CA2249465A1 - Purification d'adn plasmidique de qualite pharmaceutique - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un procédé pour la purification d'ADN plasmidique de qualité pharmaceutique comprenant au moins une étape de chromatographie colonne hydroxyapatite.

Description

CA 0224946~ 1998-09-16 wo 97/35002 PCT/FRg7/00472 PURIFICATION D'ADN PLASMIDIQUE DE QUALITE PHARMACEUTIQUE

La présente invention conc~rne un nouveau procédé pour la pllrific~tion d'ADN. Le procédé selon l'invention permet de purifier rapi~lemPnt de l'ADN double brin lltili~hle pharmacologiq~lemçnt, Plus particulièrement, le procédé de pllrifi~tion 5 selon l'invention ne fait inlel ven r que de la diafiltration et des chro--,alographies.

Les techniques de thérapie génique et cellulaire conn~ çnt actuell~m~n1 un developpement extraordinaire. Néanmoins, ces techniques impliquent la pos.eihilité de produire des quantités importantes d'ADN de pureté pharmacologique, en particulier d'ADN pl~mi~lique. En effet dans ces nouvelles thérapies, le met~ ment est souvent 10 con.~tit~le par l'ADN lui-même, et il est essentiel de pouvoir le fabriquer dans des quantités adaptées, l'isoler et le purifier de manière app,~.priée à un usage thérapeutique chez l'homme, notamment par voie i..~aveilleuse.

Ces problèmes de quantités et de pureté n'ont pas été pris en compte dans les méthodes classiques d'isolement de l'ADN. De ce fait les méthodes utili~ee~ en laboratoire ne sont pas transposables dans le domaine de l'industrie pharmace~ltique pour purifier de l'ADN pl~smi~lique~ Deux de ces méthodes sont les plus lutili.cé~s et sont celles qui donnent les meilleurs résultats. Elles consistent à partir d'un lysat bactérien brut et à l'enrichir en ADN pl~mi~ique en ~limin~nt un maximum de cnnt~min~nt~ En particulier le Iysozyme du blanc d'oeuf est utilisé pour casser la paroi bactérienne puis le Iysat est centrifugé pour ~liminer les débris celllll~ires. Le st~rn~ nt est ensuite soumis à l'action d'une Rnase pancréatique d'origine animale qui permet d'Plimin~r l'ARN, qui représente à ce moment environ 75% des acides nucléiques présents.

Les protéines sont alors précipitées par un mélange phénol/
~ 25 chloroforme/isoamyl-alcool. Le surnageant obtenu après centrifugation est débarassé
des protéines et de l'ARN mais contient encore de grandes qu~ntiteS d'ADN
chromosomique qui doit être éliminé lors d'une étape supplémentaire. Cette étapeconsiste en une ultracentrifugation en présence de Bromure d'Ft~li(litlm et de Chlorure de Césium. Les trois types d'acides nucléiques que sont l'ADN chromosomique, l'ADN

CA 0224946~ 1998-09-16 Wo 97/35002 PCT/FRg7/00472 pl~mitlique et l'ARN ont une plus ou moins grande capacite à fixer le b~mu~e d'éthidium. De ce fait ils se séparent en trois phases (lictinctes lors d'une ultracentrifugation sur gradient de chlorure de césium.

Une variante de ce protocole consiste à faire suivre l'action de la Rnase 5 pancréatique par une réduction en présence d'un détergent alc~lin,~ivie par une extraction au phénoV chloroforme. L'ADN est alors précipité par de l'éthanol, remis en suspension et reprécipité au polyéthylène glycol.

Ces deux méthodes qui permettent d'obtenir une solution d'ADN pl~mi~ ue sont cependant in~ltili~hles pour la production industrielle d'un produit de pureté
10 pharmaceutique. En effet l'utilisation d'enzymes d'origine animale pose problème. Ainsi le lysozyme et la Rnase pancréatique, du fait de leur origine, risquent d'introduire une cc,-,la~ tion virale dans le produit final. De plus, les solvants organiques sont extrèmement toxiques et doivent être ~?limines si l'on veut pouvoir utiliser le produit comme médicament. Ces solvant-infl1lic~nt également une a~ nt~tion considérable 15 des coûts.liée not~mm~nt à leur stockage, leur lltilis~tion dans des conditions de sécurité maximales et l'~limin~tion des déchets toxiques qu'ils imposent, et aussi en raison de la difficulté rencontrée pour réussir à valider l'élimin~tion complète de tels produits de la solution finale. Le bromure d'éthidium est quand à lui tellement toxique, mutagène et tératogène que sa présence même sous forme de traces ne peut être 20 tolérée dans un produit à destin~tion pharmaceutique. L'utili~ation de solvants, de réactifs toxiques, de même que d'enzymes d'origine animale est incompatible avec un procédé industriel répondant aux Bonnes Pratiques de Fabrication.

La présente invention décrit un nouveau procédé simple et particulièrement efficace pour la purification d'ADN. Le procédé décrit dans la présente ~em~n-le25 permet la production en grande quantité d'un ADN de très grande pureté. D'unemanière particulièrement avantageuse le procédé décrit dans la présente dem~n~lepermet d'éviter l'emploi de solvants organiques toxiques et d'enzymes d'origine ~nim~le Il permet également de s'affranchir de centrifugations nombreuses et f~ti~ u~t~c difficiles à extrapoler et de faible ren~em~nt en raison notamment d'étapes 30 de précipitation au PEG, à l'acétate d'amm~-nit~m ou au CaC12. Le procédé selon CA 0224946~ 1998-09-16 Wo 97/35002 PCT/FRg7/00472 l'invention permet ég~lemçnt d'obtenir de grandes quantités d'ADN (100 mg, lg, 10 g ou plus) en un seul lot, sans ~liffi~llté technique particulière. En outre le procédé selon l'invention fait appel à des méthodes compatibles avec les Bonnes Pratiques de Fabrication et permet d'obtenir un ADN de qualité pharmaceutique.

Un premier objet de l'invention cQnc~me un procédé pour la purifi~atic-n d'ADN double-brin permettant d'obtenir très rapi-lement de grandes q~l~n~;tes d'ADN
pl~mit1ique de pureté pharmaceutique, faisant .n~- ~nir une étape de chrom~tographie sur colonne hydro~yapa~ile sous forme céramique. L'hydlvAy~palile sous forme cri~talline était déjà connue mais, du fait de sa fragilité, d'un emploi difficile et limité. La forme céramique est beaucoup plus rési.~t~nte autant sur un plan physique que sur un plan chimique.

D'une manière préférée, le procédé de l'invention comprend deux étapes de chrom~tographie, l'une au moins étant une chromatographie sur hyd~oxyapatile.

Avantageueement, la deuxième chromatographie est une chromatographie d'affinité ou d'échange d'ions. Les deux chromatographies peuvent être faites dans un ordre indifférent.

Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, le procédé selon l'invention comp~end une étape de chromatographie sur colonne hydroxy~pa~ile et une étape de chromatographie d'affinité Triple-Hé}ice. La chromatographie d'affinitéTriple-Hélice est basée sur l'utilisation d'un support sur lequel est couplé de manière covalente un oligonucléotide capable de former par hybridation une triple hélice avec une séquence spécifique présente sur ledit ADN. Les deux chromatographies peuvent être faites dans un ordre indifférent.

Selon un autre mode de réalisation, le procédé de l'invention comprend une étape de chromatographie sur colonne d'hydroxy~palile et une étape de chromatographie d'échange d'anions.

Avantageusement, le procédé de l'invention comprend en outre une étape de diafiltration. Celle-ci est généralement réalisée avant les chromatographies.

CA 0224946~ 1998-09-16 W O 97/35002 PCT~FR97/00472 Une étape importante du procédé de l'invention fait inte, venir une chromatographie sur colonne hydroxyapatite.

L'hydroxyapatite est un phosphate de calcium complexe comportant dix atomes de calcium. La forme céramic plus stable que la forme cri.ct~lline à été mise 5 au point par Bio-Rad Laboratories et Asahi Optical Co., Ltd. Le composé céramique a les mêmes propriétés que le composé cristallin sans en avoir les lirnitations physiques; ce matériau est surtout utilisé en chromatographie pour la purification des protéines, mais présente des avantages et permet d'obtenir de très bons résultats lors de la purification d'acides nucléiques. Il est macroporeux, sphérique, chimiquement et 10 physiquement très stable et peut être réutilisé plusieurs tli7~ines de fois sans pertes d'efficacité. Cette forme ceramic peux supporter des pressions élevées, des pH très élevés, des flux très rapides et les solvants organiques.

La chromatographie sur colonne de ceramic hydoxyapatite est un type de chromatogaphie particulier qui n'est ni une chromatographie d'affinité ni un échange 15 d'ion aux sens stricts. Elle ell,preillte ses propriétés à ces deux types de chromatographies et l'on pourrait la définir comme a une pseudo-affinité et un pseudo échange d'ions.

Les acides nucléiques se lient à l'hydroxyapatite par la vertu d'interactions entre les groupes phosphate du squelette du polynucléotide et les résidus calcium du 20 support. Les acides nucléiques peuvent être élués de façon différentielle en faisant varier la force ionique des tampons phosphates. Les acides nucléiques peuvent être ainsi séparés des protéines et entre eux, les ADN des ARN et les ADN simple brins des ADN double-brins. Les ARN sont ceux qui se lient de la manière la moins solide et peuvent être élués avec un tampon de force ionique relativement faible. Les ADN
25 simple brins sont également moins fortement fixé que les ADN double-brins qui sont plus solidement liés au support et nécéssitent un tampon plus fort.

Le matériel biologique dans un tampon phosphate de faible force ionique est déposé sur la colonne. Les acides nucléiques ADN et ARN sont fixés. Un second tampon, de force ionique plus élevée, est ensuite utilisé pour éluer l'ARN qui est CA 0224946~ 1998-09-16 Wo 97/3s002 PCT~Rg7/00472 quasiment complétement éliminé à ce stade. Un troisième tampon de force ionique supérieure est utilisé pour éluer l'ADN double brin qui est recueilli. L'utilisation d'hydroxyapatite dans le procédé de l'invention perrnet de récupérer de l'ADN double brin ayant un très grand degré de pureté.

Comme indiqué ci-avant, un mode de réalisation préféré de l'invention comprend en outre une étape de chromatographie d'affinité triple hélice.

La chromatographie d'affinité triple hélice consiste à faire passer la solution obtenue sur un support sur lequel est couplé de manière covalente un oligonucléotide capable de forrner par hybridation une triple hélice avec une séquence spécifique présente sur l'ADN à purifier (WO96/18744).

La séquence spécifique peut être une séquence présente naturçllem~nt sur l'ADN double-brin, ou une séquence synthétique introduite artificiellement dans celui-ci. Les oligonucléotides utilisés dans la présente invention sont des oligonucléotides hybridant directement avec l'ADN en double-brin. Ces 15 oligonucléotides peuvent contenir les bases suivantes:

- thymidine (T), qui est capable de former des triplets avec les doublets A.T
de l'ADN double-brin (Rajagopal et al, Biochem 28 (1989) 7859);

- adénine (A), qui est capable de forrner des triplets avec les doublets A.T de l'ADN double-brin;

- guanine (G), qui est capable de forrner des triplets avec les doublets G.C de l'ADN double-brin;

- cytosine protonée (C+), qui est capable de forrner des triplets avec les doublets G.C de l'ADN double-brin (Rajagopal et al précitée);

- uracile (U) qui est capable de former des triplets avec les paires de bases A.U ou A.T.

CA 0224946~ 1998-09-16 W O 9~/35002 PCT/FR97/00472 Préférentiellement, l'oligonucléotide utilisé comprend une séquence homopyrimidique riche en cytosines et la séquence spécifique présente sur l'ADN est une sé~uence homopurique-homopyrimidique. La présence de cytosines permet d'avoir une triple hélice stable à pH acide, où les cytosines sont protonées, et5 déstabilisée à pH alcalin, où les cytosines sont neutralisées.

Pour permettre la fonnation d'une triple-hélice par hybridation, il est important que l'oligonucléotide et la séquence spécifique présente sur l'ADN soient complémentaires. A cet égard, pour obtenir les meilleurs rendements et la meilleure sélectivité, on utilise dans le procédé de l'invention un oligonucléotide et une10 séquence spécifique parfaitement complémentaires. Il peut s'agir en particulier d'un oligonucléotide poly-CTT et d'une séquence spécifique poly-GAA.A titre d'exemple, on peut citer l'oligonucléotide de séquence 5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3'(GAGG(CTT)7;(SEQ ID n~l), dans lequel les bases GAGG ne forment pas de triple hélice mais permettent d'espacer 15 l'oligonucléotide du bras de couplage. On peut également citer la séquence (CTT)7 (SEQ ID n~2). Ces oligonucleotides sont capables de former une triple-hélice avec une séquence spécifique comportant des motifs complémentaires IGAA). Il peut s'agir en particulier d'une région comportant 7,14OU17 motifs GAA. comme décr,t dans les exemples.

Une autre séquence d'intérêt spécifique est la séquence:

5'-AAGGGAGGGAGGAGAGGAA-3'(SEQID n~3).

Cette séquence forme une triple hélice avec les oligonucléotides 5'-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3'(SEQ ID n~4) ou 5'-TTGGTGTGGTGGGTGGGTT-3'(SEQID n~5).

Dans ce cas, l'oligonucléotide se fixe dans une orientation anlipar~llèle au brin polypurique. Ces triples hélices ne sont stables qu'en présence de Mg2+ (Vasquez et CA 0224946~ 1998-09-16 W O 97/35002 PCT~R97/00472 al., Biochemistry, 1995, 34, 7243-7251; Beal et Dervan, Science, 1991, 251, 1360-1363).

Comme indiqué ci-avant, la séquence spécifique peut etre une séquence ~ présente naturellement sur l'ADN double-brin, ou une séquence synthétique 5 introduite artificiellement dans celui-ci. Il est particulièrement intéressant d'utiliser un oligonucleotide capable de former une triple-hélice avec une séquence présente naturellement sur l'ADN double-brin, par exemple dans l'origine de réplication d'un pl~micle ou dans un gène marqueur. A cet égard, la clem~n~eresse a effectué des analyses de séquence de plasmides et a pu montrer que certaines régions de ces ADN, 10 not~mm~nt dans l'origine de réplication, possédent des régions homopurique-homopy,i",idiques. La synthèse d'oligonucléotides capables de former des triple-hélices avec ces régions homopurique-homopyrimidiques naturelles permet avantageusement d'appliquer le procédé de l'invention a des plasmides non modifiés, notamment des plasmides comr~erciaux de type pUC, pBR322, pSV, etc. Parmi les 15 séquences homopuriques-homopyrimidiques naturellement présentes sur un ADN
double brin, on peut citer une séquence comprenant tout ou partie de la séquence 5'-CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3'(SEQ ID n~6) présente dans l'origine de réplication ColE1 de E. coli. Dans ce cas, l'oligonucléotide formant la triple hélice possède la séquence: 5'-GAAGGG~Cl-rCCCTClTICC-3'(SEQ ID n~7) et se fixe 20 alternativement sur les deux brins de la double hélice, comme décrit par Beal et Dervan (J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 4976-4982) et Jayasena et Johnston (NucleicAcids Res. 1992, 20, 5279-5288). On peut aussi citer la séquence 5'-GAAAAAGGAAGAG-3'(SEQ ID n~8) du gène de la ~-lactamase du plasmide pBR322 (Duval-Valentin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 504-508).
25 L'utilisation d'un oligonucléotide capable de former une triple-hélice avec une séquence présente dans une origine de réplication ou un gène marqueur est particulièrement avantageuse car elle permet, avec le même oligonucléotide, de purifier tout ADN contenant ladite origine de réplication ou ledit gène marqueur. Il n'est donc pas néce~.c~ire de modifier le pl~mide ou l'ADN double-brin pour lui 30 incorporer une séquence spécifique artificielle.

CA 0224946~ 1998-09-16 Bien que des séquences parf:litem~nt compl~ nt~ires soient préférées il est ent~?n~u toutefois que certains mésappariements peuvent être tolérés entre la s~équ~nçe de l'oligonucléotide et la séquence présente sur l'ADN, dès lors qu'ils ne con~ çnt pas à une perte trop grande d'affinité. On peut citer la séquence 5'-5 AAAAAAGGGAATAAGGG-3'(SEQ ID n~9) présente dans le gène de la ~ ct~m~e de E. coli. Dans ce cas, la thymine inlel~u,l")anl la séquence polypurique peut être reconnue par une guanine du troisième brin, formant ainsi un triplet ATG qui eststable quand il est encadré par deux triplets TAT (Kiessling et al., Biochemistry, 1992, 31, 2829-2834).

Selon un mode de réalisation particulier, les oligonucléotides de l'invention co,l-~)renilent la séquence (CCT)n, la séquence (CT)n ou la séquence (CTT)n, dans laquelle n est un nombre entier compris entre 1 et 15 inclus. Il est particulièrement avantageux d'utiliser des séquences de type (CT)n ou (Cl~r)n. La demanderesse a en effet montré que le rendement de purification était influencé par la quantité de C dans 15 l'oligonucléotide. En particulier, comme indiqué dans l'exemple 7, le rendement de purification a1lgmçnte lorsque l'oligonucleotide comporte moins de cytosines. Il est çnten-lu que les oligonucléotides de l'invention peuvent également combiner des motifs (CCT), (CT) ou (CTT).

L'oligonucléotide utilisé peut être naturel (composé de bases naturelles, non 20 modifiées) ou modifié chimiquement. En particulier, l'oligonucléotide peut présenter avantageusement certaines modifications chimiques permettant d'augmenter sa résistance ou sa protection vis à vis des nucléases, ou son affinité vis à vis de la séquence spécifique.

Selon la présente invention on entend aussi par oligonucléotide tout 25 enchainement de nucléosides ayant subi une modification du squelette dans le but de le rendre plus résistant aux nucléases. Parmi les modifications possibles on peut citer, les oligonucléotides phosphorothioates qui sont capable de former des triples hélices avec l'ADN (Xodo et al., Nucleic Acids Res., 1994, 22, 3322-3330), de même que les oligonucléotides po.~éd~nt des squelettes formacétal ou méthylphosphonate CA 0224946~ 1998-09-16 wo 97/35002 PCT/FRg7/00472 (~ttetlc~i et al., J. Am. Chem. Soc., 1991, 113, 7767-7768). On peut également utiliser les oligonucléotides synthétisés avec des cc-anomères de nucléotides, qui forment également des triples hélices avec l'ADN (Le Doan et al., Nucleic Acids Res., 1987, 15, 7749-7760). Une autre modification du squelette est la liaison 5 phosphor~mid~te. On peut citer par exemple la liaison internucléotidique N3'-P5 phosphor~mid~te décrite par Gryaznov et Chen, qui donne des oligonucleotides formant avec l'ADN des triples hélices particulièrement stables (J. Am. Chem. Soc.
1994, 116, 3143-3144). Parmi les autres modifications du squelette, on peut citer également l'utilisation de ribonucléotides, de 2'-O-méthylribose, de phosphodiester,.. (Sun et Hélène, Curr. Opinion Struct. Biol., 116, 3143-3144). Le squelette phosphoré peut enfin être remplacé par un squelette polyamide comme dans les PNA (Peptide Nucleic Acid), qui peuvent également former des triples hélices(Nielsen et al., Science, 1991, ~, 1497-1500; Kim et al., J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 6477-6481)) ou par un squelette à base de gll~ni-line, comme dans les DNG
(déoxyribonucleic guanidine, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 6097-6101), analogues polycationiques de l'ADN, qui forment également des triples hélices.

La thymine du troisième brin peut aussi être remplacée par une 5-bromouracile, ce qui augmente l'affinité de l'oligonucléotide pour l'ADN (Povsic et Dervan, J. Am. Chem. Soc., 1989, 111, 3059-3061). Le troisième brin peut 20 également contenir des bases non naturelles, parmi lesquelles on peut citer la 7-déaza-2'-déoxyxanthosine (Milligan et al., Nucleic Acids Res., 1993, 21, 327-333), la 1- (2-déoxy-~-D-ribofuranosyl)-3-méthyl-5-amino-1H-pyrazolo[4,3-dlpyrimi-line-7-one (Koh et Dervan,J. Am. Chem. Soc., 1992, 114, 1470-1478), la 8-oxoadenine, la2-aminopurine, la 2'-O-méthyl-pseudoisocytidine, ou toute autre modification connue 25 de l'homme du métier (voir pour revue Sun et Hélène, Curr. Opinion Struct. Biol.
1993, 3, 345-356).

Un autre type de modification de l'oligonucléotide a plus particulièrement pour objet d'améliorer l'interaction et/ou l'affinité entre l'oligonucléotide et la séquence spécifique. En particulier, une modification tout à fait avantageuse selon 30 I'invention consiste à méthyler les cytosines de l'oligonucléotide. L'oligonucléotide ~ . . _ CA 0224946~ 1998-09-16 W O 97/3S002 PCT~R97/00472 ainsi méthylé présente la propriété remarquable de former une triple hélice stable avec la séquence spécifique dans des zones de pH plus proches de la neutralité(> 5).
Il permet donc de travailler à des pH plus élevés que les oligonucléotides de l'art antérieur, c'est à dire à des pH où les risques de dégradation de l'ADN pl~mi~lique 5 sont bien inférieurs.

La longueur de l'oligonucléotide utilisé dans le procédé de l'invention est d'aumoins 3 bases, et de préférence, comprise entre 5 et 30. On utilise de manière avantageuse un oligonucléotide de longueur supérieure à 10 bases. La longueur peut être adaptée au cas par cas par l'homme du métier en fonction de la sélectivité et de la 10 stabilité de l'interaction recherchées.

Les oligonucléotides selon l'invention peuvent être synthétisés par toute technique connue. En particulier, ils peuvent être préparés au moyen de synthétiseurs d'acides nucléiques. Toute autre méthode connue de l'homme du métier peut bien évidemment être utilisée.

Pour permettre son couplage covalent sur le support, l'oligonucléotide est généralement fonctionnalisé. Ainsi, il peut être modifié par un groupement terminal thiol, amine ou carboxyle, en position 5' ou 3'. En particulier, l'ajout d'un groupe thiol, amine ou carboxyle permet, par exemple, de coupler l'oligonucléotide sur un support portant des fonctions disu}fure, maléimide, amine, carboxyle, ester, époxyde, 20 brc,,~lure de cyanogène ou aldéhyde. Ces couplages se forment par établi~ement de liaisons disulfure, thioether, ester, amide ou amine entre l'oligonucléotide et le support. Toute autre méthode connue de l'homme du métier peut être utilisée, telle que des réactifs de couplage bifonctionnels, par exemple.

Par ailleurs, pour améliorer l'hybridation avec l'oligonucléotide couplé, il peut 25 être avantageux que l'oligonucléotide contienne un "bras" et une séquence de bases "espaceur". L'utilisation d'un bras permet en effet de fixer l'oligonucléotide à une t~nce choisie du support permettant d'améliorer ses conditions d'interaction avec l'ADN. Le bras est avantageusement con~titue d'une chaîne carbonée linéaire, comprenant 1 à 18, et de préférence 6 ou 12 groupes (CH2), et d'une amine qui CA 0224946~ 1998-09-16 permet la liaison à la colonne. Le bras est relié a un phosphate de l'oligonucléotide ou d'un "espaceur" composé de bases n'interférant pas avec l'hybridation. Ainsi, "l'espaceur" peut comprendre des bases puriques. A titre d'exemple, "l'espace~r" peut comprendre la séquence GAGG. Le bras est avantageusement composé d'une chaîne 5 carbonée linéaire comprenant 6 ou 12 atomes de carbones.

Pour la mise en oeuvre de la présente invention, dirfér~ s types de supports peuvent être utilisés. Il peut s'agir de supports de chromatographie fonctionn~ és, en vrac ou précon(litionnés en colonne, de surfaces plastiques fonctionn~ é~ ou de billes de latex fonctionnalisées, magnétiques ou non. Il s'agit préférentiellement de 10 supports de chromatographie. A titre d'exemple, les supports de chromatographie pouvant être utilisés sont l'agarose, l'acrylamide ou le Dextran ainsi que leurs dérivés (tels que Séphadex, Sépharose, Superose,...), les polymères tels que le poly(styrènedivinylbenzène), ou la silice greffée ou non greffée, par exemple. Les colonnes de chromatographie peuvent fonctionner en mode de diffusion ou de 15 perfusion.

Pour obtenir de meilleurs rendement de purification, il est particuliérement avantageux d'utiliser, sur le plasmide, une séquence comportant plusieurs positions d'hybridation avec l'oligonucléotide. La présence de plusieurs positions d'hybr~dation favorise en effet les interactions entre ladite séquence et l'oligonucléotide, ce qui 20 conduit à améliorer les rendements de purification. Ainsi pour un oligonucléotide comportant n réphitions de motifs (CCT), (CT) ou (CTT), il est préférable d'utiliser une séquence d'ADN comportant au moins n motifs complémentaires et, de p~efé~ ce, n+1 motifs complémentaires. Une séquence portant n+1 motifs complémentaires offre ainsi deux positions d'hybridation à l'oligonucléotide.
25 Avantageusement, la séquence d'ADN comporte jusqu'a 11 positions d'hybridation, c'est à dire n+10 motifs complémentaires.

Selon un autre mode de réalisation la chromatographie sur colonne d'hydroxyapatite céramique est suivie ou précédée d'une étape de chromatographiesur colonne d'échange d'anions. On utilise de préférence une colonne échangeuse CA 0224946~ l998-09-l6 W O 97/35002 PCT~FR97/00472 d'anions faibles,. les anions forts ont en effet la propriété de fixer très fortement l'ADN, si fortement qu'il est très difficile de récupérer le produit (le rendement est alors inférieur à 605c). C'est pourquoi la ~lPrn~n~eresse utilise des échangeurs d'anions faibles qui ne retiennent pas l'ADN pl~cmi~lique mais qui fixent les ARN r~ci-hlelc.

S Comme indiqué ci-avant, le procédé selon l'invention comprend avantageusement une étape de diafiltration. La diafiltration est une étape de concentration de l'érh~ntillon au cours de laquelle on élimine l'eau et les petites molécules (telles que les sels, les protéines et les acides nucléiques de petite taille) présentes dans le lysat clair. Les sels sont remplacés par un tampon phosphate pour la chromatographie. Aprés diafiltration, la solution est de 5 a 50 fois plus concentrée que la solution de départ (le facteur de concentration dépend du volume de la solution de départ).

L'utilic~tiQn de la diafiltration présente plusieurs av~n~g~s. Elle permet entreautres d'éviter l'utilisation de solvants organiques tel que l'isopropanol dont l'emploi nécessiterait une in.ct~ tion anti-déflagrante. De plus, cette technique est utili~hle pour des volumes très variables. Il suffit en effet d'allgmenter la surface des membranes en fonction du volume à traiter.

On utilise avantageusement pour la diafiltration un appareil servant de support à une membrane de polyether sulfone modifié ou d'acétate de cellulose modifié
permettant d'avoir un flux de liquide à débit régulable. Ces membranes sont définies par leur point de coupure qui est en valeur nominale la taille maximale des molécules pouvant traverser ladite membrane. Rapporté à une valeur réelle une membrane dont le point de coupure est égal à 100 kD permet de retenir des molécules de taille supérieure à 30 kD.

Un procédé préféré selon l'invention comprend les étapes suivantes:
diafiltration, chromatographie sur colonne de Ceramic hydroxyapatite, et chromatographie d'affinité par hybridation spécifique entre une séquence de l'ADN et un oligonucléotide avec formation d'une triple hélice.

CA 0224946~ 1998-09-16 W O 97/35002 PCT~R97/00472 Le procédé selon la présente invention peut être utilisé pour purifier tout typed'ADN double brin. Il s'agit par exemple d'ADN circulaire, tel qu'un pl~cmi~e portant généralement un ou plusieurs gènes d'intérêt thérapeutique. Ce pl~mi~le peut porter également une origine de réplication, un gène marqueur, etc.... Ce procédé permet 5 aussi de purifier de l'ADN, linéaire ou circulaire, portant une séquence d'intérêt, à
partir d'un mélange comprenant des ADN de différentes séquences.

Généralement, I'ADN de départ est produit par un microo~ ..,e hôte modifié par les techniques de l'ADN recombinant. A cet égard l'hôte c-~nten~nt l'ADN
double brin que l'on cherche à récupérer est tout d'abord multiplié et amplifié. Pour ce 10 faire on utilise les techniques classiques de fermentation permettant d'obtenir une forte densité cellulaire. La technique la plus courament employée est celle dite de "fed-batch" qui est abondament décrite dans la litterature (Jung et al. Ann. Inst. Pasteurl Microbiol. 1988, 139, pl29-146; Bauer et al. Biotechnol. Bioeng. 1976, 18, p81-94).

La fermentation est suivie par une Iyse des cçlIul~s. Pour Iyser les cellules on15 peut utiliser soit un système mécanique soit un sysème chimique suivant le type de cellules concerné ou suivant que l'on souhaite travailler sur Iysat brut ou sur lysat clair. Pour la Iyse mécanique, on utilise de preré~eIlce des systèmes qui ne dénaturent pas l'ADN (agitation, choc thermique, choc osmotique). Ces méthodes ne sont pas adaptées à l'extraction d'ADN à partir des cellules procaryotes. En effet les 20 traitements mécaniques utilisés pour casser des cellules procaryotes sont dénaturant pour l'ADN. La Iyse mécanique est préférentiellement réservée aux cellules eucaryotes, pour les cellules procaryotes on préférera une Iyse chimique.

Les cellules procaryotes sont Iysées chimiquement par toute technique connue de l'homme du métier (détergents, Iysozymes, éventuellement combinés à un choc 25 thermique, etc). Préférentiellement, on utilise un mélange de soude et de SDS. Durant ce traitement le pH passe à 12. Le pH du Iysat ainsi obtenu est ensuite ramené àenviron 6 ce qui entraine la précipitation des protéines d'une partie de l'ADN
chromosomique et de l'ARN. On élimine ce précipité par centrifugation.

CA 0224946~ l998-09-l6 W O 97~5002 PCT/FR97/00472 Un mode de réalisation préféré de l'invention consiste tout d'abord à faire subir aux cellules contenant l'ADN double brin à purifier une lyse chimique qui permetd'obtenir un Iysat clair. Le lysat clair ainsi obtenu subit une diafiltration et c'est le concentrat ainsi obtenu qui est chromatographié sur colonne hy~J~Ly~pa 5 céramique.

Le lysat cellulaire peut être un lysat de cellules procaryotes ou eucaryotes.

S'agi~s~nt de cellules procaryotes, on peut citer par exemple les bactéries E.
ÇQ!i, B. subtilis. S. typhimurium ou Streptomyces. S'agissant de cellules eucaryotes, on peut citer les cellules animales, les levures, les champignons, etc..., et plus 10 particulièrement, les levures Kluyveromyces ou Saccharomyces ou les cellules COS, CHO, Cl27, NIH3T3, etc....

Le procédé de l'invention est particulièrement avantageux puisqu'il permet d'obtenir, de manière rapide et ~imple, de l'ADN plasmidique de très haute pureté. En particulier, comme illustré dans les exemples, ce procédé permet de séparer 15 efficacement l'ADN pl~cmidique considéré de composants cont~min~nt~, tels quel'ADN chromosomique fragmenté, I'ARN, les endotoxines, les protéines, les nuclé~ces, etc.... Plus particulièrement, le procédé de l'invention permet d'obtenir des préparation d'ADN double brin, not~mm~nt pl~cmi~ique, pratiquement exemptes d'ADN chromosomique (< 0,5%). En outre les prepald~ions d'ADN obtenùes ont 20 également une teneur en endotoxines très faible (< 50 EU/mg), compatible avec une utilisation pharmaceutique.

La demanderesse a montré que, de manière tout à fait étonn~nte, la combinaison des deux étapes décrites plus haut à savoir chromatographie sur colonne Hydroxyapatite suivie ou précédée par une chromatographie Triple Hélice, permet 25 d'obtenir des pl~pala~ions d'ADN pl~mi~lique ayant une teneur en ADN
chromosomique de 0.01%. De manière tout à fait préférentielle l'invention concerne également des p~epardtion d'ADN pl~midique ayant une teneur en ADN
chromosomique inférieure ou égale à 0.01~,7o.

Wo 97/35002 PCT/FR97/00472 L'invention concerne eg~l~mPnt des préparations d'ADN pl~mi~ ue ayant une teneur en endotoxines inférieure à 50 EU/mg, p~l~ltn~iell~m~nt inférieure à 10 EU/
mg. La teneur en endotoxines est donc très en dessous de la teneur autorisée qui est de 350 EU/ injection pour une personne pesant 70 kg (une EU est une Endotoxin Unit et est égale à 100 pg).

La présente invention décrit donc des compositions comprenant de l'ADN
pl~mi~1ique ~-tili.~able pharm~ceutiquement not~mm~nt en thérapie génique ou cellulaire in vivo ou ex vivo. A cet égard, l'invention a ég~lement pour objet une composition pharm~ceutique comprenant de l'ADN double brin, linéaire ou plasmidique, préparé selon le procédé décrit ci-avant.

Les compositions peuvent comporter l'ADN pl~cmi~lique "nu" ou associé à des vecteurs de transport tels que les liposomes, les nanoparticules, les lipides cationiques, les polymères, des protéines ou virus recombin~nts, etc.

La présente dem~de sera décrite plus en détail à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être con~iderés comme illustratifs et non limit~tif~

MATERIEL ET METHODES

l. Construction du plasmide pXL2784.

Dans les expériences qui suivent on a utilisé un pl~mide spécifique pXL2784.
Ce plasmide comporte une c~3csette conten~nt le promoteur du Cytomégalovirus, legène codant pour la luciférase et une séquence homopurique- homopyrimidique (GAA)17. La construction de ce plasmide est décrite ci-après. Il est bien évident que le procédé selon l'invention n'est pas limité au pl~mi~e décrit.

1.1. Description du plasmide pXL2784 Le plasmide pXL2784 est construit à partir du vecteur pl~cm~ ue pXL2675 (2,513 kb), réplicon minimal du plasmide ColE1 issu du plasmide pBluescript (ORI) et ayant pour marqueur de sélection le gène du transposon Tn5 codant pour la résistance wo 97/3s002 PCT/FRg7/00472 à la kanamycine. Le plasmide pXL2784 contient aussi une séquence homopurique-homopyrimidique (GAA)17 issue du pl~mide pXL2563 et pouvant se lier à un oligomère (CTT)n où n=1 à 17, pour générer localement une structure triple hélice et permettre une purification par affinité. Le plasmide pXL2784 possède le locus cer (382 bp) issu du p~ e ColE1 et cloné dans le plasmide pXL565; le locus cer contient une séquence site spécifique des recombinases XerC/XerD et conduit à larésolution de multimères de pl~mides. Le transgène cloné sur ce pl~mi~le pXL2784est une cassette d'expression (3,3 kb) du gène luc codant pour la luciférase de Photinus pyralis sous contrôle du promoteur P CMV cytomégalovirus hllm~in, cettec~sette provient du pl~micle pXL2622.

Le plasmide a une taille de 6390 bp. La carte du plasmide pXL2784 est présentée sur la figure 1,~ ét sa construction est détaillée ci-après.
1.2. Vecteur minimal pXL2675 Après avoir rendu l'extrémité BsaI franche par action du fragment de Klenow, le fragment BsaI-PvuII de 1,15 kb du plasmide pBKS+ ~Stratagen) a été cloné avec le fragment SmaI de 1,2 kb du plasmide pUC4KIXX (Pharmacia) pour générer le plasmide pXL2647.
L'oligonucléotide 5542:

5'-AGCTTCTCGA GCTGCAGGAT ATCGAATTCG GATCCTCTAG AGC
GGCCGCG AGCTCC-3' (SEQ ID N~10) et roligonucléotide 5543:

5'-AGCTGGAGCT CGCGGCCGCT CTAGAGGATC CGAATTCGAT ATC
CTGCAGC TCGAGA-3'(SEQ ID N~11) ont été hybridés entre eux puis clonés au site HindIII du pXL2647 générant le pl~cmil1e pXL2675. Ce p!~mide comprend le multisite HindIII, XhoI, PstI, EcoRV, EcoRI, BamHI, XbaI, NotI, SstI entre l'origine de réplication et le gène codant pour la résistance à la kanamycine.

wo 97/3S002 PCT/FR97/00472 1.3. Cassette luciférase dans le plasmide pXL2622 Le promoteur CMV contenu dans le fragment MluI-HindIII de 660 bp du - pl~mi~le pcDNA3 (provenant d'Invitrogen) a été cloné entre les sites MluI-HindIII du pl~ e pGL2 basic (Promega contient le gène de la luciférase) pour générer le plasmide pXL2622.

1.4. Pl~cmides pXL2563 et pMTL22-TH contenant une séquence susceptible de former une triple hélice avec un oli~onucléotide.
L'oligonucléotide 4817:

5'-GATCCGAAGA AGAAGAAGAA GAAGAAGAAG AAGAAGAAGA A
GAAGAAGAA GAAGAAGG-3'(SEQ ID N~12) et l'oligonucléotide 4818:

5'-AAl~CCl-rCT TCTTClYCl-r CITCTI Cl-rC l-rCTTC~CT TCI~CT
TCTT Cl-rCl~CG-3' (SEQ ID N~13) ont été hybridés entre eux et clonés aux sites EcoRI et BamHI du pl~mi~
pBluescriptII KS pour former le plasmide pXL2563. Le fragment EcoRI-BamHI de 62 bp est cloné aux sites EcoRI-BamHI du plasmide pMTL22 (P. Minton 1988 Gene 68:139) pour générer le plasmide pMTL22-TH.

1.5. Plasmides pXL565 et pXL2781 contenant le locus cer Le fragment HpaII de 382 bp du plasmide ColE1 (P-L Biochemicals) a été
cloné au site AccI du plasmide M13 mp7 (Messing et coll. 1981 Nucleic Acids Res 9:309) pour former le plasmide pXL565. Le fragment BamHI de 382 bp du pXL565 a alors été cloné au site ~II du plasmide pSL301 (Invitrogen) pour créer le p~cmi-ie pXL2781.
1.6. Construction du plasmide pXL2784 CA 0224946~ 1998-09-16 Wo 97/35002 PCT/FRg7/00472 Le fragment BamHI-XhoI du pl~mi~le pXL2781 de 382 bp et cont~on~nt le locus cer est cloné aux sites BamHI et XhoI du pl~mi~le pXL2675 pour créer le pl~mide pXL2782.

Le fragment BglII-BamHI du pl~smi~le pMTL22-TH de 62 bp conle~-~nl Ia séquence (GAA)17 est cloné au site BamHI du pl~crnide pXL2782 pour former le pl~smi(~e pXL2783.

Enfin le fragment SalI-SpeI de 3,3 kb du plasmide pXL2622 et contPn~nt la c~.sette de la luciférase est cloné aux sites XhoI et NheI du pl~smi(le pXL2783 pour créer le pl~mide pXL2784. Il est bien entendu que toute autre c~ssette d'expression d'un gène peut être insérée à la place de la cassette luciferase La souche DH1 (Maniatis et al., 1989) contenant ce pl~smi~e est cultivée en fermenteur de 2, 7 et jusqu'à 800 litres. D'autres souches peuvent également êtres ~tli.sée,s.

2. Fermentation L'hôte contenant l'ADN plasmidique à cultiver peut être obtenu par des techniques classiques de fermentation (Jung et al. Ann. Inst. Pasteurl Micro~iol. 1988, 139, pl29-146; Bauer et al. Biotechnol. Bioeng. 1976, 18, p81-94) la technique du fed batch étant préférée. Après fermentation, les cellules sont récupérées, à l'échelle laboratoire, c'est à dire pour des volumes inférieurs à 51, par centrifugation çl~c~ ue (20 mn à 10000 rpm) ou par centrifugation en continu pour des volume plus importants (volumes industriels pouvant aller jusqu'a plusieurs c~.nt~in~s de litres). Les cellules ainsi récupérées peuvent être utilisées tout de suite ou congelées à - 80~C.

3. Lyse chimique (Iysat clair) Les cellules sont, le cas échéant, décongelées puis lysées. La lyse chimique se décompose en trois étapes. La première consiste à remettre en suspension les cellules dans un tampon Tris 25mM pH 6,8, glucose 50mM, ETDA 10mM ou équivalent. La lyse des cellules est alors effectuée dans un mélange contenant NaOH 0,2M et SDS

CA 0224946~ 1998-09-16 wo 97/3s002 PCT/FR97/00472 1G7O. Le pH de la solution est d'environ 12. Le choix d'un détergent ionique s'impose, en effet un détergent non ionique donne des rendements d'extraction 10 fois plusfaibles. La Iyse est suivie d'une pseudo-neutralisation du milieu en présence d'acétate de potassium (le pH final de la solution est compris entre 5.5 et 6). Cette ~ci~ifi~tic)n 5 du milieu conduit à l'apparition d'un précipité con~enanl les protéines, une partie de l'ADN chromosomique et de l'ARN. Cette précipitation est due à la réaction du sodium dodecyl sulfate (SDS) avec l'acétate de potassium qui forment un précipité
blanc de potassium dodecyl sulfate Le précipité doit être éliminé. Pour ce faire on procède par centrifugation en pots (15 min, 8000 rpm) si les volumes sont inférieurs à 5 litres ou par centrifugation en continu si les volumes sont plus élévés (> 5 litres). Une autre méthode pour ~limin~r le surnageant consiste à effectuer une filtration sur filtre en profondeur de porosité supérieure ou égale à 20 !lm (PALL, profile II utilisé selon les spécific~tions du fabricant).

4. Diafiltration Le surnageant récupéré après la Iyse chimique est soumis à une diafiltration afin de concentrer l'ADN pl~mi~1ique et d'~liminer les molécules de petites masse moléculaire, en particulier les sels qui sont présents à fortes concentrations. Cette diafiltration se fait sur membrane de point de coupure compris entre 50 et 300 kD
20 suivant la taille des pl~mide~ De préférence on utilise une membrane de point de coupure 100kD. La valeur de 100kD est une valeur nominale donnée pour des protéines qui sont des molécules globulaires. On considère que pour les molécules d'acides nucléiques,qui ont une structure spatiale différente, toutes les molécules ayant un poids moléculaire inférieur à 30kd sont éliminées. On mesure par HPLC la quantité
25 d'ADN présent dans la solution aprés diafiltration et la quantité présente dans le Iysat clair. Le rapport ainsi déterminé donne le rendement de cette étape qui est superieur ou égal à 80~G.

CA 0224946~ 1998-09-16 W O 97t35002 PCT/FR97/00472 Au cours de cette diafiltration, les sels sont elimin~s Ils sont remplacés par un tampon phosphate 10mM. Il est ainsi possible d'appliquer le produit directement sur une colonne de chromatographie, en particulier de Ceramic HydroxyapatiteTM

L'ADN pl~mi~iique issu de la chromatographie d'affinité triple hélice est de

5 nouveau diafiltré afin de concentrer l'éch~ntillon et d'éliminer les sels indésirables. Ceci permet d'équilibrer le produit dans le tampon de formulation approprié. Pour cela, une diafiltration sur membrane de point de coupure compris entre 10 et 50kD est effectué.
Le rendement est supérieur à 80%.

Le produit est ensuite filtré stérilement et soumis à analyses avant forrnulation.

5. Chromatographie sur colonne de Ceramic hydroxyapatiteTM

Le gel de Ceramic HydroxyapatiteTM est coulé dans une colonne de taille ap,ulop-iée suivant le volume de l'échantillon à purifier et selon la pureté de l'érh~ntillon de départ. Pour déterminer la taille de la colonne et le volume du gel on mesure par HPLC la quantité en mg/ml d'ADN présent dans la solution de départ. On 15 estime en effet que au moins 0.1mg d'ADN sont fixés par ml d'Hydroxy~palile cette valeur pouvant varier jusqu'a 1 mg voir plus en fonction de la quantité d'ARN présent dans la solution de départ. L'ARN se fixe sur le gel et plus la quantité d'ARN est importante moins l'ADN pourra se fixer. L'ARN est eliminé par élution différentielle.
La colonne est équilibrée en tampon phosphate de faible force ionique (10 mM).
20 L'é~h~ntillon est déposé sur le gel à un débit linéaire de 50 cm/h. Le gel est ensuite soumis à un lavage par un tampon phosphate de conductivité plus élévée (150 mM).La majeure partie de l'ARN contenu dans l'é~ ntillon est elimin~ à ce stade. L'ADN
pl~mi-lique est élué en augmentant à nouveau la conductivité du tampon phosphate(250mM). Les derniers contaminants sont élimines par application de NaOH 0.5N qui 25 est neutralisée par du tampon phosphate à forte molarité (500mM) avant réutili~ation éventuelle de la colonne. Dans le cas d'une production pharmaceutique, ce support a l'avantage de pouvoir subir une décont~min~tion chimique en place puisqu'il résiste à la soude 0.5M, agent de nettoyage classi~ue en chromatographie, mais aussi à des fortes concentrations d'éthanol.

CA 0224946~ 1998-09-16 wo 97t35002 PCT/F R97/00472 La résolution de l'hydroxyapatite céramique est excellente. Cette étape du procédé permet d'éliminer plus de 80% des ARN, 99.9% d'ADN chromosomique et de imin~l~r d'un facteur 1000 la teneur en endotoxines. De plus cette technologie évite l'emploi de toutes enzymes d'origine bovine ou autre (pas de Rnase, ni de protéinase 5 K), en outre sa rési~nce aux agents chimiques nous a permis de l'utiliser à ce jour plus de 40 fois sans problème de reproductibilite. Le rendement de chromatographie est supérieur ou égal à 80%.

6. Chromatographie d'affinité avec formation d'une triple hélice.
6.1. Préparation de la colonne 0 Matériel: La colonne utilisée est une colonne HiTrap activée au NHS (N-hydroxysuccinimide, Pharmacia) de 5 ml, connectée sur une pompe péristaltique (débit < lml/min). L'oligonucléotide spécifique utilisé possède un groupement NH2 en 5'.
Les tampons utilisés dans cet exemple sont les suivants:
- Tampon de couplage: NaHCO3 0,2 M, NaCI 0,5 M, pH 8,3.
- Tampon A: éthanolamine 0,5 M, NaCI 0,5 M, pH 8,3.
- Tampon B: acétate 0,1 M, NaCI 0,5 M, pH 4.

Méthode: La colonne est lavée par 30 ml de HCI 1 mM, puis l'oligonucléotide dilué dans le tampon de couplage (250 nmoles dans 5 ml) e,st appliqué sur la colonne 20 et laissé 30 minutes à température ambiante. La colonne est lavée 3 fois successives par 30 ml de tampon A puis 30 ml de tampon B. L'oligonucléotide est ainsi lié
covalemment à la colonne par une liaison CONH. La colonne est stockée à 4~C et peut être utilisée au moins quatre fois.

6.2. Purification de plasmide Matériel:

CA 0224946~ 1998-09-16 Wo 97/3s002 PCT/FRg7/00472 Le plasmide pXL2784 (décrit en 1) a été purifié sur la colonne HiTrap couplée à l'oligonucléotide décrite en 7.1. Les tampons utilisés lors de cette purification sont les suivants:

Tampon F: NaCl 2M, acétate 0,2 M, pH 4,5.

Tampon E :Tris 1 M, HCl pH 9, EDTA 0,5 mM.

Méthode:

La colonne est lavée avec du tampon F, puis la solution conten~nt le plasmide est appliqué sur la colonne et incubé a moins deux heures à température ambiante. La colonne est lavée avec du tampon F puis l'élution se fait par du tampon E.

7. Chromatographie échangeuse d'ions.

L'échantillon pré-purifié est ensuite soumis à une chromatographie sur colonne échangeuse d'anions faibles. En effet les anions forts ont la propriété de fixer très fortement l'ADN, si fortement qu'il est très difficile de récupérer le produit (le rendement est alors inférieur à 60~o). C'est pourquoi la dern~n~Presse utilise des 15 échangeurs d'anions faibles qui ne retiennent pas l'ADN pl~midillue mais qui fixent les ARN résiduels. On utilisera donc de préférence un échangeur d'anions faibles de type DEAE Sepharose ou DEAE hyper D ou équivalents. Le gel est équilibré en tampon phosphate 10mM, l'échantillon provenant de l'étape de chromatographie sur Ceramic Hydroxyapatite est directement appliqués sur le gel. L'ARN fixé est ensuite éliminé en 20 appliquant une solution concentrée de NaCI. La décont~min~tion chimique peut être faite avec une solution de soude 0.5 M ce qui permet de travailler dans de bonnes conditions d'hygiene (élimin~tion des endotoxines et des risques de contamin~ionmicrobienne.)

8. Dosage de l'ADN plasmidique dans des échantillons complexes par CA 0224946~ 1998-09-16 Wo 97t35002 PCT/FRg7/00472 L'objectif de cette méthode est de pouvoir quantifier l'ADN pl~midi(lue au cours des différentes étapes de purification afin de déterminer des rendements. On peut ainsi juger quantitativement et qualitativement de l'efficacité des différentes opératiorls La technique utilisée est la suivante:

Le support chromatographique est un gel Poros R2 de chez Pe,sepLi-~e Biosystems. Il s'agit d'un support de polystyrènedivinylbenzène, la taille des particules est de 10 ,um. La taille des pores de perfusion est de 6000 à 8000 Angstroms, la taille des pores de diffusion étant de 500 à 1000. Le volume du gel est de 1,7ml.

Il s'agit d'une chromatographie paire d'ions. Le système de solvants est eau, triéthylamine acétate pH 7,1 / triéthylamine acétate acétonitrile 90~o.

Le débit est de 3 mVmin. Nous avons défini le gradient de façon à ~istin~u~r l'ADN plasmidique des ARN.

L'échantillon de référence est un ADN pl~mi~i~lue purifié sur Qiagen selon les instructions du fabricant. Sur un gel d'agarose, cet échantillon ne contient que de r ocDNA et du cccDNA. En HPLC, il ne donne qu'un seul pic. Sa concentration a été
déterminée en mesurant sa DO à 260 nm et en prenant pour base 1 unité DO = 50 ~g/ml d'ADN.

Nous avons donc injecté des quantités croi~ntes de ce produit afin d'effectuer une gamme d'étalonnage.

La surface des pics correspondant au temps de rétention de l'ADN de référence sont comparés à la gamme. Une quantification peut donc être effectuée.

9. Dosage de l'ADN chromosomique résiduel L' ADN génomique résiduel est quantifié par PCR en ~Jtili~nt des amorces dans le gène galK d'E. coli. La séquence des amorces du gène ~ d'E. coli est (Debouck et al., Nucleic Acids Res., 1985, L3, 1841-1853):

5'-CCG AAT TCT GGG GAC CAA AGC AGT TTC-3' (SEQ ID N~14) CA 0224946~ 1998-09-16 et 5'-CCA AGC l~C ACT Gl-r CAC GAC GGG TGT-3' (SEQ ID N~15).

Le milieu réactionnel comprend, dans du tampon PCR (Promega France, Charbonnières): 1,5 mM MgCl2; 0,2 mM dXTP (Pharmacia, Orsay); 0,5 ~M en arnorce; 20 U/ml Taq polymérase (Promega). La réaction est effectuée suivant la 5 séquence: - 5 min. à 95~C

- 30 cycles delO sec. à 95~C

30 sec. à 60~C

1 min. à 78~C

- 10 min. à 78~C.

Le fragment d'ADN amplifié, d'une longueur de 124 paires de bases, est séparé
par électrophorèse sur gel d'agarose à 3% en présence de SybrGreen I (Molecular Probes, Eugene, USA), puis quantifié par référence à une gamme d'ADN génomique Ultrapur d'E. coli, souche B (Sigma, réf. D4889).

10. Transfection in vitro de cellules de mammifères Cette méthode est employée pour doser l'activité biologique du pl~mi~le purifié par le procédé selon l'invention. Les cellules utilisées sont des NIH 3T3, en~emenl~ées la veille de l'expérience dans des plaques de culture à 24 puits, à raison de 50.000 cellules/puits. Le plasmide est dilué dans du NaCl 150 mM et mélangé avec un lipofectant. On utilise un rapport charges positives du lipofectant/charges négatives 20 de l'ADN égal à 3. Le mélange est vortexé, laissé 10 min~tes à température ambiante, dilué dans du milieu de culture dépourvu de sérum de veau foetal, puis ajouté aux cellules, à raison de 1 llg d'ADN par puits de culture. Après deux heures à 37~C, on ajoute 10% v/v de sérum de veau foetal et les cellules sont incubées 48 heures à 37~C
en présence de 5~o de C02. Les cellules sont lavées deux fois au PBS et l'activité
25 luciférase est mesurée selon le protocole décrit (kit Promega, Promega Corp.
Madison, WI), sur un luminomètre Lumat LB9501 (EG et G Berthold, Evry). Les protéines som dosées avec la technique BCA (Pierce, Interchim, Asnières).

CA 0224946~ 1998-09-16 Wo 97/35002 PCT/FRg7/00472

11. Techniques diverses:

Le plasmide obtenu, analysé par électrophorèse sur gel d'agarose et coloration au bromure d'éthidium, se présente sous la forme d'une seule bande d'ADN circulaire "super enroulé". Aucune trace d'ADN de haut poids moléculaire (chromosomique), ni 5 d'ARN n'est détectable dans le pl~smi~e purifié.

La concentration en protéines dans les éch~ntillons est mesuré par Micro-BCA
(Pierce) selon les instructions du fabricant.

La concentration en endotoxines est estimée par le dosage LAL (Biosepra) selon les instructions du fabricant.

Les méthodes classiques de biologie moléculaire telles que les digestions par des enzymes de restriction, l'électrophorèse sur gel, la transformation dans E. coli, la précipitation des acides nucléiques etc, sont décrites dans la littérature (Maniatis et al., T., E. F. Fritsch, and J. Sambrook. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual, second edition. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Labo,aloJy 15 Press, New York; Ausubel F. M., R. Brent, R. E. Kinston, D. D. Moore, J. A. Smith, J. G. Seidman and K. Struhl. 1987. Current protocols in molecular biology 1987-1988. John Willey and Sons, New York. ). Les séquences nucléotidiques ont hé
déterminées par la méthode de terminaison de chaînes en suivant le protocole déjà
présenté (Ausubel et al., 1987).

Les enzymes de restriction ont été fournies par New-F.ngl~n~l Biolabs, Beverly, MA (Biolabs).

Pour les ligatures, les fragments d'ADN sont incubés dans un tampon Tris-HCl pH 7.4 50 mM, MgCl2 10 mM, DTT 10 mM, ATP 2 mM, en présence d'ADN ligase du phage T4 (Biolabs, ).

Les oligonucléotides sont synthétisés en utili~nt la chimie des phos~hl~ramidites protégés en ~ par un g-ol-pe-~lent cyanoéthyl (Sinha, N. D., J.
Biemat, J. McManus and H. Koster. 1984. Polymer support oli~n1lcleotide synthesis, W O 97/35002 PCTfFR97/00472 XVIII: Use of ~-cyanoethyl-N,N-dialkylamino-/N-morpholino phosphoramidite of deoxynucleosides for the synthesis of DNA fragmentc simplifying deprotection andisolation of the final product. Nucl. Acids Res., 12, 4539-4557; Giles, J. W. 1985.
Advances in automated DNA synthesis. Am. Biotechnol., Nov./~ec.) avec le syrth~ti~eur automatique d'ADN Biosearch 8600 en utili.c~nt les recl-mm~nrl~tions du fabricant.

Les ADN ligaturés ou à tester pour leur efficacité de L~ansîol"~ation sont utilisés pour transformer la souche rendue compétente: E. coli DH5a [F / endA1, hsdR17. supE44. thi-1, recA1, gyrA96, relA1, D(lacZYA-3~F)U169, deoR, F80dlac(~DM15)]

Les miNp,epaldlions d'ADN plasmidique sont faites suivant le protocole de Klein et ah, 1980.

Le milieu de culture LB est utilisé pour la croissance des souches d'E. ÇQli (Maniatis et ah, 1982). Les souches sont incubées à 37~C. Les bactéries sont étalées sur des boites de milieu LB supplémenté avec des antibiotiques app~op,iés.

EXEMPLES

Exemple 1. Purification d'un ADN plasmidique sur colonne hvdroxyapatite céramique 1.1. Préparation du lysat clair Matériel:
Les solutions ut~ ées dans cet exemple sont les suivantes:
Tris 25mM pH 6,8, glucose 50mM, ETDA 10mM: solution 1 NaOH 0,2M et SDS l~o: solution 2 Acétate de potassium 3M, pH 5: solution 3 Méthode:
20û g de cellules sont mises en suspension dans 2200 ml de solution 1. La solution 2 12200 ml également) est ensuite additionnée. Enfin, 1100 ml de solution 3 CA 0224946~ 1998-09-16 Wo 97/3s002 PCT/FRg7/00472 sont rajoutés. Le précipité alors formé est éliminé par centrifugation à 9000 rpm pendant 30 min. On obtient 5200 ml de surnageant.

1.2. Diafiltration Matériel:
Membrane Maximate (Filtron) de point de coupure 100 kD de surface 1860 cm2 Tampon: Pho~sph~te de sodium 100 mM pH 6,8 Méthode:

Avant tltilication, la membrane subit une décontamination chimique à la soude 0,5M pendant lH. La soude est ensuite éliminée par de l'eau ppi.
Le surnageant obtenu lors de l'étape 1.1 est concentré environ 10 fois puis diafiltré contre 4 volumes d'eau puis contre 4 volumes de tampon phosphate 100mMet pH 6,8. Le volume final est de 810 ml. L'éch~ntillon contient alors 224 mg d'ADN
pl~midique déterminé par HPLC.

1.3. Purification sur Ceramic HydroxyapatiteTM

Matériel:
Les tampons utilisés lors de cette purification sont les suivants:
Tampon A = tampon 10 mM phosphate pH 6.8 Tampon B = tampon 150 mM phosphate pH 6.8, Tampon C = tampon 250 mM phosphate pH 6;8 Tampon D = tampon 500 mM phosphate pH 6,8 NaOH 0,5M

Méthode:

La colonne (de diamètre 113 mm et de hauteur 17 cm) contient 1700 ml de gel.
Avant utilisation, le gel subit une décontamination chimique par de la soude 0,5M pendant 1 heure. La soude est ensuite éliminée par application de tampon D.Puis, la colonne est équilibrée en tampon A.

CA 0224946~ 1998-09-16 wo 97/35002 PCT/FR97/00472 On applique sur le gel 610 ml provenant des 810 ml (soit 171 mg) obtenus précédemment. Le débit est de 60 ml/min. Le gel est ensuite lavé par 6 L de tampon B.
Le produit est ensuite élué en appliquant du tampon C. Le volume d'éluat est de 1520 ml et contient 147 mg d'ADN plasmidique (déterminé par HPLC).

Le gel est ensuite régénéré par lavage avec de la soude (NaOH 0,5M) suivi par du tampon D. Le gel est alors prêt pour un nouveau cycle.

L'ensemble des opérations est suivi par spectrométrie UV à 254 nm.

1.4. Purification sur DEAE Sepharose Matériel:
Les tampons utilisés lors de cette purification sont les suivants:
Tampon A, NaCI lM et NaOH 0,5M.

Méthode:

La colonne (de diamètre 50 mm et de hauteur 6 cm) contient 110 ml de gel.
Avant ~ ation, le gel subit une décont~min~tion chimique par de la soude 0,5M pendant 1 heure. La soude est ensuite é1imin~e par une solution de NaCI lM .
Puis, la colonne est équilibrée en tampon A.

1130 ml issues des 1520 ml (soit 110 mg) obtenus précédemment sont appliqués sur le gel à un débit de 50 mVmin. L'ADN n'étant pas retenu, I'efl~uent est recueilli (1036 ml) et contient 104 mg d'ADN. Les produits retenus sur le gel sont ensuite elimine~ par une solution de NaCl lM. Le gel est alors lavé par de la soude 0,5M suivi de NaCI lM. Le gel est alors prêt pour une nouvelle opération.

L'ensemble des opérations est suivi spectrométrie UV à 254 nm.

1-5 Diafiltration Matériel:
Membrane Ultrasette (Filtron) de point de coupure 30 kD de surface 860 cm2 Tampon: eau ppi W O 97/35002 PCT~FR97/00472 Méthode:

Avant utilisation, la membrane subit une déco~ ,;n~tion chimique à la soude 0,5M pendant lH. La soude est ensuite éliminée par de l'eau ppi. 720 ml du produit obtenu lors de l'étape précédente sont concentrés environ 3 fois puis diafiltrer deux 5 fois contre 4 volumes d'eau ppi. Le volume final est de 210 ml. L'é~h~ntillon contient alors 62 mg d'ADN pl~cmi-lique déterminé par HPLC.

1.6 Caractéristiques de l'ADN .

Le procédé décrit ci-dessus permet d'obtenir le plasmide quasiment pur. Les différentes composants de l'échantillon final ont été déterminés et sont récapitulés 10 ci-après.

- ARN: non détect~hle en gel d'agarose ou en HPLC

- ADN chromosomique déterminé par PCR: <0.5 %

- ADN super-enroulé déterminé par HPLC >80 %

- endotoxines (LAL) < 50 EU/mg - protéines (microBCA) < l!lg/ml - activité biologique in vitro:

pXL2784 lot 42DNA95: 20*10 RLU/ ~g proteines (à col,lpa,~r avec le même plasmide purifié sur gradient de Chlorure de Cesium = 13*106 RLU/ llg protéines).

1.7 Variante.

Le procédé décrit ci-dessus a été reproduit en effectuant dans l'étape 1.1, une filtration sur membrane de profondeur à la place de la centrif1le~tion. Cette variante du procédé permet d'obtenir un plasmide de pureté pharmaceutique, dont les caractéristiques sont récapitulés ci-après.

CA 0224946~ 1998-09-16 - ARN: non détectable en gel d'agarose ou par HPLC

- ADN chromosomique déterminé par PCR: < 0.5 ~o - ADN superenroulé déterminé par HPLC >70 ~o - endotoxines (LAL) < 50 EU/mg - protéines (micro BCA) < 1 ~g/ml Exemple 2 Purification de l'éluat d'hvdroxyapatite par chromato~raphie d'afflnité triple hélice 2.1. Préparation de la colonne d'affinité

La colonne utilisée est une colonne HiTrap activée au NHS (N-10 hydroxysuccinimide, Pharmacia) de 5 ml, connectée sur une pompe péristaltique.
L'oligonucléotide spécifique utilisé possède un groupement NH2 en 5'. Sa séquence est la suivante:

5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (SEQ ID N~l).

Les tampons utilisés dans cet exemple sont les suivants:

Tampon de couplage: NaHC03 0,2 M, NaCl 0,5 M, pH 8,3.

Tampon A: éthanolamine 0,5 M, NaCl 0,5 M, pH 8,3.

Tampon B: acétate 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH 4.

La colonne est lavée par 30 ml de HCI 1 mM, puis l'oligonucléotide dilué dans le tampon de couplage (250 nmoles dans 5 ml) est appliqué sur la colonne et laissé 30 20 minutes à température arnbiante. La colonne est lavée 3 fois successives par 30 ml de tampon A puis 30 ml de tampon B. L'oligonucléotide est ainsi lié covalemment à la colonne par une liaison CONH. La colonne est stockée à 4~C.

2.2. Purification du plasmide WO 97/35002 PCT~R97/00472 Les tampons utilisés sont les suivants:

Tampon F: NaCl 2M, acétate 0,2 M, pH 4,5.

Tampon E :Tris 1 M, HCl pH 9, EDTA 0,5 mM.

La colonne est équilibrée dans le tampon F, puis 9ml d'éluat d'hydro~yapaLile 5 obtenu dans les conditions décrites dans l'exemple 1.3., préalablement ajustés à 2M
NaCl et pH 4,5, sont appliqués en boucle sur la colonne pendant une nuit à
température ambiante (débit 0,5 ml/min). La colonne est lavée avec du tampon F puis l'élution se fait par du tampon E. L'ADN est détecté par spectrométrie U.V. à 254 nm.

2.3. Caractéristiques de l'ADN purifié

L'ADN purifié analysé par HPLC (méthode décrite ci-dessus) se présente sous forme d'un seul pic à un temps de rétention de 24,8 min. Aucune trace d'ARN n'est etect~hle. De même, après électrophorèse sur gel d'agarose 1~o et coloration au bromure d'éthidium, l'ADN purifié ne présente aucune trace détectable d'ARN.

L'ADN a également été analysé par chromatographie échangeuse d'anions sur 15 colonne Gen-Pak Fax Waters, qui sépare l'ADN relaché de l'ADN surenroulé.
L'érh~ntillon purifié contient 97~ d'ADN surenroulé contre 80% d'ADN surenroulé
dans l'échantillon déposé.

L'ADN génomique d'E. coli a été quantifié par PCR selon la technique décrite au paragraphe 3: l'ADN purifié sur colonne d'affinité contient environ 0,01% d'ADN
20 génomique.

Exemple n~3 3.1. Purification du plasmide.

On utilise une colonne d'affinité préparée comme décrit à l'exemple 2 avec l'oligonucléotide de séquence:

5'-Cl-r CTT Cl'r Cl~ crr C~ Cl~-3' (SEQ ID N~2).

Wo 97/3s002 PCT/FRg7/00472 Les tampons utilisés sont:

Tampon F: NaCl 2M, acétate de sodium 0,2 M, pH 4,5.

Tampon E :Tris 1 M, HCI pH 9, EDTA 0,5 mM.

La colonne est équilibrée dans le tampon F, puis on dépose 0.8mg de plasmide 5 purifié selon le protocole de l'exemple 1.7, dilué dans 10 ml de tampon F. L'érh~ntillon est recirculé en boucle sur la colonne pendant une nuit à température ~m~i~nte (débit 0,5 ml/min). La colonne est lavée avec du tampon F puis l'élution se fait par du tampon E. L'ADN est détecté par spectrométrie U.V. à 254 nm.

3.2. Caractéristiques de l'ADN purifié

L'ADN obtenu a été analysé par chromatographie échangeuse d'anions sur colonne Gen-Pak Fax Waters, qui sépare l'ADN relaché de l'ADN surenroulé.
L'érh~ntillon purifié contient 100% d'ADN surenroulé, contre 72~o dans l'érh~ntillon déposé sur la colonne d'affinité.

L'ADN génomique d'E. coli a été quantifié par PCR selon la technique décrite 15 plus haut: l'ADN purifié sur colonne d'affinité contient environ 0,01% d'ADN
génomique, contre environ 0.3~o dans l'échantillon déposé sur la colonne d'affinité.

Exemple 4: Chan~ement d'échelle de la chromato~raphie d'affinité triple hélice après purification de l'éluat d'hvdroxvapatite ~pXL 2784) 4.1. Préparation de la colonne d'affinité

La colonne utilisée est une colonne contenant du Sépharose 4 Fast Flow activé
au NHS (N-hydroxysuccinimide, Pharmacia) et couplé à un oligon~1cléotide de sequence:

5'-Cl~ CTT CTT Cl'r CTT Cl~ Cl~-3' [(Cl~)7: SEQ ID n~ 2]

selon la méthode décrite dans l'exemple 2.1.

CA 0224946~ 1998-09-16 La colonne (diamètre 26 mm, hauteur: 16cm ) contient 80 ml de gel et est connectée sur une pompe péristaltique.

4.2. Purification du plasmide Les tampons utilisés sont les suivants:

Tampon F: NaCI 2M, acétate de sodium 0,2 M, pH 4,5.
Tampon E :Tris 1 M, HCI pH 9, EDTA 0,5 mM.

La colonne est équilibrée dans le tampon F, puis 135 ml soit 8 mg d'éluat d'hydroxyapatite obtenu dans les conditions décrites dans l'exemple 1.3., préalablement ajustés à 2M NaCI et pH 4,5, sont appliqués sur la colonne (débit 1,25 mVmin) enrecirculant quatre fois. La colonne est lavée avec du tampon F puis l'élution se fait par du tampon E. L'ADN est détecté par spectrométrie U.V. à 254 nm: 2,2 mg sont récupérés.

4.3. Caractéristiques de l'ADN purifié

L'ADN purifié analysé par HPLC (méthode décrite ci-dessus) se présente sous forrne d'un seul pic à un temps de rétention de 24,4 min. Aucune trace d'ARN n'est détectable. De même, après électrophorèse sur gel d'agarose 1% et coloration au bromure d'éthidium, I'ADN purifié ne présente aucune trace détectable d'ARN.

L'ADN a également été analysé par chromatographie échangeuse d'anions sur colonne Gen-Pak Fax Waters, qui sépare l'ADN relaché de l'ADN surenroulé.
L'é-~h~ntillon purifié contient 100% d'ADN surenroulé contre 94% d'ADN surenroulé
dans l'échantillon déposé.

L'ADN génomique d'E. coli a été quantifié par PCR selon la technique décrite au paragraphe 3: I'ADN purifié sur colonne d'affinité contient environ 0,02% d'ADN
génomique contre 2% dans l'échantillon déposé.

Exemple 5: Purification à ~rande echelle d'un ADN plasmidique sur colonne hvdroxyapatite céramique CA 0224946~ 1998-09-16 wo 97/35002 PCT/FR97/00472 5.1. Préparation du Iysat clair Le lysat clair est préparé comme décrit dans l'exemple 1.1 à partir d'une culture de bactéries E.coli transforrnées par le plasmide pXL2774. Le plasmide pXL2774 aune taille réduite (environ 4,5 kb) et comprend not~mm-?nt:
- une cassette d'expression du gène Luc (promoteur CMV-luc-poly(A)+) - le marqueur de sélection sup Phe - l'origine de réplication ori ~ de R6K
- le fragment cer de ColE1 0 Méthode:
456 g de cellules sont mises en suspension dans 5000 ml de solution 1. La solution 2 (5500 ml) est ensuite additionnée. Enfin, 2500 ml de solution 3 sont rajoutés. Le précipité alors forrné est éliminé par centrifugation à 9000 rpm pendant 30 min ou par filtration. On obtient 12,3 L de surnageant.

5.2. Diafiltration Matériel:
Membrane Maximate (Filtron) de point de coupure 100 kD de surface 1860 cm2 Tampon: Phosphate de sodium 100 mM pH 6,8 Méthode:

L'échantillon est diafiltré selon la méthode décrite dans l'exemple 1.2 Le volume final est de 945 ml. L'érh~ntillon contient alors 253 mg d'ADN
plasmidique déterminé par HPLC.

5.3. Purification sur Ceramic HydroxyapatiteTM

Matériel:
Les tampons utilisés lors de cette purification sont les suivants:
Tampon A = tampon 100 mM phosphate pH 6.8 CA 0224946~ 1998-09-16 wo 97/35002 PcT/FRs7/00472 Tampon B = tampon 150 mM phosphate pH 6.8, Tampon C = tampon 250 mM phosphate pH 6;8 Tampon D = tampon 500 mM phosphate pH 6,8 NaOH 0,5M

Méthode:

La colonne (de diamètre 100 mm et de hauteur 23 cm) contient 1700 ml de gel.
Avant utilisation, le gel subit une déco"l~-";~l~tion chimique par de la soude 0,5M pendant 1 heure. La soude est ensuite élirninée par application de tampon D.
Puis, la colonne est équilibrée en tampon A.

On applique sur le gel 475 ml provenant des 945 ml (soit 128 mg) obtenus précédemrnent. Le débit est de 65 ml/min. Le gel est ensuite lavé par 6 L de tampon B.
Le produit est ensuite élué en appliquant du tampon C. Le volume d'éluat est de 1760 ml et contient 100 mg d'ADN plasmidique (déterminé par HPLC).

Le gel est ensuite régénéré par lavage avec de la soude (NaOH 0,5M) suivi par 15 du tampon D. Le gel est alors prêt pour un nouveau cycle.

L'ensemble des opérations est suivi par spectrométrie UV à 254 nm..

5.4 Diafiltration La diafiltration a été réalisée selon le protocole décrit dans l'exemple 1.5.

5.5 Caractéristiques de l'ADN .

Le procédé décrit ci-dessus permet d'obtenir le pl~cmid~ q ~ m~nt pur. Les di~ér~llles composants de l'échantillon final ont été delelminés et sont récapitulés ci-après.

- ARN: non détectable en gel d'agarose - ADN chromosomique déterminé par PCR: 0.6 %
- ADN super-enroulé déterminé par HPLC: 87 %
- endotoxines (LAL) < 50 EU/mg - protéines (microBCA) < 1~g/ml CA 0224946~ l998-09-l6 LISTE DE SEQUENCES

(1) INFORMATIONS GENERALES:

(i) DEPOSANT:
(A) NOM: RHONE POULENC RORER S.A.
(B) RUE: 20, AVENUE RAYMOND ARON
(C) VILLE: ANTONY
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92165 (G) TELEPHONE: (1) 40.91.70.36 (H) TELECOPIE: (1) 40.91.72.91 (ii) TITRE DE L' INVENTION: PURIFICATION D'ADN PLASMIDIQUE DE
QUALITE PHARMACEUTIQUE
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 15 (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape (B) ORDINATEUR: IBM PC co~patible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéalre ( i i ) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:

45 ( 2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 palres de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: si~ple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:

CA 0224946~ l998-09-l6 W O 97l35002 PCT~R97/00472 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
AAGGGAGGGA GGAGAGGAA

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: slmple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc ~xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire ( i i ) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:

CA 0224946~ l998-09-l6 W O 97/35002 PCT~R97/00472 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
( i ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 13 paires de bases (B) TYPE: nucléotlde (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8 35 ( 2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 17 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIOUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 56 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc , .

CA 0224946~ l998-09-l6 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10 s (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
~A) LONGUEUR: 56 paires de bases (B) TYPE: nucléotide ~C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire ( ii ) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12:
( i ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 58 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: llnéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 58 palres de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple ( D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13 55 ( 2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 14:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 27 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: slmple CA 0224946~ 1998-09-16 W O 97/35002 PCT~R97/00472 (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 15:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 27 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15

Claims (13)

REVENDICATIONS

1. Procédé de purification d'ADN double brin de pureté pharmaceutique caractérisé en ce qu'il comprend au moins une étape de chromatographie sur colonne d'hydroxyapatite céramique.

2. Procédé de purification d'ADN double brin caractérisé en ce qu'il comprend deux étapes de chromatographie dont une sur colonne d'hydroxyapatite.

3. Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce qu'il comprend une étape de chromatographie sur colonne d'hydroxyapatite et une étape de chromatographie d'affinité ou d'echange d'ions.

4. Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce qu'il comprend une étape de chromatographie sur colonne d'hydroxyapatite et une étape de chromatographie d'affinité par hybridation spécifique entre une séquence de l'ADN et un oligonucléotide immobilise, avec formation d'une triple hélice.

5. Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce qu'il comprend une étape de chromatographie sur colonne d'hydroxyapatite et une étape de chromatographie d'echange d'anions.

6. Procédé selon l'une des revendications 1 a 5 caractérisé en ce qu'il comprenden outre une étape de diafiltration.

7. Procédé de purification d'ADN double brin caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
- lyse chimique des cellules, - diafiltration, - chromatographie sur colonne d'hydroxyapatite céramique, - chromatographie d'affinité par hybridation spécifique entre une séquence de l'ADN et un oligonucléotide immobilise, avec formation d'une triple hélice.

8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que l'ADN double brin comprend en outre une ou plusieurs séquences d'intéret.

9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 caractérisé en ce que l'ADN double brin est un ADN plasmidique.

10. Préparation d'ADN plasmidique. recombinant caractérisée par une teneur en ADN chromosomique inférieure ou égale à 0,01 %.

11. Préparation d'ADN plasmidique recombinant purifié selon la revendication 10 caractérisée par une teneur en endotoxine inférieure ou égale à 50 EU/ mg.

12. Préparation d'ADN plasmidique recombinant purifié selon la revendication 11 caractérisée par une teneur en endotoxine inférieure ou égale a 10 EU/ mg;

13. Composition pharmaceutique comprenant un ADN obtenu par le procédé
selon l'une des revendications 1 à 9.