KR100502116B1 - 약제성 플라스미드 디엔에이의 정제 - Google Patents

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Abstract

한 단계 이상의 하이드록시아파티트 컬럼 크로마토그래피에 의한 약제성 플라스미드 DNA의 정제방법에 관해 기재.

Description

약제성 플라스미드 디엔에이의 정제
본 발명은 신규의 DNA 정제방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 공정은 약리학적으로 이용 가능한 이본쇄 DNA가 빠르게 정제될 수 있게끔 해준다. 좀더 상세하게는, 본 발명에 따른 정제 공정은 단지 투석여과(diafiltration) 및 크로마토그래피 단계와 관련된다.
유전자 및 세포 치료 기술은 현재 비정상적인 증식 속도를 경험하고 있다. 그럼에도 불구하고, 이러한 기술은 상당량의 약리학적 순도의 DNA, 특히 플라스미드 DNA의 생성 가능성과 관련된다. 사실, 이러한 신규 치료법에서는, 약학적으로 종종 DNA 자체를 구성하고, 이는 이러한 DNA를 적당한 양으로 제조하고 분리하며 인간에게 치료적인 용도, 특히 정맥 경로를 통한 적절한 방법으로 정제될 수 있음이 필수적이다.
이러한 양 및 순도의 문제는 종래의 DNA 분리 기술에서는 고려되고 있지 않다. 그 결과, 약제 산업에서 플라스미드 DNA를 정제하기 위해 실험실에서 사용된 방법은 적용될 수 없다. 이러한 실험실법 중 두가지는 가장 흔히 사용되고 최상의 결과를 제공하는 것들이다. 이들은 조(crude) 박테리아 용해질로 개시하고 오염물을 가능한 최대량 제거하여 이를 플라스미드 DNA에 보강하는 것으로 구성된다. 특히, 계란 흰자의 라이소자임을 이용하여 박테리아 벽을 파괴한 후 이 용해질을 원심분리시켜 세포 파편을 제거한다. 상등액에 동물 기원의 췌장 RNase를 작용시켜, RNA를 제거하는데, 이 시기는 존재하는 핵산이 대략 75%임을 나타낸다.
단백질을 페놀/클로로포름/이소아밀 알콜 혼합물로 침전시킨다. 하기 원심분리에서 수득되는 상등액에서 단백질 및 RNA가 제거되지만 다량의 염색체 DNA는 여전히 함유하게 되는데, 이는 추가 단계 동안 제거될 필요가 있다. 이 단계는 에티디움 브로마이드 및 세슘 클로라이드의 존재하에 초원심분리로 이루어진다. 세가지 유형의 핵산, 염색체 DNA, 플라스미드 DNA 및 RNA는 에티디움 브로마이드와 결합하는 능력에 있어 차이가 난다. 그 결과, 이들은 세슘 클로라이드 구배상의 초원심분리 동안 세가지 뚜렷한 상으로 나뉘어진다.
이러한 프로토콜의 변형은 알칼리 세제 존재하의 감소와 함께 췌장 RNase의 작용에 이어, 페놀/클로로포름을 이용한 추출로 구성된다. DNA를 에탄올을 이용해 침전시키고, 재현탁시킨 다음 폴리에틸렌 글리콜로 재침전시킨다.
그러나, 플라스미드 DNA 용액을 얻는 이러한 두가지 방법은 약제 순도의 산물의 산업적 생산에는 이용될 수 없다. 따라서, 동물 기원 효소의 이용은 한가지 문제에 놓이게 된다. 이러한 기원으로 인해, 라이소자임 및 췌장 RNase 모두는 바이러스 오염물을 최종 산물로 도입하게 되는 위험을 내포하게 된다. 또한, 유기 용매는 극도로 독성이 있으며 산물을 약학적으로 이용하길 원한다면 제거될 필요가 있다. 이러한 용매는 또한 특히, 저장, 최대 안전성 조건하에서의 사용 및 이들이 야기하는 독성 폐기물의 제거와 관련되고, 또한 최종 용액으로부터 이러한 산물의 완전한 제거에 대한 성공적인 입증에 직면한 어려움으로 인해, 가격에 있어 상당한 증가를 야기한다. 에티디움 브로마이드의 경우, 독성이 있고, 돌연변이 유발성이며 배자기형발생적이어서 비록 소량이 존재하더라도, 약제용으로 의도된 산물을 받아들일 수 없다. 용매, 독성 시약 및 동물 기원 효소의 사용은 우수한 제조 실시에 따르는 산업 공정에는 적합하지 못하다.
본 발명은 DNA 정제를 위한 단순하면서, 특히 효율적인 신규 공정에 관해 기술하고 있다. 본 출원에서 기술된 공정은 고 순도의 DNA가 다량으로 생성 가능하게 해준다. 특히 유리하게도, 본 출원에서 기술된 공정은 독성 유기 용매 및 동물 기원 효소의 사용을 피할 수 있게끔 해준다. 이는 또한 특히, PEG, 암모늄 아세테이트 또는 CaCl2를 사용하는 침전 단계로 인한, 추정이 어렵고 수율이 낮은 수차례의 지루한 원심분리를 필요 없게 해준다. 본 발명에 따른 공정은 또한 특정 기술적 어려움없이 다량의 DNA(100 mg, 1 g, 10 g또는 그 이상)가 단일 뱃치에서 수득될 수 있게끔 해준다. 또한, 본 발명에 따른 공정은 우수한 제조 실시에 적합하고 약학 특성의 DNA를 수득 가능하게 하는 방법과 관련된다.
본 발명은 우선, 이본쇄 DNA의 정제공정과 관련되고, 이 공정은 다량의 약제순도의 플라스미드 DNA가 매우 빠르게 수득될 수 있게끔 해주며 세라믹 형태인 하이드록시아파티트 컬럼상의 크로마토그래피 단계와 관련된다. 결정 형태의 하이드록시아파티트에 관해 이미 밝혀져 있지만, 이러한 하이드록시아파티트는 부서지기 쉬워 사용이 어렵고 제한적이다. 세라믹 형태는 물리적 및 화학적 모두에 좀더 저항적이다.
바람직하게는, 본 발명의 공정은 두가지 크로마토그래피 단계를 포함하는데, 이 중 적어도 하나는 하이드록시아파티트상의 크로마토그래피 단계이다.
유리하게도, 제 2 크로마토그래피 단계는 친화성 크로마토그래피 또는 이온 교환 크로마토그래피 단계이다. 두 크로마토그래피 단계를 수행하는 순서는 중요하지 않다.
한가지 특히 바람직한 양태에 따라, 본 발명에 따른 공정은 하이드록시아파티트 컬럼상의 크로마토그래피 단계 및 삼중-나선 친화성 크로마토그래피 단계를 포함한다. 삼중-나선 친화성 크로마토그래피는 하이브리드화에 위해, DNA에 존재하는 특정 서열과 삼중 나선을 형성할 수 있는 올리고누클레오티드와 공유결합된 지지체의 사용에 기본한다. 이 두 크로마토그래피 단계를 수행하는 순서는 중요하지 않다.
또다른 양태에 따라, 본 발명의 공정은 한 단계의 하이드록시아파티트 컬럼상의 크로마토그래피 및 한 단계의 이온 교환 크로마토그래피를 포함한다.
유리하게도, 본 발명의 공정은 추가로 투석여과 단계를 포함한다. 후자는 일반적으로 크로마토그래피 단계 이전에 수행된다.
본 발명의 공정에서 중요한 단계는 하이드록시아파티트 컬럼상의 크로마토그래피와 관련된다.
하이드록시아파티트는 10개의 칼슘 원자를 포함하는 복합 칼슘 포스페이트이다. 결정 형태보다 좀더 안정한 세라믹 형태는 Bio-Rad Laboratories 및 Asshi Optical Co., Ltd에서 개발되었다. 세라믹 화합물은 후자의 물리적 제한없이 결정 화합물과 동일한 특성을 지닌다; 이러한 물질은 특히 단백질 정제용 크로마토그래피에서 사용되지만, 이는 핵산 정제시에 이점을 제공하고 매우 우수한 결과가 얻어지게끔 해준다. 이는 다공성, 구형이고 화학적 및 물리적으로 안정하며 수회에 걸쳐 효율의 손실없이 재이용될 수 있다. 이러한 세라믹 형태는 고압, 매우 높은 pH값, 매우 빠른 유동 및 유기 용매에 잘 견딜 수 있다.
세라믹 하이드록시아파티트 컬럼상의 크로마토그래피는 엄격하게는 친화성 크로마토그래피도 이온 교환 크로마토그래피도 아닌 특별한 유형의 크로마토그래피이다. 이는 이러한 특성을 이러한 두가지 유형의 크로마토그래피에 부여하고 슈도 친화성 크로마토그래피 및 슈도 이온 교환 크로마토그래피로 정의될 수 있다.
핵산은 폴리누클레오티드 골격의 포스페이트 그룹과 지지체의 칼습 잔기간의 상호작용에 의해 하이드록시아파티트에 결합한다. 핵산은 포스페이트 완충액의 이온 강도를 변화시켜 차별적으로 용출될 수 있다. 핵산은 단백질로부터 분리될 수 있고 이들 중, DNA는 RNA로부터 분리될 수 있으며 일본쇄 DNA는 이본쇄 DNA에서 분리될 수 있다. RNA는 적어도 굳게 결합하고 비교적 낮은 이온 강도의 완충액으로 용출될 수 있는 핵산이다. 일본쇄 DNA는 또한 이본쇄 DNA보다 좀더 덜 강하게 결합되어 있으며, 지지체에 좀더 강하게 결합하고 좀더 강한 완충액을 요구한다.
약한 이온 강도의 포스페이트 완충액에서, 생물성 물질을 컬럼상에 로딩한다. DNA 및 RNA 핵산이 결합된다. 보다 높은 이온 강도의 제 2 완충액을 이용하여 RNA를 용출하는데, 이는 이 단계에서 거의 완전히 제거된다. 보다 강한 이온 강도의 제 3 완충액을 사용하여 이본쇄 DNA를 용출시켜 모은다. 본 발명 공정에서 하이드록시아파티트의 사용은 매우 높은 수준의 순도를 지닌 이본쇄 DNA를 회수 가능하게 해준다.
앞서 지적했듯이, 본 발명의 바람직한 양태는 추가로 삼중 나선 친화성 크로마토그래피 단계를 포함한다.
삼중-나선 친화성 크로마토그래피는 하이브리드화에 의해, 정제될 DNA에 존재하는 특성 서열과 삼중 나선을 형성할 수 있는 올리고누클레오티드와 공유 결합된 지지체상에 수득된 용액을 통과시키는 것으로 구성된다(WO 96/18744).
특정 서열은 본래 이본쇄 DNA에 존재하는 서열 또는 이러한 이본쇄 DNA에 인위적으로 도입된 합성 서열일 수 있다. 본 발명에 사용되는 올리고누클레오티드는 이본쇄 DNA와 직접 하이브리드화되는 누클레오티드이다. 이러한 올리고누클레오티드는 하기의 염기를 포함할 수 있다:
- 티미딘 (T), 이본쇄 DNA의 AT 이중선과 삼중선을 형성할 수 있음[참조문헌: Rajagopal et al., Biochem 28 (1989) 7859].
- 아데닌 (A), 이본쇄 DNA의 AT 이중선과 삼중선을 형성할 수 있음.
- 구아닌 (G), 이본쇄 DNA의 GC 이중선과 삼중선을 형성할 수 있음.
- 양자화된 사이토신 (C+), 이본쇄 DNA의 GC 이중선과 삼중선을 형성할 수 있음[참조문헌: Rajagopal et al., loc. cit.].
- 유라실 (U), 염기쌍 AU 또는 AT와 삼중선을 형성할 수 있음.
바람직하게는, 사용된 올리고누클레오티드는 사이토신이-풍부한 호모피리미딘 서열을 포함하고 DNA에 존재하는 특정 서열은 호모퓨린/호모피리미딘 서열이다. 사이토신의 존재는 산성 pH에서 안정하고 - 이 경우 사이토신은 양자화됨-, 알칼리성 pH에서 불안정한 - 이 경우 사이토신은 중화됨-삼중 나선을 가질 수 있다.
하이브리드화에 의해 형성된 삼중 나선의 경우, DNA에 존재하는 올리고누클레오티드 및 특정 서열은 상보적인 것이 중요하다. 이 경우, 서로에 완전히 상보적인 올리고누클레오티드 및 특정 서열이 본 발명 공정에 이용되는데 이는 최상의 수율 및 상당한 정도의 선택성을 얻기 위함이다. 올리고누클레오티드는 특히 폴리-CTT 올리고뉴크레오타이드일 수 있고 특정 서열은 폴리-GAA 특정 서열일 수 있다. 서열 5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3'(GAGG(CTT)7)을 가진 올리고뉴크레오타이드; (서열 번호. 1), 여기서 염기 GAGG는 삼중 나선을 형성하지 않지만 올리고 뉴클레오티드는 커플링 아암에서 일정한 간격을 두고 있으며, 이는 실시예에 의해 언급될 수 있다. 서열 (CTT)7 (서열 번호: 2)도 또한 언급될 수 있다. 이러한 올리고누클레오티드는 상보성 모티브(GAA)를 포함하는 특정 서열과 함께 삼중 나선을 형성할 수 있다. 특정 서열은 특히, 실시예에서 나타내듯이, 7, 14 또는 17GAA 모티브를 포함하는 영역일 수 있다.
또다른 관련 특정 서열은 하기 서열이다:
5'-AAGGGAGGGAGGAGAGGAA-3' (서열 번호: 3)
이 서열은 올리고누클레오티드
5'-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3'(서열 번호: 4) 또는
5'-TTGGTGTGGTGGGTGGGTT-3'(서열 번호: 5)와 삼중 나선을 형성한다.
이 경우, 올리고누클레오티드는 폴리퓨린 가닥에 역평행 방향으로 결합한다. 이러한 삼중 나선은 단지 Mg2+의 존재하에 안정하다[참조문헌: Vasquez et al., Biochemistry, 1995, 34, 7243-7251; Beal and Dervan, Science, 1991, 251, 1360-1363].
앞서 지적했듯이, 특정 서열은 본래 이본쇄 DNA에 존재하는 서열이거나 이러한 이본쇄 DNA에 인위적으로 도입된 합성 서열일 수 있다. 이본쇄 DNA, 예를 들면 플라스미드의 복제 기원 또는 표지 유전자에 본래부터 존재하는 서열과 삼중 나선을 형성할 수 있는 올리고누클레오티드를 사용하는 것이 특히 유리하다. 이를 고려하여, 본 출원인은 플라스미드상에서 서열 분석을 수행했고 이러한 DNA의 특정영역, 특히 복제 기원에서 호모퓨린/호모피리미딘 영역을 소유함을 입증할 수 있었다. 이러한 천연 호모퓨린/호모피리미딘 영역과 상중 나선을 형성할 수 있는 올리고누클레오티드의 합성은 유리하게도 본 발명의 공정이 변형되지 않은 플라스미드, 특히 pUC, pBR322, pSV 유형 등의 공업용 플라스미드에 적용될 수 있게끔 해준다. 본래 이본쇄 DNA에 존재하는 호모퓨린/호모피리미딘 서열 중, 이. 콜라이(E. coli) ColE1 복제 기원에 존재하는 서열 5'-CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3'(서열 번호: 6)의 전부 또는 일부를 포함하는 서열이 언급될 수 있다. 이 경우, 삼중 나선을 형성하는 올리고누클레오티드는 서열: 5'-GAAGGGTTCTTCCCTCTTTCC-3'(비열 번호: 7)를 소유하고 Beal과 Dervan[참조문헌: J. Am, Chem. Soc, 1992, 114, 4976-4982] 및 Jayasena 및 Johnston[참조문헌: Nucleic Acids Res. 1992, 20, 5279-5288]에 의해 기재된 바와 같이, 두 이본쇄와 결합한다. 플라스미드 pBR322의 β-락타메이즈 유전자[참조문헌: Duval-Valentin et al., Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 1992, 89, 504-508]의 서열 5'-GAAAAAGGAAGAG-3'(서열 번호: 8)도 또한 언급될 수 있다. 복제 기원 또는 표지 유전자에 존재하는 서열과 삼중 나선을 형성할 수 있는 올리고누클레오티드의 사용이 특히 유리한데 이는 복제 기원 또는 표지 유전자를 함유한 모든 DNA가 동일한 올리고누클레오티드를 사용하여 정제될 수 있기 때문이다. 따라서, 플라스미드 또는 이본쇄 DNA를 변형시킬 필요는 없는데 이는 인위적인 특정서열을 이에 혼입시키기 위함이다.
완전히 상보적인 서열이 바람직하지만, 그럼에도 불구하고 올리고누클레오티드 서열과 DNA에 존재하는 서열간의 잘못된 염기쌍은 이들이 상당한 친화력의 손실을 야기함이 없는 한 용인될 수 있는 것으로 이해되고 있다. 이. 콜라이 β-락타메이즈 유전자에 존재하는 서열 5'-AAAAAAGGGAATAAGGG-3'(서열 번호: 9)이 언급될 수 있다. 이 경우, 폴리퓨린 서열을 방해하는 티미딘은 3번째 가닥의 구아닌에 의해 인식되어, 이것이 두 TAT 삼중선에 의해 플랭킹될 경우 안정한 ATG 삼중선을 형성한다[참조문헌: Kiessling et al., Biochemistry, 1992, 31, 2829-2834].
한가지 특정 양태에 따라, 본 발명의 올리고누클레오티드는 서열 (CCT)n, 서열 (CT)n 또는 서열 (CTT)n을 포함하고, 여기서 n은 1에서 15까지의 정수이다. (CT)n 또는 (CTT)n 유형의 서열을 사용하는 것이 특히 유리하다. 따라서, 본 출원인은 정제 수율이 올리고누클레오티드 중 C의 양에 영향을 받는 것으로 밝혀졌다. 특히, 실시예 7에서 알 수 있듯이, 정제 수율은 올리고누클레오티드가 사이토신을 거의 포함하지 않는 경우에 증가한다. 본 발명의 올리고누클레오티드는 (CTT), (CT) 또는 (CTT) 모티브와도 결합할 수 있는 것으로 이해될 수 있다.
사용되는 올리고누클레오티드는 천연(변형되지 않은, 본래 염기로 구성됨) 또는 화학적으로 변형될 수 있다. 특히, 올리고누클레오티드는 유리하게도 뉴클레아제에 대한 내성, 또는 이의 보호를 증가시키거나, 특정 서열에 대한 친화성을 증가시키는 임의의 화학적 변형을 나타낼 수 있다.
본 발명에 따라, 올리고누클레오티드는 또한 어떠한 뉴클레오사이드 서열을 의미하는데 이의 골격은 뉴클레아제에 좀더 내성이 있도록 변형되어 왔다. 언급될 수 있는 가능한 변형은 DNA와 삼중 나선을 형성할 수 있는 포스포로티오에이트 올리고뉴크레오타이드[참조문헌: Xodo et al., Nucleic acid Res., 1994, 22, 3322-3330] 및 또는 포름아세탈 또는 메틸포스포네이트 골격을 지닌 올리고누클레오티드[참조문헌. Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc., 1991, 113, 7767-7768]이다. 누클레오티드 α-아노머와 함께 합성되고 또한 DNA와 삼중 나선을 형성하는 올리고누클레오티드도 또한 이용될 수 있다[참조문헌: Le Doan et al., Nucleic Acids kes., 1987, 15, 7749-7760]. 골격의 또다른 변형은 포스포아미데이트 결합이다. 예를 들면, 포스포아미데이트 N3'-P5' 상호누클레오티드 결합이 언급될 수 있고, 이는 Gryaznov 및 Chen에 의해 기술되고 있으며 DNA와 특히 안정한 삼중 나선을 형성하는 올리고누클레오티드를 수득한다[참조문헌: J. Am. Chem. Soc., 1994, 116, 3143-3144]. 언급될 수 있는 기타 골격 변형은 리보누클레오티드, 2'-O-메틸리보스, 포스포이에스테르 등의 사용이다[참조문헌: Sun and , Currr. Opinion Struct. Biol., 116, 3143-3144]. 결국, 인-함유 골격은 PNA(팹티드 핵산)에서와 같이 삼중 나선을 형성할 수 있는 폴리아미드 골격[참조문헌: Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500; Kim et al , J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 6477-6481]에 의하거나 DNG(데옥시리보핵산 구아니딘)에서와 같이, DNA의 다가양이온 유사체이고 또한 삼중 나선을 형성하는 구아니딘-기본 골격[참조문헌: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 6097-6101]에 의해 치환될 수 있다.
세 번째 가닥의 티미딘도 또한 5-브로모유라실로 치환되어, DNA에 대한 올리고누클레오티드의 친화성을 증가시킨다[참조문헌. Povsic and Dervan, J. Am. Chem. Soc., 1989, 111, 3059-3061].
세 번째 가닥은 또한 변칙적인 염기를 함유할 수 있는데, 이 중 7-데아자-2'-데옥시잔토신[참조문헌: Milligan et al., Nucleic Acids Res., 1993, 21, 327-333], 1-(2-데옥시-β-D-리보퓨라노실)-3-메틸-5-아미노-1H-피라졸로[4,3-d]-피리미딘-7-온[참조문헌: Koh and Dervan, J. Am, Chem. Soc., 1992, 114, 1470-1478], 8-옥소아데닌, 2-아미노퓨린, 2'-O-메틸슈도이소시티딘, 또는 숙련인에게 공지된 임의의 기타 변형[참조문헌: Sun and , Curr. Opinion Struct. Biol., 1993, 3, 345-356]이 언급될 수 있다.
또다른 유형의 올리고누클레오티드의 변형 목적은 좀더 특별하게는 올리고누클레오티드 및 특정 서열간의 상호작용 및/또는 친화성을 개선시키는데 있다. 특히, 본 발명에 따른 매우 유리한 변형은 올리고누클레오티드의 사이토신을 메틸화시키는데 있다. 이렇게 메틸화된 올리고누클레오티드는 중성에 가까운 pH 범위(≥ 5)에서 특정 서열과 안정한 삼중 나선을 형성하는 주목할 만한 특성을 나타낸다. 따라서 이보다 높은 pH값에서 작업하는 것은 이전 분야의 올리고누클레오티드의 경우로써, 이 pH값에서는 플라스미드 DNA의 파괴 위험을 다소 약하게 할 수 있다.
본 발명의 공정에 적용된 올리고누클레오티드의 길이는 적어도 3 염기 바람직하게는 5 내지 30 염기이다. 유기하게도, 길이가 10 염기 이상인 올리고누클레오티드가 사용된다. 길이는 필요로 하는 선택성 및 상호작용의 안정성과 조화되게 각기의 경우에 따라 숙련인에 의해 변형될 수 있다.
본 발명에 따른 올리고누클레오티드는 공지 기술에 의해 합성될 수 있다. 특히, 이들은 핵산 합성기를 사용하여 제조될 수 있다. 숙련인에게 공지된 기타의 방법도 물론 이용될 수 있다.
일반적으로, 올리고누클레오티드는 지지체에 공유결합될 수 있도록 작용화된다. 따라서, 이는 5' 또는 3' 위치에서 말단 티올, 아민 또는 카복실 그룹에 의해 변형될 수 있다. 특히, 티올, 아민 또는 카복실 그룹의 첨가는 예를 들면, 올리고누클레오티드를 디설파이드, 말레이미드, 아민, 카복실, 에스테르, 에폭시드, 시아노겐 브로마이드 또는 알데히드 작용기를 운반하는 지지체에 커플링시킬 수 있다. 이러한 커플링은 올리고누클레오티드와 지지체간의 디설파이드, 티오에테르, 에스테르, 아미드 또는 아민 결합을 이룸으로써 형성된다. 숙련인에게 공지된 기타 방법, 예를 들면 이작용성 커플링제도 또한 이용될 수 있다.
또한, 커플링된 올리고누클레오티드로 하이브리드화를 개선시키기 위해, 올리고누클레오티드는 "아암" 및 "스페이서" 염기 서열을 함유하는 것이 유리하다. 따라서, 아암의 사용은 지지체로부터 선택된 거리에서 올리고누클레오티드를 결합시켜, DNA와의 상호작용을 위한 조건을 개선시킬 수 있다. 아암은 유리하게도 1 내지 18개, 바람직하게는 6 또는 12개의 (CH2) 그룹을 포함하는 선형 탄소 사슬 및 컬럼과 결합하는 아민으로 구성된다. 아암은 하이브리드화를 방해하지 않는 염기로 구성된 올리고누클레오티드 또는 "스페이서"의 포스페이트에 연결된다. 따라서, "스체이서"는 퓨린 염기로 구성될 수 있다. 예를 들면, "스페이서"는 서열GAGG로 구성될 수 있다. 아암은 유리하게는 6 또는 12개의 탄소 원자를 포함하는 선형 탄소 사슬로 이루어져 있다.
다양한 유형의 지지체가 본 발명을 실현시키는데 이용될 수 있다. 이러한 지지체는 벌크 또는 컬럼-예비조건화된 작용화 크로마토그래피 지지체, 작용화 플라스틱 표면 또는 자기 또는 비-자기 작용화 라텍스 비드일 수 있다. 이들은 바람직하게는 크로마토그래피 지지체이다. 예를 들어 보면, 사용될 수 있는 크로마토그래피 지지체는 아가로스, 아크릴아미드 또는 텍스트란 및 이들의 유도체(예를 들면 Sephadex, Sepharose, Superose 등)로서, 예를 들면, 폴리(스티렌디비닐벤젠) 또는 그래프트 또는 비-그래프트 실리카와 같은 중합체가 있다. 크로마토그래피 컬럼은 확산 양식 또는 관류 양식으로 작용할 수 있다.
보다 우수한 정제 수율을 얻기 위해, 플라스미드에서, 올리고누클레오티드와 하이브리드화를 위한 여러 위치를 포함하는 서열을 이용하는 것이 특히 유리하다. 따라서, 여러 하이브리드화 위치의 존재는 상기 서열과 올리고누클레오티드간의 상호작용을 선호하게 되어, 정제 수율에 있어 개선을 야기한다. 따라서, n(CCT), (CT) 또는 (CTT) 모티브 반복 부위를 포함하는 올리고누클레오티드의 경우, 최소한 n개의 상보적인 모티브, 바람직하게는 n+1개의 상보적인 모티브를 포함하는 DNA 서열을 사용하는 것이 바람직하다. 따라서, n+1개의 상보적인 모티브를 운반하는 서열은 2개의 하이브리드화 위치를 올리고누클레오티드에 제공한다. 유리하게도, DNA 서열은 n+10개의 상보적인 모티브인 11 이하의 하이브리드화 위치를 포함한다.
또다른 양태에 따라, 세라믹 하이드록시아파티트 컬럼상의 크로마토그래피는 음이온 교환 컬럼상의 크로마토그래피 단계보다 앞서거나 이 다음에 행해진다. 약 음이온의 교환 컬럼을 사용하는 것이 바람직하다. 따라서, 강 음이온은 DNA와 매우 강하게 결합하는 성질을 지니고 있으면서, 실제로도 너무 강하게 결합하여 산물을 회수하는데 매우 어렵다(수율은 60% 이하). 이러한 이유로 인해, 본 출원인은 플라스미드 DNA를 보유하지 않지만 잔류 RNA와 결합하는 약 음이온 교환 물질을 사용한다.
앞서 지적했듯이, 본 발명에 따른 공정은 유리하게도 투석여과 단계를 포함한다. 투석여과는 샘플을 농축하는 단계로서, 이 과정 동안 맑은 용해질에 존재하는 물 및 소 분자(예를 들면 염, 단백질 및 작은 크기의 핵산)는 제거된다. 염은 크로마토그래피용 포스페이트 완충액으로 대체된다. 투석여과 후, 용액은 개시 용액보다 5 내지 50배 더 농축된다(농축 인자는 개시 용액의 부피에 좌우됨).
투석여과의 사용은 몇가지 이점을 제공한다. 이는 특히, 이소프로판올과 같은 유기 용매의 사용을 피할 수 있게 해주며, 이의 사용은 폭발-방지 장치가 필수적일 수 있다. 또한, 이 기술은 매우 광범위한 부피에도 이용될 수 있다. 따라서, 이는 취급될 부피에 따라 막 표면적을 증가시키는데만 필요하다.
유리하게도, 투석여과의 경우, 조절 가능한 속도로 액체 유동을 가능케하는 변형 폴리에테르 술폰 또는 변형 셀룰로스 아세테이트막에 대한 지지체로 작용하는 장치가 이용된다. 이러한 막은 분리점으로 규정되고, 이는 막을 가로지를 수 있는 분자의 일반적인 최대 크기이다. 실제값과 관련하여, 분리점이 100kD인 막은 30 kD 이상 크기의 분자를 보유할 수 있다.
본 발명에 따른 바람직한 공정은 하기 단계를 포함한다:
투석여과,
세라믹 하이드록시아파티트 컬럼상의 크로마토그래피, 및
삼중 나선의 형성을 이용한, DNA서열과 올리고누클레오티드간의 특정 하이브리드화에 의한 친화성 크로마토그래피.
본 발명에 따른 공정은 임의 유형의 이본쇄 DNA를 정제하는데 이용될 수 있다. 이 이본쇄 DNA는 예를 들면, 일반적으로 하나 이상의 관련 치료 유전자를 운반하는 플라스미드와 같은 환형 DNA일 수 있다. 이 플라스미드는 또한 복제 기원, 표지 유전자 등을 운반할 수 있다. 본 공정은 또한 관련 서열을 운반하는 선형 또는 환형 DNA가 상이한 서열의 DNA를 포함하는 혼합물로부터 정제될 수 있도록 해준다.
일반적으로, 개시 DNA는 재조합 DNA 기술에 의해 변형된 숙주 미생물에 의해 생성된다. 이 점에 관해, 회수될 이본쇄 DNA를 정착시키는 숙주를 우선적으로 복제하고 중폭시킨다. 이를 위해서는 고 세포 밀도를 얻을 수 있도록 하는 표준 발효 기술이 이용된다. 가장 일반적으로 적용되는 기술은 "페드-뱃치"로 불리는 기술로서, 이는 문헌[참조: Jung et al, Ann. Inst. Pasteur/Microbiol. 1988, 139, p.129-146; Bauer et al., Biotechnol. Bioeng. 1976, 18, p. 81-94]에 자세히 기재되어 있다.
발효에 이어 세포를 용해시킨다. 관련 세포 유형에 따르거나 조 용해질 또는 맑은 용해질에서 작업할지 원하는 바에 따라, 기계 시스템 또는 화학 시스템 중 어느 하나를 세포를 용해시키는데 이용할 수 있다. DNA를 변성(진탕, 열적 충격 또는 삼투압 충격)시키지 않는 시스템은 바람직하게는 기계적 용해에 이용될 수 있다. 이들 방법은 원핵 세포로부터 DNA를 추출하는데는 적당하지 않다. 따라서, 원핵 세포를 파괴하는데 이용되는 기계적 처리는 DNA를 변형시키는 효과를 지닌다. 기계적 용해는 바람직하게는 진핵 세포의 경우에 한정되며, 원핵 세포의 경우에는 화학적 용해가 바람직하다.
원핵 세포는 숙련인에게 공지된 임의 기술을 이용하여 화학적으로 용해된다(세제 또는 라이소자임, 적절한 곳에서는 열적 충격 등과 조합됨). 나트륨 하이드록사이드 용액 및 SDS 혼합물이 바람직하게 이용된다. 이러한 처리 동안, pH는 12에 이른다. 이렇게 수득된 용해질의 pH는 대략 pH 6으로 환원되고, 이는 일부의 염색체 DNA 및 RNA 단백질의 침전을 야기한다. 이 침전물은 원심분리에 의해 제거된다.
본 발명의 바람직한 양태는 우선적으로 정제될 이본쇄 DNA를 정착시키는 세포를 화학적 용해시켜 맑은 용해질을 얻는데 있다. 생성된 맑은 용해질은 투석여과되고 세라믹 하이드록시아파티트 컬럼상에서 크로마토그래피되어 수득된 농축액이다.
세포 용해질은 원핵 또는 진핵 세포의 용해질일 수 있다.
언급될 수 있는 원핵 세포의 예로는 박테리아 이. 콜라이. 바실러스 서브틸리스(B. subtilis), S. 티피뮤리움(S. typhimurium) 또는 스트렙토마이세스(Streptomyces)가 있다. 언급될 수 있는 진핵 세포는 동물 세포, 효모, 진균 등, 좀더 바람직하게는, 효모 클뤼베로마이세스(Kluyveromyces) 또는 사카로마이세스(Saccharomyces) 또는 COS 세포, CHO 세포, C127 세포, NIH3T3 세포 등이 있다.
본 발명의 공정은 매우 높은 순도의 플라스미드 DNA가 빠르면서도 간단히 수득될 수 있도록 하기 때문에 특히 유리하다. 특히, 실시예에서 설명하듯이, 본 공정은 관련 플라스미드 DNA가 분획된 염색체 DNA, RNA, 엔도톡신, 단백질, 뉴크레아제 등과 같은 오염 성분으로부터 효과적으로 분리되게끔 한다. 좀더 상세하게는, 본 발명의 공정은 실제로 염색체 DNA가 없는(< 0.5%) 이본쇄 DNA 제제, 특히 프라스미드 DNA 제제를 수득 가능하게 해준다. 또한, 수득된 DNA제제 중 엔도톡신의 함량은 매우 낮고(< 50 EU/mg), 그 값은 약제용으로 적합하다.
본 출원인은 매우 놀랍게도, 상술된 두 단계, 즉 하이드록시아파티트 컬럼상의 크로마토그래피 다음 또는 그 이전의 삼중 나선 크로마토그래피의 조합이 0.01%의 염색체 DNA 함량을 지닌 플라스미드 DNA 제제를 수득시킴을 입증했다. 매우 바람직하게는, 본 발명은 또한 0.01% 이하의 염색체 DNA 함량을 지닌 플라스미드 DNA 제제에 관한 것이다.
본 발명은 또한 50 EU/mg 이하, 바람직하게는 10 EU/mg 이하인 엔도톡신 함량을 지닌 플라스미드 DNA 제제에 관한 것이다. 엔도톡신 함량은 따라서 허가 함량 이하인 것이 바람직하며, 이는 체중이 70 kg인 사람의 경우 350 EU/주입이다(1EU는 1 엔도톡신 단위이고 100 pg와 동일함).
본 발명은 따라서 약학적, 특히 생체 내 또는 생체 외에서 유전자 또는 세포치료에 이용될 수 있는 플라스미드 DNA를 포함하는 조성물에 관해 기술하고 있다. 이에 관해, 본 발명은 또한 상술된 공정에 따라 제조된 선형 또는 플라스미드 이본쇄 DNA를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 조성물은 "네이키드" 또는 리포솜, 나노입자, 양이온 지질, 중합체, 단백질 또는 재조합 바이러스 등과 같은 전달 벡터와 결합된 플라스미드 DNA를 포함할 수 있다.
본 발명 출원은 하기 실시예에 의해 좀더 상세히 기술될 것이고, 이는 설명적이면서 비제한적으로 간주되어야 한다.
재료 및 방법
1. 플라스미드 pXL2784의 작제
특정 플라스미드, pXL2784를 하기 실험에 이용한다. 이 플라스미드는 사이토메갈로바이러스 프로모터를 함유한 카세트, 루시퍼라제를 암호화하는 유전자 및 호모퓨린/호모피리미딘 서열, (GAA)17을 포함한다. 이 플라스미드의 작제는 하기에 기술되어 있다. 물론 본 발명의 공정은 기재된 플라스미드에 한정되지 않는 것으로 이해될 것이다.
1.1 플라스미드 pXL2784 특징 열거
플라스미드 pXL2784는 플라스미드 ColE1의 최소 레플리콘이고 pBluescript플라스미드(ORI)에서 유도된, 플라스미드 벡터 pXL2675(2.513 kb)로부터 작제되고 선택 표지로서, 카나마이신 내성 부위를 암호화하는 트란스포손 Tn5를 가진다. 플라스미드 pXL2784는 또한 호모퓨린/호모피리미딘 서열, (CAA)17을 함유하며, 이는 플라스미드 pXL2563에서 유도되고 n이 1 내지 17인 (CTT)n 올리고머에 결합할 수 있는데, 이는 국지적으로 삼중 나선을 생성하고 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있도록 하기 위함이다. 플라스미드 pXL2784는 플라스미드 ColE1에서 유도되고 플라스미드 pXL565로 클로닝되는 cer 자리(382 bp)를 소유한다: cer 자리는 XerC/XerD 재조합효소에 대한 자리-특이성 서열을 함유하고 플라스미드 멀티머를 분해한다. 이 플라스미드 pXL2784로 클로닝된 트랜스유전자는 플라스미드 pXL2622에서 유래된 카세트와 함께, 인간 사이토메갈로바이러스 CMV P 프로모터의 조절하에 포티너스 피랄리스(Photinus pyralis) 루시퍼라제를 암호화하는 luc 유전자를 구성하는 발현 카세트(3.3 kb)이다.
플라스미드의 크기는 6390 bp이다. 플라스미드 pXL2784의 지도는 도 1에서 기술하고 있고 이의 작제는 하기에서 상술하고 있다.
1.2. 최소 벡터 pXL2675
클레노우(Klenow) 단편을 이용하여 BsaI 무딘 말단을 만든 후, 플라스미드 pBKS+(Stratagene) 기원 1.15 kb BsaI/PvuII 단편을 플라스미드 pUC4KIXX(Pharmacia) 기원 1.2 kb SmaI 단편과 함께 클로닝하여 플라스미드 pXL2647을 생성한다.
올리고누클레오티드 5543:
5'-AGCTTCTCGA GCTGCAGGAT ATCGAATTCG GATCCTCTAG AGCGGCCGCG AGCTCC-3' (서열 번호: 10)
및 올리고누클레오티드 5543:
5'-AGCTGGAGCT CGCGGCCGCT CTAGAGGATC CGAATTCGAT ATCCTGCAGC TCGAGA-3' (서열 번호: 11)를 함께 하이브리드화시킨 다음 pXL2647의 HindIII 부위로 클로닝하여 플라스미드 pXL2675를 생성한다. 이 플라스미드는 복제 기원 및 파나마이신에 내성인 부위를 암호화하는 유전자 사이의 HindIII, XhoI, PstI, EcoRV, EcoRI, BamHI, XbaI, NotI, SstI 다중클로닝 부위를 함유한다.
1.3. 플라스미드 pXL2622의 루시퍼라제 카세트
플라스미드 pcDNA3(Invitrogen에서 제공) 기원 660 bp MluI/HindIII에 함유된 CMV 프로모터를 기본 플라스미드 pGL2(Promega, 루시퍼라제 유전자 함유)의 MluI 및 HindIII 부위 사이에 클로닝하여 플라스미드 pXL2622를 제조한다.
1.4. 올리고누클레오티드와 삼중 나선을 형성할 수 있는 서열을 함유한 플라스미드 pXL2563 및 pMTL22-TH
올리고누클레오티드 4817:
5'-GATCCGAAGA AGAAGAAGAA GAAGAAGAAG AAGAAGAAGA ASAAGAAGAA GAAGAAGG-3'(서열 번호: 12)
및 올리고누클레오티드 4818:
5'-AATTCCTTCT TCTTCTTCTT CTTCTTCTTC TTCTTCTTCT TCTTCTTCTT CTTCTTCG-3' (서열 번호: 13)를 함께 하이브리드화하고 플라스미드 pBluescriptII KS의 EcoRI 및 BamHI 부위로 클로닝하여 플라스미드 pXL2563을 형성한다. 62 bp EcoRI/BamHI 단편을 플라스미드 pMTL22[참조문헌: P. Minton 1988 Gene 68:139]의 EcoRI 및 BamHI 부위로 클로닝하여 플라스미드 pMTL22-TS를 제조한다.
1.5. cer 자리를 함유하는 플라스미드 pXL565 및 pXL2781
플라스미드 ColE1(P-L Biochemicals) 기원 382 bp HpaII 단편을 플라스미드 M13 mp7[참조문헌: Messint et al., 1981 Nucleic Acids Res 9 : 309]의 AccI 부위로 클로닝하여 플라스미드 pXL565를 형성한다. pXL565 기원 382 bp BamHI 단편을 플라스미드 pSL301(Invitrogen)의 BglII 부위로 클로닝하여 플라스미드 pXL2781를 제조한다.
1.6. 플라스미드 pXL2784의 작제
cer 자리를 함유한, 플라스미드 pXL278l 기원 382 bp BamHI/XhoI 단편을 플라스미드 pXL2675의 BamHI 및 XhoI 위치로 클로닝하여 플라스미드 pXL2782를 제조한다.
(GAA)17 서열을 함유한, 플라스미드 pMTL22-TH 기원 62 bp BglII/BamHI 단편을 플라스미드 pXL2782의 BamHI 부위로 클로닝하여 플라스미드 pXL2783을 형성한다.
결국, 루시퍼라제 카세트를 함유한, 플라스미드 pXL2622 기원 3.3 kb SalI/SpeI 단편을 플라스미드 pXL2783의 XhoI 및 NheI 부위로 클로닝하여 플라스미드 pXL2784를 제조한다. 물론 유전자를 발현시키는 기타 카세트를 루시퍼라제 카세트 대신 삽입시킬 수 있음이 이해될 것이다.
이 플라스미드를 함유한 균주 DH1(Maniatis et al., 1989)을 2, 7 및 800 리터 이하의 발효조에서 배양한다. 기타 균주도 또한 적용될 수 있다.
2. 발효
배양 가능한 플라스미드 DNA-정착 숙주를 표준 발효 기술[참조문헌: Jung et al., Ann. Inst. Pasteur/Microbiol. 1988, 139, p. 129-146; Bauer et al., Biotechnol. Bioeng. 1976, 18, p. 81-94]에 의해 수득할 수 있고, 이 중 페드-뱃치 기술이 바람직하다. 발효에 이어, 세포를 종래의 원심분리(10000 rpm 20분간)(이는 실험실적-규모의 제조로, 5 ℓ 이하의 부피에 해당), 또는 좀더 상당한 부피(수백 리터의 양을 가진 산업적 규모의 부피)의 경우 연속 원심분리에 의해 회수한다. 이렇게 회수된 세포를 즉시 이용하거나 -80℃에서 동결시킬 수 있다.
3. 화학적 용해(맑은 용해질)
세포를 적절한 곳에서 녹인 다음 용해시킨다. 화학적 용해는 3 단계로 나뉠 수 있다. 첫번째는 25 mM 트리스, pH 6.8, 50 mM 글루코스, 10 mM ETDA 완충액 또는 이에 상응하는 곳에서 세포를 재현탁시키는데 있다. 세포를 0.2 M NaOH 및 1% SDS를 함유한 혼합물에서 용해시킨다. 용액의 pH는 대략 12이다. 이온성 세제의 선택이 필수적인데 이는 비-이온성 세제가 10배 낮은 추출 수율을 제공하기 때문이다. 용해한 다음 칼륨 아세테이트의 존재하에 매질을 슈도-중화시킨다(용액의 최종 pH는 5.5 내지 6임). 매질의 이러한 산성화는 단백질 및 염색체 DNA 및 RNA의 일부를 함유한 침전물을 발생시킨다. 이러한 침전은 칼륨 아세테이트와 나트륨 도데실 설페이트(SDS)간의 반응에 기인하는 것으로, 이들은 함께 백색의 칼륨 도데실 설페이트 침전물을 형성한다.
침전물은 제거될 필요가 있다. 이를 위해, 혼합물은 부피가 5 리터 이하인 경우, 버킷(8000 rpm 15분간)에서 원심분리되거나, 부피가 이 보다 크면(> 5 리터) 연속적으로 원심분리된다. 상등액을 제거하는 또다른 방법은 구멍이 20 ㎛ 이상인 심층 필터를 통해 여파시키는 것이다(PALL, 프로필 II, 제조자의 권장에 따라 사용).
4. 투석여과
화학적 용해 후 회수된 상등액을 투석여과시켜 플라스미드 DNA를 농축하고 소 분자량의 분자, 특히 고 농도로 존재하는 염을 제거한다. 이러한 투석여과를 플라스미드 크기에 따라, 50 및 300 kD의 분리점을 지닌 막을 통해 실행한다. 바람직하게는 100 kD의 분리점을 지닌 막이 사용된다. 100 kD의 값은 구형 분자인 단백질에 의해 제공된 일반값이다. 상이한 공간 구조를 지닌 핵산 분자의 경우, 30 kd 이하의 분자량을 지닌 모든 분자를 제거하는 것으로 간주되고 있다. 투석여과 후 용액내에 존재하는 DNA의 양 및 맑은 용해질에 존재하는 DNA의 양을 HPLC로 측정한다. 이러한 방법으로 결정된 비는 이 단계에 대해 80% 이상의 수율을 제공한다.
염을 이러한 투석여과 동안 제거한다. 이들은 10 mM 포스페이트 완충액에 의해 대체된다. 결국 크로마토그래피 컬럼, 특히 Ceramic HydroxyapatiteTM 크로마토그래피 컬럼에 직접 산물을 적용시킬 수 있다.
삼중 나선 친화성 크로마토그래피로부터 생성된 플라스미드 DNA를 다시 한번 투석여과시켜 샘플을 농축시키고 원하지 않는 염을 제거한다. 이는 적절한 제형 완충액에서 산물을 평형화시킨다. 이 경우, 투석여과는 10 내지 50 kD의 분리점을 지닌 막을 통해 수행된다. 수율은 80% 이상이다.
산물을 차후 여과에 의해 멸균하고 제형 이전에 분석한다.
5. Ceramic Hydroxyapatite TM 컬럼상의 크로마토그래피
Ceramic HydroxyapatiteTM 겔을 샘플 부피가 정제되기에 적절한 크기이고 개시 샘플의 순도에 따라 컬럼에 붓는다. 컬럼의 크기 및 겔의 부피를 측정하기 위해, 개시 용액에 존재하는 DNA의 양(mg/㎖)을 HPLC로 측정한다. 이는 하이드록시아파티트 1 ㎖당 최소 0.1 mg의 DNA가 결합되는 것으로 간주되며, 이 값은 개시 용액에 존재하는 RNA의 양에 따라, 1 mg 이하(비록 이보다 많지 않더라도)로 변할 수 있다. RNA는 겔에 결합하고 RNA 양이 많을수록 보다 적은 DNA가 결합할 수 있을 것이다. RNA를 차동적인 용출에 의해 제거한다. 컬럼을 낮은 이온 농도(10 mM)의 포스페이트 완충액에서 평형화시킨다. 샘플을 50 cm/시간의 선형 유동 속도로 겔상에 로딩한다. 겔을 보다 큰 전도성의 포스페이트 완충액(150 mM)으로 세척한다. 샘플에 함유된 대부분의 RNA를 이 단계에서 제거한다. 플라스미드 DNA를 다시 한번 포스페이트 완충액(250 mM)의 전도성을 증가시켜 용출한다. 컬럼의 재이용 이전에 높은 몰농도(500 mM)의 포스페이트 완충액으로 중화된, 최종 오염물을 0.5 N NaOH를 적용하여 제거한다. 약제 생성과 관련할 경우, 이 지지체는 현장 화학적 정화에 견딜 수 있는 이점을 가지는데 이는 크로마토그래피에서 표준 세정제인 0.5 M 나트륨 하이드록사이드 용액, 및 고 농도의 에탄을 모두에 저항적이기 때문이다.
세라믹 하이드록시아파티트의 해상이 뛰어나다. 본 공정의 이 단계는 80% 이상의 RNA 및 99.9%의 염색체 DNA를 제거하고 엔도톡신 함량을 인자 1000으로 감소시킨다. 또한, 이 기술은 소 또는 기타 기원의 효소 사용을 피하고(RNase, 및 단백질 분해 효소 K가 없음); 또한, 화학 시약에 대한 세라믹 하이드록시아파티트의 내성은 현재까지 어떠한 재생가능성의 문제없이 본 출원인이 40회 이상 이를 사용 가능하도록 한다. 크로마토그래피 수율은 80% 이상이다.
6. 삼중 나선 형성을 이용한 친화성 크로마토그래피
6.1. 컬럼의 제조
재료: 사용된 컬럼은 페리스탈틱 펌프에 연결된 5 ㎖의 NHS (N-하이드록시석신이미드, Pharmacia)-활성 HiTrap 컬럼이다(유동 속도 < 1 ㎖/분). 사용된 특정 올리고누클레오티드는 5' NH2 그룹을 소유한다.
하기 완충액을 본 실시예에서 사용한다:
- 커플링 완충액: 0.2 M NaHCO3, 0.5 M NaCl, pH 8.3.
- 완충액 A: 0.5 M 에탄올아민, 0.5 M NaCl, pH 8.3.
- 완충액 B: 0.1 M 아세테이트, 0.5 M NaCl, pH 4.
방법: 컬럼을 1 mM HCl 30 ㎖로 세척하고, 커플링 완충액(5 ㎖ 중 250 nmol)에서 희석된 올리고누클레오티드를 컬럼에 로딩하며, 이때 30분간 주위 온도로 유지한다. 컬럼을 완충액 A 30 ㎖ 및 완충액 B 30 ㎖로 연속 3회 세척한다. 올리고누클레오티드를 이러한 방법으로 CONH 결합에 의해 컬럼에 공유 결합시킨다. 컬럼을 4℃에서 저장하고 최소 4 회 이용할 수 있다.
6.2. 플라스미드 정제
재료:
플라스미드 pXL 2784(1에서 기술됨)를 HiTrap 컬럼상에서 정제하고, 7.1.에서 기재된 올리고누클레오티드와 커플링시킨다. 하기 완충액을 이러한 정제동안 사용한다:
완충액 F: 2 M NaCl, 0.2 M 아세테이트, pH 4.5.
완충액 E: 1 M 트리스-HCl, pH 9, 0.5 mM EDTA.
방법:
컬럼을 완충액 F로 세척하고 플라스미드를 함유한 용액을 컬럼에 로딩하여 최소 2 시간 동안 주위 온도에서 배양한다. 컬럼을 완충액 F로 세척하고, 이 후 완충액 E를 사용하여 용출을 수행한다.
7. 이온 교환 크로마토그래피
미리정제된 샘플을 약 음이온 교환 컬럼상에서 크로마토그래피한다. 따라서, 강 음이온은 매우 강하게 DNA와 결합하는 특성을 가지고, 실제로 매우 강하여 산물을 회수하기가 매우 어렵다(수율은 60% 이하). 이러한 이유로 인해, 본 출원인은 플라스미드 DNA를 보유하지 않지만 잔류 RNA와 결합하는 약 음이온 교환 물질을 사용한다. 따라서 DEAE 세파로스 또는 DEAE 하이퍼 D 유형, 또는 이와 동류의 약 음이온 교환 물질을 사용하는 것이 바람직하다. 겔을 10 mM 포스페이트 완충액에서 평형화시키고 세라믹 하이드록시아파티트상의 크로마토그래피 단계에서 유도된 샘플을 겔에 직접 로딩한다. 결합된 RNA를 NaCl 농축액을 적용하여 제거한다. 0.5 M의 나트륨 하이드록사이드 용액을 사용하여 화학적 정화를 행하고, 이로인해 좋은 위생 조건하에(엔도톡신 제거 및 미생물 오염 위험의 제거) 작업을 행할 수 있다.
8. 복합 샘플에서 플라스미드 DNA를 분석하기 위한 HPLC의 사용
본 방법의 목적은 다양한 정제 단계 동안 플라스미드 DNA를 정량하여 수율을 측정하는데 있다고 할 수 있겠다. 이는 모든 정량 및 정성적으로 상이한 작업 효율을 분석 가능케 해준다.
하기 기술이 사용된다:
크로마토그래피 지지체는 Perseptive Biosystems사의 Poros R2 겔이다. 이는 입자 크기가 10 ㎛인 폴리스티렌-디비닐벤젠 지지체이다. 관류 세공의 크기는 6000 내지 8000 Å이고, 확산 세공의 크기는 500 내지 1000Å이다. 겔의 부피는 1.7 ㎖이다.
이온 쌍 크로마토그래피를 이용한다. 용매계는 물, 트리에틸아민 아세테이트, pH 7.1/트리에틸아민 아세테이트 90% 아세토니트릴이다.
유동 속도는 3 ㎖/분이다. 본 출원인은 플라스미드 DNA를 RNA와 구분하기 위해 구배를 규정해 왔다.
기준 샘플은 제조자의 지시에 따라 Qiagen상에서 정제된 플라스미드 DNA이다. 아가로스 겔상에서, 이 샘플은 단지 ocDNA 및 cccDNA를 함유한다. 이는 단지 HPLC에서 단일 피크를 제공한다. 이의 농도는 260 nm에서 OD값을 측정하고 1 OD 단위 = 50 ㎍ DNA/㎖를 기준으로 하여 측정된다.
본 출원인은 따라서 증가량의 이 산물을 주입하여 표준 곡선을 작성한다.
기준 DNA의 보류 시간에 상응하는 피크의 면적을 표준 곡선과 비교한다. 이는 정량화를 수행 가능케한다.
9. 잔류 크로마토그래피 DNA의 분석
잔류 게놈 DNA를 이. 콜라이 galK 유전자에서 기원한 프라이머를 사용하여 PCR로 정량한다. 이. 콜라이 galK 유전자 프라이머 서열은 하기와 같다[참조문헌: Debouck et al , Nucleic Acids Res., 1985, 13, 1841-1853]:
5'- CCG AAT TCT GGG GAC CAA AGC AGT TTC-3'(서열 번호: 14) 및 5'- CCA AGC TTC ACT GTT CAC GAC GGG TGT-3'(서열 번호: 15).
반응 매질은 PCR 완충액(Promega France, Charbonni res)에 하기를 함유한다: 1.5 mM MgCl2; 0.2 mM dXTP(Pharmacia, Orsay): 0.5 μM프라이머; 20 U/㎖ Taq 폴리머라제(Promega). 반응을 순서에 따라 수행한다: 95℃에서 5분
- 95℃에서 10초간 30 순환
60℃에서 30초간
78℃에서 1분간
- 78℃에서 10분간.
길이가 124 염기쌍인 증폭된 DNA 단편을 SybrGreen I (Molecular Probes, Eugene, USA)존재하에 3% 아가로스 겔상에서 전기영동에 의해 분리한 다음 이. 콜라이 균주 B(Sigma, ref. D4889)에서 기원한 Ultrapur 게놈 DNA 범위를 참조하여 정량한다.
10. 시험관 내에서 포유동물 세포의 형질감염
본 방법은 본 발명에 따른 공정에 의해 정재된 플라스미드의 생물학적 활성을 평가하기 위해 적용된다. 사용된 세포는 실험 하루전에, 50,000 세포/웰의 속도로 24-웰 배양 플레이트에서 시이딩된 NIH 3T3 세포이다. 플라스미드를 150 mM NaCl로 희석하고 리포펙탄트와 함께 혼합한다. 리포펙탄트의 양전하/DNA의 음전하 비가 3이 되도록 사용한다. 혼합물을 와동시키고, 주위 온도에서 10분간 유지시키며, 태 송아지 혈청이 없는 배양 배지에서 희석한 다음 세포에 1 ㎍ DNA/배양 웰의 속도로 첨가한다. 37℃에서 2시간 후, 10 용적/용적%의 태 송아지 혈청을 첨가하고 세포를 5% CO2 존재하에 37℃에서 48시간 동안 배양한다. 세포를 PBS로 2회 세척하고 Lumat LB9501 루미노미터상에서(EG 및 G Berthold, Evry), 기술된 프로토콜(Promega kit, Prometa Corp. Madison, WI)에 따라 루시퍼라제 활성을 측정한다. 단백질을 BCA 기술(Pierce, Interchim, Asnieres)로 분석한다.
11. 다방면 기술
아가로스 겔상의 전기영동 및 에티디움 브로마이드를 이용한 염색에 의해 분석할 경우, 수득된 플라스미드는 "초나선" 환형 DNA의 단일 밴드 형태로 나타난다. 고분자량의 (염색체) DNA 또는 RNA의 흔적은 정제된 플라스미드에서 검출되지 않는다.
샘플내의 단백질 농도는 제조자의 지시에 따라 Micro-BCA(Pierce)에 의해 측정된다.
엔도톡신 농도는 제조자의 지시에 따라 LAL(Biosepra) 분석으로 평가한다.
분자 생물학의 표준 기술, 예를 들면 제한 효소를 이용한 분해, 겔 전기 영동, 이. 콜라이로의 형질전환, 핵산의 침전 등에 관해서는 문헌[참조: Maniatis et al., T., E.F. Fritsch, and J. Sambrook, 1989. Molecular cloning; a laboratory manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York: Ausubel F.M., R. Brent, R. E. Kinston, D. D, Moore, J. A. Smith, J. G. Seidman and K. Struhl, 1987. Current protocols in molecular biology 1987-1988, John Wiley and Sons, New York]에 기재되어 있다. 누클레오티드 서열은 상술된 프로토콜(Ausubel et al., 1987)에 따른 연쇄-말단법으로 결정된다.
제한 효소는 New-England Biolabs, Beverly, MA(Biolabs)에 의해 공급된다.
연결의 경우, DNA 단편을 파아지 T4 DNA 라이게이즈(Biolabs)의 존재하에 50 mM 트리스-HCl, pH 7.4, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 2 mM ATP 완충액에서 배양한다.
올리고누클레오티드는 시아노에틸 그룹[참조 문헌: Sinha, N.D., J. Biernat, J. McManus and H. , 1984, Polymer support oligonucleotide synthesis, XVIII: Use of β-cyanoethyl-N,N-dialkylamino-/N-morpholino phosphramidite of deoxynucleosides for the synthesis of DNA fragments simplifying deprotection and isolation of the final product, Nucl. Acids. Res., 12, 4539-4557; Giles, J.W 1985, Advances in automated DNA synthesis; Am. Biotechnol., Nov/Dec.]에 의해 β-보호된 포스포아미디트 화학을 이용하고 제조자의 권장에 따라 Biosearch 8600 자동화 DNA 합성기를 사용하여 합성된다.
연결된 DNA, 또는 이들의 형질전환 효율을 시험할 수 있는 것들을 사용하여 하기 균주를 형질전환한다: 적응된 이. 콜라이 DH5α[F' / endA1, hsdR17, supE44, thi-1, recA1, gyrA96, relA1, D(lacZYA-argF)U169, deoR, F80dlac(lacZDM15)].
플라스미드 DNA의 미니제조는 Klein et al., 1980 프로토콜에 따라 수행된다.
LB 배양 배지를 사용하여 이. 콜라이 균주를 증식시킨다(Maniatis et al., 1982). 균주를 37℃에서 배양한다. 적절한 항생제가 보충된 LB 배지의 플레이트상에 박테리아를 스트리킹한다.
실시예 1.
세라믹 하이드록시아파티트 컬럼상에서 플라스미드 DNA의 정제
1.1. 맑은 용해질의 제조
재료:
본 실시예에서는 하기 용액을 사용한다:
25 mM 트리스, pH 6.8, 50 mM 글루코스, 10 mM ETDA: 용액 1
0.2 M NaOH 및 1% SDS: 용액 2
3 M 칼륨 아세테이트, pH 5: 용액 3
방법:
세포 200 g을 용액 1의 2200 ㎖에 현탁시킨다. 용액 2(또한 2200 ㎖)를 첨가한다. 최종적으로 1100 ㎖의 용액 3을 첨가한다. 형성된 침전물을 30분 동안 9000 rpm에서 원심분리하여 제거한다. 상등액 5200 ㎖를 수득한다.
1.2. 투석여과
재료:
100 KD의 분리점 및 1860 ㎠ 면적을 지닌 Maximate(Filtron)막
완충액: 100 mM 나트륨 포스페이트, pH 6.8
방법:
사용 전에, 막을 0.5 M 나트륨 하이드록사이드 용액을 이용해 1시간 동안 화학 정화시킨다. 나트륨 하이드록사이드 용액을 주입수를 이용해 제거한다.
단계 1.1 동안 수득된 상등액을 약 10회 농축시킨 다음 물 4 부피에 이어 pH 6.8의 100 mM 포스페이트 완충액 4 부피로 투석여과시킨다. 최종 부피는 810 ㎖이다. 샘플은 HPLC로 측정할 경우, 플라스미드 DNA 224 mg을 함유한다.
1.3. Ceramic Hydroxyapatite TM 상에서의 정제
재료:
하기 완충액을 본 정제동안 이용한다:
완충액 A = 10 mM 포스페이트 완충액, pH 6.8
완충액 B = 150 mM 포스페이트 완충액, pH 6.8
완충액 C = 250 mM 포스페이트 완충액, pH 6.8
완충액 D = 500 mM 포스페이트 완충액, pH 6.8
0.5 M NaOH
방법:
컬럼(직경 113 mm 및 높이 17 cm)은 1700 ㎖의 겔을 함유한다.
사용 이전에, 겔을 0.5 M 나트륨 하이드록사이드 용액으로 1시간 동안 화학 정화시킨다. 나트륨 하이드록사이드 용액을 완충액 D를 이용하여 제거한다. 컬럼을 완충액 A로 평형화시킨다.
앞서 수득된 810 ㎖ 중 610 ㎖(즉 171 mg)를 겔상에 로딩한다. 유동 속도는 60 ㎖/분이다. 겔을 완충액 B 6 L로 세척한다. 이 후, 완충액 C를 적용하여 산물을 용출한다. 용출물은 1520 ㎖의 부피를 지니고 플라스미드 DNA 147 mg을 함유한다(HPLC로 측정).
차후 겔을 나트륨 하이드록사이드 용액(0.5 M NaOH)에 이어 완충액 D로 세척하여 재생시킨다. 겔은 새로운 순환을 준비중이다.
전체 작업에 이어 254 nm에서 UV 분광법을 적용한다.
1.4. DEAE Sepharose상에서의 정제
재료:
본 정제에서는 하기 완충액을 사용한다:
완충액 A, 1 M NaCl 및 0.5 M NaOH.
방법:
컬럼(직경 50 mm 및 높이 6 cm)은 겔 110 ㎖를 함유한다.
사용 전에, 겔을 0.5 M 나트륨 하이드록사이드 용액으로 1시간 동안 화학 정화시킨다. 나트륨 하이드록사이드 용액을 NaCl 1M 용액으로 제거한다. 이 후, 컬럼을 완충액 A에서 평형화시킨다.
앞서 수득된 1520 ㎖ 중 1130 ㎖(즉 110 mg)를 50 ㎖/분의 유동 속도로 겔상에 로딩한다. DNA를 보유하고 있지 않기 때문에, 모아진 용출액(1036 ㎖)은 DNA 104 mg을 함유한다. 겔상에 보유된 산물을 NaCl 용액 1M로 제거한다. 이 후, 겔을 0.5 M 나트륨 하이드록사이드 용액에 이어 1 M NaCl로 세척한다. 겔은 새로운 작업을 준비중이다.
전체 작업에 이어 254 nm에서 UV 분광법을 적용한다.
1.5. 투석여과
재료:
30 KD의 분리점 및 860 ㎠의 면적을 지닌 울트라세트(Filtron)막
완충액 : 주입수
방법:
사용 전에, 막을 0.5 M 나트륨 하이드록사이드 용액으로 1 시간 동안 화학 정화시킨다. 나트륨 하이드록사이드 용액을 주입수로 제거한다. 상기 단계에서 수득된 산물 720 ㎖를 대략 3회 농축한 다음 주입수 4 부피로 2회 투석여과시킨다. 최종 부피는 210 ㎖이다. 샘플은 HPLC로 측정할 경우, 플라스미드 DNA 62 mg을 함유한다.
1.6. DNA의 특성
상술한 공정은 플라스미드가 실제로 순수한 상태로 수득 가능하게 해준다. 최종 샘플의 상이한 성분을 결정하여 하기에서 요약하고 있다:
- RNA: 아가로스 겔 또는 HPLC로 검출되지 않음
- PCR로 측정된 염색체 DNA: < 0.5%
- HPLC로 측정된 초나선 DNA > 80%
- 엔도톡신 (LAL) < 50 EU/mg
- 단백질 (microBCA) < 1 ㎍/㎖
- 시험관 내에서 생물학적 활성:
pXL2784 뱃치 42DNA95: 20 x 106 RLU/㎍ 단백질(세슘 클로라이드 구배상에서 정제된 동일한 플라스미드 = 13 x 106 RLU/㎍ 단백질과 비교).
1.7. 변형
단계 1.1에서, 원심분리 대신 심층막을 통해 여과를 수행하는 것을 제외하고는 상술된 공정을 반복한다. 본 공정의 이러한 변형은 하기에서 요약된 특성을 지닌 약제 순도의 플라스미드를 수득 가능하게 해준다.
- RNA: 아가로스 겔 또는 HPLC에서 검출되지 않음
- RCR로 측정된 염색체 DNA: < 0.5%
- HPLC로 측정된 초나선 DNA > 70%
- 엔도톡신 (LAL) < 50 EU/mg
- 단백질 (microBCA) < 1 ㎕/㎖
실시예 2
삼중 나선 친화성 크로마토그래피에 의한 하이드록시아파티트 용출액의 정제
2.1. 친화성 컬럼의 제조
사용된 컬럼은 페리스탈틱 펌프에 연결된 5 ㎖의 NHS (N-하이드록시석신이미드, Pharmacia)-활성 HiTrap 컬럼이다. 사용된 특정 올리고누클레오티드는 5' NH2 그룹을 소유한다. 이 서열은 하기와 같다:
5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (서열 번호: 1).
하기 완충액을 본 실시예에서 사용한다:
커플링 완충액: 0.2 M NaHCO3, 0.5 M NaCl, pH 8.3.
완충액 A: 0.5 M 에탄올아민, 0.5M NaCl, pH 8.3.
완충액 B: 0.1 M 아세테이트, 0.5 M NaCl, pH 4.
컬럼을 1 mM HCl 30 ㎖로 세척한 후, 커플링 완충액(5 ㎖ 중 250 nmol)에서 희석된 올리고누클레오티드를 컬럼상에 로딩하고 주위 온도에서 30분간 유지한다. 컬럼을 완충액 A 30 ㎖에 이어 완충액 B 30 ㎖로 연속 3회 세척한다. 올리고누클레오티드는 CONH 결합에 의해 컬럼에 공유 결합된다. 컬럼을 4℃에서 저장한다.
2.2. 플라스미드의 정제
하기 완충액이 사용된다:
완충액 F: 2 M NaCl, 0.2 M 아세테이트, pH 4.5.
완충액 E: 1 M 트리스-HCl, pH 9, 0.5 mM EDTA.
컬럼을 완충액 F에서 평형시킨 다음 루프에서, 실시예 1.3.에서 기술된 조건하에 수득되고, 미리 2 M NaCl 및 pH 4.5로 맞춰진 하이드록시아파티트 용출액 9㎖를 컬럼으로 주위 온도에서 밤새 로딩한다(유동 속도 0.5 ㎖/분). 컬럼을 완충액 F로 세척하고 완충액 E로 용출을 수행한다. DNA를 254 nm에서 UV 분광계로 검출한다.
2.3. 정제된 DNA의 특성
HPLC로 분석할 경우(상술된 방법), 정제된 DNA는 24.8 분의 보유 시간에서 단일 피크의 형태로 나타난다. RNA의 흔적은 검출되지 않는다. 유사하게는, 1% 아가로스 걸상에서의 전기 영동 및 에티디움 브로마이드를 이용한 염색 후, 정제된 DNA는 검출 가능한 RNA의 흔적을 나타내지 않는다.
DNA를 또한 Waters Gen-Pak Fax 컬럼상에서 초나선 DNA로부터 이완 DNA를 분리하는 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 분석한다. 정제된 샘플은 로딩된 샘플내의 80% 초나선 DNA에 비해 97% 초나선 DNA를 함유한다.
이. 콜라이 게놈 DNA를 단락 3에서 기술된 기술을 이용하여 PCR에 의해 정량한다: 친화성 컬럼상에서 정제된 DNA는 대략 0.01%의 게놈 DNA를 함유한다.
실시예 3
3.1. 플라스미드의 정제
하기 서열의 올리고누클레오티드를 이용해 실시예 2에서 기재된 대로 제조된 친화성 컬럼을 이용한다:
5'-CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT-3' (서열 번호: 2)
하기 완충액을 사용한다:
완충액 F: 2 M NaCl, 0.2 M 나트륨 아세테이트, pH 4.5.
완충액 E: 1 M 트리스-HCl, pH 9, 0.5 mM EDTA.
컬럼을 완충액 F에서 평형화시킨 후, 실시예 1.7의 프로토콜에 따라 정제되고, 완충액 F 10㎖에서 희석된 플라스미드 0.8 mg을 로딩한다. 샘플을 주위 온도에서 밤새 루프에서 컬럼을 통해 재순환시킨다(유동 속도 0.5 ㎖/분). 컬럼을 완충액 F로 세척하고 완충액 E를 사용하여 용출을 수행한다. DNA를 254 nm에서 UV 분광계로 검출한다.
3.2. 정제된 DNA의 특성
수득된 DNA를 Waters Gen-Pak Fax 컬럼상에서 초나선 DNA로부터 이완 DNA를 분리하는 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 분석한다. 정제된 샘플은 100% 초나선 DNA를 함유하는데 반해, 친화성 컬럼상에 로딩된 샘플에서는 72%이다.
이. 콜라이 게놈 DNA를 앞서 기술된 기술을 이용해 PCR로 정량한다: 친화성 컬럼상에서 정제된 DNA는 대략 0.01% 게놈 DNA를 함유하는데 반해, 친화성 컬럼상으로 로딩된 샘플에서는 대략 0.3%이다.
실시예 4
하이드록시아파티트 용출물(pXL 2784)을 정제한 후 삼중 나선 친화성 크로마토그래피의 규모 변화
4.1. 친화성 컬럼의 제조
이용된 컬럼은 NHS (N-하이드록시석신이미드, Pharmacia)-활성 Sepharose 4 Fast Flow를 함유하고 실시예 2.1에서 기술된 방법에 따라 하기 서열의 올리고누클레오티드와 커플링되는 컬럼이다:
5'-CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT -3'[(CTT)7: 서열 번호: 2]
컬럼(직경 26 mm, 높이: 16 cm)은 80㎖의 겔을 함유하고 페리스탈틱 펌프에 연결된다.
4.2. 플라스미드의 정제
하기 완충액을 사용한다:
완충액 F: 2 M NaCl, 0.2 M 나트륨 아세테이트, pH 4,5.
완충액 E: 1 M 트리스-HCl, pH 9, 0.5 mM EDTA.
컬럼을 완충액 F로 평형화시킨 다음, 실시예 1.3.에서 기술된 조건하에 수득되고, 미리 2 M NaCl 및 pH 4.5로 맞춰진 하이드록시아파티트 용출액 135 ㎖, 즉 8 mg을 4회의 재순환에 의해 컬럼으로 로딩한다(유동 속도 1.25 ㎖/분). 컬럼을 완충액 F로 세척하고 완충액 E로 용출을 수행한다. DNA를 254 nm에서 UV 분광계로 검출한다: 2.2 mg이 회수됨.
4.3. 정제된 DNA의 특성
HPLC로 분석할 경우(상술된 방법), 정제된 DNA는 24.4 분의 보유 시간에서 단일 피크의 형태로 나타난다. RNA의 흔적은 검출되지 않는다. 유사하게는, 1% 아가로스 겔상의 전기 영동 및 에티디움 브로마이드를 이용한 염색 후, 정제된 DNA는 검출 가능한 RNA의 흔적을 나타내지 않는다.
DNA를 또한 Waters Gen-Pak Fax 컬럼상에서 초나선 DNA로부터 이완 DNA를 분리하는 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 분석한다. 정제된 샘플은 100% 초나선 DNA를 함유하는데 반해, 로딩된 샘플에서는 94% 초나선 DNA를 함유한다.
이. 콜라이 게놈 DNA를 단락 3에서 기재된 기술을 이용하여 PCR에 의해 정량한다: 친화성 컬럼상에서 정제된 DNA는 대략 0.02%의 게놈 DNA를 함유하는데 반해, 로딩된 샘플에서는 2%이다.
실시예 5
세라믹 하이드록시아파티트 컬럼상의 플라스미드 DNA의 대규모 정제
5.1. 맑은 용해질의 제조
실시예 1.1에서 기술한 바와 같이, 플라스미드 pXL2774로 형질전환된 이. 콜라이 박테리아 배양액으로부터 맑은 용해질을 제조한다. 플라스미드 pXL2774는 축소 크기(대략 4.5 kb)이고 특히
- Luc유전자를 발현시키는 카세트(CMV 프로모터-luc-폴리(A)+)
- sup Phe 선택 표지
- R6K에서 기원한 ori γ 복제 기원
- ColE1의 cer 단편을 포함한다.
방법:
세포 456 g을 5000 ㎖의 용액 1에 현탁시킨다. 용액 2(5500 ㎖)를 첨가한다. 최종적으로, 2500 ㎖의 용액 3를 첨가한다. 형성된 침전물을 9000 rpm에서 30분간의 원심분리 또는 여과에 의해 제거한다. 상등액 12.3 ℓ를 수득한다.
5.2. 투석여과
재료:
100 kD의 분리점 및 1860 ㎠의 면적을 지닌 Maximate(Filtron)막
완충액: 100 mM 나트륨 포스페이트, pH 6.8
방법:
샘플을 실시예 1.2에서 기술된 방법에 따라 투석여과시킨다.
최종 부피는 945 ㎖이다. 샘플은 HPLC로 측정할 경우 플라스미드 DNA 253 mg을 함유한다.
5.3. Ceramic Hydroxyapatite TM 상에서의 정제
재료:
하기 완충액을 본 정제에 이용한다:
완충액 A = 100 mM 포스페이트 완충액, pH 6.8
완충액 B = 150 mM 포스페이트 완충액, pH 6.8
완충액 C = 250 mM 포스페이트 완충액, pH 6.8
완충액 D = 500 mM 포스페이트 완충액, pH 6.8
0.5 M NaOH
방법:
컬럼(직경 100 mm 및 높이 23 cm)은 1700 ㎖의 겔을 함유한다.
사용 이전에, 겔을 0.5 M 나트륨 하이드록사이드 용액으로 1시간 동안 화학 정화시킨다. 나트륨 하이드록사이드 용액을 완충액 D를 이용하여 제거한다. 이 후, 컬럼을 완충액 A로 평형화시킨다.
앞서 수득된 945 ㎖ 중 475 ㎖(즉, 128 mg)를 겔상에 로딩한다. 유동 속도는 65 ㎖/분이다. 겔을 완충액 B 6 ℓ로 세척한다. 차 후, 완충액 C를 적용하여 산물을 용출한다. 용출액은 1760 ㎖의 부피를 지니고 플라스미드 DNA 100 mg을 함유한다(HPLC로 측정).
차후 겔을 나트륨 하이드록사이드 용액(0.5 M NaOH)에 이어 완충액 D로 세척하여 재생시킨다. 겔은 새로운 순환을 준비중이다.
전체 작업에 이어 254 nm에서 UV 분광법을 적용한다.
5.4. 투석여과
실시예 1.5에서 기술된 프로토콜에 따라 투석여과를 수행한다.
5.5. DNA의 특성
상술한 공정은 플라스미드가 실제로 순수한 상태로 수득 가능하게 해준다. 최종 샘플의 상이한 성분을 결정하여 하기에서 요약하고 있다:
- RNA: 아가로스 겔에서 검출되지 않음
- PCR로 측정된 염색체 DNA: 0.6%
- HPLC로 측정된 초나선 DNA: 87%
- 엔도톡신 (LAL) < 50 EU/mg
- 단백질 (microBCA) < 1 ㎍/㎖

Claims (10)

  1. 세포를 용해하는 단계; 및
    세라믹 하이드록시아파티트(ceramic hydroxyapatite) 칼럼상에서 한 단계 이상의 크로마토그래피에 의해 DNA를 다른 생물학적 물질로부터 분리하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는, 0.5%미만의 염색체 함량 및 50 EU/mg 미만의 엔도톡신 함량을 함유하는 약제 순도의 이본쇄 DNA의 정제 방법.
  2. 세포를 용해하는 단계; 및
    세라믹 하이드록시아파티트(ceramic hydroxyapatite) 칼럼 상에서 한 단계 이상의 크로마토그래피에 의해 DNA를 다른 생물학적 물질로부터 분리하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는, 이본쇄 DNA의 정제 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 두 단계의 크로마토그래피 단계를 포함하고, 그 중 한 단계는 하이드록시아파티트 칼럼 상의 크로마토그래피임을 특징으로 하는, 이본쇄 DNA의 정제 방법.
  4. 제3항에 있어서, 한 단계의 크로마토그래피는 하이드록시아파티트 칼럼 상의 크로마토그래피이고, 한 단계의 크로마토그래피는 친화성(affinity) 크로마토그래피 또는 이온 교환(ion exchange) 크로마토그래피임을 특징으로 하는, 이본쇄 DNA의 정제 방법.
  5. 제4항에 있어서, 한 단계의 크로마토그래피는 하이드록시아파티트 칼럼 상의 크로마토그래피이고, 한 단계의 크로마토그래피는 DNA 서열 및 고정화된 올리고뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 삼중 나선의 형성과 함께 수반하는 친화성 크로마토그래피임을 특징으로 하는, 이본쇄 DNA의 정제 방법.
  6. 제4항에 있어서, 한 단계의 크로마토그래피는 하이드록시아파티트 칼럼 상의 크로마토그래피이고, 한 단계의 크로마토그래피는 음이온 교환 크로마토그래피임을 특징으로 하는, 이본쇄 DNA의 정제 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 투석여과하는 단계를 추가적으로 포함함을 특징으로 하는, 이본쇄 DNA의 정제 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 이본쇄 DNA가 하나이상의 관심 서열을 부가적으로 함유함을 특징으로 하는, 이본쇄 DNA의 정제 방법,
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 이본쇄 DNA가 플라스미드 DNA임을 특징으로 하는, 이본쇄 DNA의 정제 방법.
  10. 세포를 화학적으로 용해하는 단계;
    투석여과하는 단계;
    세라믹 하이드록시아파티트 칼럼상에서 크로마토그래피를 수행하는 단계; 및
    DNA 서열 및 고정화된 올리고뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 삼중 나선의 형성과 함께 수반하는 친화성 크로마토그래피를 수행하는 단계
    를 포함함을 특징으로 하는, 이본쇄 DNA의 정제 방법.
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