JP2000506736A - 医薬品質のプラスミドｄｎａの精製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、少なくとも１つのヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー段階を含む医薬品質のプラスミドＤＮＡの精製方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 医薬品質のプラスミドＤＮＡの精製 本発明は、ＤＮＡの新規な精製方法に関する。本発明方法は、薬理学的に有用 な二重鎖ＤＮＡを迅速に精製し得る。より特定的には、本発明の精製方法は、透 析濾過及びクロマトグラフィーの処理だけを用いる方法である。 細胞遺伝子治療の技術は今や目覚ましい発展を遂げたが、これらの技術は、薬 理学的純度のＤＮＡの量産、特にプラスミドＤＮＡの量産ができることを前提と している。何故なら、この新規な治療方法においてはしばしば医薬がＤＮＡ自体 から構成されるので、特に静脈内投与経路でヒトの治療に使用できる適正な量の ＤＮＡを製造し、このＤＮＡを適当な方法で単離及び精製できることが不可欠で あると考えられている。 従来のＤＮＡ単離方法ではこれらの量及び純度の問題は考慮されていなかった 。従って、実験室で使用される方法を医薬産業の分野でプラスミドＤＮＡを精製 するために転用することはできない。実験室では２つの方法が頻用されており、 双方ともが最良結果を与える方法である。これらの方法は、細菌の粗溶 菌液を出発材料とし、夾雑物を最大限に除去することによって溶菌液中のプラス ミドＤＮＡを富化する。より特定的には、卵白のリゾチームを使用して細菌細胞 壁を破壊し、次いで溶菌液を遠心して細胞落屑を除去する。次に、動物起原の膵 ＲＮアーゼを上清に作用させる。動物起原の膵ＲＮアーゼは、存在する核酸の約 ７５％を占めるＲＮＡを除去し得る。 次いで、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混合物によってタ ンパク質を沈殿させる。遠心後に得られる上清は、タンパク質とＲＮＡとを含ん でいないが、大量の染色体ＤＮＡをまだ含んでいるので、追加の除去段階が必要 である。この段階では、臭化エチジウム及び塩化セシウムの存在下の超遠心を行 う。３種類の核酸、即ち、染色体ＤＮＡとプラスミドＤＮＡとＲＮＡとは臭化エ チジウムに対して異なった結合能力を有している。このため、塩化セシウム勾配 を用いて超遠心すると明らかに別々の３つの層に分離する。 このプロトコルの変形では、膵ＲＮアーゼの作用、アルカリ性界面活性剤の存 在下の還元、フェノール／クロロホルム抽出を順次行う。次いで、ＤＮＡをエタ ノールで沈殿させ、ポリエチレングリコールに再懸濁させて再沈殿させる。 しかしながらこれらの２つの方法は、プラスミドＤＮＡ溶液を製造することは できるが医薬純度の生成物の工業生産に利用することはできない。何故なら、動 物起原の酵素の使用は問題を含むからである。即ち、リゾチーム及び膵ＲＮアー ゼは、それらの起原が原因で最終生成物にウィルス汚染を導入する危険がある。 また、有機溶媒は極めて毒性であり、生成物を医薬目的に使用する場合には除去 しなければならない。特に、有機溶媒は最高の安全性条件下で保存及び使用され る必要があること、これらの溶媒の使用によって有毒廃棄物処理の問題が生じる こと、最終溶液からこれらの物質が完全に除去されたか否かを正確に判断するの は難しいこと、などの理由からこれらの溶媒の使用はコストを高騰させる。臭化 エチジウム自体が、顕著に毒性、変異原性、催奇形性であるため、医薬目的に使 用される生成物中では微量成分の形態で存在することも許容されない。溶媒、毒 性反応試薬、動物起原の酵素などの使用はいずれも、適正製造規格（Ｂｏｎｎｅ ｓ Ｐｒａｔｉｑｕｅｓ ｄｅ Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ）に適合する工業的方 法では許容されない。 本発明は、ＤＮＡを精製するための簡単で特に効率的な新規 な方法を開示している。本願に開示された方法は、極めて高純度のＤＮＡを大量 に供給し得る。本願に開示された方法が毒性有機溶媒及び動物起原の酵素の使用 を回避できることは特に有利な特徴である。方法はまた、特にＰＥＧ、酢酸アン モニウム及びＣａＣｌ₂による沈殿段階を含むため一般的な結論を引き出すこと が難しく収率も悪い多数の遠心段階の使用を削除し得る。本発明方法はまた、特 別な技術的困難を伴うことなく単一のロットで大量のＤＮＡ（１００ｍｇ、１ｇ 、１０ｇ更にそれ以上）を供給し得る。更に、本発明方法では、適正製造規格に 適合する方法を使用して医薬品質のＤＮＡを供給し得る。 本発明の第一の目的は、セラミック形態のヒドロキシアパタイトカラムクロマ トグラフィー段階を使用して大量の医薬純度のプラスミドＤＮＡを極めて迅速に 供給する二重鎖ＤＮＡの精製方法を提供することである。結晶質形態のヒドロキ シアパタイトは既に知られているが、脆性であるためその使用が難しく制約も多 い。セラミック形態は、物理的な面でも化学的な面でも卓越した耐性を有してい る。 好ましくは、本発明方法は２つのクロマトグラフィー段階を含み、その少なく とも一方はヒドロキシアパタイトクロマトグ ラフィーである。 好ましくは、第二のクロマトグラフィーがアフィニティークロマトグラフィー またはイオン交換クロマトグラフィーである。２つのクロマトグラフィーの使用 順序は任意である。 特に好ましい実施態様によれば、本発明方法は、ヒドロキシアパタイトカラム クロマトグラフィー段階とトリプルヘリックスアフィニティークロマトグラフィ ー段階とを含む。トリプルヘリックスアフィニティークロマトグラフィーの基本 原理は、ＤＮＡに存在する特異的配列と共にハイブリダイゼーションによって三 重螺旋を形成し得るオリゴヌクレオチドを共有結合的に結合させた支持体を使用 することである。２つのクロマトグラフィーの使用順序は任意である。 別の実施態様によれば、本発明方法はヒドロキシアパタイトカラムクロマトグ ラフィー段階とアニオン交換クロマトグラフィー段階とを含む。 本発明方法は更に透析濾過段階を含むのが有利である。この段階は一般にはク ロマトグラフィー段階に先行する。 ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーが本発明方法の重要な段階で ある。 ヒドロキシアパタイトは１０個のカルシウム原子を含むリン酸カルシウム錯体 である。結晶質形態よりも安定なセラミック形態はＢｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｉｅｓ及びＡｓａｈｉ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．によって製 造されている。セラミック化合物は結晶質化合物と同じ特性を有しているが結晶 質化合物に伴う物理的な制約がない。この材料は特にタンパク質精製用クロマト グラフィーで使用されるが、核酸精製用としても多数の利点を有しており極めて 良好な結果を与える。セラミックヒドロキシアパタイトは、マクロポーラスな球 状で化学的にも物理的にも極めて安定であり、効力低下を生じることなく数十回 の再使用が可能である。このセラミック形態は高圧、極めて高いｐＨ、極めて早 い流速及び有機溶媒に対して耐性である。 セラミックヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーは、厳密な意味で アフィニティークロマトグラフィーでもなくイオン交換クロマトグラフィーでも ない特殊な種類のクロマトグラフィーである。セラミックヒドロキシアパタイト カラムクロマトグラフィーはアフィニティークロマトグラフィーと共通の特性も 有し、イオン交換クロマトグラフィーと共通の特性も 有しているので、擬似アフィニティー及び擬似イオン交換と定義することもでき る。 核酸はポリヌクレオチド主鎖のリン酸基と支持体のカルシウム残渣との相互作 用の結果としてヒドロキシアパタイトに結合する。燐酸塩バッファのイオン強度 を変更することによって核酸を分別的に溶出させ得る。即ち、核酸をタンパク質 から分離させ、核酸相互間でＤＮＡをＲＮＡから分離させ、一本鎖ＤＮＡを二重 鎖ＤＮＡから分離させる。最も弱く結合しているＲＮＡは比較的低イオン強度の バッファによって溶出し得る。一本鎖ＤＮＡは二重鎖ＤＮＡよりも弱く結合して いる。支持体に最も強く結合している二重鎖ＤＮＡに対しては最も強いバッファ が必要である。 低イオン強度の燐酸塩バッファ中の生物材料をカラムに導入する。ＤＮＡ及び ＲＮＡの双方の核酸が結合する。次に、より高いイオン強度の第二のバッファを 使用してＲＮＡを溶出させる。ＲＮＡはこの段階でほぼ完全に除去される。二重 鎖ＤＮＡを溶出させて回収するためには最も高イオン強度の第三のバッファを使 用する。本発明方法にヒドロキシアパタイトを使用すると、極めて高い純度をも つ二重鎖ＤＮＡを回収し得る。 上述のように、本発明の好ましい実施態様は更に、トリプルヘリックスアフィ ニティークロマトグラフィー段階を含む。 トリプルヘリックスアフィニティークロマトグラフィー段階では、先行段階で 得られた溶液を、精製すべきＤＮＡの特異的配列と共にハイブリダイゼーション によって三重螺旋を形成し得るオリゴヌクレオチドを共有結合的に結合した支持 体（ＷＯ９６／１８７４４）に接触させる。 特異的配列は二重鎖ＤＮＡに天然に存在する配列でもよく、または、該二重鎖 ＤＮＡに人為的に導入された合成配列でもよい。本発明で使用されるオリゴヌク レオチドは、二重鎖ＤＮＡと直接ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである 。これらのオリゴヌクレオチドは以下の塩基を含み得る： −チミジン（Ｔ）、これは二重鎖ＤＮＡのダブレットＡ．Ｔと共にトリプレット を形成し得る（Ｒａｊａｇｏｐａｌら，Ｂｉｏｃｈｅｍ ２８（１９８９）７８ ５９）； −アデニン（Ａ）、これは二重鎖ＤＮＡのダブレットＡ．Ｔと共にトリプレット を形成し得る； −グアニン（Ｇ）、これは二重鎖ＤＮＡのダブレットＧ．Ｃと共にトリプレット を形成し得る； −プロトン付加シトシン（Ｃ＋）、これは二重鎖ＤＮＡのダブレットＧ．Ｃと共 にトリプレットを形成し得る（Ｒａｊａｇｏｐａｌら、前出）； −ウラシンル（Ｕ）、これは塩基対Ａ．ＵまたはＡ．Ｔと共にトリプレットを形 成し得る。 好ましくは、使用されるオリゴヌクレオチドがシトシンに富むホモピリミジン 配列を含み、ＤＮＡに存在する特異的配列がホモプリン−ホモピリミジン配列で ある。シトシンの存在によって、酸性ｐＨではシトシンがプロトン付加されて安 定であるがアルカリ性ｐＨではシトシンが中和されて不安定であるような三重螺 旋が得られる。 ハイブリダイゼーションによって三重螺旋が形成されるためには、オリゴヌク レオチドとＤＮＡに存在する特異的配列との相補性が重要である。この観点から 、最良の収率及び選択性を得るために、本発明方法ではたがいに完全に相補的な オリゴヌクレオチドと特異的配列とを使用する。例えば、オリゴヌクレオチドと してポリ−ＣＴＴを使用し特異的配列としてポリ−ＧＡＡを使用する。オリゴヌ クレオチドとして例えば、配列：５’−ＧＡＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴ ＴＣＴＴＣＴＴ −３’（（ＧＡＧＧ（ＣＴＴ）₇、配列１）を使用する。この配列の塩基ＧＡＧ Ｇは三重螺旋の形成に関与せず、結合アームからオリゴヌクレオチドを離間させ るスペーサーの機能を果たす。また、配列：（ＣＴＴ）₇（配列２）も例示でき る。これらのオリゴヌクレオチドは、相補的モチーフ（ＧＡＡ）を含む特異的配 列と共に三重螺旋を形成し得る。特異的配列としては実施例に記載したような７ 個、１４個または１７個のモチーフＧＡＡを含む領域を例示し得る。 別の有益な特異的配列は、配列： ５’−ＡＡＧＧＧＡＧＧＧＡＧＧＡＧＡＧＧＡＡ−３’（配列３）である。 この配列は以下のオリゴヌクレオチド： ５’−ＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＧＧＧＡＧＧＧＡＡ−３’（配列４）、または、 ５’−ＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴＧＧＧＴＴ−３’（配列５）と共に三重螺 旋を形成する。 この場合、オリゴヌクレオチドはポリプリン鎖に平行で方向が逆に結合する。 これらの三重螺旋はＭｇ²⁺の存在下でのみ安定である（Ｖａｓｑｕｅｚら，Ｂｉ ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９９５，３４，７２４３−７２５１；Ｂｅａｌ ＆ Ｄｅｒｖａｎ，Ｓｃｉｅ ｎｃｅ，１９９１，２５１，１３６０−１３６３）。 上述のように、特異的配列は、二重鎖ＤＮＡに天然に存在する配列でもよく、 または、二重鎖ＤＮＡに人為的に導入された合成配列でもよい。例えばプラスミ ドの複製起点またはマーカー遺伝子の二重鎖ＤＮＡに天然に存在する配列と共に 三重螺旋を形成し得るオリゴヌクレオチドの使用が特に有益である。この観点か ら、出願人はプラスミドの配列を分析し、特に複製起点のこれらのＤＮＡのいく つかの領域がホモプリン−ホモピリミジン領域を有することを知見した。これら の天然ホモプリン−ホモピリミジン領域と共に三重螺旋を形成し得るオリゴヌク レオチドを合成することができれば、本発明方法を非修飾プラスミド、特にｐＵ Ｃ、ｐＢＲ３２２、ｐＳＶなどの種類の市販のプラスミドに有利に応用できる。 二重鎖ＤＮＡに天然に存在するホモプリン−ホモピリミジン配列としては、大腸 菌ＣｏｌＥ１の複製起点に存在する配列：５’−ＣＴＴＣＣＣＧＡＡＧＧＧＡＧ ＡＡＡＧＧ−３’（配列６）の全部または一部を含む配列を例示し得る。この場 合、三重螺旋を形成するオリゴヌクレオチドは、配列：５’−ＧＡＡＧＧＧＴＴ ＣＴＴＣＣＣＴＣＴＴ ＴＣＣ−３’（配列７）を有しており、Ｂｅａｌ ＆ Ｄｅｒｖａｎ（Ｊ．Ａｍ ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９２，１１４，４９７６−４９８２）及びＪａｙａｓ ｅｎａ ＆ Ｊｏｈｎｓｔｏｎ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９ ２，２０，５２７９−５２８８）に記載されているように二重螺旋の二本の鎖に 交互に結合する。また、プラスミドｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼの遺伝子の 配列：５’−ＧＡＡＡＡＡＧＧＡＡＧＡＧ−３’（配列８）を例示し得る（Ｄｕ ｖａｌ−Ｖａｌｅｎｔｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ，１９９２，８９，５０４−５０８）。複製起点またはマーカー遺伝子に存在す る配列と共に三重螺旋を形成し得るオリゴヌクレオチドの使用が特に有利である 。その理由は、このような複製起点またはこのような遺伝子を含むすべてのＤＮ Ａを同じオリゴヌクレオチドによって精製でき、人工の特異的配列を組込むため にプラスミドまたは二重鎖ＤＮＡを修飾する必要がないからである。 完全な相補性をもつ配列が好ましいが、オリゴヌクレオチドの配列とＤＮＡに 存在する配列との間のある程度の不対合は、過度の親和性低下が生じない範囲で 許容される。このような配列としては、大腸菌のβ−ラクタマーゼ遺伝子に存在 する配 列：５’−ＡＡＡＡＡＡＧＧＧＡＡＴＡＡＧＧＧ−３’（配列９）を例示し得る 。この場合、ポリプリン配列を遮断するチミジンが第三鎖のグアニンによって認 識され、トリプレットＡＴＧが形成される。このトリプレットは２つのトリプレ ットＴＡＴに挟まれて安定である（Ｋｉｅｓｓｌｉｎｇら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ ｔｒｙ，１９９２，３１，２８２９−２８３４）。 特定の実施態様によれば、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列（ＣＣＴ）ｎ 、配列（ＣＴ）ｎまたは配列（ＣＴＴ）ｎを含む。式中のｎは１〜１５の整数で ある（両端値を含む）。（ＣＴ）ｎまたは（ＣＴＴ）ｎ型の配列の使用が特に有 利である。出願人は実際、精製効率がオリゴヌクレオチド中のＣの量によって左 右されることを知見した。特に、実施例７に示すように、オリゴヌクレオチドが 含むシトシンの数が少ないほど精製効率が向上する。勿諭、本発明のオリゴヌク レオチドがモチーフ（ＣＣＴ）、（ＣＴ）または（ＣＴＴ）を混在させていても よい。 使用されるオリゴヌクレオチドは、天然化合物でもよく（非修飾の天然塩基化 合物）、または、化学的に修飾されていてもよい。より特定的には、オリゴヌク レオチドが、ヌクレアーゼ に対する耐性もしくは防御性を強化し得るかまたは特異的配列に対する親和性を 強化し得るいくつかの化学的修飾を有しているのが有利である。 本発明で使用されたオリゴヌクレオチドなる用語はまた、ヌクレアーゼに対す る耐性を強化するために主鎖が修飾された任意のヌクレオシド鎖を意味する。考 えられる修飾の例としては、ＤＮＡと共に三重螺旋を形成し得るオリゴヌクレオ チドホスホロチオエート（Ｘｏｄｏら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ，１９９４，２２，３３２２−３３３０）、ホルムアセタール主鎖またはメチル ホスホネート主鎖を有するオリゴヌクレオチド（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら，Ｊ．Ａ ｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９１，１１３，７７６７−７７６８）がある。ま た、ヌクレオチドのα−アノマーによって合成され、同じくＤＮＡと共に三重螺 旋を形成し得るオリゴヌクレオチド（ＬｅＤｏａｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ ｄｓ Ｒｅｓ．，１９８７，１５，７７４９−７７６０）も使用し得る。主鎖の 別の修飾方法としてはホスホラミデート結合がある。例えば、Ｇｒｙａｚｎｏｖ ＆ Ｃｈｅｎによって記載されたヌクレオチド間のＮ３’−Ｐ５’ホスホラミ デート結合があり、この結合は、ＤＮＡと共 に特に安定な三重螺旋を形成するオリゴヌクレオチドを与える（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈ ｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９４，１１６，３１４３−３１４４）。その他の主鎖の修 飾方法としては、リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボース、ホスホジエス テルの使用がある（Ｓｕｎ ＆ Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｓ ｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，１１６，３１４３−３１４４）。最後に、同じく三重 螺旋を形成し得るＰＮＡ（ペプチド核酸、Ｎｉｅｌｓｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９１，２５４１４９７−１５００；Ｋｉｍら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ ．，１９９３，１１５，６４７７−６４８１）の場合のようにリン酸化主鎖をポ リアミド主鎖で置換してもよく、または、ＤＮＡのポリカチオン性類似体であり 同じく三重螺旋を形成するＤＮＧ（デオキシリボ核酸グアニジン、Ｐｒｏｃ．Ｎ ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９５，９２，６０９７−６１０１）の 場合のようにリン酸化主鎖をグアニジンベースの主鎖で置換してもよい。 また、第三鎖のチミジンが５−ブロモウラシルによって置換されてもよい。そ の結果としてＤＮＡに対するオリゴヌクレオチドの親和性が強化される（Ｐｏｖ ｓｉｃ ＆ Ｄｅｒｖａｎ， Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９８９，１１１，３０５９−３０６１）。 第三鎖はまた非天然性塩基を含んでいてもよく、その例として特に、７−デア ザ−２’−デオキシキサントシン（Ｍｉｌｌｉｇａｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ ｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９３，２１，３２７−３３３）、１−（２−デオキシ− β−Ｄ−リボフラノシル）−３−メチル−５−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ〔４，３ −ｄ〕ピリミジン−７−オン（Ｋｏｈ ＆ Ｄｅｒｖａｎ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ ．Ｓｏｃ．，１９９２，１１４，１４７０−１４７８）、８−オキソアデニン、 ２−アミノプリン、２’−Ｏ−メチル−シュードイソシチジン、または、当業者 に公知の他の任意の修飾がある（Ｓｕｎ ＆ Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉ ｎｉｏｎ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，１９９３，３，３４５−３５６参照）。 また、特にオリゴヌクレオチドと特異的配列との相互作用及び／または親和性 を強化する目的でオリゴヌクレオチドの別の種類の修飾が行われる。より特定的 には、オリゴヌクレオチドのシトシンのメチル化が本発明に特に有利な修飾であ る。このようなメチル化オリゴヌクレオチドは、ほぼ中性のｐＨ範囲 （≧５）で特異的配列と共に安定な三重螺旋を形成する特性が顕著である。従っ て、従来技術のオリゴヌクレオチドよりも高いｐＨで処理することができ、この ようなｐＨではプラスミドＤＮＡが分解する危険が極めて少ない。 本発明方法で使用されるオリゴヌクレオチドは少なくとも３塩基、好ましくは ５〜３０塩基の長さを有している。１０塩基を上回る長さのオリゴヌクレオチド の使用が有利である。最適な長さは、当業者が相互作用の望ましい選択性及び安 定性を考慮して個々のケース毎に決定し得る。 本発明のオリゴヌクレオチドは、公知の任意の技術によって合成され得る。特 に、核酸シンセサイザーを用いて合成され得る。当業者に公知の他の任意の方法 も勿論使用できる。 オリゴヌクレオチドが支持体に共有結合可能になるように、通常はオリゴヌク レオチドを官能化する。即ち、オリゴヌクレオチドの５’位または３’位をチオ ール、アミンまたはカルボキシルなどの末端基によって修飾する。特に、チオー ル基、アミン基またはカルボキシル基が付加されたオリゴヌクレオチドは、ジス ルフィド、マレイミド、アミン、カルボキシル、エステル、エポキシド、臭化シ アノゲンまたはアルデヒド官能基を 含む支持体に結合し得る。これらの結合は、オリゴヌクレオチドと支持体との間 のジスルフィド結合、チオエーテル結合、エステル結合、アミド結合またはアミ ン結合の成立によって形成される。例えば二官能性結合試薬を使用する方法のよ うな当業者に公知の他の任意の方法も使用できる。 更に、支持体に結合したオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを促進 するために、オリゴヌクレオチドが“アーム”及び“スペーサー”塩基配列を含 むのが有利である。即ち、アームを使用すると、オリゴヌクレオチドとＤＮＡと の相互作用が促進されるように選択された間隔を隔ててオリゴヌクレオチドが支 持体に結合し得る。有利なアームは１〜１８個、好ましくは６個または１２個の （ＣＨ₂）基を含む直鎖状の炭素含有鎖とカラムに結合し得るアミンとから構成 されている。アームは、オリゴヌクレオチドの燐酸塩に結合されるか、または、 ハイブリダイゼーションを妨害しない塩基から成る“スペーサー”に結合される 。従って、“スペーサー”はプリン塩基を含み得る。例えば、“スペーサー”は 配列ＧＡＧＧから成り得る。アームが６個または１２個の炭素原子を含む直鎖状 の炭素含有鎖から構成されるのが特に好ましい。 本発明を実施するために、種々の支持体を使用し得る。支持体は例えば、ばら 材料の状態もしくはカラムに予め包装された状態の官能化クロマトグラフィー支 持体、官能化プラスチック表面、または、磁性もしくは非磁性の官能化ラテック スビーズから成る。好ましい支持体はクロマトグラフィー支持体である。使用で きるクロマトグラフィー支持体の例は、アガロース、アクリルアミドまたはデキ ストラン及びそれらの誘導体(例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ 、Ｓｕｐｅｒｏｓｅなど)、ポリ（スチレンジビニルベンゼン）のようなポリマ ー、または、グラフト化もしくは非グラフト化シリカである。クロマトグラフィ ーカラムは拡散モードまたは潅流モードで作動し得る。 最大精製効率を得るためには、オリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズす る複数の位置を有している配列を含むプラスミドを使用するのが特に有利である 。複数のハイブリダイゼーション位置が存在すると、この配列とオリゴヌクレオ チドとの相互作用が促進され、その結果として精製効率が向上する。例えば、モ チーフ（ＣＣＴ）、（ＣＴ）または（ＣＴＴ）のｎ個の反復を含むオリゴヌクレ オチドの場合、少なくともｎ個の相 補的モチーフ、好ましくはｎ＋１個の相補的モチーフを含むＤＮＡ配列を使用す るのが好ましい。即ち、ｎ＋１個の相補的モチーフを含む配列はオリゴヌクレオ チドに２つのハイブリダイゼーション位置を提供する。ＤＮＡ配列が１１個以下 のハイブリダイゼーション位置、即ちｎ＋１０個の相補的モチーフを含むのが有 利である。 別の実施態様によれば、セラミックヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラ フィーとアニオン交換カラムクロマトグラフィー段階とを順序不同で併用する。 好ましくは、弱いアニオン交換カラムを使用する。何故なら、強いアニオンはＤ ＮＡに強力に結合する特性があり、あまりにも強力に結合するので、生成物の回 収が極めて難しくなるからである（収率が６０％未満になる）。出願人が、プラ スミドＤＮＡを保持することなく残留ＲＮＡと結合する弱いアニオン交換体を使 用する理由はここにある。 上述のように、本発明方法は透析濾過段階を含むのが有利である。透析濾過は サンプルの濃縮段階であり、この段階中に透明溶菌液中に存在する水と小分子（ 塩、タンパク質及び小さい寸法の核酸など）が除去される。塩はクロマトグラフ ィー用の リン酸バッファによって置換される。透析濾過の後、溶液は出発溶液の５〜５０ 倍に濃縮されている（濃縮倍率は出発溶液の容量に依存する）。 透析濾過の使用には複数の利点がある。特に、使用の際に爆燃防止装置を要す るイソプロパノールのような有機溶媒の使用を回避し得る。更に、この技術は極 めて多様な量に使用できる。実際、処理すべき量に応じて膜の表面積を増加させ るだけでよい。 調整自在な流速で液体を流動させ得る改質ポリエーテルスルホン膜または改質 酢酸セルロース膜の支持体として機能する装置を透析濾過に使用するのが有利で ある。これらの膜は、膜を透過し得る分子の最大規格寸法によって表されるカッ トオフ点によって定義される。実際の値で示すと、例えば１００ｋＤのカットオ フ点を有する膜は３０ｋＤよりも大きい粒度をもつ分子を保持し得る。 本発明の好ましい方法は、 透析濾過段階と、 セラミックヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー段階と、 ＤＮＡ配列とオリゴヌクレオチドとの特異的ハイブリダイゼーションによる三 重螺旋の形成を伴うアフィニティークロマトグラフィー段階とを含む。 本発明方法は任意の種類の二重鎖ＤＮＡを精製するために使用され得る。例え ば、通常は１つまたは複数の有益な治療用遺伝子を含んでいるプラスミドのよう な環状ＤＮＡを精製するために使用され得る。このプラスミドはまた、複製起点 、マーカー遺伝子、などを含み得る。この方法はまた、種々の配列のＤＮＡを含 む混合物から有益な配列を含む直鎖状または環状のＤＮＡを精製し得る。 通常は、組換えＤＮＡ技術によって修飾した宿主微生物によって出発ＤＮＡを 産生させる。この観点から、回収すべき二重鎖ＤＮＡを含む宿主を先ず増殖及び 増幅させる。このためには、高い細胞密度を与え得る慣用の発酵技術を使用する 。最も頻用される技術は所謂“フェッド−バッチ”法であり、この技術は文献に 十分に記載されている（Ｊｕｎｇら，Ａｎｎ．Ｉｎｓｔ．Ｐａｓｔｅｕｒ／Ｍｉ ｃｒｏｂｉｏｌ．１９８８，１３９，ｐ１２９−１４６；Ｂａｕｅｒら，Ｂｉｏ ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１９７６，１８，ｐ８１−９４）。 発酵後の細胞を溶解処理する。溶解の対象とする細胞の種類次第で及び粗溶菌 液を処理するかまたは透明溶菌液を処理するかに従って、機械的システムまたは 化学的システムを細胞の溶解に使用する。機械的溶解の場合には、ＤＮＡを変性 させないシステムの使用が好ましい（撹拌、熱ショック法、浸透圧ショック法） 。これらの方法は、原核細胞由来のＤＮＡの抽出には使用できない。何故なら、 原核細胞の破壊に機械的処理を使用するとＤＮＡの変性が生じるからである。機 械的溶解の使用対象は真核細胞に限定され、原核細胞に対しては化学的溶解が好 ましい。 当業者に公知の任意の技術（任意に熱ショックなどを併用する界面活性剤及び リゾチームなど）で原核細胞を化学的に溶解する。好ましくは、水酸化ナトリウ ムとＳＤＳとの混合物を使用する。この処理中、ｐＨは１２に上がる。このよう にして得られた溶菌液のｐＨを次に約６まで下げると、染色体ＤＮＡ及びＲＮＡ の一部からタンパク質が沈殿する。この沈殿物を遠心によって除去する。 本発明の好ましい実施態様では、先ず、精製すべき二重鎖ＤＮＡを含んでいる 細胞を化学的溶解処理して透明溶菌液を得 る。このようにして得られた透明溶菌液を透析濾過し、その結果として得られた 濃縮液をセラミックヒドロキシアパタイトカラムでクロマトグラフィー処理する 。 細胞溶解液は原核細胞の溶解液でもよく真核細胞の溶解液でもよい。 原核細胞としては例えば、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ、枯草菌Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ 、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍまたはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓが挙げられる。 真核細胞としては例えば、動物細胞、酵母、真菌類、特にＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙ ｃｅｓ もしくは酵母菌Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓのような酵母、または、ＣＯ Ｓ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｃ１２７細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、などが挙げられる。 本発明方法は、極めて高い純度のプラスミドＤＮＡが迅速かつ容易に得られる 特に有利な方法である。実施例でより特定的に説明するように、本発明方法は、 目的とするプラスミドＤＮＡを、断片化した染色体ＤＮＡ、ＲＮＡ、内毒素、タ ンパク質、ヌクレアーゼ、などのような夾雑成分から有効に分離し得る。より特 定的には本発明方法によれば、染色体ＤＮＡを実質的に含まない（＜０．５％） 二重鎖ＤＮＡ、特にプラスミドＤＮＡ の調製物が得られる。更に、得られたＤＮＡ調製物の内毒素含量（＜５０ＥＵ／ ｍｇ）も極めて低いので、医薬利用に適合する。 出願人は全く意外にも、上記の２つの段階の併用によって、即ち、ヒドロキシ アパタイトカラムクロマトグラフィーとトリプルヘリックスクロマトグラフィー との順序不同の併用によって、染色体ＤＮＡ含量０．０１％のプラスミドＤＮＡ 調製物が得られることを知見した。従って、極めて好ましい本発明の目的はまた 、染色体ＤＮＡ含量０．０１％以下のプラスミドＤＮＡ調製物を提供することで ある。 内毒素含量５０ＥＵ／ｍｇ未満、好ましくは１０ＥＵ／ｍｇ未満のプラスミド ＤＮＡ調製物を提供することも本発明の目的である。体重７０ｋｇの成人に対す る内毒素の許容含量は１注射あたり３５０ＥＵであるが、本発明によれば内毒素 含量はこの許容含量を大幅に下回っている（ＥＵは内毒素単位（Ｅｎｄｏｔｏｘ ｉｎ Ｕｎｉｔ）の略号であり、１ＥＵは１００ｐｇに等しい）。 従って本発明は、特にｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏの細胞遺伝子治療 において医薬として有用なプラスミドＤＮＡ を含む組成物を開示している。この観点から、上述の本発明方法によって製造し た直鎖状二重鎖ＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡを含む医薬組成物も本発明の目的 の１つである。 組成物は“裸の”プラスミドＤＮＡでもよく、または、リポソーム、ナノ粒子 、カチオン性脂質、ポリマー、タンパク質または組換えウィルスなどのような運 搬ベクターに組込まれていてもよい。 本発明を実施例に基づいてより詳細に以下に説明する。これらの実施例は本発 明の代表例であるが、本発明がこれらの実施例に限定されると考えてはならない 。 材料及び方法１．プラスミドｐＸＬ２７８４の構築 以下の実験では、特異的プラスミドｐＸＬ２７８４を使用した。このプラスミ ドは、サイトメガロウィルスのプロモーターと、ルシフェラーゼをコードする遺 伝子と、ホモプリン−ホモピリミジン配列（ＧＡＡ）１７とを含むカセットを内 包している。このプラスミドの構築を以下に記載する。本発明方法が記載のプラ スミドに限定されないことは勿諭明らかである。１．１．プラスミドｐＸＬ２７８４の記述 プラスミドｐＸＬ２７８４は、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＯＲＩ） に由来しカナマイシン耐性をコードするトランスポゾンＴｎ５の遺伝子を選択マ ーカーとして有しているプラスミドＣｏｌＥ１の最小レプリコンであるプラスミ ドベクターｐＸＬ２６７５（２．５１３ｋｂ）から構築する。プラスミドｐＸＬ ２７８４はまた、オリゴマー（ＣＴＴ）ｎ（但し、ｎ＝１〜１７）に結合して三 重螺旋構造を局部的に形成しアフィニティークロマトグラフィーによる精製を可 能にするプラスミドｐＸＬ２５６３に由来のホモプリン−ホモピリミジン配列（ ＧＡＡ）１７を含む。プラスミドｐＸＬ２７８４は、プラスミドＣｏｌＥ１に由 来しプラスミドｐＸＬ５６５にクローニングされたｃｅｒ遺伝子座（３８２ｂｐ ）を有している。ｃｅｒ遺伝子座はリコンビナーゼＸｅｒＣ／ＸｅｒＤの部位特 異的配列を含み、プラスミドのマルチマーを分解させる。このプラスミドｐＸＬ ２７８４にクローニングされたトランスジーンは、ヒトサイトメガロウィルスの プロモーターＰ ＣＭＶのコントロール下でＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ のルシフェラーゼをコードしているｌｕｃ遺伝子の発現カセット（３．３ｋｂ） であ る。このカセットはプラスミドｐＸＬ２６２２に由来する。 プラスミドｐＸＬ２７８４は６３９０ｂｐの大きさを有している。プラスミド ｐＸＬ２７８４の地図を図１に示し、その構築を以下に詳述する。１．２．最小ベクターｐＸＬ２６７５ クレノウフラグメントの作用によってＢｓａＩ末端を平滑末端にした後、プラ スミドｐＢＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ）の１．１５ｋｂのＢｓａＩ−ＰｖｕＩ Ｉフラグメントを、プラスミドｐＵＣ４ＫＩＸＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の１． ２ｋｂのＳｍａＩフラグメントと共にクローニングして、プラスミドｐＸＬ２６ ４７を作製した。 オリゴヌクレオチド５５４２： ５’−ＡＧＣＴＴＣＴＣＧＡ ＧＣＴＧＣＡＧＧＡＴ ＡＴＣＧＡＡＴＴＣＧ ＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧ ＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧ ＡＧＣＴＣＣ−３’（配列１０ ）と、 オリゴヌクレオチド５５４３： ５’−ＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴ ＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴ ＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣ ＣＧＡＡＴＴＣＧＡＴ ＡＴＣＣＴＧＣＡＧＣ ＴＣＧＡＧＡ−３’（配列１１ ）と、 を互いにハイブリダイズし、次いでｐＸＬ２６４７のＨｉｎｄＩＩＩ部位にクロ ーニングして、プラスミドｐＸＬ２６７５を作製した。このプラスミドは、複製 起点とカナマイシン耐性をコードする遺伝子との間に、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｘｈｏ Ｉ、ＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＶ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＮｏｔＩ、Ｓ ｓｔ Ｉなどの多クローング部位を有している。１．３．プラスミドｐＸＬ２６２２中のルシフェラーゼカセッ ト プラスミドｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手）の６６０ｂｐのＭ ｌｕ Ｉ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントに含まれているＣＭＶプロモーターを、ベ ーシックプラスミドｐＧＬ２（Ｐｒｏｍｅｇａ、ルシフェラーゼ遺伝子含有）のＭｌｕ Ｉ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングして、プラスミドｐＸＬ２６２２ を作製した。１．４．オリゴヌクレオチドと共に三重螺旋を形成し得る配列を含むプラスミド ｐＸＬ２５６３及びｐＭＴＬ２２−ＴＨ オリゴヌクレオチド４８１７： ５’−ＧＡＴＣＣＧＡＡＧＡ ＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ ＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧ ＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡ ＡＧＡＡＧＡＡＧＡ Ａ ＧＡＡＧＡＡＧＧ−３’（配列１２）と、 オリゴヌクレオチド４８１８： ５’−ＡＡＴＴＣＣＴＴＣＴ ＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴ ＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣ ＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴ ＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴ ＣＴＴＣＴＴＣＧ−３’（配列 １３）と、 を互いにハイブリダイズさせ、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳのＥｃｏ ＲＩ部位とＢａｍＨＩ部位とにクローニングして、プラスミドｐＸＬ２５ ６３を作製した。６２ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをプラスミド ｐＭＴＬ２２（Ｐ．Ｍｉｎｔｏｎ １９８８ Ｇｅｎｅ ６８：１３９）のＥｃ ｏ ＲＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローニングして、プラスミドｐＭＴＬ２２−ＴＨを 作製した。１．５．ｃｅｒ遺伝子座を含むプラスミドｐＸＬ５６５及びｐＸＬ２７８１ プラスミドＣｏｌＥ１（Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の３８２ｂｐのＨｐａ ＩＩフラグメントをプラスミドＭ１３ｍｐ７（Ｍｅｓｓｉｎｇら，１９８ １ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ９：３０９）のＡｃｃＩ部位にクロ ーニングして、プラスミドｐＸＬ５６５を作製した。ｐＸＬ５６５の ３８２ｂｐのＢａｍＨＩフラグメントをプラスミドｐＳＬ３０１（Ｉｎｖｉｔｒ ｏｇｅｎ）のＢｇｌＩＩ部位にクローニングして、プラスミドｐＸＬ２７８１を 作製した。１．６．プラスミドｐＸＬ２７８４の構築 ｃｅｒ遺伝子座を含む３８２ｂｐのプラスミドｐＸＬ２７８１のＢａｍＨＩ−Ｘｈｏ ＩフラグメントをプラスミドｐＸＬ２６７５のＢａｍＨＩ部位及びＸｈｏ Ｉ部位にクローニングしてプラスミドｐＸＬ２７８２を作製した。 配列（ＧＡＡ）₁₇を含む６２ｂｐのプラスミドｐＭＴＬ２２−ＴＨのＢｇｌＩ Ｉ−ＢａｍＨＩフラグメントをプラスミドｐＸＬ２７８２のＢａｍＨＩ部位にク ローニングしてプラスミドｐＸＬ２７８３を作製した。 最後に、ルシフェラーゼのカセットを含むプラスミドｐＸＬ２６２２の３．３ ｋｂのＳａｌＩ−ＳｐｅＩフラグメントをプラスミドｐＸＬ２７８３のＸｈｏＩ 部位及びＮｈｅＩ部位にクローニングしてプラスミドｐＸＬ２７８４を作製した 。勿論、ルシフェラーゼカセットの代わりに他の任意の遺伝子発現カセットを挿 入し得る。 このプラスミドを含むＤＨ１菌株（Ｍａｎｉａｔｉｓら， １９８９）を２、７及び８００リットルまでの発酵槽で培養する。他の菌株の使 用も可能である。２．発酵 培養すべきプラスミドＤＮＡを含む宿主は慣用の発酵技術によって得られる（ Ｊｕｎｇら，Ａｎｎ．Ｉｎｓｔ．Ｐａｓｔｅｕｒ／Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９８ ８，１３９，ｐ１２９−１４６；Ｂａｕｅｒら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏ ｅｎｇ．１９７６，１８，ｐ８１−９４）。フェッドバッチ法が好ましい。発酵 後、実験室規模の量、即ち５リットル未満の量の場合には慣用の遠心（１０，０ ００ｒｐｍで２０分）によって細胞を回収し、もっと多い量（工業生産量は数百 リットルに上る）の場合には連続遠心によって細胞を回収する。このようにして 回収した細胞を直ちに使用してもよくまたは−８０℃で冷凍してもよい。３．化学的溶菌（透明溶菌液） 細胞を、必要な場合には解凍し、次いで溶解させる。化学的溶菌は３段階に分 解できる。第一段階では、５０ｍＭのグルコース、１０ｍＭのＥＤＴＡまたは等 価成分を含む２５ｍＭのトリスバッファ，ｐＨ６．８に細胞を再懸濁させる。次 いで、０．２ＭのＮａＯＨと１％のＳＤＳとを含む混合物中で細胞を 溶解させる。溶液のｐＨは約１２である。イオン性界面活性剤の選択が必須要件 である。何故なら、非イオン性界面活性剤の場合には１／１０の抽出効率しか得 られないからである。溶菌処理後、酢酸カリウムの存在下で媒体を擬似中和する （溶液の最終ｐＨは５．５〜６である）。このように媒体を酸性化すると、タン パク質と染色体ＤＮＡ及びＲＮＡの一部を含む沈殿物が形成される。この沈殿は ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）と酢酸カリウムとの反応に起因し、ドデシル 硫酸カリウムの白色沈殿物が形成される。 沈殿物を除去しなければならない。このために、５リットル未満の量の場合に はポット遠心（１５分、８，０００ｒｐｍ）によって処理し、もっと多い量（＞ ５リットル）の場合には連続遠心によって処理する。上清を除去する別の方法で は、細孔径２０μｍ以上の高性能フィルター（ＰＡＬＬ，ｐｒｏｆｉｌｅＩＩ、 製造業者の使用説明書通りに使用）によって濾過する。４．透析濾過 化学的溶菌後に回収した上清を透析濾過によって処理してプラスミドＤＮＡを 濃縮し、低分子量分子、特に高濃度で存在する塩を除去する。この透析濾過は、 プラスミドの大きさに基づ いてカットオフ点５０〜３００ｋＤの範囲の膜を用いて行う。好ましくはカット オフ点１００ｋＤの膜を使用する。１００ｋＤという値は、球状分子であるタン パク質に対して与えられた表示値である。異なる立体構造を有する核酸分子の場 合、この表示値の膜によって３０ｋＤ未満の分子量を有する分子が完全に除去さ れると考えられる。透析濾過後に溶液中に存在するＤＮＡの量と透明溶菌液中に 存在する量とをＨＰＬＣによって測定する。測定値から計算した比がこの段階の 収率を表すが、その値は８０％以上である。 この透析濾過中に塩が除去される。塩は１０ｍＭの燐酸塩バッファによって置 換される。従って、生成物をカラムクロマトグラフィー、特にセラミックヒドロ キシアパタイト（登録商標）カラムクロマトグラフィーに直接導入することがで きる。 サンプルを濃縮し不要な塩を除去するために、トリプルヘリックスアフィニテ ィークロマトグラフィーから得られたプラスミドＤＮＡを再度透析濾過する。こ の処理を行うと、適当な製剤用バッファ中で生成物を平衡させることが可能にな る。このためには、カットオフ点１０〜５０ｋＤの膜で透析濾過処理する。収率 は８０％を上回る。 次いで、生成物を無菌的に濾過し、製剤化する前に分析処理する。 ５．セラミックヒドロキシアパタイト（登録商標）カラムクロマトグラフィー 精製すべきサンプルの量及び出発サンプルの純度に応じた適正寸法のカラムに セラミックヒドロキシアパタイト（登録商標）ゲルを充填する。カラムの寸法及 びゲルの量を決定するために、出発溶液中に存在するＤＮＡの量をＨＰＬＣによ って測定し、ｍｇ／ｍｌで表す。何故なら、ヒドロキシアパタイト１ｍｌあたり 少なくとも０．１ｍｇのＤＮＡが結合すると推定されるが、この値は出発溶液中 に存在するＲＮＡの量次第では１ｍｇまたはそれ以上の値まで変化し得るからで ある。ＲＮＡはゲルに結合し、ＲＮＡの量が多いほど結合するＤＮＡの量が少な い。ＲＮＡを分別溶出によって除去する。低イオン強度の燐酸塩バッファ（１０ ｍＭ）でカラムを平衡させる。線速度にして５０ｃｍ／時の流速でサンプルをゲ ルに導入する。次いで、より高い導電率の燐酸塩バッファ（１５０ｍＭ）でゲル を洗浄する。サンプルに含まれているＲＮＡの大部分がこの段階で除去される。 燐酸塩バッファ（２５０ｍＭ）の導電率を更に上昇させることによってプラスミ ドＤＮＡを溶出させる。０．５Ｎ のＮａＯＨを導入することによって残りの夾雑物を除去する。このＮａＯＨは高 いモル濃度（５００ｍＭ）の燐酸塩バッファで中和した後カラムを再使用できる 。医薬製造の場合、この支持体は、従来のクロマトグラフ洗浄剤である０．５Ｎ の水酸化ナトリウムに耐性であり、同時に高濃度のエタノールに耐性であるため 、汚染除去のためにその場で化学処理できるという利点を有している。 セラミックヒドロキシアパタイトは優れた分離能力を有している。この段階で 、ＲＮＡの８０％以上、染色体ＤＮＡの９９．９％を除去することができ、内毒 素の含量を１／１０００に減少させ得る。更に、この方法では、ウシまたは他の 起原のすべての酵素の使用を回避できる（ＲＮアーゼもプロテイナーゼＫも使用 しない）。更に、化学薬品に対して耐性であるため、現在でも再現精度の問題を 伴うことなく４０回以上再使用できる。クロマトグラフィーの収率は８０％以上 である。６．三重螺旋の形成を伴うアフィニティークロマトグラフィー６．１．カラムの 調製 材料 ： 使用されるカラムは、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ ド、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で活性化され蠕動ポンプ（流速＜１ｍｌ／分）に接続 された５ｍｌのＨｉＴｒａｐカラムである。使用される特異的オリゴヌクレオチ ドは５’にＮＨ₂基を有している。 この例では以下のバッファを使用する： −結合バッファ：０．２ＭのＮａＨＣＯ₃、０．５ＭのＮａＣｌ，ｐＨ８．３： −バッファＡ：０．５Ｍのエタノールアミン、０．５ＭのＮａＣｌ，ｐＨ８．３ ： −バッファＢ：０．１Ｍの酢酸塩、０．５ＭのＮａＣｌ，ｐＨ４。方法 ： カラムを３０ｍｌの１ｍＭのＨＣｌで洗浄し、次いで結合バッファに希釈した オリゴヌクレオチド（５ｍｌ中に２５０ナノモル）をカラムに導入し、室温で３ ０分間静置する。カラムを３０ｍｌのバッファＡで３回、３０ｍｌのバッファＢ で順次洗浄する。この結果、オリゴヌクレオチドはＣＯＮＨ結合によってカラム に共有結合する。カラムは４℃で保存し、少なくとも４回使用し得る。６．２．プラスミドの精製 材料 ： プラスミドｐＸＬ２７８４（１に記載）を７．１に記載のオリゴヌクレオチド に結合したＨｉＴｒａｐカラムで精製した。この精製には以下のバッファを使用 する： −バッファＦ：２ＭのＮａＣｌ、０．２Ｍの酢酸塩，ｐＨ４．５ −バッファＥ：１Ｍのトリス−塩酸、ｐＨ９、０．５ｍＭのＥＤＴＡ。方法 ： カラムをバッファＦで洗浄し、次いで、プラスミドを含む溶液をカラムに導入 し、室温で２時間以上インキュベートする。カラムをバッファＦで洗浄し、次い でバッファＥで溶出させる。７．イオン交換クロマトグラフィー 予備精製したサンプルを次に、弱アニオン交換カラムクロマトグラフィーで処 理する。何故なら、強アニオンは極めて強力にＤＮＡを結合する特性を有してお り、余りにも強く結合するので、生成物の回収が極めて難しいからである（収率 が６０％未満になる）。出願人が、プラスミドＤＮＡを保持しないで残留ＲＮＡ と結合する弱アニオン交換体を使用する理由はここに ある。従って好ましくは、ＤＥＡＥセファロースまたはＤＥＡＥハイパーＤのタ イプまたは同種類の弱アニオン交換体を使用する。ゲルを１０ｍＭの燐酸塩バッ ファに平衡させ、セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー段階で得 られたサンプルをゲルに導入する。次に、高濃度のＮａＣｌ溶液を加えることに よって結合ＲＮＡを除去する。良好な衛生条件で処理できるように０．５Ｍの水 酸化ナトリウム溶液によって化学処理して汚染除去する（内毒素の除去、及び、 微生物汚染の危険の回避）。８．複合体サンプル中のプラスミドＤＮＡのＨＰＬＣアッセイ この方法の目的は、種々の精製段階中のプラスミドＤＮＡを定量し、各段階の 収率を測定することである。このようにして、種々の処理の効率を定量的及び定 性的に判定し得る。 以下の技術を使用する。 クロマトグラフィーの支持体はＰｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ のＰｏｒｏｓ Ｒ２ゲルから成る。これは、ポリスチレンジビニルベンゼン支持 体であり、粒子の粒径は１０μｍである。潅流用細孔の孔径は６，０００〜８， ０００オングストロームであり、拡散用細孔の孔径は５００〜１，０００ オングストロームである。ゲル容量は１．７ｍｌである。 イオン対クロマトグラフィーを使用する。溶媒系は水、ｐＨ７．１の酢酸トリ エチルアミン／酢酸トリエチルアミン９０％アセトニトリルである。 流速は３ｍｌ／分である。プラスミドＤＮＡがＲＮＡから分離するような勾配 を設定した。 基準サンプルはＱｉａｇｅｎを製造業者の指示通りに用いて精製したプラスミ ドＤＮＡである。このサンプルはアガロースゲル上でｏｃＤＮＡ及びｃｃｃＤＮ Ａだけを含む。このサンプルはＨＰＬＣで単一ピークだけを与える。２６０ｎｍ のＯＤを測定し、ＯＤの１単位が５０μｇ／ｍｌのＤＮＡを表すことに基づいて ＤＮＡの濃度を測定した。 標準曲線（ｇａｍｍｅ ｄ’ｅｔａｌｏｎｎａｇｅ）を作成するためにこの物 質を漸増量で注入した。 基準ＤＮＡの保持時間に対応するピークの面積を標準曲線に比較する。このよ うにして定量が行われる。９．残留染色体ＤＮＡのアッセイ 大腸菌のｇａｌＫ遺伝子中のプライマーを用いたＰＣＲによって残留ゲノムＤ ＮＡを定量する。大腸菌のｇａｌＫ遺伝子の プライマーは以下の配列を有している（Ｄｅｂｏｕｃｋら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９８５，１３，１８４１−１８５３） ５’−ＣＣＧ ＡＡＴ ＴＣＴ ＧＧＧ ＧＡＣ ＣＡＡ ＡＧＣ ＡＧＴ Ｔ ＴＣ−３’（配列１４）：及び、 ５’−ＣＣＡ ＡＧＣ ＴＴＣ ＡＣＴ ＧＴＴ ＣＡＣ ＧＡＣ ＧＧＧ Ｔ ＧＴ−３’（配列１５）。 反応媒体は、ＰＣＲバッファ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｆｒａｎｃｅ，Ｃｈａｒｂｏ ｎｎｉｅｒｅｓ）中に、１．５ｍＭのＭｇＣｌ₂と０．２ｍＭのｄＸＴＰ（Ｐｈ ａｒｍａｃｉａ，Ｏｒｓａｙ）と０．５μＭのプライマーと２０Ｕ／ｍｌのＴａ ｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）とを含む。反応は、 ９５℃で５分間、 ９５℃で１０秒、６０℃で３０秒、７８℃で１分を３０サイクル、 ７８℃で１０分間、 の順序で行う。 １２４塩基対の長さをもつ増幅したＤＮＡフラグメントをＳｙｂｒＧｒｅｅｎ Ｉ(Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ，ＵＳＡ)の存在下の３％アガロースゲル電気泳動によって分離す る。次いで、大腸菌Ｂ株のウルトラピュア（Ｕｌｔｒａｐｕｒ）ゲノムＤＮＡ（ Ｓｉｇｍａ，ｒｅｆ．Ｄ４８８９）の範囲に準拠して定量する。１０．哺乳動物細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション この方法は、本発明方法によって精製されたプラスミドの生物学的活性を定量 するために使用される。使用した細胞はＮＩＨ ３Ｔ３細胞であり、実験の前日 に細胞を５０，０００細胞／ウェルの割合で２４ウェルの培養プレートに播種す る。プラスミドを１５０ｍＭのＮａＣｌに希釈し、リポフェクタントと混合する 。リポフェクタントの正電荷／ＤＮＡの負電荷の比が３になる量で使用する。混 合物を渦流させて混合し、室温で１０分間静置し、ウシ胎仔血清を除いた培養培 地で希釈し、次いで培養ウェルあたり１μｇのＤＮＡとなる割合で細胞に加える 。３７℃で２時間維持した後、１０％ｖ／ｖのウシ胎仔血清を添加し、５％のＣ Ｏ₂の存在下で細胞を３７℃で４８時間インキュベートする。細胞をＰＢＳで２ 回洗浄し、ルミノメーターＬｕｍａｔ ＬＢ９５０１（ＥＧ ＆ Ｇ Ｂｅｒｔ ｈｏｌｄ，Ｅｖｒｙ．）を用い、記載されたプロトコル（Ｐｒｏｍｅｇａ キット，Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に従ってルシフェ ラーゼ活性を測定する。タンパク質をＢＣＡ技術（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｉｎｔｅｒｃ ｈｉｍ，Ａｓｎｉｅｒｅｓ）によって定量する。１１．各種の技術 アガロースゲル電気泳動及び臭化エチジウム染色によって分析すると、得られ たプラスミドは、単一バンドの形態の“超螺旋”構造の環状ＤＮＡである。精製 されたプラスミド中で高分子量の（染色体）ＤＮＡ及びＲＮＡは微量成分として も全く検出されない。 サンプル中のタンパク質濃度はＭｉｃｒｏ−ＢＣＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）を製造業 者の指示通りに用いて測定する。 内毒素の濃度は、ＬＡＬ（Ｂｉｏｓｅｐｒａ）アッセイを製造業者の指示通り に行って測定する。 制限酵素による消化、ゲル電気泳動、大腸菌の形質転換、核酸沈殿、などのよ うな分子生物学で慣用の方法は文献に記載されている（Ｍａｎｉａｔｉｓら，Ｔ ．，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，＆ Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ．１９８９．Ｍｏｌｅ ｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．，Ｒ．Ｂｒｅ ｎｔ，Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，Ｊ ．Ｇ．Ｓｅｉｄｍａｎ ＆ Ｋ．Ｓｔｒｕｈｌ．１９８７．Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐ ｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ １９８７−１ ９８８．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．）。既存の プロトコル（Ａｕｓｕｂｅｌら，１９８７）を用いたチェーンターミネーション 方法によってヌクレオチド配列を決定した。 制限酵素はＮｅｗ−Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ （Ｂｉｏｌａｂｓ）から入手した。 結合のためには、ＤＮＡフラグメントを、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂、１０ｍＭの ＤＴＴ、２ｍＭのＡＴＰを含む５０ｍＭのトリス−ＨＣｌバッファ，ｐＨ７．４ 中でＴ４ファージのＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下でインキュベー トする。 全自動ＤＮＡシンセサイザーＢｉｏｓｅａｒｃｈ８６００を製造業者の指示通 りに用い、シアノエチル基によってβ保護さ れたホスホラミジットの化学作用を利用してオリゴヌクレオチドを合成する（Ｓ ｉｎｈａ ，Ｎ．Ｄ．，Ｊ．Ｂｉｅｒｎａｔ，Ｊ．ＭｃＭａｎｕｓ ＆ Ｈ．Ｋｏ ｓｔｅｒ．１９８４，“ポリマー支持オリゴヌクレオチド合成，ＸＶＩＩＩ：最 終精製物の脱保護及び単離が容易なＤＮＡフラグメントを合成するためのデオキ シヌクレオチドのβ−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノ−／Ｎ−モルホ リノホスホラミジットの使用（Ｐｏｌｙｍｅｒ ｓｕｐｐｏｒｔ ｏｌｉｇｏｎ ｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＸＶＩＩＩ：Ｕｓｅ ｏｆ β−ｃ ｙａｎｏｅｔｈｙｌ−Ｎ，Ｎ−ｄｉａｌｋｙｌａｍｉｎｏ−／Ｎ−ｍｏｒｐｈｏ ｌｉｎｏ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ ｏｆ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓ ｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅ ｎｔｓ ｓｉｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｓｏ ｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｎａｌ ｐｒｏｄｕｃｔ）”Ｎｕｃｌ．Ａｃ ｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２，４５３９−４５５７；Ｇｉｌｅｓ，Ｊ．Ｗ．１９８５ ．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ．Ａｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｎｏｖ．／Ｄｅｃ．）。 コンピテントにした大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉの菌株ＤＨ５α〔Ｆ’／ｅｎｄＡ１，ｈｓｄＲ１７ ，ｓｕｐＥ４４，ｔｈｉ−１，ｒｅｃＡ１，ｇｖｒＡ９６，ｒｅｌ Ａ１ ，Ｄ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９，ｄｅｏＲ，Ｆ８０ｄｌａｃ（ｌ ａｃＺ ＤＭ１５）〕を、結合したＤＮＡを用いて形質転換させるか、または、そ の形質転換効率を知るために試験されるＤＮＡを用いて形質転換させる。 Ｋｌｅｉｎら，１９８０のプロトコルに従ってプラスミドＤＮＡのミニ調製物 を調製する。 ＬＢ培養培地を使用して大腸菌の菌株を増殖させる（Ｍａｎｉａｔｉｓら，１ ９８２）。菌株を３７℃でインキュベートする。適当な抗生物質を加えたＬＢ培 地の培養皿に細菌を播種する。実施例 実施例１．セラミックヒドロキシアパタイトカラムにおけるプラスミドＤＮＡの 精製 １．１．透明溶菌液の調製 材料 ： この実施例では以下の溶液を使用する： 溶液１：５０ｍＭのグルコースと１０ｍＭのＥＤＴＡとを含む２５ｍＭのトリス ，ｐＨ６．８： 溶液２：０．２ＭのＮａＯＨと１％のＳＤＳ；及び、 溶液３：３Ｍの酢酸カリウム，ｐＨ５。方法 ： ２００ｇの細胞を２，２００ｍｌの溶液１に懸濁させる。次に、溶液２（同じ く２，２００ｍｌ）を加える。最後に、１，１００ｍｌの溶液３を加える。形成 された沈殿物を９，０００ｒｐｍで３０分間遠心することによって除去する。５ ，２００ｍｌの上清が得られる。１．２．透析濾過 材料 ： 表面積１，８６０ｃｍ²でカットオフ点１００ｋＤのＭａｘｉｍａｔｅ膜（Ｆｉ ｌｔｒｏｎ）。 バッファ：１００ｍＭのリン酸ナトリウム，ｐＨ６．８。方法 ： 使用に先立って、汚染除去のために０．５Ｍの水酸化ナトリウムでゲルを１時 間化学処理する。次に、注射用蒸留水によって水酸化ナトリウムを除去する。 段階１．１で得られた上清を約１０倍に濃縮し、次いで４倍容の水、４倍容の １００ｍＭの燐酸塩バッファ，ｐＨ６．８で透析濾過する。最終容量は８１０ｍ ｌである。ＨＰＬＣで測定するとサンプルは２２４ｍｇのプラスミドＤＮＡを含 有している。１．３．セラミックヒドロキシアパタイト（登録商標）による精製 材料 ： この精製には以下のバッファを使用する： バッファＡ＝１０ｍＭの燐酸塩バッファ，ｐＨ６．８： バッファＢ＝１５０ｍＭの燐酸塩バッファ，ｐＨ６．８： バッファＣ＝２５０ｍＭの燐酸塩バッファ，ｐＨ６．８： バッファＤ＝５００ｍＭの燐酸塩バッファ，ｐＨ６．８： ０．５ＭのＮａＯＨ。方法 ： カラム（直径１１３ｍｍ、高さ１７ｃｍ）に１，７００ｍｌのゲルを充填する 。 使用に先立って、汚染除去のために０．５Ｍの水酸化ナトリウムでゲルを１時 間化学処理する。次に、バッファＤを加えて 水酸化ナトリウムを除去する。次いで、カラムをバッファＡで平衡させる。 前述の手順で得られた８１０ｍｌのうちの６１０ｍｌ（即ち１７１ｍｇ）のサ ンプルをゲルに導入する。流速を６０ｍｌ／分とする。次に、ゲルを６リットル のバッファＢで洗浄する。バッファＣを加えて生成物を溶出させる。溶出液の量 は１，５２０ｍｌであり、１４７ｍｇのプラスミドＤＮＡを含有している（ＨＰ ＬＣによって測定）。 次に、ゲルを水酸化ナトリウム（０．５ＭのＮａＯＨ）及びバッファＤで順次 洗浄することによって再生する。このゲルは新しいサイクルに使用できる。 一連処理を２５４ｎｍのＵＶ分光測定によって追跡する。１．４．ＤＥＡＥセファロースによる精製 材料 ： この精製には、バッファＡ、１ＭのＮａＣｌ及び０．５ＭのＮａＯＨをバッフ ァとして使用する。方法 ： カラム（直径５０ｍｍ、高さ６ｃｍ）に１１０ｍｌのゲルを充填する。 使用に先立って、汚染除去のために０．５Ｍの水酸化ナトリウムでゲルを１時 間化学処理する。次に、１ＭのＮａＣｌ溶液によって水酸化ナトリウムを除去す る。次いで、カラムをバッファＡで平衡させる。 前述の手順で得られた１，５２０ｍｌのうちの１，１３０ｍｌ（即ち１１０ｍ ｇ）のサンプルを流速を５０ｍｌ／分でゲルに導入する。ＤＮＡが保持されない ので、流出液を回収する（１，０３６ｍｌ）。この流出液は１０４ｍｇのＤＮＡ を含有している。ゲルに保持された物質を１ＭのＮａＣｌ溶液によって除去する 。ゲルを０．５Ｍの水酸化ナトリウム及び１ＭのＮａＣｌで順次洗浄する。この ゲルは新しいサイクルに使用できる。 一連処理を２５４ｎｍのＵＶ分光測定によって追跡する。１．５．透析濾過 材料 ： 表面積８６０ｃｍ²でカットオフ点３０ｋＤのＵｌｔｒａｓｅｔｔｅ膜（Ｆｉ１ ｔｒｏｎ）。 バッファ：注射用蒸留水。方法 ： 使用に先立って、汚染除去のために０．５Ｍの水酸化ナトリウムで膜を１時間 化学処理する。次に、注射用蒸留水によって水酸化ナトリウムを除去する。直前 の段階で得られた７２０ｍｌの生成物をほぼ３倍に濃縮し、次いで、４倍容の注 射用蒸留水で２回透析濾過する。最終容量は２１０ｍｌである。このサンプルは ６２ｍｇのプラスミドＤＮＡを含有している（ＨＰＬＣによって測定）。１．６．ＤＮＡの特性値 上記の方法によってほぼ純粋なプラスミドが得られる。最終サンプルの種々の 成分を測定し、以下に要約する。 −ＲＮＡ：アガロースゲル中でもＨＰＬＣでも検出不能： −ＰＣＲで測定した染色体ＤＮＡ＜０．５％： −ＨＰＬＣで測定した超螺旋ＤＮＡ＞８０％： −内毒素（ＬＡＬ）＜５０ＥＵ／ｍｇ： −タンパク質（ｍｉｃｒｏＢＣＡ）＜１μｇ／ｍｌ： −ｉｎ ｖｉｔｒｏ生物学的活性： ｐＸＬ２７８４ロット４２ＤＮＡ９５：タンパク質１μｇあたり２０×１０⁶ ＲＬＵ（塩化セシウム勾配で精製した同じプ ラスミドがタンパク質１μｇあたり１３×１０⁶ＲＬＵであることに比較）。１．７．変形 段階１．１の遠心の代わりにデプスフィルタ濾過を用いる以外は上記と同じ手 順で処理した。方法のこの変形では、医薬純度のプラスミドが得られる。その特 性値を以下に要約する。 −ＲＮＡ：アガロースゲル中でもＨＰＬＣでも検出不能： −ＰＣＲで測定した染色体ＤＮＡ＜０．５％： −ＨＰＬＣで測定した超螺旋ＤＮＡ＞７０％： −内毒素（ＬＡＬ）＜５０ＥＵ／ｍｇ −タンパク質（ｍｉｃｒｏＢＣＡ）＜１μｇ／ｍｌ。実施例２：トリプルヘリックスアフィニティークロマトグラフィーによるヒドロ キシアパタイト溶出物の精製 ２．１．アフィニティカラムの調製 使用したカラムは、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｐｈａｒｍａｃ ｉａ）で活性化し蠕動ポンプに接続した５ｍｌのＨｉＴｒａｐカラムである。使 用した特異的オリゴヌクレオチドは、５’にＮＨ₂基を有している。その配列を 以下に示す。 ５’−ＧＡＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴ −３’（配列１）。 この実施例では以下のバッファを使用する： 結合バッファ：０．２ＭのＮａＨＣＯ₃、０．５ＭのＮａＣｌ，ｐＨ８．３： バッファＡ：０．５Ｍのエタノールアミン、０．５ＭのＮａＣｌ，ｐＨ８．３ ： バッファＢ：０．１Ｍの酢酸塩、０．５ＭのＮａＣｌ，ｐＨ４。 ３０ｍｌの１ｍＭのＨＣｌでカラムを洗浄し、次いで結合バッファに希釈した オリゴヌクレオチド（５ｍｌ中に２５０ナノモル）をカラムに導入し、室温で３ ０分間静置する。カラムを３０ｍｌのバッファＡで３回、３０ｍｌのバッファＢ で順次洗浄する。その結果、オリゴヌクレオチドがＣＯＮＨ結合によってカラム に共有結合する。カラムを４℃で保存する。２．２．プラスミドの精製 以下のバッファを使用する： バッファＦ：２ＭのＮａＣｌ、０．２Ｍの酢酸塩，ｐＨ４．５： バッファＥ：１Ｍのトリス−塩酸、ｐＨ９、０．５ｍＭのＥＤＴＡ。 カラムをバッファＦで平衡させ、次いで、実施例１．３に記 載の条件で得られた９ｍｌのヒドロキシアパタイト溶出液を予め２ＭのＮａＣｌ 及びｐＨ４．５に調整し、カラムに導入して室温で一夜循環させる（流速０．５ ｍｌ／分）。カラムをバッファＦで洗浄し、次いでバッファＥで溶出させる。２ ５４ｎｍのＵＶ分光測定によってＤＮＡを検出する。２．３．精製ＤＮＡの特性値 ＨＰＬＣ分析（前述の方法）によれば精製ＤＮＡは２４．８分の保持時間の単 一ピークとして検出される。ＲＮＡは全く検出されない。また、１％アガロース ゲル電気泳動及び臭化エチジウム染色後の精製ＤＮＡは検出可能な量のＲＮＡを 全く含んでいない。 また、リラックス型ＤＮＡを超螺旋ＤＮＡから分離するＧｅｎ−Ｐａｋ Ｆａ ｘ Ｗａｔｅｒｓカラムを用いたアニオン交換クロマトグラフィーによってＤＮ Ａを分析した。カラムに導入した処理前のサンプル中の超螺旋ＤＮＡは８０％で あった精製サンプルは９７％の超螺旋ＤＮＡを含んでいた。。 大腸菌のゲノムＤＮＡを第３項に記載の技術に従ってＰＣＲによって定量した 。アフィニティカラムで精製したＤＮＡは約０．０１％のゲノムＤＮＡを含んで いる。実施例３ ３．１．プラスミドの精製 実施例２に記載の手順で調製したアフィニティカラムを以下の配列のオリゴヌ クレオチドと共に使用する。 ５’−ＣＴＴ ＣＴＴ ＣＴＴ ＣＴＴ ＣＴＴ ＣＴＴ ＣＴＴ−３’（配列 ２）。 以下のバッファを使用する： バッファＦ：２ＭのＮａＣｌ、０．２Ｍの酢酸ナトリウム，ｐＨ４．５： バッファＥ：１Ｍのトリス−塩酸、ｐＨ９、０．５ｍＭのＥＤＴＡ。 カラムをバッファＦで平衡させ、次いで実施例１．７に記載のプロトコルで精 製し、１０ｍｌのバッファＦに希釈した０．８ｍｇのプラスミドを加える。カラ ムのサンプルを室温で１晩循環させる（流速０．５ｍｌ／分）。カラムをバッフ ァＦで洗浄し、次いでバッファＥで溶出させる。２５４ｎｍのＵＶ分光測定によ ってＤＮＡを検出する。３．２．精製ＤＮＡの特性値 リラックス型ＤＮＡを超螺旋ＤＮＡから分離するＧｅｎ−Ｐ ａｋ Ｆａｘ Ｗａｔｅｒｓカラムを用いたアニオン交換クロマトグラフィーに よってＤＮＡを分析した。カラムに導入した処理前のサンプル中の超螺旋ＤＮＡ は７２％であったが、精製サンプルは１００％の超螺旋ＤＮＡを含んでいた。。 大腸菌のゲノムＤＮＡを前述の技術に従いＰＣＲによって定量した。アフィニ ティカラムに導入した処理前のサンプルは約０．３％のゲノムＤＮＡを含んでい たが、アフィニティカラムで精製したＤＮＡは約０.０１％のゲノムＤＮＡを含 んでいた。実施例４：ヒドロキシアパタイト溶出（ｐＸＬ２７８４）の精製後のトリプルヘ リックスアフィニティークロマトグラフィーの規模の変更 ４．１．アフィニティカラムの調製 使用したカラムは、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｐｈａｒｍａｃ ｉａ）で活性化し、実施例２．１に記載の方法で、配列： ５’−ＣＴＴ ＣＴＴ ＣＴＴ ＣＴＴ ＣＴＴ ＣＴＴ ＣＴＴ−３’〔（Ｃ ＴＴ）７：配列２〕のオリゴヌクレオチドに結合させたセファロース４ Ｆａｓ ｔ Ｆｌｏｗを含むカラムである。 カラム（直径２６ｍｍ、高さ１６ｃｍ）に８０ｍｌのゲルを充填し、蠕動ポン プに接続する。４．２．プラスミドの精製 以下のバッファを使用する： バッファＦ：２ＭのＮａＣｌ、０．２Ｍの酢酸ナトリウム，ｐＨ４．５： バッファＥ：１Ｍのトリス−塩酸、ｐＨ９、０．５ｍＭのＥＤＴＡ。 カラムをバッファＦに平衡させ、次いで、実施例１．３に記載の条件で得られ た１３５ｍｌ、即ち８ｍｇのヒドロキシアパタイト溶出液を、予めｐＨ４．５、 ２ＭのＮａＣｌ溶液に調整し、カラムに導入して室温で４回循環させる（流速１ ．２５ｍｌ／分）。カラムをバッファＦで洗浄し、次いでバッファＥで溶出させ る。２５４ｎｍのＵＶ分光測定によってＤＮＡを検出する。２．２ｍｇが回収さ れる。４．３．精製ＤＮＡの特性値 ＨＰＬＣ分析（前述の方法）によれば、精製ＤＮＡは２４．４分の保持時間で 単一ピークとして検出される。ＲＮＡは全く検出されない。また、１％アガロー スゲル電気泳動及び臭化エチ ジウム染色後の精製ＤＮＡは検出可能なＲＮＡを全く含んでいない。 また、リラックス型ＤＮＡを超螺旋ＤＮＡから分離するＧｅｎ−Ｐａｋ Ｆａ ｘ Ｗａｔｅｒｓカラムを用いたアニオン交換クロマトグラフィーによってＤＮ Ａを分析した。カラムに導入した処理前のサンプル中の超螺旋ＤＮＡは９４％で あったが、精製サンプルは１００％の超螺旋ＤＮＡを含んでいる。 大腸菌のゲノムＤＮＡを第３項に記載の技術に従ってＰＣＲによって定量した 。カラムに導入した処理前のサンプル中のゲノムＤＮＡは約２％であったが、ア フィニティーカラムで精製したＤＮＡは約０．０２％のゲノムＤＮＡを含んでい る。実施例５：セラミックヒドロキシアパタイトカラムによるプラスミドＤＮＡの大 規模精製 ５．１．透明溶菌液の調製 プラスミドｐＸＬ２７７４によって形質転換した大腸菌の培養物から実施例１ ．１に記載の手順で透明溶菌液を調製する。プラスミドｐＸＬ２７７４は小さい 寸法（約４．５ｋｂ）を有し、特に、 −Ｌｕｃ遺伝子の発現カセット（ＣＭＶプロモーター−ｌｕｃ −ポリ（Ａ）＋）と、 −選択マーカーｓｕｐ Ｐｈｅと、 −Ｒ６Ｋの複製起点ｏｒｉ γと、 −ＣｏｌＥ１のｃｅｒフラグメントとを含む。方法 ： ４５６ｇの細胞を５，０００ｍｌの溶液１に懸濁させる。次に、溶液２（５， ５００ｍｌ）を加える。最後に、２，５００ｍｌの溶液３を加える。形成された 沈殿物を９，０００ｒｐｍで３０分間遠心するかまたは濾過によって除去する。 １２．３リットルの上清が得られる。５．２．透析濾過 材料 ： 表面積１，８６０ｃｍ²でカットオフ点１００ｋＤのＭａｘｉｍａｔｅ膜（Ｆｉ ｌｔｒｏｎ）。 バッファ：１００ｍＭのリン酸ナトリウム，ｐＨ６．８。方法 ： サンプルを実施例１．２に記載の方法で透析濾過する。 最終容量は９４５ｍｌである。ＨＰＬＣで測定するとこのサンプルは２５３ｍ ｇのプラスミドＤＮＡを含んでいる。５．３．セラミックヒドロキシアパタイト（登録商標）による精製 材料 ： この精製には以下のバッファを使用する： バッファＡ＝１００ｍＭの燐酸塩バッファ，ｐＨ６．８： バッファＢ＝１５０ｍＭの燐酸塩バッファ，ｐＨ６．８： バッファＣ＝２５０ｍＭの燐酸塩バッファ，ｐＨ６．８： バッファＤ＝５００ｍＭの燐酸塩バッファ，ｐＨ６．８： ０．５ＭのＮａＯＨ。方法 ： カラム（直径１００ｍｍ、高さ２３ｃｍ）に１，７００ｍｌのゲルを充填する 。 使用に先立って、汚染除去のために０．５Ｍの水酸化ナトリウムでゲルを１時 間化学処理する。次に、バッファＤを加えて水酸化ナトリウムを除去する。次い で、カラムをバッファＡで平衡させる。 前述の手順で得られた９４５ｍｌ（即ち１２８ｍｇ）のうちの４７５ｍｌをゲ ルに加える。流速を６５ｍｌ／分とする。次に、ゲルを６リットルのバッファＢ で洗浄する。バッファＣを 加えて生成物を溶出させる。溶出液の容量は１，７６０ｍｌであり、１００ｍｇ のプラスミドＤＮＡを含有している（ＨＰＬＣによって測定）。 次に、ゲルを水酸化ナトリウム（０．５ＭのＮａＯＨ）及びバッファＤで順次 洗浄することによって再生する。このゲルは新しいサイクルに使用できる。 一連処理を２５４ｎｍのＵＶ分光測定によって追跡する。５．４．透析濾過 実施例１．５に記載のプロトコルに従って透析濾過を実施した。５．５．ＤＮＡの特性値 上記の方法によってほぼ純粋なプラスミドが得られる。最終サンプルの種々の 成分を測定し、以下に要約する。 −ＲＮＡ：アガロースゲル中で検出不能： −ＰＣＲで測定した染色体ＤＮＡ：０．６％ −ＨＰＬＣで測定した超螺旋ＤＮＡ：８７％ −内毒素（ＬＡＬ）＜５０ＥＵ／ｍｇ −タンパク質（ｍｉｃｒｏＢＣＡ）＜１μｇ／ｍｌ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ， ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．少なくとも１つのセラミックヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィ ー段階を含むことを特徴とする医薬純度の二重鎖ＤＮＡの精製方法。 ２．２つのクロマトグラフィー段階を含み、一方の段階がヒドロキシアパタイト カラムにおいて行われることを特徴とする二重鎖ＤＮＡの精製方法。 ３．１つのヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー段階と１つのアフィ ニティークロマトグラフィー段階またはイオン交換クロマトグラフィー段階とを 含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。 ４．１つのヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー段階と、ＤＮＡ配列 と固定化オリゴヌクレオチドとの特異的ハイブリダイゼーションによって三重螺 旋の形成を伴う１つのアフィニティークロマトグラフィー段階とを含むことを特 徴とする請求項３に記載の方法。 ５．１つのヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー段階と１つのアニオ ン交換クロマトグラフィー段階とを含むこと を特徴とする請求項３に記載の方法。 ６．更に、透析濾過段階を含むことを特徴とする請求項１から５のいずれか一項 に記載の方法。 ７．細胞の化学的溶解段階と、 透析濾過段階と、 セラミックヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー段階と、 ＤＮＡ配列と固定化オリゴヌクレオチドとの特異的ハイブリダイゼーションによ って三重螺旋の形成を伴うアフィニティークロマトグラフィー段階と、 を含むことを特徴とする二重鎖ＤＮＡの精製方法。 ８．二重鎖ＤＮＡが更に１つまたは複数の有益な配列を含むことを特徴とする請 求項１から７のいずれか一項に記載の方法。 ９．二重鎖ＤＮＡがプラスミドＤＮＡであることを特徴とする請求項１から８の いずれか一項に記載の方法。 １０．染色体ＤＮＡの含量が０．０１％以下であることを特徴とする組換えプラ スミドＤＮＡ調製物。 １１．内毒素の含量が５０ＥＵ／ｍｇ以下であることを特徴とする請求項１０に 記載の精製された組換えプラスミドＤＮＡ調 製物。 １２．内毒素の含量が１０ＥＵ／ｍｇ以下であることを特徴とする請求項１１に 記載の精製された組換えプラスミドＤＮＡ調製物。 １３．請求項１から９のいずれか一項に記載の方法によって得られたＤＮＡを含 む医薬組成物。