CZ295587B6 - Purifikace plazmidové DNA farmaceutické kvality - Google Patents

Purifikace plazmidové DNA farmaceutické kvality Download PDF

Info

Publication number
CZ295587B6
CZ295587B6 CZ19982984A CZ298498A CZ295587B6 CZ 295587 B6 CZ295587 B6 CZ 295587B6 CZ 19982984 A CZ19982984 A CZ 19982984A CZ 298498 A CZ298498 A CZ 298498A CZ 295587 B6 CZ295587 B6 CZ 295587B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
dna
plasmid
sequence
buffer
column
Prior art date
Application number
CZ19982984A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ298498A3 (cs
Inventor
Pierre Wils
Monique Ollivier
Original Assignee
Centelion
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centelion filed Critical Centelion
Publication of CZ298498A3 publication Critical patent/CZ298498A3/cs
Publication of CZ295587B6 publication Critical patent/CZ295587B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/101—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by chromatography, e.g. electrophoresis, ion-exchange, reverse phase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Řešení se týká způsobu purifikace dvouvláknové plazmidové DNA, poskytující DNA farmaceutické kvality, kdy způsob zahrnuje krok chromatografie na koloně keramického hydoxyapatitu.ŕ

Description

(57) Anotace:
Řešení se týká způsobu purifikace dvouvláknové plazmidové DNA, poskytující DNA farmaceutické kvality, kdy způsob zahrnuje krok chromatografíe na koloně keramického hydoxyapatitu.
ORI
Purifíkace plazmidové DNA farmaceutické kvality
Oblast techniky
Předložený vynález se týká nové metody pro purifíkaci DNA. Metoda podle vynálezu umožňuje rychle purifíkovat farmaceuticky použitelnou dvouvláknovou DNA. Metoda purifíkace podle vynálezu zahrnuje pouze diafiltraci a chromatografie.
Dosavadní stav techniky
Techniky genové terapie a buněčné terapie zaznamenávají výjimečný vývoj. Nicméně tyto techniky zahrnují možnost velké důležité množství farmaceuticky čisté DNA, zejména plazmidové DNA. V nových terapiích medikament je často tvořený samotnou DNA, kterou je možné připravit v přijatelném množství, izolovat ji a vhodným způsobem purifíkovat k terapeutickému použití u lidí, zejména pro použití intravenózním způsobem.
Problémy týkající se množství a purifíkace nejsou zahrnuty v klasických metodách izolace DNA. Metody použité v laboratoři nejsou přenosné do farmaceutického průmyslu pro purifíkaci plazmidové DNA. Dvě z těchto metod, které jsou nejvíce používané jsou to metody, které poskytují nej lepší výsledky. Vycházejí ze surového bakteriálního lyzátu obohaceného plazmidovou DNA při současném vyloučení kontaminantů. Pro rozbití bakteriální stěny se používá zejménalyzozym vaječného bílku, potom se lyzát odstředí, aby se vyloučily buněčné zbytky. Supematant je potom podroben působení pankreatické Rnasy zvířecího původu, která umožňuje vyloučit RNA, která představuje v této etapě okolo 75 % přítomných nukleových kyselin.
Proteiny jsou vysráženy směsí fenol/chloroform/izoamylalkohol. Získaný supematant po odstřeďování je zbaven proteinů a RNA, ale obsahuje ještě velké množství chromozomální DNA, která musí být vyloučena až v následující etapě. Tato etapa spočívá v ultracentrifugaci v přítomnosti ethidiumbromidu a chloridu cesnatého. Tři typy nukleových kyselin: chromozomální DNA, plazmidová DNA a RNA mají větší nebo menší schopnost fixovat ethidiumbromid. Rozdělují se ve třech fázích ultracentrifugace v gradientu chloridu cesnatého.
Varianta tohoto protokolu spočívá v následujícím působení pankreatické Rnasy redukcí v přítomnosti alkalického detergentu, následovanou extrakcí směsí fenol/chloroform. DNA je tedy srážena ethanolem, rozpuštěna a znovu srážena polyethylenglykolem.
Tyto dvě metody, které umožňují získat roztok plazmidové DNA jsou běžně používané pro průmyslovou výrobu farmaceuticky čistého produktu. Použití enzymů zvířecího původu způsobuje problém. Lyzozym a pankreatická Rnasa, vzhledem ke svému původu, riskují zavlečení virové kontaminace do konečného produktu. Navíc organická rozpouštědla jsou velmi toxická a musí být vyloučena jestliže se jedná o výrobek, který se má použít jako lék. Tato rozpouštědla vedou ke značnému zvýšení ceny výrobku spojenou zejména s jejich skladováním s jejich používáním za maximálně bezpečných podmínek a s odstraněním toxických odpadů, které se vytvářejí a z důvodu obtížnosti úplného úspěšného odstranění těchto produktů v konečném roztoku. Co se týče ethidiumbromidu, je jako takový toxický, mutagenní a teratogenní a ani stopové množství nemůže být tolerováno v produktu, který je určen pro léčení. Použití rozpouštědel, toxických reaktantů, stejně jako enzymů zvířecího původu je nekompatibilní s průmyslovou metodou odpovídající dobrým postupům výroby.
-1 CZ 295587 B6
Podstata vynálezu
Předložený vynález popisuje novou jednoduchou a účinnou metodu pro purifíkaci DNA. Metoda popsaná v předloženém vynálezu umožňuje produkci velkého množství velmi čisté DNA. Metoda popsaná v předloženém vynálezu výhodně umožňuje vyloučit použití toxických organických rozpouštědel a použití enzymů zvířecího původu. Umožňuje také omezit počet odstřeďování a omezit slabý výtěžek zejména z důvodu etap srážení PEG, octanem amonným nebo CaCl2. metoda podle vynálezu umožňuje získat velké množství DNA (100 mg, lg, 10 g nebo více) bez technických obtíží. Metoda podle vynálezu pracuje s metodami kompatibilními s dobrými výrobními postupy a umožňuje získat DNA farmaceutické kvality.
První předmět vynálezu se týká postupu pro purifíkaci dvouvláknové DNA, který umožňuje získat velmi rychle velké množství plazmidové DNA s farmaceutickou čistotou a zahrnuje etapu chromatografíe na hydroxyapatické koloně v keramické formě, hydroxyapatit ve formě krystalické koloně byl již dříve známý, ale pro svoji křehkost bylo jeho použití obtížné a omezené. Keramická forma je více odolná fyzikálně i chemicky.
Upřednostňovaný způsob postupu podle vynálezu obsahuje dvě chromatografícké etapy, alespoň jednu chromatografíi na hydroxyapatitu.
Druhá chromatografíe je výhodně chromatografíe afínitní nebo iontoměničová. Tyto dvě chromatografíe mohou být provedeny v jakémkoliv pořadí.
Podle způsobu provedení, zejména upřednostňovaném, postup podle vynálezu zahrnuje etapu chromatografíe na koloně hydroxyapatitové a etapu afínitní chromatografíe Triple-Helix. Afinitní chromatografíe Triple-Helix je založena na použití nosiče, na kterém je vázán kovalentním způsobem oligonukleotid schopný tvořit hybridizací triple helix se specifickou sekvencí přítomnou na uvedené DNA. Tyto dvě chromatografíe mohou být provedeny vjakémkoliv pořadí.
Podle jiného způsobu provedení postup podle vynálezu zahrnuje etapu chromatografíe na hydroxyapatické koloně a etapu iontoměničové chromatografíe.
Postup podle vynálezu výhodně obsahuje mimo jiné etapu diafíltrace. Taje všeobecně provedena před chromatografiemi.
Hlavní etapa postupu podle vynálezu spočívá v chromatografíi na hydroxyapatické koloně.
Hydroxyapatie je komplex fosforečnanu vápenatého obsahujícího deset atomů vápníku. Keramická forma, která je stabilnější než krystalická forma, byla poskytnuta Bio-Rad Laboratories a Asahi Optical Co., Ltd. Keramická sloučenina má stejné vlastnosti jako krystalická sloučenina, ale bez fyzikálních omezení; tento materiál se spíše používá pro chromatografíe pro purifíkaci proteinů, oproti keramické formě má výhody a umožňuje získat velmi dobré výsledky, co se týče purifikace nukleových kyselin, je to materiál makropórovitý, sférický, chemicky a fyzikálně velmi stabilní a může být opakovaně použit pro více použití bez ztráty účinnosti. Tato keramická forma může snášet zvýšené tlak, velmi vysoké pH, velmi rychlý průtok a organická rozpouštědla.
Chromatografíe na koloně keramického hydroxyapatitu je typ chromatografíe částicové, která není ze striktního hlediska ani chromatografíí afínitní ani chromatografíí iontoměničovou. Má vlastnosti těchto dvou typů chromatografíí a může se tedy definovat jako pseudoafinitní nebo pseudoiontoměničová chromatografíe.
Nukleové kyseliny se váží na hydroxyapatit na základě interakcí mezi skupinami fosfátového skeletu a vápenatými zbytky nosiče. Nukleové kyseliny mohou být eluovány různými způsoby za použití různé iontové síly fosfátových pufrů. Nukleové kyseliny mohou být tedy separovány od proteinů, DNA může být separována od RNA a jednovláknová DNA může být separovány od
-2CZ 295587 B6 dvouvláknové DNA. RNA se váží méně pevně a mohou být eluovány pufrem relativně slabí iontové síly. Jednovláknové DNA jsou slaběji fixované než dvouvláknové DNA, které jsou pevněji vázané k nosiči a nepotřebují silnější pufr.
Biologický materiál ve fosfátovém pufru slabší ionické síly se vloží na kolonu. Nukleové kyseliny DNA a RNA se fixují. Potom je použit druhý pufr zvýšené iontové síly pro eluci RNA, která je téměř úplně vyloučen v tomto stádiu. Třetí pufr vysoké iontové síly je použit pro eluci dvouvláknové DNA, která je požadována. Použití hydroxyapatitu v metodě podle vynálezu umožňuje získat dvouvláknovou DNA, která má vysoký stupeň čistoty.
Jak je již naznačeno, způsob provedení vynálezu obsahuje mimo jiné etapu afinitní chromatografie triple-helix.
Afinitní chromatografíe triple-helix spočívá v průchodu roztoku získaného na nosiči, na kterém je vázán kovalentně oligonukleotid schopný tvořit hydridaci triple-helix se specifickou sekvencí přítomnou na DNA, která je určena k purifikaci (WO96/18744).
Specifická sekvence může být sekvencí přirozeně přítomnou na dvouvláknové DNA nebo sekvencí syntetickou uměle vloženou do této kyseliny. Oligonukleotidy použité v předloženém vynálezu jsou oligonukleotidy hybridující přímo s dvouvláknovou DNA. Tyto oligonukleotidy mohou obsahovat následující báze:
- thymidin (T), který ie schopný tvořit triplet s dubletem A.T dvouvláknová DNA (Rajagopal et al., Biochem 28 (1989) 7859),
- adenin (A), který je schopný tvořit triplet s dubletem A.T dvouvláknové DNA
- guanin (G), který je schopný tvořit triplet s dubletem G.C dvouvláknové DNA
- protonovaný cytosin (C+), který je schopný tvořit triplet s dubletem G.C dvouvláknové DNA (Rajagopal et al., Biochem 28 (1989) 7859)
- uráčil (U), který je schopný tvořit triplet s páry bází A.U nebo A.T.
Použité oligonukleotidy obsahují zejména sekvence homopyrimidinové, bohaté na cytosiny a specifickou sekvenci přítomnou na DNA, která je sekvencí homopurono-homopyrimidinovou. Přítomnost cytosinů umožňuje, že triple-helix je stabilní při kyselém pH, kde jsou cytosiny protonované a destabilizovaný v alkalickém pH, kde cytosiny jsou neutrální.
Pro umožnění tvorby triple-helix hybridací je důležité, aby oligonukleotid a specifická sekvence přítomná na dvouvláknové DNA byly komplementární. V tomto ohledu pro získání nejlepších výtěžků nej lepší selektivity se používá postup podle vynálezu, ve kterém oligonukleotid a specifická sekvence jsou úplně komplementární. Může se zejména jednat o oligonukleotid poly-CTT a specifickou sekvenci poly-GAA. Například se může uvést oligonukleotid sekvence 5'GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (GAGG (CTT)7, (SEQ ID n°l), ve které báze GAGG netvoří triple-helix, ale umožňuje oddálit rameno oligonukleotidů k vázání. Může se uvést sekvence (CTT)7 (SEQ ID n°2). Tyto oligonukleotidy jsou schopné tvořit triple-helix se specifickou sekvencí obsahující komplementární motivy (GAA). Může se jednat zejména o oblast obsahující 7, 14 nebo 17 motivů GAA, jak je popsáno v příkladech.
Jinou specifickou sekvencí zájmu je sekvence:
5'-AAGGGAGGGAGGAGAGGAA-*3'(S EQ ID n0 3)
Tato sekvence tvoří triple-helix s oligonukleotidem
-3CZ 295587 B6
5'-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3' {SEQ ID n 0 4) nebo
5'-TTGGTGTGGTGGGTGGGTT-3'(SEQ ID n°5).
V tomto případě se oligonukleotid fixuje v antiparalelním směru polypurinového vlákna. Tyto triple-helixy jsou stabilní jen v přítomnosti Mg2+ (Vasquez et al., Biochemistry, 1995, 34, 7243-721, Beal etDerven, Science, 1991, 251, 1360-1363).
Jak je již naznačeno, specifická sekvence může být sekvence přirozeně přítomná na dvouvláknové DNA nebo sekvence syntetická uměle vložená do této kyseliny. Je zejména zajímavé použít oligonukleotid schopný tvořit triple-helix se sekvencí přirozeně přítomnou na dvouvláknové DNA, například na počátku replikace plazmidu nebo na značeném genu. V tomto ohledu předkladatel provedl analýzu plazmidové sekvence a ukázal, že určité oblasti této DNA, zejména v počátku replikace, mají oblasti homopurino-homopyrimidinové. Syntéza oligonukleotidů schopných tvořit triple-helix s těmito přirozenými homopurino-homopyrimidinovými oblastmi umožňuje výhodně aplikovat postup podle vynálezu na nemodifikované plazmidy, zejména plazmidy komerčního typu pUC, pBR322, pSV atd. Mezi homopurino-homopyrimidinovými sekvencemi přirozeně přítomnými na dvouvláknové DNA se mohou uvést sekvence obsahující celek nebo část sekvence 5-CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3' (SEQIDn06) přítomné na počátku replikace ColEl E. coli. V tomto případě oligonukleotid tvořící triple-helix má sekvenci: 5-GAAGGGTTCTTCCCTCTTTCC-3' (SEQ ID n°7) a fixuje se alternativně na dvě vlákna dvouhelixu, jak je popsáno (Bael et Dervan J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 4976—4982, Jayasena et a Johnston, Nucleic Acids Res. 1992, 20, 5279-5288). Může se také uvést sekvence 5'GAAAAAGGAAGAG-3' (SEQ ID n°8) genu β-laktamasy plazmidu pBR322 (Duval-Valentin et al., Proč. Nati. Acad. Sci USA, 1992, 89, 504-508). Použití oligonukleotidu schopného tvořit triple-Helix se sekvencí přirozenou na počátku replikace nebo na značeném genu je zejména výhodné, protože umožňuje se stejným oligonukleotidem purifikovat každou DNA obsahující výše uvedený počátek replikace nebo výše uvedený značený gen. Není tedy nutné modifikovat plazmid nebo dvouvláknovou DNA, aby byla zahrnuta do umělé specifické sekvence.
Ačkoliv sekvence úplně komplementární budou upřednostněny může být tolerováno určité nespárování mezi sekvencí oligonukleotidu a sekvencí přítomnou na DNA, což nevede k velké ztrátě afinity. Může se uvést sekvence 5'-AAAAAAGGGAATAAGGG-3' (SEQ ID n°9) přítomná v genu β-laktamasy E. coli. V tomto případě thymidin, který přerušuje sekvenci polypurinovou může být rozpoznán guaninem třetího vlákna tvořícího tak triplet ATG, který je stabilní, když je doprovázený dvěma triplety TAT (Kiessling et al., Biochemmistry, 1992, 31, 2829-2834).
Podle způsobu provedení oligonukleotidy podle vynálezu obsahují sekvenci (CCT)n, sekvenci (CT)n nebo sekvenci (CTT)n, ve kterých n odpovídá hodnotám mezi 1 až 15. Je také výhodné použít sekvence typu (CT)n nebo (CTT)n. Předkladatel vskutku ukázal, že na výtěžek purifíkace mělo vliv množství C v oligonukleotidu. Jak je naznačeno v příkladu 7, výtěžek purifíkace se zvyšuje, že oligonukleotid obsahuje méně cytosinů. Oligonukleotidy podle vynálezu mohou také kombinovat motivy (CCT), (CT) nebo (CTT).
Použitý oligonukleotid může být přírodní (sloučeniny nebo přirozeném základě, nemodifikované) nebo chemicky modifikovaný. Oligonukleotid může výhodně obsahovat určité chemické modifikace umožňující zvýšit jeho rezistenci nebo jeho ochranu vůči nukleázám nebo zvýšit svou afinitu vůči specifické sekvenci.
Podle předloženého vynálezu se také rozumí oligonukleotidem každé spojení nukleotidů, které podlehly modifikaci skeletu za cílem získat větší rezistenci k nukleázám. Mezi možnými modifikovanými oligonukleotidy se mohou uvést oligonukleotidy fosfothioátové, které jsou schopné tvořit triplet-helixy sDNA (Xodo et al. Nucleic Acids Res. 1994, 22, 3322-3330, stejně jako oligonukleotidy, které mají skelet formacetálový nebo methylfosfonátový (Matteucci et al., J.
-4CZ 295587 B6
Am. Chem. Soc., 1991, 113, 7767-7768). Mohou se také použít oligonukleotidy syntetizované z α-anomerů nukleotidů, které tvoří také triplet-helix s DNA (Le Doan et all., Nucleic Acids Res. 1987, 15, 7749-7760). Jiná modifikace skeletuje fosforamidová vazba. Může se například uvést intemukleotidová vazba N3'-P5'fosforamidu popsaná v publikaci (Gryaznov et Chen, J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 3143-3144), která poskytuje oligonukleotidy tvořící s DNA triplet-helix velmi stabilní. Mezi jinými modifikacemi skeletu se může také uvést použití ribonukleotidů, 2'O-methylribosy, fosfodiesteru atd. (Sun et Helene, Curr, Opinion Struct. Biol, 116, 3143-3144). Fosfátový skelet může být nahrazen skeletem polyamidovým jako v PNA (Peptide Nucleic Acid), které mohou také tvoři triple-helixy (Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500, Kim et al., J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 6477-6481) nebo skeletem na základě guanidinu, jako vDNG (deoxyribonukleic guanidin, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 6097-6101), které jsou polykationické analogy DNA, které také tvoří triple-helix.
Thymidin třetího vlákna může být také nahrazen 5-bromuracilem, čímž se zvýší afinita oligonukleotidu pro DNA (Povsic et Derva, J. Am. Chem. Soc., 1989, 111, 3059-3061). Třetí vlákno může také obsahovat nepřirozené báze, mezi kterými se může uvést 7-deasa-2'-deoxyxanthosin (Meligan et al., Nucleic Acids Res., 1993, 21, 327-333), l-(2-deoxy-P-D-ribofuranosyl)-3methyl-5-amino-lH-pyrazolo[4,3-<7]pyrimidin-7-on (Koh et Dervan, J. Am. Chem. Soc., 1992, 114, 1470-1478), 8-oxoadenin, 2-aminopurin, 2'-O-methylpseudoizocytidin nebo každá modifikace odborníky známá (viz Sun et Helene, Curr. Opinion Struct. Biol., 1993, 3, 345-356).
Jiný typ modifikace oligonukleotidů je určený pro zvýšení interakce nebo/a pro zvýšení afinity mezi oligonukleotidem a specifickou sekvencí. Modifikace podle vynálezu spočívá výhodně v methylaci cytosinů oligonukleotidu. Takto methylovaný oligonukleotid má schopnost tvořit stabilní triple-helix se specifickou sekvencí v oblastech pH blízkých neutrálních hodnotách (>5). Tyto oligonukleotidy umožňují tedy pracovat při zvýšeném pH než oligonukleotidy vedlejších oborů, totiž při pH, kde nebezpečí degradace plazmidové DNA je druhořadé.
Délka použitého oligonukleotidu v předloženém vynálezu je alespoň 3 báze, výhodněji obsahuje mezi 5 a 30 bázemi. Výhodně se používá oligonukleotid délky o 10 bázích. Délka může být odborníkem přizpůsobena, případ od případu, funkci selektivity a stability hledané interakce.
Oligonukleotidy podle vynálezu mohou být syntetizovány všemi známými technikami. Zejména mohou být připraveny prostřednictvím syntetizátoru nukleových kyselin. Může být také použita každá jiná odborníky známá metoda.
Aby se umožnila kovalentní vazba na náplň, je oligonukleotid všeobecně funkcionalizován. Může být modifikován skupinami thiolovými, aminovými nebo karboxylovými v poloze 5' nebo 3'. Přidání skupiny thiolové, aminové nebo karboxylové umožňuje například vazbu oligonukleotidu na nosič nesoucí funkce disulfidové, maleimidové, aminové, karboxylové, esterové, epoxydové, bromkyanové nebo aldehydové. Tyto vazby se tvoří vystavěním disulfidových, thioetherových, esterových, amidových nebo aminových vazeb mezi oligonukleotidem a náplní. Může být použita také každá jiná odborníky známá metoda, taková která bifunkčně váze reaktanty.
Pro zvýšení hybridace s vázaným oligonukleotidem může být výhodné, aby oligonukleotid obsahovat „rameno“ a sekvence bází „mezemík“. Použití ramene umožňuje, fixovat oligonukleotid ve vybrané vzdálenosti náplně, která umožňuje zlepšit podmínky interakce s DNA. Rameno je výhodně tvořeno lineárním uhlíkovým řetězcem, obsahujícím 1 až 18, a přednostně 6 nebo 12, skupin (CH2) a jednu aminovou, která umožňuje vazbu ke koloně. Rameno je spojeno fosfátem oligonukleotidu nebo „mezemíkem“ tvořeným bázemi, které neintervenují s hybridací. „Mezerník“ může obsahovat purinové báze. Například může „mezemík“ obsahovat sekvence GAGG. Rameno je výhodně tvořeno uhlíkovým lineárním řetězcem, který obsahuje 6nebo 12 uhlíkových atomů.
-5 CZ 295587 B6
Pro uvedení předloženého vynálezu byly použity různé typy nosiče. Může se zejména jednat o chromatograficky funkční volně ložený nosič nebo předem vložený na koloně s plasticky funkčním povrchem nebo funkčními latexovými kuličkami, magnetický nebo nemagnetický. Jedná se především o chromatografícký nosič. Například chromatografické nosiče, které mohou být použity jsou agaróza, akrylamid nebo Dextran, stejně jako jejich deriváty (jako je Sephadex, Sepharosa, Superosa, ...), polymery jako poly(styrendivinylbenzen), nebo roubovací nebo neroubovací silice. Chromatografické kolony mohou být zfunkčněny difúzí nebo perfúzí.
Pro získání lepších výtěžků purifikace je zejména výhodné použít na plazmidu sekvenci obsahující více hybridačních pozic s oligonukleotidem. Přítomnost více hybridačních pozic upřednostňuje interakce mezi uvedenou sekvencí a oligonukleotidem, což vede ke zvýšení výtěžků purifikace. Pro oligonukleotid obsahující n opakovaných modifikací (CCT), (CT) nebo (CTT) je přednostně použita sekvence DNA obsahující alespoň n komplementárních motivů a zejména, η + 1 komplementárních motivů. Sekvence, která nese η + 1 komplementárních motivů nabízí tak dvě hybridační polohy k oligonukleotidů. Sekvence výhodně obsahuj až 11 hybridačních poloh, totiž n + 10 komplementárních motivů.
Podle jiného způsobu provedení chromatografie na koloně keramického hydroxyapatitu je následována nebo předcházena chromatografíí na iontoměničové koloně. Přednostně se používá slabá iontoměničová kolona, silné ionty mají fixační vlastnosti velmi silné kDNA, vtom případě, je velmi obtížné získat produkt (výtěžek je tak nižší než 60 %). To je důvod, proč předkladatel používá slabou iontoměničovou kolonu, která nezadržuje plazmidovou DNA, ale fixuje reziduální RNA.
Jak je již naznačeno, postup podle vynálezu obsahuje výhodně etapu diafíltrace. Diafíltrace je koncentrační etapou, ve které se vyloučí voda a malé molekuly (takové jako soli, proteiny, nukleové kyseliny malé velikosti), které jsou přítomny v čistém lyzátu. Soli jsou nahrazeny fosfátovým pufrem pro chromatografii. Po diafíltraci je roztok 5 až 50 krát koncentrován než na počátku diafíltrace (koncentrační faktor závisí na objemu počátečního roztoku).
Použití diafíltrace má více výhod. Umožňuje, mezi jiným, vyhnout se použití organických rozpouštědel, jako je izopropanol, jehož použití je nezbytné při instalaci antideflagrační. Tato technika je použitelná zejména pro velmi rozdílné objemy. Stačí zvýšit povrch membrán se zvýšením určeného objemu.
Pro diafíltraci se výhodně používá přístroj, který má náplň tvořenou modifikovanou polyethersulfonovou membránou nebo modifikovanou acetylcelulózovou membránou, které umožňují regulovaný počáteční průtok. Tyto membrány jsou definovány póry, které jsou v nominální hodnotě maximální velikosti molekul, které mohou projít přes uvedenou membránu. Vzhledem ke skutečné velikosti membrána, jejíž póry jsou 100 kD, umožňuje zadržet molekuly velkosti vyšší než 30 kD.
Upřednostňovaný postup podle vynálezu obsahuje následující etapy:
Diafíltrace chromatografie na koloně keramického hydroxyapatitu afinitní chromatografie specifickou hybridací mezi sekvencí DNA a oligonukleotidem s tvorbou triple-helix.
Postup podle předloženého vynálezu může být použit pro purifikaci každého typu dvouvláknové DNA. Jedná se například o kružnicovou DNA, takovou jako je plazmid, který je všeobecně nesen jedním nebo více geny terapeutického zájmu. Tento plazmid může nést také počátek replikace,
-6CZ 295587 B6 značený gen atd. Tento postup umožňuje také purifíkovat DNA, lineární nebo kružnicovou, která nese sekvenci zájmu ze směsi obsahující DNA různých sekvencí.
DNA je produktem hostitelského mikroorganizmu modifikovaného technikami rekombinující DNA. V tomto ohledu hostitel obsahující dvou vláknovou DNA, která je předmětem zájmu, je rozmnožen a amplifikován. K tomu se používají klasické fermentační techniky, které umožňují získat silnou buněčnou denzitu. Přednostně používaná technika je technika nazvaná „fed-batch“, která je podrobně popsána v literatuře (Jung et al., Ann. Inst. pasteur/Microbiol. 1988, 139, pl29-146, Bauer et al., Biotechnol. Bioeng. 1976, 18, p81-94).
Fermentace je následována lýzou buněk. Pro lýzu buněk se používá buď mechanický systém, nebo systém chemický následovaný buněčnou koncentrací podle toho, zda je třeba pracovat se surovým buněčným lyzátem nebo s čistým buněčným lyzátem. Pro mechanickou lýzu se přednostně používá systém, který nedenaturuje DNA (míchání, tepelný šok, osmotický šok). Tyto metody nejsou přizpůsobeny extrakci DNA z prokaryontních buněk. Mechanické působení použité pro rozbití prokaryontních buněk denaturuje DNA. Mechanická lýza je přednostně používaná pro eukaryotní buňky, pro prokaryontní buňky se přednostně používá chemická lýza.
Prokaryontní buňky jsou lyžovány všemi odborníky známými technikami (detergenty, lyzozomy, případně kombinované s tepelným šokem,...). Přednostně se používá směs NaOH s SDS. Během tohoto působení se pH pohybuje okolo 12. pH lyzátu takto získaného je potom znovu upraveno na hodnotu 6, což způsobí srážení proteinů části chromozomální DNA a RNA. Tato sraženina se odstraní odstředěním.
Upřednostňovaný způsob provedení vynálezu spočívá především v podrobení buněk, které obsahují dvouvláknovou DNA určenou k purifikaci, chemické lýze, která umožňuje získat čistý lyzát. Takto získaný čistý lyzát se podrobí diafiltraci a takto získaný koncentrát je chromatcgrafován na koloně keramického hydroxyapatitu.
Buněčný lyzát může být lyzát prokaryotních nebo eukaryotních buněk.
Co se týče prokaryontních buněk, mohou se uvést například bakterie E. coli, B. subtilis,
S. typhimurium nebo Streptomyces. Co se týče eukaryotních buněk, mohou se uvést zvířecí buňky, kvasinky, houby, atd., zejména kvasinky Kluyveromyces nebo Saccharomyces nebo buňky COS, CHO, C127, NIH3T3, atd.
Postup podle vynálezu je zejména výhodný, protože umožňuje získat rychle a jednoduše plazmidovou DNA vysoké čistoty. Jak je naznačeno v příkladech, postup umožňuje účinně separovat požadovanou plazmidovou DNA od složek kontaminantů jako jsou fragmenty chromozomální DNA, RNA, endotoxiny, proteiny, nukleas, atd. Postup podle vynálezu umožňuje zejména získat preparát dvouvláknové DNA, zejména plazmidové, prakticky bez chromozomální DNA (<0,5%). Mimoto přípravky získaných DNA obsahují velmi malé množství endotoxinů (<50 EU/mg), což je slučitelné s farmaceutickým použitím.
Předkladatel překvapivě ukázal, že kombinace těchto dvou výše popsaných etap, chromatografie na koloně Hydroxyapatie, která následuje nebo předchází chromatografíi Triple-Helix, umožňuje získat preparát plazmidové DNA, který obsahuje chromozomální DNA v hodnotách 0,01 %. Vynález se také týká přípravy plazmidové DNA, která má obsah chromozomální DNA nižší nebo rovný 0,01 %.
Vynález se také týká přípravy plazmidové DNA, která má obsah endotoxinů nižší nebo rovný 50 EU/mg, zejména nižší než 10 EU/mg. Obsah endotoxinů je tedy nižší než je autorizovaný obsah, který je 350 EU/injekci pro člověka vážícího 70 kg (EU znamená Endotoxin Unit a je rovný 100 pg).
Předložený vynález popisuje tedy kompozice obsahující plazmidovou DNA farmaceuticky použitelnou zejména v genové nebo buněčné terapii in vivo nebo ex vivo. V tomto ohledu vynález má za předmět vynálezu farmaceutickou kompozici, která obsahuje dvouvláknovou DNA lineární nebo plazmidovou, připravenou podle popsaného postupu.
Kompozice mohou obsahovat plazmidovou DNA „holou“ nebo spojenou s přenosným vektorem takovým, jako jsou lipozomy, nanočástice, kationické lipidy, polymery, proteiny nebo rekombinantní viry, atd.
Následující obrázky a příklady blíže ilustrují vynález, aniž by však v jakémkoliv směsu omezovaly jeho rozsah.
Materiál a metody
1. Konstrukce plazmidů pXL2784
V příkladech, které následují se použilo specifického plazmidů pXL2784. Tento plazmid obsahuje kazetu obsahující promotor Cytomegalovirus, gen kódující luciferasu a homopurino-homopyrimidinovou sekvenci (GAA)17. Konstrukce tohoto plazmidů je dále popsána. Je evidentní, že postup podle vynálezu není omezený pouze na popsaný plazmid.
1.1 Popis plazmidů pXL2784
Plazmid je konstruován z plazmidového vektoru pXL2675 (2,513 kb), minimálního replikonu plazmidů ColEl vzešlého z plazmidů pBluescrip (ORI), který má pro značení selekce transportní gen Tn5, který kóduje rezistenci ke kanamycinu. Plazmid pXL2784 obsahuje také homopurinohomopyrimidinovou sekvenci (GAA)]7 pocházející z plazmidů pXL2563, který se může vázat k oligomeru (CTT)n, kde η = 1 až 17, aby se lokálně vytvořila struktura triplet-helix a umožnila purifíkace afinitou. Plazmid pXL2784 má lokus cer (382 bp) pocházející z plazmidů ColEl a klonován do plazmidů pXL565, lokus cer obsahuje regiospecifíckou sekvenci rekombinas XerC/XerD a vede k výslednému plazmidovému multimeru. Transgen klonovaný na plazmidů pXL2784 je kazeta exprese (3,3 kb) genu luc, který kóduje luciferasu Photinus pyralis pod řízením promotoru pCM lidského cytomegaloviru, tato kazeta pochází z plazmidů pXL2622.
Plazmid má velikost 6390 bp. Mapa plazmidů pXL2784 je uvedena na Obrázku 1 a je detailní konstrukce je dále popsána.
1.2 Minimální vektor PXL2675
Po ztrátě přesahujících konců Bsal působením Klenowova fragmentu, fragment Bsal-PvuII 1,15 kb plazmidů pBKS+ (Stratagen) byl klonován se fragmentem Smál 1,2 kb plazmidů pUC4KIXX (Pharmacia), aby se vytvořil plazmid pXL2647.
Oligonukleotid 5542:
5'-AGCTTCTCGA GCTGCAGGAT ATCGAATTCG GATCCTCTAG
AGCGGCCGCG AGCTCC-3'(SEQ ID n°10) a oligonukleotid 5543:
5'-AGCTGGAGCT CGCGGCCGCT CTAGAGGATC CGAATTCGAT
ATCCTGCAGC TCGAGA-3'(SEQ ID n’ll)
-8CZ 295587 B6 byly hybridovány mezi sebou a potom klonovány v místě HindlII pXL2647 tvořící plazmid pXL2675. Tento plazmid obsahuje multimísto HindlI, Xhol, Pstl, EcoRV, EcoRI, BamHI, Xbal, Notl, Sstl mezi počátkem replikace a genem kódujícím rezistenci ke kanamycinu.
1.3 Kazeta luciferasy v plazmidu pXL2622
Promotor CMV obsažený ve fragmentu mluI-HindlII 660 bp plazmidu pcDNA3 (pocházející z Invitrogenu) byl klonován mezi místy mluI-HindlII základního plazmidu pGL2 (Promega obsahuje gen luciferasy), aby se vytvořil plazmid pXL2622.
1.4 Plazmidy pXL2563 a pMTL22-TH obsahující sekvenci schopnou tvořit triplet-helix s oligonukleotidem
Oligonuleotid 4817:
5' -GATCCGAAGA AGAAC-AAGAA GAAGAAGAAG AAGAAGAAGA
AGAAGAAGAA GAAGAAGG-3'(SEQ ID ne12) a oligonukleotid 4818:
AATTCCTTCT
TCTTCTTCTT
CTTCTTCTTC
TTCTTCTTCT
TCTTCTTCTT CTTCTTCG-3'(SEQ ID n°13) byly hybridovány mezi sebou a klonovány v místech EcoRI a BamHI plazmidu pBluescriptlI KS, aby se vytvořil plazmid pXL2563. Fragment EcoRI-BamHI 62 bp je klonován v místech EcoRI-BamHI plazmidu pMTL22 (P. Minton 1988 Gene 68: 139), aby se vytvořil plazmid pMTL22-TH.
1.5 Plazmidový pXL565 a pXL2781 obsahující lokus cer
Fragment Hpall 382 bp plazmidu ColEl (P-L Biochemicals) byl klonován vmiste AccI plazmidu M13 mp7 (Messing et coli. 1981 Nucleic Acids Res 9: 309), aby se vytvořil plazmid pXL565. Fragment BamHI 382 pb pXL565 byl klonován v místě BglII plazmidu pSL301 (Invitrogen), aby se vytvořil plazmid pXL2781.
1.6 Konstrukce plazmidu pXL2784
Fragment BamHI-XhoI plazmid pXL2781 382 bp obsahující lokus cer je klonován v místech BamHI a Xhol plazmidu pXL2675, aby se vytvořil plazmid pXL2782.
Fragment BglII-BamHI plazmidu pMTL22-TH 62 bp obsahující sekvenci (GAA)17 je klonován v místě BamHI plazmidu pXL2782, aby se vytvořil plazmid pXL2783.
Fragment Sall-Spel 3,3 kb plazmidu pXL2622 obsahující kazetu luciferasy je klonován v místech Xhol a Nhel plazmidu pXL2783, aby se vytvořil plazmid pXL2784. Očekává se, že může být vložena v místě kazety luciferasy každá jiná kazeta exprese genu luciferasy.
Kmen DH1 (Maniatis et al., 1989) obsahující tento plazmid je kultivován ve fermentoru o obsahu 2 1, 7 1 a až 800 1. Mohou být použity také jiné kmeny.
-9CZ 295587 B6
2. Fermentace
Hostitel obsahující plazmidovou DNA pro kultivaci může být získán klasickými metodami fermentace (Jung et al., Ann. Inst. Pasteur/Microbiol. 1988, 139, pl291—146, Bauer et al., Biotechniol. Bioeng. 1976, 18, p81-94), technika fed-batch je upřednostňovaná. Po fermentaci v laboratorním měřítku tzn. pro objemy menší než 5 1, jsou získané buňky klasicky odstředěny (20 minut při 1000 rpm) nebo jsou odstřeďovány kontinuálně pro větší objemy (průmyslové objemy, které mohou obsahovat až několik set litrů). Takto získané buňky mohou být použity hned nebo po zmrazení na -80 °C.
3. Chemická lýza
Buňky jsou popřípadě rozmražené a potom lyžované. Chemická lýza se skládá ze třech etap. První etapa spočívá ve vložení buněčné suspenze do pufru 25 mM Tris pH 6,8, 50 mM glukosy, 10 mM EDTA nebo ekvivalentu. Lýza buněk se tedy provádí ve směsi obsahující 0,2 M NaOH a 1 % SDS. pH roztoku se pohybuje okolo 12. Výběr ionického detergentu je důležitý, jelikož neionický detergent dává výtěžky extrakcí 10 krát slabší. Lýza je následována pseudoneutralizací prostředí v přítomnosti octanu draselného (konečné pH roztoku je mezi 5,5 a 6). Tato acidifíkace prostředí vede k vytvoření sraženiny, která obsahuje proteiny, části chromozomální DNA aRNA. Toto srážení je způsobeno reakcí dodekylsulfátu sodného (SDS) s octanem draselným které tvoří bílou sraženinu dodekylsulfátu sodného.
Sraženina musí být odstraněna. Proto se postupuje tak, že odstřeďování se provádí v nádobách (15 minut při 8000 rpm), je-li odstřeďovaný objem nižší než 5 litrů, nebo kontinuálním způsobem, jsou-li objemy vyšší (>5 litrů). Jiná metoda pro eliminaci supematantu spočívá ve zlepšení filtrace na filtru s velikostí pórů větší nebo rovnou 20 pm (PALL, profil II použit podle doporučení dodavatele).
4. Diafiltrace
Supernatant získaný po chemické lýze je shromážděn k diafiltraci, aby se plazmidová DNA zakoncentrovala, a aby se vyloučily molekuly malé molekulové hmotnosti, zejména soli, které jsou přítomny v silné koncentraci. Tato diafiltrace se provádí na membráně s velikostí pórů mezi 50 až 300 kD podle velikosti plazmidů. Přednostně se používá membrána s velikostí pórů 100 kD. Hodnota 100 kD je hodnotou nominálně danou pro proteiny, které jsou globulámí molekuly. Požaduje se, aby pro molekuly nukleových kyselin, které mají molekulovou hmotnost nižší než 30 kd byly vyloučeny. Množství přítomné DNA v roztoku po diafiltraci a množství přítomné DNA v čistém lyzátu se měří pomocí HPLC. Výtěžek této etapy je vyšší nebo roven 80%.
V průběhu diafiltrace jsou vyloučeny soli. Jsou nahrazeny 10 mM fosfátovým pufrem. Je tedy možné aplikovat produkt přímo na chromatografickou kolonu zejména na Ceramic Hydroxyapatite™.
Plazmidová DNA pocházející z afinitní chromatografie triple-helix je opět diafiltrována, aby došlo k zakoncentrování vzorku a k vyloučení nežádoucích solí. To umožňuje ekvilibrovat produkt v pufru vhodného složení. Diafiltrace na membráně s póry o velikosti 10 a 50 kD je proto účinná. Výtěžek je vyšší než 80 %.
Vzorek je potom sterilně filtrován a připraven k analýzám před formulací.
5. Chromatografie na koloně Ceramic Hydroxyapatie™
Gel Ceramic Hydroxyapatie™ je nalit do kolony vhodné velikosti, která je uzpůsobena objemu vzorku kpurifikaci a čistotě vzorku na počátku chromatografie. Pro určení velikosti kolony a objemu gelu se měří pomocí HPLC množství DNA v mg/ml přítomné v roztoku na počátku
-10CZ 295587 B6 chromatografíe. Stanoví se, že alespoň 0,1 mg DNA je fixováno ml hydroxyapatitu, tato hodnota se může měnit až k 1 mg v závislosti na množství RNA přítomné v roztoku na počátku. RNA se fixuje na gel více než by se mohla fixovat DNA. RNA je vyloučena různou eluci. Kolona je ekvilibrována fosfátovým pufrem slabé iontové síly (10 mM). Vzorek je vložen na gel při lineárním průtoku 50 cm/h. Gel je potom připraven k promytí fosfátovým pufrem zvýšené velikosti (150 mM). Hlavní část DNA získané ze vzorkuje vyloučena v tomto stádiu. Plazmidová DNA je eluována novým zvýšením vodivosti fosfátového pufru (250 mM). Poslední kontaminanti jsou vyloučeny aplikací 0,5 N NaOH, který je neutralizován fosfátovým pufrem molámí síly (500 mM) před případném opětném použití kolony. V případě farmaceutické produkce má tato náplň výhodu, že může podléhat chemické dekontaminaci, poněvadž je rezistentní k 0,5 M NaOH, což je klasicky čisticí činitel při chromatografii, a je také rezistentní k silné koncentraci ethanolu.
Výsledek použití keramického hydroxyapatitu je výhodný. Tato etapa postupu umožňuje vyloučit více než 80 % RNA, 99,9 % chromozomální DNA a snížit obsah endotoxinů faktorem 1000. Tato technologie nabízí použití každého enzymu hovězího původu nebo jiného původu (ne Rnasy ani proteasy K); mimoto jejich rezistence keramického hydroxyapatitu k chemickým činidlům umožňuje ho použít dnes více než 40 krát bez problémů reproducibility. Výtěžek chromatografíe je vyšší nebo roven 80 %.
6. Afinitní chromatografíe s tvorbou triple-helix
6.1 Příprava kolony
Materiál: Použitá kolona je klona HiTrap aktivovaná 5 ml NHS (N-hydroxysukcinimid, Pharmacia), spojená s peristaltickou pumpou (začátek lml/min). Použitý specifický oligonukleotid má Skupinu NH2 na 5'.
Pufry, které byly použity v tomto příkladu jsou následující:
- Vazebný pufr: 0,2 M NaHCO3, 0,5 M NaCl, pH 8,3
- Pufr A: 0,5 M ethanolamin, 0,5 M NaCl, pH 8,3
- Pufr B: 0,1 M octan draselný, 0,5 M NaCl, pH 4.
Metoda: Kolona je promyta 30 ml 1 mM HC1, potom je diluovaný oligonukleotid ve vazebném pufru (250 nMol v 5 ml) aplikován na kolonu a ponechán třicet minut v okolní teplotě. Kolona je 3 krát promyta 30 ml pufru A a potom 20 ml pufru B. Oligonukleotid je takto kovalentně vázán ke koloně vazbou CONH. Kolona je skladována při teplotě 4 °C a může být použita alespoň čtyřikrát.
6.2 Purifikace plazmidu
Materiál:
Plazmid pXL2784 (popsán v kapitole 1) byl purifíkován na koloně HiTrap spojené soligonukleotidem popsaném v kapitole 7.1. Pufry, které byly použity v tomto příkladu jsou následující:
Pufr F: 2 M NaCl, 0,2 M octan draselný, pH 4,5
- Pufr Ε: 1M Tris, pH 9, 0,5 mM EDTA.
-11 CZ 295587 B6
Metoda:
Kolona je promyta pufrem F, potom roztok, který obsahuje plazmid, je aplikován na kolonu a ponechán alespoň dvě hodiny temperovat v okolní teplotě. Kolona je promyta pufrem F a potom se eluce provádí pufrem E.
7. Iontoměničová chromatografie
Předčištěný vzorek je připraven k chromatografíi na slabé iontoměničové koloně. Silné anionty mají vlastnost fixovat velmi sině DNA, tak silně, že je velmi obtížné novu získat produkt (výtěžek je tedy nižší než 60 %). To je důvod proč předkladatel používá slabou výměnu iontů, které nezachycují plazmidovou DNA, ale fixují zbytky RNA. Přednostně by se mohl používat slabý měnič aniontů typu DEAE Sepharose nebo DEAE hyper D nebo ekvivalenty. Gel je ekvilibrován v 10 mM fosfátovém pufru, vzorek pocházející z chromatografie na Ceramic Hydroxyapatie je přímo aplikován na gel. Fixovaná RNA je potom vyloučena při aplikaci koncentrovaného roztoku NaCl. Chemická dekontaminace může být provedena roztokem 0,5 M NaOH, což umožní pracovat za dobrých hygienických podmínek (vyloučení endotoxin a nebezpečí mikrobiální kontaminace).
8. Stanovení plazmidové DNA v komplexních vzorcích HPLC
Předmětem této metody je možnost určit množství plazmidové DNA v průběhu různých etap purifikace, aby se určil výtěžek. Může se také kvantitativně a kvalitativně posoudit účinnost různých operací.
Použití techniky j sou následuj ící:
Chromatografická náplň je gel Poros R2 od Perseptive Biosystems. Jedná se o polystyrendivinylbenzonovou náplň s velikostí částic 10 pm. Velikost fúzních pórů je 6000 až 8000 Angstrómů, velikost difuzních pórů je 500 až 1000. Objem gelu je 1,7 ml.
Jedná se o chromatografíi párů iontů. Systém roztoků je voda, triethylamin acetát pH 7,1/triethyL amin acetát acetonitril 90 %.
Průtok je 3 ml/min. Byl definován grafient k rozlišování plazmidové DNA od RNA.
Referenční vzorek je plazmidová DNA purifikována na Qiagen podle doporučení výrobce. Na agarózovém gelu tento vzorek obsahuje jen ocDNA a cccDNA. V HPLC nedává než jeden samotný pík. Koncentrace byla určena měřením jeho DO při 260 nm a za základ byla vzata 1 jednotka DO = 50 pg/ml DNA.
Bylo tedy injektováno vzrůstající množství produktu, aby se vytvořila kalibrační stupnice.
Plocha píků odpovídajících retenčním časům referenční DNA je porovnán s kalibrační stupnicí. Může tak být stanoveno množství purifikované DNA.
9. Stanovení zbytkové chromozomální DNA
Zbytková genomická DNA je kvantifikována PCR za použití nástrojů v genu gal E. coli. Sekvence nástroje genu galK E. coli je (Debouck et al., Nucleic Acids Res., 1985, 13, 1841-1853):
-12CZ 295587 B6
5'-CCG AAT TCT GGG GAC CAA AGC AGT TTC-3'(SEQ ID n°14) a 5'-CCA AGC TTC ACT GTT CAC GAC GGG TGT-3'(SEQ ID n°15).
Reakční prostředí obsahuje v pufru PCR (Promega Francie, Charbonnieres): 1,5 mMmgCl2; 0,2 mM dXTP (Pharmacia, orsay); 0,5 μΜ nástroje, 20 U/ml Taq-polymerázy (promega). Reakce byl provedena podle sekvencí:
- 5 minut při teplotě 95 °C
-30 cyklů 10 sekund při teplotě 95 °C sekund při teplotě 60 °C minuta při teplotě 78 °C
-10 minut při teplotě 78 °C.
Fragment amplifíkované DNA délky 124 párů bází je separován elektroforeticky na 3% agarózovém gelu v přítomnosti SybrGreen I (Molecular Probes, Eugene, USA), potom kvantifikován srovnáním se stupnicí genomické DNA Ultrapur E. coli, kmen B (Sigma, Ref. 4889).
10. Transfekce savčích buněk in vitro
Tato metoda je použita pro určení biologické aktivity plazmidu purifíkovaného metodou podle vynálezu. Použité buňky jsou NIH 3T3, rozmnožené v předvečer pokusu na kultivačních miskách se 24 jamkami s počtem 50 000 buněk na jamku. Plazmid je diluován 150 mM NaCl a smísen s lipofektantem. Používá se poměr pozitivních nábojů k negativním nábojům DNA rovný 3. Směs se zamíchá, nechává deset minut temperovat při okolní teplotě, rozředí v kultivační půdě, je zbavena hovězího plodového séra, potom přidána k buňkám v množství 1 pg DNA na kultivační jamku. Po dvou hodinách při teplotě 37 °C se přidá 10 % obj./obj. hovězího plodového séra a buňky jsou inkubovány po dobu 48 hodin při teplotě 37 °C v přítomnosti 5 % CO2. Buňky jsou dvakrát promyty PBS a aktivita luciferasy je měřena podle popsaného protokolu (souprava Promega, Promega Corp. Madison, WI) na luminomertru Lumat LB9501 (EG a G Bertholt, Evry). Proteiny byly stanoveny technikou BCA (Pierce, Interchim Asniéres).
11. Různé techniky
Získané plazmidy analyzované elektroforézou na agarózovém gelu a barveny ethidiumbromidem se detekují ve formě jednoho pruhu kruhové DNA „nadšroubovicové“. Žádná stopa DNA s vysokou molekulovou hmotností (chromozomální) ani RNA nebyla detekována v puntíkovaném plazmidu.
Koncentrace proteinů ve vzorkuje měřena Micro-BCA (Pierce) podle doporučení výrobce.
Koncentrace endotoxinů je stanovena LAL (Biosepra) podle doporučení výrobce.
Klasické metody molekulární biologie jako je digesce restrikčními enzymy, elektroforéza na gelu, transformace v E. coli, srážení nukleových kyselin atd. jsou popsány v literatuře (Maniatis et al., T., E.F. Fritsch, and J. Sambrook, 1989, Molecular cloning: laboratory manual, druhé vydání. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Ausubel F. M., R. Brent, R. E. Kinston, D.D. Moore, J. A. Smith, J. G. Seidman and K. Struhl. 1987. Current protocols in molecular biology 1987-1988. John Willey and Sons, New York). Nukleotidové sekvence byly určeny metodou terminace řetězce uvedenou v popsaném protokolu (Ausubel et al., 1987).
-13CZ 295587 B6
Restrikční enzymy byly dodány New-England Biolabs, Beverly, MA (Biolabs).
Pro ligaci byly fragmenty DNA inkubovány v pufru 50 mM Tris-HCl pH 7,4; lOmM MgCl2; 10 mM DTT, 2 mM ATP v přítomnosti DNA ligázy fágu T4 (Biolabs).
Oligonukleotidy byly syntetizovány za použití chemie fosforamidů chráněných V β kyanoethylovou skupinou (Sinha, N. D., J. Biemat, J. McManus and H. Koster, 1984. Polymer Supprt oligonukleotide synthesis, XVIII: Use of b-cyanoethyl-N,N.dialkylamino-/N-morpholino phosphoramidite of deoxynucleosides for the synthesis of DNA fragments simplifying deprotection and izolation of the finál product. Nucl. Acids Res. 12, 4539-4557; Giles, J. W. 1985. Advances in automated DNA synthesis. Am Biotechnol., Nov./Dec.) automatickým syntetizátorem DNA Biosearch 8600 za použití doporučení výrobce.
Ligaturovaná DNA nebo DNA určená k testování pro svou účinnost transformace jsou použity pro transformování příslušného kmene: E. coli HD5a [F/endAl, hsdR17, supE44, thi-1, gyrA96, relAl, D(lazZYA-argF)U169, deoR, F80dlac(lacZDM15)J.
Minipreparace plazmidové DNA byla provedena podle protokolu Klaina et al., 1980.
Kultivační půda LB byla použita pro kultivaci kmene E. coli (Maniatis et al., 1982). Kmeny byly inkubovány při teplotě 37 °C. Bakterie byla rozloženy na kultivačních miskách s půdou LB doplněnou vhodnými antibiotiky.
Příklady
Příklad 1: Purifikace plazmidové DNA na keramické hydroxyapatické koloně
1.1. Příprava čistého lyzátu
Materiál:
Roztoky, které byly použity v tomto příkladu jsou následující: roztok 1: Tris 25 mM pH 6,8, 50 mM glukosy, 10 mM ETDA roztok 2: 0,2 M NaOH a 1% SDS roztok 3: 3M octan draselný, pH 5
Metoda:
200g buněk je vloženo do suspenze 2200 ml roztoku 1. Potom je přidán roztok 2 (také 2200 ml). Potom je přidáno 1100 ml roztoku. Takto vytvořená sraženina je odstředěna při 9000 rpm po dobu 30 minut. Získá se 5200 ml supematantu.
1.2 Diafiltrace
Materiál: Membrána Maximate (Filtron), velikost pórů 100 kD na povrchu 1860 cm2
Pufr: 100 mM fosforečnan sodný, pH 6,8
Metoda:
Po použití membrána se podrobí chemické dekontaminaci 0,5 M hydroxidem sodným během jedné hodiny. NaOH je potom vyloučen vodou ppi.
- 14CZ 295587 B6
Supematant takto získaný v etapě 1.1 je koncentrovaný asi 10 krát, potom diafiltrován proti čtyřnásobnému objemu fosfátovému pufru 100 mM a pH 6,8. Výsledný objem je 810 ml. Vzorek tak obsahuje 224 mg plazmidové DNA určené pomocí HPLC.
1.3 Purifikace na Ceramic Hydroxyapatie™
Materiál:
Pufry, které byly použity v tomto příkladu jsou následující:
Pufr A = 10 mM fosfátový pufr pH 6,8
Pufr B = 150 mM fosfátový pufr pH 6,8
Pufr C = 250 mM fosfátový pufr pH 6,8
Pufr D = 500 mM fosfátový pufr pH 6,8
0,5 M NaOH
Metoda:
Kolona (průměr 113 mm a délka 17 cm) obsahuje 1700 ml gelu.
Před použitím byl gel podroben chemické dekontaminaci 0,5 M hydroxidem sodným během jedné hodiny. NaOH je pak vyloučen aplikací pufru D. Kolona je ekvilibrována pufrem A.
Aplikuje se 610 ml pocházející z předem získaných 810 ml (tj. 171 mg) na gel. Na začátku je průtok 60 ml/min. Gel je pak promyt 61 pufru B. Produkt je eluován při aplikaci pufru C. Objem eluátu je 1520 ml a obsahuje 147 mg plazmidové DNA (určené HPLC).
Gel je potom regenerován promytím 0,5 M hydroxidem sodným a pak pufrem D. Gel je takto připraven pro nový cyklus.
Tyto operace jsou sledovány spektrometrií UV při 254 nm.
1.4 Purifikace na DEAE Sepharose
Materiál:
Pufr, který byl použit v tomto příkladu je následující:
Pufr A 1M NaCl a 0,5 M NaOH
Metoda:
Kolona (průměr 50 mm a délka 6 cm) obsahuje 110 ml gelu.
Před použitím gel byl podroben chemické dekontaminaci 0,5 M hydroxidem sodným během jedné hodiny. NaOH je pak vyloučen aplikací 1 M NaCl. Kolona je ekvilibrována pufrem A.
1130 ml vzniklých z 1520 ml (tj. 110 ml) předem získaných je aplikováno na gel s počátečním průtokem 50 ml/min. Jelikož DNA není zadržena, výtok je sesbírán (1036 ml) a obsahuje 10 mg DNA. Získané produkty na gelu jsou potom eliminovány roztokem 1 M NaCl. Gel je tedy promyt 0,5 M NaOH a pak 1 M NaCl. Gel je takto připraven pro novou operaci.
- 15CZ 295587 B6
Tyto operace jsou sledovány spektrometrií UV při 254 nm.
1.5 Diafíltrace
Materiál:
Membrána Ultrasette (Filtron), velikost pórů 30 kD na povrchu 860 cm2
Pufr: voda ppi
Metoda:
Před použitím membrána je podrobena chemické dekontaminaci 0,5 M NaOH po dobu jedné hodiny. NaOH je pak eliminován vodou ppi. 720 ml produktu získaného v předchozí etapě je koncentrováno třikrát, potom dvakrát diafiltrován proti čtyřnásobnému objemu vody ppi. Konečný objem je 210 ml. Vzorek obsahuje 62 mg plazmidové DNA určené HPLC.
1.6 Charakteristika DNA
Metoda popsaná dále umožňuje získat plazmid dostatečně čistý. Byly stanoveny různé příměsy ve vzorku a byly určeny jako:
- RNA: nedetekovatelná na agarózovém gelu nebo HPLC chromozomální DNA určená PCR: 0,5%
- nadšroubovicová DNA určená HPLC: 80%
- endotoxiny (LÁL) 50 EU/mg
- proteiny (microBCA) 1 pg/ml
- biologická aktivita in vitro:
pXL2784 část 42DNA95 : 20*106 RLU/pg proteinů (ve srovnání se stejným plazmidem purifíkovaným v gradientu chloridu cesnatého = 13*106 RLU/pg proteinů).
1.7 Varianta
Postup popsaný dále byl opakován za podmínek uvedených v etapě 1.1 a doplněn filtrací na membráně místo odstřeďování. Tato varianta postupu umožňuje získat plazmid farmaceutické čistoty, jehož charakteristika je následující:
- RNA: nedetekovatelná na agarózovém gelu nebo HPLC
- chromozomální DNA určená PCR: 0,5%
- nadšroubovicová DNA určená HPLC: 70%
- endotoxiny (LAL) 50 EU/mg
- proteiny (microBCA) 1 pg/ml
Příklad 2: Purifikace hydroxyapatitového eluátu afinitní triple-helix chromatografií
2.1 Příprava afinitní kolony
Použití kolona je kolona HiTrap aktivovaná 5 ml NHS (N-hydroxysukcinimid, Pharmacia), spojená s peristaltickou pumpou. Použitý specifický oligonukleotid má skupinu NH2 na 5'konci. Jeho sekvence je následující:
-16CZ 295587 B6
5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3'(SEQ ID n°l).
Použité pufry v tomto příkladu jsou následující:
- Vazebný pufr: 0,2 M NaHCO3, 0,5 M NaCl, pH 8,3
- Pufr A: 0,5 M ethanolamin, 0,5 M NaCl, pH 8,3
- Pufr B: 0,1 M octan draselný, 0,5 M NaCl, pH 4.
Kolona je promyta 30 ml 1 mM HC1, potom zředěný oligonukleotid ve vazebném pufru (250 nmol v 5 ml) je aplikován na kolonu a ponechán třicet minut v okolní teplotě. Kolona je 3 krát promyta 30 ml pufru A a potom 20 ml pufru B. Oligonukleotid je takto kovalentně vázán ke koloně vazbou CONH. Kolona je skladována při teplotě 4 °C.
2.2 Purifíkace plazmidu
Pufry, které byly použity v tomto příkladu jsou následující:
- Pufr F: 2 M NaCl, 0,2 M acetát, pH 4,5
- Pufr Ε: 1M Tris, pH 9, 0,5 mM EDTA.
Kolona, předem upravená 2M NaCl pH 4,5, je ekvilibrována v pufru F, potom je 9 ml hydroxyapatitového eluátu získaného za podmínek popsaných v příkladu 1.3 aplikováno ve smyčce na kolonu během noci při okolní teplotě (začátek 0,5 ml/min). Kolona je promyta pufrem F a potom se eluce provádí pufrem E. DNA je detekována spektrometricky UV při 254 nm.
2.3 Charakteristika purifikované DNA
Purifíkovaná DNA analyzovaná pomocí HPLC (metoda je dále popsaná) je vyjádřená ve formě jednoho píku s retenčním časem 24,8 min. Nebyl dekován žádný obsah RNA. Po elektroforéze na 1% agarózovém gelu s detekcí ethidiumbromidem purifíkovaná DNA nevyjadřuje žádný detekovatelný obsah RNA.
DNA byla také analyzována iontoměničovou chromatografií na koloně Gen-Pak Waters, který odděluje relaxovanou DNA od nadšroubovicové DNA. Purifikovaný vzorek obsahuje 97 % nadšroubovicové DNA proti 80% nadšroubovicové DNA v kontrolním vzorku.
Genomická DNA E. coli byla kvantifikována PCR podle technik popsaných v paragrafu 3: DNA purifíkovaná na afinitní koloně obsahuje okolo 0,01 % genomické DNA.
Příklad 3
3.1 Purifíkace plazmidu
Používá se afinitní kolona připravená tak, jak je popsáno v příkladu 2 s oligonukleotidovou sekvencí:
5'-CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT-3'(SEQ ID ne2).
Pufry, které byly použity v tomto příkladu jsou následující:
- Pufr F: 2 M NaCl, 0,2 M octan draselný, pH 4,5
- Pufr Ε: 1M Tris, pH 9, 0,5 mM EDTA.
-17CZ 295587 B6
Kolona je ekvilibrována v pufru F, potom se přidá 0,8 mg purifíkovaného plazmidu podle protokolu v příkladu 1.7, rozředěného v 10 ml pufru F. Vzorek je aplikován smyčkou na kolonu během noci při okolní teplotě (průtok 0,5 ml/min). Kolona je promyta pufrem F a potom se eluce provádí pufrem E. DNA je detekována spektrometricky UV při 254 nm.
3.2 Charakteristiky purifikované DNA
Získaná DNA byla analyzována iontoměničovou chromatografíí na koloně Gen-Pak Fax Waters, která odděluje relaxovanou DNA od nadšroubovicové DNA. Purifíkovaný vzorek obsahuje 100 % nadšroubovicové DNA proti 72 % nadšroubovicové DNA v kontrolním vzorku na afínitní koloně.
Genomická DNA E. coli byla kvantifikována PCR podle technik popsaných výše: DNA purifikovaná na afínitní koloně obsahuje okolo 0,01 % genomické DNA proti 0,3 % ve vzorku na afínitní koloně.
Příklad 4: Změna stupnice afínitní chromatografíe triple-helix po purifíkaci hydroxyapatického eluátu (pXL2784)
4.1 Příprava afínitní kolony
Použitá kolona je kolona obsahující Sepharosu 4 Fast Flow aktivovaná NHS (N-hydroxysukcinimid, Pharmacia) spojena s oligonukleotidem sekvence:
5'~CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT-3' ( (CTT)7: SEQ ID nel) podle metody popsané v příkladu 2.1.
Kolona (průměr 26 mm, délka 16 cm) obsahuje 80 ml gelu a je spojena s peristaltickou pumpou.
4.2 Purifikace plazmidu
Pufry, které byly použity v tomto příkladu jsou následující:
- Pufr F: 2 M NaCl, 0,2 M acetát, pH 4,5
- Pufr Ε: IM Tris, pH 9, 0,5 mM EDTA.
Kolona je ekvilibrována v pufru F, potom 135 ml tj. 8 mg hydroxyapatitu získaného za podmínek popsaných v příkladu 1.3, předem upraveného 2M NaCl pH 4,5 je aplikováno na kolonu (začátek 1,25 ml/min) za čtyřnásobné recirkulace. Kolona je promyta pufrem F a potom se eluce provádí pufrem E. DNA je detekována spektrometricky UV při 254 nm: bylo získáno 2,2 mg.
4.3 Charakteristiky purifikované DNA
Purifíkovaná DNA analyzovaná pomocí HPLC (metoda je dále popsána) je vyjádřena ve formě jednoho píku s retenčním časem 24,4 min. Nebyl dekován žádný obsah RNA. Po elektroforéze na 1 % agarózovém gelu s detekcí ethidiumbromidem purifíkovaná DNA nevyjadřuje žádný detekovatelný obsah RNA.
DNA byla také analyzována iontoměničovou chromatografíí na koloně Gen-Pak Waters, která odděluje relaxovanou DNA od nadšroubovicové DNA. Purifíkovaný vzorek obsahuje 100 % nadšroubovicové DNA proti 94 % nadšroubovicové DNA v kontrolním vzorku.
-18CZ 295587 B6
Genomická DNA E. coli byla kvantifikována PCR podle technik popsaných v paragrafu 3: DNA purifíkovaná na afínitní koloně obsahuje okolo 0,02% genomické DNA proti 2 % v kontrolním vzorku.
Příklad 5: Purifikace vysokého stupně plazmidové DNA na keramické hydroxyapatitové koloně
5.1 Příprava čistého lyzátu
Čistý lyzát je připraven tak, jak je popsáno v příkladu 1.1 z bakteriální buněčné kultury E. coli transformované plazmidem pXL2774. Plazmid pXL2774 má redukovanou velikost (okolo 4,5 kb) a obsahuje zejména:
- kazetu exprese genu Luc (promotor CMV-luc-poly(A)+)
- selektivní markér sup Phe
- počátek replikace ori γ R6K
- fragment cer ColEl
Metoda:
456 g buněk se umístí do suspenze 50000 ml roztoku 1. Potom je přidán roztok 2 (5500 ml). Je přidáno 2500 ml roztoku. Takto vytvořená sraženina je vyloučena odstředěním při 9000 rpm po dobu 30 minut nebo filtrací. Získá se 12,3 1 supematantu.
5.2 Diafiltrace
Materiál:
Membrána Maximate (Filtron) s velikostí pórů 100 kD na povrchu 1860 cm2.
Pufr: 100 mM fosforečnan sodný pH 6,8
Metoda:
Vzorek je diafiltrován podle metody popsané v příkladu 1.2.
Konečný objem je 945 ml. Vzorek obsahuje 235 mg plazmidové DNA určené pomocí HPLC.
5.3 Purifikace na Ceramic Hydroxyapatitte™
Materiál:
Pufry, které byly použity v tomto příklady jsou následující:
Pufr A: 100 mM fosfátový pufr pH 6,8
Pufr B: 150 mM fosfátový pufr pH 6,8
Pufr C: 250 mM fosfátový pufr pH 6,8
Pufr D: 500 mM fosfátový pufr pH 6,8
0,5 M NaOH
- 19CZ 295587 B6
Metoda:
Kolona (průměr 100 mm a délka 23 cm) obsahuje 1700 ml genu. Po použití je gen podroben dekontaminaci 0,5M NaOH po dobu jedné hodiny. NaOH je po odstranění aplikací pufru D. Kolona je ekvilibrována pufrem A.
Na gel bylo aplikováno 475 ml, které pocházejí z 945 ml (tj. 128 mg) předem získaných. Průtok je 65 ml/min. Gel je potom promyt 6 1 pufru B. Produkt je eluován aplikací pufru C. Objem eluátu je 1760 ml a obsahuje 100 mg plazmidové DNA (určené HPLC).
Gel se potom regeneruje promytím 0,5 M NaOH, potom pufrem D. Gel je tak připraven pro nový cyklus.
5.4 Diafíltrace
Diafiltrace byla provedena podle protokolu popsaného v příkladu 1.5.
5.5 Charakteristiky DNA
Postup popsaný dále umožňuje získat plazmid dostatečně čistý. Byly stanoveny různé příměsi ve vzorku a byly určeny jako:
- RNA: nedetekovatelná a agarózovém gelu
- chromozomální DNA určená PCR: 0,6%
- nadšroubovicová DNA určená HPLC: 87%
- endotoxiny (LAL) 50 EU/mg proteiny (microBCA) 1 pg/ml
Seznam sekvencí (1) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 1:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 25 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární:
(ii) typ molekuly: cDNA (ix) popis sekvence SEQ ID NO: 1:
GAGGCTTCTT CTTCTTCTTC TTCTT (1) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 2:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 21 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární:
-20CZ 295587 B6 (ii) typ molekuly: cDNA (ix) popis sekvence SEQ ID NO: 2:
T (1) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 3:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 19 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární:
(ii) typ molekuly: cDNA (ix) popis sekvence SEQ ID NO: 3:
AAGGGAGGGA GGAGAGGAA (1) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 4:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 19 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární:
(ii) typ molekuly: cDNA (ix) popis sekvence SEQ ID NO: 4:
AAGGAGAGGA GGGAGGGAA (1) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 5:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 19 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární:
(ii) typ molekuly: cDNA (ix) popis sekvence SEQ ID NO: 5:
TTGGTGTGGT GGGTGGGTT
-21 CZ 295587 B6 (1) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 6:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 19 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární:
(ii) typ molekuly: cDNA (ix) popis sekvence SEQ ID NO: 6:
CTTCCCGAAG GGAGAAAAGG (1) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 7:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 21 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární:
(ii) typ molekuly: cDNA (ix) popis sekvence SEQ ID NO: 7:
GAAGGGTTCT TCCCTCTTTC C 21 (1) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 8:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 13 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární:
(ii) typ molekuly: cDNA (ix) popis sekvence SEQ ID NO: 8:
GAAAAAGGAA GAG 13 (1) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 9:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 17 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární:
(ii) typ molekuly: cDNA
-22CZ 295587 B6 (ix) popis sekvence SEQ ID NO: 9:
AAAAAAAGGGA TAAGGG (1) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 10:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 56 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno ío (D) konfigurace: lineární:
(ii) typ molekuly: cDNA (ix) popis sekvence SEQ ID NO: 10:
AGCTTCTCGA GCTGCAGGAT ATCGAATTCG GATCCTCTAG AGCGGCCGCG 1S AGCTCC 56 (1) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 11:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 56 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární:
(ii) typ molekuly: cDNA (ix) popis sekvence SEQ ID NO: 11:
AGCTGGAGCT CGCGGCCGCT CTAGAGGATC CGAATTCGAT ATCCTGCAGC
TCGAGA (1) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 12:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 58 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární:
(ii) typ molekuly: cDNA (ix) popis sekvence SEQ ID NO: 12:
GATCCGAAGA AGAAGAAGAA GAAGAAGAAG AAGAAGAAGA AGAAGAAGAA
GAAGAAGG
-23CZ 295587 B6 (1) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 13:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka; 58 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární:
(ii) typ molekuly: cDNA (ix) popis sekvence SEQ ID NO: 13:
AATTCCTTCT TCTTCTTCTT CTTCTTCTTC TTCTTCTTCT TCTTCTTCTT
CTTCTTCG (1) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 14:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 27 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární:
(ii) typ molekuly: cDNA (ix) popis sekvence SEQ ID NO: 14:
CCGAATTCTG GGGACCAAAG CAGTTTC 27 (1) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 15:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 27 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární:
(ii) typ molekuly: cDNA

Claims (14)

1. Způsob purifíkace dvouvláknové plazmidové DNA od kontaminant obsahujících chromozomální DNA, se kterými je ve směsi, vyznačující se tím, že zahrnuje alespoň jeden chromatografický krok na koloně s keramickým hydroxyapatitem.
2. Způsob purifíkace podle nároku 1,vyznačující se tím, že dále zahrnuje krok afinitní chromatografie nebo iontové výměnné chromatografie.
3. Způsob podle kteréhokoliv z nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že dále zahrnuje krok afinitní chromatografie zahrnující specifickou hybridizaci mezi sekvencí DNA a mobilizovaným oligonukleotidem, přičemž se vytváří trojšroubovice.
4. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vy z n a č uj í c í se t i m , že dále zahrnuje krok aniontové výměnné chromatografie.
5. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že dále zahrnuje krok diafiltrace.
6. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5,vyznačující se tím, že dvouvláknová DNA se purifikuje z buněčného lyzátu.
7. Způsob purifíkace dvouvláknové DNA z buněk, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:
- chemické lýze buněk,
- diafiltrace,
- chromatografie na koloně keramického hydroxyapatitu, afinitní chromatografie zahrnující specifickou hybridizaci mezi sekvencí DNA a mobilizovaným oligonukleotidem, přičemž se vytváří trojšroubovice.
8. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že dvouvláknová DNA navíc obsahuje jednu nebo více požadovaných sekvencí.
9. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že dvouvláknová DNA je plazmidová DNA.
10. Preparát rekombinantní plazmidové DNA získané způsobem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9, kde obsah chromozomální DNA je nižší nebo roven 0,5 %.
11. Preparát rekombinantní plazmidové DNA podle nároku 10, kde obsah chromozomální DNA je nižší nebo roven 0,01 %.
12. Preparát purifíkované rekombinantní plazmidové DNA podle nároku 10 nebo 11, kde obsah endotoxinu je nižší nebo roven 50 EU/mg.
13. Preparát purifíkované rekombinantní plazmidové DNA podle nároku 12, kde obsah endotoxinu je nižší nebo roven 10 EU/mg.
14. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje DNA podle kteréhokoliv z nároků 10 až 13.
CZ19982984A 1996-03-21 1997-03-17 Purifikace plazmidové DNA farmaceutické kvality CZ295587B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9603519A FR2746412B1 (fr) 1996-03-21 1996-03-21 Purification d'adn plasmidique de qualite pharmaceutique

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ298498A3 CZ298498A3 (cs) 1999-01-13
CZ295587B6 true CZ295587B6 (cs) 2005-08-17

Family

ID=9490391

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19982984A CZ295587B6 (cs) 1996-03-21 1997-03-17 Purifikace plazmidové DNA farmaceutické kvality

Country Status (15)

Country Link
US (1) US6730781B1 (cs)
EP (1) EP0902835A1 (cs)
JP (1) JP2000506736A (cs)
KR (1) KR100502116B1 (cs)
AU (1) AU730755B2 (cs)
BR (1) BR9708227A (cs)
CA (1) CA2249465A1 (cs)
CZ (1) CZ295587B6 (cs)
FR (1) FR2746412B1 (cs)
HU (1) HU225426B1 (cs)
IL (1) IL126268A0 (cs)
NO (1) NO984342L (cs)
SK (1) SK129198A3 (cs)
WO (1) WO1997035002A1 (cs)
ZA (1) ZA972462B (cs)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7026468B2 (en) 1996-07-19 2006-04-11 Valentis, Inc. Process and equipment for plasmid purification
US7807822B2 (en) 1996-08-01 2010-10-05 Robert Bridenbaugh Methods for purifying nucleic acids
US6214586B1 (en) * 1997-12-08 2001-04-10 Genzyme Corporation Method for purifying plasmid DNA and plasmid DNA substantially free of genomic DNA
MXPA02011463A (es) * 2000-05-26 2004-09-06 Centelion Purificacion de una formacion de triple helice con un oligonucleotido inmovilizado.
FR2822476B1 (fr) * 2001-03-23 2004-04-02 Aventis Pharma Sa Procedes de purification et de detection de sequences cibles d'adn double brin par interaction triple helice
KR101002499B1 (ko) * 2001-03-23 2010-12-17 센텔리옹 에스아에스 2본쇄 ｄｎａ 표적 서열을 3중 나선 상호작용에 의해 정제 및 검출하는 방법
AU2003267175A1 (en) 2002-09-13 2004-04-30 Valentis, Inc. Apparatus and method for preparative scale purification of nucleic acids
EP1628749B1 (en) 2003-05-30 2019-07-31 VGXI, Inc. Devices and methods for biomaterial production
MXPA06003004A (es) * 2003-09-17 2006-06-23 Centelion Metodo de preparacion de acido desoxirribonucleico plasmidico de grado farmaceutico.
CA2559368A1 (en) * 2004-04-19 2005-10-27 Centelion Method for purifying plasmid dna
EP2246413A3 (en) * 2004-04-19 2011-10-26 Centelion Method for purifying plasmid DNA having pharmaceutical quality
BRPI0515418A (pt) 2004-08-16 2008-07-22 Nature Technology Corp método para a produção de dna de plasmìdio super-enrolado fechado covalentemente e composição de matéria
ES2529675T3 (es) 2004-11-30 2015-02-24 Merial Ltd. Dispositivos de mezclado para la lisis química de células
US20120258502A1 (en) * 2011-04-08 2012-10-11 Vinod Pandiripally Method of producing recombinant plasmid dna using substantially solid growth medium
US20120283503A1 (en) * 2011-04-29 2012-11-08 The Johns Hopkins University Nanoparticle loaded stem cells and their use in mri guided hyperthermia
CN116790578B (zh) * 2023-08-22 2023-12-12 赛奥斯博生物科技(北京)有限公司 一种基于碱裂解法快速纯化质粒的生产工艺

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3888079T2 (de) * 1987-10-22 1994-07-14 Asahi Optical Co Ltd Poröses keramisches Material.
JPH01135792A (ja) * 1987-11-20 1989-05-29 Mitsui Toatsu Chem Inc 核酸の分離・精製方法
CA2006008C (en) * 1988-12-20 2000-02-15 Donald J. Kessler Method for making synthetic oligonucleotides which bind specifically to target sites on duplex dna molecules, by forming a colinear triplex, the synthetic oligonucleotides and methods of use
AU6125294A (en) * 1993-01-13 1994-08-15 Genetics Institute Inc. Process for producing m-csf 223
US5503816A (en) * 1993-09-27 1996-04-02 Becton Dickinson And Company Silicate compounds for DNA purification
CA2182388C (en) * 1994-02-07 2007-08-07 Metin Colpan Process for producing endotoxin-free or endotoxin-poor nucleic acids and/or oligonucleotides for gene therapy
US5576196A (en) * 1995-01-13 1996-11-19 Vical Incorporated Process for reducing RNA concentration in a mixture of biological material using diatomaceous earth
US6750333B1 (en) 1996-02-06 2004-06-15 Roche Diagnostics Gmbh Process for preparing purified nucleic acid and the use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
BR9708227A (pt) 1999-07-27
AU2166197A (en) 1997-10-10
EP0902835A1 (fr) 1999-03-24
NO984342D0 (no) 1998-09-18
JP2000506736A (ja) 2000-06-06
HUP9902152A3 (en) 2001-04-28
HU225426B1 (en) 2006-11-28
HUP9902152A2 (hu) 1999-11-29
CA2249465A1 (fr) 1997-09-25
KR20000064693A (ko) 2000-11-06
FR2746412B1 (fr) 1998-06-12
SK129198A3 (en) 1999-03-12
IL126268A0 (en) 1999-05-09
AU730755B2 (en) 2001-03-15
US6730781B1 (en) 2004-05-04
FR2746412A1 (fr) 1997-09-26
KR100502116B1 (ko) 2005-12-20
ZA972462B (en) 1997-09-29
NO984342L (no) 1998-09-18
CZ298498A3 (cs) 1999-01-13
WO1997035002A1 (fr) 1997-09-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ295587B6 (cs) Purifikace plazmidové DNA farmaceutické kvality
JP2009045070A (ja) 固定化させたオリゴヌクレオチドと三重らせんを形成させることによるｄｎａ精製
US8399636B2 (en) Purification of a triple helix formation with an immobilized obligonucleotide
AU2007202804B8 (en) Purification of a triple helix formation with an immobilized oligonucleotide
MXPA98007323A (en) Purification of plasmid dna of pharmaceutical quality
AU2001263459A1 (en) Purification of a triple heli formation with an immobilized oligonucleotide
IL152860A (en) Purification of dna by a triple helix formation with an immobilized oligonucleotide

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20090317