EA009447B1 - Способ получения плазмидной днк фармацевтического качества - Google Patents

Abstract

Согласно данному изобретению предложен способ непрерывного щелочного лизиса бактериальной суспензии для получения пДНК. Согласно ему дополнительно предложены возможные дополнительные стадии, включающие фильтрацию лизата, анионообменную хроматографию, аффинную хроматографию с образованием тройной спирали и гидрофобную хроматографию. Эти возможные стадии очистки можно комбинировать с непрерывным лизисом для того, чтобы получить продукт высокоочищенной плазмидной пДНК, по существу, лишенной гДНК, РНК, белка, эндотоксина и других примесей.

Description

Область изобретения

Данное изобретение относится к получению высокоочищенной плазмидной ДНК и, в частности, к получению и выделению плазмидной ДНК фармацевтического качества для применения в плазмидной терапии.

Предшествующий уровень техники

Разработки в молекулярной биологии ясно свидетельствуют о том, что плазмидная терапия, особенно в области вакцин и генной терапии человека, может быть эффективным способом лечения заболеваний. Однако значительным препятствием для этой технологии является нахождение эффективных способов доставки интересующего гена в клетку. Одним из многообещающих способов безопасной и эффективной доставки нормального гена в человеческие клетки является доставка с помощью плазмидной ДНК. Плазмидная ДНК представляет собой замкнутую, кольцевую форму бактериальной ДНК, в которую можно вставлять интересующую последовательность ДНК. Сразу после доставки в человеческую клетку, пДНК начинает реплицироваться и производить копии встроенной последовательности ДНК. Таким образом, исследователи рассматривают плазмидную ДНК в качестве многообещающего носителя для доставки нормальных генов в человеческие клетки с целью лечения целого ряда болезненных состояний.

Огромные количества плазмидной ДНК необходимы для развития исследований с целью осуществления этой новой технологии и терапии человека. Так как плазмидная ДНК, используемая в генной терапии и других клинических применениях, обычно продуцируется бактериями, такими как ЕксйейсЫа сой (Е. сой), нужны способы эффективного отделения плазмидной ДНК от геномной ДНК (гДНК) бактериальной клетки, а также от эндотоксина и белков в бактериальной клетке. Таким образом, существует растущая потребность в простых, надежных и масштабных способах очистки, которые можно использовать для выделения больших количеств плазмидной ДНК из бактериальных клеток.

Важной стадией в любом способе очистки плазмид является лизис бактериальных клеток с целью высвобождения клеточного содержимого, из которого затем можно выделить пДНК. На самом деле, сначала необходимо выполнить три стадии ресуспендирования клеток, лизис клеток и нейтрализацию, а также осаждение примесей из хозяина. При ресуспендировании клеток обычно применяют перемешивание вручную или магнитную мешалку, и гомогенизатор или лопастную мешалку для ресуспендирования клеток в буфере для ресуспендирования. Лизис клеток можно осуществлять путем перемешивания вручную или перемешивания с помощью магнитной мешалки для того, чтобы смешать ресуспендированные клетки с лизирующим раствором (состоящим из разбавленной щелочи (основания) и детергентов); затем выдерживания смеси при комнатной температуре (20-25°С) или на льду в течение периода времени, например 5 мин, до полного лизиса. Как указано выше, перемешивание вручную и перемешивание с помощью магнитной мешалки не являются масштабируемыми. Третьей стадией является нейтрализация и осаждение примесей из хозяина. Лизат, полученный на второй стадии, обычно смешивают с холодным нейтрализующим раствором путем мягкого перемешивания или перемешивания с помощью магнитной мешалки для подкисления лизата перед помещением на лед на 10-30 мин с целью облегчения денатурации и осаждения высокомолекулярной хромосомной ДНК, белков хозяина и других молекул хозяина. И перемешивание вручную, и перемешивание с помощью магнитной мешалки не являются масштабируемыми.

Обычно клеточную стенку переваривают путем обработки лизоцимом в течение короткого периода времени или путем обработки щелочью или ацетатом калия (КОАс). Обычно также добавляют РНКазу для деградации РНК бактериальной суспензии. Эти химические стадии могут быть эффективными при лизисе клеток в малом масштабе. Однако увеличение вязкости делает очень сложной обработку в большом масштабе. Альтернативный простой и быстрый способ получения плазмид включает обработку бактерий лизоцимом, затем кипячение при примерно 100°С в подходящем буфере в течение 20-40 с с образованием нерастворимого сгустка геномной ДНК, белка и дебриса, оставляя плазмиду в растворе с РНК в качестве основной примеси. Далее добавляют смешанный раствор ΝαΟΗ и додецилсульфата натрия (ДСН) с целью растворения цитоплазматической мембраны. ΝαΟΗ частично денатурирует ДНК и частично деградирует РНК, а ДСН действует, растворяя мембрану и денатурируя белки. Комплекс ДСНбелок и клеточный дебрис осаждают путем добавления 5 н. ацетата калия (рН 4,8). В это время рН важен как для нейтрализации ΝαΟΗ, используемого в указанной процедуре, так и для ренатурации плазмиды. Однако эта методика не подходит для осуществления бактериальных ферментации в большом объеме и предназначена для ферментации с объемом менее пяти литров. Затем применяют центрифугирование для удаления осадков, получая, таким образом, целевые плазмиды в супернатанте. Эти серии манипуляций также требуют медленного и тщательного перемешивания во избежание разрезания бактериальной хромосомной ДНК на маленькие фрагменты и агрегаты, приводящие к загрязнению плазмиды, и затрудняют осуществление крупномасштабной обработки.

Один из обычных альтернативных способов лизиса клеток, известный как щелочной лизис, заключается в смешивании суспензии бактериальных клеток (раствор 1) с щелочным лизирующим раствором (раствор 2). Раствор 2 состоит из детергента, например, додецилсульфата натрия (ДСН), для лизиса бак

- 1 009447 термальных клеток и высвобождения внутриклеточного материала, и щелочи, например гидроксида натрия, для денатурации белков и нуклеиновых кислот клеток (особенно гДНК и РНК). По мере того как клетки лизируются и ДНК денатурирует, вязкость раствора резко увеличивается. После денатурации добавляют кислотный раствор, например ацетат калия (раствор 3), для нейтрализации гидроксида натрия, индуцируя ренатурацию нуклеиновых кислот. Длинные фрагменты гДНК вновь ассоциируют случайным образом и образуют сети, которые осаждаются в виде хлопьев, захватывающих белки, липиды и другие нуклеиновые кислоты. Калиевая соль додецилсульфата также осаждается, унося белки, с которыми она ассоциирована. Две цепи пДНК (плазмидной ДНК), переплетенные друг с другом, обычно снова ассоциируют с образованием исходной плазмиды, которая остается в растворе.

В предшествующем уровне техники этот способ лизиса обычно описывают как периодический, т.е. когда различные растворы смешивают путем последовательного добавления растворов в сосуды или емкости. Так как щелочной лизат представляет собой вязко-эластичную жидкость, которой очень трудно манипулировать, то одна из трудностей при осуществлени этого способа возникает во время смешивания различных растворов. Так как напряжение сдвига вызывает фрагментацию гДНК, которую затем чрезвычайно трудно отделить от пДНК, необходимы способы, позволяющие избежать приложения силы сдвига к жидкости. Кроме того, большие пДНК (т.е. более примерно 10 т.п.н.) также подвержены повреждению при сдвиге во время процесса смешивания. После того как раствор, содержащий клеточную суспензию, смешали с лизирующим раствором, вязко-эластичный щелочной лизат смешивают с нейтрализующим раствором. Этот способ смешивания снова является проблематичным из-за вязко-эластичных свойств раствора.

Кроме того, другой проблемой при масштабировании процесса периодического лизиса является эффективность перемешивания различных жидкостей при одновременной попытке ограничить силу сдвига, во избежание фрагментации гДНК. Как указано ранее, хроматографическое поведение фрагментированной геномной ДНК очень похоже на поведение пДНК в том, что фактически невозможно избавиться от нее стандартными методами очистки. Таким образом, некоторые ограничения применения периодического способа лизиса бактериальных клеток являются очевидными, такие как увеличение масштаба, плохое качество выделенной пДНК из-за загрязнения фрагментированной гДНК и относительно низкое количество полученной пДНК.

В качестве альтернативы периодическому способу были предложены также несколько способов непрерывного смешивания различных лизирующих растворов с применением ряда статических смесителей. Согласно этим способам, раствор клеточной суспензии и лизирующий раствор одновременно добавляют в статический смеситель. Раствор лизированных клеток, который выходит из первого статического смесителя, и осаждающий раствор затем одновременно добавляют во второй статический смеситель. Раствор, который выходит из этого второго смесителя, содержит осажденный лизат и плазмиды (XVО 97/23601). Другие непрерывные способы лизиса клеток включают применение проточного теплообменника, где суспендированные клетки нагревают до 70-100°С. После лизиса клеток в теплообменнике выходящий поток подвергают либо центрифугированию с непрерывным протоком, либо центрифугированию порциями, во время которых клеточный дебрис и геномная ДНК осаждаются, оставляя плазмидную ДНК в супернатанте.

Поэтому крупномасштабное выделение и очистка плазмидной ДНК из большого объема микробных ферментации требуют разработки улучшенного способа получения плазмид.

Несмотря на многочисленные способы, используемые в настоящее время для лизиса бактериальных клеток, ни один из них не решает проблем, вызванных вязко-эластичными свойствами жидкостей и напряжениями сдвига, имеющими место во время стадий перемешивания. Таким образом, настоящее изобретение относится к новому способу непрерывного щелочного лизиса суспензии бактериальных клеток в большом масштабе и дает главное преимущество в ограничении сил сдвига.

Другой важной стадией в получении плазмидной ДНК является выделение плазмид, или выделение и очистка. Классические методы выделения и очистки плазмидной ДНК из бактериальных ферментаций подходят для получения плазмид в небольшом или лабораторном масштабе. После разрушения бактериальных клеток-хозяев, содержащих плазмиду, с последующей нейтрализацией ацетатом, вызывающим осаждение геномной ДНК и белков клеток-хозяев, их обычно удаляют, например, центрифугированием. Жидкая фаза содержит плазмидую ДНК, которую осаждают спиртом и затем подвергают изопикническому центрифугированию с использованием СкС1 в присутствии бромистого этидия для выделения различных форм плазмидной ДНК, т.е. суперскрученной, кольца с однонитевыми разрывами и линеаризованной. Требуется дополнительная экстракция бутанолом для удаления остаточного бромистого этидия, затем осаждение ДНК с использованием спирта. Следуют дополнительные стадии очистки для удаления белков клеток-хозяев.

Эти современные способы выделения плазмидной ДНК имеют некоторые ограничения. Например, способы очистки, которые включают применение больших количеств горючих органических растворителей (например этанола и изопропанола) и токсичных химических веществ, например бромистого этидия, фенола и хлороформа, обычно являются нежелательными для крупномасштабного выделения и очистки плазмидной ДНК. Для очистки плазмидной ДНК можно использовать способы, альтернативные

- 2 009447 центрифугированию в хлориде цезия, такие как гель-фильтрация, хроматография на гидроксиапатите и различные хроматографические методы, основанные на обращенной фазе и обмене анионами. Эти альтернативные методы могут быть адекватными для получения небольших количеств исследовательского материала в лабораторном масштабе, но обычно не являются легко масштабируемыми и не позволяют получать большие количества плазмидной ДНК.

С помощью ряда манипуляций, описанных выше, можно получить плазмиду с относительно высокой чистотой (далее в данном описании указанный способ выделения и очистки нуклеиновых кислот упоминается как способ химического выделения). Однако при способе химического выделения процесс выделения и очистки является сложным и требует использования большого количества органического растворителя, следовательно, он поднимает многие проблемы переработки отработанных растворителей и другие проблемы.

Кроме способа химического выделения и очистки существует способ выделения плазмид с помощью электрофореза. Электрофоретический способ включает электрофорез на бумаге и гельэлектрофорез, и гель-электрофорез является обычным в настоящее время. Электрофоретический способ имеет преимущество, состоящее в получении плазмиды с высокой чистотой, однако, он имеет много проблем, таких как длительное выделение, сложный сбор (образцов), малая загрузка образцов и т.д. Поэтому современная ситуация такова, что электрофоретическое разделение используют только тогда, когда чистоту плазмидной фракции, очищенной указанным способом химического разделения и очистки, желают дополнительно улучшить.

В имеющихся в настоящее время способах разделения двух форм плазмидной ДНК используют ионообменную хроматографию (Эиайс с1 а1., 1оигпа1 о£ Сйгоша!одгарйу А, 606 (1998), 31-45) или гельфильтрацию (Ргахсгс5. Ό.Μ., Вю1ес1шо1оду Тсе11пк|ис5 Уо1. 1, Ыо. 6, 1ипе 1997, р 417-420) в сочетании с применением добавок, таких как полиэтиленгликоль (ПЭГ), детергенты и другие компоненты, такие как гексамин кобальта, спермидин и поливинилпирролидон (ПВП). Однако известные в настоящее время способы не могут обеспечить эффективное и дешевое выделение суперскученной ДНК и ДНК с однонитевыми разрывами (или релаксированной). Кроме того, многие из известных способов страдают от недостатков использования ПЭГ или других добавок, которые могут быть нежелательными при производстве плазмидной ДНК, так как они требуют дополнительного отделения, способов контроля удаления и качества, которые могут быть сложными, требующими больше времени и более дорогими. В альтернативных разновидностях известных способов разделения суперскрученной и релаксированной форм плазмидной ДНК используют очень дорогие фирменные смолы, с которыми в процессе обработки также используют растворители, такие как ацетонитрил, этанол и другие компоненты, подобные триэтиламину и тетрабутиламмония фосфату. Дополнительные способы разделения суперскрученной и релаксированной ДНК основаны на гель-фильтрации, которая включает разделение двух форм плазмидной ДНК на основании небольшого различия в размере. Эти колонки имеют тенденцию быть относительно длинными, что затрудняет масштабирование, делая невозможным осуществление крупномасштабного производства. Кроме того, для способов гель-фильтрации нужны концентрированные растворы образцов, которые невозможно получить из растворов плазмидной ДНК из-за высоковязкой природы ДНК. Препараты плазмидной ДНК, которые получают из бактериальных препаратов и которые часто содержат смесь релаксированной и суперскученной плазмидной ДНК, часто требуют удаления эндотоксина, как того требует ΕΌΑ (Еооб апб Эгид Абш1ш81га1юп, Департамент по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств), так как известно, что эндотоксины, продуцируемые многими бактериями-хозяевами, вызывают у хозяина, получающего плазмидную ДНК, воспалительные реакции, такие как лихорадка или сепсис. Эти эндотоксины обычно представляют собой липополисахариды или их фрагменты, которые являются компонентами наружной мембраны грамотрицательных бактерий и которые присутствуют в препарате ДНК клеток-хозяев и в мембранах или макромолекулах клетокхозяев. Поэтому удаление эндотоксинов является ключевой и необходимой стадией при очистке плазмидной ДНК для терапевтического или профилактического применения. При удалении эндотоксина из растворов плазмидной ДНК сначала использовали отрицательно заряженную структуру эндотоксинов. Однако плазмидная ДНК также является отрицательно заряженной, и поэтому разделение обычно осуществляют на анионообменных смолах, которые связывают обе эти молекулы и в определенных условиях предпочтительно обеспечивают элюцию плазмидной ДНК с одновременным связыванием эндотоксинов. Такое разделение приводит только к частичному удалению, так как значительные количества эндотоксинов элюируются с плазмидной ДНК и/или достигается очень низкий выход плазмидной ДНК.

Таким образом, крупномасштабное выделение и очистка плазмидной ДНК из больших объемов микробных ферментаций требует разработки улучшенного способа получения плазмид. Также требуется более простой и быстрый способ разделения и очистки большого количества плазмидной ДНК. Для исследования и плазмидной терапии также желательно, чтобы нуклеиновые кислоты можно было разделить и очистить, сохраняя ту же самую структуру, воспроизводимым способом, и для того, чтобы избежать вредного влияния примесей на человеческий организм, требуется, чтобы нуклеиновые кислоты были разделены и очищены с высокой степенью чистоты.

Однако с указанным традиционным способом существует проблема в том, что нуклеиновые кисло

- 3 009447 ты достаточно высокой чистоты, в особенности, плазмидные ДНК, не могут быть получены в большом количестве. Поэтому настоящее изобретение направлено на обеспечение способа разделения, в котором используют по меньшей мере две хроматографические стадии, которые делают возможным разделение больших количеств плазмидных ДНК за короткое время и с наиболее высокой степенью чистоты.

Краткое описание сущности изобретения

Изобретение основано на открытии способа получения и выделения высокоочищенной плазмидной ДНК. Плазмидная ДНК, полученная и выделенная способом по изобретению, содержит очень низкие уровни загрязняющих хромосомных ДНК, РНК, белка и эндотоксинов. Плазмидная ДНК, полученная согласно изобретению, имеет достаточную чистоту для плазмидной терапии.

Таким образом, изобретение охватывает способ получения и выделения высокоочищенной плазмидной ДНК, который включает стадию лизиса клеток, на которой имеется (а) средство для создания турбулентного потока с целью быстрого смешивания клеточной суспензии с раствором, который лизирует клетки; и (б) средство для создания ламинарного потока с целью обеспечения инкубации смеси, образованной в (а), без существенного встряхивания, где смесь, образовавшаяся в (а), течет из средства для создания турбулентного потока в средство для создания ламинарного потока.

В дополнительном воплощении изобретения данное устройство может дополнительно включать средство для добавления второго раствора, который нейтрализует лизирующий раствор, где смесь, инкубируемая в (б), течет из средства для создания ламинарного потока в средство для добавления второго раствора.

В еще одном воплощении может быть использовано устройство для выделения плазмидной ДНК из клеток в способе, включающем: (а) смешивание клеток с щелочным лизирующим раствором в средстве для создания турбулентного потока и (б) нейтрализацию щелочного лизирующего раствора путем добавления кислотного раствора.

Изобретение дополнительно охватывает способ получения и выделения высокоочищенной плазмидной ДНК, которая по существу не содержит примеси и, таким образом, представляет собой ДНК фармацевтического качества.

Другая цель настоящего изобретения относится к способу разделения и очистки нуклеиновых кислот и плазмидной ДНК. Более подробно, она относится к способу разделения нуклеиновых кислот и плазмидной ДНК фармацевтического качества, которая является полезной для исследования и плазмидной терапии. Препарат плазмидной ДНК, выделенный согласно способам по изобретению, может быть подвергнут стадиям очистки, которые включают по меньшей мере хроматографию с образованием тройной спирали и дополнительно могут включать анионообменную хроматографию и гидрофобную хроматографию.

Таким образом, эти способы включают стадию непрерывного щелочного лизиса, раскрытую в данном описании, в сочетании с последующей анионообменной хроматографией и хроматографией с образованием тройной спирали, и дополнительно гидрофобной хроматографией.

Эти способы, таким образом, также включают стадию непрерывного щелочного лизиса, раскрытую в данном описании, в сочетании с последующими стадиями анионообменной хроматографии и хроматографии с образованием тройной спирали, и в сочетании с гидрофобной хроматографией. Фильтрация лизата или другое удаление хлопьевидного осадка может предшествовать первой хроматографической стадии.

Другая цель изобретения состоит в максимизации выхода плазмидной ДНК из комбинации клеткахозяин/плазмидная ДНК.

Другая цель изобретения состоит в получении препарата плазмидной ДНК, который, по существу, не содержит РНК бактериального хозяина.

Другая цель изобретения состоит в получении препарата плазмидной ДНК, который, по существу, не содержит белок бактериального хозяина.

Другая цель изобретения состоит в получении препарата плазмидной ДНК, который, по существу, не содержит хромосомную ДНК бактериального хозяина.

Другая цель изобретения состоит в получении препарата плазмидной ДНК, который, по существу, не содержит эндотоксины бактериального хозяина.

Другая цель изобретения состоит в том, чтобы предложить способ получения плазмидной ДНК фармацевтического качества с высокой степенью чистоты для применения в научном исследовании и плазмидной терапии, поддающийся масштабированию до крупномасштабного производства.

Изобретение, таким образом, охватывает плазмидную ДНК фармацевтического качества, которая, по существу, не содержит примесей, высокоочищенную и интактную, и имеет преимущества над предшествующим уровнем техники, ДНК, которая включает векторную основу, терапевтический ген и связанные с ним регуляторные последовательности.

Настоящее изобретение также относится к жидкому препарату плазмидной ДНК, который является стабильным и не деградирует при комнатной температуре в течение длительного периода времени и, таким образом, является полезным для хранения плазмидной ДНК, которую используют в научном исследовании и связанной с ним терапии человека.

- 4 009447

Наконец, настоящее изобретение относится к устройству для непрерывного щелочного лизиса клеток, включающему первый смеситель или инжектор, способный впрыскивать щелочную жидкость в направлении, противоположном движению клеточной суспензии, первую трубку малого диаметра для того, чтобы создавать турбулентный поток в смеси, вторую трубку большого диаметра для того, чтобы создавать ламинарный поток в жидкости, второй смеситель или инжектор для впрыскивания нейтрализующего раствора на одном конце и сбора смеси на другом конце.

Дополнительные цели и преимущества изобретения будут изложены частично в описании, которое следует ниже, а частично будут очевидны из описания, или их можно узнать путем применения изобретения на практике. Цели и преимущества изобретения будут воплощены и достигнуты с помощью элементов и комбинаций, конкретно указанных в прилагаемой формуле изобретения.

Следует понимать, что как вышеизложенное общее описание, так и последующее подробное описание являются лишь примерными и поясняющими и не ограничивают заявленное изобретение.

Сопровождающие рисунки, которые включены в это описание и составляют его часть, иллюстрируют одно (несколько) воплощение (воплощений) изобретения и вместе с описанием служат для объяснения принципов изобретения.

Краткое описание графических материалов

На фиг. 1 представлена схема прибора, который можно использовать для непрерывного способа лизиса клеток по изобретению.

На фиг. 2 - схема смесителя М1 в приборе для непрерывного лизиса клеток.

На фиг. 3 представлена таблица сравнения выходов очистки в отношении гДНК, РНК, белков, эндотоксиновых примесей, с применением одной стадии анионообменной хроматографии (АЕС), или двухстадийного способа со стадией анионообменной хроматографии в сочетании с аффинной хроматографией с образованием тройной спирали (ТНАС), и трехстадийного способа, включающего стадию анионообменной хроматографии, стадию аффинной хроматографии с образованием тройной спирали в сочетании со стадией гидрофобной хроматографии (Н1С). НО означает не обнаружен: аналитические методы низкой чувствительности.

На фиг. 4 - таблица сравнения различных способов разделения и очистки плазмидной ДНК, таких как анионообменная хроматография (АЕС), НАС, гидроксиапатитная хроматография (НАС), гидрофобная хроматография (Н1С), обращенно-фазная хроматография (НРС), гель-фильтрация (8ЕС), аффинная хроматография с образованием тройной спирали (ТНАС) отдельно или в сочетании, и способ по настоящему изобретению. Результаты представлены здесь с точки зрения качества очищенной плазмидной ДНК. НО - не обнаружен (аналитические методы низкой чувствительности).

На фиг. 5А и 5Б представлены графики, показывающие скорости депуринизации и образования однонитевых разрывов (образование открытой кольцевой формы плазмиды) плазмидной ДНК, хранящейся при +25°С и +5°С в течение вплоть до 90 дней.

Определения

Кислотный означает относящийся к кислоте или содержащий кислоту; имеющий рН менее 7.

Щелочной означает относящийся к щелочи или основанию, или содержащий щелочь или основание; имеющий рН более 7.

Непрерывный означает не прерываемый, не имеющий перерывов.

Геномная ДНК означает ДНК, которая происходит из хромосомы или находится в хромосоме.

Ламинарный поток означает тип потока в токе воды раствора, в котором каждая частица движется в направлении, параллельном каждой частице.

Лизат означает материал, образующийся в процессе лизиса клеток. Термин лизис относится к действию разрушения клеточной стенки и/или клеточной мембраны клетки, которая находится в забуференном растворе (т.е. клеточная суспензия), посредством химической обработки с использованием раствора, содержащего лизирующий агент. Лизирующие агенты включают, например, щелочь, детергенты, органические растворители и ферменты. В предпочтительном воплощении клеточный лизис осуществляют для высвобождения интактных плазмид из клеток-хозяев.

Нейтрализует, чтобы сделать (раствор) нейтральным или чтобы вызвать нейтрализацию (кислоты или основания/щелочи). Под этим термином авторы подразумевают, что нечто, нейтрализующее раствор, доводит рН раствора до рН от 5 до 7, и предпочтительно приблизительно 7 или более, предпочтительно ближе к 7, чем ранее.

Ньютоновская жидкость представляет собой жидкость, в которой напряжение сдвига пропорционально градиенту скорости и перпендикулярно плоскости сдвига. Константа пропорциональности известна как вязкость. Примеры ньютоновских жидкостей включают жидкости и газы.

Неньютоновская жидкость представляет собой жидкость, в которой напряжение сдвига не пропорционально исключительно градиенту скорости и перпендикулярно плоскости сдвига. Неньютоновские жидкости могут не иметь точно определенной вязкости. Неньютоновские жидкости включают пластичные твердые вещества, жидкости, подчиняющиеся экспоненциальному закону, вязко-эластичные жидкости (имеющие как вязкие, так и эластичные свойства) и жидкости с вязкостью, зависящей от времени.

Плазмидная ДНК означает маленькое клеточное включение, состоящее из кольца ДНК, которое не

- 5 009447 является хромосомой, которое может обладать способностью включать фрагмент неэндогенной ДНК. Методы конструирования плазмид включают методы, описанные у Машайк и др., Мо1еси1аг С1ошпд, А ЬаЬога1огу Мапиа1, 26, Со16 8рппд НагЬог ЬаЬога1огу Ргекк (1989).

Для целей настоящего изобретения термин поток относится к пропусканию жидкости с конкретной скоростью потока (например, литры в минуту) через смеситель, обычно под действием насоса. Следует отметить, что считают, что скорость потока через смеситель влияет на эффективность лизиса, осаждения и перемешивания.

ДНК с однонитевыми разрывами (шскеб) и релаксированная ДНК означает, что ДНК не является суперскрученной. Суперскрученная ДНК представляет собой термин, хорошо понятный в данной области.

Загрязняющая примесь представляет собой любое вещество, от которого желательно отделить или выделить ДНК. Загрязняющие примеси включают, но не ограничиваются, белки клетки-хозяина, эндотоксин, ДНК и/или РНК клетки-хозяина. Понятно, что то, что рассматривают в качестве загрязняющей примеси, может зависеть от контекста, в котором используют на практике способы по изобретению. Загрязняющая примесь может происходить или может не происходить из клетки-хозяина, т.е. она может быть или может не быть примесью клетки-хозяина.

Выделение или очистка первого компонента (такого как ДНК) означает обогащение первого компонента из других компонентов, с которыми первоначально обнаружен первый компонент. Степени желательной и/или получаемой очистки представлены в данном описании.

Термины по существу не содержит и высокоочищенный определяют как примерно на 95% и предпочтительно более чем на 98,99% чистый или свободный от примесей, или содержащий менее 5% и предпочтительно менее 1-2% примесей.

ДНК фармацевтического качества определяют в данном описании как препарат ДНК, который содержит не более примерно 5%, и предпочтительно не более примерно 1-2% клеточных компонентов, таких как мембраны клеток.

Плазмидную ДНК фармацевтического качества определяют в данном описании как препарат ДНК, который содержит часть на миллион или млн^-1 (< 0,0001%, т.е. < 0,0001 мг на 100 мг плазмидной ДНК) геномной ДНК, РНК или белковых примесей.

Более точно, плазмидная ДНК фармацевтического качества означает в данном описании препарат ДНК, который содержит менее примерно 0,01%, или менее 0,001% и предпочтительно менее 0,0001%, или предпочтительно менее 0,00008% (< 0,00008%, т.е. < 0,00008 мг на 100 мг плазмидной ДНК) хромосомной ДНК или геномной ДНК.

Плазмидная ДНК фармацевтического качества означает в данном описании препарат ДНК, который содержит менее примерно 0,01%, или менее 0,001% и предпочтительно менее 0,0001%, или предпочтительно менее 0,00002% (< 0,00002%, т.е. < 0,00002 мг на 100 мг плазмидной ДНК) примесей РНК.

Плазмидная ДНК фармацевтического качества означает в данном описании препарат ДНК, который содержит менее примерно 0,0001%, и наиболее предпочтительно менее 0,00005% (< 0,00005%, т.е. < 0,00005 мг на 100 мг плазмидной ДНК) белковых примесей.

ДНК фармацевтического качества означает в данном описании препарат ДНК, который содержит менее 0,1 ЕЙ (эндотоксиновая единица)/мг эндотоксинов.

ДНК фармацевтического качества означает в данном описании препарат ДНК, который предпочтительно преобладает в кольцевой форме и более точно, который содержит более 80, 85, 90, 95 или более 99% замкнутой кольцевой формы плазмидной ДНК.

Т-трубка относится к Т-образной конфигурации трубопровода, где Т-форма образована одной частью трубопровода, созданной в этой конфигурации, или более чем одной частью трубопровода, объединенной с образованием этой конфигурации. Т-трубка имеет три рукава и центральную часть, где рукава соединяются. Т-трубку можно использовать для смешивания ингредиентов, так как каждая из двух жидкостей может затекать в один из рукавов Т, сливаться в центральной части и вытекать из третьего рукава. Смешивание происходит при слиянии жидкостей.

Турбулентный поток означает нерегулярное случайное движение частиц жидкости в направлении, поперечном направлению основного потока, при котором скорость в данной точке неравномерно изменяется по величине и направлению.

Термин вязко-эластичный относится к жидкостям, имеющим как вязкие, так и эластичные свойства.

Подробное описание изобретения

Изобретение основано на открытии масштабируемого способа получения высокого выхода плазмидной ДНК фармацевтического качества. В частности, изобретение основано на открытии способа получения и выделения высокоочищенной плазмидной ДНК с использованием непрерывного щелочного лизиса клеток-хозяев.

На первой стадии клетки-хозяева инокулируют, т.е. клетки, трансформированные плазмидной ДНК в фазе экспоненциального роста, высевают штрихом в чашки, содержащие среду ЬВ, содержащую антибиотики, такие как тетрациклин. Затем каждую из одиночных колоний из чашки инокулируют в 20 мл

- 6 009447 среды ЬВ, дополненной подходящим антибиотиком тетрациклином, в отдельную стерильную пластиковую колбу Эрленмейера и выращивают в течение 12-16 ч при 37°С во встряхиваемом инкубаторе. Одну из этих культур затем использовали для инокуляции 200 мл стерильной среды ЬВ, добавленной в 2 л колбы Эрленмейера. Ее выращивали при 37°С и 200 об./мин во встряхиваемом инкубаторе и использовали для инокуляции двух 5 л колб Эрленмейера, и выращивали при 30°С и 200 об./мин во встряхиваемом инкубаторе и использовали для инокуляции ферментера, когда клетки находились в средней фазе экспоненциального роста, через 5 ч и при ΘΌ600 нм, составляющей 2 единицы.

Культуры клеток-хозяев и инокуляция хорошо известны в данной области. Обычно клетки-хозяева выращивают до тех пор, пока они не достигают большой биомассы, и клетки находятся в фазе экспоненциального роста для того, чтобы иметь большое количество плазмидной ДНК. Можно использовать два различных способа, например периодическое культивирование и периодическое культивирование с подпиткой.

Периодическое культивирование позволяет контролировать скорость роста посредством манипуляции температурой роста и используемым источником углерода. Термин периодическое культивирование, используемый в данном описании, означает способ культивирования клеток, при котором все питательные вещества, необходимые для роста клеток и для получения плазмид, содержащихся в культивируемых клетках, находятся в сосуде во время инокуляции в большом избытке (например, 10-кратное превышение концентраций питательных веществ над концентрациями питательных веществ из предшествующего уровня техники), посредством чего устраняется необходимость делать добавки в стерильный сосуд после пост-стерилизационных добавок и необходимость в сложных моделях и стратегиях подпиток.

Другим типом культивирования, полезным согласно изобретению, является культивирование с подпиткой, при котором скорость роста клеток контролируют добавлением питательных веществ в культуру в течение роста клеток. Термин культивирование с подпиткой, используемый в данном описании, относится к способу культивирования клеток, при котором скорость роста контролируют при помощи тщательно отслеживаемых добавок метаболитов в культуру в процессе культивирования. Культивирование с подпиткой согласно изобретению позволяет культуре клеток достигать более высокой биомассы, чем периодическое культивирование.

Примеры способа культивирования и примерные скорости добавления подпиток описаны ниже для 50 л препарата. Однако, используя примерные скорости подпиток, описанные ниже, также можно обрабатывать и другие объемы, например, 10 л, 50 л или более 500 л, в зависимости от размера обрудования.

Периодическое культивирование в высокообогащенной среде и культивирование в среде с подпиткой являются подходящими для получения культуры клеток с высокой плотностью с максимизацией специфического выхода плазмиды и обеспечением сбора клеток при высокой биомассе, которые все еще находятся в фазе экспоненциального роста.

При культивировании с подпиткой в качестве источника углерода используют глюкозу или глицерин. Культивирование с подпиткой протекает до тех пор, пока не будет израсходован первоначальный углеродный субстрат (глюкоза). Эту точку замечают по внезапному увеличению ΌΘ (растворенного кислорода, б188о1уеб охудеп) и подтверждают анализом на глюкозу образца, взятого сразу после этого события. Затем запускают насос, заранее наполненный подпиточной средой. Скорость насоса определяют с помощью модели, описанной Сиг1е88 и др. (Вюепд. 38:1082-1090, 1991), которая целиком включена в данное описание изобретения посредством ссылки. Модель предназначена для того, чтобы облегчить контроль за фазой подпитки в способе культивирования с подпиткой. При исходном периодическом способе неингибирующая концентрация субстрата потребляется клетками, растущими с максимальной для них специфической скоростью роста (тах), давая быстрое увеличение уровней биомассы после инокуляции. Культура не может расти с этой скоростью неопределенно долго из-за накопления токсических метаболитов (ИексЫо е! а1., ЕегтеШаНоп Теейпо1оду Иапд ВесотЫпап! Мюгоогдашктк. 1п Вю1еейпо1оду, еб5. Η. 1. Вйет аиб 6. Вееб. ^е1ийе1т: УСН УебадкдекеШсйай тЬН 7Ь: 117-140, 1989). Для обеспечения непрерывного логарифмического роста в этой модели рассчитывают зависимую от времени скорость подпитки рост-лимитирующим углеродным субстратом без необходимости контроля по типу обратной связи, чтобы задать рост во время фазы подпитки на уровне, установленном оператором. Его выбирают на уровне, который не приводит к образованию ингибирующих катаболитов и является достаточным для получения высокой биомассы.

Обычно при периодическом культивировании используют высокие уровни (например, в 4 раза более высокие концентрации, чем концентрации, известные из уровня техники) предшественников, присутствующих в обогащенной среде для подпитки. В частности, количества дрожжевого экстракта в среде для подпитки увеличивали от 5 г/л (как в среде ЬВ) до 20 г/л, обеспечивая, таким образом, огромные количества ростовых факторов и предшественников нуклеиновых кислот. Среду также дополняли сульфатом аммония (5 г/л), который действует в качестве источника органического азота. Добавки предшественников (органического азота в форме сульфата аммония) в процессе подпитки при культивировании с подпиткой предназначены для предупреждения вредных воздействий на качество плазмид.

- 7 009447

Одним из важных аспектов способа по настоящему изобретению является лизис клеток. Таким образом, настоящее изобретение охватывает способ продуцирования и выделения высокоочищенной плазмидной ДНК, который включает стадию лизиса клеток, при котором имеется (а) средство для создания турбулентного потока с целью быстрого смешивания клеточной суспензии (раствор 1 на фиг. 1), с раствором, который лизирует клетки (раствор 2 на фиг. 1); и (б) средство для создания ламинарного потока с целью обеспечения инкубации смеси, образующейся в (а), без существенного встряхивания, где смесь, образующаяся в (а), течет из средства для создания турбулентного потока в средство для создания ламинарного потока.

Согласно одному воплощению изобретения, устройство может дополнительно включать средство для добавления второго раствора, который нейтрализует лизирующий раствор (раствор 3 на фиг. 1), где смесь, инкубируемая в (б), течет из средства для создания ламинарного потока в средство для добавления второго раствора.

В еще одном воплощении может быть использовано устройство в способе выделения из клеток плазмидной ДНК, включающем: (а) смешивание клеток с щелочным лизирующим раствором в средстве для создания турбулентного потока; и (б) нейтрализацию щелочного лизирующего раствора путем добавления кислотного раствора.

Несмотря на многочисленные способы, используемые в настоящее время для лизиса бактериальных клеток, ни один из них не решает проблем, вызванных вязко-эластичными свойствами жидкостей и напряжениями сдвига, возникающими во время стадий перемешивания. Одной из целей настоящего изобретения является способ применения Т-трубок для однородного и очень быстрого смешивания клеточной суспензии (раствор 1) и щелочного раствора (раствор 2) перед тем, как появится вязко-эластичная жидкость. Таким образом, непрерывный лизис согласно настоящему изобретению обеспечивает главное преимущество в ограничении сил сдвига. Т-трубки обычно имеют малый диаметр трубок, обычно диаметр менее 1 см, предпочтительно примерно от 2 до 8 мм, и наиболее предпочтительно приблизительно 6 мм для того, чтобы увеличить время контакта перемешиваемых жидкостей, но в этом способе не используют перемешивание, индуцированное пропусканием через трубку. В табл. 1 здесь ниже показано изменение параметров В 1а, В1Ь, В2, соответственно, средства для создания турбулентного потока, ламинарного потока и турбулентного потока и соответствующие им скорости потока 81, 82 и 83, как показано на фиг. 1.

Таблица 1

В1а (60 л/ч)	В1Ь (60 л/ч)	В2 (90 л/ч)	Скорости потока
диаметр	длина	диаметр	длина	диаметр	длина	81, 32 и 83	Диапазон
5-7 мм	2-6 м	12,5-19 мм	13-23 м	5-8 мм	2-4 м	60/60/90 л/ч	± 20%

Другим объектом настоящего изобретения является смеситель или инжектор с трубками вместо Ттрубки, которые обеспечивают диспергирование клеток в лизирующем растворе. Соответственно, механическое напряжение, действующее на жидкости, которые проходят через трубки, значительно снижено по сравнению с тем, когда жидкости перемешивают, например, при помощи лопастей в емкостях. Первоначальная эффективность перемешивания приводит даже к большей эффективности в последующие секунды, так как эта жидкость еще не имеет вязко-эластичных свойств, и перемешивание, осуществляемое с помощью трубки малого диаметра, является очень эффективным. Напротив, когда для перемешивания используют Т-трубку, первоначальное перемешивание является только умеренным, в то время как жидкости быстро становятся вязко-эластичными, что приводит к значительным проблемам при протекании в трубке. Это частичное перемешивание приводит к лизису лишь части клеток и, следовательно, может высвобождать только часть плазмид перед нейтрализацией.

Согласно настоящему изобретению, авторы идентифицировали две фазы во время лизиса, названные фазой I и фазой II. Эти две фазы соответствуют I) лизису клеток и II) денатурации нуклеиновых кислот, вызывающей сильное изменение реологического поведения, которое дает в результате вязкоэластичную жидкость. Коррекция диаметров трубок делает возможным их соответствие требованиям этих двух фаз. В трубке малого диаметра (В1 а) перемешивание усиливается. Это конфигурация, используемая для фазы I. В трубке большого диаметра (В1Ь) перемешивание (и, таким образом, напряжение сдвига) ослабевает. Это конфигурация, используемая для фазы II.

Соответственно, авторы изобретения используют смеситель, названный М1, как изображено на фиг. 2. Для обеспечения диспергирования клеточной суспензии согласно настоящему изобретению также можно использовать любое Т-образное устройство. С помощью этого смесителя раствор 1 впрыскивают против тока в щелочной лизирующий раствор через одно или более чем одно отверстие малого диаметра для того, чтобы обеспечить эффективное диспергирование. Диаметры этих отверстий в изображенной конфигурации составляют примерно от 0,5 до 2 мм и предпочтительно примерно 1 мм.

Смесь выходит из смесителя М1 для того, чтобы пройти через трубку малого диаметра (фиг. 1) за

- 8 009447 короткий период времени (примерно 2,5 с). Комбинацию диаметра и времени потока можно легко рассчитать с целью поддержания турбулентного потока. Примеры изменений этих параметров даны в табл. 1. Во всех ссылках на диаметр трубки дается внутренний диаметр трубки, а не наружный диаметр, который включает толщину стенок самой трубки. Это короткое время пребывания в трубке обеспечивает очень быструю гомогенизацию растворов 1 и 2. Полагая, что раствор 1 и раствор 2 все еще являются ньютоновскими жидкостями во время фазы I, тип потока в течение фазы гомогенизации является турбулентным. На выходе из этой трубки растворы 1 и 2 являются гомогенизированными, и в суспензии начинается лизис клеток.

Гомогенизированная смесь затем проходит через вторую трубку (В1Ь) значительно большего диаметра (фиг. 1), в которой происходит лизис клеток и образование вязко-эластичной жидкости. Во время этой фазы перемешивание может быть минимизировано и раствору можно дать успокоиться с целью ограничения турбулентности насколько это возможно и с тем, чтобы уменьшить любое напряжение сдвига, которое в противном случае фрагментировало бы гДНК. В одном воплощении настоящего изобретения для завершения лизиса клеток и для денатурации нуклеиновых кислот достаточным является время контакта примерно от 1 до 3 мин, приблизительно 2 мин и предпочтительно 1 мин 20 с. Во время фазы денатурации тип потока жидкости является ламинарным, что способствует медленной диффузии ДСН и гидроксида натрия в клеточные компоненты.

Полученный таким образом лизат и нейтрализующий раствор 3 затем смешивают при помощи Υсмесителя, названного М2. В одном воплощении настоящего изобретения внутренний диаметр Υсмесителя составляет примерно от 4 до 15 мм или примерно от 6 до 10 мм и может составлять приблизительно 6 мм или приблизительно 10 мм. Трубка малого диаметра (например, примерно 6 мм трубка) расположена на выходе из Υ-смесителя с целью обеспечения быстрого (менее 1 с) и эффективного смешивания лизата с раствором 3. Нейтрализованный раствор затем собирают в сборной емкости. Во время нейтрализации быстрое снижение рН индуцирует образование хлопьевидного осадка (т.е. образование комков или масс). С другой стороны, частично денатурированная плазмида очень быстро ренатурирует и остается в растворе. Хлопья постепенно оседают в сборной емкости, унося с собой основную массу примесей.

На схематическом чертеже на фиг. 1 показано одно из воплощений системы непрерывного лизиса (НЛ). Непрерывный лизис можно использовать сам по себе или с дополнительными процессами.

Способ по настоящему изобретению можно использовать для лизиса любого типа клеток (т.е. прокариотических или эукариотических) для любой цели, относящейся к лизису, такой как высвобождение желательной плазмидной ДНК из целевых клеток для последующей очистки. В предпочтительном воплощении способ по настоящему изобретению используют для лизиса клеток-хозяев, содержащих плазмиды, с высвобождением плазмид.

Способ непрерывного щелочного лизиса согласно настоящему изобретению можно осуществлять на клетках, собранных из культуры, которую выращивали до биомассы клеток, которые еще не достигли стационарной фазы и, таким образом, находятся на стадии экспоненциального роста (2-10 г сухой массы/л). Стадию непрерывного щелочного лизиса также можно осуществлять на клетках, собранных из культуры, которую выращивали до высокой биомассы клеток, и которые больше не находятся на стадии экспоненциального роста, но достигли стационарной фазы, с концентрацией клеток приблизительно 10200 г сухой массы на литр и предпочтительно 10-60 г сухой массы на литр.

Изобретение дополнительно охватывает способ получения и выделения высокоочищенной плазмидной ДНК, которая, по существу ,А не содержит примеси и, таким образом, представляет собой ДНК фармацевтического качества. Плазмидная ДНК, полученная и выделенная способом по изобретению, содержит очень низкие уровни, т.е. часть на миллион (млн^-1) загрязняющих хромосомной ДНК, РНК, белка и эндотоксинов, и содержит, главным образом, замкнутую кольцевую форму плазмидной ДНК. Плазмидная ДНК, полученная согласно изобретению, имеет достаточную чистоту для применения в научном исследовании и плазмидной терапии.

Способ по изобретению включает стадии очистки, включающие аффинную хроматографию с образованием тройной спирали с дополнительной стадией ионообменной хроматографии, и дополнительно может включать гидрофобную хроматографию или гель-фильтрацию. Стадия ионообменной хроматографии может представлять собой как ионообменную хроматографию в псевдоожиженном слое, так и аксиальную и/или радиальную анионообменную хроматографию высокого разрешения.

Таким образом, этот способ включает стадию щелочного лизиса, раскрытую в данном описании, в сочетании с последующими стадиями ионообменной хроматографии, аффинной хроматографии с образованием тройной спирали и гидрофобной хроматографии, осуществляющимися в указанном порядке. Фильтрация лизата или иное удаление хлопьевидного осадка могут предшествовать первой хроматографической стадии. Способы по изобретению для очистки плазмидной ДНК, раскрытые в данном описании, являются масштабируемыми и, таким образом, подходящими для расширения до крупномасштабного производства.

В некоторых воплощениях изобретения непрерывный лизис можно комбинировать с дополнительными стадиями очистки для того, чтобы получить продукт с высокой степенью чистоты, содержащий

- 9 009447 пДНК. Его можно, например, комбинировать, по меньшей мере, с удалением хлопьевидного осадка (таким как фильтрация лизата, осаждение отстаиванием или центрифугирование), ионообменной хроматографией (такой как катионо- или анионообменная), триплексной аффинной хроматографией и гидрофобной хроматографией. В одном воплощении после непрерывного лизиса следуют анионообменная хроматография, триплексная аффинная хроматография и гидрофобная хроматография в указанном порядке. В другом воплощении после непрерывного лизиса следуют фильтрация лизата, анионообменная хроматография, триплексная аффинная хроматография и гидрофобная хроматография в указанном порядке. Эти стадии обеспечивают действительно масштабный способ производства плазмид, с помощью которого можно получать большие количества пДНК беспрецедентной чистоты. ДНК и РНК хозяина, а также белки находятся в интервале очень низких концентраций.

В способе по настоящему изобретению также можно использовать дополнительные стадии гельфильтрации, обращенно-фазной хроматографии, гидроксиапатитной хроматографии и т.д. в сочетании со стадиями, раскрытыми в данном описании согласно настоящей заявке.

Удаление хлопьевидного осадка можно использовать для обеспечения более высокой чистоты получаемого в результате продукта пДНК. Эту стадию можно использовать для удаления основной массы выпавшего в осадок материала (флокулята). Один способ удаления хлопьевидного осадка осуществляют посредством стадии фильтрации лизата, например, через 1-5 мм и предпочтительно через 3,5 мм сетчатый фильтр с последующей объемной фильтрацией в качестве конечной стадии фильтрации. Другие способы удаления хлопьевидного осадка осуществляют посредством центрифугирования или осаждения отстаиванием.

Ионообменную хроматографию можно использовать для обеспечения более высокой чистоты получаемого в результате продукта пДНК. Анионообменная хроматография может быть выбрана в зависимости от свойств примесей и рН раствора.

Анионообменную хроматографию можно использовать для обеспечения более высокой чистоты получаемого в результате продукта пДНК. Анионообменная хроматография функционирует путем связывания отрицательно заряженных (или кислотных) молекул с носителем, который является положительно заряженным. Использование ионообменной хроматографии затем делает возможным разделение молекул на основе их заряда. Семейства молекул (кислотные вещества, щелочные вещества и нейтральные вещества) можно легко разделить с помощью этой методики. Можно использовать схемы ступенчатой элюции, при этом многочисленные примеси элюируются в ранних фракциях, а пДНК элюируется в более поздних фракциях. Анионообменная хроматография является очень эффективной для удаления белка и эндотоксина из препарата пДНК.

Что касается ионообменной хроматографии, то наполнитель и способ получения такого материала, а также способ получения, полимеризации и функционализации анионообменной хроматографии, и элюция, и разделение плазмидной ДНК посредством этого хорошо известны в данной области.

Соединения, которые используются для синтеза основных материалов, используемых в качестве наполнителя для анионообменной хроматографии, могут представлять собой любые соединения, если различные функциональные группы, проявляющие гидрофобность, или различные ионообменные группы могут быть введены в них посредством последующей реакции после того, как будут синтезированы основные материалы. Примеры монофункциональных мономеров включают в себя стирол, ортогалогенометилстирол, мета-галогенометилстирол, пара-галогенометилстирол, орто-галогеноалкилстирол, мета-галогеноалкилстирол, пара-галогеноалкилстирол, α-метилстирол, α-метил-орто-галогенометилстирол, α-метил-мета-галогенометилстирол, α-метил-пара-галогенометилстирол, α-метил-ортогалогеноалкилстирол, α-метил-мета-галогеноалкилстирол α-метил-пара-галогеноалкилстирол, ортогидроксиметилстирол, мета-гидроксиметилстирол, пара-гидроксиметилстирол, орто-гидроксиалкилстирол, мета-гидроксиалкилстирол, пара-гидроксиалкилстирол, α-метил-орто-гидроксиметилстирол, α-метил-мета-гидроксиметилстирол, α-метил-пара-гидроксиметилстирол, α-метил-ортогидроксиалкилстирол, α-метил-мета-гидроксиалкилстирол, α-метил-пара-гидроксиалкилстирол, глицидилметакрилат, глицидилакрилат, гидроксиэтилакрилат, гидроксиметакрилат и винилацетат. Наиболее предпочтительными соединениями являются галогеноалкильные группы, замещенные на ароматическом кольце, галогены, такие как С1, Вг, I и Е, и насыщенные углеводороды с прямой или разветвленной цепью с количеством атомов углерода от 2 до 15. Примеры полифункциональных мономеров включают в себя дивинилбензол, тривинилбензол, дивинилтолуол, тривинилтолуол, дивинилнафталин, тривинилнафталин, этиленгликольдиметакрилат, этиленгликольдиакрилат, диэтиленгликольдиметакрилат, диэтиленгликольдиакрилат, метиленбисметакриламид и метиленбисакриламид.

Различные ионоообменные группы могут быть введены с помощью последующей реакции. Получение основного материала включает первую стадию, где монофункциональный мономер и полифункциональный мономер взвешивают в подходящем соотношении и добавляют точно взвешенный разбавитель или растворитель, которые используются в целях регуляции размера пор в образующихся частицах, и, аналогично, точно взвешенный инициатор полимеризации, с последующим тщательным перемешиванием. Смесь затем подвергают полимеризации суспензии типа масло в воде, где смесь добавляют в зара

- 10 009447 нее точно взвешенный стабилизатор суспензии, растворенный в водном растворе, и капельки масла желательного размера образуются путем перемешивания мешалкой, и полимеризацию осуществляют путем постепенного нагревания перемешанного раствора. Отношение монофункционального мономера к полифункциональному мономеру обычно составляет приблизительно 1 моль монофункционального мономера и примерно от 0,01 до 0,2 моль полифункционального мономера для того, чтобы получить мягкие частицы основного материала. Также нет особых ограничений для инициатора полимеризации, и используют обычно применяемые инициаторы азобис типа и/или пероксидного типа.

Для предотвращения агрегации между самими капельками масла также можно использовать стабилизаторы суспензии, такие как ионные поверхностно-активные вещества, неионные поверхностноактивные вещества, полимеры с амфипатическими свойствами и их смеси.

Предпочтительно, чтобы наполнитель, используемый для ионообменной хроматографии для очистки плазмидных ДНК, имел относительно большой диаметр пор, особенно в интервале от 1500 до 4000 А. Поверхностные модификации для введения ионообменных групп в основные материалы хорошо известны в данной области.

Для ионообменной хроматографии можно использовать два типа элюентов. Можно использовать первый элюент, содержащий низкую концентрацию соли, и второй элюент, содержащий высокую концентрацию соли. Способ элюции состоит в ступенчатом переходе от первого элюента ко второму элюенту или в способе градиентной элюции, непрерывно изменяющем состав от первого элюента до второго элюента. Можно использовать буферы и соли, которые обычно используют в этих элюентах для ионообменной хроматографии. Для первого элюента, содержащего низкую концентрацию соли, особенно предпочтительным является водный раствор с концентрацией буфера от 10 до 50 мМ и значением рН от 6 до 9. Для второго элюента, содержащего высокую концентрацию соли, особенно предпочтительным является водный раствор с 0,1-2 М натриевой солью, добавленной к элюенту. Что касается натриевых солей, можно использовать хлорид натрия и сульфат натрия.

Кроме того, для ингибирования деградации плазмид, обусловленной ферментами, разрушающими ДНК в лизате ЕксйепсЫа сой, можно использовать хелатирующий агент для ионов двухвалентных металлов, такой как, например, этилендиаминтетрауксусная кислота. Концентрация хелатирующего агента для ионов двухвалентных металлов предпочтительно составляет от 0,1 до 100 мМ.

Для применения в настоящем изобретении подходит широкий спектр имеющихся в продаже анионообменных матриц, включая, но не ограничиваясь этим, матрицы, доступные от РОК.О8 Άηίοη Ехсйапде Кектк, ^^адеη, Тою Наак, 81егодепе. 8рйето6ех, Ыис1еорас и Рйаттааа. Например, колонку (Роток II Р1/М, 4,5 мм · 100) сначала уравновешивают 20 мМ Βίκ/Трис-пропаном при рН 7,5 и 0,7 М ЫаС1. Образец наносят и промывают тем же исходным буфером. Затем применяют градиент элюции от 0,5 М до 0,85 М №1С1 примерно в 25 объемах колонки и собирают фракции. Предпочтительная анионообменная хроматография включает Етас1оде1 ТМАЕ Н1Сар.

Согласно предпочтительному воплощению способа разделения и очистки плазмидной ДНК, настоящее изобретение относится к способу разделения и очистки нуклеиновых кислот и/или плазмидной ДНК с помощью ионообменной хроматографии в сочетании с хроматографией с образованием тройной спирали для эффективного получения нуклеиновых кислот с высокой чистотой и в большом количестве.

Аффинная хроматография с образованием тройной спирали описана, в частности, в патентах США 6319672, 6287762, а также в международной заявке на патент данного заявителя, опубликованной под номером АО 02/77274.

Аффинная хроматография с образованием тройной спирали основана на специфической гибридизации олигонуклеотидов и целевой последовательности в двухцепочечной ДНК. Эти олигонуклеотиды могут содержать следующие основания:

тимидин (Т), который может образовывать триплеты с дублетами А.Т двухцепочечной ДНК (К.а)адора1 е1 а1., Вюсйет 28 (1989) 7859);

аденин (А), который может образовывать триплеты с дублетами А.Т двухцепочечной ДНК; гуанин (О), который может образовывать триплеты с дублетами О.С двухцепочечной ДНК; протонированный цитозин (С+), который может образовывать триплеты с дублетами О.С двухцепочечной ДНК (Ра)адора1 е1 а1., 1ос. сй);

урацил (И), который может образовывать триплеты с парами оснований А.и или А.Т.

Предпочтительно используемый олигонуклеотид содержит обогащенную цитозином гомопиримидиновую последовательность, а специфическая последовательность, присутствующая в ДНК, представляет собой гомопурин-гомопиримидиновую последовательность. Присутствие цитозинов делает возможным образование тройной спирали, которая стабильна при кислом рН, когда цитозины протонированы, и дестабилизируется при щелочном рН, когда цитозины нейтрализуются.

Олигонуклеотид и специфическая последовательность, присутствующая в ДНК, предпочтительно являются комплементарными для того, чтобы обеспечить образование тройной спирали. Лучшие выходы и лучшую селективность можно получить, используя олигонуклеотид и специфическую последовательность, которые являются полностью комплементарными. Например, олигонуклеотид поли(СТТ) и специфическая последовательность поли(ОАА). Предпочтительные олигонуклеотиды имеют последова

- 11 009447 тельность 5'-ОАООСТТСТТСТТСТТСТТСТТСТТ-3' (6АО6(СТТ)₇ (8ЕО ГО N0:1), в которой основания ОАОО не образуют тройной спирали, но позволяют олигонуклеотиду находиться на некотором расстоянии от связывающего плеча; последовательность (СТТ)₇. Эти олигонуклеотиды способны образовывать тройную спираль со специфической последовательностью, содержащей комплементарные единицы (ОАА). Рассматриваемая последовательность может, в частности, представлять собой область, содержащую 7, 14 или 17 единиц ОАА, как описано в примерах.

Другой последовательностью, представляющей особый интерес, является последовательность 5'АА666А666А66А6А60АА-3' (8Е0 ГО N0: 2). Эта последовательность образует тройную спираль с олигонуклеотидами 5'-АА66А6А66А666А660АА-3' (8Е0 ГО N0: 3) или 5'ТТ66Т6Т66Т666Т660ТТ-3' (8Е0 ГО N0: 4). В этом случае олигонуклеотид связывается с полипуриновой цепью в антипараллельной ориентации. Эти тройные спирали стабильны только в присутствии Мд²⁴ (Уакциех е! а1., Вюсйет1к1ту, 1995, 34, 7243-7251; Веа1 апб Эетуап, 8с1епсе, 1991, 251, 1360-1363).

Как указано выше, специфическая последовательность может быть природной последовательностью, присутствующей в двухцепочечной ДНК, или синтетической последовательностью, искусственно введенной в последнюю. Особенно полезным является применение олигонуклеотида, способного образовывать тройную спираль с природной последовательностью, присутствующей в двухцепочечной ДНК, например, в точке инициации репликации плазмиды или в маркерном гене. В этом отношении из анализа последовательности известно, что некоторые области этих ДНК, особенно в точке инициации репликации, могут обладать гомопурин-гомопиримидиновыми участками. Синтез олигонуклеотидов, способных образовывать тройные спирали с этими природными гомопурин-гомопиримидиновыми участками, преимущественно делает возможным применение способа по изобретению к немодифицированным плазмидам, в частности, к коммерческим плазмидам типа рИС, рВК322, р8У и тому подобного. Среди гомопурин-гомопиримидиновых последовательностей, имеющихся в природе в двухцепочечной ДНК, можно упомянуть последовательность, содержащую всю или часть последовательности 5'СТТССС0АА666А6ААА60-3' (8Е0 ГО N0: 5), присутствующей в точке инициации репликации плазмиды Со1Е1 Е. сой. В этом случае олигонуклеотид, образующий тройную спираль, обладает последовательностью: 5'-6ААО6ОСТТСССТСТТТСС-3' (8Е0 ГО N0: 6) и связывается поочередно с двумя цепями двойной спирали, как описано Веа1 апб Эетуап (1. Ат. СЬет. 8ос. 1992, 114, 4976-4982) и 1ауакепа апб 1о1тк1оп (М1с1е1с Ас1бк Кек. 1992, 20, 5279-5288). Также можно упомянуть последовательность 5'ОААААА66АА6АО-3' (8Е0 ГО N0: 7) β-лактамазного гена плазмиды рВК322 (Оиуа1-Уа1епйп е! а1., Ргос. №11. Асаб. δα. И8А, 1992, 89, 504-508).

Подходящие целевые последовательности, которые могут образовывать триплексные структуры с конкретными олигонуклетидами, были идентифицировали в точках инициации репликации плазмид Со1Е1, а также плазмид рС0К. Плазмиды рС0К представляют собой плазмиды с условной точкой инициации репликации и, в частности, описаны в И8 2004/142452 и И8 2003/161844. Происходящие из Со1Е1 плазмиды содержат 12-мерную гомопуриновую последовательность (5'-АОАААААААООА-3') (8Е0 ГО N0: 8), картированную выше от транскрипта КЫА-П, участвующего в репликации плазмиды (Ъаса1епа е! а1., 1981, №11иге. 294, 623). Эта последовательность образует стабильную триплексную структуру с 12-мерным комплементарным олигонуклеотидом 5'-ТСТТТТТТТССТ-3' (8Е0 ГО N0: 9). Основа рС0К содержит гомопуриновый отрезок из 14 неповторяющихся оснований (5'-ААОААААААААОАА3' (8Е0 ГО N0: 10), расположенный в А+Т-богатом участке точки инициации репликации у репликона рС0К (Ьеусйепко е! а1., 1996, №с1ек Аабк Кек., 24, 1936). Эта последовательность образует стабильную триплексную структуру с 14-мерным комплементарным олигонуклеотидом 5'-ТТСТТТТТТТТСТТ-3' (8Е0 ГО N0: 11). Соответствующие олигонуклеотиды 5'-ТСТТТТТТТССТ-3' (8Е0 ГО N0: 8) и 5'ТТСТТТТТТТТСТТ-3' (8Е0 ГО N0: 11) эффективно и специфически выявляют их соответствующие комплементарные последовательности, локализованные в точке инициации репликации либо Со1Е1 об, либо рС0К (опу). На самом деле, одиночная неканоническая триада (Т*ОС или С*АТ) может приводить к полной дестабилизации триплексной структуры.

Применение олигонуклеотида, способного образовывать тройную спираль с последовательностью, находящейся в точке инициации репликации или в маркерном гене, является особенно полезным, так как оно делает возможным очистку любой ДНК, содержащей указанную точку инициации репликации или указанный маркерный ген, с использованием одного и того же олигонуклеотида. Следовательно, нет необходимости модифицировать плазмиду или двухцепочечную ДНК для того, чтобы включить в нее искусственную специфическую последовательность.

Хотя полностью комплементарные последовательности и являются предпочтительными, однако понятно, что допустимы некоторые ошибочные спаривания оснований между последовательностью олигонуклеотида и последовательностью, присутствующей в ДНК, при условии, что они не приводят к слишком большой потере сродства. Можно упомянуть последовательность 5'АААААА066ААТАА660-3' (8Е0 ГО N0: 12), присутствующую в β-лактамазном гене Е. сой. В этом случае тимин, прерывающий полипуриновую последовательность, может быть распознан гуанином третьей цепи, в результате чего образуется триплет О*ТА, который стабилен в том случае, когда он

- 12 009447 фланкирован двумя триплетами Т*АТ (К1С8ь11пд с1 а1., ВюсЬетЫгу, 1992, 31, 2829-2834).

Согласно конкретному воплощению, олигонуклеотиды по изобретению содержат последовательность (ССТ)_п, последовательность (СТ)_п или последовательность (СТТ)_п, в которых п представляет собой целое число от 1 до 15 включительно. Особенно полезным является применение последовательностей типа (СТ)_п или (СТТ)_п. В действительности заявитель показал, что на выход очистки влияло количество С в олигонуклеотиде. В частности, как показано в примере 7, выход очистки возрастает, когда олигонуклеотид содержит меньше цитозинов. Понятно, что олигонуклеотиды по изобретению также могут объединять единицы (ССТ), (СТ) или (СТТ).

Используемый олигонуклеотид может быть природным (состоящим из немодифицированных природных оснований) или химически модифицированным. В частности, олигонуклеотид может преимущественно содержать определенные химические модификации, позволяющие увеличивать его устойчивость или его защиту против нуклеаз, или его сродство к специфической последовательности. Также понятно, что олигонуклеотид подразумевает любую связанную последовательность нуклеозидов, которая подверглась модификации скелета с целью сделать ее более устойчивой к нуклеазам. Среди возможных модификаций могут быть упомянуты фосфоротиоаты, которые способны образовывать тройные спирали с ДНК (Хобо е1 а1., №.1с1ею Ас1бк Век., 1994, 22, 3322-3330), а также олигонуклеотиды, обладающие формацетальными или метилфосфонатными скелетами (МаИеиса е1 а1., 1. Ат. СЬет. 8ос, 1991, 113, 77677768). Также можно использовать олигонуклеотиды, синтезированные с α-аномерами нуклеотидов, которые также образуют тройные спирали с ДНК (Ъе Эоап е1 а1., №.1с1ею Ас1бк Век., 1987, 15, 7749-7760). Другой модификацией скелета является фосфорамидатная связь. Например, можно упомянуть Ν³-Ρ⁵ межнуклеотидную фосфорамидатную связь, описанную Сгуахпоу и СЬеп, которая дает олигонуклеотиды, образующие особенно стабильные тройные спирали с ДНК (1. Ат. СЬет. 8ос, 1994, 116, 3143-3144). Среди других модификаций скелета также можно упомянуть применение рибонуклеотидов, 2'-Ометилрибозы, фосфодизфира и т.д. (8ип апб Не1епе, Сигг. Оршюп 81гис1. Вю1., 116, 3143-3144). Наконец, скелет на основе фосфора можно заместить полиамидным скелетом, как в ПНК (пептидные нуклеиновые кислоты), которые также могут образовывать тройные спирали (№е1кеп е1 а1., 8с1епсе, 1991, 254, 14971500; К1т е1 а1., 1. Ат. СЬет. 8ос, 1993, 115, 6477-6481), или скелетом на основе гуанидина, как в ДНГ (дезоксирибонуклеиновый гуанидин, Ргос. №11. Асаб. 8сг И8А, 1995, 92, 6097-6101), или поликатионными аналогами ДНК, которые также образуют тройные спирали.

Тимин третьей цепи также можно заместить 5-бромурацилом, который увеличивает сродство олигонуклеотида к ДНК (Роукю апб Эегуап, 1. Ат. СЬет. 8ос, 1989, 111, 3059-3061). Третья цепь также может содержать неприродные основания, среди которых можно упомянуть 7-деаза-2'-дезоксиксантозин (Мбйдап е1 а1., №.1с1ею Ас1бк Век., 1993, 21, 327-333), 1-(2-дезокси-в-Э-рибофуранозил)-3-метил-5-амино1Н-пиразоло[4,3-б]пиримидин-7-он (КоЬ апб Эегуап, 1. Ат. СЬет. 8ос, 1992, 114, 1470-1478), 8оксоаденин, 2-аминопурин, 2'-О-метилпсевдоизоцитидин или любую другую модификацию, известную специалисту в данной области (для обзора см. 8ип апб Не1епе, Сигг. Оршюп 81гис1. Вю1., 1993,3,345-356).

Другой тип модификации олигонуклеотида имеет более конкретную цель улучшения взаимодействия и/или сродства между олигонуклеотидом и специфической последовательностью. В частности, более предпочтительная модификация согласно изобретению состоит в метилировании цитозинов олигонуклеотида. Олигонуклеотид, метилированный таким образом, проявляет замечательное свойство образовывать стабильную тройную спираль со специфической последовательностью в интервале рН, более близком к нейтральному (> 5). Следовательно, он позволяет работать при более высоких значениях рН, чем олигонуклеотиды, известные из предшествующего уровня техники, то есть, при значениях рН, где риски деградации плазмидной ДНК намного меньше.

Длина олигонуклеотида, используемого в способе по изобретению, составляет от 5 до 30 оснований. Преимущественно используют олигонуклеотид с длиной более 10 оснований. Длина может быть адаптирована специалистом в данной области для каждого индивидуального случая для того, чтобы она подходила для желательной селективности и стабильности взаимодействия.

Олигонуклеотиды по изобретению могут быть синтезированы любым известным методом. В частности, они могут быть получены с помощью синтезаторов нуклеиновых кислот. Вполне очевидно, что может быть использован любой другой способ, известный специалисту в данной области.

Для обеспечения ковалентного связывания олигонуклеотида с носителем, его обычно функционализируют. Так, он может быть модифицирован тиольной, амино- или карбоксильной концевой группой в положении 5' или 3'. В частности, добавление тиольной, амино- или карбоксильной группы делает возможным, например, связывание олигонуклеотида с носителем, несущим дисульфидные, малеимидные, амино-, карбоксильные, эфирные, эпоксидные, бромциановые или альдегидные функциональные группы. Эти связи формируются путем установления дисульфидных, тиоэфирных, эфирных, амидных или аминных связей между олигонуклеотидом и носителем. Можно использовать любой другой способ, известный специалисту в данной области, такой как, например, с применением бифункциональных связывающих реагентов.

Кроме того, для улучшения гибридизации со связанным олигонуклеотидом может быть полезным,

- 13 009447 чтобы олигонуклеотид содержал последовательность оснований плеча и спейсера. Применение плеча, в действительности, делает возможным связывание олигонуклеотида на выбранном расстоянии от носителя, обеспечивая улучшение условий его взаимодействия с ДНК. Плечо преимущественно состоит из линейной углеродной цепи, содержащей от 1 до 18 и предпочтительно от 6 до 12 групп (СН₂), и амина, который обеспечивает связывание с колонкой. Плечо связывается с фосфатом олигонуклеотида или спейсера, состоящего из оснований, которые не препятствуют гибридизации. Таким образом, ''спейсер может содержать пуриновые основания. В качестве примера, спейсер может содержать последовательность САСС. Плечо преимущественно состоит из линейной углеродной цепи, содержащей 6 или 12 атомов углерода.

Триплексная аффинная хроматография является очень эффективной для удаления РНК и геномной ДНК. Предпочтительно используют хроматографические носители. Они могут представлять собой функционализированные хроматографические носители без упаковки или предварительно упакованные в колонку, функционализированные пластиковые поверхности или функционализированные латексные шарики, магнитные или иные. В качестве примера, хроматографические носители, которые можно использовать, представляют собой агарозу, акриламид или декстран, а также их производные (такие как Зерйабех, Зерйагозе, Зирегозе и т.д.), полимеры, такие как поли(стирол/дивинилбензол), или, например, привитый или непривитый диоксид кремния. Хроматографические колонки могут работать в диффузионном или перфузионном режиме.

Для получения лучших выходов очистки особенно полезным является применение в плазмиде последовательности, содержащей несколько положений для гибридизации с олигонуклеотидом. Присутствие нескольких позиций гибридизации в действительности стимулирует взаимодействия между указанной последовательностью и олигонуклеотидом, что приводит к улучшению выходов очистки. Таким образом, для олигонуклеотида, содержащего η повторов мотивов (ССТ), (СТ) или (СТТ), предпочтительно использовать последовательность ДНК, содержащую по меньшей мере η комплементарных мотивов, и предпочтительно η+1 комплементарный мотив. Последовательность, несущая η+1 комплементарный мотив, таким образом, дает две позиции гибридизации с олигонуклеотидом. Преимущественно, последовательность ДНК содержит вплоть до 11 позиций гибридизации, то есть η+10 комплементарных мотивов.

Способ по настоящему изобретению можно использовать для очистки любого типа двухцепочечной ДНК. Примером последней является кольцевая ДНК, такая как плазмида, обычно несущая один или более чем один терапевтически важный ген. Эта плазмида также может нести точку инициации репликации, маркерный ген и тому подобное. Способ по изобретению можно применять непосредственно к клеточному лизату. В этом воплощении плазмиду, амплифицированную путем трансформации с последующим культивированием клеток, очищают сразу же после лизиса клеток. Способ по изобретению также можно применять к осветленному лизату, то есть к супернатанту, полученному после нейтрализации и центрифугирования клеточного лизата. Вполне очевидно, что его можно применить также к раствору, предварительно очищенному известными способами. Этот способ также позволяет очищать линейную или кольцевую ДНК, несущую важную последовательность, из смеси, содержащей ДНК различных последовательностей. Способ по изобретению также можно использовать для очистки двухцепочечной ДНК.

Клеточный лизат может представлять собой лизат прокариотических или эукариотических клеток.

Что касается прокариотических клеток, то в качестве примеров можно упомянуть бактерии Е. сой, В. 8иЫ1118, З. 1урЫтигшт или З1гер1отусез. Что касается эукариотических клеток, то можно упомянуть клетки животных, дрожжи, грибы и тому подобное и, более конкретно, дрожжи К1цууеготусез или Зассйаготусез или клетки СОЗ, СНО (клетки яичника китайского хомячка), С127, ΝΙΗ3Τ3 и тому подобное.

Способ по настоящему изобретению, который включает, по меньшей мере, стадию триплексной аффинной хроматографии, может быть использован для получения более высокой чистоты получаемого в результате продукта пДНК. В триплексной аффинной хроматографии олигонуклеотид связывают с носителем, таким как хроматографическая смола или другой матрикс. Образец, который очищают, затем смешивают со связанным олигонуклеотидом, например, путем нанесения образца на хроматографическую колонку, содержащую олигонуклеотид, связанный с хроматографической смолой. Желательная плазмида в образце будет связываться с олигонуклеотидом, образуя триплекс. Связи между олигонуклеотидом и плазмидой могут представлять собой связи Хугстина (НоодДеен). Эта стадия может происходить при рН не более 5, при высокой концентрации соли в течение времени контакта 20 мин или более. Можно использовать стадию промывки. Наконец, в нейтральном буфере происходит депротонирование цитозина, элюция плазмиды из смолы со связанным олигонуклеотидом.

Согласно наиболее предпочтительному воплощению, способ разделения и очистки нуклеиновых кислот и/или плазмидных ДНК включает стадии ионообменной хроматографии в сочетании с аффинной хроматографией с образованием тройной спирали и гидрофобной хроматографией.

При гидрофобной хроматографии используются гидрофобные группы на субстрате для привлечения гидрофобных участков в молекулах в образце для очистки. Следует отметить, что эти носители Н1С работают за счет эффекта кластеризации; при ассоциации этих молекул ковалентные или ионные связи не образуются и не задействованы. Гидрофобная хроматография является полезной, так как она очень

- 14 009447 эффективно удаляет формы плазмид с открытым кольцом и другие примеси, такие как гДНК, РНК и эндотоксин.

Синтез основных материалов для гидрофобной хроматографии, также как и способ получения, полимеризации и функционализации гидрофобной хроматографии, элюции и разделения плазмидной ДНК посредством ее, являются хорошо известными в данной области и среди прочих описаны в патенте США № 6441160, который включен в данное описание изобретения посредством ссылки.

Соединениями, используемыми для синтеза основных материалов, которые применяют для набивочного материала для гидрофобной хроматографии, могут быть любые соединения, если различные функциональные группы, проявляющие гидрофобность, или различные ионообменные группы, могут быть введены путем последующей реакции после того, как будут синтезированы основные материалы. Примеры монофункциональных мономеров включают стирол, орто-галогенометилстирол, метагалогенометилстирол, пара-галогенометилстирол, орто-галогеноалкилстирол, мета-галогеноалкилстирол, пара-галогеноалкилстирол, α-метилстирол, α-метил-орто-галогенометилстирол, α-метил-метагалогенометилстирол, α-метил-пара-галогенометилстирол, α-метил-орто-галогеноалкилстирол, α-метилмета-галогеноалкилстирол, α-метил-пара-галогеноалкилстирол, орто-гидроксиметилстирол, метагидроксиметилстирол, пара-гидроксиметилстирол, орто-гидроксиалкилстирол, мета-гидроксиалкилстирол, пара-гидроксиалкилстирол, α-метил-орто-гидроксиметилстирол, α-метил-метагидроксиметилстирол, α-метил-пара-гидроксиметилстирол, α-метил-орто-гидроксиалкилстирол, αметил-мета-гидроксиалкилстирол, α-метил-пара-гидроксиалкилстирол, глицидилметакрилат, глицидилакрилат, гидроксиэтилакрилат, гидроксиметакрилат и винилацетат. Наиболее предпочтительными соединениями являются галогеноалкильные группы, замещенные на ароматическом кольце, галогены, такие как С1, Вг, I и Р, и насыщенные углеводороды с прямой или разветвленной цепью с числом атомов углерода от 2 до 15.

Примеры полифункциональных мономеров включают дивинилбензол, тривинилбензол, дивинилтолуол, тривинилтолуол, дивинилнафталин, тривинилнафталин, этиленгликольдиметакрилат, этиленгликольдиакрилат, диэтиленгликольдиметакрилат, диэтиленгликольдиакрилат, метиленбисметакриламид и метиленбисакриламид.

С помощью последующей реакции можно вводить различные гидрофобные функциональные группы или различные ионообменные группы. Для того чтобы минимизировать влияние на целевые продукты, которые желательно разделить, обусловленное гидрофобностью, проявляемой самим основным материалом, или набуханием, или сокращением самого основного материала из-за изменения концентрации соли и изменения значения рН, основной материал предпочтительно приготавливают, используя относительно гидрофильные мономеры, такие как глицидилметакрилат, глицидилакрилат, гидроксиэтилакрилат, гидроксиметакрилат и винилацетат. Получение основного материала включает первую стадию, на которой монофункциональный мономер и полифункциональный мономер взвешивают в подходящем соотношении и добавляют точно взвешенный разбавитель или растворитель, которые используют с целью регуляции размера пор образующихся частиц, и аналогичным образом точно взвешенный инициатор полимеризации с последующим тщательным перемешиванием. Смесь затем подвергают полимеризации суспензии типа масло в воде, где смесь добавляют в заранее точно взвешенный стабилизатор суспензии, растворенный в водном растворе, и капельки масла целевого размера образуются с помощью перемешивания мешалкой, а полимеризацию проводят, постепенно нагревая перемешанный раствор.

Отношение монофункционального мономера к полифункциональному мономеру обычно составляет примерно 1 моль монофункционального мономера и примерно от 0,01 до 0,2 моль полифункционального мономера для того, чтобы получить мягкие частицы основного материала. Отношение полифункционального мономера можно увеличить примерно до 0,2-0,5 моль для того, чтобы получить твердые частицы основных материалов. Можно использовать один полифункциональный мономер для того, чтобы получить еще более твердые частицы.

Также нет особых ограничений для инициатора полимеризации, и используют обычно применяющиеся инициаторы азобис типа и/или пероксидного типа.

Для предотвращения агрегации между самими капельками масла также можно использовать стабилизаторы суспензии, такие как ионные поверхностно-активные вещества, неионные поверхностноактивные вещества и полимеры с амфипатическими свойствами или их смеси.

Диаметр образующихся частиц обычно составляет примерно от 2 до 500 мкм. Предпочтительный диаметр частиц составляет от 2 до 30 мкм и более предпочтительно примерно от 2 до 10 мкм. Когда целью является крупномасштабная очистка нуклеиновых кислот с высокой чистотой, то он составляет примерно от 10 до 100 мкм, при выделении целевого продукта из неочищенного исходного раствора он может составлять от 100 до 500 мкм, более предпочтительно примерно от 200 до 400 мкм. Для подведения диаметра частиц можно регулировать скорость вращения мешалки во время полимеризации. Когда нужны частицы с малым диаметром, можно повысить число оборотов, а когда желательны большие частицы, можно уменьшить число оборотов. В данном описании выбор разбавителя является особенно важным, так как разбавитель, который будут использовать, применяют для регуляции размера пор в обра

- 15 009447 зующихся частицах. В качестве фундаментальной идеи относительно растворителя, который будут использовать для полимеризации, регуляцию осуществляют, комбинируя различным образом растворитель, который является плохим растворителем для мономера, с растворителем, который является хорошим растворителем для мономера. Размер диаметра пор можно выбрать подходящим образом в зависимости от размера молекул нуклеиновых кислот, которые предполагается разделять, но он предпочтительно находится в интервале от 500 до 4000 А для набивочного материала для гидрофобной хроматографии, и в интервале от 1500 до 4000 А для набивочного материала для ионообменной хроматографии.

В гидрофобной хроматографии для разделения нуклеиновых кислот с различной гидрофобностью, предпочтительно, соответственно, с применением набивочных материалов с различной гидрофобностью, важным является модификация поверхности основного материала.

Гидрофобные группы могут быть выбраны среди углеводородных групп с длинной или разветвленной цепью, включая насыщенные углеводородные группы или ненасыщенные углеводородные группы, с числом атомов углерода от 2 до 20. В углеводородной группе также может содержаться ароматическое кольцо.

Гидрофобные группы также можно выбрать среди соединений, имеющих следующую формулу:

Основные материалы

где η составляет от 0 до примерно 20, и метиленовая группа может принадлежать прямой или разветвленной цепи, т составляет от 0 до примерно 3, и углеводородная группа может быть прямой или разветвленной цепью, и А представляет собой группу С=О или эфирную группу, но метиленовая группа может быть связана непосредственно с основным материалом без А.

Гидрофобные группы могут дополнительно включать эфирную группу алкиленгликоля с 2-20 углеродными атомами, которая состоит из 0-10 повторяющихся единиц, где противоположный конец функциональной группы, прореагировавшей с основным материалом, может быть группой ОН, оставшейся в таком виде, или она может быть завершена алкильной группой с числом атомов углерода от 1 до 4.

Описанные выше гидрофобные группы могут быть использованы по одиночке или в смеси для модификации поверхности.

Цепь алкильных групп с 6-20 атомами углерода является предпочтительной из-за низкой гидрофобности, подобной гидрофобности плазмид. Длинная цепь алкильных групп, имеющих от 2 до 15 атомов углерода, подходит для разделения соединений с высокой гидрофобностью, таких как РНК, происходящая из Е^сНепсЫа сой, и РНК в клетках человека и животных. Алкильные группы с 4-18 атомами углерода подходят для разделения соединений с относительно низкой гидрофобностью, таких как ДНК, происходящие из ЕксйепсЫа сой, и ДНК в клетках человека и животных.

При разделении этих веществ можно подходящим образом выбрать соединения для модификации поверхности, не ограничиваясь указанным пояснительным примером. В действительности, степень гидрофобности набивочного материала варьирует в зависимости от концентрации соли в среде или концентрации соли в элюенте для адсорбции. Кроме того, степень гидрофобности набивочного материала различается в зависимости от количества групп, введенных в основной материал.

Особенно предпочтительно, чтобы диаметр пор основного материала для гидрофобной хроматографии составлял от 500 до 4000 А, но его можно выбрать соответствующим образом из указанного интервала, в зависимости от размера молекул нуклеиновых кислот, которые желательно разделить. В общем, поскольку удерживание нуклеиновых кислот в набивочном материале и способность к адсорбции (продвижение образца) различаются в зависимости от диаметра пор, предпочтительно использовать основной материал с большим диаметром пор для нуклеиновых кислот с большим размером молекул и основной материал с маленьким диаметром пор для нуклеиновых кислот с маленьким размером молекул.

Например, можно провести реакцию стирольного основного материала с гидрофобной группой, содержащей длинную цепь алкильных групп, с использованием галогенсодержащего соединения и/или карбонилгалоида и катализатора, такого как ЕеС1₃, 8пС1₂ или А1С1₃, и используя реакцию ФриделяКрафта, можно непосредственно добавлять ее к ароматическому кольцу в основном материале в виде дегалогенированного и/или ацилированного соединения. В случае, если основной материал представляет собой частицы, содержащие галогеновую группу, функциональную группу можно вводить через эфирную связь, например, применяя соединения с ОН, содержащейся в функциональной группе, которую нужно добавить, подобные бутанолу, и используя реакцию Вильямсона с щелочным катализатором, таким как ΝαΟΗ или КОН. В случае, если функциональной группой, которую желательно добавить, является соединение, содержащее аминогруппу, подобное гексамину, ее можно добавить, применяя щелочной катализатор, такой как ΝαΟΗ или КОН, и используя реакцию удаления галоидной кислоты. Наоборот, в случае основного материала, содержащего группу ОН, при предварительном введении эпоксигруппы, галогеновой группы или карбонилгалоидной группы в функциональную группу, которую желательно добавить, функциональную группу можно вводить через простую эфирную или сложноэфирную связь. В случае основного материала, содержащего эпоксигруппу, при реакции с соединением с группой

- 16 009447

ОН или аминогруппой, содержащейся в функциональной группе, которую желательно добавить, функциональную группу можно вводить через простую эфирную или аминосвязь. Кроме того, в случае, если функциональная группа, которую желательно добавить, содержит галогеновую группу, функциональную группу можно добавить через простую эфирную связь, используя кислотный катализатор. Так как на относительное содержание функциональных групп, которые необходимо ввести в основной материал, влияет гидрофобность подвергаемого реакции продукта, который желательно разделить, ее невозможно ограничить, но обычно подходящим является набивочный материал с примерно 0,05-4,0 ммоль функциональной группы, добавленной на 1 г сухого основного материала.

Что касается модификации поверхности, то способ добавления функциональной группы через последующую реакцию после образования основного материала или частиц является таким, как описано. Модификацию поверхности проводят согласно тому же самому способу, где основной материал образуется после полимеризации с использованием мономеров с указанными функциональными группами, добавленными перед полимеризацией.

Основным материалом также может быть пористый силикагель. Способ изготовления силикагеля включает связывание силана с использованием такого соединения, как алкилтриметоксисилан, непосредственно на частицах, изготовленных согласно способу, описанному в Ьагеч Н1дк-8рееб Ыс.|шб СЬготаЮдгарНу. стр. 289 и следующие страницы (написано ТокЫо ЫатЬага и ЫоЬио 1кеда\\'а. опубликовано Токуо Нпока^а ВоокЧоге в 1988 г.).

Функциональную группу можно добавить согласно вышеупомянутому способу перед или после связывания силана с использованием агента сочетания силана, содержащего эпоксигруппу. Подходящей является относительно содержание функциональной группы, которую вводят, примерно от 0,05 до 4,0 ммоль функциональной группы, добавленной на 1 г сухого основного материала.

На стадии разделения или очистки гидрофобной хроматографией используют элюенты. Обычно используют два типа элюентов. Один элюент содержит высокую концентрацию соли, тогда как второй элюент содержит низкую концентрацию соли. Способ элюции включает ступенчатый переход от элюента, имеющего высокую концентрацию соли, к элюенту, имеющему низкую концентрацию соли, и можно использовать способ градиентной элюции, непрерывно меняющий состав от одного элюента к другому. Что касается буферов и солей, можно использовать буферы и соли, обычно применяемые для гидрофобной хроматографии. Что касается элюента, содержащего высокую концентрацию соли, то особенно предпочтительным является водный раствор с концентрацией соли от 1,0 до 4,5 М и значением рН от 6 до 8. Что касается элюента, содержащего низкую концентрацию соли, особенно предпочтительным является водный раствор с концентрацией соли от 0,01 до 0,5 М и значением рН от 6 до 8. Обычно в качестве солей могут быть использованы сульфат аммония и сульфат натрия.

Стадию очистки плазмидной ДНК гидрофобной хроматографией можно проводить, комбинируя набивочный материал со введенной функциональной группой слабой гидрофобности с набивочным материалом с введенной функциональной группой сильной гидрофобности. В действительности, клетки Е^сНепсЫа сой, культивируемые в среде, содержат в большом количестве различные компоненты, отличающиеся по гидрофобности, такие как полисахариды, геномную ДНК ЕксйепсШа сой, РНК, плазмиды и белки. Также известно, что есть различия в гидрофобности даже среди самих нуклеиновых кислот. Белки, которые становятся примесями, имееют более высокую гидрофобность по сравнению с плазмидами.

В продаже доступны многие смолы для гидрофобной хроматографии, такие как ЕгасЮде1 ргору1, Тоуореаг1, 8оигсе 15оргору1 или любые другие смолы, имеющие гидрофобные группы. Наиболее предпочтительными смолами являются полимерные среды в виде массы Тоуореаг1. Тоуореаг1 представляет собой метакрилатный полимер, сочетающий высокую механическую и химическую стабильность. Смолы доступны в виде нефункционализированной серии смол Ήν, и на их основе могут быть получены производные с поверхностными химическими группами для ионообменной хроматографии или гидрофобных взаимодействий. Можно использовать четыре типа смол Тоуореаг1 для Н1С, имеющих различную химию поверхности и уровни гидрофобности. Гидрофобность смол Тоуореаг1 для Н1С возрастает в серии: ЕШег, Р1епу1, Ви1у1 и Неху1. Структуры предпочтительных смол Тоуореаг1 для Н1С, т.е. Тоуореаг1 Н^-65, имеющих диаметр пор 1000 А, показаны ниже:

- 17 009447

Описанные выше смолы Тоуореаг1 могут иметь различный класс крупности частиц. Тоуореаг1 650С имеет размер частиц примерно от 50 до 150 мкм, предпочтительно примерно 100 мкм, тогда как Тоуореаг1 650М имеет размер частиц примерно от 40 до 90 мкм, предпочтительно примерно 65 мкм, и Тоуореаг1 6508 имеет размер частиц примерно от 20 до 50 мкм, предпочтительно примерно 35 мкм. Хорошо известно, что размер частиц влияет на разрешение, т.е. разрешение улучшается в зависимости от класса крупности частиц от С к М к 8 и, таким образом, возрастает с уменьшением размера частиц. Наиболее предпочтительной смолой Тоуореаг1, используемой на стадии гидрофобной хроматографии в способе разделения и очистки плазмидной ДНК согласно настоящему изобретению, является Тоуореаг1 Ьи4у1-6508, которую продает ТокоЬ ВюкДепсе.

Согласно предпочтительному воплощению проводят дополнительную стадию диафильтрации. Для применения в этом способе подходят стандартные, имеющиеся в продаже материалы для диафильтрации, согласно стандартным методикам, известным в данной области. Предпочтительным способом диафильтрации является диафильтрация с использованием ультрафильтрационной мембраны, имеющей порог отсечения молекулярной массы в интервале от 30000 до 500000, в зависимости от размера плазмиды. На этой стадии диафильтрации осуществляют обмен буфера, а затем концентрирование. Элюат со стадии 12 концентрируют в 3-4 раза с помощью проточной фильтрации вдоль потока (порог отсечения мембраны 30 кДа) до целевой концентрации примерно от 2,5 до 3,0 мг/мл, и концентрат обменивают с буфером путем диафильтрации при постоянном объеме с 10 объемами солевого раствора и доводят солевым раствором до целевой концентрации плазмиды. Концентрацию ЫУ1ЕОЕ рассчитывают из поглощения образцов концентрата при 260 нм. Раствор ЫУ1ЕОЕ фильтруют через 0,2 мкм капсульный фильтр и делят на несколько аликвот, которые хранят в контейнерах в холодном помещении при 2-8°С до дополнительной обработки. Это дает очищенный концентрат с концентрацией плазмидной ДНК суперскрученной плазмиды приблизительно 70, 75, 80, 85, 90, 95 и предпочтительно 99%. Общий выход плазмиды с помощью этого способа составляет по меньшей мере 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 и 80%, со средним выходом 60%.

Согласно этому воплощению стадию диафильтрации выполняют согласно следующим условиям: используют буфер для стадии а) и для стадии б):

1) первая диафильтрация (стадия а) против 12,5-13,0 объемов 50 мМ Трис/НС1,150 мМ ЫаС1, рН 7,4 (названный как буфер I) и

2) проводят вторую диафильтрацию ретентата со стадии (а) выше, (стадия б), против 3,0-3,5 объемов солевого эксципиента (150 мМ ЫаС1). Эта предпочтительная стадия диафильтрации по настоящему изобретению эффективно и тщательно удаляет сульфат аммония и ЭДТА. Также, после этих стадий диафильтрации, получают подходящую физиологическую концентрацию №1С1 (примерно 150 мМ) и конечную концентрацию Трис ниже 1 мМ (от 200 мкМ до 1 мМ).

Препарат плазмидной ДНК, полученный таким способом с использованием этой стадии диафильтрации, содержит ЫаС1 в виде солевого эксципиента и подходящую концентрацию Трис-буфера для того, чтобы поддерживать или контролировать величину рН от 7 до 7,5. Препараты плазмидной ДНК по настоящему изобретению являются особенно полезными, так как неожиданно их плазмидную ДНК можно хранить в стабильной недеградированной форме в этих условиях в течение длительного периода времени при 5°С и вплоть до 25°С, то есть при комнатной температуре.

Как описано, согласно способу изобретения для разделения, плазмидную ДНК с высокой чистотой и в большом количестве можно получить с помощью более простой манипуляции по сравнению с традиционным способом.

Способ очистки плазмид можно использовать после способа непрерывного лизиса, как описано выше, или любых альтернативных способов лизиса, которые хорошо известны в данной области. Например, можно использовать проточный лизис с нагреванием микробных клеток, содержащих плазмиду. Этот способ описан, в частности, в международной публикации МО 96/02658. Конкретный теплообменник состоял из трубки из нержавеющей стали размером 10 футов (3,048 м) х 0,25 дюйма (0,635 см) (на

- 18 009447 ружный диаметр) в форме спирали. Спираль полностью погружают в водную баню с постоянной высокой температурой. Удерживаемый объем спирали составляет примерно 50 мл. Термопары и термометр использовали, соответственно, для измерения температур на входе и выходе и температуры водной бани. Поток продукта закачивают в нагревающую спираль с использованием перистальтического насоса Маз1егПех с силиконовой трубкой. Лизат клеток выходит из спирали, и затем его центрифугируют в центрифуге периодического действия Весктап 1-21 для осветления. После центрифугирования плазмидную ДНК можно очистить, используя способ очистки по настоящему изобретению.

При альтернативном способе лизиса клеток можно использовать статические смесители последовательно. В действительности, как описано в У О 97/23601 (включена в данное описание посредством ссылки), первый статический смеситель для лизиса клеток в первом статическом смесителе и для осаждения лизата клеток с помощью второго статического смесителя можно использовать в качестве альтернативного способа лизиса клеток перед способом очистки плазмидной ДНК по настоящему изобретению. Большие объемы клеток можно мягко и непрерывно лизировать на одной линии, используя статический смеситель и другие статические смесители, расположенные на одной линии для выполнения других функций, таких как разбавление и осаждение. Подходящие статические смесители, полезные в способе по настоящему изобретению, включают любые проточные устройства, именуемые в данной области как статические или неподвижные смесители, с длиной, достаточной для обеспечения способов по настоящему изобретению. Например, для того чтобы лизировать клетки, статическому смесителю нужно было бы иметь длину, которая обеспечила бы достаточное время контакта между лизирующим раствором и клетками для того, чтобы вызвать лизис данных клеток во время пропускания через смеситель. В предпочтительном воплощении подходящие статические смесители содержат внутреннюю спиральную структуру, которая заставляет две жидкости приходить в контакт друг с другом в противоположно направленном вращающемся потоке, вызывающем смешивание жидкостей вместе в турбулентном потоке.

Способ разделения и очистки плазмидной ДНК согласно настоящему изобретению может быть использован для разделения и очистки любых типов векторов любых размеров. Диапазон размеров плазмидных ДНК, которые можно разделять способом по настоящему изобретению, составляет примерно от 5 т.п.н. до примерно 50 т.п.н., предпочтительно от 15 т.п.н. до 50 т.п.н., причем ДНК включает векторную основу размером примерно 3 т.п.н., терапевтический ген и связанные с ним регуляторные последовательности. Таким образом, векторная основа, полезная в изобретении, сможет нести вставки размером примерно 10-50 т.п.н. или больше. Вставка может включать ДНК из любого организма, но предпочтительно будет происходить из млекопитающих и может включать, кроме гена, кодирующего терапевтический белок, регуляторные последовательности, такие как промоторы, последовательности полиаденилирования, энхансеры, области контоля локусов и пр. Ген, кодирующий терапевтический белок, может быть геномного происхождения и, следовательно, может содержать экзоны и интроны, как отражено в его геномной организации, или может происходить из комлементарной ДНК. Такие векторы могут включать, например, векторную основу, реплицируемую посредством репликации с получением большого числа копий, имеющую полилинкер для вставки терапевтического гена, ген, кодирующий селективный маркер, например, 8ирРйе ΙΡΝΛ. ген устойчивости к тетрациклину и канамицину, и является физически маленькой и стабильной. Векторная основа плазмиды преимущественно позволяет осуществлять вставки фрагментов ДНК млекопитающих, других эукариот, прокариот или вурусов, и полученную плазмиду можно очистить и использовать в плазмидной терапии ίη νίνο или ех νίνο. Векторы, имеющие относительно высокое число копий, например, в интервале от 20-40 копий/клетку вплоть до 1000-2000 копий/клетку, можно разделять и очищать способом по настоящему изобретению. Например, вектор, который включает точку инициации репликации рИС, является предпочтительным согласно способу по изобретению. Точка инициации репликации рИС обеспечивает более эффективную репликацию плазмидной ДНК и приводит к десятикратному увеличению числа копий плазмиды/клетку по сравнению, например, с точкой инициациим репликации рВК322. Предпочтительно, плазмидную ДНК с условной точкой инициации репликации или рСОЯ, как описано в И8 2003/1618445, можно разделять с помощью способа по настоящему изобретению. Полученное высокое число копий значительно увеличивает отношение плазмидной ДНК к хромосомной ДНК, РНК, клеточным белкам и кофакторам, улучшает выход плазмиды и облегчает последующую очистку. Соответственно, согласно изобретению можно использовать любой вектор (плазмидную ДНК). Репрезентативные векторы включают, но не ограничиваются этим, плазмиду ΝΥ1ΡΟΡ. Плазмида ΝΥ1ΡΟΡ, кодирующая кислый фактор роста фибробластов или фактор роста фибробластов 1-го типа (РСР-1), полезная при лечении пациентов с последней стадией окклюзии периферических артерий (ОПА) или с заболеванием периферических артерий (ЗПА), удовлетворяет требованиям безопасности. Сатего1а и др. Ц Уазе. 8игд., 2002, 35, 5: 930-936) описывают, что 51 пациенту с неизлечимой конечной стадией ЗПА, имеющих боль в состоянии покоя или некроз тканей, внутримышечно инъецировали возрастающие одноразовые или повторные дозы Νν1ΡΟΡ в ишемизированные бедро или икру. Затем оценивали различные параметры, такие как чрескожное давление кислорода, брахиальные индексы лодыжки и пальцев ног, оценка болей и излечение язвы. После введения Νν1ΡΟΡ наблюдали значительное увеличение брахиальных индексов, уменьшение боли, сокращение размера язвы и улучшенную перфузию.

- 19 009447

Клетки-хозяева, полезные согласно изобретению, могут представлять собой любой бактериальный штамм, т.е. как грамположительные, так и грамотрицательные штаммы, такие как Е. со11 и 8а1топе11а !урЫтигшт, или ВасШик, которые способны поддерживать высокое число копий плазмид, описанных выше; например, 20-200 копий. Хозяйские штаммы Е. сой могут быть использованы согласно изобретению и включают НВ101, ΌΗ1 и ΌΗ5αΕ, ХАС-1 и ХАС-1рц· 116, ТЕХ2 и ТЕХ2рй42 (\УО 04/033664). Штаммы, содержащие Е плазмиду или производные Е плазмиды (например, ДМ109), обычно не являются предпочтительными, так как Е плазмида может совместно очищаться с терапевтическим плазмидным продуктом.

Согласно другому аспекту, в настоящем изобретении также предложена композиция, содержащая высокоочищенную плазмидную ДНК, которая, по существу, не содержит примесей или содержит очень низкие концентрации примесей и, таким образом, представляет собой ДНК фармацевтического качества. Композиция плазмидной ДНК фармацевтического качества по настоящему изобретению, таким образом, содержит очень низкие концентрации (< 0,0001%, т.е. < 0,0001 мг на 100 мг плазмидной ДНК) гДНК, РНК и белковых примесей.

Композиция плазмидной ДНК фармацевтического качества, таким образом, содержит менее примерно 0,01 или менее 0,001%, и предпочтительно менее 0,0001%, или предпочтительно менее 0,00008% (< 0,0008%, т.е. < 0,0008 мг на 100 мг плазмидной ДНК) хромосомной ДНК или геномной ДНК.

Композиция плазмидной ДНК фармацевтического качества, таким образом, содержит менее примерно 0,01 или менее 0,001%, и предпочтительно менее 0,0001 или предпочтительно менее 0,00002% (< 0,0002%, т.е. < 0,0002 мг на 100 мг плазмидной ДНК) примесей РНК.

Композиция плазмидной ДНК фармацевтического качества, таким образом, содержит менее примерно 0,0001%, и наиболее предпочтительно менее 0,00005% белковых примесей.

Композиция плазмидной ДНК фармацевтического качества, таким образом, содержит менее 0,1 МЕ/мг эндотоксинов.

Композиция плазмидной ДНК фармацевтического качества, таким образом, содержит преимущественно кольцевую форму и, более конкретно, содержит более 80, 85, 90, 95 или 99% замкнутой кольцевой формы плазмидной ДНК.

Настоящее изобретение также относится к жидкому препарату плазмидной ДНК, который является стабильным и не деградирует при комнатной температуре в течение длительного периода времени и, таким образом, является полезным для хранения плазмидной ДНК, которую используют в научном исследовании и в связанной с ним терапии человека.

Настоящее изобретение, таким образом, относится к препарату стабильной плазмидной ДНК, содержащему плазмидную ДНК, очень разбавленный буферный раствор и солевой эксципиент, где буферный раствор присутствует в такой концентрации, чтобы поддерживать рН указанного препарата или композиции в интервале от 7 до 7,5.

Буферные растворы, которые способны поддерживать рН композиции в интервале от 7 до 7,5, состоят либо из системы кислота/основание, включающей Трис [трис(гидроксиметил)-аминометан] или лизин, и кислоту, выбранную из сильной кислоты (например, соляной кислоты) или слабой кислоты (например, малеиновой кислоты, яблочной кислоты или уксусной кислоты), или из системы кислота/основание, включающей Нерек [2-(4-(2-гидроксиэтилпиперазин)-1-ил)этансульфоновая кислота] и сильное основание (например, гидроксид натрия). Буферный раствор также может включать трис/НС1, лизин/НС1, трис/малеиновую кислоту, трис/яблочную кислоту, трис/уксусную кислоту или Нерек/гидроксид натрия.

Предпочтительно рН поддерживают в интервале от 7 до 7,5 и еще более конкретно при примерно 7,2.

Солевой эксципиент, который можно использовать в препарате по настоящему изобретению, предпочтительно представляет собой ЫаС1 в концентрации от 100 до 200 мМ и предпочтительно в концентрации примерно 150 мМ. Другие солевые эксципиенты могут содержать анионы и катионы, выбранные из группы, состоящей из ацетата, фосфата, карбоната, 8О₄ ^2-, С1^-, Вг^-, ΝΟ3^-, Мд²⁺, Ь1⁺, Ыа⁺, К⁺ и ΝΗ4⁺.

Молярную концентрацию буферного раствора определяют таким образом, чтобы оказывать буферное действие в пределах границ и в объеме, где значение рН стабилизировано от 7 до 7,5. Композиция для хранения стабильной плазмидной ДНК согласно настоящему изобретению, таким образом, содержит плазмидную ДНК, солевой эксципиент и буферный раствор, где буферный раствор присутствует в концентрации вплоть до 1 мМ и предпочтительно от 250 мкМ до 1 мМ, или предпочтительно от 400 мкМ до 1 мМ, чтобы поддерживать рН указанного препарата или композиции в диапазоне от 7 до 7,5. Среди буферных систем согласно изобретению Трис-буферный раствор в концентрации 400 мкМ дает особенно удовлетворительные результаты и, таким образом, является предпочтительным в препарате плазмид по настоящему изобретению.

Как показано в примерах, приведенных ниже, препарат плазмидной ДНК по настоящему изобретению демонстрирует превосходную стабильность и при 4°С, и при комнатной температуре (КТ), например, при 20 или 25°С. В частности, препарат плазмидной ДНК является полезным в течение длительного

- 20 009447 периода времени, 1 месяца, 2 месяцев, 3 месяцев, до 6 месяцев и вплоть до 12 месяцев при 4°С и при 25°С, т.е. КТ.

Настоящее изобретение, таким образом, относится к композиции, содержащей плазмидную ДНК, буферный раствор и солевой эксципиент, где буферный раствор присутствует в концентрации, достаточной для сохранения плазмидной ДНК в стабильной форме при температуре от 4 до 25°С,

Настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей плазмидную ДНК, буферный раствор и солевой эксципиент, где буферный раствор присутствует в концентрации, достаточной для сохранения плазмидной ДНК в стабильной форме при температуре от 4 до 25°С в течение длительного периода времени, 1 месяца, 2 месяцев, 3 месяцев, до 6 месяцев и вплоть до 12 месяцев.

В действительности, плазмидная ДНК, которую хранят при 5°С или при комнатной температуре в течение длительного периода времени, показывает очень низкие скорости депуринизации и открытия кольца, в пределах 20, 15, 10, 5 или не более 1% в месяц.

Композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать адъювант, такой как, например, полимер, выбранный из полиэтиленгликоля, плуроника или полисорбатного сахара, или спирта.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу сохранения плазмидной ДНК в композиции, включающему: а) получение очищенного препарата плазмидной ДНК и б) объединение указанного очищенного препарата плазмидной ДНК с солевым эксципиентом и буферным раствором, который поддерживает рН полученной композиции в интервале от 7 до 7,5.

Настоящее изобретение также относится к способу сохранения плазмидной ДНК в композиции при температуре вплоть до примерно 20°С, включающему: а) получение очищенного препарата плазмидной ДНК, б) объединение очищенного препарата плазмидной ДНК с солевым эксципиентом и буферным раствором, где буферный раствор предствлен в концентрации менее чем 1 мМ, или в интервале от 250 мкМ до 1 мМ и предпочтительно 400 мкМ; и в) хранение композиции плазмидной ДНК при температуре примерно 4 и вплоть до примерно 20°С.

Примеры

Общие методы клонирования и молекулярной биологии

Традиционные методы молекулярной биологии, такие как переваривание рестриктазами, гельэлектрофорез, трансформация в Е. сой, осаждение нуклеиновых килот и тому подобное, описаны в литературе (Машайк е! а1., Т., Е.Е. Егйксй апб 1. 8атЬгоок, 1989. Мо1еси1аг с1ошид: а 1аЬога1огу тапиа1, кесоиб ебйюи. Со1б 8ргтд НагЬог ЬаЬога1огу, Со1б 8ргтд НагЬог ЬаЬога1огу Ргекк, №\ν Уогк; АикиЬе1 Е.М., К. Вгеи1, К.Е. Кшк!ои, Ό.Ό. Мооге, 1.Л. 8тйй, 1.6. 8е1бтаи апб К. 8!гиЬ1. 1987. Сиггеп! рго!осо1к ίη то1еси1аг Ью1оду 1987-1988. 1о1т \УП1еу апб 8оик, Ыете Уогк.). Нуклеотидные последовательности определяли методом терминации цепи согласно уже опубликованному протоколу (АикиЬе1 е! а1., 1987).

Рестриктазы поставлялись фирмой Ыете Еид1апб Вю1аЬк, Веуег1у, МА (Вю1аЬк).

Для проведения лигирований, фрагменты ДНК инкубировали в буфере, содержащем 50 мМ ТрисНС1 рН 7,4, 10 мМ МдС1₂, 10 мМ ДТТ, 2 мМ АТФ в присутствии ДНК-лигазы фага Т4 (Вю1аЬк).

Олигонуклеотиды синтезировали, используя фосфорамидитную химию с фосфорамидитами, защищенными в (3-положении цианоэтиловой группой (8шйа, Ν.Ό., 1. В1ета!, 1. МсМаиик апб Н. Кок!ег, 1984. Ро1утег киррой ойдоиис1ео!1бе купИеМк, XVIII: Ике оГ в-суапое111у1-И^б1а1ку1атто^-тогр1ю1то рйокркогат1бйе оГ беохуиис1еок1бек Гог !1е кугИкекй оГ ΌΝΑ Ггадтеи!к кипркГушд берго!ес!юи апб 1ко1айои оГ !1е йиа1 ргобис!. №с1. Ас1бк Кек., 12, 4539-4557: 6йек, Е\¥. 1985. Абуапсек т аи!ота!еб ΌΝΑ куи!йек1к. Ат. Вю!есЬио1., №у./Эес.) с помощью автоматического синтезатора ДНК Вюкеагсй 8600, используя рекомендации производителя.

Лигированные ДНК или ДНК, тестируемые на эффективность трансформации, использовали для трансформации следующих компетентных штаммов: Е. сой ОН5а[Е/еибА1, 1кбК17, кирЕ44, !Ы-1, гесА1, с|угА96, ге1А1, Δ (1ас2УА-ащЕ)Ш69, беоК, Ф80б1ас (1ас2ДМ15)] (для любой плазмиды Со1 Е1); или Е. сой ХАС-рй (для любой плазмиды, происходящей из рСог).

Минирепараты плазмидной ДНК делают согласно протоколу К1ет и др., 1980.

Для роста штаммов Е. сой используют культуральную среду ЬВ (Машайк е! а1., 1982). Штаммы инкубируют при 37°С. Бактерии высеивают на чашки со средой ЬВ, дополненной подходящими антибиотиками.

Пример 1.

Подведение диаметров к используемым скоростям потока следует из рассчета чисел Рейнолдса в спиралях системы непрерывного лизиса. Так как следующий анализ предполагает, что поведение жидкостей является ньютоновским, приведенные ниже цифры полностью верны только в В1 а и до определенной степени в В2.

Значение числа Рейнолдса позволяет специалисту в данной области точно определить тип поведения, с которым сталкиваются. В данном описании авторы будут рассмотривать только поток жидкости в трубке (гидравлическая техника).

1) Неньютоновская жидкость

- 21 009447

Двумя типами неньютоновских жидкостей, наиболее часто встречающихся в промышленности, являются жидкости Бингема (Вшдйат) и Оствальда де Вале (ОЧ\\'а1й йе \Уас1с).

В этом случае число Рейнолдса (Не) рассчитывают следующим образом:

Вен представляет собой обобщенное число Рейнолдса

Вен = (1/(2^п-3)) х (η/3η+1 )^η х ((ρ х Ό^η х \\'^2-)/т) (1)

Ό - внутренний диаметр поперечного среза (м);

ρ - объемная масса жидкости (кг/м³);

ν - пространственная скорость жидкости (м/с);

η - индекс поведения жидкости (безразмерный);

т - коэффициент плотности (сопийопсу) жидкости (дин-с/см²) и η и т определяют эмпирически (исследование реологического поведения)

2) Ньютоновская жидкость

Что касается первой части, в уравнении (1) мы имеем

Ве = ^внутренний диаметр, μ, ρ и и), так как η и т являются функциями μ.

Ве = (μ х Ό х ρ )/μ (2) ρ - объемная масса жидкости (кг/м³);

μ - вязкость жидкости (Па-с и 1 мПа-с = 1 сП);

Ό - внутренний диаметр поперечного среза (м);

и - средняя полная скорость жидкости (м/с)

Уравнение (1) при η=1 сокращается до уравнения (2).

При О = скорость потока (м³/ч) и 8 = площадь поверхности поперечного сечения (м²), и если μ дана в сП, тогда

Ве = (4 х (0/3600) х ρ )/(( μ /1000) х П х Ό) (3)

В кольцевом трубопроводе поток является ламинарным для числа Рейнолдса менее 2500 и гидравлически ровным турбулентным потоком для числа Рейнолдса от 2000 до 500000. Граница между 2000 и 2500 является осознанно размытой, где для установления того, что может затем произойти, используют оба типа поведения и выбор делают а роЧепоп.

3) Рассчеты

Так как η и т обычно неизвестны, использовали следующие приближения для того, чтобы оценить тенденции:

ньютоновская жидкость (во всех поперечных сечениях);

ρ = 1000 кг/м³ (для всех жидкостей);

μ = 5 сП в В 1а и 40 сП в В1Ь (данные авторов);

2,5 сП в В2 (данные авторов).

Следующие рассчеты проводили, используя уравнение (3) для двух стандартных протестированных конфигураций трубок, названных конфигурация 1 и конфигурация 2 (без трубки В1Ь):

Таблица 2

Спираль	Конфигурация 1	Конфигурация 2
В1а	В2	В1а	В2
Вязкость*(сП)	5	2,5	5	2,5
Диаметр (мм)	12,7	9,5	6	6
Скорость потока (л/ч)	60	105	12	21
Число Рейнолдса	334	1564	141	495
Процесс	ламинарный	ламинарный	ламинарный	ламинарный

В этих двух конфигурациях потоки являются ламинарными на всех стадиях и растворы не смешиваются друг с другом в достаточной мере.

Для других конфигураций трубок (нет трубки В1Ь) мы имеем

- 22 009447

Таблица 3

Спираль	Высокая скорость/ станд. диаметр	Высокая скорость/ внутр, диаметр 16 мм	Высокая скорость/ внутр, диаметр 6 мм
В1а	В2	В1а	В2	В1а	В2
Вязкость* сП)	5	2,5	5	2,5	5	2,5
Диаметр (мм)	12	10	16	16	6	6
Скорость потока (л/ч)	120	210	120	210	120	210
Число Рейнолдса	707	2971	531	1857	1415	4951
Процесс	ламинар	турбулен	ламинар	ламинар	ламинар	турбулен
	ный	тный	ный	ный	ный	тный

Сходные рассчеты провели, используя уравнение (3), для различных конфигураций трубок, когда присутствовали и трубка В 1а, и трубка В1Ь:

Таблица 4

Спираль

Рейнолдса

Процесс

Вязкость* сП) Диаметр (мм) Скорость потока (л/ч) Число

Высокая скорость	В2	Высокая скорость/ макс, перемешивание
В1а	В1Ь
В1а	В1а	В1а
5	5	2,5	5	5	5
6	16	6	3	2	3
120	120	210	120	120	160
1415	531	4951	2829	4244	3773
ламинар	ламинар	турбулен	турбулен	турбулен	турбулен
ный	ный	тный	тный	тный	тный

Ясно, что можно получить определенные заранее значения Рейнолдса путем регулирования диаметров трубок и скоростей потока.

Специалист в данной области может рассмотреть множество комбинаций диаметров и длины В2 или двух секций В1 (В 1а и В1Ь). Например, первую секцию В1 можно уменьшить с 6 до 3 мм для того, чтобы уменьшить длину и увеличить перемешивание. Дополнительно, η и т могут быть определены из исследования реологического поведения жидкостей и использованы для определения правильных характеристик трубок.

Кроме эффективности перемешивания, также можно рассматривать продолжительность перемешивания, которую в некоторых воплощениях настоящего изобретения получают, регулируя длину спиралей.

Диаметр трубок или скорость жидкости, по-видимому, не играют главную роль в уравнении (1) для неньютоновской жидкости (данные не показаны). Другими словами, кажется, что изменение диаметра не является более эффективным, чем изменение скорости потока, если уравнение (1) используют для рассчетов в В1Ь и в В2. Там, где желательными являются высокие скорости потока, можно варьировать диа метр вместе со скоростью потока.

Эти принципы можно использовать в качестве основы для ограничения перемешивания в В1Ь и В2 насколько это возможно для того, чтобы избежать фрагментации гДНК.

Во время лизиса перемешивание может быть достаточно энергичным при условии, что гДНК не денатурирует. Снижение диаметра в начале В1 делает возможным усиление перемешивания (повышенное Не) для того, чтобы в достаточной степени перемешать раствор 2 с клетками. С другой стороны, когда клетки лизируют, перемешивание и силы трения на стенку могут быть уменьшены для предотвращения фрагментации нуклеиновых кислот. Увеличение диаметра позволяет снизить перемешивание (пониженное Не) и трение (пониженная скорость).

М1: перемешивание жидкостей.

В 1а: точное регулирование перемешивания в начале лизиса: феномен конвекции (макросмешива

- 23 009447 ние).

В1Ь: обеспечение денатурации плюс феномена диффузии (микросмешивание).

Предполагают, что обобщенное число Рейнолдса имеет то же самое значение для неньютоновской жидкости, что и классическое число Рейнолдса для ньютоновской жидкости. В частности, предполагают, что пределом для ламинарного режима в трубопроводе с круглым поперечным сечением является Вен < 2300.

Нейтрализацию проводят в В2. Высокие скорости потока имеют тенденцию увеличивать фрагментацию геномной ДНК, вызываемую перемешиванием, которое является слишком энергичным, и силами трения у стенки (механические напряжения). Использование трубки большого диаметра позволяет снизить перемешивание (Ве) и силы трения (скорость). Авторы расположили здесь трубку малого диаметра (6 мм) для того, чтобы избежать недостаточного перемешивания. Наблюдения авторов показали, что для В2 лучше всего было иметь только трубку малого диаметра для того, чтобы сильно и быстро перемешивать нейтрализованный лизат.

Пример 2.

Авторы могут разбить систему лизиса клеток на 5 стадий. В одном конкретном воплощении конфигурация была следующей:

1) Смешивание: клетки (в растворе 1) + раствор 2 (М1 + 3 м 6-мм трубки). Начало лизиса клеток с помощью ДСН, отсутствие риска фрагментации ДНК, пока она не денатурирована.

2) Окончание лизиса и денатурации гДНК (13 м 16-мм трубки).

3) Смешивание: лизат + раствор 3 (М2 + 3 м 6-мм трубки).

4) Сбор нейтрализованного лизата при 4°С

5) Оседание хлопьев и больших фрагментов гДНК в течение ночи при 4°С.

Для проведения непрерывного лизиса можно использовать следующие условия:

Раствор 1: 10 мМ ЭДТА, 9 г/л глюкозы (Глк) и 25 мМ Трис-НС1, рН 7,2.

Раствор 2: 1% ДСН и 0,2 н.ИаОН

Раствор 3: 2М уксусная кислота и 3М ацетат калия.

Скорость потока 60 л/ч: Раствор 1 и раствор 2

Скорость потока 90 л/ч: Раствор 3.

Клетки доводят до 38,5 г/л раствором 1.

Клетки в растворе 1 проходят через 3 сопла, которые диспергируют их в растворе 2, который поступает из противоположного направления.

Смеситель М1 имеет геометрию, позволяющую оптимизировать перемешивание двух жидкостей (см. фиг. 2, схематический рисунок смесителя).

Первая секция трубки после смесителя М1 - это В1 а, а следующая секция - В1Ь.

В1а: длина 3 м, диаметр 6 мм, время пребывания 2,5 с

В1Ь: длина 13 м, диаметр 16 мм, время пребывания 77 с

Способ по настоящему изобретению дает преимущество в показателях эффективности, просуммированное как: дисперсия, быстрое сильное перемешивание и мягкое перемешивание путем диффузии.

При использовании способа по настоящему изобретению увеличивается число лизированных клеток и, следовательно, возрастает количество выделенной пДНК.

Идея диффузии является особенно важной из-за трудностей при смешивании этих жидкостей, обусловленных их свойствами, в особенности вязко-эластичностью.

Способ по настоящему изобретению позволяет ограничить напряжение сдвига и, следовательно, ограничить фрагментацию гДНК, облегчая ее удаление в течение последующей хроматографической очистки.

Проблема заключается в последующем смешивании с раствором 3, который может быть охлажден до 4°С. В одном воплощении в способе по изобретению используют:

смеситель М2, который имеет Υ-образную форму с внутренним диаметром примерно 10 мм; секцию трубки В2, расположенную после смесителя М2. В2: 2 м 6-мм трубки, время пребывания: 1 с.

В табл. 5 ниже даны результаты, полученные в сравнительных тестах, с целью показать преимущества способа непрерывного лизиса по изобретению по сравнению с периодическим лизисом.

- 24 009447

Таблица 5

	Отношение гДНК/пДНК в лизате	Количество экстрагированной плазмиды, на г клеток (мг/г)
Периодический лизис	16,9	1,4
Непрерывный лизис с системой лизиса клеток, описанной в примере 1	1,6	1,9 .

Пример 3.

Используемая колонка представляет собой 1 мл колонку Н1Тгар, активированную ΝΗ8 (Νгидроксисукцинимид, Рйагтас1а), соединенную с перистальтическим насосом (выход < 1 мл/мин). Используемый специфический олигонуклеотид имеет ΝΗ₂ группу на 5' конце, его последовательность является следующей: 5'-6А66СТТСТТСТТСТТСТТСТТСТТ-3' (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1).

В этом примере используют следующие буферы:

Буфер для связывания: 0,2М МаН^з, 0,5М ЫаС1, рН 8,3.

Буфер А: 0,5М этаноламин, 0,5М ЫаС1, рН 8,3.

Буфер В: 0,1М ацетат, 0,5М ЫаС1, рН 4.

Колонку промывают 6 мл 1 мМ НС1, и олигонуклеотид, разбавленный в буфере для связывания (50 нмоль в 1 мл), затем наносят на колонку и оставляют на 30 мин при комнатной температуре. Колонку промывают три раза подряд 6 мл буфера А и затем 6 мл буфера В. Олигонуклеотид, таким образом, ковалентно связывается с колонкой через связь СΟNΗ. Колонку хранят при 4°С в РВ8 (фосфатно-солевой буфер), 0,1% ΝηΝ₃, и ее можно использовать по меньшей мере четыре раза.

Синтезировали два следующих олигонуклеотида: олигонуклеотид 4817: 5'6АТСС6АА6АА6АА6АА6АА6АА6АА6АА6АА6АА6АА6АА6АА6АА6АА6А А6АА66-3' (8 ЕС) ГО ΝΟ: 13) и олигонуклеотид 4818 5'-ААТТССТТСТТСТТСТТСТТСТТСТТСТТСТТСТТСТТСТТСТТСТТСТТСТТСТТС 6-3' (8ЕС) ГО ΝΟ: 14).

При гибридизации и клонировании в плазмиду, эти олигонуклеотиды вводят гомопурингомопиримидиновую последовательность (6АА)₁₇ (8ЕО ГО ΝΟ: 15) в соответствующую плазмиду, как описано выше.

Последовательность, соответствующую этим двум гибридизованным олигонуклеотидам, клонировали в сайте множественного клонирования плазмиды рВК8+ (8ГгаГадепе С1ошпд 8у§Гет, Ьа 1о11а СА), которая несет ген устойчивости к ампициллину. Для этого олигонуклеотиды гибридизовали следующим образом: один мкг этих двух олигонуклеотидов помещали вместе в 40 мл конечного буфера, содержащего 50 мМ Трис-НС1 рН 7,4, 10 мМ МдС1₂. Эту смесь нагревали до 95°С и затем помещали при комнатной температуре для того, чтобы температура медленно снижалась. Десять нг смеси гибридизованных олигонуклеотидов лигировали с 200 нг плазмиды рВК8+ (8ГгаГадепе С1ошпд 8у§Гет, Ьа Йо11а СА), переваренной ВатН1 и ЕсоК! в конечном объеме 30 мкл. После лигирования, аликвоту трансформировали в ЭН5а. Трансформационные смеси переносили на чашки со средой Ь, дополненной ампициллином (50 мг/л) и Xда1 (20 мг/л). Рекомбинантные клоны должны показать отсутствие синего окрашивания на этой среде, в отличие от родительской плазмиды (рВК8+), которая обеспечивает α-комплементацию фрагмента ω βгалактозидазы из Е. со11. После получения минипрепаратов плазмидной ДНК из 6 клонов, все они продемонстрировали исчезновение сайта Рз(1, расположенного между сайтами ЕсоК! и ВатН1 в рВК8+, и увеличение молекулярной массы полосы Руи11 длиной 448 п.н., содержащей сайт множественного клонирования. Отбирали один клон, и соответствующую плазмиду обозначали рХЬ2563. Клонированную последовательность подтверждали секвенированием, используя праймер -20 (5'-Т6АСС66СА6СААААТ6-3' (8ЕО ГО ΝΟ: 16)) (У1ега 1. апй 1. Мекыпд. 1982. ТНе рИС р1а8т1Й8, ап М13тр7-йепуей 5у51ет Гог пъегНоп тиГадепекк апй кедиепсшд \νί11ι купГйейс ишуегаа1 рптегк. 6епе, 19, 259-268) для плазмиды рВК8+ (8!га!адепе С1ошпд 8у§Гет, Ьа Йо11а СА). Плазмиду рХЬ2563 очищали в соответствии с набором νί/агй Медаргер (Рготеда Согр. Майкоп, ν1) согласно рекомендациям поставщика. Затем этот препарат плазмидной ДНК использовали в примерах, описанных ниже.

Плазмиду рХЬ2563 очищали на колонке НГГгар со присоединенным к ней олигонуклеотидом, описанным в 1.1., из раствора, также содержащего плазмиду рВК8+. Буферы, используемые при этой очистке, являются следующими:

Буфер Е: 2М ЫаС1, 0,2М ацетат, рН от 4,5 до 5.

Буфер Е: 1М Трис-НС1, рН 9, 0,5 мМ ЭДТА.

Колонку промывали 6 мл буфера Е, наносили на колонку плазмиды (20 мкг рХЬ2563 и 20 мкг рВК8+ в 400 мкл буфера Е) и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Колонку промывали 10 мл буфера Е и затем проводили элюцию буфером Е. Плазмиды определяли после электрофореза

- 25 009447 на 1%-ном агарозном геле и окрашивания бромистым этидием. Процентное содержание плазмид в растворе оценивали, измеряя их трансформирующую активность на Е. сой.

Начиная со смеси, содержащей 30% рХЬ2563 и 70% рВК8+, на выходе колонки получали раствор, содержащий 100% рХЬ2563. Чистота, оцениваемая по отношению ΟΌ при 260 и 280 нм, возрастает от 1,9 до 2,5, что указывает на удаление загрязняющих белков с помощью этого способа.

Пример 4.

Связывание олигонуклеотида (5'-ОАООСТТСТТСТТСТТСТТСТТСТТ-3' (8ЕС) ГО ΝΟ: 1)) с колонкой проводили, как описано в примере 3. Для связывания олигонуклеотид модифицировали на 5'-конце аминогруппой, связанной с фосфатом спейсера группировкой, содержащей 6 атомов углерода (Моййеб о11допис1еой6е Еигодейес 8А, Бельгия). Плазмиду рХЬ2563 очищали, используя набор Αί/агб Медаргер (Рготеда Согр., Майкоп, А1), согласно рекомендациям поставщика. В этом примере использовали следующие буферы:

Буфер Е: 2 М №С1, 0,2 М ацетат, рН от 4,5 до 5.

Буфер Е: 1 М Трис-НС1, рН 9, 0,5 мМ ЭДТА.

Колонку промывают 6 мл буфера Е, затем на колонку наносят 100 мкг плазмиды рХЬ2563, разбавленной в 400 мкл буфера Е, и инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре. Колонку промывают 10 мл буфера Е, и затем проводят элюцию буфером Е. Количество плазмиды оценивают, измеряя оптическую плотность при 260 нм.

В этом примере связывание осуществляют в буфере, молярность которого по отношению к №1С1 варьирует от 0 до 2М (буфер Е). Выход очистки снижается, когда уменьшается молярность №С1. рН буфера для связывания может варьировать от 4,5 до 5, причем выход очистки лучше при 4,5. Также можно использовать другой буфер элюции с основным рН: элюцию, таким образом, проводили буфером, содержащим 50 мМ борат, рН 9, 0,5 мМ ЭДТА. Связывание олигонуклеотида (5'-ОАООСТТСТТСТТСТТСТТСТТСТТ-3' (8Е^ ГО ΝΟ: 1)) с колонкой проводят, как описано в примере 3. Плазмиду рХЬ2563 очищали, используя набор Αί/агб Медаргер (Рготеда Согр., Майкоп, А1), согласно рекомендациям поставщика. В этом примере использовали следующие буферы:

Буфер Е: 0,1М №С1, 0,2М ацетат, рН 5.

Буфер Е: 1М Трис-НС1, рН 9, 0,5 мМ ЭДТА.

Колонку промывают 6 мл буфера Е, затем на колонку наносят 100 мкг плазмиды рХЬ2563, разбавленной в 400 мкл буфера Е, и инкубируют в течение одного часа при комнатной температуре. Колонку промывают 10 мл буфера Е и затем проводят элюцию буфером Е. Измеряют содержание геномной или хромосомной ДНК Е. сой, присутствующей в образцах плазмиды до и после пропускания через олигонуклеотидную колонку. Количество этой геномной ДНК измеряют с помощью ПЦР, используя праймеры в гене Е. сой да1К, согласно следующему протоколу: Последовательности этих праймеров описаны ИеЬоиск и др. (№.1с1ею Лай Век. 1985, 13, 1841-1853):

5'-ССО ААТ ТСТ ООО ОАС САА АОС АОТ ТТС-3' (8Е^ ГО ΝΟ: 17) и

5'-ССА АОС ТТС АСТ ОТТ САС ОАС ООО ТОТ-3' (8Е^ ГО ΝΟ: 18).

Реакционная среда содержит в 25 мкл буфера для ПЦР (Рготеда Егапсе, Сйайопйегек): 1,5 мМ МдС1₂; 0,2 мМ 6ХТР (Рйагтайа, Ογ^); 0,5 мкМ праймера; 20 ед./мл Тад полимеразы (Рготеда). Реакцию проводят согласно последовательности:

мин при 95°С циклов по 10 с при 95°С с при 60°С мин при 78°С мин при 78°С.

Амплифицированный фрагмент ДНК, имеющий длину 124 п.н., разделяют электрофорезом на 3%ном агарозном геле в присутствии 8уЬгОгееп I (Мо1еси1аг РгоЬек, Еидепе, США) и затем измеряют количественно относительно серии геномной ДНК ИЙгариг из Е. сой штамм В (81дта, пек И4889).

Пример 5.

В этом примере описана очистка плазмидной ДНК из осветленного лизата бактериальной культуры в так называемой системе минипреп: центрифугируют 1,5 мл ночной культуры штаммов ИН5а, содержащих плазмиду рХЬ2563, осадок ресуспендируют в 100 мкл 50 мМ глюкозы, 25 мМ Трис-НС1, рН 8, 10 мМ ЭДТА. Добавляют 200 мкл 0,2М ΝιΟ^ 1 % ДСН, переворачивают пробирки для перемешивания, затем добавляют 150 мкл 3М ацетата калия, рН 5, и переворачивают пробирки для перемешивания. После центрифугирования супернатант выделяют и наносят на олигонуклеотидную колонку, полученную, как описано в примере 1. Связывание, промывки и элюция идентичны таковым, описанным в примере 3. Из 1,5 мл культуры выделяют примерно 1 мкг плазмиды. Полученная плазмида, проанализированная с помощью электрофореза на агарозном геле и окрашивания бромистым этидием, принимает форму единственной полосы суперскрученной кольцевой ДНК. В плазмиде, очищенной этим способом, не обнаруживается никаких следов высокомолекулярной (хромосомной) ДНК или РНК.

- 26 009447

Пример 6.

В этом примере описан эксперимент по очистке плазмидной ДНК, выполненный в тех же условиях, что и в примере 5, начиная с 20 мл бактериальной культуры штаммов ЭН5а. содержащих плазмиду рХЬ2563. Осадок клеток растворяют в 1,5 мл 50 мМ глюкозы, 25 мМ Трис-НС1, рН 8, 10 мМ ЭДТА. Лизис проводят с помощью 2 мл 0,2 М ЫаОН, 1% ДСН, а нейтрализацию - 1,5 мл 3М ацетата калия, рН 5. Затем ДНК осаждают 3 мл 2-пропанола, осадок растворяют в 0,5 мл 0,2М ацетата натрия, рН 5, 0,1М №С1 и наносят на олигонуклеотидную колонку, как описано в примере выше. Связывание, промывку колонки и элюцию проводят, как описано в примере выше, за исключением промывочного буфера, молярность которого относительно №1С1 составляет 0,1М. Полученная плазмида, проанализированная с помощью электрофореза на агарозном геле и окрашивания бромистым этидием, принимает форму единственной полосы суперскрученной кольцевой ДНК. В очищенной плазмиде не обнаруживается никаких следов высокомолекулярной (хромосомной) ДНК или РНК. Переваривание плазмиды рестриктазой дает единственную полосу с ожидаемой молекулярной массой 3 т.п.н. Используемая плазмида содержит кассету, содержащую цитомегаловирусный промотор, ген, кодирующий люциферазу, и гомопурингомопиримидиновую последовательность (САА)₁₇ (8ЕЦ ΙΌ N0: 15), происходящую из плазмиды рХЬ2563. Штамм ΌΗ1 (ΜαηίαΙίκ с1 а1., 1989), содержащий эту плазмиду, культивируют в 7-литровом ферментере. Осветленный лизат получают из 200 грамм клеток: осадок клеток растворяют в 2 л 25 мМ Трис-буфера, рН 6,8, 50 мМ глюкозы, 10 мМ ЭДТА, к которым добавляют 2 л 0,2М ΝαΟΗ. 1% ДСН. Лизат нейтрализуют путем добавления одного литра 3М ацетата калия. После диафильтрации, 4 мл этого лизата наносят на 5 мл колонку ΗιΤηρ-ΝΗδ, связанную с олигонуклеотидом последовательности 5'САСССТТСТТСТТСТТСТТСТТСТТ-3' (8Е0 ΙΌ N0: 1), согласно способу, описанному в примере 3. Промывку и элюцию проводят, как описано в примере выше.

Пример 7.

В этом примере описано применение олигонуклеотида, несущего метилированные цитозины. Последовательность используемого олигонуклеотида является следующей:

5'-САСС^МеСТТ^МеСТТ^МеСТТ^МеСТТ^МеСТТ^МеСТТ^МеСТТ-3' (8ЕС ΙΌ N0: 19).

Этот олигонуклеотид имеет группу ΝΗ₂ на 5'-конце. ^МеС представляет собой 5-метилцитозин. Этот олигонуклеотид делает возможной очистку плазмиды рХЬ2563 в условиях примера 1 буфером для связывания с рН 5 (риск деградации плазмиды при этом снижается).

Пример 8.

В примерах, приведенных выше, используемый олигонуклеотид модифицируют на 5'терминальном конце аминогруппой, связанной с фосфатом через группировку, содержащую 6 атомов углерода: ΝΗ₂-(ίΉ₂)₆. В этом примере аминогруппу связывают с фосфатом 5'-терминального конца через группировку, содержащую 12 атомов углерода: ΝΗ₂-^Η₂)_!2. Связывание олигонуклеотида и пропускание через колонку проводят, как описано в примере 3, буфером Р: 2М №С1, 0,2М ацетат, рН 4,5. Этот олигонуклеотид позволяет получать лучшие выходы очистки: получают выход 53%, тогда как с олигонуклеотидом, содержащим 6 атомов углерода, этот выход имеет порядок 45% в тех же самых условиях.

Пример 9.

Следуя стратегии клонирования, описанной в примере 3, сконструировали две другие плазмиды, несущие гомопурин-гомопиримидиновые последовательности: плазмиду рХЬ2725, которая содержит последовательность (ССА)1₆, (8ЕЦ ΙΌ N0: 20) и плазмиду рХЬ2726, которая содержит последовательность (6А)₂₅(8ЕЦ ΙΌ N0: 21).

Плазмиды рХЬ2725 и рХЬ2726, аналогичныеплазмиде рХЬ2563, сконструировали согласно стратегии клонирования, описанной в примере 3, используя следующие пары олигонуклеотидов:

5986: 5'-6АТСС(6А)₂₅66С-3' (8ЕС ΙΌ N0: 22)

5987: 5'-ААТТССС(ТС)₂₅С-3' (8ЕС ΙΌ N0: 23) 5981: 5'-САТСС(66А)₁₇6С-3' (8ЕС ΙΌ N0: 24) 5982: 5'-ААТТ(ССТ)₁₇СС6-3' (8ЕС ΙΌ N0: 25)

Пару нуклеотидов 5986 и 5987 использовали для конструирования плазмиды рХЬ2726 путем клонирования олигонуклеотидов в сайтах ВатН1 и ЕсоК! рВК8+ (8!га!адепе С1ошпд 8ук!ет, Ьа 1о11а СА), тогда как олигонуклеотиды 5981 и 5982 использовали для конструирования плазмиды рХЬ2725. Использовали те же экспериментальные условия, что и при конструировании плазмиды рХЬ2563, и изменили только пары олигонуклеотидов. Аналогично, клонированные последовательности подтверждали секвенированием плазмид. Это позволяло увидеть, что плазмида рХЬ2725 обладает модификацией, имеющей отношение к ожидаемой последовательности: вместо последовательности ССА, повторенной 17 раз, присутствует ССАСА(ССА)1₅ (8ЕЦ ΙΌ N0: 26).

Пример 10.

Олигонуклеотиды, образующие тройные спирали с этими гомопуриновыми последовательностями, связывали с колонками НГТгар согласно методике, описанной в примере 1.1. Для очистки плазмиды рХЬ2725 использовали олигонуклеотидную последовательность 5'-ААТСССТССТССТССТССТССТССТ-3' (8Е0 ΙΌ N0: 27), и олигонуклеотидную последовательность 5'АСТССТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСТ-3' (8Е0 ΙΌ N0: 28) использовали для очистки плазмиды рХЬ2726.

Две колонки, полученные посредством этого, обеспечивали очистку соответствующих плазмид согласно методике, описанной в примере 2, со следующими буферами:

Буфер Р: 2М ЫаС1, 0,2 М ацетат, рН 4,5.

Буфер Е: 1М Трис-НС1, рН 9, 0,5 мМ ЭДТА.

Полученные выходы составляли 23 и 31% для рХЬ2725 и рХЬ2726 соответственно.

Пример 11.

Этот пример иллюстрирует влияние длины специфической последовательности, присутствующей в плазмиде, на выходы очистки.

Репортерный ген, используемый в этих экспериментах для демонстрации активности композиций по изобретению, представляет собой ген, кодирующий люциферазу (Ьис).

Плазмида рХЬ2621 содержит кассету, содержащую цитомегаловирусный промотор (СМУ) из 661 п.н., экстрагированную из рсПЫА3 (1пуйгодеп Согр., 8ап О|едо. СА) путем расщепления рестриктазами М1и1 и НтбШ, клонированную выше гена, кодирующего люциферазу, в сайтах М1и1 и НтбШ в векторе рСЬ базового вектора (Рготеда Согр., Мабкоп, XVI). Эту плазмиду сконструировали, используя стандартные методы молекулярной биологии.

Плазмиды рХЬ2727-1 и рХЬ2727-2 сконструировали следующим образом:

Два микрограмма плазмиды рХЬ2621 линеаризовали с помощью ВатН1; фермент инактивировали обработкой при 65°С в течение 10 мин; в то же самое время гибридизировали олигонуклеотиды 6006 и 6008, как описано для конструирования плазмиды рХЬ2563. 6006: 5'-САТСТ(САА)_!7СТССАСАТСТ-3' (8ЕС) ГО N0: 29) 6008: 5'-САТСАСАТСТССАС(ТТС)1₇А-3' (8ЕС) ГО N0: 30).

Эту гибридизационную смесь клонировали на ВатН1 концах плазмиды рХЬ2621 и после трансформации в ЭН5α идентифицировали рекомбинантные клоны посредством анализа рестриктазой Ркб, так как олигонуклеотиды включают сайт Ркб. Выбирали два клона и подтверждали нуклеотидную последовательность клонированного фрагмента с использованием праймера (6282, 5'АСАСТСАТААСТССССССАСС-3' (8Е0 ГО N0: 31)) в качестве праймера реакции секвенирования (VIега 1. апб 1. Мекктд, 1982. Тйе рИС р1акт1б8 ап М13тр7-бепуеб кук1ет Еог ткейюп тШадепекк апб кес.|иепстд \νί11ι кугИйебс пп|уегка1 рптегк. Сепе, 19:259-268).

Первый клон (рХЬ2727-1) содержит последовательность САА, повторенную 10 раз. Второй клон (рХЬ2727-2) содержит последовательность 5'-СААСААСАС(САА)₇ССААСАСАА-3' (8Е0 ГО N0: 32).

Используют колонку, такую как колонка, описанная в примере 3, с которой связан олигонуклеотид 5'-САСССТТСТТСТТСТТСТТСТТСТТ-3' (81У) ГО N0: 1).

Плазмида рХЬ2727-1 несет 14 повторов последовательности САА. Олигонуклеотид, описанный выше, который содержит только 7 повторов соответствующей гибридизационной последовательности СТТ, может, следовательно, гибридизироваться с плазмидой в 6 различных положениях. Плазмида рХЬ2727-2, напротив, обладает гибридизационной последовательностью (САА)₇ (8Е0 ГО N0: 36) той же длины, что и длина олигонуклеотида, связанного с колонкой. Этот олигонуклеотид может, следовательно, гибридизироваться только в одном положении в рХЬ2727-2.

Эксперимент идентичен эксперименту, описанному в примере 4, со следующими буферами:

Буфер Р: 2М №С1, 0,2 М ацетат, рН 4,5.

Буфер Е: 1М Трис-НС1, рН 9, 0,5 мМ ЭДТА.

Выход очистки составляет 29% с плазмидой рХЬ2727-1 и 19% с плазмидой рХЬ2727-2.

Используемые клетки представляют собой клетки N14 ЗТЗ, инокулируемые за день до эксперимента в 24-луночные культуральные планшеты из расчета 50000 клеток/лунку. Плазмиду разбавляют в 150 мМ №1С1 и смешивают с липофектантом КРК115335. Используют отношение положительных зарядов липофектанта к отрицательным зарядам ДНК, равное 6. Смесь встряхивают (на уойех), оставляют на 10 минут при комнатной температуре, разбавляют в среде без фетальной телячьей сыворотки и затем добавляют к клеткам в соотношении 1 мкг ДНК на культуральную лунку. Через два часа при 37°С добавляют 10% об./об. фетальной телячьей сыворотки и инкубируют клетки в течение 48 ч при 37°С в присутствии 5% СО2. Клетки дважды промывают РВ8 и измеряют активность люциферазы согласно описанному протоколу (набор Рготеда, Рготеда Согр., Мабкоп, М1) на люминометре Бита! ЬВ9501 (ЕС апб С Вепйо1б, Еугу). Плазмида рХЬ2727-1, очищенная как описано в примере 8.2, дает выходы трансфекции, в два раза более высокие, чем выходы трансфекции, полученные с той же плазмидой, очищенной с использованием набора Χνί/агб Медаргер (Рготеда Согр. Мабкоп, М1).

Пример 12.

Следующий пример демонстрирует очистку плазмид, происходящих из рС0Я, с использованием аффинной хроматографии с образованием тройной спирали. Показали, что эта методика удаляет загрязнения нуклеиновыми кислотами (особенно геномную ДНК и РНК хозяина) до уровней, которые не были достигуты традиционными хроматографическими методами.

Триплексный аффинный гель синтезировали с 8ерйасгу1 8-1000 8Р (Атегкйат-Рйагтааа Вю1ес11) в качестве хроматографического матрикса. 8ерйасгу1 8-1000 сперва активировали мета-перйодатом натрия

- 28 009447 (3 мМ, комнатная температура, 1 ч) в 0,2М ацетате натрия (рН 4,7). Затем связывали олигонуклеотид через его 5'-ΝΗ₂ концевую группировку с альдегидными группами активированного матрикса с помощью восстановительного аминирования в присутствии аскорбиновой кислоты (5 мМ), как было описано ранее для связывания белков (Ноткеу е! а1., 1. 1ттипо1. МеИобк, 1986, 93, 83-88). Гомопиримидиновый олигонуклеотид, используемый в этих экспериментах (от ЕигодеЫес, очищенный ВЭЖХ), имел последовательность, которая была комплементарна короткой 14-мерной гомопуриновой последовательности (5'ААСААААААААСАА-3') (ЗЕО ГО N0: 10), присутствующей в точке инициации репликации (опу) плазмиды рСОК (ЗонЬпег е! а1., Сене Тйегару, 1999, 6, 1482-1488). Как обсуждали выше, последовательность гомопиримидинового олигонуклеотида представляет собой 5'-ТТСТТТТТТТТСТТ-3' (ЗЕО ГО N0: 11).

Следующие плазмиды подвергали хроматографии: рХЬ3296 (рСОК без трансгена, 2,0 т.п.н.), рХЬ3179 (рСОК-ЕСЕ, 2,4 т.п.н.), рХЬ3579 (рСОК-УЕСЕВ, 2,5 т.п.н.), рХЬ3678 (рСОК-АЕР, 3,7 т.п.н.), рХЬ3227 (рСОК-1ас2 5,4 т.п.н.) и рХЬ3397 (рСОК-Вбе1е!еб ЕУШ, 6,6 т.п.н.). Все эти плазмиды очищали на двух стадиях анионообменной хроматографии из осветленных лизатов, полученных как описано в примере 4. Также исследовали плазмиду рВКЗ+ (рВЫекспр! II КЗ + от З^^де^), происходящую от Со1Е1 плазмиды, очищенную ультрацентрифугированием в СкС1. Все использованные плазмиды находились в их суперскрученном (более 95%) топологическом состоянии.

В каждом эксперименте по очистке плазмидной ДНК на аффинную колонку, содержащую вышеупомянутый олигонуклеотид 5'-ТТСТТТТТТТТСТТ-3' (ЗЕО ГО N0: 11), наносили 300 мкг плазмидной ДНК в 6 мл 2 М №С1, 0,2 М ацетата калия (рН 5,0) со скоростью потока 30 см/ч. После промывки колонки 5 объемами того же буфера, связанную плазмиду элюировали 1М Трис/НС1, 0,5 мМ ЭДТА (рН 9,0) и количественно оценивали с помощью УФ (260 нм) и ионообменной хроматографии на колонке МзШроге Сен-Рак (Магдие! е! а1., ВюРйагт, 1995, 8, 26-37). Выходы плазмид в собранной фракции составляли 207 мкг для рХЬ3296, 196 мкг для рХЬ3179, 192 мкг для рХЬ3579, 139 мкг для РХЬ3678, 97 мкг для рХЬ3227 и 79 мкг для рХЬ3397.

Когда на этой колонке хроматографировали рВКЗ, не смогли определить связывание плазмиды (< 3 мкг). Это указывает на то, что олигонуклеотид 5'-ТТСТТТТТТТТСТТ-3' (ЗЕО ГО NО: 11) образует стабильные триплексные структуры с комплементарной 14-мерной последовательностью 5'ААСААААААААСАА-3' (ЗЕО ГО NО: 10), присутствующей в рСОК (опу ), но не с близкородственной последовательностью 5'-АСАААААААССА-3' (ЗЕО ГО NО: 8), присутствующей в рВКЗ. Это указывает на то, что введение одной неканонической триады (в данном случае Т*СС) приводит к полной дестабилизации триплексной структуры.

В качестве контроля, не наблюдали связывания плазмиды (< 1 мкг) при хроматографировании рХЬ3179 на контрольной колонке, синтезированной строго в таких же условиях, но без олигонуклеотида.

Оперируя этой колонкой для аффинной очистки при условиях, описанных в данном изобретении, уровень загрязнения геномной ДНК хозяина снизили для препарата рХЬ3296 от 2,6 до 0,07%. Аналогично, уровень загрязнения ДНК хозяина снизили для препарата рХЬ3179 от 0,5 до 0,008% при хроматографировании образца через ту же аффинную колонку.

Пример 13.

Следующий пример демонстрирует очистку плазмид, происходящих из Со1Е1, с использованием аффинной хроматографии с образованием тройной спирали. Показали, что эта методика удаляет загрязнения нуклеиновыми кислотами (особенно геномной ДНК и РНК хозяина) до уровней, которые не были достигнуты традиционными хроматографическими методами.

Триплексный аффинный гель синтезировали путем связывания олигонуклеотида, имеющего последовательность 5'-ТСТТТТТТТССТ-3' (ЗЕО ГО NО: 9), с Зер1асгу1 З-1000 ЗЕ, окисленным перйодатом, как описано в примере выше.

Плазмиды рХЬ3296 (рСОК без трансгена) и рВКЗ, плазмиду, происходящую из Со1Е1, хроматографировали на 1-мл колонке, содержащей олигонуклеотид 5'-ТСТТТТТТТССТ-3' (ЗЕО ГО NО: 9) в условиях, описанных в примере 9. Выходы плазмид в собранной фракции составляли 175 мкг для рВКЗ и менее 1 мкг для рХЬ3296. Это указывает на то, что олигонуклеотид 5'-ТСТТТТТТТССТ-3' (ЗЕО ГО NО: 9) образует стабильные триплексные структуры с комплементарной 12-мерной последовательностью (5'АСАААААААССА-3') (ЗЕО ГО NО: 8), присутствующей в рВКЗ, но не с очень близкородственной 12мерной последовательностью (5'-АСААААААААСА-3') (ЗЕО ГО NО: 34), присутствующей в рСОК. Это показывает, что введение одной неканонической триады (в данном случае С* АТ) может приводить к полной дестабилизации триплексной структуры.

Пример 14.

Посевную культуру получали в колбе Эрленмейера без перегородки с помощью следующего способа. Рабочий банк клеток инокулируют в колбу Эрленмейера, содержащую среду М9тобС5, со скоростью посева 0,2% об./об. Штамм культивируют при 220 об./мин в ротационном шейкере при 37° ± 1°С в течение примерно 18 ± 2 ч до истощения глюкозы. Это дает 200 мл посевной культуры. Ожидается, что оптическая плотность культуры при А₆₀₀ составляет примерно 2-3.

- 29 009447

Затем создают предварительную культуру в первом ферментере. Посевную культуру асептически переносят в предварительный ферментер, содержащий среду М9тобС5 для того, чтобы обеспечить скорость посева 0,2% (об./об.), и культивируют при аэрации и перемешивании. рО₂ поддерживают на уровне более 40% насыщения. Культуру собирают, когда через 16 ч потребляется глюкоза. Это дает примерно 30 л предварительной культуры. Ожидается, что оптическая плотность культуры при А600 составляет примерно 2-3.

Затем создают основную культуру во втором ферментере. 30 л предварительной культуры асептически переносят в ферментер, заполненный 270 л стерилизованной среды ЕшобС2 для того, чтобы обеспечить скорость посева примерно 10% (об./об.). Культивирование начинают периодическим способом для создания некоторой биомассы. Подпитку глюкозой начинают сразу после потребления исходного сахара примерно через 4 ч. Контролируют аэрацию, перемешивание, рО₂ (40%), рН (6,9 ± 0,1), температуру (37± 1°С) и подпитку глюкозой для того, чтобы поддерживать специфическую скорость роста, близкую к 0,09 ч^-1. Культивирование заканчивают примерно через 35 ч после подпитки. Это дает примерно 400 л культуры. Ожидается, что оптическая плотность культуры при А₆₀₀ составляет примерно 100.

Проводят первую стадию разделения, которая называется сбор клеток. Биомассу собирают с помощью центрифуги с коническими перегородками в роторе. Жидкую среду концентрируют в 3-4 раза для того, чтобы удалить использованную культуральную среду, и непрерывно ресуспендируют в 400 л стерильного буфера 81. Это дает примерно 500 л предварительно кондиционированной среды. Сухая масса клеток составляет 25 ± 5 г/л.

Проводят вторую стадию разделения, которую называют стадией концентрирования. После ресуспендирования/гомогенизации в буфере 81, клетки вновь подвергают обработке сепаратором с образованием концентрированной суспензии. Это дает примерно 60-80 л промытой и концентрированной суспензии. Сухая масса клеток составляет 150 ± 30 г/л; масса пДНК составляет 300 ± 60 мг/л.

Затем проводят стадию замораживания. Суспензию асептически переносят в 20-литровые мешки Б1ехЬоу™ (заполненные до 50% от их емкости) и далее замораживают при -20 ± 5°С перед дальнейшей обработкой. Это дает замороженную биомассу. Содержание пДНК составляет 300 ± 60 мг/л; суперскрученная форма составляет более 95%.

Затем проводят стадию оттаивания клеток. Замороженные мешки нагревают вплоть до 20°С, и клеточную суспензию разбавляют до 40 г/л, рН 8,0 100 мМ Трис-гидрохлоридом, 10 мМ ЭДТА, 20 мМ глюкозой, и суспензию оставляют при 20 ± 2°С на 1 ч с перемешиванием перед лизисом клеток. Это дает оттаявшую суспензию биомассы. рН составляет 8,0 ± 0,2.

В течение этой стадии можно использовать температуры примерно 20°С.

Затем проводят стадию щелочного лизиса. Стадия лизиса клеток состоит из прокачивания разбавленной клеточной суспензии через расположенный на одной линии смеситель раствором 0,2 н. ЫаОН 35 мМ ДСН (раствор 82) с последующей непрерывной контактной стадией в спиральной трубке. Непрерывная контактная стадия должна обеспечить полный лизис клеток и денатурацию геномной ДНК и белков. Раствор лизированных клеток смешивают соответственно с раствором 3 (83) охлажденного 3 М ацетата калия - 2 н. уксусной кислоты перед сбором в охлажденный встряхиваемый сосуд. Добавление раствора 83 приводит к осаждению геномной ДНК, РНК, белков и ДСН.

Затем проводят фильтрацию лизата. Нейтрализованный лизат затем инкубируют при 5 ± 3°С в течение 2-24 ч без перемешивания и фильтруют через 3,5 мм сетчатый фильтр для удаления массы осажденного вещества (хлопьевидной фазы) с последующей объемной фильтрацией в качестве стадии окончательной фильтрации. Это дает осветленный лизат с концентрацией суперскрученной плазмиды более 90%.

Затем проводят анионообменную хроматографию. Раствор прозрачного лизата разбавляют очищенной водой до намеченного значения проводимости 50 мС/см, фильтруют через двухслойный фильтр (3 мкм - 0,8 мкм) и наносят на колонку для анионообменной хроматографии. Используют 300-мм колонку, заполненную 11,0 л смолы Бгас(оде1® ТМАЕ Н1Сар (М) (Мегск; #1.10316.5000). Осветеленный лизат наносят на колонку и проводят элюцию, используя ступенчатый градиент ЫаС1. Основную массу примесей, связавшихся с колонкой, элюируют раствором №101 при примерно 61 мС/см, и плазмидную ДНК элюируют раствором Хао при примерно 72 мС/см. Это дает элюат ионообменной хроматографии, имеющий высокую концентрацию плазмидной ДНК.

После этого следует триплексная аффинная хроматография. Элюат из колонки для анионообменной хроматографии разбавляют примерно 0,5 объемами раствора 500 мМ ацетата натрия (рН 4,2), содержащего 4,8М ЫаС1, и прокачивают через колонку для триплексной аффинной хроматографии, уравновешенную 50 мМ ацетатом натрия (рН 4,5), содержащим 2М ЫаС1. Колонка имеет диаметр 300 мм и содержит 10,0 л геля для аффинной хроматографии с образованием тройной спирали 8ерйасгу1™ 8-1000 (Атегайат Вюкаепсек; Рщса(атау, N1). Колонку промывают раствором 50 мМ ацетата натрия (рН 4,5), содержащего 1 М №С1, и ΝΥ1Ρ6Ρ элюируют 100 мМ Трис-буфером (рН 9,0), содержащим 0,5 мМ ЭДТА. Это дает элюат после триплексной аффинной хроматографии, имеющий высокую концентрацию плазмиды.

- 30 009447

Затем следует стадия гидрофобной хроматографии. Элюат из колонки аффинной хроматографии разбавляют 3,6 объемами раствора 3,8 М сульфата аммония в Трис-буфере (рН 8,0). После фильтрации через 0,45 мкм фильтр, фильтрат наносят со скоростью 60 см/ч на гидрофобную колонку (диаметр 300 мм), заполненную 9,0 л смолы Тоуореаг1® Ви1у1-6508 (ТокоН согр., Сгоуе Сйу, ОН). Колонку промывают раствором сульфата аммония при примерно 240 мС/см и ЫУ1ЕСЕ элюируют сульфатом аммония при 220 мС/см. Это дает элюат после гидрофобной хроматографии, свободный от релаксированных форм.

Согласно предпочтительному воплощению проводят дополнительную стадию диафильтрации. Для применения в этом процессе подходят стандартные, имеющиеся в продаже материалы для диафильтрации, согласно стандартным методам, известным в данной области. Предпочтительным способом диафильтрации является диафильтрация с использованием ультрафильтрационной мембраны, имеющей порог отсечения молекулярной массы в интервале от 30000 до 500000, в зависимости от размера плазмиды. Эта стадия диафильтрации обеспечивает обмен буфера, и затем проводят концентрирование. Элюат со стадии 12 концентрируют в 3-4 раза путем фильтрации в тангенциальном потоке (порог отсечения мембраны - 30 кДа) до целевой концентрации примерно от 2,5 до 3,0 мг/мл, и концентрат обменивают с буфером путем диафильтрации при постоянном объеме с 10 объемами солевого раствора и доводят до целевой концентрации плазмиды солевым раствором. Концентрацию ЫУ1ЕСЕ рассчитывают из поглощения образцов концентрата при 260 нм. Раствор ЫУ1ЕСЕ фильтруют через 0,2 мкм капсульный фильтр и хранят в контейнерах в холодном помещении при 2-8°С до дальнейшей обработки. Это дает очищенный концентрат с концентрацией плазмидной ДНК суперскрученной плазмиды приблизительно 70, 75, 80, 85, 90, 95 и предпочтительно 99%. Общий выход плазмиды с помощью этого способа составляет по меньшей мере 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 и 80% со средним выходом 60%.

Пример 15.

Способ согласно изложенному выше примеру, включающий стадию ионообменной хроматографии, стадию аффинной хроматографии с образованием тройной спирали и стадию гидрофобной хроматографии дает препарат более очищенной плазмидной ДНК по сравнению с ранее известными способами. Этот новый способ сравнили с ранее известными способами, и он дал препараты пДНК, имеющие значительно меньшие количества геномной ДНК, РНК, белка и эндотоксина. Это отражено на фиг. 6. Эти эксперименты показывают, что АЕС, ТНАС и Н1С дают неожиданно более высокий выход очистки по сравнению с некоторыми двухстадийными комбинациями для эффективного удаления всех примесей. Сочетание этих стадий дает очевидный синергизм в показателях эффективности отделения плазмидной ДНК от других биологических веществ и примесей, таких как белок и эндотоксин, РНК и геномная ДНК, а также открытая кольцевая плазмида. Кроме того, комбинация синергических стадий, т. е. АЕС/ТНАС/Н1С, согласно настоящему изобретению делает возможным не только получение высокоочищенной плазмидной ДНК фармацевтического качества, но также композиций высокоочищенной и полностью суперскрученной, более чем 80, 85, 90, 95 и более чем 99% плазмидной ДНК.

Пример 16.

Способ согласно изложенному выше примеру, который включает стадию ионообменной хроматографии, стадию аффинной хроматографии с образованием тройной спирали и стадию гидрофобной хроматографии для получения препарата высокоочищенной плазмидной ДНК сравнивают с ранее известными способами. Как показано на фиг. 3, способ по настоящему изобретению неожиданно дает препараты пДНК, имеющие значительно меньшие количества геномной ДНК, РНК, белка и эндотоксина в интервале очень низких концентраций. Также, как показано на фиг. 4, способ по настоящему изобретению демонстрирует качество полученного продукта при его количестве вплоть до 10 г.

Пример 17.

Стадию диафильтрации, как описано в примере 14, проводят согласно следующим условиям: использовали буфер для стадии (а) и для стадии (б) с целью определения наилучших условий для

3) первой диафильтрации (стадия а) против 12,5-13,0 объемов 50 мМ Трис/НС1, 150 мМ ЫаС1, рН 7,4 (буфер I) и

4) проведения второй диафильтрации (стадия б) ретентата со стадии а) выше против 3,0-3,5 объемов солевого эксципиента (150 мМ №1С1).

Эта альтернативная стадия диафильтрации согласно настоящему изобретению эффективно и тщательно удаляет сульфат аммония и ЭДТА. Также после этих стадий диафильтрации получают подходящую целевую концентрацию ЫаС1 примерно 150 мМ и конечную концентрацию Трис от 400 мкМ до 1 мМ. Примеры композиций препаратов плазмидной ДНК даны в табл. 6 ниже.

- 31 009447

Таблица 6

Соединения
1-я диафильтрация
Сульфат аммония	10 мкМ
ЭДТА	4 мкМ
Трис	50 мМ
№С1	154 мМ

<онечная концентрация
2-я диафильтрация	Активный фармацевтический ингредиент
< 1 мкМ	< 1 мкМ
< 1 мкМ	< 1 мкМ
1,48 мМ	740 мкМ
154 мМ	154 мМ

Пример 18.

Техническую партию плазмидной ДНК ЫУ1РСР АФИ (активные фармацевтические ингредиенты), названную Ь806, производят согласно примеру 13 со стадией процесса диафильтрации, описанного в примере 17. Элюат сначала диафильтруют при содержании АФИ примерно 2 мг/мл против примерно 13 объемов буфера I, и образующийся в результате ретентат подвергали диафильтрации против примерно 3 объемов солевого эксципиента. Конечный ретентат затем фильтровали через 0,2 мкм фильтр и доводили до 1 мг/мл. Конечные АФИ (рН 7,24) хранили в стеклянной бутыли Дюрана при +5°С до производства желательного продукта.

Исследование стабильности проводили на образцах Ь806, хранящихся в стеклянных бутылях Дюрана (АФИ), а также в 8-мл сосудах, используемых для производства лекарственного продукта. Через 90 суток при +5°С степень и депуринизации и раскрытия-циркуляризации для всех образцов была едва определимой (не более 0,3%). Через 90 суток при 25°С скорости депуринизации и раскрытияциркуляризации образцов Ь806 также были довольно низкими.

Рассчитанные из этого исследования, скорости депуринизации и раскрытия-циркуляризации составляли не более 1% в месяц.

Это исследование продемонстрировало, что профиль стабильности плазмидной ДНК ЫУ1РСР является очень устойчивым в препарате по настоящему изобретению, где значения рН поддерживают примерно 7-7,5. В то время как скорости депуринизации и внесения однонитевых разрывов в плазмиду обычно сильно ускоряются при +25 °С заявитель показал, что плазмидная ДНК остается стабильной в недеградированной форме в течение длительного периода времени даже при комнатной температуре.

Данное описание изобретения следует понимать в свете идей ссылок, процитированных в описании. Воплощения в описании дают иллюстрацию воплощений изобретения, и их не следует истолковывать, как ограничивающие область изобретения. Квалифицированный специалист легко узнает, что многие другие воплощения охвачены изобретением. Все публикации и патенты, процитированные в этом описании, включены в него посредством ссылки во всей их полноте. В той мере, в которой материал, включенный посредством ссылки, противоречит или не согласуется с этим описанием, описание будет заменять любой такой материал. Цитирование в данном описании любых ссылок не является признанием того, что такие ссылки являются предшествующим уровнем техники в отношении настоящего изобретения.

Если не указано иначе, все числа, выражающие количества ингредиентов, условия реакции и так далее, используемые в этом описании изобретения, включая формулу, следует понимать как модифицированные во всех случаях термином примерно. Соответственно, если не указано иначе, числовые параметры являются приближениями и могут варьировать в зависимости от желательных свойств, которые стараются получить с помощью настоящего изобретения. В самом крайнем случае и не в качестве попытки ограничения применения доктрины эквивалентов к объему притязаний, каждый числовой параметр следует истолковывать в свете количества значимых цифр и обычных подходов округления.

Если не указано иначе, следует понимать, что термин по меньшей мере, предшествующий ряду элементов, относится к каждому элементу в этом ряду. Специалисты в данной области узнают или смогут установить, используя не более чем рутинное экспериментирование, многие эквиваленты конкретных воплощений изобретения, описанных в данном изобретении. Подразумевается, что такие эквиваленты входят в объем следующей формулой изобретения.

Ссылки

Патенты:

νθ 98/00815 (ιιΐίΐίζαΐίοη ок Т [Тее], Райеиг Мепеих 8егит8 е( Уассиъ [8ега анй Уасстек]) νθ 96/02658, Л.Ь. Ьее е( а1., А Ме11юй ког Ьагде 8са1е Р1акт1й Ри^^ί^саΐ^οη (1996).

νθ 97/23601, КС. Vаη е! а1., МеШой ког Ьуктд Се11з (1997).

νθ 99/29832, Ό.8. МсЫеШу, Ме11юй ког рипкутд р1а8т1й ΌΝΑ анй р1а8т1й ΌΝΑ киЬкНнзНаНу кгее ок деиотю ΌΝΑ (1999).

и.8. Ра1егИ №. 6214568, Ό.8. Мс№Шу Ме11юй ког рипкутд р1а8т1й ΌΝΑ анй р1а8т1й ΌΝΑ 8ΐώ8ΐηη- 32 009447 йа11у Ггее оГ депотк ЭЫА (2001).

Публикации:

Н.С. ВппЬопп апб 1. Эо1у, А гар1б а1ка1ше ехГгасРоп ргосебиге Гог ксгеешпд гесотЫпап! р1акт1б ЭЫА Ыис1ек Ааб Кекеагсй 7(6): 1513-1523 (1979).

Ό. 8!ерйеп8оп, Е. Ыогтап апб КН. Ситттд, 8йеаг (Ыскептд оГ ЭЫА ш 8Ό8 1ука1ек Вюкерагайоп 3:285-289 (1993).

М.8. Ьеуу, ЬА8. С1ссо11п1, 8.8.8. Уть !Т. Ткак Ν. Тйсйепег-Ноокег, Р. Ауа/ί 811ат1ои апб Р. ОиппШ, Тйе еГГес1к оГ та1епа1 ргорегйек апб Пи1б По\у 1п(епкНу оп р1акт1б ЭЫА гесоуегу биппд се11 1νκίκ Сйетка1 Епдшеегшд 8аепсе 54:3171-3178 (1999).

Перечень последовательностей <110> йен се! 1 5А5 <120> мегИос) οί Ргерага1поп РкагтасеиХтса! огабе Р1азппб смд <130> 6С030О1-РСТ <150> 05 60/503,464 <151> 2003-09-17 <150> 115 60/563,008 <151> 2004-04-19 <160> 34 <170> ратеп-ып νβπδίοη 3.2 <210> 1 <211> 25 <212> 0ΝΑ <213> ΑΓΐτίι ста!

<220>

<223> 5упхЬех1с 011допис1еохтбе <400> 1 даддстСсС·!: сХХсХХсХХс ΐΐεΐΐ 25 <210> 2 <211> 19 <212> ΟΝΑ <213> Агст Ή ст а!

<220>

<223> ЗугтеЬё-Ст с ойдописТеоттбе <400> 2 аадддаддда ддададдаа 19 <210> 3 <211> 19 <212> 0ΝΑ <213> ΑΓΐτίι ста!

<220>

<223> БупТНеХтс оИдописТеоБтбе <400> 3 ааддададда дддадддаа 19 <210> 4 <211> 19 <212> ОНА <213> ΑΓΐίΐι ста1 <22О>

<223> БупгйеХтс оИдописЗеоТтбе <400> 4

ГСддтдгдд-е дддхдддгх 19 <210> 5 <211> 19

- 33 009447 <212> ΟΝΑ <213> αγϊΉι ста!

<220>

<223> зупхИехтс оНдописТеохтбе <400>5 сххсссдаад ддадааадд19 <210> Й <211>19 <212> βΝΑ <213> Аггтртста!

<22О>

<223> зупхКехтс о!тдопис1еох1бе <400> б даадддсХХс ссХсХХХсс19 <210>7 <211>13 <212> ϋΝΑ <213> АггтНста!

<22О>

<223> ЗупХНеХтс о!тдопис1еохтбе <400> 7 даааааддаа дад 13 <210> 8 <211> 12 <212> ΟΝΑ ' <213> ΑΓΐί Ή с1 а1 <220>

<223> зупХбеХтс о!1допис1еохтбе <400>8 адааааааад да12 <210>9 <211> 12 <212> ΟΝΑ <213> АгхтРтста1 <22О>

<223> ЗупхЬеХтс о!тдопис!еохтбе <400>9 хехххсхххс сг12 <210> 10 <211>14 <212> ϋΝΑ <213> АГСт-Ртста!

<22О>

<223> зупхИехтс оНдописТеохтбе <400> 10 аадааааааа адаа 2.4

- 34 009447

<210>	11
<211>	14
<212>	ΟΝΑ
<213>	АгХтТтста!
<220>
<22 3>	ЗупХЬеХтс пис1еохт6е
<400>	11
ххсххххххх ХсХХ				14
<210>	-.12
<2ΐι>	17
<212>	ϋΝΑ
<213>	Агхт-Нста!
<220>
<22 3>	зупхЬехтс о!тдопис1еохтбе
<400>	12
ааааааддда агааддд				17
<210>	13
<211>	58
<212>	ϋΝΑ -
<213>	АГХ1ΪΊ СТа!
<22О>
<223>	ЗупхЬехтс оИдописТеохтбе
<400>	13
дахссдаада адаадаадаа даадаадаад	аадаадаада	адаадаадаа	даадаадд	58
<210>	14
<211>	58
<212>	ΟΝΑ
<213>	Агхп Стета!
<220>
<223>	зупхНехтс о1тдопцс1еохтс1е
<400>	14
ааххссххсх хсххсххсхх сххсххсххс	ХХСХХСХХсХ	ХСХХСХХСХХ	сххсххсд	58
<210>	15
<211>	51
<212>	ΟΝΑ
<213>	ΑΓΕΙίίст а!
<22О>
<223>	ЗупхКеХт с о! т допис!еохт бе
<400>	15
даадаадаад аадаадаада адаадаадаа	даадаадаад	аадаадаада	а	51
<210>	16
<211>	17
<212>	ΟΝΑ
<213>	АгХтСтста!
<22О>

- 35 009447 <223> зупгйегтс оНдолис! еоИтбе <400> 16 йдассддсад саааатд <210> 17 <211> 27 <212> ϋΝΑ <213> ΑΓΐΐΪΊ ст а!

<22О>

<223> зуптЬеП’с оНдопис1еоТ1бе <400>17 ссдаагссСд дддассааад садтгсс27 <21О>18 <211>27 <212> ЭИА <213> АгГ1Яс1а1 <22О>

<223> БупгЬехтс оИдолисТеохтбе <400> 18 ссаадсеьса сЬдгссасда сдддьдг <210> 19 <211> 25 <212> ΟΝΑ <213> АгГтЕтста!

<22О>

<223> 5-ше-гйу1суСО51пе <400> 19 даддсСтстт сггсгсссгс ντσεΐ 25 <210> 20 <211> 48 <212> ОНА <213> Агг1Наа1 <220>

<223> ЗупсЬеттс о!тдописТеогтбе <400>20 ддаддаддад даддаддадд аддаддадда ддаддаддад даддадда48 <210> 21 <211>50 <212> ϋΝΑ <213> Аг-ст£1с1а1 <220>

<223> ЗупсНеЪтс оНдописТеоСтбе <400> 21 дадададада дадададада дадададада дадададада дадададада <210> 22 <211> 58

- 36 009447 <212> ΟΝΑ <213> αγϊί 1п ст а!

<22О>

<223> 5уп1(1е1тс οΊ 1 дописЧеап’бе <400> 22

датссдадад ададададад ададададад	ададададад	ададададад	адададдд	58
<21О>
<211>	58
<212>	ϋΝΑ
<213>	Агст £1С1 аЧ
<22О>
<223>	гупхйегтс оЧЧдописЧеогтбе
<400>	23
аагссссгсг сСстсгсгсх сгегсссгст	сгсгс-сс-ьст	сТстсГсгсС	εΐεΐοΐχρ	58
<210>	24
<211>	58
<212>	ϋΝΑ
<213>	АгпЧп'стаЧ
<220>
<223>	5упХ:£1е1:л с оЧ ί дописЧ еоДт бе
<400>	24
да^ссддадд аддаддадда ддаддаддад	даддаддадд	аддаддадда	ддаддадд	58
<210>	25
<211>	58
<212>	ОМА *
<213>	ΑΓΐίίίσί аЧ
<220>
<223>	ЗупхЬегк οΐί дописЧ еоп'бе
<400>	25
аахгссгссг сс1:сс±сс±с сгссСссСсс	Исс1ссгсс1:	ссгссссстс	сиссгссд	58
<210>	26
<211>	50
<212>	ϋΝΑ
<213>	АггЖспаЧ
<220>
<223>	5уггСНе1л'с о11 дописЧ βοΐΐбе
<400>	26
ддададдадд аддаддадда ддаддаддад	даддаддадд	аддаддадда		50

<210> 27 <211> 25 <212> ОМА <213> АИгНЧстаЧ <220>

<223> зупгйеМ’с оЧтдописЧеотЧ бе <400> 27 аабдссгсгс ссгссгссгс сгссг 25

- 37 009447 <210> 28 <211> 26 <212> ΟΝΑ .

<213> АгГИтсча!

<220>

<223> зуЕтсйегчс о1чдопис!еогчбе <400> 28 адхдсьсел скллс-ссч: сесест 26 <210> 29 <211> 66 <212> 0ΝΑ <213> αγχί Ή сча!

<220>

<223> ЗуптйеЕчс оЗчдописТеотчбе <400> 29 дагсЕдаада адаадаадаа даадаадаад аадаадаада адаадаадаа даадаасЕдс 60 адагсг 66 <210> 30 .

<211> 66 <212> ϋΝΑ <213> АгхчЕчсча! .

<220>

<223> зуп±Не11'с оТчдопис1ео1чбе <400> 30 ^х да-Ьсадагс-е дсадЕЕсхЕс ΐΐίΐΐοΐΐοΐ ΐοΐΐοΐΐοΐΐ сттстгсгСс ΐΐεΐΐσΐΐοτ 60 гс«са 66 <210> 31 <211> 21 <212> 0ΝΑ <213> дгсч-Рчсча!

<220>

<223> ЗупЕНегчс оИдописЧеоЫбе <400> 31 асадгсагаа дЕдсддсдас д 21 <210> 32 <211> 39 <212> ΟΝΑ <213> АгЕчбчсч'а!

<22 0>

<223> ЗупЕКепс оИдопис1еоЕ1бе <400> 32 даадаададд аадаадаада адаадаадаа ддаададаа 39 <210> 33 <211> 21

Claims (34)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Устройство для лизиса клеток, включающее:

   а) средство для создания турбулентного потока с целью быстрого смешивания клеточной суспензии с раствором, который лизирует клетки, и

   б) средство для создания ламинарного потока, соединенное со средствами создания турбулентного потока для того, чтобы обеспечить инкубацию смеси, образующейся в средстве создания турбулентного потока, без существенного перемешивания.
2. 2. Устройство по п.1, дополнительно включающее средство для добавления второго раствора, который нейтрализует лизирующий раствор, соединенное со средством создания ламинарного потока.

   - 38 009447
3. 3. Способ выделения плазмидной ДНК из клеток с помощью устройства по п.2, включающий:

   а) смешивание клеток с щелочным лизирующим раствором в средстве для создания турбулентного потока; и

   б) нейтрализацию щелочного лизирующего раствора путем добавления кислотного раствора.
4. 4. Устройство для непрерывного щелочного лизиса клеток, включающее первый смеситель или инжектор, способный впрыскивать щелочную жидкость в направлении, противоположном впрыскиванию клеточной суспензии;

   первую трубку малого диаметра для того, чтобы создавать в смеси турбулентный поток;

   вторую трубку большого диаметра для того, чтобы создавать в смеси ламинарный поток;

   второй смеситель или инжектор для впрыскивания нейтрализующего раствора на одном конце и сбора смеси на другом конце.
5. 5. Устройство по п.4, где диаметр трубок и инжекторов выбран таким образом, чтобы контролировать скорости потока смесей в турбулентном и ламинарном потоках.
6. 6. Устройство для непрерывного щелочного лизиса клеток по п.4 или 5, дополнительно включающее насос для впрыскивания или закачивания клеточной суспензии для контакта в направлении, противоположном щелочному раствору.
7. 7. Устройство по любому из пп.4-6, где первый смеситель или инжектор представляет собой смеситель или инжектор, расположенный на одной линии.
8. 8. Устройство по любому из пп.4-7, где первый смеситель представляет собой Т-образную трубку.
9. 9. Устройство по любому из пп.4-8, где первая трубка имеет диаметр менее 1 см, предпочтительно от 2 до 8 мм и более предпочтительно примерно 6 мм и длину от 1 до 10 м, предпочтительно от 2 до 6 м.
10. 10. Устройство по любому из пп.4-9, где вторая трубка представляет собой спиральный трубопровод, способный создавать ламинарный поток для того, чтобы обеспечить непрерывный контакт щелочного раствора и клеточной суспензии и гарантировать полный лизис клеток.
11. 11. Устройство по любому из пп.4-10, где вторая трубка имеет диаметр менее 1 см, предпочтительно от 10 до 20 мм или от 12,5 до 19 мм и более предпочтительно равный 16 мм и длину от 5 до 30 м и предпочтительно от 13 до 23 м.
12. 12. Устройство по любому из пп.4-11, где третья трубка имеет диаметр менее 1 см, предпочтительно от 2 до 10 мм, более предпочтительно от 5 до 8 мм и длину от 1 до 10 м и более предпочтительно от 2 до 4 м.
13. 13. Устройство по любому из пп.4-12, где второй смеситель или инжектор имеет Υ-образную форму и расположен на одной линии с лизируемыми клетками для впрыскивания раствора, приводящего к осаждению геномной ДНК, РНК и белков.
14. 14. Устройство по любому из пп.4-13, которое снабжено средством для функционального соединения с емкостью для ферментации.
15. 15. Способ лизиса клеток, включающий пропускание клеток через средство для создания турбулентного потока с целью быстрого перемешивания клеточной суспензии с раствором, который лизирует клетки; и средство для создания ламинарного потока с целью обеспечения инкубации образующейся смеси без существенного перемешивания.
16. 16. Способ по п.15, где смесь подвергают воздействию турбулентного потока в течение 1-10 с, предпочтительно 2-5 с и более предпочтительно 2,5 с.
17. 17. Способ по п.15 или 16, где лизирующий раствор представляет собой щелочную жидкость, а период непрерывного контакта его с клеточной суспензией в средстве создания ламинарного потока составляет от 30 с до 2 мин, предпочтительно от 1 мин до 1 мин 30 с и предпочтительно 1 мин 20 с.
18. 18. Способ по любому из пп.15-17, дополнительно включающий протекание инкубированной смеси из средства создания ламинарного потока в средство для добавления второго раствора, который нейтрализует лизирующий раствор.
19. 19. Способ высвобождения плазмид из клеток, содержащих плазмиды, включающий пропускание клеток через средство для создания турбулентного потока с целью быстрого перемешивания клеточной суспензии с раствором, который лизирует клетки, пропускание клеток через средство для создания ламинарного потока с целью обеспечения инкубации образующейся смеси без существенного перемешивания и приведение в контакт инкубированной смеси с раствором, который нейтрализует лизирующий раствор.
20. 20. Способ по любому из пп.15-19, где лизирующий раствор представляет собой раствор, содержащий лизирующий агент, выбранный из группы, состоящей из щелочи, детергента, органического растворителя и фермента или их смеси.
21. 21. Способ по любому из пп.15-20, дополнительно включающий по меньшей мере две стадии хроматографирования инкубированной смеси, выбранные из анионообменной хроматографии, аффинной хроматографии с образованием тройной спирали и гидрофобной хроматографии.
22. 22. Способ по п.21, где осуществляют анионообменную хроматографию, затем аффинную хроматографию с образованием тройной спирали и затем гидрофобную хроматографию.
23. 23. Способ по п.21, где перед первой хроматографией проводят фильтрацию лизата.

    - 39 009447
24. 24. Способ по п.21, где перед первой хроматографией проводят удаление хлопьевидного осадка.
25. 25. Способ по п.21, включающий стадию анионообменной хроматографии в сочетании с хроматографией с образованием тройной спирали.
26. 26. Способ по п.25, который дополнительно включает стадию гидрофобной хроматографии.
27. 27. Способ крупномасштабного производства высокоочищенной плазмидной ДНК, при котором клетки хозяина, содержащие плазмиду, пропускают через средство для создания турбулентного потока с целью быстрого смешивания клеточной суспензии с раствором, который лизирует клетки, затем клетки пропускают через средство для создания ламинарного потока с целью обеспечения инкубации образующейся смеси без существенного перемешивания, приводят в контакт инкубированную смесь с раствором, который нейтрализует лизирующий раствор, и плазмиды, высвобожденные из клеток, разделяют анионообменной хроматографией, затем аффинной хроматографией с образованием тройной спирали и затем гидрофобной хроматогафией.
28. 28. Способ получения и очистки плазмидной ДНК фармацевтического качества, включающий стадию получения клеток, содержащих плазмидную ДНК, стадию получения лизата, содержащего плазмидную ДНК, путем разрушения клеток способом непрерывного щелочного лизиса, стадию концентрирования путем осаждения подходящим агентом, стадию анионообменной хроматографии, стадию хроматографии с образованием тройной спирали, стадию гидрофобной хроматографии и конечную стадию диафильтрации и/или буферного обмена.
29. 29. Способ по любому из пп.15-28, дополнительно включающий предварительную стадию удаления хлопьевидного осадка путем пропускания раствора через сетчатый фильтр и посредством объемной фильтрации.
30. 30. Способ по любому из пп.15-29, дополнительно включающий стадию диафильтрации после последней стадии хроматографии.
31. 31. Способ по п.30, где стадию диафильтрации используют для достижения подходящих целевых концентраций соли, буфера и значения рН.
32. 32. Способ по п.30 или 31, где стадия диафильтрации включает следующие стадии:

    сбор раствора с последней хроматографической стадии;

    осуществление первой стадии диафильтрации против буфера Трис/НаС1;

    осуществление второй стадии диафильтрации против солевого раствора в условиях, подходящих для контролирования конечной концентрации буфера и для стабилизации рН конечного препарата плазмидной ДНК.
33. 33. Способ по любому из пп.15-32, где хроматографические стадии осуществляют на твердом носителе, который представляет собой любой органический, неорганический или композиционный материал, пористый, сверхпористый или непористый, подходящий для хроматографического разделения, который дериватизирован поли(алкенгликолями), алканами, алкенами, алкинами, аренами или другими молекулами, которые придают этому носителю гидрофобный характер.
34. 34. Способ по любому из пп.15-32, где гидрофобную хроматографию проводят в неподвижном слое или во вспученном слое.