、ｉダＭ　ＮａＣｌ、ｐＨｇ。

ＴＥ−蔗糖：２３ｆｂ蔗糖（ｗ／ｖ　）、５０ｍＭＴｒ
ｌｓ−塩酸緩衝液、／　ｍＭ　ＥＤＴＡ　。

ｐｉｌ　ｇ。

リゾチーム：１０可／　ｍｌリゾチーム、θ、コ、Ｓ−
ＭＴｒｌｓ−塩酸緩衝液、ｐＨｇ。

Ｏ０耀ＥＤＴＡ　　：　ｐＨｇ。

ＲＮａｓｅ　：　０　、　Ｉｌｌ　Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ５
に１０ｎｙ／１の製置に浴かし、１０ＯＣで５分間 加熱処理する。

Ｌｙｔｉｃ　Ｍｉｘｔｕｒｅ　：θ、　／　％　Ｔｒｌ
ｔｏｎ　Ｘ−／　００゜！ｒ　ＯｍＭ　Ｔｒｌｓ−塩酸
緩衝液、ｉｓ　２　、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨｇ０（
Ｃ）／リエチレンダリコール（ＰＥＧ）による濃縮およ
びＥＢ−Ｃ５ＣＩ平衡密度勾配遠心ｃｌｅａｒｅｄ　１
ｙｓａｔｅ　　Ｋそのへ重量のＰＥＧ粉末およびへ容量
の！；　Ｍ　ＮａＣｌ　　を加え、マグネチックスター
ラーで完全に溶解させる。マグネットを取勺除きＯＣで
３時間以上／晩程度放置した後、１０．０θＯｒｌ）ｍ
、％／　０分間遠心ｆるとぅす茶色の粘稠な沈殿が得ら
れる。上滑には蛋白質とＲＮＡ断片の大半が含まれてい
るのでこれを傾けて捨てる。沈殿ＫｔｌｊグラスミドＤ
ＮＡが回収される。遠心管の口を下にして斜めＫねがし
て置き上清をできるだけ除く、ダｏｏｄ培養の標準スケ
ールから調製した場合、この沈殿を３＊ｌのＴＥによく
浴かしスピンコのＩＩ−Ｑまたは５０番の遠心管に移丁
。さらに少量のＴＥを加えて全体を正確にｔ。７４？（
比重／としてダ、りＡ　ｍｅ　）にする。これに５　、
０　Ｏｒ　ＣｌＣｌ、０．３ｔｔｔｔＥＢ溶液を加えよ
く混合する。多量、たとえはｇｔの培養液から出発した
場合、前記処決に従って３００ｍ１のｃｌｅａｒｅｄ　
１ｙｓａｔｅ　　を調製し、ＰＥＧでＤＮＡを沈殿させ
た段階でいったんフェノール処理を施した万がよい。こ
のために沈殿を／５ｒｎｅのＴＥＫ溶かし、１０ｙｎｌ
の水飽和フェノールを加えて乳化後、低速遠心してコ層
に分ける。上にくる水層を回収し、コ容のエタノールを
加える。０℃、２０分後ｉｏ、ｏｏ。

ｒｐｍで７０分間遠心し、上清をよく除き（沈殿が流出
しないように注意して倒立しておくか、あるいはデシケ
ータ−内で脱気によりアルコール分を除けばよい）、沈
殿をｑｄのＴヒ５ａｒｋｏｓｙｌによく溶かし、さらに
少量のＴＥ−３ａｒｋｏｓｙｌで９、、Ｓ−，２ｒＫｖ
＠整ｊる。これＫ　／　Ｏｆ　ＣｓＣ１、８ ／　ｍｅ　Ｅ　Ｂ浴液を混ぜてコ本の遠心管で遠心する
。

遠心は約、２０℃、ａｔ、、０００ｒｐｍ’Ｃ／ｇ　〜
３６時間行なう。遠心後ブレーキを使わすに停止させ、
遠心管を静かに取り出す。ＥＢＯ色が遠心管の上部から
底にかけて薄くなっており密度勾配ができていることが
わかる。暗室でブラックランフ″（３乙θｎｒｎ）で照
らすと試料の下から只の位置にグラスミドｃｃＤＮＡの
バンド、上から只の位置にＯｅ　　および染色体断片の
ＤＮＡのバンドが黄緑体に光って許、える（／μ２のＤ
ＮＡがあれば十分検出できる）。下のｃｃＤＮＡ　／？
ンドを注意してなるべく幅狭く回収する。

用いた試薬は、それぞれ、次のものを示す。

ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）乙ｏｏｏ：ｉ級の粉
末でよい１、 ！；　Ｍ　ＮａＣｌ　、ＣｓＣｌ固体。

ＥＢ浴溶液エチジウムブロマイドを水に対してｑ、４７
■／　ｍｅになるよう溶解し、光をさえぎったビンに入
れ１ＩｔＣで保存。

ｉ Ｔ　Ｅ　　：　　／　ＯｍＭＴｒｉｓ−塩酸緩衝ｉ、　
／ｍＭＥＤＴＡ、　　　ｐＨ７、Ｑｏ ＴＥ−ｓａｒｋｏｓｙｌ　：　／　ＯｍＭ　Ｔｒｉｓ−
塩酸緩衝液、７ｍＭ　ＥＤＴＡ、　　０　．３　＆％Ｓ
ｏｄｉｕｍ　Ｎ−Ｌａｕｒｏｙｌ　　５ａｒｋｏｓｉｎ
ａｔｅ　、ｐＨ７，４（０（ｄ）グル濾過法による除Ｒ
ＮＡ操作 Ｔ　Ｅ　Ｎ　（／　ＯｍＭＴｒｉｓ−塩酸緩ｉ液、／ｍ
ＭＥＤＴＡ、０　、／ＭＮａＣＩ、ｐＨ７，４りで平衡
化した５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ−４Ｂカラム（０、ｇ
　ｘ　２０ｃｒｒＬ）を用意する。これにＥＢ−ＣｓＣ
Ｉ遠心で得たｃｃＤＮＡ画分（０，５〜）、ｇｌｌｌ）
をそのまま加え、ＴＥＮで自然流出法にニジダル濾過を
行なう。

波長、７．３１１　ｎｒｎにおける吸光度でモニターす
ると約５ｆｆｉｌのｖｏｉｄ　ｖｏｌｕｍｅが流出した
ところでＤＮＡ画分が出、遅れてＲＮＡ画分、さらに続
いてＥＢやＣｓＣＩ　　が出てくる。ＤＮＡ画分に相当
する最初のピークを来めてＴＥＫ透析するかエタノール
沈殿で濃縮するとともにエチジウムブロマイドを除くと
約１００μＶのプラスミドｐｃＴｌ　　が得られた。

実施例ｊ 前記ＨＧ　ＨＣ／　株（Ｉｉ＆工研−１ｆ／ＩＩ寄ｍｌ
、Ｉ／ｌ、号）を、実施例３と同様に培養及び後処理を
行って、プラスミドｐＨＧＨＣ／を約／θ０μを得た。

【図面の簡単な説明】

第７図は、ヒト生長ホルモンカルブキシ末端遺伝子の合
成経路を示す概略説明図であり、第２図は、プラスミド
ｐｔｒｐＥＤ５−　／のトリブトファンプロモーター領
域から切り出される約３００の塩基対を示す模式図であ
り、第３図は切り出された３００の塩基対を、リンカ−
を介してグラスミドｐＢＲ３，２２のＥｃｏＲｌ切断部
に挿入した状態を示す模式図であり、第９図は、グラス
ミドｐＯｃＴコー９の模式図であり、第Ｓ図１はプラス
ミ、ドｐＯｃＴ、２−９からプラスミドｐＣＴ／　　’
（ｉｌ−合成する経路を示す模式図、■は■部分の拡大
詳細図、■は０部分の拡大詳細図であり、第６図１はプ
ラスミドｐＣＴ／のマツプを示し、■は０部分の拡大詳
細図であり、第７図はプラスミドｐＣＴ／　　からグラ
スミドｐＨＧＨＣ／を合成する経路を示す模式図である
。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）デオキシグアノシン、デオキシシチジン、デオキ
   シアデノシン及びチミジンのそれぞれの了−エステルか
   ら選ばれる／ｍと、一般式：（ただし、式中、Ｂ及びＢ
   ′は、Ａ−Ｎ−ベンゾイルアデニン−９−イル、４−Ｎ
   −ベンゾイルシトシン−／−イル、２−Ｎ−インブチリ
   １ルグアニンーワーイル、チミン−／−イル基を示し、
   同−又は異っていてもよい。） で表わされるジヌクレオシドを固相法により順次縮合さ
   せて得られるフラグメント群を、Ｓ′−酵素的リン酸化
   とＤＮＡリガーゼによる結合反応を行うことを特徴とす
   る塩基配列：