KR20070058621A - 플라스미드 ｄｎａ의 안정한 액체 제제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 +4℃ 내지 실온에서 장기간 동안 안정하여 비분해된 상태로 유지되어 연구, 플라스미드 기재 요법, 예를 들어 DNA 백신 및 유전자 요법에 사용되는 플라스미드 DNA의 보관에 유용한 플라스미드 DNA 액체 제제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 +4℃ 내지 실온에서 플라스미드 DNA를 일정 시간에 걸쳐 안정한 형태로 보존하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 플라스미드 기재 요법, 예를 들어 DNA 백신 처리 또는 유전자 요법에 의해 인간 또는 동물 신체의 치료 방법에 사용하기 위한 안정한 플라스미드 DNA 액체 조성물에 관한 것이다.

플라스미드, DNA, 보관 안정성, 액체 제제, DNA 액체 보관 조성물

Description

플라스미드 ＤＮＡ의 안정한 액체 제제 {STABLE LIQUID FORMULATIONS OF PLASMID DNA}

본 발명은 플라스미드가 +4℃ 내지 실온에서 장기간 동안 분해되지 않고 유지되는 안정한 플라스미드 DNA 액체 제제에 관한 것이다. 따라서, 상기 제제는 연구 또는 플라스미드 기재 요법, 예를 들어 DNA 백신 및 유전자 요법에 사용되는 플라스미드 DNA의 보관에 유용하다.

분자생물학의 발전은 플라스미드 기재 요법, 특히 DNA 백신 및 유전자 요법 분야가 질병 치료에 효과적인 수단을 제공할 수 있음을 분명히 시사한다. 정상 유전자를 인간 세포 내로 안전하고 효과적으로 전달하는 한 유망한 방법은 플라스미드 DNA를 통한 것이다. 플라스미드 DNA는 그 내부에 목적하는 DNA 서열이 삽입될 수 있는 공유결합성 폐환형 (ccc) 또는 수퍼코일형 형태의 세균 DNA이다. 포유동물 세포에 도입될 수 있는 목적하는 DNA 서열의 예는 외인성 유전자, 기능성 유전자, 또는 돌연변이체 유전자, 안티센스 서열, RNAi 또는 dsRNAi 서열, 리보자임, 및 예를 들어 바이러스 감염에 대한 DNA 백신, 또는 심혈관 질병, 혈관신생 관련 질병 또는 암 치료에 사용하기 위한 것을 포함한다. 인간 세포에 전달되면, 플라스미드 DNA는 삽입된 DNA 서열의 카피 복제 및 생산을 시작한다. 따라서, 플라스 미드 DNA를 활성 제약 성분 (API)으로서 사용하는 것은 다양한 질병 상태의 치료를 위해 고려할 수 있지만, 보관이 상기 기술에 대한 큰 장애로서 나타났다. 실제로, 플라스미드 DNA가 비-최적 조건에서 유지될 경우, 그의 구조가 분해되고, 분자의 수퍼코일형 (ccc) 토폴로지가 산화 손상을 통해 불활성 형태 (개환형 및 선형)로 전환될 수 있다. 산화제, 예를 들어 과산화수소, 초과산화물 및 Fenton-형 반응을 통해 생성되는 히드록실 라디칼은 DNA 산화 분해의 원인이 된다. 특히, 유리 라디칼 산화 경로 및 탈퓨린화 및 β-제거는 DNA 단일 가닥 파괴 또는 닉 형성 (nicking) 및 공유결합성 폐환형 (ccc) 이중가닥 수퍼코일형 DNA의 이완형 (relaxed) 환상 또는 개환형 및 선형 형태로의 후속 전환을 야기하는, 수성 제제에서 고도로 정제된 플라스미드 DNA의 DNA 분해의 주요 원인이다.

플라스미드 DNA는 대체로 포스페이트 또는 트리스(Tris)-완충된 수용액에서 제제화되고, 여기서 포스페이트 또는 트리스 버퍼는 약 10 mM의 농도로 존재한다. 그러나, 상기 조성물은 일반적으로 수용액에서 보관 동안 발생하는 분해 과정을 거치게 된다. 상기 플라스미드 DNA 용액은 약 +4℃ 및 +25℃에서 안정성이 매우 불량하다. 특히, 그의 탈퓨린화 속도는 +4℃ 내지 실온 (RT)에서 매우 빠르다. 분해 과정은 대체로 수퍼코일형, 개환형 및 선형 DNA 함량의 측정에 의해 및 탈퓨린화, 즉 퓨린 제거 부위의 축적 속도에 의해 및 산화, 즉 시간에 따른 8-히드록시구아닌 형성에 의해 모니터링된다.

따라서, 플라스미드 DNA 약품의 장기간 보관은 DNA의 안정성에 영향을 끼치는 많은 분해 반응을 야기한다. 상기 문제를 극복하기 위해서, 플라스미드 DNA는 통상적으로 실온까지 상승하는 온도에서 보관을 위해 동결건조되지만, 이것은 추후 다시 제제화하는 추가의 조작 단계를 필요로 하고 오염 및/또는 분해의 추가의 위험이 있다.

플라스미드 DNA에서 발생하는 임의의 DNA 가닥 파괴는 품질 및 성능에 영향을 주기 때문에, 플라스미드 DNA의 보관 및 조작 동안 시간에 걸쳐 발생하는 손상을 처리하고 +4℃ 내지 실온의 넓은 온도에서 플라스미드 DNA의 장기간 보관 안정성 및 안전한 조작을 보장하는 보관 조성물을 제공하는 것이 중요하다.

따라서, 발명자들은 장기간 동안 광범위한 온도, 예를 들어 실온 이하의 온도에서 안정하게 유지되어 대상에게 안전하게 투여하기 전에 DNA 기재 약물, DNA 백신 또는 유전자 요법제의 보관, 수송, 조작 및 배포를 용이하게 하는 플라스미드 DNA의 신규한 액체 조성물을 발견하였다. 특히, 상기 액체 제제는 연구 및 플라스미드 기재 요법, 예를 들어 유전자 요법 및 DNA 백신에 사용될 수 있는 고도로 정제된 플라스미드 DNA에 유용하다.

<발명의 개요>

본 발명의 제1 목적은 +25℃ 이하의 온도에서 장기간 동안 액체 제제 중에서 플라스미드 DNA를 보존하기 위한 조성물이다.

따라서, 발명은 플라스미드 DNA, 및 플라스미드 DNA 조성물의 pH를 6 내지 9로 유지하여 플라스미드 DNA를 수퍼코일형 함량이 적어도 80％이고 탈퓨린화 및 닉 형성된 플라스미드 함량이 20％ 미만이 되도록 보존할 수 있기에 충분한 5 mM 이하, 4 mM 이하, 또는 3 mM 이하, 또는 2 mM 이하의 농도의 버퍼를 포함하는 안정한 플라스미드 DNA 액체 보관 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 플라스미드 DNA, 및 제제 또는 조성물의 pH를 6.2 내지 8.5, 및/또는 상기 값 중 하나 또는 둘 모두의 약 +/- 0.3으로 유지하여 약 +4℃에서 보관시에 1년당 탈퓨린화 및 닉 형성 비율이 5％ 미만이 되도록, 약 +25℃에서 보관시에 1개월당 5％ 미만이 되도록 플라스미드 DNA를 보존할 수 있기에 충분한 2 mM 이하의 농도의 버퍼를 포함하는 안정한 플라스미드 DNA 액체 보관 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 플라스미드 DNA, 및 제제 또는 조성물의 pH를 6.7 내지 8.0, 및/또는 상기 값 중 하나 또는 둘 모두의 약 +/- 0.3으로 유지하여 약 +4℃에서 보관시에 1년당 탈퓨린화 및 닉 형성 비율이 2％ 미만이 되도록, 약 +25℃에서 보관시에 1개월당 2％ 미만이 되도록 플라스미드 DNA를 보존할 수 있기에 충분한 2 mM 이하의 농도의 버퍼를 포함하는 안정한 플라스미드 DNA 액체 보관 조성물에 관한 것이다.

추가로, 본 발명은 플라스미드 DNA, 및 제제 또는 조성물의 pH를 7.0 내지 7.5, 및/또는 상기 값 중 하나 또는 둘 모두의 약 +/- 0.3으로 유지하여 약 +4℃에서 보관시에 1년당 탈퓨린화 및 닉 형성 비율이 1％ 미만이 되도록, 약 +25℃에서 보관시에 1개월당 1％ 미만이 되도록 플라스미드 DNA를 보존할 수 있기에 충분한 2 mM 이하의 농도의 버퍼 용액을 포함하는 안정한 플라스미드 DNA 액체 보관 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 (i) 플라스미드 DNA의 정제된 샘플을 제조하고; (ii) 상기 플라스미드 DNA의 정제된 샘플을 생성되는 조성물의 pH를 6 내지 9로 유지하기에 충분한 2 mM 이하의 농도의 버퍼 용액과 합하고; (iii) 플라스미드 DNA를 보관하는 것을 포함하는, 보관 액체 조성물 중에서 플라스미드 DNA를 안정한 형태로 보존하는 방법이다. 본 발명에 따른 방법에 의하면, 고품질의 플라스미드 DNA를 수퍼코일형 플라스미드 DNA를 80％ 이상 갖도록 보존할 수 있다.

본 발명은 (i) 플라스미드 DNA의 정제된 샘플을 제조하고; (ii) 상기 플라스미드 DNA의 정제된 샘플을 생성되는 조성물의 pH를 6.2 내지 8.5 및/또는 상기 값 중 하나 또는 둘 모두의 약 +/- 0.3으로 유지하기에 충분한 2 mM 이하의 농도의 버퍼 용액과 합하고; (iii) 플라스미드 DNA를 선택된 온도에서 보관하는 것을 포함하는, 플라스미드 DNA를 약 +4℃ 내지 +25℃의 온도에서 탈퓨린화 및 닉 형성 비율이 1개월당 5％ 미만, 1년당 5％ 미만이 되도록 안정한 형태로 보관 액체 조성물 중에서 보존하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 (i) 플라스미드 DNA의 정제된 샘플을 제조하고; (ii) 상기 플라스미드 DNA의 정제된 샘플을 생성되는 조성물의 pH를 6.7 내지 8 또는 상기 값 중 하나 또는 둘 모두의 약 +/- 0.3으로 유지하기에 충분한 2 mM 이하의 농도의 버퍼 용액과 합하고; (iii) 플라스미드 DNA를 선택된 온도에서 보관하는 것을 포함하는, 플라스미드 DNA를 약 +4℃ 내지 +25℃의 온도에서 탈퓨린화 및 닉 형성 비율이 1개월당 2％ 미만, 1년당 2％ 미만이 되도록 안정한 형태로 보관 액체 조성물 중에서 보존하는 방법에 관한 것이다.

추가로, 본 발명은 (i) 플라스미드 DNA의 정제된 샘플을 제조하고; (ii) 상 기 플라스미드 DNA의 정제된 샘플을 생성되는 조성물의 pH를 7.0 내지 7.5 및/또는 상기 값 중 하나 또는 둘 모두의 약 +/- 0.3으로 유지하기에 충분한 2 mM 이하의 농도의 버퍼 용액과 합하고; (iii) 플라스미드 DNA를 선택된 온도에서 보관하는 것을 포함하는, 플라스미드 DNA를 약 +4℃ 내지 +25℃의 온도에서 탈퓨린화 및 닉 형성 비율이 1개월당 1％ 미만, 1년당 1％ 미만이 되도록 안정한 형태로 보관 액체 조성물 중에서 보존하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 플라스미드 DNA의 조성물은 5 mM 미만, 또는 4 mM 미만, 또는 3 mM 미만의 농도의 버퍼 용액을 포함한다. 바람직하게는, 안정한 플라스미드 DNA 보관 조성물은 미량 수준의 또는 2 mM 이하, 보다 바람직하게는 1 mM 내지 2 mM의 매우 희석된 농도의 버퍼 용액을 포함한다. 가장 바람직하게는, 버퍼 용액은 상기 제제 또는 조성물의 pH를 6 내지 9, 또는 6.2 내지 8.5, 바람직하게는 6.7 내지 8, 가장 바람직하게는 7 내지 7.5, 및/또는 상기 값의 임의의 하나 이상의 약 +/- 0.3으로 유지하기 위해서 1 mM 미만, 250 μM 내지 1 mM, 또는 400 μM 내지 1 mM의 농도로 존재한다.

본 발명에 따른 안정한 조성물은 매우 낮은 수준의 오염 염색체 DNA, RNA, 단백질 및 내독소를 갖는 고도로 정제된 플라스미드 DNA의 보관에 특히 유용하다. 상기 고도로 정제된 플라스미드 DNA는 약 0.01％ 미만의 숙주세포 RNA 오염물질, 및/또는 약 0.01％ 미만의 숙주세포 단백질 오염물질, 및/또는 약 0.01％ 미만의 숙주세포 게놈 DNA 오염물질을 갖는다. 바람직한 고도로 정제된 플라스미드 DNA는 약 0.001％ 미만의 숙주세포 RNA 오염물질, 및/또는 약 0.001％ 미만의 숙주세포 단백질 오염물질, 및/또는 약 0.001％ 미만의 숙주세포 게놈 DNA 오염물질을 갖는다. 가장 바람직한 고도로 정제된 플라스미드 DNA는 약 0.0001％ 미만의 숙주세포 RNA 오염물질, 및/또는 약 0.0001％ 미만의 숙주세포 단백질 오염물질, 및/또는 약 0.0001％ 미만의 숙주세포 게놈 DNA 오염물질을 갖는다.

본 발명의 또다른 목적은 (1) (a) 세포 현탁액과 세포를 용해시키는 용액을 신속하게 혼합하기 위해 난류를 통해 세포를 유동시키고; (b) 실질적인 진탕 없이 (a)에서 형성된 혼합물의 인큐베이션을 허용하기 위해 층류를 통해 세포를 유동시키고, 여기서 (a)에서 형성된 혼합물은 난류로부터 층류로 유동시키고, (c) 임의로, 플라스미드 DNA를 세포로부터 방출시키기 위해 용해 용액을 중화시키는 제2 용액을 첨가하고, (b) 층류에서 인큐베이션된 혼합물을 제2 용액으로 첨가하는 것을 추가로 포함하는, 세포의 용해 단계; (2) 방출되는 플라스미드 DNA를 정제하기 위해 크로마토그래피를 수행하는 한 단계; (3) 상기 정제된 플라스미드 DNA를 생성되는 조성물의 pH를 6 내지 9로 유지하기에 충분한 2 mM 이하의 농도의 버퍼 용액과 합하는 단계, 및 (4) 약 25℃ 이하의 온도에서 플라스미드 DNA 조성물을 보관하는 단계를 포함하는, 약 25℃ 이하의 온도에서 보관하기 위한 안정한 플라스미드 DNA 액체 조성물의 제조 방법이다.

또한, 본 발명은 (1) (a) 세포 현탁액과 세포를 용해시키는 용액을 신속하게 혼합하기 위해 난류 유동을 위한 수단을 통해 세포를 유동시키고; (b) 실질적인 진탕 없이 (a)에서 형성된 혼합물의 인큐베이션을 허용하기 위해 층류를 통해 세포를 유동시키고, 여기서 (a)에서 형성된 혼합물은 난류로부터 층류로 유동시키고, (c) 임의로 플라스미드 DNA를 세포로부터 방출시키기 위해 용해 용액을 중화시키는 제2 용액을 첨가하기 위한 수단을 첨가하고, (b)에서 인큐베이션된 혼합물을 제2 용액을 첨가하기 위한 수단으로 유동시키는 것을 추가로 포함하는, 세포의 용해 단계; (2) 방출되는 플라스미드 DNA를 정제하기 위한 크로마토그래피 단계를 수행하는 단계; (3) 투석여과 및/또는 버퍼 교환을 수행하는 단계; (4) 상기 정제된 플라스미드 DNA를 생성되는 조성물의 pH를 6 내지 9로 유지하기에 충분한 2 mM 이하의 농도의 버퍼 용액과 합하는 단계, 및 (5) 플라스미드 DNA 액체 조성물로 바이알을 충전하여 약 25℃ 이하의 온도에서 플라스미드 DNA 조성물을 보관하는 단계를 포함하는, 약 25℃ 이하의 온도에서 보관하기 위한 안정한 플라스미드 DNA 액체 제제의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법에 따르면, 버퍼 용액은 5 mM 미만, 또는 4 mM 미만, 또는 3 mM 미만의 농도에서 플라스미드 DNA의 조성물에 첨가된다. 바람직하게는, 상기 방법은 미량 수준의 버퍼 용액의 첨가 또는 2 mM 이하, 보다 바람직하게는 1 mM 내지 2 mM의 매우 희석된 농도의 버퍼 용액의 첨가를 포함한다. 가장 바람직하게는, 버퍼 용액은 상기 제제 또는 조성물의 pH를 6 내지 9, 또는 6.2 내지 8.5, 바람직하게는 6.7 내지 8, 가장 바람직하게는 7 내지 7.5, 및/또는 상기 값 중 임의의 하나 이상의 약 +/- 0.3으로 유지하기 위해서 1 mM 미만, 250 μM 내지 1 mM, 또는 400 μM 내지 1 mM의 농도로 존재한다.

본 발명의 추가의 목적은 연구 또는 플라스미드 기재 요법, 예를 들어 유전자 요법 또는 DNA 백신에 사용하기 위한 활성 제약 성분으로서 안정한 플라스미드 DNA 액체 제제를 포함하는 바이알이다.

본 발명의 또다른 목적은 말초 사지 허혈, 예를 들어 말초 동맥 질환 (PAOD 또는 PAD) 및 중증 사지 허혈 (CLI)의 치료에 유용한 FGF-1 유전자를 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 pCOR 플라스미드인, NV1FGF로 명명된 플라스미드인 정제된 플라스미드 DNA를 포함하는 바이알이다.

본 발명의 추가의 목적 및 잇점은 부분적으로 하기 상세한 설명에 제시될 것이고, 부분적으로는 상세한 설명으로부터 자명하거나 본 발명의 실시를 통해 알 수 있다. 본 발명의 목적 및 잇점은 특히 첨부하는 청구의 범위에서 제시된 성분 및 조합에 의해 실현 및 달성될 것이다.

상기 일반적인 설명 및 하기 상세한 설명은 단지 예로서 설명하기 위한 것으로서 특허 청구된 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아님을 이해하여야 한다. 본원 명세서에 포함되고 그 일부를 구성하는 첨부 도면은 본 발명의 여러 실시태양을 예시하고, 상세한 설명과 함께 본 발명의 원리를 설명하는 것이다.

도 1은 본 발명의 연속 방식의 세포 용해에 사용될 수 있는 장치의 모식도이다.

도 2는 연속 세포 용해 장치의 혼합기 M1의 모식도이다.

도 3은 1단계의 음이온 교환 크로마토그래피 (AEC), 또는 음이온 교환 크로마토그래피 단계와 삼중 나선 친화도 크로마토그래피 (THAC)를 조합한 2단계 방법, 및 음이온 교환 크로마토그래피 단계, 삼중 나선 친화도 크로마토그래피 단계와 소 수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 단계를 조합한 3단계 방법을 사용할 때, gDNA, RNA, 단백질, 내독소 오염물질 측면에서의 정제 수율을 비교한 표이다. ND는 검출되지 않음을 의미한다 (저감도 분석 방법).

도 4는 음이온 교환 크로마토그래피 (AEC), 히드록시아파타이트 크로마토그래피 (HAC), 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC), 역상 크로마토그래피 (RPC), 크기 배제 크로마토그래피 (SEC), 삼중 나선 친화도 크로마토그래피 (THAC) 단독 또는 이들의 조합법과 같은 플라스미드 DNA를 분리 및 정제하기 위한 다양한 방법과 본 발명에 따른 방법을 비교하는 표이다. 그 결과를 정제된 플라스미드 DNA의 품질의 측면에서 본원에서 제시한다. ND는 검출되지 않음을 의미한다 (저감도 분석 방법).

도 5A 및 5B는 +25℃ 및 +5℃에서 90일 이하 동안 보관된 플라스미드 DNA의 탈퓨린화 및 닉 형성 비율 (개환형 플라스미드 형태의 형성)을 보여주는 그래프이다.

도 6A 및 6B는 +25℃ 및 +5℃에서 150일 이하 동안 보관된 플라스미드 DNA의 탈퓨린화 및 닉 형성 비율 (개환형 플라스미드 형태의 형성)을 보여주는 그래프이다.

<정의>

플라스미드 DNA 제제 또는 조성물은 효율적인 양의 플라스미드 DNA를 포함하는 조성물, 또는 연구 또는 플라스미드 기재 요법, 예를 들어 유전자 요법 또는 DNA 백신에 사용하기 위한 효율적인 양으로 존재하는 플라스미드 DNA의 제제를 의 미한다.

안정한 보관 플라스미드 DNA 제제는 연구 또는 플라스미드 기재 요법을 위해 사용하기 전에 장기간 동안 플라스미드 DNA를 안정한 형태로 보관하기 위해 사용될 수 있는 제제를 의미한다. 보관 시간은 +5℃ 내지 +25℃ (RT: 실온)의 온도에서 수개월, 1년, 5년, 10년, 15년, 또는 20년 이하로 길 수 있다.

일반적으로, 안정한 플라스미드 DNA 제제 또는 조성물은 수퍼코일형 이중가닥 DNA의 비율은 적어도 80％이고, 나머지는 개환형 및/또는 선형 플라스미드 형태인 플라스미드 DNA 제제를 의미한다.

본원에서, 안정한 플라스미드 DNA 제제는 탈퓨린화 및 닉 형성 비율 (개환형 플라스미드 형태의 형성)이 +25℃에서 보관시에 1개월당 5％ 미만이고 +5℃에서 보관시에는 1년당 5％ 미만인 플라스미드 DNA를 포함하는 조성물을 의미한다. 바람직하게는, 안정한 플라스미드 DNA 제제는 본원에서 탈퓨린화 및 닉 형성 비율 (개환형 플라스미드 형태의 형성)이 +25℃에서 보관시에 1개월당 2％ 미만이고 +5℃에서 보관시에는 1년당 2％ 미만인 플라스미드 DNA를 포함하는 조성물을 의미한다. 보다 바람직하게는, 안정한 플라스미드 DNA 제제는 본원에서 탈퓨린화 및 닉 형성 비율 (개환형 플라스미드 형태의 형성)이 +25℃에서 보관시에 1개월당 1％ 미만이고 +5℃에서 보관시에는 1년당 1％ 미만인 플라스미드 DNA를 포함하는 조성물을 의미한다.

산성은 산에 관련되거나 산을 함유하는, pH가 7 미만임을 의미한다.

알칼리성은 알칼리 또는 염기에 관련되거나 알칼리 또는 염기를 함유하는, pH가 7 초과임을 의미한다.

연속은 중단되지 않은, 중단이 존재하지 않음을 의미한다.

게놈 DNA (gDNA로 약칭)은 염색체로부터 유도되거나 염색체에 존재하는 DNA를 의미한다.

층류는 각각의 입자가 모든 입자에 평행한 방향으로 이동하는 용액 스트림의 유동 종류이다.

용해물은 세포 용해 과정에 의해 생성된 물질을 의미한다. 용어 용해는 용해제를 포함하는 용액을 사용한 화학적 처리를 통해 완충된 용액 (즉, 세포 현탁액)에 존재하는 세포의 세포벽 및/또는 세포막의 파열 작용을 의미한다. 용해제는 예를 들어 알칼리, 세제, 유기 용매 및 효소를 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 세포의 용해는 숙주세포로부터 무손상 플라스미드를 방출할 것이다.

(용액을) 중성으로 만들거나 (산 또는 염기/알칼리를) 중화시킨다는 표현에서, 용액을 중화시키는 것은 용액의 pH를 pH 5 내지 7, 바람직하게는 약 7 또는 보다 바람직하게는 이전보다 7에 더 가깝게 만든다는 것을 의미한다.

뉴턴 유체는 전단 응력이 속도 구배에 비례하고 전단 평면에 수직인 유체이다. 비례 상수는 점도로 알려져 있다. 뉴턴 유체의 예는 액체 및 기체를 포함한다.

비-뉴턴 유체는 전단 응력이 속도 구배에만 비례하지 않고 전단 평면에 수직인 유체이다. 비-뉴턴 유체는 잘 규정된 점도를 갖지 않을 수 있다. 비-뉴턴 유체는 플라스틱 고체, 지수 법칙 (power-law) 유체, 점탄성 유체 (점성과 탄성을 모 두 가짐), 및 시간 의존성 점도 유체를 포함한다.

플라스미드 DNA는 비-내인성 DNA 단편을 그 내부에 삽입시키는 능력을 가질 수 있는, 염색체가 아닌 DNA 고리로 이루어진 작은 세포성 구조체이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 플라스미드 DNA는 또한 임의의 형태의 플라스미드 DNA, 예를 들어 절단, 가공된 또는 다른 조작된 형태의 비-염색체 DNA, 예를 들어 임의의 닉 형성된 (nicked) 환상 플라스미드 DNA, 이완형 환상 플라스미드 DNA, 수퍼코일형 플라스미드 DNA, 절단된 플라스미드 DNA, 선형화된 또는 선형 플라스미드 DNA, 및 단일 가닥 플라스미드 DNA 또는 이들의 임의의 조합물일 수 있다. 플라스미드 제조 방법은 문헌 [Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]에 기재된 것을 포함한다. 당업계에 공지된 플라스미드 DNA의 소량-제조(mini-prep) 프로토콜 (Birnboim and Doly, Nucleic Acids Research 7:1513 (1979))은 본 발명의 일부 측면을 통해 추후 처리하기 위해 초기에 플라스미드 DNA를 단리하기 위해 사용될 수 있고, 본 발명의 방법에 의해 생성된 고도로 정제된 샘플과 비교될 수 있다. 바람직하게는, 플라스미드 DNA의 형태는 그 자체가 실질적으로 폐환형 형태의 플라스미드 DNA 또는 약 80％, 85％, 90％, 95％, 또는 약 99％ 초과의 폐환형 형태의 플라스미드 DNA이거나, 또는 적어도 본 발명의 정제 방법에 의해 제조된 후에 상기 형태의 DNA이다. 별법으로, 수퍼코일형 공유결합성 폐환형 형태의 플라스미드 DNA (ccc)가 일부 치료 방법에서 바람직할 수 있고, 개환형, 선형, 또는 다합체 형태보다 더 효과적일 수 있다. 따라서, 제약 등급 플라스미드 DNA는 하나 이상의 형태의 플라스미드로부터 단리 또는 분리될 수 있고, 실질적으로 하나 이상의 요구되는 형태를 포함할 수 있다.

본 발명의 목적을 위해, 용어 유동은 대체로 펌프의 작용에 의해 액체가 특정 유속 (예를 들어, 리터/분)으로 혼합기를 통과함을 의미한다. 혼합기를 통한 유속은 용해, 침전 및 혼합의 효능에 영향을 주는 것으로 생각됨을 주목하여야 한다.

용어 "닉 형성된" 및 "이완형" DNA는 수퍼코일형이 아닌 DNA를 의미한다. "수퍼코일형" DNA는 특정한 단리된 형태의 플라스미드 DNA를 설명할 때 당업계에서 잘 이해되는 용어이다. 다른 형태의 플라스미드 DNA도 당업계에 알려져 있다.

"오염 불순물"은 그로부터 DNA를 분리 또는 단리하는 것이 요구되는 임의의 물질이다. 오염 불순물은 숙주세포 단백질, 내독소, 숙주세포 DNA, 예를 들어 염색체 DNA 또는 게놈 DNA, 및/또는 숙주세포 RNA를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 오염 불순물이거나 오염 불순물로 간주될 수 있는 것은 본 발명의 방법이 실행되는 방식에 따라 결정될 수 있음이 이해된다. "오염 불순물"은 숙주세포로부터 유래된 것이거나 유래되지 않은 것일 수 있다. 즉, 오염 불순물은 숙주세포 불순물이거나 아닐 수 있다.

제1 성분 (예를 들어 DNA)의 "단리" 또는 "정제"는 그와 함께 제1 성분이 초기에 발견되는 다른 성분으로부터 제1 성분을 농축하는 것을 의미한다. 요구되는 및/또는 얻을 수 있는 정제 정도는 본원에서 제공된다.

용어 "본질적으로 존재하지 않고 고도로 정제된"은 약 95％, 바람직하게는 98.99％ 초과의 순도이거나 오염물질이 존재하지 않거나 5％ 미만, 바람직하게는 1-2％ 미만의 오염물질을 갖는 것으로 규정된다.

제약 등급 DNA는 본원에서 약 5％ 이하, 바람직하게는 약 1-2％ 이하의 세포 성분, 예를 들어 세포막을 포함하는 DNA 제제로서 규정된다.

또한, 본질적으로 오염물질이 존재하지 않고 따라서 제약 등급 DNA인 고도로 정제된 플라스미드 DNA를 생산 및 단리하는 방법이 설명된다. 본 발명의 방법에 의해 생산되고 단리된 플라스미드 DNA는 매우 낮은 수준, 즉 수 ppm의 오염 염색체 DNA, RNA, 단백질 및 내독소를 포함하고, 대부분 폐환형 형태의 플라스미드 DNA를 포함한다. 본 발명에 따라 생산된 플라스미드 DNA는 연구 및 플라스미드 기재 요법, 및 임의로 인간 임상 시험 물질 및 인간 유전자 요법 실험 및 임상 시험에 사용하기 위한 충분한 순도를 갖는 것이다.

본 발명의 "제약 등급 플라스미드 DNA 조성물"은 본 발명의 방법에 의해 생산된 것이고/것이거나 "제약 등급 플라스미드 DNA"로서 하기 정의되는 순도 수준의 적어도 하나를 갖는 조성물이다. 바람직하게는, 본 발명의 "제약 등급 플라스미드 DNA 조성물"은 "제약 등급 플라스미드 DNA"로서 하기 확인된 것의 적어도 2개에 의해 정의된 순도 수준, 예를 들어 약 0.01％ 미만의 염색체 또는 게놈 DNA 및 약 0.01％ 미만의 단백질 오염물질, 또는 예를 들어 약 0.01％ 미만의 염색체 또는 게놈 DNA 및 약 0.1 EU/mg 미만의 내독소를 보이는 것이다. 제약 등급 플라스미드 DNA는 바람직하게는 약 0.001％ 미만의 염색체 또는 게놈 DNA 및 약 0.001％ 미만의 단백질 오염물질, 또는 예를 들어 약 0.001％ 미만의 염색체 또는 게놈 DNA 및 약 0.1 EU/mg 미만의 내독소를 포함한다. 보다 바람직하게는, 이것은 약 0.0001％ 미만의 염색체 또는 게놈 DNA 및 약 0.0001％ 미만의 단백질 오염물질, 또는 예를 들어 약 0.0001％ 미만의 염색체 또는 게놈 DNA 및 약 0.1 EU/mg 미만의 내독소를 포함한다. 가장 바람직한 제약 등급 DNA 플라스미드는 약 0.00008％ 미만의 염색체 또는 게놈 DNA 및 약 0.00005％ 미만의 단백질 오염물질, 또는 예를 들어 약 0.00008％ 미만의 염색체 또는 게놈 DNA 및 약 0.1 EU/mg 미만의 내독소를 포함한다. 순도 수준의 다른 조합도 상기 정의 하에 포함된다. 물론, 제약 등급 플라스미드 DNA 조성물은 임의의 특정 용도, 예를 들어 조합 치료, 조성물 및 요법에 사용하기 위해 요구되는 추가의 성분을 추가로 포함 또는 함유할 수 있다. 염색체 또는 게놈 DNA, RNA, 내독소 또는 단백질의 수준은 플라스미드의 세포 기재 생산에 의한 오염물질 또는 정제 과정으로부터의 다른 오염물질(들)을 의미한다.

가장 바람직하게는, "제약 등급 플라스미드 DNA"는 본원에서 1 ppm (100 mg의 플라스미드 DNA당 < 0.0001％, 즉 < 0.0001 mg) 이하의 게놈 DNA, RNA, 및/또는 단백질 오염물질을 포함하는 DNA 제제로서 정의된다.

또한, 또는 보다 엄밀하게는, 본원에서 "제약 등급 플라스미드 DNA"는 약 0.01％ 미만, 0.001％ 미만, 바람직하게는 0.0001％ 미만, 바람직하게는 0.00008％ 미만 (100 mg의 플라스미드 DNA당 < 0.00008％, 즉 < 0.00008 mg)의 염색체 DNA 또는 게놈 DNA를 포함하는 DNA 제제를 의미할 수 있다.

또한, "제약 등급 플라스미드 DNA"는 약 0.01％ 미만, 0.001％ 미만, 바람직하게는 0.0001％ 미만, 바람직하게는 0.00002％ 미만 (100 mg의 플라스미드 DNA당 < 0.00002％, 즉 < 0.00002 mg)의 염색체 RNA 오염물질을 포함하는 DNA 제제를 의미할 수 있다.

또한, "제약 등급 플라스미드 DNA"는 약 0.0001％ 미만, 가장 바람직하게는 0.00005％ 미만 (100 mg의 플라스미드 DNA당 < 0.00005％, 즉 < 0.00005 mg)의 단백질 오염물질을 포함하는 DNA 제제를 의미할 수 있다.

또한, "제약 등급 플라스미드 DNA"는 0.1 EU/mg 미만의 내독소를 포함하는 DNA 제제를 의미할 수 있다.

제약 등급 플라스미드 DNA는 바람직하게는 환상 형태가 우세한 DNA 제제, 보다 엄밀하게는 80％, 85％, 90％, 95％ 또는 99％ 초과의 폐환형 형태의 플라스미드 DNA를 포함하는 DNA를 의미한다.

T 튜브는 배관의 T-형태의 형상을 의미하고, 여기서 T-형태는 그 형상으로 제조되는 배관의 단일 조각에 의해 또는 그 형상을 생성시키기 위해 조합된 배관의 2개 이상의 조각에 의해 형성된다. T 튜브는 3개의 암(arm) 및 암이 연결되는 중앙 영역을 갖는다. T 튜브는 두 유체가 T의 한 암 내로 각각 유동하여 중앙 영역에서 연결되고 제3 암에서 배출되면서 성분을 혼합하기 위해 사용될 수 있다. 혼합은 유체가 합류하면서 발생한다.

난류는 소정의 지점에서의 속도가 규모 및 방향에서 특이하게 변하는, 주류의 방향에 횡단하는 방향으로의 유체 입자의 불규칙적인 랜덤한 움직임을 의미한다.

점탄성은 유체가 점성과 탄성 특성을 모두 갖는 것을 의미한다.

본 발명은 안정하고 플라스미드 DNA가 실온에서 장기간 동안 분해되지 않은 상태로 유지되는 플라스미드 DNA 액체 제제에 관한 것이다. 따라서, 상기 플라스미드 DNA 제제 또는 조성물은 연구, 플라스미드 기재 요법, 예를 들어 유전자 요법 또는 DNA 백신에서 플라스미드 DNA의 보관에 유용하다.

본 발명에 따르면, 안정한 플라스미드 DNA 액체 보관 조성물은 플라스미드 DNA, 및 상기 조성물의 pH를 6 내지 9로 유지하기에 충분한 5 mM 이하, 4 mM 이하, 또는 3 mM 이하, 또는 2 mM 이하의 농도의 버퍼 용액을 포함하고, 상기 조성물은 약 4℃ 내지 25℃의 온도에서 수개월, 1년, 2년, 3년, 4년, 5년 및 10년 이하 동안 우세하게 수퍼코일형 형태의 플라스미드 DNA를 포함한다.

수퍼코일형 형태의 플라스미드를 우세하게 갖는 플라스미드 DNA의 조성물은 수퍼코일형 또는 폐환형 플라스미드 DNA를 적어도 80％, 또는 약 85％, 바람직하게는 약 90％, 또는 약 95％ 포함한다. 가장 바람직하게는, 안정한 플라스미드 DNA의 조성물은 수퍼코일형 또는 폐환형 형태의 플라스미드 DNA를 약 99％ 포함한다. 별법으로, 플라스미드 DNA 보관을 위한 안정한 조성물은 탈퓨린화 및 닉 형성 비율이 1개월당 5％ 미만이다.

따라서, 본 발명에 따른 안정한 플라스미드 DNA 액체 보관 제제는 플라스미드 DNA, 및 조성물의 pH를 적어도 약 6, 최대 9, 또는 6.2 내지 8.5, 바람직하게는 6.7 내지 8, 보다 바람직하게는 7 내지 7.5, 및/또는 상기 값 중 하나 또는 둘 모두의 약 +/- 0.3으로 유지하기에 충분한 2 mM 이하의 농도의 매우 희석된 버퍼 용액을 포함한다.

안정한 플라스미드 DNA 액체 조성물은 상기 제제 또는 조성물의 pH를 6.2 내지 8.5, 및/또는 상기 값 중 하나 또는 둘 모두의 약 +/- 0.3으로 유지하여 약 +4℃에서 보관시에 1년당 탈퓨린화 및 닉 형성 비율이 5％ 미만이 되도록, 약 +25℃에서 보관시에 1개월당 5％ 미만이 되도록 플라스미드 DNA를 보존하기 위해 2 mM 이하의 농도의 버퍼 용액을 포함한다.

바람직하게는, 안정한 플라스미드 DNA 액체 조성물은 상기 제제 또는 조성물의 pH를 6.7 내지 8, 및/또는 상기 값 중 하나 또는 둘 모두의 약 +/- 0.3으로 유지하여 약 +4℃에서 보관시에 1년당 탈퓨린화 및 닉 형성 비율이 2％ 미만이 되도록, 약 +25℃에서 보관시에 1개월당 2％ 미만이 되도록 플라스미드 DNA를 보존하기 위해 2 mM 이하의 농도의 버퍼 용액을 포함한다.

보다 바람직하게는, 안정한 플라스미드 DNA 액체 조성물은 상기 제제 또는 조성물의 pH를 7 내지 7.5, 및/또는 상기 값 중 하나 또는 둘 모두의 약 +/- 0.3으로 유지하여 약 +4℃에서 보관시에 1년당 탈퓨린화 및 닉 형성 비율이 1％ 미만이 되도록, 약 +25℃에서 보관시에 1개월당 1％ 미만이 되도록 플라스미드 DNA를 보존하기 위해 2 mM 이하의 농도의 버퍼 용액을 포함한다.

버퍼 용액의 몰 농도는 pH값이 6 내지 9, 또는 6.2 내지 8.5, 바람직하게는 6.7 내지 8, 가장 바람직하게는 7 내지 7.5, 및/또는 임의의 상기 값의 약 +/- 0.3에서 안정화되는 한계 내 및 부피에서 완충 효과를 발휘하도록 결정된다. 따라서, 버퍼 용액은 5 mM 미만의 농도로 첨가될 수 있다. 바람직하게는, 안정한 플라스미드 DNA 보관 조성물은 미량의 버퍼 용액 또는 2 mM 이하, 보다 바람직하게는 1 mM 내지 2 mM의 매우 희석된 농도의 버퍼 용액을 포함한다. 가장 바람직하게는, 버퍼 용액은 상기 제제 또는 조성물의 pH를 6 내지 9, 또는 6.2 내지 8.5, 바람직하게는 6.7 내지 8, 가장 바람직하게는 7 내지 7.5, 및/또는 상기 값의 임의의 하나 이상의 약 +/- 0.3으로 유지하도록 1 mM 미만, 250 μM 내지 1 mM, 또는 400 μM 내지 1 mM의 농도로 존재한다.

버퍼 용액은 2 mM 이하, 또는 1 내지 2 mM의 농도로 존재한다. 바람직하게는, 버퍼 용액은 1 mM 미만의 농도로 존재한다. 가장 바람직하게는, 버퍼 용액은 250 μM 내지 1 mM 이하의 낮은 농도의 미량 수준으로 존재한다. 미량 수준의 버퍼 용액은 약 400 μM일 수 있고, pH를 본원에서 상기 나타낸 범위에서 유지하기에 충분하다.

본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 버퍼 용액은 트리스 [트리스(히드록시메틸)-아미노메탄], 또는 리신 및 강산 (예를 들어 염산) 또는 약산 (예를 들어 말레산, 말산 또는 아세트산)으로부터 선택되는 산을 포함하는 산/염기 시스템, 또는 헤페스(Hepes) [2-(4-(2-히드록시에틸피페라진)-1-일)에탄술폰산] 및 강염기 (수산화나트륨 예를 들어)를 포함하는 산/염기 시스템, 또는 포스페이트 버퍼, 예를 들어 인산나트륨 또는 인산칼륨으로 이루어진다. 또한, 버퍼 용액은 트리스/HCl, 리신/HCl, 트리스/말레산, 트리스/말산, 트리스/아세트산, 또는 헤페스/수산화나트륨을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 트리스 버퍼가 본 발명의 안정한 플라스미드 DNA 보관 조성물에 사용된다.

하기 실시예에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 플라스미드 DNA 제제는 4℃와 실온 (RT), 예를 들어 20 또는 25℃ 모두에서 우수한 안정성을 보인다.

본 발명의 조성물은 염수 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 염수 부형제는 아세테이트, 포스페이트, 탄산염, SO₄ ^{2 -}, Cl^-, Br^-, NO₃ ^-, Mg^{2 +}, Li⁺, Na⁺, K⁺, 및 NH₄ ⁺로 이루어지는 군 중에서 선택되는 음이온 및 양이온 및 이용가능하거나 이전에 사용된 제약 화합물의 임의의 다른 염 또는 형태를 포함할 수 있다. 바람직한 염수 부형제는 농도 100 내지 200 mM, 바람직하게는 약 150 mM 농도의 NaCl이다.

본 발명에 따른 안정한 조성물은 매우 낮은 수준의 오염 염색체 DNA, RNA, 단백질 및 내독소를 갖는 고도로 정제된 플라스미드 DNA 또는 제약 등급 플라스미드 DNA의 보관에 특히 유용하다. 상기 고도로 정제된 플라스미드 DNA는 약 0.01％ 또는 0.001％ 또는 0.0001％ 미만의 숙주세포 RNA 오염물질, 및/또는 약 0.01％ 또는 0.001％ 또는 0.0001％ 미만의 숙주세포 단백질 오염물질, 및/또는 약 0.01％; 또는 0.001％ 또는 0.0001％ 미만의 숙주세포 게놈 DNA 오염물질을 갖는다.

본 발명에 따른 조성물은 보조제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 플루로닉, 또는 폴리소르베이트 당, 또는 알콜 중에서 선택되는 중합체를 추가로 포함할 수 있다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 a) 플라스미드 DNA의 정제된 샘플을 제조하고, b) 상기 플라스미드 DNA의 정제된 샘플을 생성되는 조성물의 pH를 6.2 내지 9로 유지하는 2 mM 이하의 농도의 버퍼 용액과 합하는 것을 포함하는, 플라스미드 DNA를 조성물 중에서 보존하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, pH는 6.5 내지 8.5, 바람직하게는 6.7 내지 8, 가장 바람직하게는 7 내지 7.5, 보다 특히 약 7.2에서 유지된다.

또한, 본 발명은 a) 플라스미드 DNA의 정제된 샘플을 제조하고, b) 상기 플라스미드 DNA의 정제된 샘플을 생성되는 조성물의 pH를 6 내지 9로 유지하기에 충분한 2 mM 이하의 농도의 버퍼 용액과 합하고, c) 플라스미드 DNA를 보관하는 것을 포함하는, 플라스미드 DNA를 조성물 중에서 보존하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법에 의하면, 수퍼코일형 플라스미드 DNA를 80％ 이상 갖는 플라스미드 DNA이 보관이 가능하다.

생성되는 조성물의 pH는 6.2 내지 8.5 및 상기 값 중 하나 또는 둘 모두의 약 +/- 0.3으로 유지되어 플라스미드 DNA를 탈퓨린화 및 닉 형성 비율이 1개월당 5％ 미만, 1년당 5％ 미만이 되도록 약 +4℃ 내지 +25℃에서 보존할 수 있다.

바람직하게는, 생성되는 조성물의 pH는 6.7 내지 8 +/- 약 0.3으로 유지되어 플라스미드 DNA를 탈퓨린화 및 닉 형성 비율이 1개월당 2％ 미만, 1년당 2％ 미만이 되도록 약 +4℃ 내지 +25℃에서 보존할 수 있다.

가장 바람직하게는, 생성되는 조성물의 pH는 7 내지 7.5 및 상기 값 중 하나 이상의 약 +/- 0.3으로 유지되어 플라스미드 DNA를 탈퓨린화 및 닉 형성 비율이 1개월당 1％ 미만, 1년당 1％ 미만이 되도록 약 +4℃ 내지 +25℃에서 보존할 수 있다.

본 발명의 방법에 따르면, 버퍼 용액은 2 mM 이하, 또는 1 내지 2 mM의 농도로 플라스미드 DNA의 조성물에 첨가된다. 바람직하게는, 버퍼 용액은 1 mM 미만의 농도에 도달하도록 첨가된다. 가장 바람직하게는, 버퍼 용액은 250 μM 내지 1 mM 이하의 낮은 농도에서 미량 수준으로 존재한다. 미량 수준의 버퍼 용액은 약 400 μM일 수 있고, pH를 본원에서 상기 나타낸 범위에서 유지하기에 충분하다.

본 발명의 방법에 따르면, 염수 부형제가 플라스미드 DNA 및 버퍼 용액에 추가로 첨가될 수 있다. 이들은 본원에서 상기한 바 있다. 바람직한 염수 부형제는 농도 100 내지 200 mM, 바람직하게는 약 150 mM의 NaCl이다.

본 발명에 따른 조성물로 제제화되는 플라스미드 DNA는 단리된 형태일 수 있다. 이들은 본원에서 설명되는 바와 같은 세균 세포 용해 및 정제를 통해 단리되거나, 자동 핵산 합성 설비를 통해 합성될 수 있다.

플라스미드 DNA는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 폴리뉴클레오티드는 도입유전자 (transgene), 예를 들어 포유동물 기원의 치료 유전자, 예를 들어 설치류 또는 인간 유전자일 수 있고, 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된다. 플라스미드 DNA 내에 삽입되는 폴리뉴클레오티드는 게놈에서 유래할 수 있고, 따라서 그의 게놈 조직에 반영되는 엑손 및 인트론을 포함할 수 있거나, 상보성 DNA로부터 유도될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 다양한 폴리펩티드, 예를 들어 면역원 펩티드 또는 단백질, 혈관신생 인자, 에리트로포이에틴, 아데노신 데아미나제, 인자 VIII, 인자 IX, 디스트로핀, β-글로빈, LDL 수용체, CFTR, 인슐린, 항-혈관신생 인자, 성장 호르몬, α1-항트립신, 페닐알라닌 히드록실라제, 티로신 히드록실라제, 인터루킨 및 인터페론 (이로 제한되지 않음)을 코딩할 수 있다. 바람직하게는, 플라스미드 DNA는 혈관신생 인자, 예를 들어 FGF 유전자 (FGF-1 내지 FGF-22), VEGF, HGF, 또는 HIF-1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 사용에 대한 대안으로서, 폴리뉴클레오티드는 siRNA를 코딩할 수 있고, 이것은 예를 들어 유전자 발현이 바람직하지 않거나 (예를 들어 병원성 유전자) 또는 유전자 발현 수준이 세포에서 바람직하지 않게 높은 경우에 표적 유전자의 발현을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 다양한 척추동물계에 사용하기 적합한 프로모터는 공지되어 있고, 예를 들어, RSV LTR, MPSV LTR, SV40, 메탈로티오네인 프로모터를 포함하고, CMV IEP가 유리하게 사용될 수 있다.

플라스미드 DNA는 원핵세포 및 진핵세포 벡터, 및 발현 벡터, 예를 들어 pBR322 및 pUC 벡터 및 이들의 유도체를 포함할 수 있다. 이들은 상이한 상이한 복제 기점, 예를 들어 원핵세포 복제 기점, 예를 들어 pMB1 및 ColE1, 또는 진핵세포 복제 기점, 예를 들어 효모, 진균, 곤충 및 포유동물 세포에서 복제를 용이하게 하는 것 (예를 들어 SV40 ori)을 포함할 수 있다.

삽입체는 임의의 유기체로부터의 DNA를 포함할 수 있지만, 바람직하게는 포유동물 기원일 것이고, 치료 단백질을 코딩하는 유전자 이외에, 조절 서열, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 로커스 조절 영역, 선택가능한 유전자, 도입유전자의 삽입을 위한 다중링커, 리더 펩티드 서열, 인트론, 폴리아데닐화 시그날, 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 벡터, 기원 및 유전자 성분의 선택은 요구 조건에 따라 상이할 것이고, 당업계의 숙련인이 용이하게 결정할 수 있다. 선택가능한 마커는 예를 들어 항생제 내성 유전자, 예를 들어 SupPhe tRNA, 테트라사이클린, 내성 유전자, 카나마이신 내성 유전자, 퓨로마이신 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 히그로마이신 내성 유전자, 및 티미딘 키나제 내성 유전자일 수 있다. 플라스미드의 주쇄는 포유동물, 다른 진핵세포, 원핵세포 또는 바이러스 DNA 단편의 삽입을 유리하게 허용하고, 생성되는 플라스미드는 정제되어 생체내 또는 생체외 플라스미드 기재 요법에 사용될 수 있다.

바람직하게는, 조건화 복제 기점을 갖는 플라스미드 DNA, 예를 들어 미국 특허 출원 공개 2003/1618445에 기재되어 있는 pCOR 플라스미드가 사용된다. 생성되는 높은 카피수는 플라스미드 DNA 대 염색체 DNA, RNA, 세포 단백질 및 보조인자의 비율을 크게 증가시키고, 플라스미드 수율을 개선시키고, 보다 용이한 하류 정제를 촉진시킨다. 따라서, 임의의 플라스미드 DNA가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 대표적인 벡터는 NV1FGF 플라스미드를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. NV1FGF는 말기 말초 동맥 폐색 질병 (PAOD) 또는 말초 동맥 질환 (PAD) 환자 치료에 유용한 산성 섬유모세포 성장인자 또는 섬유모세포 성장인자 타입 1 (FGF-1)을 코딩하는 플라스미드이다. 문헌 [Camerota et al., J Vasc. Surg., 2002, 35, 5:930-936]에는 휴식시 통증 또는 조직 괴사가 있는 회복 불가능한 51명의 말기 PAD 환자가 증가량의 단일 또는 반복 투여량의 NV1FGF을 허혈성 허벅지 및 종아리 내로 근내 주사하는 것이 기재되어 있다. 상이한 파라미터, 예를 들어 경피 산소압, 발목 및 발가락 상완 지수, 통증 평가, 및 궤양 치료를 후속적으로 평가하였다. NV1FGF 투여 후에 상완 지수의 유의한 증가, 통증 감소, 궤양 크기의 감소, 및 관류의 개선이 관찰되었다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 요법에 의한 인체 또는 동물 신체의 치료 방법에 사용하기 위한, 상기 정의된 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 조성물은 심혈관 질환, 예를 들어 말초 허혈, 말초 동맥 질환, 예를 들어 PAOD 또는 PAD, 중증 사지 허혈 (CLI) 및 간헐성 절뚝거림 (IC)의 치료를 위한, FGF 또는 VEGF 패밀리의 혈관신생 유전자를 코딩하는 pCOR 플라스미드를 포함한다.

또다른 바람직한 용도로서, 플라스미드 DNA는 면역처리 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, DNA 백신으로서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 세포내 바이러스를 포함하는 감염 물질에 대해, 및 종양 세포에 대해 효과적인 면역성을 생성시키는 인간 또는 동물의 면역 처리용 조성물을 제공한다. 사실상, 안정한 플라스미드 DNA 조성물은 특정 바이러스 단백질, 및 정상적으로는 빈약한 면역 반응을 생성시키는 암 특이적 항원의 면역원성을 크게 증강시키기 위한 DNA 백신으로서 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 허피즈 바이러스, 비-A형, 비-B형 간염 바이러스 및 HIV로부터의 불량한 면역원성 바이러스 단백질에 대해 세포독성 T 세포 면역성을 유도하기에 유용하다.

플라스미드 DNA는 체액성 또는 세포성 반응, 또는 둘 모두를 야기하기 위한 내인성 면역원으로서 또는 항체에 대해 작용할 수 있는 면역성 부여 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 이와 관련하여, 용어 "항체"는 임의의 클래스의 전체 면역글로불린, 키메라 항체, 및 이중 또는 다중 항원 또는 에피토프 특이성을 갖는 하이브리드 항체, 및 하이브리드 단편을 포함하는 단편, 예를 들어 F(ab)₂, Fab', Fab 등을 포함한다. 또한, "항체"의 의미에는 상기 단편의 컨쥬게이트, 및 예를 들어 미국 특허 4,704,692 (그 내용이 본원에 참고로 포함됨)에 기재된 소위 항원 결합 단백질 (단일쇄 항체)이 포함된다. 따라서, 계내 항체 생산을 위해 항체의 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드 DNA를 사용할 수 있다. 항체 코딩 폴리뉴클레오티드 제조에 관한 예시적인 방법에 대해서는 문헌을 참조한다 (Ward et al. Nature, 341:544-546 (1989); Gillies et al., Biotechnol. 7:799-804 (1989); 및 Nakatani et al., 상기 문헌, 805-810 (1989) 참조). 항체는 예를 들어 병원성과 관련된 표면 항원에 결합함으로써 치료 효과를 발휘할 것이다. 별법으로, 코딩된 항체는 예를 들어 미국 특허 4,699,880에 기재된 바와 같은 항개별특이형 항체 (다른 항체에 결합하는 항체)일 수 있다. 상기 항개별특이형 항체는 치료되는 개체에서 내인성 또는 외래 항체에 결합하여 예를 들어 자가면역 질병에서 면역 반응과 관련된 병리학적 상태를 완화 또는 억제할 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 조성물은 인간 또는 동물에게 생체내 투여되어 동물 신체의 상이한 세포, 예를 들어 근육, 피부, 뇌, 폐, 간, 비장 또는 혈액의 세포에 전달시킬 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 생체내 직접 전달은 바람직하게는 근육 또는 피부의 세포에 대해 수행된다. 주사는 예를 들어 주사기 또는 대상의 효과적인 면역처리를 제공하는 백신 건을 사용하여 근육 또는 피부 내로 수행될 수 있다. 사실상, 대상의 세포, 현재 항원을 발현하는 형질감염된 세포 내로 도입되는 항원에 대한 유전자는 정상적인 세포 경로에 의해 처리되어 면역계에 제시될 것이다. 보조제 또는 림포킨이 가능하게는 면역처리를 보다 향상시키기 위해 동시 주사될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 플라스미드 DNA 안정한 조성물은 세포 내에 불활성 또는 부분적으로 활성 형태로 유지되는 바이러스에 대한 면역처리를 위해, 또는 예를 들어 B형 간염, HIV 및 허피즈 바이러스 군 멤버와 같은 잠복 바이러스 감염을 치료하기 위한 DNA 백신으로서 사용될 수 있다. 본 발명의 플라스미드 DNA 조성물은 또한 악성 질병의 치료에, 악성 상태, 발암 유전자, 태아 항원 또는 활성화 마커에 특이적인 단백질에 대한 세포성 면역 반응을 증강시키기 위해 사용될 수 있다.

본 발명에 따라 장기간 보관을 위해 제제화되는 플라스미드 DNA (pDNA)는 대체로 세균 세포에서 생산된 후, 그로부터 pDNA가 단리되는 세포 내용물을 방출시키기 위해 용해된다.

상기 방법은 일반적으로 세포 재현탁, 세포 용해, 숙주 오염물질의 중화 및 침전을 포함하는 3 단계를 수반한다. 세포 재현탁은 세포를 재현탁 버퍼에 재현탁시키기 위해서 통상 수동 교반 또는 자기 교반기 및 균질화기 또는 임펠러 혼합기를 이용한다.

세포 용해는 재현탁된 세포를 리소자임 또는 희석된 알칼리 (염기), 예를 들어 알칼리성 또는 아세트산칼륨 (KOAc) 및 세제로 이루어지는 용해 용액과 혼합하기 위해 손으로 빙빙 돌리거나 자기 교반시킨 후, 혼합물을 실온 (20-25℃)에서 또는 빙상에서 일정 시간, 예를 들어 5분 동안 유지시켜 완전히 용해시킴으로써 수행할 수 있다. 또한, 세균 현탁액의 RNA를 분해하기 위해 RNase도 일반적으로 첨가된다. 제3 단계는 숙주 오염물질의 중화 및 침전이다. 제2 단계로부터의 용해물은 고분자량 염색체 DNA, 숙주 단백질, 및 다른 숙주 분자의 변성 및 침전을 용이하게 하기 위해 10-30분 동안 얼음 내에서 조절하기 전에 통상 용해물을 산성화시키기 위해 부드럽게 빙빙 돌리거나 자기 교반에 의해 차가운 중화 용액과 혼합된다.

세포 용해를 리소자임 처리를 사용하여 수행할 때, 세균은 리소자임과 접촉한 후, 적절한 버퍼 중에서 약 100℃에서 20 내지 40초 동안 비등시켜 게놈 DNA, 단백질 및 파쇄물의 불용성 덩어리를 형성하고, 이에 의해 RNA가 주 오염물질인 용액에 플라스미드가 존재하게 된다. 이어서, 세포질막을 용해시키기 위해서 NaOH 및 나트륨 도데실술페이트 (SDS)의 혼합된 용액을 첨가한다. NaOH는 부분적으로 DNA를 변성시키고, 부분적으로 RNA를 분해하고, SDS는 세포질막을 용해시키고 단백질을 변성시키는 작용을 수행한다. 성공적으로, SDS-단백질 복합체 및 세포 파쇄물은 5N 아세트산칼륨 (pH 4.8)을 첨가하여 침전시킨다. 이때, pH는 상기 처리에 사용되는 NaOH의 중화 및 플라스미드 재생 모두에 중요하다. 이후에, 원심분리를 수행하여 침전물을 제거하고, 상등액 중에서 목적하는 플라스미드 DNA를 얻는다.

별법으로, 알칼리성 용해를 수행하고, 이는 세균 세포의 현탁액을 알칼리성 용해 용액과 혼합하는 것으로 이루어진다. 알칼리성 용해 용액은 세균 세포를 용해시키고 세포내 물질을 방출시키는 세제, 예를 들어 소듐 도데실 술페이트 (SDS), 및 세포의 단백질 및 핵산 (특히 gDNA 및 RNA)을 변성시키는 알칼리, 예를 들어 수산화나트륨으로 이루어진다. 세포가 용해되고 DNA가 변성되면서, 용액의 점도는 크게 증가한다. 변성 후에, 산성 용액, 예를 들어 아세트산칼륨 (용액 3)을 첨가하여 수산화나트륨을 중화시키고 핵산 재생을 유도한다. gDNA의 긴 단편은 랜덤하게 회합하여 단백질, 지질 및 다른 핵산을 포획하는 부유체로서 침전하는 네트워크를 형성한다. 또한, 도데실 술페이트의 칼륨염이 침전되고, 그와 회합되는 단백질을 함께 침전시킨다. 서로 얽힌 pDNA (플라스미드 DNA)의 두 가닥이 정상적으로 재회합하여 초기 플라스미드를 형성하고, 이는 용액에 남는다.

상기 화학적 단계는 5리터 미만의 소규모 또는 작은 부피의 세균 발효에서 세포를 용해시키기에 적합할 수 있지만, 점도의 증가는 대규모 처리를 더 어렵게 만들 수 있다.

용해 기술은 상이한 용액을 순차적으로 용기 또는 탱크에 첨가함으로써 혼합되는 배치식으로 수행할 수 있다. 세포 현탁액을 포함하는 용액을 용해 용액과 혼합한 후에, 점탄성 알칼리성 용해물을 중화 용액과 혼합한다.

특히 대규모 플라스미드 생산이 고려될 때 배치식 방법에 대한 대안으로서 일련의 고정 혼합기를 사용하여 상이한 세포 용해 용액을 연속적으로 혼합하는 방법이 사용될 수 있다. 상기 방법에 따르면, 세포 현탁액 용액 및 세포 용해 용액은 동시에 고정 혼합기에 첨가된다. 이어서, 제1 고정 혼합기를 빠져나가는 용해된 세포 용액 및 침전 용액이 동시에 제2 고정 혼합기에 첨가된다. 상기 제2 혼합기를 빠져나가는 용액은 침전된 용해물 및 플라스미드를 포함한다. 다른 연속 방식의 세포 용해는 현탁된 세포가 70-100℃로 가열되는 관통 유동 열 교환기의 사용을 포함한다. 열 교환기에서 세포 용해 후에, 배출 스트림은 연속 유동 또는 배치식-유사 원심분리에 적용되고, 그 동안 세포 파쇄물 및 게놈 DNA가 침전되어 플라스미드 DNA가 상등액에 존재하게 된다.

특히 대규모로 세균 세포 현탁액의 연속 알칼리성 용해를 위한 바람직한 방법은 본원에 참고로 포함된 국제 특허 출원 공개 WO 05/026331에 기재되어 있다. 상기 바람직한 방법은 혼합 단계 동안 수반되는 유체의 점탄성 및 전단력에 의해 야기되는 문제를 처리하고, 전단력 제한시에 큰 잇점을 제공한다. 따라서, 본원에서 상세히 설명되는, 규모 확대가 가능한 숙주세포의 연속 알칼리성 용해 방법을 사용하여 플라스미드 DNA를 높은 수율로 제조할 수 있다.

제1 단계로서, 숙주세포를 지수 성장기 세포에서 플라스미드 DNA로 접종, 즉 형질전환시키고, 항생제, 예를 들어 테트라사이클린을 함유하는 LB 배지를 포함하는 플레이트에 도말한다. 이어서, 플레이트로부터 단일 콜로니를 각각 별개의 멸균 플라스틱 얼렌마이어(Erlenmyer) 플라스크 내의 적절한 항생제 테트라사이클린으로 보충한 20 ml LB 배지에 접종하고, 37℃에서 진탕 인큐베이터에서 12-16시간 동안 성장시킨다. 상기 배양액 중의 하나를 사용하여 2L 얼렌마이어 플라스크에 보충된 200 ml의 멸균 LB 배지를 접종하였다. 이를 37℃ 및 200 rpm에서 진탕 인큐베이터에서 성장시키고, 2개의 5 L 얼렌마이어 플라스크를 접종하고, 30℃ 및 200 rpm에서 진탕 인큐베이터에서 성장시키고, 5시간 후에 2 단위의 OD600 nm에서 중기 지수 성장기에 발효 용기에 접종시켰다.

숙주세포 배양 및 접종은 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 숙주세포는 높은 생물량에 도달하고 대량의 플라스미드 DNA를 갖도록 세포가 지수 성장기에 존재할 때까지 성장한다. 2가지 특유한 방법, 즉 배치식 및 유가식 (fed-batch) 발효를 사용할 수 있다.

배치식 발효는 성장 온도 및 사용되는 탄소 공급원의 조작을 통한 성장 속도의 조절을 허용한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "배치식 발효"는 세포 성장 및 배양된 세포에 포함된 플라스미드의 생산을 위해 필요한 모든 영양물질이 접종시에 과량, 예를 들어 10배 이하의 과량 농도로 용기에 존재하여 멸균 처리 후 첨가 후에 멸균 용기에 첨가할 필요성 및 복잡한 공급 모델 및 전략에 대한 필요성을 방지하는 세포 배양 공정이다. 특히, 배치식 배지 내의 효모 추출물의 양은 5 g/리터 (LB 배지에서처럼)로부터 20 g/리터로 풍부하게 되어 다량의 성장 인자 및 핵산 전구체를 제공한다. 배지는 또한 유기 질소 공급원으로서 작용하는 황산암모늄 (5 g/리터)으로 보충된다.

다른 유형의 발효는 유가식 발효로서, 세포 성장 속도는 세포 성장 동안 배양액에 영양물질을 첨가함으로써 조절된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "유가식 발효"는 발효 동안 대사물질을 배양액에 조심스럽게 모니터링하면서 첨가함으로써 성장 속도를 조절하는 세포 배양 공정을 의미한다. 본 발명에 따른 유가식 발효는 세포 배양액이 배치식 발효보다 많은 생물량에 도달하도록 허용한다. 50L 제제에 대한 발효 공정의 예 및 예시적인 공급물 첨가 속도를 아래에서 설명한다. 그러나, 다른 부피, 예를 들어 10L, 50L, 또는 500L 초과의 부피도 설비 규모에 따라 아래에서 설명되는 예시적인 공급 속도를 사용하여 처리할 수 있다. 고농축 배치식 배지 및 유가식 배지 발효가 특정 플라스미드 수율을 최대화하고 계속 지수 성장이면서 높은 생물량의 수거를 허용하기 위한 높은 세포 밀도 배양액의 생산에 적절하다. 유가식 발효는 탄소원으로서 글루코스 또는 글리세롤을 이용한다. 발효는 초기 탄소 기질 (글루코스)이 소모될 때까지 배치식으로 작동된다. 이 시점은 DO의 급작스러운 상승으로 알 수 있고, 그 직후 채취한 샘플의 글루코스 분석에 의해 확인된다. 이어서, 사전에 프라이밍시킨 공급 배지 펌프를 작동시킨다. 펌프 속도는 그 전부가 본원에 참고로 포함된 문헌 [Curless et al., Bioeng. 38:1082-1090, 1991]에서 유래한 모델에 의해 결정된다. 상기 모델은 유가식 공정의 공급기의 조절을 용이하게 하도록 디자인된 것이다. 초기 배치식 공정에서, 비-억제 농도의 기재가 그의 최대 비성장 속도로 성장하는 세포에 의해 소비되어 접종 후에 생물량 수준을 급격히 상승시킨다. 배양액은 독성 대사물질의 축적에 의해 상기 속도로 무한히 성장할 수 없다 (Fieschio et al., "Fermentation Technology Using Recombinant Microorganisms." In Biotechnology, eds. H. J. Rhem and G. Reed. Weinheim: VCH Verlagsgesellschaft mbH 7b: 117-140, 1989). 계속적인 로그 성장을 허용하기 위해서, 모델은 작동장치에 의해 설정된 유가식 성장기를 제공하기 위해 피드백 조절의 필요 없이 성장 제한 탄소 기재의 시간에 따른 공급 속도를 계산한다. 이것은 억제성 이화대사산물의 축적을 야기하지 않고 높은 생물량을 제공하기에 충분한 수준으로 선택된다. 유가식 발효에서 공급 과정 동안 전구체 (황산암모늄 형태의 유기 질소)의 첨가는 플라스미드 품질에 대한 유해한 효과를 억제하도록 디자인된다.

당업계의 공지의 용해 방법, 예를 들어 플라스미드를 포함하는 미생물 세포의 관통 유동 가열 용해를 사용할 수 있다. 상기 공정은 특히 국제 출원 공개 WO 96/02658에 기재되어 있다. 특정 열 교환기는 코일 (coil) 형태로 형성된 10 피트 x 0.25 인치 O.D. 스테인레스 스틸 튜브로 구성되었다. 코일은 일정한 고온 수조에 완전히 침지된다. 코일의 보유 부피는 약 50 mL이다. 열전쌍 및 온도계를 사용하여 각각 유입구 및 배출구 온도, 및 수조 온도를 측정하였다. 생성물 스트림은 실리콘 배관을 갖는 Masterflex 연동 펌프를 사용하여 가열 코일 내로 펌핑한다. 세포 용해물은 코일에서 배출된 후, Beckman J-21 배치 원심분리기에서 원심분리된다. 원심분리 후에, 플라스미드 DNA는 본 발명에 따른 정제 방법을 사용하여 정제될 수 있다.

다른 세포 용해는 일련의 고정 혼합기를 이용할 수 있다. WO97/23601 (본원에 참고로 포함됨)에 기재된 바와 같이, 제1 고정 혼합기를 통해 세포를 용해시키고 제2 고정 혼합기를 통해 세포 용해물을 침전시키기 위한 고정 혼합기를 본 발명에 따른 플라스미드 DNA 정제 방법 전에 세포를 용해시키기 위한 대안적인 방법으로서 사용할 수 있다. 고정 혼합기를 사용하여 큰 부피의 세포를 부드럽게 연속적으로 인-라인(in-line)으로 용해시키고, 다른 기능, 예를 들어 희석 및 침전을 수행하기 위해서 다른 고정 혼합기가 인-라인으로 배치된다. 본 발명의 방법에 유용한 적합한 고정 혼합기는 본 발명의 방법을 허용하기에 충분한 길이의 고정 또는 정지식 혼합기로 당업계에서 불리는 임의의 관통 유동 장치를 포함한다. 예를 들어, 세포 용해를 위해, 고정 혼합기는 혼합기를 통과하는 동안 해당 세포의 용해를 야기하기 위해 용해 용액과 세포 사이의 충분한 접촉 시간을 제공하는 길이를 가질 필요가 있다. 적합한 고정 혼합기는 액체를 난류에서 함께 혼합하는 반대 회전 유동으로 두 액체를 서로 접촉시키는 내부 나선 구조를 포함한다.

세포 용해를 위한 가장 바람직한 방법 또는 장치는 (a) 세포 현탁액 (도 1의 용액 1)을 세포를 용해시키는 용액 (도 1의 용액 2)과 신속하게 혼합하기 위해 난류 수단; 및 (b) (a)에서 형성된 혼합물을 실질적인 진탕 없이 인큐베이션하는 것을 허용하기 위해 층류 수단을 포함하고, 여기서 (a)에서 형성된 혼합물은 난류 수단으로부터 층류 수단으로 유동한다. 또한, 이는 용해 용액을 중화시키는 제3 용액 (도 1의 용액 3)을 첨가하기 위한 수단을 포함할 수 있고, 여기서 (b)에서 인큐베이션된 혼합물은 층류 수단으로부터 제2 용액을 첨가하기 위한 수단 내로 유동한다. 따라서, 예를 들어 (a) 세포를 난류 수단에서 알칼리성 용해 용액과 혼합하고; (b) 산성 용액을 첨가하여 알칼리성 용해 용액을 중화시키는 것을 포함하는 상기 공정은 플라스미드 DNA를 세포로부터 단리하기 위해 사용될 수 있다.

상기 방법은 점탄성 유체가 보이기 전에 세포 현탁액 (용액 1)을 알칼리성 용액 (용액 2)과 균일하고 매우 신속하게 혼합하여 전단력 제한시에 큰 잇점을 제공하기 위해 T 튜브를 사용한다. T 튜브는 혼합된 유체의 접촉 시간을 증가시키기 위해서 일반적으로 대체로 직경이 1 cm 이하, 바람직하게는 약 2 내지 8 mm, 보다 바람직하게는 약 6 mm인 작은 직경 배관을 갖지만, 상기 방법은 튜브 통과에 의해 유도되는 혼합을 이용하지 않는다. 하기 표 1은 도 1에 도시된 바와 같은, 각각 난류, 층류 및 난류 수단의 파라미터 B1a, B1b, B2 및 그의 대응하는 유속 S1, S2 및 S3의 변동을 보여준다.

B1a (60 L/h)		B1b (60L/h)		B2 (90L/h)		유속
직경	길이	직경	길이	직경	길이	S1, S2, S3	범위
5 내지 7 mm	2 내지 6 m	12.5 내지 19 mm	13 내지 23 m	5 내지 8 mm	2 내지 4 m	60/60/90 L/h	±20％

상기 방법은 세포의 용해 용액으로의 분산을 허용하는, T 대신에 튜브를 갖는 혼합기 또는 주사기를 사용할 수 있다. 따라서, 튜브를 통해 통과하는 유체 상의 기계적 응력은 유체가 예를 들어 탱크 내에서 패들에 의해 교반될 때보다 크게 감소된다. 초기 혼합 효율은 수초 내에 훨씬 더 크고, 이것은 유체가 아직 점탄성을 갖지 않고, 소직경 튜브에 의해 달성되는 혼합이 매우 효율적이기 때문이다. 이와 대조적으로, T 튜브가 혼합에 사용될 때, 초기 혼합은 단지 중간 정도이고, 유체가 신속하게 점탄성이 되면서 튜브 내에서 유동하는 동안 상당한 문제를 야기한다. 이러한 부분적인 혼합은 단지 세포의 일부만을 용해시키고, 따라서 중화 전에 플라스미드의 일부만을 방출시킬 수 있다. 용해는 용해 동안 두 상, 즉 상 I 및 상 II로 분할할 수 있다. 상기 두 상은 I) 세포의 용해 및 II) 핵산의 변성에 대응하고, 이는 점탄성 유체를 생성시키는 유동학적 거동의 큰 변경을 야기한다. 튜브의 직경을 조정하면 상기 두 상의 필요성을 충족시킬 수 있다. 소직경 튜브 (B1a) 내에서, 혼합은 증가한다. 이것은 상 I에 사용되는 형상이다. 큰 직경 튜브 (B1b) 내에서, 혼합 (및 따라서 전단 응력)은 감소한다. 이것은 상 II에 사용되는 형상이다.

사용된 바람직한 혼합기는 도 2에 도시된 바와 같은 M1으로 불리는 것이지만, 본 발명에 따른 세포 현탁액의 분산액을 제공하기 위해 임의의 T 형상 장치도 사용될 수 있다. 상기 혼합기를 사용하여 용해를 수행하는 한 방법은 효율적인 분산액을 얻기 위해 용액 1을 소직경 오리피스를 통해 알칼리성 용해 용액 내로 역류로 주사하는 것이다. 상기 오리피스의 직경은 도시된 형상에서 약 0.5 mm 내지 2 mm, 바람직하게는 약 1 mm일 수 있다. 이어서, 혼합물은 혼합기 M1을 빠져나가 단시간 (약 2.5초) 동안 소직경의 튜브 (도 1)를 통과한다. 직경 및 유동 시간의 조합은 난류를 유지하기 위해 쉽게 계산될 수 있다. 이러한 파라미터의 변동의 예는 표 1에 제시된 바 있다. 튜브 직경에 대한 모든 언급은 튜브 벽의 두께 자체를 포함하는 외부 직경이 아니라 튜브의 내경을 의미한다. 상기 튜브 내의 짧은 체류 시간은 용액 1 및 2의 매우 신속한 균질화를 허용한다. I상 동안 용액 1 및 용액 2가 여전히 뉴턴 유체인 것으로 가정하므로, 유동 방식은 균질화상 동안 난류이다. 상기 튜브로부터의 배출구에서, 용액 1 및 2는 균질화되고, 현탁액 내의 세포의 용해가 시작된다.

이어서, 균질화된 혼합물은 훨씬 더 큰 직경 (도 1)의 제2 튜브 (B1b)를 통과하고, 여기서 세포의 용해 및 점탄성 유체의 형성이 발생한다. 상기 상 동안, 혼합은 최소화될 수 있고, gDNA를 단편화시키는 임의의 전단 응력을 최소화하기 위해 용액은 가능한 한 난류를 제한하기 위해 "정체"할 수 있다. 약 1 내지 3분, 약 2분, 바람직하게는 1분 20초의 접촉 시간은 세포 용해를 완료하고 핵산을 변성시키기에 충분할 수 있다. 변성 상 동안, 유체의 유동 방식은 층류일 수 있고, 세포 성분을 향한 SDS 및 수산화나트륨의 느린 확산을 촉진시킨다.

이와 같이 얻은 용해물 및 중화 용액 3은 이어서 M2로 불리는 Y 혼합기로 혼합될 수 있다. 본 발명의 한 실시태양에서, Y 혼합기의 내경은 약 4 내지 15 mm, 또는 약 6 내지 10 mm이고, 약 6 mm 또는 약 10 mm일 수 있다. 작은 직경의 튜브 (예를 들어, 약 6 mm 튜브)가 Y 혼합기의 배출구에 위치하여 용해물과 용액 3의 신속하고 (< 1초) 효과적인 혼합을 가능하게 한다. 이어서, 중화된 용액은 수거 탱크에 회수된다. 중화 동안, 신속하게 저하된 pH는 응집체 형성 (즉 덩어리 또는 괴의 형성)을 유도한다. 다른 한편으로, 부분적으로 변성된 플라스미드는 매우 신속하게 재생되어 용액에 유지된다. 부유체는 점진적으로 수거 탱크에서 침강되고, 대부분의 오염물질을 소실시킨다. 도 1에 도시된 모식도는 연속 용해 (CL) 시스템의 한 실시태양을 보여준다. 연속 용해는 그 자체로 또는 추가의 공정과 함께 사용될 수 있다.

임의의 종류의 세포, 즉 원핵세포 또는 진핵세포는 용해, 예를 들어 표적 세포로부터 요구되는 플라스미드 DNA의 방출 (후속적으로 정제됨)과 관련된 임의의 목적을 위해 상기 방법으로 용해시킬 수 있다.

상기 연속 알칼리성 용해 단계의 과정은 정지기에 아직 도달하지 않아 지수 성장 (2-10 g 건조 중량/리터) 중에 있는 세포의 생물량으로 성장한, 발효액으로부터 수거한 세포에 대해 수행할 수 있다. 연속 알칼리성 용해 단계는 또한 세포의 높은 생물량으로 성장하고 더 이상 지수 성장 중이 아니지만 정지기에 도달한, 세포 농도가 약 10-200 g 건조 중량/리터, 바람직하게는 12-60 g 건조 중량/리터인, 발효액으로부터 수거한 세포에 대해 수행할 수 있다.

플라스미드 DNA는 본 발명에 따라 안정한 보관 조성물로 제제화되기 전에 상이한 방법을 사용하여 정제될 수 있다. 사실상, 종종 세균 제제로부터 생산되는 플라스미드 DNA 제제는 이완형 및 수퍼코일형 플라스미드 DNA의 혼합물을 포함한다. 플라스미드 DNA 정제 방법은 당업계에 공지되어 있다.

일반적으로, 플라스미드 DNA를 세균 발효액으로부터 단리 및 정제하는 방법은 상기한 플라스미드를 포함하는 세균 숙주세포를 붕괴시키고, 용해물을 아세테이트로 중화시켜 숙주세포 게놈 DNA 및 단백질을 침전시킨 후, 예를 들어 원심분리에 의해 제거하는 것으로 구성된다. 액체 상은 플라스미드 DNA를 포함하고, 이는 알콜 침전된 후, 상이한 형태의 플라스미드 DNA, 즉 수퍼코일형, 닉 형성된 환상 및 선형화된 플라스미드 DNA를 분리하기 위해 에티듐 브로마이드의 존재 하에 CsCl을 사용한 등밀도 원심분리에 적용된다. 부탄올을 사용한 추가의 추출은 잔류 에티듐 브로마이드를 제거한 후 알콜을 사용한 DNA 침전을 위해 필요하다. 숙주세포 단백질을 제거하기 위해 추가의 정제 단계를 수행한다. 상기 방법은 일반적으로 소규모 또는 실험실 규모 플라스미드 제조에 적합하다.

대안적인 방법은 예를 들어 크기 배제 크로마토그래피, 히드록시아파타이트 상의 크로마토그래피, 및 역상 또는 음이온 교환에 기초한 상이한 크로마토그래피 방법을 포함한다. 상기 대안은 소량의 연구 물질을 실험실 규모로 생산하기에 적합할 수 있지만, 다량의 플라스미드 DNA를 생산하기 위해 규모를 증대시키는 것이 쉽지 않을 수 있다. 예를 들어, 플라스미드 DNA를 분리하기 위한 이용가능한 방법은 첨가제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 세제 및 다른 성분, 예를 들어 헥사민 코발트, 스페르미딘, 및 폴리비닐피롤리돈 (PVP)의 사용과 연결된 이온 교환 크로마토그래피 (Duarte et al., Journal of Chromatography A, 606 (1998), 31-45) 또는 크기 배제 크로마토그래피 (Prazeres, D.M., Biotechnology Techniques Vol. 1, No. 6, June 1997, p 417-420)를 포함한다. 수퍼코일형 및 이완형 형태의 플라스미드 DNA의 분리를 위한 대안적인 공지의 방법은 처리 동안 수지 및 용매, 예를 들어 아세토니트릴, 에탄올 및 다른 성분, 예를 들어 트리에틸아민 및 테트라부틸 암모늄 포스페이트를 이용한다.

치료 측면에서 핵산 또는 플라스미드 DNA가 인간 또는 동물에게 도입되는 경우에, 고도로 정제된 제약 등급 플라스미드 DNA가 필요하고, 상기 정제된 핵산은 안전성, 효과 및 효능의 약물 품질 표준을 충족시켜야 한다. 오염 내독소의 제거는 플라스미드 DNA가 높은 수준의 내독소를 갖는 그람 음성 세균 공급원으로부터 정제될 경우에 특히 필요할 수 있다. 상기 내독소는 일반적으로 지질다당류, 또는 그의 단편이고, 이는 그람 음성 세균의 외막 성분이고 숙주세포의 DNA 제제 및 숙주세포막 또는 거대분자에 존재한다. 내독소는 플라스미드 DNA가 투여된 숙주에서 염증 반응, 예를 들어 열 또는 패혈증을 야기할 수 있다. 따라서, 내독소의 제거는 치료 또는 예방 용도를 위한 플라스미드 DNA의 정제에서 중요하고 필요한 단계일 수 있다. 플라스미드 DNA 용액으로부터 내독소의 제거는 주로 내독소의 음대전된 구조를 사용한다. 그러나, 플라스미드 DNA도 음대전되고, 따라서, 분리는 대체로 상기 분자 모두에 결합하여 특정 조건 하에서 내독소에 결합하면서 플라스미드 DNA를 우선적으로 용출시키는 음이온 교환 수지를 사용하여 달성된다. 환자에게 투여될 경우 독성 반응을 유발할 수 있는 오염 내독소가 존재하지 않는 핵산을 제조하는 것에 추가하여, 생성되는 핵산의 안전성 또는 효능을 손상시키는 독성 화학물질, 돌연변이원, 유기 용매 또는 다른 시약을 포함하지 않는 고순도의 핵산을 제조하는 것이 바람직할 수 있다.

본 발명에 따라 장기간 보관을 위해 안정한 수용액 중에 플라스미드 DNA를 제제화하기 전에, 플라스미드 DNA는 바람직하게는 크로마토그래피 단계의 조합을 통해 정제하여, 낮은 수준, 즉 수 ppm의 오염 염색체 DNA, RNA, 단백질 및 내독소를 포함하고 대부분 폐환형 형태의 플라스미드 DNA를 포함하는 플라스미드 DNA 제제를 얻을 수 있다. 보다 바람직하게는, 국제 출원 공개 WO95/026331 및 국제 출원 PCT/EP2005/005213에 기재된 정제 방법이 연구 및 플라스미드 기재 요법, 예를 들어 유전자 요법 및 DNA 백신에 적용하기 위한 플라스미드 DNA의 제조에 사용된다.

정제 방법은 임의로 또는 전형적으로 최종 정제 단계로서 또는 적어도 플라스미드 정제 과정의 종료시에 또는 종료에 가까운 시점에 적어도 하나의 추가의 크로마토그래피 기술이 선행하거나 후행하는 삼중 나선 친화도 크로마토그래피의 사용을 포함한다. 삼중 나선 친화도 크로마토그래피는 하나 이상의 크로마토그래피 단계, 예를 들어 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 투과, 또는 크기 배제 크로마토그래피, 히드록시아파타이트 (타입 I 및 II) 크로마토그래피, 역상 및 친화도 크로마토그래피와 조합되어 사용된다. 핵산 분리를 수반하는 임의의 이용가능한 친화도 크로마토그래피 프로토콜이 사용을 위해 채용될 수 있다. 사용되는 음이온 교환 크로마토그래피 또는 임의의 하나 이상의 다른 크로마토그래피 단계 또는 기술은 정지상, 치환 크로마토그래피 방법, 모사 (simulated) 이동층 기술, 및/또는 연속층 컬럼 또는 시스템을 사용할 수 있다. 또한, 임의의 하나 이상의 단계 또는 기술은 고성능 크로마토그래피 기술 또는 시스템을 사용할 수 있다.

따라서, 상기 방법은 바람직하게는 삼중 나선 친화도 크로마토그래피를 이온 교환 크로마토그래피의 추가의 단계와 함께 포함하는 정제 단계를 포함하고, 소수성 상호작용 크로마토그래피 또는 겔 투과 크로마토그래피를 추가로 포함할 수 있다. 이온 교환 크로마토그래피 단계는 유동층 이온 교환 크로마토그래피와 축방향 및/또는 방사상 고분리능 음이온 교환 크로마토그래피일 수 있다. 가장 바람직한 방법은 이온 교환 크로마토그래피, 삼중 나선 친화도 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 단계의 조합 (제시된 순서로 수행)을 포함한다. 용해물 여과 또는 다른 응집체 제거가 제1 크로마토그래피 단계에 선행할 수 있다.

따라서, 연속 용해는 상기 나열된 정제 단계와 조합될 수 있고, pDNA를 포함하는 고순도 생성물을 생성시킨다. 연속 용해는 예를 들어 응집체 제거 (예를 들어 용해물 여과, 침강, 또는 원심분리), 이온 교환 크로마토그래피 (예를 들어 양이온 또는 음이온 교환), 삼중 친화도 크로마토그래피, 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 중의 적어도 하나와 조합될 수 있다. 한 실시태양에서, 연속 용해 후에 음이온 교환 크로마토그래피, 삼중 친화도 크로마토그래피, 및 소수성 상호작용 크로마토그래피가 순서대로 수행된다. 다른 연속 용해에서, 용해물 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 삼중 친화도 크로마토그래피, 및 소수성 상호작용 크로마토그래피가 순서대로 이어서 수행된다. 상기 단계는 전례가 없는 순도를 갖는 대량의 pDNA를 생산할 수 있는, 실제로 규모 확장이 가능한 플라스미드 제조 방법을 가능하게 한다. 숙주 DNA 및 RNA 및 단백질은 ppm 미만의 범위로 존재한다.

또한, 상기 방법은 본원에 따라 본원에 기재된 단계와 조합된 크기 배제 크로마토그래피 (SEC), 역상 크로마토그래피, 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 및/또는 다른 이용가능한 크로마토그래피 기술, 방법, 또는 시스템의 추가 단계를 사용할 수 있다.

응집체 제거는 생성되는 pDNA 생성물에 보다 높은 순도를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 상기 단계는 대부분의 침전된 물질 (응집체)을 제거하기 위해 사용될 수 있다. 응집체 제거를 수행하기 위한 한 메카니즘은 예를 들어 1 내지 5 mm, 바람직하게는 3.5 mm 그리드 필터를 통한 용해물 여과 단계, 이어서 연마 여과 단계로서의 다층 여과이다. 응집체 제거를 수행하는 다른 방법은 원심분리 또는 침강이다.

이온 교환 크로마토그래피는 생성되는 pDNA 생성물에 보다 높은 순도를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 음이온 교환은 오염물질의 특성 및 용액의 pH에 따라 선택될 수 있다.

음이온 교환 크로마토그래피는 생성되는 pDNA 생성물에 보다 높은 순도를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 음이온 교환 크로마토그래피는 음대전된 (또는 산성) 분자를 양대전된 지지체에 결합시킴으로써 기능한다. 이어서, 이온 교환 크로마토그래피의 사용에 의해 분자를 그의 하전에 기초로 하여 분리할 수 있다. 일군의 분자 (산성, 염기성 및 중성)는 상기 기술에 의해 쉽게 분리할 수 있다. 단계적인 용출 과정을 사용할 수 있고, 많은 오염물질이 초기 분획으로 용출되고, pDNA는 후기 분획으로 용출된다. 음이온 교환은 pDNA 제제로부터 단백질 및 내독소의 제거를 위해 매우 효율적이다.

이온 교환 크로마토그래피를 위해, 충전 물질 및 상기 물질의 제조 방법 및 음이온 교환 크로마토그래피를 제조, 중합 및 관능화시키고 이를 통해 플라스미드 DNA를 용출 및 분리하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.

음이온 교환 크로마토그래피의 충전 물질을 위해 사용되는 염기 물질의 합성에 사용되는 화합물은 소수성 또는 상이한 이온 교환기를 보이는 상이한 관능기가 염기 물질이 합성된 후 후반응에 의해 도입될 수 있는 임의의 화합물일 수 있다. 일관능성 모노머의 예는 스티렌, o-할로메틸스티렌, m-할로메틸스티렌, p-할로메틸스티렌, o-할로알킬스티렌, m-할로알킬스티렌, p-할로알킬스티렌, α-메틸스티렌, α-메틸-o-할로메틸스티렌, α-메틸-m-할로메틸스티렌, α-메틸-p-할로메틸스티렌, α-메틸-o-할로알킬스티렌, α-메틸-m-할로알킬스티렌, α-메틸-p-할로알킬스티렌, o-히드록시메틸스티렌, m-히드록시메틸스티렌, p-히드록시메틸 스티렌, o-히드록시알킬스티렌, m-히드록시알킬스티렌, p-히드록시알킬스티렌, α-메틸-o-히드록시메틸스티렌, α-메틸-m-히드록시메틸스티렌, α-메틸-p-히드록시메틸스티렌, α-메틸-o-히드록시알킬스티렌, α-메틸-m-히드록시알킬스티렌, α-메틸-p-히드록시알킬스티렌, 글리시딜 메타크릴레이트, 글리시딜 아크릴레이트, 히드록시에틸 아크릴레이트, 히드록시메타크릴레이트, 및 비닐 아세테이트를 포함한다. 가장 바람직한 화합물은 방향족 고리 상에 치환된 할로알킬기, 할로겐, 예를 들어 Cl, Br, I 및 F 및 탄소 원자수 2 내지 15의 직쇄 및/또는 분지쇄 포화 탄화수소이다. 다관능성 모노머의 예는 디비닐벤젠, 트리비닐벤젠, 디비닐톨루엔, 트리비닐톨루엔, 디비닐나프탈렌, 트리비닐나프탈렌, 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트, 에틸렌 글리콜 디아크릴레이트, 디에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트, 디에틸렌 글리콜 디아크릴레이트, 메틸렌비스메타크릴아미드 및 메틸렌비스아크릴아미드를 포함한다.

다양한 이온 교환기는 후반응에 의해 도입될 수 있다. 염기 물질의 제조는 일관능성 모노머 및 다관능성 모노머를 적절한 비율로 칭량하고, 형성된 입자 내의 세공을 조절하기 위해 사용되는 정확하게 칭량된 희석제 또는 용매 및 유사하게 정확하게 칭량된 중합 개시제를 첨가한 후 잘 교반하는 제1 단계를 포함한다. 이어서, 혼합물을 수중유형 현탁액 중합에 적용하고, 여기서 혼합물은 미리 정확하게 칭량된 현탁액 안정화제가 용해된 수용액에 첨가하고, 교반기를 사용한 혼합에 의해 목적하는 크기를 갖는 유적 (oil droplet)을 형성하고, 혼합된 용액을 점진적으로 가온시켜 중합을 수행한다. 일관능성 모노머 대 다관능성 모노머의 비율은 염기 물질의 연질 입자를 얻기 위해 일반적으로 약 1 mol의 일관능성 모노머 대 약 0.01 내지 0.2 mol의 다관능성 모노머이다. 중합 개시제도 특별히 제한되지 않고, 통상적으로 사용되는 아조비스 타입 및/또는 퍼옥시드 타입이 사용된다.

유적 자체 중의 응집을 방지하기 위해서 현탁액 안정화제, 예를 들어 이온계 계면활성제, 비이온계 계면활성제 및 양쪽성 특성을 갖는 중합체 또는 이들의 혼합물도 사용할 수 있다.

플라스미드 DNA 정제를 위한 이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 충전 물질은 비교적 큰 세공 직경, 특히 1500 내지 4000 옹스트롬의 세공 직경을 갖는 것이 바람직하다. 이온 교환기를 염기 물질에 도입하기 위한 표면 변형은 당업계에 공지되어 있다.

이온 교환 크로마토그래피를 위해 두 종류의 용리액이 사용될 수 있다. 저농도의 염을 포함하는 제1 용리액 및 고농도의 염을 포함하는 제2 용리액이 사용될 수 있다. 용출 방법은 제1 용리액에서 제2 용리액으로의 단계적인 전환으로 구성되고, 구배 용출 방법은 조성물을 제1 용리액에서 제2 용리액으로 연속적으로 변경시키는 것으로 이루어진다. 이온 교환 크로마토그래피를 위해 상기 용리액에 일반적으로 사용되는 버퍼 및 염이 사용될 수 있다. 저농도의 염을 포함하는 제1 용리액에 대해, 버퍼 농도가 10 내지 50 mM이고 pH값이 6 내지 9인 수용액이 특히 바람직하다. 고농도의 염을 포함하는 제2 용리액에 대해, 용리액 C에 첨가된 0.1 내지 2M 나트륨 염의 수용액이 특히 바람직하다. 나트륨 염의 경우, 염화나트륨 및 황산나트륨을 사용할 수 있다.

또한, 이. 콜라이 (E. coli)의 용해물 내의 DNA-분해 효소에 의한 플라스미드의 분해를 억제하기 위해 2가 금속 이온에 대한 킬레이팅제, 예를 들어 에틸렌디아민-테트라아세트산을 사용할 수 있다. 2가 금속 이온에 대한 킬레이팅제의 농도는 바람직하게는 0.1 내지 100 mM이다.

포로스 애니온 익스체인지 레진즈 (POROS Anion Exchange Resins), 퀴아겐 (Qiagen), 토소 하스 (Toso Haas), 스테로겐 (Sterogene), 스페로덱스 (Spherodex), 뉴클레오팩 (Nucleopac), 및 파마시아 (Pharmacia)로부터 입수가능한 것을 포함하여 이로 제한되지 않는 매우 다양한 시판 음이온 교환 매트릭스가 본 발명에서 사용하기 적합하다. 예를 들어, 컬럼 (Poros II PI/M, 4.5 mm x 100)은 초기에 pH 7.5 및 0.7 M NaCl에서 20 mM Bis/TRIS 프로판으로 평형화된다. 샘플을 로딩하고, 동일한 초기 버퍼로 세척한다. 약 25 컬럼 부피의 0.5 M 내지 0.85 M NaCl의 용출 구배를 이어서 적용하고, 분획을 수거한다. 바람직한 음이온 교환 크로마토그래피는 프락토겔 TMAE HiCap을 포함한다.

삼중 나선 친화도 크로마토그래피는 미국 특허 6,319,672, 6,287,762 및 본 출원인의 국제 출원 WO02/77274에 기재되어 있다.

삼중 나선 친화도 크로마토그래피는 올리고뉴클레오티드와 이중가닥 DNA 내의 표적 서열의 특이적 혼성화에 기초한 것이다. 이들 올리고뉴클레오티드는 다음 염기를 포함할 수 있다:

- 티미딘 (T): 이중가닥 DNA의 A.T 더블렛 (doublet)과 트리플렛 (triplet)을 형성할 수 있음 (Rajagopal et al., Biochem 28 (1989) 7859);

- 아데닌 (A): 이중가닥 DNA의 A.T 더블렛과 트리플렛을 형성할 수 있음;

- 구아닌 (G): 이중가닥 DNA의 G.C 더블렛과 트리플렛을 형성할 수 있음;

- 양성자화된 시토신 (C+): 이중가닥 DNA의 G.C 더블렛과 트리플렛을 형성할 수 있음 (Rajagopal et al., 상기 문헌);

- 우라실 (U): A.U 또는 A.T 염기쌍과 트리플렛을 형성할 수 있음.

바람직하게는, 사용되는 올리고뉴클레오티드는 시토신-풍부 호모피리미딘 서열을 포함하고, DNA에 존재하는 특정 서열은 호모퓨린-호모피리미딘 서열이다. 시토신의 존재는 삼중 나선을 시토신이 양성자화되는 산 pH에서 안정하고 시토신이 중화되는 알칼리성 pH에서 불안정하게 되도록 만들 수 있다.

올리고뉴클레오티드 및 DNA에 존재하는 특정 서열은 바람직하게는 삼중 나선의 형성을 허용하도록 상보성이다. 최고 수율 및 최고 선택성은 올리고뉴클레오티드 및 충분히 상보성인 특정 서열, 예를 들어 올리고뉴클레오티드 폴리(CTT) 및 특정 서열 폴리(GAA)을 사용하여 얻을 수 있다. 바람직한 올리고뉴클레오티드는 서열 5'-GAGGCTTCTTCTTCTT CTTCTTCTT-3' (GAGG(CTT)₇ (서열 1)을 갖고, 여기서 염기 GAGG는 삼중 나선을 형성하지 않지만, 올리고뉴클레오티드가 커플링 아암 (arm)으로부터 이격되도록 한다 (서열 (CTT)₇). 상기 올리고뉴클레오티드는 상보성 단위 (GAA)를 포함하는 특정 서열과 함께 삼중 나선을 형성할 수 있다. 목적하는 서열은 특히 실시예에서 설명되는 바와 같은 7, 14 또는 17개의 GAA 단위를 포함하는 영역일 수 있다.

목적하는 다른 특정 서열은 서열 5'-AAGGGAGGGAGGA GAGGAA-3' (서열 2)이다. 상기 서열은 올리고뉴클레오티드 5'-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3' (서열 3) 또는 5'-TTGGTGTGGTGGGTGGGTT-3' (서열 4)와 함께 삼중 나선을 형성한다. 이 경우에, 올리고뉴클레오티드는 폴리퓨린 가닥에 역평행 배향으로 결합한다. 이들 삼중 나선은 Mg^{2 +}의 존재 하에서만 안정하다 (Vasquez et al., Biochemistry, 1995, 34, 7243-7251; Beal and Dervan, Science, 1991, 251, 1360-1363).

상기한 바와 같이, 특정 서열은 이중가닥 DNA에 천연적으로 존재하는 서열, 또는 이중가닥 DNA에 인공적으로 도입된 합성 서열일 수 있다. 특히, 이중가닥 DNA에, 예를 들어 플라스미드의 복제 기점에 또는 마커 유전자에 천연적으로 존재하는 서열과 삼중 나선을 형성할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것이 유리하다. 이와 관련하여, 이들 DNA, 특히 복제 기점의 일부 영역이 호모퓨린-호모피리미딘 영역을 가질 수 있음이 서열 분석을 통해 알려져 있다. 상기 천연 호모퓨린-호모피리미딘 구역과 삼중 나선을 형성할 수 있는 올리고뉴클레오티드의 합성은 본 발명의 방법을 비변형 플라스미드, 특히 pUC, pBR322, pSV 등의 종류의 시판 플라스미드에 유리하게 적용할 수 있도록 허용한다. 이중가닥 DNA에 천연적으로 존재하는 호모퓨린-호모피리미딘 서열 중에서, 이. 콜라이 플라스미드 ColE1의 복제 기점에 존재하는 서열 5'-CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3' (서열 5)의 전부 또는 일부를 포함하는 서열을 언급할 수 있다. 이 경우에, 삼중 나선을 형성하는 올리고뉴클레오티드는 서열 5'-GAAGGGCTTCCCTCTTTCC-3' (서열 6)을 갖고, 문헌 [Beal and Dervan, J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 4976-4982 및 Jayasena and Johnston, Nucleic Acids Res. 1992, 20, 5279-5288]에 기재된 바와 같이 이중 나선의 두 가닥에 교대로 결합한다. 플라스미드 pBR322 β-락타마제 유전자 (Duval-Valentin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 504-508)의 서열 5'-GAAAAAGGAAGAG-3' (서열 7)도 언급될 수 있다.

특정 올리고뉴클레오티드와 삼중 구조체를 형성할 수 있는 적절한 표적 서열은 플라스미드 ColE1 및 플라스미드 pCOR의 복제 기점에서 확인되었다. pCOR 플라스미드는 조건화 복제 기점을 갖는 플라스미드이고, US 2004/142452 및 US 2003/161844에 기재되어 있다. ColE1-유래 플라스미드는 플라스미드 복제에 관여하는 RNA-II 전사체의 상류에 맵핑된 12합체 호모퓨린 서열 (5'-AGAAAAAAAGGA-3') (서열 8)을 포함한다 (Lacatena et al., 1981, Nature, 294, 623). 상기 서열은 12합체 상보성 5'-TCTTTTTTTCCT-3' (서열 9) 올리고뉴클레오티드와 안정한 삼중 구조체를 형성한다. pCOR 주쇄는 pCOR의 γ 기원 레플리콘의 A+T-풍부 세그먼트에 위치한 14개의 비반복 염기 (5'-AAGAAAAAAAAGAA-3') (서열 10)의 호모퓨린 스트레치를 포함한다 (Levchenko et al., 1996, Nucleic Acids Res., 24, 1936). 상기 서열은 14합체 상보성 올리고뉴클레오티드 5'-TTCTTTTTTTTCTT-3' (서열 11)과 안정한 삼중 구조체를 형성한다. 대응하는 올리고뉴클레오티드 5'-TCTTTTTTTCCT-3' (서열 8) 및 5'-TTCTTTTTTTTCTT-3' (서열 11)은 ColE1 ori 또는 pCOR (oriγ)의 복제 기점 내에 위치한 그의 각각의 상보성 서열을 효율적으로 및 특이적으로 표적으로 한다. 사실상, 비-정규적 단일 삼중체 (T*GC 또는 C*AT)는 삼중 구조체의 완전한 불안정화를 야기할 수 있다.

복제 기점 또는 마커 유전자에 존재하는 서열과 삼중 나선을 형성할 수 있는 올리고뉴클레오티드의 사용이 특히 유리하고, 이것은 동일한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 상기 복제 기점 또는 상기 마커 유전자를 포함하는 임의의 DNA를 정제하는 것이 가능하기 때문이다. 따라서, 그 내부에 인공적인 특정 서열을 포함시키기 위해서 플라스미드 또는 이중가닥 DNA를 변형시킬 필요가 없다.

충분히 상보성인 서열이 바람직하지만, 지나치게 큰 친화도 상실을 야기하지 않는다면 올리고뉴클레오티드 서열과 DNA에 존재하는 서열 사이에 일부 미스매치가 관용될 수 있음이 이해된다. 이. 콜라이 β-락타마제 유전자에 존재하는 서열 5'-AAAAAAGGGAATAAGGG-3' (서열 12)를 언급할 수 있다. 이 경우에, 폴리퓨린 서열에 개재하는 티민은 제3 가닥의 구아닌에 의해 인식되어 2개의 T*AT 트리플렛이 인접할 때 안정한 G*TA 트리플렛을 형성할 수 있다 (Kiessling et al., Biochemistry, 1992, 31, 2829-2834).

특정 실시태양에 따르면, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 서열 (CCT)_n, 서열 (CT)_n 또는 서열 (CTT)_n을 포함하고, 여기서 n은 1 내지 15의 정수이다. 특히, (CT)_n 또는 (CTT)_n의 서열을 사용하는 것이 유리하다. 본 발명자들은 정제 수율이 올리고뉴클레오티드 내의 C의 양에 의해 영향받음을 실제적으로 제시하였다. 특히, 실시예 7에서 알 수 있는 바와 같이, 정제 수율은 올리고뉴클레오티드가 시토신을 거의 포함하지 않을 때 증가한다. 또한, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 (CCT), (CT) 또는 (CTT) 단위를 조합할 수 있음이 이해된다.

사용되는 올리고뉴클레오티드는 천연 (비변형 천연 염기로 구성됨) 또는 화학적으로 변경된 것일 수 있다. 특히, 올리고뉴클레오티드는 뉴클레아제에 대한 그의 내성 또는 보호, 또는 특정 서열에 대한 그의 친화도가 증가하도록 특정 화학적 변형을 유리하게 포함할 수 있다. 또한, 올리고뉴클레오티드는 뉴클레아제에 대한 보다 큰 내성을 갖도록 하기 위해 골격 변형을 거친 뉴클레오시드의 임의의 연결된 연속체를 의미하는 것으로 이해된다. 가능한 변형 중에서, DNA와 삼중 나선을 형성할 수 있는 올리고뉴클레오티드 포스포로티오에이트 (Xodo et al., Nucleic Acids Res., 1994, 22, 3322-3330), 및 포름아세탈 또는 메틸포스포네이트 골격을 갖는 올리고뉴클레오티드 (Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc, 1991, 113, 7767-7768)를 언급할 수 있다. 또한, DNA와 삼중 나선을 형성하는 뉴클레오티드의 α 아노머로 합성된 올리고뉴클레오티드를 사용할 수도 있다 (Le Doan et al., Nucleic Acids Res., 1987, 15, 7749-7760). 골격의 다른 변형은 포스포르아미데이트 연결이다. 예를 들어, 문헌 (Gryaznov and Chen, J. Am. Chem. Soc, 1994, 116, 3143-3144)에 설명된, DNA와 특히 안정한 삼중 나선을 형성하는 올리고뉴클레오티드를 제공하는 N^3'-P^5' 뉴클레오티드간 포스포르아미데이트 연결을 언급할 수 있다. 골격의 다른 변형 중에서, 2'-O-메틸리보스, 포스포디에스테르 등의 리보뉴클레오티드의 사용도 언급할 수 있다 (Sun and Helene, Curr. Opinion Struct. Biol., 116, 3143-3144). 마지막으로, 인-계 골격은 PNA (펩티드 핵산)에서와 같이 삼중 나선을 또한 형성할 수 있는 폴리아미드 골격에 의해 (Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500; Kim et al., J. Am. Chem. Soc, 1993, 115, 6477-6481), 또는 DNG에서와 같이 구아니딘-계 골격에 의해 (데옥시리보핵산 구아니딘, Proc Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 6097-6101), 또는 역시 삼중 나선을 형성하는 DNA의 다가양이온성 유사체에 의해 치환될 수 있다.

또한, 제3 가닥의 티민은 DNA에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화도를 증가시키는 5-브로모우라실로 치환될 수 있다 (Povsic and Dervan, J. Am. Chem. Soc, 1989, 111, 3059-3061). 제3 가닥은 또한 비천연 염기를 포함할 수 있고, 그 예로는 7-데아자-2'-데옥시크산토신 (Milligan et al., Nucleic Acids Res., 1993, 21, 327-333), 1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-3-메틸-5-아미노-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-7-온 (Koh and Dervan, J. Am. Chem. Soc, 1992, 114, 1470-1478), 8-옥소아데닌, 2-아미노퓨린, 2'-O-메틸슈도이소시티딘, 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 변형 (Sun and Helene, Curr. Opinion Struct. Biol., 1993, 3, 345-356 참조)을 언급할 수 있다.

올리고뉴클레오티드의 다른 종류의 변형은 특히 올리고뉴클레오티드와 특정 서열 사이의 상호작용 및/또는 친화도를 개선시키는 것을 목적으로 한다. 특히, 본 발명에 따른 가장 유리한 변형은 올리고뉴클레오티드의 시토신의 메틸화이다. 이와같이 메틸화된 올리고뉴클레오티드는 중성에 보다 가까운 pH 범위 (≥5)에서 특정 서열과 안정한 삼중 나선을 형성하는 주목할만한 특성을 보인다. 따라서, 선행 기술의 올리고뉴클레오티드보다 더 큰 pH값에서, 즉 플라스미드 DNA의 분해 위험이 훨씬 더 작은 pH값에서 기능할 수 있다.

본 발명의 방법에 사용되는 올리고뉴클레오티드의 길이는 5 내지 30개 염기이다. 10개 초과의 염기 길이의 올리고뉴클레오티드가 유리하게 사용된다. 길이는 상호작용의 요구되는 선택성 및 안정성에 적합하게 만들기 위해 각각의 개별 케이스에 대해 당업계의 숙련인에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 임의의 공지의 기술에 의해 합성할 수 있다. 특히, 핵산 합성기에 의해 제조할 수 있다. 당업계의 숙련인에게 공지된 임의의 다른 방법을 사용할 수 있다.

지지체에 대한 그의 공유 커플링을 가능하게 하기 위해, 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 관능화된다. 따라서, 올리고뉴클레오티드는 5' 또는 3' 위치에서 티올, 아민 또는 카르복실 말단기에 의해 변형될 수 있다. 특히, 티올, 아민 또는 카르복실기를 첨가하면, 예를 들어 올리고뉴클레오티드를 디술피드, 말레이미드, 아민, 카르복실, 에스테르, 에폭시드, 브롬화시안 또는 알데히드 관능기 함유 지지체에 대해 커플링시킬 수 있다. 이들 커플링은 올리고뉴클레오티드와 지지체 사이의 디술피드, 티오에테르, 에스테르, 아미드 또는 아민 연결을 확립함으로써 형성된다. 예를 들어 2관능성 커플링 시약과 같은 당업계의 숙련인에게 공지된 임의의 다른 방법이 사용될 수 있다.

또한, 커플링된 올리고뉴클레오티드와의 혼성화를 개선시키기 위해, 올리고뉴클레오티드가 "아암" 및 "스페이서(spacer)" 염기 서열을 포함하는 것이 유리할 수 있다. 아암의 사용은 지지체로부터 선택된 거리에서 올리고뉴클레오티드의 결합을 가능하게 하여 그의 DNA와의 상호작용 조건을 개선시킬 수 있다. 아암은 유리하게는 1 내지 18개, 바람직하게는 6 또는 12개 (CH₂) 기를 포함하는 선형 탄소 사슬 및 컬럼에 대한 결합을 허용하는 아민으로 구성된다. 아암은 올리고뉴클레오티드의 포스페이트에 또는 혼성화를 방해하지 않는 염기로 이루어진 "스페이서"의 포스페이트에 연결되다. 따라서, "스페이서"는 퓨린 염기를 포함할 수 있다. 예로서, "스페이서"는 서열 GAGG를 포함할 수 있다. 아암은 유리하게는 6 또는 12개 탄소 원자의 선형 탄소 사슬로 구성된다.

삼중 친화도 크로마토그래피는 RNA 및 게놈 DNA의 제거에 매우 효율적이다. 이들은 그 자체로 또는 컬럼에 예비충전된 관능화된 크로마토그래피 지지체, 관능화된 플라스틱 표면 또는 관능화된 자성 라텍스 비드일 수 있다. 크로마토그래피 지지체가 바람직하게 사용된다. 예로서, 사용될 수 있는 크로마토그래피 지지체는 아가로스, 아크릴아미드 또는 덱스트란 및 그의 유도체 (예를 들어 Sephadex, Sepharose, Superose 등), 중합체, 예를 들어 폴리(스티렌/디비닐벤젠), 또는 그라프팅된 또는 그라프팅되지 않은 실리카이다. 크로마토그래피 컬럼은 확산 또는 관류 방식으로 작동할 수 있다.

보다 우수한 정제 수율을 얻기 위해, 올리고뉴클레오티드와 혼성화를 위한 복수의 위치를 포함하는 서열을 플라스미드에 사용하는 것이 특히 유리하다. 복수의 혼성화 위치는 사실상 상기 서열과 올리고뉴클레오티드 사이의 상호작용을 촉진하여 정제 수율을 개선시킨다. 따라서, (CCT), (CT) 또는 (CTT) 모티프의 n개 반복체를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 경우, 적어도 n개의 상보성 모티프, 바람직하게는 n+1개의 상보성 모티프를 포함하는 DNA 서열을 사용하는 것이 바람직하다. n+1개의 상보성 모티프를 포함하는 서열은 올리고뉴클레오티드와 혼성화를 위한 2개의 위치를 제공한다. 유리하게는, DNA 서열은 11개 이하의 혼성화 위치, 즉 n+10개의 상보성 모티프를 포함한다.

본 발명에 따른 방법은 임의의 형태의 이중가닥 DNA 정제에 사용될 수 있다. 이중가닥 DNA의 예는 환상 DNA, 예를 들어 일반적으로 치료상 중요한 하나 이상의 유전자를 포함하는 플라스미드이다. 또한, 상기 플라스미드는 복제 기점, 마커 유전자 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법은 세포 용해물에 직접 적용될 수 있다. 상기 실시태양에서, 형질전환에 의해 증폭되고 세포 배양된 플라스미드는 세포 용해 후에 직접 정제된다. 본 발명의 방법은 또한 맑은 용해물, 즉 세포 용해물의 중화 및 원심분리 후 얻은 상등액에 적용될 수 있다. 상기 방법은 공지의 방법으로 예비정제된 용액에도 분명하게 적용될 수 있다. 상기 방법에 따르면, 또한 중요한 서열을 포함하는 선형 또는 환상 DNA를 상이한 서열의 DNA를 포함하는 혼합물로부터 정제할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 방법은 이중가닥 DNA의 정제에도 사용될 수 있다.

세포 용해물은 원핵세포 또는 진핵세포의 용해물일 수 있다.

원핵세포에 대해, 세균 이. 콜라이, 비. 섭틸리스 (B. subtilis), 에스. 티피무륨 (S. typhimurium) 또는 스트렙토마이세스 (Strepomyces)를 예로서 언급할 수 있다. 진핵세포에 대해, 동물 세포, 효모, 진균 등, 보다 특히 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 또는 사카로마이세스 (Saccharomyces) 효모 또는 COS, CHO, C127, NIH3T3 등의 세포를 언급할 수 있다.

적어도 삼중 친화도 크로마토그래피 단계를 포함하는 본 발명의 방법은 보다 고순도의 pDNA 생성물을 얻기 위해 사용될 수 있다. 삼중 친화도 크로마토그래피에서, 올리고뉴클레오티드는 지지체, 예를 들어 크로마토그래피 수지 또는 다른 매트릭스에 결합된다. 이어서, 정제된 샘플은 예를 들어 크로마토그래피 수지에 결합된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 크로마토그래피 컬럼에 샘플을 적용함으로써 결합된 올리고뉴클레오티드와 혼합된다. 샘플 내의 요구되는 플라스미드는 올리고뉴클레오티드에 결합하여 트리플렉스를 형성할 것이다. 올리고뉴클레오티드와 플라스미드 사이의 결합은 후그스틴(Hoogsteen) 결합일 수 있다. 상기 단계는 20분 이상의 접촉 시간 동안 pH≤5, 높은 염 농도에서 발생할 수 있다. 세척 단계를 사용할 수 있다. 마지막으로, 시토신 탈양성자화는 중성 버퍼에서 발생하여 플라스미드를 올리고뉴클레오티드 결합 수지로부터 용출시킨다.

소수성 상호작용 크로마토그래피는 정제를 위해 샘플 내의 분자의 소수성 영역을 끌어당기기 위해 기재 상의 소수성 잔기를 사용한다. 상기 HIC 지지체는 "클러스터링 (clustering)" 효과에 의해 작용하고, 상기 분자 회합시에 공유 또는 이온 결합이 형성되거나 공유되지 않음을 알아야 한다. 소수성 상호작용 크로마토그래피는 개환형 플라스미드 형태 및 다른 오염물질, 예를 들어 gDNA, RNA 및 내독소를 매우 효율적으로 제거하기 때문에 유리하다.

소수성 상호작용 크로마토그래피를 위한 염기 물질의 합성, 및 소수성 상호작용 크로마토그래피의 제조, 중합 및 관능화 및 그를 통한 플라스미드 DNA의 용출 방법은 당업계에 공지되어 있고, 본원에 참고로 포함된 미국 특허 6,441,160에 기재되어 있다.

소수성 상호작용 크로마토그래피를 위한 충전 물질에 사용되는 염기 물질의 합성에 사용되는 화합물은 소수성을 보이는 상이한 관능기 또는 상이한 이온 교환기가 염기 물질 합성 후에 후반응에 의해 도입될 수 있는 임의의 화합물일 수 있다. 일관능성 모노머의 예는 스티렌, o-할로메틸스티렌, m-할로메틸스티렌, p-할로메틸스티렌, o-할로알킬스티렌, m-할로알킬스티렌, p-할로알킬스티렌, α-메틸스티렌, α-메틸-o-할로메틸스티렌, α-메틸-m-할로메틸스티렌, α-메틸-p-할로메틸스티렌, α-메틸-o-할로알킬스티렌, α-메틸-m-할로알킬스티렌, α-메틸-p-할로알킬스티렌, o-히드록시메틸스티렌, m-히드록시메틸스티렌, p-히드록시메틸스티렌, o-히드록시알킬스티렌, m-히드록시알킬스티렌, p-히드록실알킬스티렌, α-메틸-o-히드록시메틸스티렌, α-메틸-m-히드록시메틸스티렌, α-메틸-p-히드록시메틸스티렌, α-메틸-o-히드록시알킬스티렌, α-메틸-m-히드록시알킬스티렌, α-메틸-p-히드록시알킬스티렌, 글리시딜 메타크릴레이트, 글리시딜 아크릴레이트, 히드록시에틸 아크릴레이트, 히드록시메타크릴레이트 및 비닐 아세테이트를 포함한다. 가장 바람직한 화합물은 방향족 고리 상에 치환된 할로알킬기, 할로겐, 예를 들어 Cl, Br, I 및 F 및 탄소 원자수 2 내지 15의 직쇄 및/또는 분지쇄 포화 탄화수소이다.

다관능성 모노머의 예는 디비닐벤젠, 트리비닐벤젠, 디비닐톨루엔, 트리비닐톨루엔, 디비닐나프탈렌, 트리비닐나프탈렌, 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트, 에틸렌 글리콜 디아크릴레이트, 디에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트, 디에틸렌 글리콜 디아크릴레이트, 메틸렌비스메타크릴아미드 및 메틸렌비스아크릴아미드를 포함한다.

상이한 소수성 관능기 또는 상이한 이온 교환기는 후반응에 의해 도입될 수 있다. 염기 물질 자체에 의한 소수성, 또는 염 농도의 변화 및 pH값의 변화에 의한 염기 물질의 팽윤 또는 수축에 의한 분리하고자 하는 목적 생성물에 대한 영향을 최소화하기 위해, 염기 물질은 바람직하게는 비교적 친수성의 모노머, 예를 들어 글리시딜 메타크릴레이트, 글리시딜 아크릴레이트, 히드록시에틸 아크릴레이트, 히드록시메타크릴레이트 및 비닐 아세테이트를 사용하여 제조된다. 염기 물질의 제조는 일관능성 모노머 및 다관능성 모노머를 적절한 비율로 칭량하고, 형성된 입자 내의 세공을 조절하기 위해 사용되는 정확하게 칭량된 희석제 또는 용매 및 유사하게 정확하게 칭량된 중합 개시제를 첨가한 후 잘 교반하는 제1 단계를 포함한다. 이어서, 혼합물을 수중유형 현탁액 중합에 적용하고, 여기서 혼합물은 미리 정확하게 칭량된 현탁액 안정화제가 용해된 수용액에 첨가하고, 교반기를 사용한 혼합에 의해 목적하는 크기를 갖는 유적을 형성하고, 혼합된 용액을 점진적으로 가온시켜 중합을 수행한다.

일관능성 모노머 대 다관능성 모노머의 비율은 염기 물질의 연질 입자를 얻기 위해 일반적으로 약 1 mol의 일관능성 모노머 및 약 0.01 내지 0.2 mol의 다관능성 모노머이다. 다관능성 모노머의 비율은 염기 물질의 경질 입자를 얻기 위해약 0.2 내지 0.5 mol로 증가시킬 수 있다. 다관능성 모노머는 훨씬 더 경질의 입자를 얻기 위해 단독으로 사용될 수도 있다.

중합 개시제도 특별히 제한되지 않고, 통상적으로 사용되는 아조비스 타입 및/또는 퍼옥시드 타입이 사용된다.

유적 자체 중의 응집을 방지하기 위해서 현탁액 안정화제, 예를 들어 이온계 계면활성제, 비이온계 계면활성제 및 양쪽성 특성을 갖는 중합체 또는 이들의 혼합물도 사용할 수 있다.

형성된 입자의 직경은 일반적으로 약 2 내지 500 ㎛이다. 바람직한 입자의 직경은 2 내지 30 ㎛, 보다 바람직하게는 약 2 내지 10 ㎛이다. 핵산을 고순도로 대규모로 정제할 때, 직경은 약 10 내지 100 ㎛이고, 조원액으로부터 목적하는 생성물을 분리할 경우에는 100 내지 500 ㎛, 보다 바람직하게는 약 200 내지 400 ㎛일 수 있다. 입자 직경을 조정하기 위해, 교반기의 회전 속도를 중합 동안 조정할 수 있다. 직경이 작은 입자가 필요할 경우, 회전수는 증가할 수 있고, 큰 입자가 요구될 경우에는 회전수는 감소할 수 있다. 여기서, 사용되는 희석제는 형성된 입자 내의 세공을 조정하기 위해 사용되기 때문에, 희석제의 선택이 특히 중요하다. 기본적인 개념으로서, 중합을 위해 사용되는 용매는 모노머에 대한 불량한 용매를 모노머에 대한 우수한 용매와 상이하게 조합함으로써 조정된다. 세공 직경의 크기는 분리되는 핵산의 분자 크기에 따라 적절하게 선택할 수 있지만, 소수성 상호작용 크로마토그래피를 위한 충전 물질의 경우 500 내지 4000 옹스트롬, 이온 교환 크로마토그래피를 위한 충전 물질의 경우 1500 내지 4000 옹스트롬인 것이 바람직하다.

각각 소수성이 상이한 충전 물질을 바람직하게 사용함으로써 소수성이 상이한 핵산을 분리하기 위한 소수성 상호작용 크로마토그래피에서, 염기 물질의 표면 변형이 중요하다.

소수성 기는 탄소 원자수 2 내지 20의 포화 탄화수소기 또는 불포화 탄화수소기를 포함하여 장쇄 또는 분지쇄 중에서 선택될 수 있다. 또한, 방향족 고리도 탄화수소기에 포함될 수 있다.

소수성기는 또한 다음 식을 갖는 화합물 중에서 선택될 수 있다:

여기서, n은 0 내지 약 20이고, 메틸렌기는 직쇄 또는 분지쇄일 수 있고, m은 0 내지 약 3이고, 탄화수소기 직쇄 또는 분지쇄일 수 있고, A는 C=O 기 또는 에테르기이지만, 메틸렌기는 A없이 염기 물질에 직접 결합할 수 있다.

소수성 기는 0 내지 10의 반복 단위로 구성되는 탄소 원자수 2 내지 20의 알킬렌 글리콜의 에테르기를 추가로 포함할 수 있고, 여기서 염기 물질과 반응하는 관능기의 반대 말단은 탄소 원자수 1 내지 4의 알킬기로 캡핑되거나 될 수 있기 때문에 잔여 OH기일 수 있다.

상기한 소수성기는 표면을 변형시키기 위해 단독으로 또는 혼합물로 사용될 수 있다.

탄소 원자수 6 내지 20의 알킬기의 사슬은 플라스미드와 같은 낮은 소수성에 바람직하다. 2 내지 15개의 탄소 원자를 갖는 알킬기의 장쇄는 소수성이 높은 화합물, 예를 들어 이. 콜라이 유래 RNA 및 인간 및 동물 세포 내의 RNA를 분리하기 위해 바람직하다. 4 내지 18개의 탄소 원자를 갖는 알킬기는 소수성이 비교적 낮은 화합물, 예를 들어 이. 콜라이 유래 DNA 및 인간 및 동물 세포 내의 DNA를 분리하기 위해 바람직하다.

상기 화합물 분리시에, 화합물은 상기 예로 제한되지 않으면서 표면을 변형시키기 위해 적절하게 선택될 수 있다. 사실상, 충전 물질의 소수성 정도는 배지 내의 염 농도 또는 흡착을 위한 용리액 내의 염 농도에 따라 상이하다. 또한, 충전 물질의 소수성 정도는 염기 물질 내로 도입되는 기의 양에 따라 상이하다.

소수성 상호작용 크로마토그래피를 위한 염기 물질의 세공 직경은 특히 500 내지 4000 옹스트롬이 바람직하지만, 분리가 요구되는 핵산의 분자 크기에 따라 상기 범위로부터 적절하게 선택될 수 있다. 일반적으로, 충전 물질 상의 핵산의 체류 및 흡착 용량 (샘플 유도)은 세공 직경에 따라 상이하기 때문에, 세공 직경이 큰 염기 물질을 분자 크기가 큰 핵산에, 세공 직경이 작은 염기 물질을 분자 크기가 작은 핵산에 사용하는 것이 바람직하다.

예를 들어, 스티렌 염기 물질은 할로겐 함유 화합물 및/또는 카르보닐 할라이드 및 촉매, 예를 들어 FeCl₃, SnCl₂ 또는 AlCl₃를 사용하여 장쇄의 알킬기를 포함하는 소수성 기와 반응할 수 있고, 프리델-크라프트 (Friedel-Craft) 반응을 사용하여 탈할로겐된 화합물 및/또는 아실화된 화합물로서 염기 물질의 방향족 고리에 직접 첨가할 수 있다. 염기 물질이 할로겐기를 포함하는 입자인 경우에, 예를 들어 부탄올처럼 첨가되는 관능기에 포함된 OH를 포함하는 화합물을 이용하고 알칼리 촉매, 예를 들어 NaOH 또는 KOH를 사용한 윌리암슨 (Williamson) 반응을 이용하여 관능기를 에테르 결합을 통해 도입할 수 있다. 첨가가 필요한 관능기가 아미노기 함유 화합물, 예를 들어 헥실아민인 경우에, 알칼리 촉매, 예를 들어 NaOH 또는 KOH를 사용하고 탈할로겐산 반응을 이용하여 첨가할 수 있다. 반대로, OH기를 포함하는 염기 물질의 경우에, 첨가가 필요한 관능기에 에폭시기, 할로겐기 또는 카르보닐 할라이드기를 미리 도입할 때 관능기를 에테르 또는 에스테르 결합을 통해 도입할 수 있다. 에폭시기를 함유하는 염기 물질의 경우, 첨가가 필요한 관능기에 포함된 OH기 또는 아미노기를 갖는 화합물과 반응할 때 관능기를 에테르 또는 아미노 결합을 통해 도입할 수 있다. 또한, 첨가가 필요한 관능기가 할로겐기를 포함할 경우에, 관능기는 산 촉매를 사용하여 에테르 결합을 통해 첨가할 수 있다. 염기 물질에 도입되는 관능기의 비율은 분리가 필요한 해당 생성물의 소수성에 의해 영향받기 때문에, 특별히 제한되지는 않지만, 일반적으로 건조된 염기 물질 1 g당 약 0.05 내지 4.0 mmol의 관능기를 갖는 충전 물질이 적합하다.

표면 변형에 있어서, 염기 물질 또는 입자의 형성 후에 후반응을 통해 관능기를 첨가하는 방법이 설명된다. 표면 변형은 중합 전에 첨가된 상기 관능기를 갖는 모노머를 사용한 중합 후에 염기 물질이 형성되는 동일한 방법에 따라 수행된다.

또한, 염기 물질은 다공성 실리카 겔일 수 있다. 실리카 겔 제조 방법은 화합물, 예를 들어 알킬트리메톡시실란을 사용하여 문헌 [Toshio Nambara and Nobuo Ikegawa, "Latest High-Speed Liquid Chromatography", page 289 ff., Tokyo Hirokawa Bookstore, 1988]에 기재된 방법에 따라 제조된 입자에 대해 직접 실란을 커플링하는 것을 포함한다.

에폭시기 함유 실란 커플링제를 사용한 실란 커플링 전 또는 후에, 관능기를 상기한 방법에 따라 첨가할 수 있다. 건조된 염기 물질 1 g당 약 0.05 내지 4.0 mmol의 관능기가 도입되는 관능기 비율이 적합하다.

용리액은 소수성 상호작용 크로마토그래피 분리 또는 정제 단계에 사용된다. 일반적으로, 두 종류의 용리액이 사용된다. 한 용리액은 고농도의 염을 포함하고, 제2 용리액은 저농도의 염을 포함한다. 용출 방법은 고농도의 염을 갖는 용리액으로부터 저농도의 염을 갖는 용리액으로의 단계적인 전환을 포함하고, 조성물을 한 용리액에서 다른 용리액으로 연속적으로 변경시키는 구배 용출 방법이 사용될 수 있다. 소수성 상호작용 크로마토그래피에 대해 일반적으로 사용되는 버퍼 및 염이 사용될 수 있다. 고농도의 염을 포함하는 용리액의 경우, 염 농도가 1.0 내지 4.5M이고 pH값이 6 내지 8인 수용액이 특히 바람직하다. 저농도의 염을 포함하는 용리액의 경우, 염 농도가 0.01 내지 0.5M이고 pH값이 6 내지 8인 수용액이 특히 바람직한 염이다. 일반적으로, 황산암모늄 및 황산나트륨이 염으로서 사용될 수 있다.

소수성 상호작용 크로마토그래피 플라스미드 DNA 정제 단계는 소수성이 약한 관능기가 도입된 충전 물질을 소수성이 강한 관능기가 도입된 충전 물질과 순서대로 조합함으로써 수행될 수 있다. 사실상, 이. 콜라이를 배양하는 배지는 소수성 상이한 다양한 성분, 예를 들어 다당류, 이. 콜라이 게놈 DNA, RNA 플라스미드 및 단백질을 다량 포함한다. 또한, 심지어 핵산 자체 중에서도 소수성이 상이함이 알려져 있다. 불순물이 되는 단백질은 플라스미드에 비해 더 큰 소수성을 갖는다.

많은 소수성 상호작용 크로마토그래피 수지, 예를 들어 프락토겔(Fractogel) 프로필, 토요펄(Toyopearl), 소스(Source) 이소프로필, 또는 소수성기를 갖는 임의의 다른 수지를 상업적으로 입수할 수 있다. 가장 바람직한 수지는 토요펄 벌크 중합체 매질이다. 토요펄은 높은 기계적 및 화학적 안정성을 갖는 메타크릴릭 중합체이다. 수지는 비-관능화된 "HW" 시리즈 수지로서 입수가능하고, 이온 교환 크로마토그래피 또는 소수성 상호작용을 위해 표면 화학 처리로 유도체화될 수 있다. 상이한 표면 화학 특성 및 소수성 수준을 특징으로 하는 4 종류의 토요펄 HIC 수지를 사용할 수 있다. 토요펄 HIC 수지의 소수성은 에테르, 페닐, 부틸 및 헥실 시리즈를 통해 증가한다. 바람직한 토요펄 HIC 수지, 즉 세공 직경이 1000 옹스트롬인 토요펄 HW-65의 구조는 다음과 같다.

상기한 토요펄 수지는 상이한 입자 크기 등급을 가질 수 있다. 토요펄 650C는 입자 크기가 약 50 내지 150 ㎛, 바람직하게는 약 100 ㎛인 반면, 토요펄 650M은 입자 크기가 약 40 내지 90 ㎛, 바람직하게는 약 65 ㎛이고, 토요펄 650S는 입자 크기가 약 20 내지 50 ㎛, 바람직하게는 약 35 ㎛이다. 입자 크기는 분해능에 영향을 주고, 즉 분해능은 입자 크기 등급이 C에서 M으로, 다시 S로 갈수록 개선되어 보다 작은 입자 크기에서 증가한다는 것이 공지되어 있다. 본 발명에 따른 플라스미드 DNA의 분리 및 정제 공정에서 HIC 크로마토그래피 단계에 사용되는 가장 바람직한 토요펄 수지는 토소 바이오사이언스 (Tosoh Bioscience)에서 시판되는 토요펄 부틸-650S이다.

추가의 투석여과 단계를 수행할 수 있다. 표준 시판 투석여과 물질이 당업계에 공지된 표준 기술에 따라 본 공정에 사용하기에 적합하다. 바람직한 투석여과 방법은 플라스미드 크기에 따라 30,000 내지 500,000 범위의 분자량 컷오프 (cutoff)를 갖는 한외여과막을 사용하는 투석여과이다. 상기 투석여과 단계는 버퍼 교환을 허용하고, 이어서 농축이 수행된다. 용출물은 접선 흐름 여과 (막 컷오프, 30 kDa)에 의해 약 2.5 내지 3.0 mg/mL의 표적 농도로 3배 내지 4배 농축되고, 농축물은 일정 부피에서 10 부피의 염수를 사용하는 투석여과에 의해 버퍼 교환되고, 염수를 사용하여 표적 플라스미드 농도로 조정된다. 플라스미드 DNA 농도는 농축물의 샘플의 260 nm에서의 흡광도로부터 계산된다. 플라스미드 DNA 용액을 0.2 ㎛ 캡슐 필터를 통해 여과하고 몇몇 분취액으로 나누고, 이를 추가로 처리할 때까지 2-8℃에서 냉장실에서 용기 내에 보관한다. 이는 수퍼코일형 플라스미드의 플라스미드 DNA 농도가 약 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 바람직하게는 99％인 정제된 농축물을 생성시킨다. 상기 공정을 사용하는 총 플라스미드 회수율은 적어도 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％ 및 80％이고, 평균 회수율은 60％이다.

상기 투석여과 단계는 다음 조건에 따라 수행한다: 단계 a) 및 단계 b)에 대한 버퍼가 사용된다:

i) 12.5 내지 13.0 부피의 50 mM 트리스/HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4 (버퍼 I)에 대한 제1 투석여과 (단계 a) 및

ii) 3.0 내지 3.5 부피의 염수 부형제 (150 mM NaCl)에 대한 상기 단계 a)로부터의 보유액의 제2 투석여과 (단계 b). 본 발명에 따른 상기 바람직한 투석여과 단계는 황산암모늄 및 EDTA를 효율적으로 광범하게 제거한다. 또한, 상기 투석여과 단계 후에, 적절한 생리학적 NaCl 농도 (약 150 mM) 및 1 mM 미만 (200 μM 내지 1 mM)의 최종 트리스 농도가 얻어진다.

사용되는 플라스미드 DNA 조성물은 바람직하게는 본질적으로 오염물질이 존재하지 않거나 ppm 미만의 오염물질이 존재하여 제약 등급 DNA인 정제된 플라스미드 DNA를 포함한다. 제약 등급 플라스미드 DNA 조성물은 ppm 미만 (100 mg의 플라스미드 DNA당 < 0.0001％, 즉 < 0.0001 mg)의 gDNA, RNA 및 단백질 오염물질을 포함할 수 있다.

제약 등급 플라스미드 DNA 조성물은 약 0.01％ 미만, 또는 0.001％ 미만, 바람직하게는 0.0001％ 미만, 또는 바람직하게는 0.00008％ 미만 (100 mg의 플라스미드 DNA당 < 0.0008％, 즉 < 0.0008 mg)의 염색체 DNA 또는 게놈 DNA을 포함할 수 있다.

제약 등급 플라스미드 DNA 조성물은 약 0.01％ 미만, 또는 0.001％ 미만, 바람직하게는 0.0001％ 미만, 또는 바람직하게는 0.00002％ 미만 (100 mg의 플라스미드 DNA당 < 0.0002％, 즉 < 0.0002 mg)의 RNA 오염물질을 포함할 수 있다.

제약 등급 플라스미드 DNA 조성물은 약 0.0001％ 미만, 가장 바람직하게는 0.00005％ 미만 (100 mg의 플라스미드 DNA당 < 0.00005％, 즉 < 0.00005 mg)의 숙주세포 단백질 오염물질을 포함하는 플라스미드 DNA 제제를 포함할 수 있다.

또한, 제약 등급 플라스미드 DNA 조성물은 0.1 EU/mg 미만의 내독소를 포함하는 플라스미드 DNA 제제를 포함할 수 있다.

따라서, 제약 등급 플라스미드 DNA 조성물은 우세하게 환상 형태를 포함하고, 보다 엄밀하게는 80％, 85％, 90％, 95％, 또는 99％ 초과의 폐환형 형태의 플라스미드 DNA를 포함한다.

제약 조성물은 약 0.01％ 미만의 검출가능한 수준의 숙주세포 게놈 DNA를 가질 수 있고, 약 0.001％ 미만의 숙주세포 RNA가 본 발명에 포함될 수 있다. 가장 바람직하게는, 제약 등급 플라스미드 DNA 조성물은 약 0.00008％ 미만의 숙주세포 게놈 DNA 및 약 0.00002％ 미만의 숙주세포 RNA 및 약 0.00005％ 미만의 숙주세포 단백질을 가질 수 있다. 사실상, 상기한 순도 수준의 임의의 조합을 본 발명의 임의의 특정 제약 등급 플라스미드 DNA 조성물에 사용할 수 있다. 또한, 조성물은 제약상 허용되는 다른 성분, 버퍼, 안정화제, 또는 세포 또는 유기체 내로의 유전자 전달, 특히 플라스미드 DNA 전달을 개선시키기 위한 화합물을 포함한다.

이와 같이 얻은 플라스미드 DNA는 이어서 본 발명에 따라 염수 부형제로서의 NaCl 및 pH값을 6.2 내지 9, 바람직하게는 6.5 내지 8, 보다 바람직하게는 7 내지 7.5로 유지 또는 제어하기 위한 적절한 농도의 트리스 버퍼 중에 제제화될 수 있다. 본 발명에 따른 플라스미드 DNA 제제는 놀랍게도 5℃ 내지 25℃ 이하, 즉 실온에서 연장된 기간 동안 상기 조건에서 안정한 비-분해가능한 형태로 보관될 수 있기 때문에 특히 유용하다.

상기한 바와 같이, 정제된 플라스미드 DNA는 용액 내에 약 0.1 EU/mg 미만의 내독소, 또는 약 0.00005％ 미만의 숙주세포 단백질 오염물질, 약 0.00002％ 미만의 숙주세포 RNA 오염물질, 약 0.00008％ 미만의 숙주세포 게놈 DNA 오염물질과 함께 존재한다. 제약 등급 플라스미드 DNA 조성물은 ppm 미만의 (< 0.00001％) 숙주세포 gDNA, RNA 및 단백질 오염물질을 포함한다. 보다 엄밀하게는, 제약 등급 플라스미드 DNA 조성물에는 본질적으로 검출가능한 gDNA, RNA 및 단백질 오염물질이 존재하지 않는다. 또한, 제약 등급 플라스미드 DNA 조성물에는 실질적으로 검출가능한 세균 숙주 염색체 DNA가 존재하지 않고, 따라서 약 0.01％ 미만, 또는 약 0.001％ 미만, 또는 약 0.0001％ 미만, 또는 바람직하게는 0.00008％ 미만의 염색체 DNA 또는 게놈 DNA를 포함한다. 또한, 제약 등급 플라스미드 DNA 조성물은 실질적으로 검출가능한 숙주세포 RNA가 존재하지 않고, 보다 엄밀하게는 약 0.01％ 미만, 또는 0.001％ 미만, 바람직하게는 0.0001％ 미만, 또는 바람직하게는 0.00002％ 미만의 숙주세포 RNA 오염물질을 포함한다. 또한, 제약 등급 플라스미드 DNA 조성물은 실질적으로 검출가능한 숙주세포 단백질 오염물질이 존재하지 않고, 보다 엄밀하게는 약 0.0001％ 미만, 가장 바람직하게는 0.00005％ 미만의 숙주세포 단백질 오염물질을 포함한다. 마지막으로, 제약 등급 플라스미드 DNA 조성물에는 실질적으로 측정가능한 내독소 오염물질이 존재하지 않고, 보다 엄밀하게는 0.1 EU/mg 미만의 내독소가 존재한다. 플라스미드 DNA는 실질적으로 수퍼코일형 형태로 존재하고, 보다 엄밀하게는 약 99％ 초과의 폐환형 형태의 플라스미드 DNA를 포함한다.

정제된 플라스미드 DNA로 바이알을 충전하기 전에 멸균 여과 단계를 수행할 수 있다. 이들 방법에 의해 얻을 수 있는 정제된 플라스미드 DNA의 바이알도 제공된다.

상이한 크기를 갖는 임의의 종류의 벡터의 정제를 수행할 수 있다. 분리될 수 있는 플라스미드 DNA의 크기 범위는 약 5 kb 내지 약 50 kb, 바람직하게는 15 kb 내지 50 kb이고, 상기 DNA는 약 3 kb의 벡터 주쇄, 치료 유전자 및 회합된 조절 서열을 포함한다. 따라서, 본 발명에 유용한 벡터 주쇄는 약 10-50 kb 이상의 삽입체를 보유할 수 있다. 삽입체는 임의의 유기체로부터의 DNA를 포함할 수 있지만, 바람직하게는 포유동물 기원일 것이고, 치료 단백질을 코딩하는 유전자 이외에 조절 서열, 예를 들어 프로모터, 폴리아데닐화 서열, 인핸서, 로커스 조절 영역 등을 포함할 수 있다. 치료 단백질을 코딩하는 유전자는 게놈 기원일 수 있고, 따라서 그의 게놈 구조에 반영된 엑손 및 인트론을 포함할 수 있거나, 또는 상보성 DNA로부터 유도될 수 있다. 상기 벡터는 예를 들어 높은 카피수 복제로 복제가능하고 치료 유전자, 선택가능한 마커, 예를 들어 SupPhe tRNA를 코딩하는 유전자, 테트라사이클린 카나마이신 내성 유전자의 삽입을 위한 다중링커를 갖고 물리적으로 작고 안정한 벡터 주쇄를 포함할 수 있다. 플라스미드의 벡터 주쇄는 유리하게는 포유동물, 다른 진핵세포, 원핵세포 또는 바이러스 DNA의 단편의 삽입을 허용하고, 생성되는 플라스미드는 정제되어 생체 내 또는 생체 외 플라스미드 기재 요법에 사용될 수 있다. 비교적 많은 카피수를 갖는, 즉 20-40 카피/세포 내지 1000-2000 이하의 카피/세포의 벡터를 본 발명에 따른 방법에 의해 분리 및 정제할 수 있다. 예를 들어, pUC 복제 기점을 포함하는 벡터가 본 발명의 방법에 따라 바람직하다. pUC 복제 기점은 플라스미드 DNA의 보다 효율적인 복제를 가능하게 하고, 예를 들어 pBR322 기점에 비해 플라스미드 카피수/세포를 10배 증가시킨다. 바람직하게는, 조건화 복제 기점을 갖는 플라스미드 DNA 또는 US 2003/1618445에 기재되어 있는 pCOR을 본 발명의 방법에 의해 분리할 수 있다. 생성되는 높은 카피수는 플라스미드 DNA 대 염색체 DNA, RNA, 세포 단백질 및 보조인자의 비율을 크게 증가시키고, 플라스미드 수율을 개선시키고, 보다 용이한 하류 정제를 촉진시킨다. 따라서, 임의의 벡터 (플라스미드 DNA)가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 대표적인 벡터는 NV1FGF 플라스미드를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. NV1FGF는 말기 말초 동맥 폐색 질병 (PAOD) 또는 말초 동맥 질환 (PAD) 환자 치료에 유용한 산성 섬유모세포 성장인자 또는 섬유모세포 성장인자 타입 1 (FGF-1)을 코딩하는 플라스미드이다. 문헌 [Camerota et al., J Vasc. Surg., 2002, 35, 5:930-936]에는 휴식시 통증 또는 조직 괴사가 있는 회복 불가능한 51명의 말기 PAD 환자가 증가량의 단일 또는 반복 투여량의 NV1FGF을 허혈성 허벅지 및 종아리 내로 근내 주사하는 것이 기재되어 있다. 상이한 파라미터, 예를 들어 경피 산소압, 발목 및 발가락 상완 지수, 통증 평가, 및 궤양 치료를 후속적으로 평가하였다. NV1FGF 투여 후에 상완 지수의 유의한 증가, 통증 감소, 궤양 크기의 감소, 및 관류의 개선이 관찰되었다.

플라스미드 DNA 조성물은 세포 내로의 플라스미드 DNA 전달을 개선시키기 위해 적어도 하나의 중합체를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 플라스미드 DNA 조성물은 제약상 허용되는 비히클 또는 부형제를 포함할 수 있다. 플라스미드 DNA 조성물은 주사, 정맥내 주사, 근내 주사, 종양내 주사, 작은 입자 폭격, 또는 조직에 대한 국소 적용에 의한 전달을 위해 제제화될 수 있다. 상기 조성물 내의 플라스미드 DNA는 실질적으로 수퍼코일형 폐환형 DNA 형태이다.

본 발명에 따라 유용한 숙주세포는 상기 설명된 플라스미드의 높은 카피수, 예를 들어 20-200 카피를 유지할 수 있는 임의의 세균 균주, 즉 그람 양성 및 그람 음성 균주, 예를 들어 이. 콜라이 및 살모넬라 티피무리움 (Salmonella Typhimurium) 또는 바실러스 (Bacillus)일 수 있다. 이. 콜라이 숙주 균주가 본 발명에 따라 사용될 수 있고, HB101, DH1, 및 DH5αF, XAC-1 및 XAC-1pir 116, TEX2, 및 TEX2pir42 (WO04/033664)를 포함한다. F 플라스미드는 치료 플라스미드 생성물과 동시 정제될 수 있기 때문에, F 플라스미드 또는 F 플라스미드 유도체를 함유하는 균주 (예를 들어 JM109)는 일반적으로 바람직하지 않다.

클로닝 및 분자생물학의 일반적인 기술

분자 생물학의 전통적인 방법, 예를 들어 제한 효소를 사용한 소화, 겔 전기영동, 이. 콜라이에서 형질전환, 핵산의 침전 등은 문헌에 기재되어 있다 (Maniatis et al., 1., E.F. Fritsch, and J. Sambrook, 1989. Molecular cloning: a laboratory manual, second edition. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Ausubel F.M., R. Brent, R.E. Kinston, D.D. Moore, J.A. Smith, J.G. Seidman and K. Struhl. 1987. Current protocols in molecular biology 1987-1988. John Willey and Sons, New York.). 뉴클레오티드 서열은 이미 간행된 프로토콜 (Ausubel et al., 1987)에 따른 사슬 종결 방법에 의해 결정하였다.

제한 효소는 뉴 잉글랜드 바이오랩스 (New England Biolabs, 미국 매사추세츠주 비벌리 (바이오랩스))에서 공급받았다.

라이게이션을 수행하기 위해, DNA 단편을 파지 T4 DNA 리가제 (바이오랩스)의 존재 하에 50 mM 트리스-HCl pH 7.4, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 2 mM ATP를 포함하는 버퍼 내에서 인큐베이션한다.

올리고뉴클레오티드는 제조회사의 권고를 이용하여 Biosearch 8600 자동 DNA 합성기를 사용하여 포스포르아미다이트가 β 위치에서 시아노에틸기에 의해 보호된 포스포르아미다이트 화학을 사용하여 합성한다 (Sinha, N.D., J. Biernat, J. McManus and H. Koester, 1984. Polymer support oligonucleotide synthesis, XVIII: Use of β-cyanoethyl-N,N-dialkylamino-/N-morpholino phosphoramidite of deoxynucleosides for the synthesis of DNA fragments simplifying deprotection and isolation of the final product. Nucl. Acids Res., 12, 4539-4557: Giles, J.W. 1985. Advances in automated DNA synthesis. Am. Biotechnol., Nov./Dec.).

라이게이션된 DNA 또는 그의 형질전환 효능에 대해 시험할 DNA를 사용하여 하기 수용성 (competent) 균주로 형질전환시킨다:

이. 콜라이 DH5α[F/endAl, hsdR17, supE44. thi-1, recA1. gyrA96. relA1, Δ(lacZYA-arqF)U169, deoR, φ80dlac (lacZΔM15)] (임의의 Col E1 플라스미드에 대해); 또는

이. 콜라이 XAC-pir (임의의 pCor-유래 플라스미드에 대해).

플라스미드 DNA의 소량 제제는 문헌 [Klein et al., 1980]의 프로토콜에 따라 제조한다.

이. 콜라이 균주의 성장을 위해 LB 배양 배지를 사용한다 (Maniatis et al., 1982). 균주는 37℃에서 인큐베이션한다. 세균은 적합한 항생제로 보충한 LB 배지의 접시 상에 플레이팅한다.

실시예 1

사용된 유속에 대한 직경의 조정은 연속 용해 시스템의 코일에서 레이놀즈 수 (Reynolds number)의 계산을 따른다. 다음 분석은 유체의 거동이 뉴턴임을 가정하므로, 하기 기록된 숫자는 B1a에서만 완전히 유효하고 B2에서는 어느 정도 유효하다.

레이놀즈 수의 값은 당업계의 숙련인이 마주치는 거동의 종류를 지정하도록 허용한다. 여기서는 튜브 내에서 유동하는 유체만을 다룰 것이다 (유압 공학).

1) 비-뉴턴 유체

산업에서 가장 일반적으로 마주치는 2 종류의 비-뉴턴 유체는 빙햄 (Bingham) 및 오스트왈드 드 웨일 (Ostwald de Waele)이다.

이 경우에, 레이놀즈 수 (Re)는 다음과 같이 계산된다:

Re_N은 일반화된 레이놀즈 수이다.

Re_N = (1/(2^n-3)) x (n/3n+1)ⁿ x ((ρ x Dⁿ x w^{2 -n})/m) (1)

D: 단면의 내경 (m)

ρ: 유체의 부피 질량 (kg/m³)

w: 유체의 공간 속도 (m/s)

n: 유동 거동 지수 (단위없음)

m: 유체 점조도 계수 (dyn.sⁿ/cm²)

n 및 m은 경험적으로 결정된다 (유동학적 거동의 연구).

2) 뉴턴 유체

제1 섹션에 대해, 식 (1)에서:

n 및 m은 μ의 함수이므로 Re = f(내경,μ,ρ, 및 u).

Re = (u x D x ρ)/μ (2)

ρ: 유체의 부피 질량 (kg/m³)

μ: 유체의 점도 (Pa.s, 및 1 mPa.s = 1 cP)

D: 단면의 내경 (m)

u: 유체의 평균 공간 속도 (m/s)

n=1에 대해 식 (1)은 식 (2)로 정리된다.

Q = 유속 (m³/h) 및 S = 단면의 표면적 (m²)에서, μ가 cP로 주어지면:

Re = (4 x (Q/3600) x ρ) / ((μ/1000) x Π x D) (3)

환상 도관에서, 2500 미만의 레이놀즈 수에 대해 유동은 층류이고, 레이놀즈 수 2000 내지 500,000에 대해 수압적으로 평온한 난류이다. 한계는 2000과 2500 사이에서 의도적으로 모호하고, 여기서 두 종류의 거동은 다음에 무엇이 일어날 수 있을지 결정하기 위해 사용되고, 선택은 귀납적으로 이루어진다.

3) 계산

n 및 m은 일반적으로 알려지지 않으므로, 경향을 추정하기 위해 다음 근사치가 사용된다:

뉴턴 유체 (모든 단면에서)

ρ = 1000 kg/m³ (모든 유체에 대해)

μ = B1a에서 5 cP 및 B1b에서 4O cP (본 발명의 데이타)

B2에서 2.5 cP (본 발명의 데이타)

다음 계산은 형상 1 및 형상 2로 불리는 시험된 2개의 표준 튜브 형상에 대해 식 (3)을 사용하여 수행하였다 (B1b 튜브 없이):

코일	형상 1		형상 2
	B1a	B2	B1a	B2
점도* (cP)	5	2.5	5	2.5
직경 (mm)	12.7	9.5	6	6
유속 (L/h)	60	105	12	21
레이놀즈수	334	1564	141	495
공정	층류	층류	층류	층류

이들 2가지 형상에서, 유동은 모든 단계에서 층류이고, 용액은 함께 적절하게 혼합되지 않는다.

다른 튜브 형상에 대해 (B1b 튜브 없이):

코일	고속/표준 직경		고속/16 mm ID		고속/6 mm ID
	B1a	B2	B1a	B2	B1a	B2
점도* (cP)	5	2.5	5	2.5	5	2.5
직경 (mm)	12	10	16	16	6	6
유속 (L/h)	120	210	120	210	120	210
레이놀즈수	707	2971	531	1857	1415	4951
공정	층류	난류	층류	층류	층류	난류

제시된 B1a 및 B1b 튜브를 모두 갖는 다양한 튜브 형상에 대해 식 (3)을 사용하여 유사한 계산을 수행하였다:

코일	고속			고속/최대 진탕
	B1a	B1b	B2	B1a	B1a	B1a
점도* (cP)	5	5	2.5	5	5	5
직경 (mm)	6	16	6	3	2	3
유속 (L/h)	120	120	210	120	120	160
레이놀즈수	1415	531	4951	2829	4244	3773
공정	층류	층류	난류	난류	난류	난류

명백히, 미리 정해진 레이놀즈 값은 튜브 직경 및 유속을 조정함으로써 얻을 수 있다.

당업계의 숙련인은 B2에 대한 또는 B1의 2개의 섹션 (B1a 및 B1b)에 대한 직경 및 길이의 많은 조합을 계획할 수 있다. 예를 들어, 길이를 감소시키고 진탕을 증가시키기 위해 B1의 제1 섹션은 6 mm에서 3 mm로 감소될 수 있다. 또한, n 및 m은 유체의 유동학적 거동의 연구로부터 결정되고 튜브의 적당한 특징을 결정하기 위해 사용될 수 있다.

진탕 효율 외에, 진탕의 지속 시간을 또한 고려할 수 있고, 이는 본 발명의 일부 실시태양에서 코일 길이를 조정함으로써 얻을 수 있다.

튜브의 직경 또는 유체 속도는 비-뉴턴 유체에 대한 식 (1)에서 지배하는 것으로 보이지 않는다 (데이타를 나타내지 않음). 즉, 식 (1)이 B1b 내에서 및 B2에서 계산을 위해 사용되면 직경을 변경시키는 것이 유속을 변경시키는 것보다 더 효과적인 것으로 보이지 않는다. 높은 유속이 바람직한 경우, 직경은 유속에 따라 변할 수 있다.

이들 원리는 gDNA을 단편화하는 것을 피하기 위해 B1b 및 B2에서 진탕을 가능한 한 많이 제한하기 위한 기초로서 사용될 수 있다.

용해 동안, gDNA가 변성되지 않는 한 진탕은 꽤 격렬할 수 있다. B1의 초기에서 직경을 감소시키면 용액 2를 세포와 충분히 혼합하기 위해 진탕을 증가시키는 것이 가능하다 (증가된 Re). 한편, 세포가 용해될 때, 핵산 단편화를 피하기 위해 진탕 및 벽에 대한 마찰력은 감소될 수 있다. 직경을 증가시키면 진탕 (감소된 Re) 및 마찰 (느려진 속도)을 감소시키는 것이 가능하다.

M1: 유체를 혼합한다.

B1a: 용해의 초기에 혼합을 미세조정한다: 대류 현상 (마크로믹싱).

B1b: 변성 발생 + 확산 현상 (마이크로믹싱).

일반화된 레이놀즈 수는 비-뉴턴 유체에 대해 전통적인 레이놀즈 수가 뉴턴 유체에 대해 갖는 것과 동일한 의미를 갖는 것으로 가정된다. 특히, 환상 단면의 도관에서 층류 체제에 대한 한계는 Re_N < 2300인 것으로 가정된다.

중화는 B2 내에서 수행된다. 높은 유속은 너무 격렬한 진탕을 유발함으로써 및 벽에서 마찰력 (기계적 응력)에 의해 게놈 DNA의 단편화를 증가시키는 경향이 있다. 큰 직경 튜브를 사용하면 진탕 (Re) 및 마찰력 (속도)를 감소시키는 것이 가능해진다. 충분한 진탕이 없는 것을 피하기 위해 소직경 튜브 (6 mm)를 배치하였다. 본 발명자들의 관찰은 중화된 용해물을 "격렬하고 재빠르게" 진탕하기 위해 B2에 대해 소직경 튜브만을 갖는 것이 최상임을 보여준다.

실시예 2

CL 시스템을 5 단계로 분류할 수 있다. 한 특정한 실시태양에서, 형상은 다음과 같다:

1) 혼합: 세포 (용액 1 중) + 용액 2 (M1 + 6 mm 튜브의 3 m). SDS에 의한 세포의 용해의 시작, DNA가 변성되지 않는 한 단편화될 위험이 없음.

2) gDNA의 용해 및 변성의 끝 (16 mm 튜브의 13 m).

3) 혼합: 용해물 + 용액 3 (M2 + 6 mm 튜브의 3 m).

4) 중화된 용해물을 4℃에서 회수함

5) 부유체 및 gDNA의 큰 단편을 4℃에서 밤새 침강시킴.

연속 용해를 수행하기 위해 다음 조건을 사용할 수 있다:

- 용액 1: EDTA 10 mM, 글루코스 (Glc) 9 g/l 및 트리스 HCl 25 mM, pH 7.2.

- 용액 2: SDS 1％ 및 NaOH 0.2 N.

- 용액 3: 아세트산 2 M 및 아세트산칼륨 3M.

- 유속 60 l/h: 용액 1 및 용액 2

- 유속 90 l/h: 용액 3.

- 세포를 용액 1로 38.5 g/l로 조정함.

용액 1 중 세포는 이들을 반대 방향으로부터 도달하는 용액 2에 분산시키는 3 노즐을 통해 통과한다.

- 혼합기 M1은 2개의 유체의 혼합을 최적화하는 것을 가능하게 하는 기하형태를 갖는다 (도 2 참조, 혼합기의 개략도).

- 혼합기 M1 이후 튜브의 제1 섹션은 B1a이고 다음 섹션은 B1b이다.

B1a: 3 m 길이, 6 mm 직경, 2.5 sec 체류 시간

B1b: 13 m 길이, 16 mm 직경, 77 sec 체류 시간

본 발명의 방법은은 분산, 잠깐 동안의 격렬한 혼합, 및 확산에 의한 부드러운 혼합으로 요약되는 효율의 면에서 잇점을 제공한다.

본 발명의 방법을 사용하면, 용해된 세포의 수가 증가하고, 따라서 회수된 플라스미드 DNA의 양이 증가한다.

이들 유체는 그의 특성, 특히 점탄성으로 인해 혼합하기 어렵기 때문에 확산의 개념이 특히 중요하다.

본 발명의 방법은 전단 응력을 제한하고, 따라서 gDNA의 단편화를 제한하는 것을 가능하게 하여, 후속 크로마토그래피 정제 동안 그의 제거를 용이하게 한다.

이어서, 문제는 4℃로 냉각될 수 있는 용액 3과의 혼합이다. 한 실시태양에서, 본 발명의 방법은 아래의 것을 사용한다:

- 혼합기 M2, 내경이 약 10 mm인 Y

- 튜브 B2의 섹션은 혼합기 M2 다음에 놓인다.

B2: 6 mm 튜브의 2 m; 체류 시간: 1 sec.

하기 표 5는 배치식 용해에 비교하여 본 발명의 연속 용해 공정의 잇점을 보여주기 위한 비교 시험에서 얻은 결과를 제시한다.

	용해물 중 비 gDNA/pDNA	세포 g당 추출된 플라스미드의 양 (mg/g)
배치식 용해	16.9	1.4
실시예 1에 기재된 CL 시스템을 사용하는 연속 용해	1.6	1.9

실시예 3

사용된 컬럼은 연동 펌프 (출력 < 1 ml/min)에 연결된 NHS (N-히드록시숙신이미드, 파마시아)로 활성화된 1 ml HiTrap 컬럼이다. 사용된 구체적인 올리고뉴클레오티드는 5' 단부에서 NH₂기를 갖고, 그의 서열은 다음과 같다:

5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (서열 1)

본 실시예에서 사용된 버퍼는 다음과 같다:

커플링 버퍼: 0.2 M NaHCO₃, 0.5 M NaCl, pH 8.3.

버퍼 A: 0.5 M 에탄올아민, 0.5 M NaCl, pH 8.3.

버퍼 B: 0.1 M 아세테이트, 0.5 M NaCl, pH 4.

컬럼을 6 ml의 1 mM HCl로 세척한 후, 커플링 버퍼에 희석시킨 올리고뉴클레오티드 (1 ml 중 50 nmol)를 컬럼에 적용하고 30분 동안 실온에서 정치시킨다. 컬럼을 6 ml의 버퍼 A, 이어서 6 ml의 버퍼 B로 연속 3회 세척한다. 이에 의해 올리고뉴클레오티드는 CONH 연결을 통해 컬럼에 공유 결합된다. 컬럼은 4℃에서 PBS, 0.1％ NaN₃에 보관하고, 적어도 4회 사용할 수 있다.

하기 2가지 올리고뉴클레오티드를 합성하였다:

올리고뉴클레오티드 4817:

5'-GATCCGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGG-3' (서열 13)

올리고뉴클레오티드 4818

5'-AATTCCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCG-3' (서열 14)

상기 올리고뉴클레오티드는 플라스미드 내로 혼성화되고 클로닝될 때 호모퓨린-호모피리미딘 서열 (GAA)₁₇ (서열 15)를 상기한 바와 같이 대응하는 플라스미드 내로 도입시킨다.

이들 2가지 혼성화된 올리고뉴클레오티드에 대응하는 서열은 암피실린-내성 유전자를 갖는 플라스미드 pBKS+ (스트라타젠 클로닝 시스템 (Stratagene Cloning System, 미국 캘리포니아주 라 졸라))의 다중 클로닝 부위에 클로닝된다. 이를 위해, 올리고뉴클레오티드는 다음 방식으로 혼성화된다: 1 ㎍의 이들 2가지 올리고뉴클레오티드를 50 mM 트리스-HCl pH 7.4, 10 mM MgCl₂를 포함하는 40 ml의 최종 버퍼에 함께 넣는다. 상기 혼합물을 95℃로 가열한 후 실온에 놓아 온도가 서서히 내려가도록 하였다. 10 ng의 혼성화된 올리고뉴클레오티드의 혼합물을 30 ㎕ 최종 중 BamHI 및 EcoRI로 소화시킨 200 ng의 플라스미드 pBKS+ (스트라타젠 클로닝 시스템)와 라이게이션시킨다. 라이게이션 후, 분취액을 DH5a 내로 형질전환시킨다. 형질전환 혼합물을 암피실린 (50 mg/l) 및 X-gal (20 mg/l)을 보충한 L 배지 상에 플레이팅한다. 재조합 클론은 이. 콜라이 β-갈락토시다제의 단편 ω의 α-상보성을 허용하는 모 플라스미드 (pBKS+)와 반대로 상기 배지 상에 청색 착색의 부재를 나타낼 것이다. 6개 클론으로부터 플라스미드 DNA의 소량 제조 후, 이들은 모두 pBKS+의 EcoRI과 BamHI 부위 사이에 위치한 PstI 부위의 소실, 및 다중 클로닝 부위를 함유하는 448-bp PvuII 밴드의 분자량 증가를 나타내었다. 하나의 클론이 선택되고, 대응하는 플라스미드는 pXL2563으로 불린다. 클로닝된 서열은 플라스미드 pBKS+ (스트라타젠 클로닝 시스템)에 대해 프라이머 -20 (5'-TGACCGGCAGCAAAATG-3' (서열 16))을 사용하여 서열분석함으로써 확인된다 (Viera J. and J. Messing. 1982. pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene, 19, 259-268). 플라스미드 pXL2563은 공급자의 권고에 따라 Wizard Megaprep 키트 (프로메가 코오퍼레이션 (Promega Corp. 미국 위스콘신주 매디슨)에 따라 정제된다. 상기 플라스미드 DNA 제제는 하기 실시예에 사용된다.

플라스미드 pXL2563은 상기 1.1에 설명된 올리고뉴클레오티드에 커플링된 HiTrap 컬럼 상에서 또한 플라스미드 pBKS+를 함유하는 용액으로부터 정제된다.

본 정제에 사용된 버퍼는 다음과 같다:

버퍼 F: 2 M NaCl, 0.2 M 아세테이트, pH 4.5 내지 5.

버퍼 E: 1 M 트리스-HCl, pH 9, 0.5 mM EDTA.

컬럼을 6 ml의 버퍼 F로 세척하고, 플라스미드 (400 ㎕의 버퍼 F 중 20 ㎍의 pXL2563 및 20 ㎍의 pBKS+)를 컬럼에 적용하고 2시간 동안 실온에서 인큐베이션한다. 컬럼을 10 ml의 버퍼 F로 세척한 후, 버퍼 E를 사용하여 용출을 수행한다. 플라스미드는 1％ 아가로스 겔 상의 전기영동 및 에티듐 브로마이드 염색 후 검출된다. 용액 중 플라스미드의 비율은 이. 콜라이에 대한 그의 형질전환 활성을 측정함으로써 추정한다.

30％의 pXL2563 및 70％의 pBKS+를 함유하는 혼합물을 출발물질로 사용하여, 100％의 pXL2563을 함유하는 용액을 컬럼 배출구에서 회수한다. 260 및 280 nm에서 OD비에 의해 추정되는 순도는 1.9에서 2.5로 상승하고, 이는 오염 단백질이 상기 방법으로 제거됨을 나타낸다.

실시예 4

올리고뉴클레오티드 (5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (서열 1))를 컬럼에 커플링하는 것은 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행한다. 커플링을 위해, 올리고뉴클레오티드는 5' 단부에서 6개의 탄소 원자를 함유하는 아암에 의해 스페이서의 포스페이트에 연결된 아민기로 변형된다 (변형 올리고뉴클레오티드, 유로젠텍 에스에이 (Eurogentec SA, 벨기에)). 플라스미드 pXL2563은 공급자의 권고에 따라 Wizard Megaprep 키트 (프로메가 코오퍼레이션)를 사용하여 정제된다. 본 실시예에서 사용된 버퍼는 다음과 같다:

버퍼 F: 0-2 M NaCl, 0.2 M 아세테이트, pH 4.5 내지 5.

버퍼 E: 1 M 트리스-HCl pH 9, 0.5 mM EDTA.

컬럼을 6 ml의 버퍼 F로 세척한 후, 400 ㎕의 버퍼 F에 희석시킨 100 ㎍의 플라스미드 pXL2563을 컬럼에 적용하고 2시간 동안 실온에서 인큐베이션한다. 컬럼을 10 ml의 버퍼 F로 세척한 후, 버퍼 E를 사용하여 용출을 수행한다. 플라스미드는 260 nm 광학 밀도를 측정하여 정량한다.

본 실시예에서, 결합은 NaCl에 관한 그의 몰농도가 0 내지 2 M로 변하는 버퍼 (버퍼 F) 중에서 수행한다. 정제 수율은 NaCl의 몰농도가 떨어질 때 감소한다. 결합 버퍼의 pH는 4.5 내지 5로 변할 수 있고, 정제 수율은 4.5에서 더 우수하다. 염기성 pH의 다른 용출 버퍼를 사용하는 것도 가능하고: 따라서, 용출은 50 mM 보레이트, pH 9, 0.5 mM EDTA를 포함하는 버퍼를 사용하여 수행한다.

올리고뉴클레오티드 (5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (서열 1)를 컬럼에 커플링하는 것은 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행한다. 플라스미드 pXL2563은 공급자의 권고에 따라 Wizard Megaprep 키트 (프로메가 코오퍼레이션)를 사용하여 정제한다. 본 실시예에서 사용된 버퍼는 다음과 같다:

버퍼 F: 0.1 M NaCl, 0.2 M 아세테이트, pH 5.

버퍼 E: 1 M 트리스-HCl pH 9, 0.5 mM EDTA.

컬럼을 6 ml의 버퍼 F로 세척한 후, 400 ㎕의 버퍼 F에 희석시킨 100 ㎍의 플라스미드 pXL2563을 컬럼에 적용하고 1시간 동안 실온에서 인큐베이션한다. 컬럼을 10 ml의 버퍼 F로 세척한 후, 버퍼 E를 사용하여 용출을 수행한다. 올리고뉴클레오티드 컬럼을 통한 통과 전후의 플라스미드 샘플 내에 존재하는 게놈 또는 염색체 이. 콜라이 DNA의 함량을 측정한다. 상기 게놈 DNA는 이. 콜라이 galK 유전자 내에서 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 정량한다. 다음 프로토콜에 따른다: 이들 프라이머의 서열은 문헌 [Debouck et al. (Nucleic Acids Res. 1985, 13, 1841-1853)]에 기재되어 있다:

5'-CCG AAT TCT GGG GAC CAA AGC AGT TTC-3'(서열 17) 및

5'-CCA AGC TTC ACT GTT CAC GAC GGG TGT-3' (서열 18).

반응 매질은 25 ㎕의 PCR 버퍼 (프로메가 프랑스 (Promega France, 프랑스 샤르보니에르)) 중에 1.5 mM MgCl₂; 0.2 mM dXTP (파마시아, 프랑스 오르세); 0.5 μM 프라이머; 20 U/ml Taq 폴리머라제 (프로메가)를 포함한다. 반응은 다음 순서에 따라 수행한다:

- 95℃에서 5 min

- 95℃에서 10 sec

6O℃에서 30 sec

78℃에서 1분의 30 사이클

- 78℃에서 10분.

증폭된 DNA 단편 (124 염기쌍 길이)은 SybrGreen I (몰레큘라 프로브스 (Molecular Probes, 미국 오레곤주 유진))의 존재 하에 3％ 아가로스 겔 상에서 전기영동에 의해 분리한 후, 이. 콜라이 균주 B (시그마 (Sigma), ref D4889)로부터의 Ultrapur 게놈 DNA 시리즈를 참조하여 정량한다.

실시예 5

본 실시예는 소위 "소량-제조" 규모로 세균 배양물의 맑은 용해물로부터 플라스미드 DNA 정제를 설명한다: 플라스미드 pXL2563을 포함하는 DH5α 균주의 철야 배양물 1.5 ml을 원심분리하고, 펠렛을 100 ㎕의 50 mM 글루코스, 25 mM 트리스-HCl, pH 8, 10 mM EDTA에 재현탁시킨다. 200 ㎕의 0.2 M NaOH, 1％ SDS를 첨가하고, 튜브를 뒤집어 혼합한 후, 150 ㎕의 3 M 아세트산칼륨, pH 5를 첨가하고, 튜브를 뒤집어 혼합한다. 원심분리 후, 상등액을 회수하고 실시예 1에 기재된 바와 같이 얻은 올리고뉴클레오티드 컬럼 상에 로딩한다. 결합, 세척 및 용출은 실시예 3에 기재된 것과 동일하다. 1.5 ml의 배양물로부터 약 1 ㎍의 플라스미드가 회수된다. 아가로스 겔 전기영동 및 에티듐 브로마이드 염색에 의해 분석된 얻어진 플라스미드는 "수퍼코일형" 환상 DNA의 단일 밴드 형태를 취한다. 미량의 고분자량 (염색체) DNA 또는 RNA는 상기 방법에 의해 정제된 플라스미드 내에서 검출가능하지 않았다.

실시예 6

본 실시예는 플라스미드 pXL2563을 포함하는 DH5α 균주의 세균 배양물 20 ml을 출발물질로 사용하여, 실시예 5와 동일한 조건 하에 수행된 플라스미드 DNA 정제 실험을 설명한다. 세포 펠렛을 1.5 ml의 50 mM 글루코스, 25 mM 트리스-HCl, pH 8, 10 mM EDTA에 용해시킨다. 용해는 2 ml의 0.2 M NaOH, 1％ SDS를 사용하여 수행하고, 중화는 1.5 ml의 3 M 아세트산칼륨, pH 5를 사용하여 수행한다. 이어서, DNA를 3 ml의 2-프로판올로 침전시키고, 펠렛을 0.5 ml의 0.2 M 아세트산나트륨, pH 5, 0.1 M NaCl에 용해시키고, 상기 실시예에 설명된 바와 같이 얻은 올리고뉴클레오티드 컬럼 상에 로딩한다. 결합, 컬럼의 세척 및 용출은 NaCl에 관한 그의 몰 농도가 0.1 M인 세척 버퍼를 제외하고는 상기 실시예에 설명된 바와 같이 수행한다. 아가로스 겔 전기영동 및 에티듐 브로마이드 염색에 의해 분석된 얻어진 플라스미드는 "수퍼코일형" 환상 DNA의 단일 밴드 형태를 취한다. 미량의 고분자량 (염색체) DNA 또는 RNA는 정제된 플라스미드 내에서 검출가능하지 않았다. 제한 효소를 사용하여 플라스미드를 소화시키면 3 kb의 예상 분자량에서 단일 밴드를 제공한다. 플라스미드는 사이토메갈로바이러스 프로모터, 루시퍼라제를 코딩하는 유전자, 및 플라스미드 pXL2563으로부터 기원하는 호모퓨린-호모피리미딘 서열 (GAA)₁₇ (서열 15)를 함유하는 카세트를 포함한다. 상기 플라스미드를 함유하는 균주 DH1 (Maniatis et al., 1989)은 7-리터 발효조 내에서 배양한다. 맑은 용해물은 200 g의 세포로부터 제조하고: 세포 펠렛을 2 리터의 25 mM 트리스, pH 6.8, 50 mM 글루코스, 10 mM EDTA에 용해시키고, 여기에 2 리터의 0.2 M NaOH, 1％ SDS를 첨가한다. 1 리터의 3M 아세트산칼륨을 첨가하여 용해물을 중화시킨다. 투석여과 후, 4 ml의 상기 용해물을 실시예 3에 기재된 방법에 따라 서열 5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (서열 1)의 올리고뉴클레오티드에 커플링된 5 ml HiTrap-NHS 컬럼에 적용한다. 세척 및 용출은 상기 실시예에 기재된 바와 같이 수행한다.

실시예 7

본 실시예는 메틸화 시토신을 갖는 올리고뉴클레오티드의 사용을 설명한다. 사용된 올리고뉴클레오티드의 서열은 다음과 같다:

5'-GAGG^MeCTT^MeCTT^MeCTT^MeCTT^MeCCT^MeCTT^MeCTT-3' (서열 19)

상기 올리고뉴클레오티드 5' 단부에서 NH₂기를 갖는다. ^MeC = 5-메틸시토신. 상기 올리고뉴클레오티드는 플라스미드 pXL2563이 실시예 1의 조건 하에 pH 5의 결합 버퍼를 사용하여 정제될 수 있도록 한다 (그의 의해 플라스미드의 분해 위험이 감소된다).

실시예 8

상기 실시예에서, 사용된 올리고뉴클레오티드는 5'-말단에서 6 탄소 원자를 함유하는 아암을 통해 포스페이트에 연결된 아민기 NH₂-(CH₂)₆으로 변형된다. 본 실시예에서, 아민기는 12개의 탄소 원자를 함유하는 아암을 통해 5'-말단의 포스페이트에 연결된다: NH₂-(CH₂)₁₂. 올리고뉴클레오티드의 커플링 및 컬럼을 통한 통과는 버퍼 F: 2 M NaCl, 0.2 M 아세테이트, pH 4.5를 사용하여 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행한다. 상기 올리고뉴클레오티드는 보다 우수한 정제 수율을 얻도록 하여: 53％ 수율이 얻어지는 반면, 6 탄소 원자를 함유하는 올리고뉴클레오티드에서 수율은 동일한 조건 하에 약 45％이다.

실시예 9

실시예 3에 기재된 클로닝 전략에 따라, 호모퓨린-호모피리미딘 서열을 갖는 다른 2개의 플라스미드를 제작하였다: 서열 (GGA)₁₆ (서열 20)을 갖는 플라스미드 pXL2725 및 서열 (GA)₂₅ (서열 21)을 갖는 플라스미드 pXL2726.

플라스미드 pXL2563과 유사한 플라스미드 pXL2725 및 pXL2726은 실시예 3에 기재된 클로닝 전략에 따라 다음 올리고뉴클레오티드 쌍을 사용하여 제작한다:

5986: 5'-GATCC(GA)₂₅GGG-3' (서열 22)

5987: 5'-AATTCCC(TC)₂₅G-3' (서열 23)

5981: 5'-GATCC(GGA)₁₇GG-3' (서열 24)

5982: 5'-AATT(CCT)₁₇CCG-3' (서열 25)

올리고뉴클레오티드 쌍 5986 및 5987은 올리고뉴클레오티드를 pBKS+ (스트라타젠 클로닝 시스템)의 BamHI 및 EcoRI 부위에서 클로닝함으로써 플라스미드 pXL2726을 제작하기 위해 사용되는 한편, 올리고뉴클레오티드 5981 및 5982는 플라스미드 pXL2725의 제작을 위해 사용된다. 플라스미드 pXL2563의 제작에 대한 것과 동일한 실험 조건이 사용되고, 올리고뉴클레오티드 쌍만 변화된다. 유사하게, 클로닝된 서열은 플라스미드 상에서 서열분석함으로써 확인된다. 이는 플라스미드 pXL2725가 예상 서열에 비해 변형을 갖도록 할 수 있다: 17번 반복된 서열 GGA 대신, GGAGA(GGA)₁₅ (서열 26)이 존재한다.

실시예 10

이들 호모퓨린 서열과 삼중 나선을 형성하는 올리고뉴클레오티드는 실시예 1.1에 기재된 기술에 따라 HiTrap 컬럼에 커플링된다. 플라스미드 pXL2725의 정제를 위해 서열 5'-AATGCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCT-3' (서열 27)의 올리고뉴클레오티드를 사용하고, 플라스미드 pXL2726의 정제를 위해 서열 5'-AGTGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT-3' (서열 28)의 올리고뉴클레오티드를 사용한다.

이에 의해 얻어진 2개의 컬럼은 다음 버퍼를 사용하여 대응하는 플라스미드가 실시예 2에 기재된 기술에 따라 정제되도록 한다:

버퍼 F: 2 M NaCl, 0.2 M 아세테이트, pH 4.5.

버퍼 E: 1 M 트리스-HCl, pH 9, 0.5 mM EDTA.

얻어진 수율은 pXL2725 및 pXL2726 각각에 대해 23％ 및 31％이다.

실시예 11

본 실시예는 플라스미드 내에 존재하는 특정한 서열의 길이의 정제 수율에 대한 영향을 설명한다.

본 발명의 조성물의 활성을 입증하기 위한 이들 실험에 사용된 리포터 유전자는 루시퍼라제를 코딩하는 유전자 (Luc)이다.

플라스미드 pXL2621은 MluI 및 HindIII 부위에서 벡터 pGL 기초 벡터 (프로메가 코오퍼레이션) 내로 루시퍼라제를 코딩하는 유전자의 상류에 클로닝된 661-bp 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터를 함유하는 카세트를 포함한다. 상기 플라스미드는 분자 생물학의 표준 기술을 사용하여 제작한다.

플라스미드 pXL2727-1 및 pXL2727-2는 다음과 같은 방식으로 제조한다.

2 ㎍의 플라스미드 pXL2621을 BamHI을 사용하여 선형화시키고; 효소를 10분 동안 65℃에서 처리하여 불활성화시키고; 동시에, 올리고뉴클레오티드 6006 및 6008은 플라스미드 pXL2563의 제작에 대해 기재된 바와 같이 혼성화시킨다.

6006: 5'-GATCT(GAA)₁₇CTGCAGATCT-3' (서열 29)

6008: 5'-GATCAGATCTGCAG(TTC)₁₇A-3' (서열 30).

상기 혼성화 혼합물은 플라스미드 pXL2621의 BamHI 단부에서 클로닝되고, DH5α 내로 형질전환된 후, 올리고뉴클레오티드가 PstI 부위로 도입하기 때문에 재조합 클론은 PstI 효소 제한 분석에 의해 확인된다. 2개의 클론이 선택되고, 클로닝된 단편의 뉴클레오티드 서열은 서열분석 반응 프라이머로서 프라이머 (6282, 5'-ACAGTCATAAGTGCGGCGACG-3' (서열 31))를 사용하여 확인된다 (Viera J. and J. Messing, 1982. The pUC plasmids, M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene 19:259-268).

제1 클론 (pXL2727-1)은 10회 반복된 서열 GAA를 포함한다. 제2 클론 (pXL2727-2)는 서열 5'-GAAGAAGAG(GAA)₇GGAAGAGAA-3' (서열 32)을 포함한다.

올리고뉴클레오티드 5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (서열 1)에 커플링된 실시예 3에 기재된 것과 같은 칼럼을 사용한다.

플라스미드 pXL2727-1은 서열 GAA의 14개 반복체를 갖는다. 따라서, 대응하는 혼성화 서열 CTT의 7개 반복체만을 갖는 상기한 올리고뉴클레오티드는 플라스미드와 8개의 상이한 위치에서 혼성화할 수 있다. 대조적으로, 플라스미드 pXL2727-2는 컬럼에 결합된 올리고뉴클레오티드와 동일한 길이의 혼성화 서열 (GAA)₇ (서열 36)을 갖는다. 따라서, 상기 올리고뉴클레오티드는 pXL2727-2 상의 하나의 위치에서만 혼성화할 수 있다.

실험은 다음 버퍼를 사용하여 실시예 4에 기재된 것과 동일하다:

버퍼 F: 2 M NaCl, 0.2 M 아세테이트, pH 4.5.

버퍼 E: 1 M 트리스-HCl, pH 9, 0.5 mM EDTA.

정제 수율은 플라스미드 pXL2727-1에서 29％이고 pXL2727-2에서 19％이다.

사용된 세포는 실험 전날에 24-웰 배양판 내로 50,000 세포/웰의 기초로 접종된 NIH 3T3 세포이다. 플라스미드는 150 mM NaCl에 희석시키고 리포펙턴트 (lipofectant) RPR1 15335와 혼합한다. 6의 리포펙턴트 양전하/DNA 음전하 비를 사용한다. 혼합물을 볼텍싱하고, 10분 동안 실온에서 정치시키고, 소 태아 혈청이 없는 배지 내에 희석한 후, 세포에 1 ㎍의 DNA/배양 웰의 비율로 첨가한다. 37℃에서 2시간 후, 10％ 부피/부피의 소 태아 혈청을 첨가하고, 세포를 48시간 동안 37℃에서 5％의 CO₂의 존재 하에 인큐베이션한다. 세포를 PBS로 2회 세척하고, 루시퍼라제 활성을 Lumat LB9501 발광분석기 (이지 앤드 지 베르톨드 (EG and G Berthold, 프랑스 에브리)) 상에서 설명된 프로토콜 (Promega 키트, 프로메가 코오퍼레이션)에 따라 측정한다. 실시예 8.2에 설명된 바와 같이 정제된 플라스미드 pXL2727-1은 Wizard Megaprep 키트 (프로메가 코오퍼레이션)을 사용하여 정제된 동일한 플라스미드를 사용하여 얻은 것보다 2배 더 큰 형질감염 수율을 제공한다.

실시예 12

다음 예는 삼중 나선 친화도 크로마토그래피를 사용하는 pCOR-유래 플라스미드의 정제를 증명한다. 상기 기술은 핵산 오염물질 (특히 숙주 게놈 DNA 및 RNA)을 통상적인 크로마토그래피 방법으로 달성할 수 없었던 수준으로 제거할 수 있는 것으로 나타났다.

삼중 친화도 겔은 크로마토그래피 매트릭스로서 Sephacryl S-1000 SF (아머샴-파마시아 바이오테크 (Amersham-Pharmacia Biotech))를 사용하여 합성한다. Sephacryl S-1000을 먼저 0.2 M 아세트산나트륨 (pH 4.7) 중 나트륨 m-페리오데이트 (3 mM, 실온, 1 h)로 활성화시킨다. 이어서, 올리고뉴클레오티드를 그의 5'-NH₂ 말단 잔기를 통해 단백질의 커플링에 대해 앞서 설명한 바와 같이 아스코르브산 (5 mM)의 존재 하에 활성화된 매트릭스의 알데히드기에 환원적 아민화에 의해 커플링시킨다 (Hornsey et al., J. Immunol. Methods, 1986, 93, 83-88). 이들 실험에 사용된 호모피리미딘 올리고뉴클레오티드 (유로젠텍, HPLC-정제된)는 pCOR 플라스미드의 복제 기점 (oriγ)에 존재하는 짧은 14합체 호모퓨린 서열 (5'-AAGAAAAAAAAGAA-3') (서열 10)에 상보성인 서열을 가졌다 (Soubrier et al., Gene Therapy, 1999, 6, 1482-1488). 상기 논의한 바와 같이, 호모피리미딘 올리고뉴클레오티드의 서열은 5'-TTCTTTTTTTTCTT-3' (서열 11)이다.

다음 플라스미드를 크로마토그래피시킨다: pXL3296 (도입유전자가 없는 pCOR, 2.0 kpb), pXL3179 (pCOR-FGF, 2.4 kpb), pXL3579 (pCOR-VEGFB, 2.5 kbp), pXL3678 (pCOR-AFP, 3.7 kbp), pXL3227 (pCOR-lacZ, 5.4 kbp) 및 pXL3397 (pCOR-Bdeleted FVIII, 6.6 kbp). 이들 모든 플라스미드는 실시예 4에 설명된 바와 같이 얻은 맑은 용해물로부터 2개의 음이온 교환 크로마토그래피 단계에 의해 정제한다. 플라스미드 pBKS+ (pBluescript II KS + 스트라타젠으로부터) (CsCl 중에서 초원심분리에 의해 정제된 ColE1-유래 플라스미드)를 또한 연구한다. 사용된 모든 플라스미드는 그의 수퍼코일형 (> 95％) 위상 상태 또는 형태로 존재한다.

각각의 플라스미드 DNA 정제 실험에서, 6 ml의 2 M NaCl, 0.2 M 아세트산칼륨 (pH 5.0) 중 300 ㎍의 플라스미드 DNA를 30 cm/h의 유속으로 상기 언급된 올리고뉴클레오티드 5'-TTCTTTTTTTTCTT-3' (서열 11)을 함유하는 친화도 컬럼 상에 로딩한다. 컬럼을 5 부피의 동일한 버퍼로 세척한 후, 결합된 플라스미드를 1 M 트리스/HCl, 0.5 mM EDTA (pH 9.0)으로 용출하고 Millipore Gen-Pak 컬럼을 사용한 UV (260 nm) 및 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정량한다 (Marquet et al., BioPharm, 1995, 8, 26-37). 수거된 분획에서 플라스미드 회수량은 pXL3296에 대해 207 ㎍, pXL3179에 대해 196 ㎍, pXL3579에 대해 192 ㎍, pXL3678에 대해 139 ㎍, pXL 3227에 대해 97 ㎍, pXL 3397에 대해 79 ㎍이다.

pBKS를 상기 컬럼 상으로 크로마토그래피시킬 때 플라스미드 결합은 검출할 수 없었다 (< 3 ㎍). 이는 올리고뉴클레오티드 5'-TTCTTTTTTTTCTT-3' (서열 11)이 pCOR (oriγ) 내에 존재하는 상보성 14합체 서열 5'-AAGAAAAAAAAGAA-3' (서열 10)과 함께 안정한 삼중 구조체를 제조하지만, pBKS 내에 존재하는 밀접하게 관련된 서열 5'-AGAAAAAAAGGA-3' (서열 8)과 함께는 그렇지 않음을 나타낸다. 이는 단일 비-정규적 삼중체 (이 경우에 T*GC)를 도입하면 삼중 구조체의 완전 불안정화를 생성시킴을 나타낸다.

대조군으로서, pXL3179를 엄격하게 유사한 조건 하에 합성되지만 올리고뉴클레오티드를 갖지 않는 블랭크 컬럼 상에서 크로마토그래피시킬 때 플라스미드 결합 (< 1 ㎍)이 관찰되지 않았다.

상기 친화도 정제 컬럼을 본원에 기록된 조건으로 작동시킴으로써, 숙주 게놈 DNA에 의한 오염 수준은 pXL3296의 제조에 대해 2.6％에서 0.07％로 감소되었다. 유사하게, 샘플을 동일한 친화도 컬럼을 통해 크로마토그래피시킬 때 숙주 DNA에 의한 오염 수준은 pXL3179의 제조에 대해 0.5％에서 0.008％로 감소된다.

실시예 13

하기 실시예는 삼중 나선 친화도 크로마토그래피를 사용하는 ColE1-유래 플라스미드의 정제를 증명한다. 상기 기술은 핵산 오염물질 (특히 숙주 게놈 DNA 및 RNA)을 통상적인 크로마토그래피 방법으로 달성할 수 없었던 수준으로 제거할 수 있는 것으로 나타났다.

삼중 친화도 겔은 상기 실시예에 설명된 바와 같이 서열 5'-TCTTTTTTTCCT-3' (서열 9)를 갖는 올리고뉴클레오티드를 페리오데이트-산화된 Sephacryl S-1000 SF 상으로 커플링시켜 합성한다.

플라스미드 pXL3296 (도입유전자가 없는 pCOR) 및 pBKS (ColE1-유래 플라스미드)를 실시예 9에 기재된 조건에서 올리고뉴클레오티드 5'-TCTTTTTTTCCT-3' (서열 9)를 함유하는 1-ml 컬럼 상에서 크로마토그래피시킨다. 수거된 분획 중의 플라스미드 회수량은 pBKS에 대해 175 ㎍이고 pXL3296에 대해 <1 ㎍이다. 이는 올리고뉴클레오티드 5'-TCTTTTTTTCCT-3' (서열 9)가 pBKS 내에 존재하는 상보성 12합체 서열 (5'-AGAAAAAAAGGA-3') (서열 8)과 안정한 삼중 구조체를 제조하지만, pCOR 내에 존재하는 매우 밀접하게 관련된 12합체 서열 (5'-AGAAAAAAAAGA-3') (서열 34)와는 그렇지 않음을 나타낸다. 이는 단일 비-정규적 삼중체 (이 경우에 C*AT)의 도입이 삼중 구조체의 완전 불안정화를 생성시킬 수 있음을 나타낸다.

실시예 14

종균 배양액은 배플장치가 없는 (unbaffled) 얼렌마이어 플라스크 내에서 다음 방법에 의해 제조한다. 작업 세포 뱅크 (working cell bank)를 M9modG5 배지를 함유하는 얼렌마이어 플라스크 내에 0.2％v/v의 종균율로 접종한다. 균주를 220 rpm에서 회전식 진탕기 내에서 37℃±1℃에서 약 18±2시간 동안 글루코스 고갈까지 배양한다. 이는 200 ml 종균 배양액을 생성시킨다. 배양물의 광학 밀도는 A_60O 약 2-3인 것으로 예상된다.

이어서, 제1 발효조 내에서 예비-배양액을 생성시킨다. 종균 배양액을 M9modG5 배지를 함유하는 예비-발효조에 0.2％(v/v)의 종균율을 보장하도록 무균적으로 옮기고 통기 및 교반 하에 배양한다. pO₂는 포화의 40％를 초과하여 유지시킨다. 글루코스가 16시간 후 소모될 때 배양액을 수거한다. 이는 약 30 리터의 예비-배양액을 생성시킨다. 배양액의 광학 밀도는 A₆₀₀ 약 2-3인 것으로 예상된다.

이어서 주 배양액을 제2 발효조에서 생성시킨다. 30 리터의 예비배양액을 270 리터의 멸균된 FmodG2 배지로 충전된 발효조에 약 10％(v/v)의 종균율을 보장하도록 무균 상태로 옮긴다. 배양은 배치 양식으로 시작하여 일부 생물량을 형성시킨다. 초기 당이 약 4시간 후 소모되면 글루코스 공급을 시작한다. 통기, 교반, pO₂ (40％), pH (6.9±0.1), 온도 (37±1℃) 및 글루코스 공급은 비성장률을 0.09h^-1에 가까이 유지하기 위해 제어된다. 공급 약 35시간 후 배양을 종료한다. 이는 약 400 리터의 배양액을 생성시킨다. 배양액의 광학 밀도는 A_60O 약 100인 것으로 예상된다.

세포 수거로 불리는 제1 분리 단계를 수행한다. 생물량은 디스크 스택 (disk stack) 원심분리기로 수거한다. 브로쓰는 3배 내지 4배 농축시켜 사용된 배양 배지를 제거하고, 400 리터의 멸균 S1 버퍼에 연속적으로 재현탁시킨다. 이는 약 500 리터의 예비-컨디셔닝된 생물량을 생성시킨다. DCW = 25±5 g/L.

농축 단계로 불리는 제2 분리 단계를 수행한다. S1 버퍼에 재현탁/혼성화 후, 세포를 분리기로 다시 처리하여 농축된 슬러리를 수득한다. 이는 약 60-80 리터의 세척되고 농축된 슬러리를 생성시킨다. DCW = 150±30 g/L; 플라스미드 DNA = 300±60 mg/L.

이어서, 동결 단계를 수행한다. 슬러리를 20-L Flexboy™ 백 (bag) (그의 용량의 50％로 충전시킴) 내로 무균 상태로 옮기고, 후속적으로 -20℃±5℃에서 동결시킨 후, 추가로 하류 처리한다. 이는 동결된 생물량을 생성시킨다. pDNA = 300±60 mg/L; 수퍼코일형 형태 > 95％.

이어서, 세포 해동 단계를 수행한다. 동결된 백을 20℃까지 가온시키고, 세포 슬러리를 100 mM 트리스 염산염, 10 mM EDTA, 20 mM 글루코스로 40 g/L, pH 8.0으로 희석시키고, 현탁액을 20±2℃에서 1 h 동안 진탕 하에 방치한 후 세포 용해시킨다. 이는 해동된 생물량 슬러리를 생성시킨다. pH=8.0±0.2.

약 20℃의 온도가 상기 단계 동안 사용될 수 있다.

이어서, 알칼리성 용해 단계를 수행한다. 세포 용해 단계는 희석된 세포 현탁액을 인-라인 혼합기를 통해 0.2 N NaOH-35 mM SDS의 용액 (용액 S2)과 함께 펌핑한 후, 코일 튜브 내의 연속 접촉 단계로 이루어진다. 연속 접촉 단계는 완전 세포 용해 및 게놈 DNA와 단백질의 변성을 보장하기 위한 것이다. 용해된 세포의 용액을 인-라인으로 냉각된 3 M 아세트산칼륨-2 N 아세트산의 용액 3 (S3)과 혼합한 후, 냉각 교반 용기 내에 수거한다. 용액 S3을 첨가하면 게놈 DNA, RNA, 단백질 및 KDS를 침전시킨다.

이어서, 용해물 여과를 수행한다. 이어서, 중화된 용해물을 5±3℃에서 2 내지 24 h 동안 진탕 없이 인큐베이션하고, 3.5 mm 그리드 필터를 통해 여과하여 침전된 물질 (부유체 상)의 벌크를 제거한 후, 폴리싱 (polishing) 여과 단계로서 다층 여과한다. 이는 수퍼코일형 플라스미드의 농도가 90％ 이상인 맑아진 용해물을 생성시킨다.

이어서, 음이온 교환 크로마토그래피를 수행한다. 맑은 용해물 용액을 정제수로 50 mS/cm의 표적 전도도 값으로 희석시키고, 이중층 필터 (3 ㎛-0.8 ㎛)를 통해 여과하고, 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼 상에 로딩한다. 11.0 L 프락토겔(등록상표) TMAE HiCap (M) 수지 (머크 (Merck); #1.10316.5000)로 충전된 300-mm 컬럼을 사용한다. 맑은 용해물을 컬럼 상에 로딩하고, 단계 구배의 NaCl을 사용하여 용출을 수행한다. 컬럼에 결합된 오염물질의 벌크는 NaCl 용액으로 약 61 mS/cm에서 용출되고, DNA 플라스미드는 NaCl 용액으로 약 72 mS/cm에서 용출된다. 이는 고농도의 플라스미드 DNA를 갖는 이온 교환 크로마토그래피 용출물을 생성시킨다.

이어서 삼중 친화도 크로마토그래피를 수행한다. 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼으로부터의 용출물을 약 0.5 부피의 4.8 M NaCl을 함유하는 500 mM 아세트산나트륨 (pH 4.2)의 용액으로 희석하고, 2 M NaCl을 함유하는 50 mM 아세트산나트륨 (pH 4.5)로 평형화시킨 삼중 친화도 크로마토그래피 컬럼을 통해 펌핑한다. 컬럼은 직경 300 mm이고, 10.0 L의 THAC Sephacryl™ S-1000 겔 (아머샴 바이오사이언시즈 (Amersham Biosciences; 미국 뉴저지주 피스카타웨이)을 포함한다. 컬럼을 1 M NaCl을 함유하는 50 mM 아세트산나트륨 (pH 4.5)의 용액으로 세척하고, NV1FGF를 0.5 mM EDTA를 함유하는 100 mM 트리스 (pH 9.0)으로 용출시킨다. 이는 높은 플라스미드 농도를 갖는 삼중 친화도 크로마토그래피 용출물을 생성시킨다.

소수성 상호작용 크로마토그래피 단계가 이어진다. 친화도 크로마토그래피 컬럼의 용출물을 3.6 부피의 트리스 (pH 8.0) 중 3.8 M 황산암모늄의 용액으로 희석한다. 0.45 ㎛ 필터를 통해 여과한 후, 여액을 60 cm/h에서 9.0 L의 토요펄(등록상표) 부틸-650S 수지 (토소 코퍼레이션 (TosoH corp., 미국 오하이오주 그로브 시티))로 충전된 소수성 상호작용 컬럼 (직경 300 mm) 상에 로딩한다. 컬럼을 황산암모늄의 용액으로 약 240 mS/cm에서 세척하고, NV1FGF를 황산암모늄으로 220 mS/cm에서 용출시킨다. 이는 이완된 형태가 없는 HIC 용출물을 생성시킨다.

바람직한 실시태양에 따라, 추가의 투석여과 단계를 수행한다. 표준 시판 투석여과 물질이 당업계에 공지된 표준 기술에 따라 본 공정에 사용하기에 적합하다. 바람직한 투석여과 방법은 플라스미드 크기에 따라 30,000 내지 500,000 범위의 분자량 컷오프를 갖는 한외여과막을 사용하는 투석여과이다. 상기 투석여과 단계는 버퍼 교환을 허용하고, 이어서 농축이 수행된다. 단계 12의 용출물은 용출물은 접선 흐름 여과 (막 컷오프, 30 kDa)에 의해 약 2.5 내지 3.0 mg/mL의 표적 농도로 3배 내지 4배 농축되고, 농축물은 일정 부피에서 10 부피의 염수를 사용하는 투석여과에 의해 버퍼 교환되고, 염수를 사용하여 표적 플라스미드 농도로 조정된다. NV1FGF 농도는 농축물의 샘플의 260 nm에서의 흡광도로부터 계산된다. NV1FGF 용액을 0.2 ㎛ 캡슐 필터를 통해 여과하고, 추가로 처리할 때까지 2-8℃에서 냉장실에서 용기 내에 보관한다. 이는 수퍼코일형 플라스미드의 플라스미드 DNA 농도가 약 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 바람직하게는 99％인 정제된 농축물을 생성시킨다. 상기 공정을 사용하는 총 플라스미드 회수율은 적어도 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％ 및 80％이고, 평균 회수율은 60％이다.

실시예 15

이온 교환 크로마토그래피 (AEC) 단계, 삼중 나선 친화도 크로마토그래피 단계 (THAC) 및 소수성 크로마토그래피 단계 (HIC)를 포함하는 상기 실시예의 방법은 이전에 공지된 방법에 비해 보다 정제된 플라스미드 DNA 제제를 생성시킨다. 상기 새로운 방법을 이전에 공지된 방법에 비교하였고, 훨씬 더 적은 양의 게놈 DNA, RNA, 단백질 및 내독소를 갖는 플라스미드 DNA 제제를 생성시켰다. 이는 도 3에 반영된다. 이들 실험은 AEC, THAC 및 HIC가 모든 오염물질의 효과적인 제거를 위한 2-단계 조합 중 일부에 비교하여 놀랍게도 더 높은 정제 수율을 제공함을 보여준다. 이들 단계의 조합은 다른 생물학적 물질 및 오염물질, 예를 들어 단백질 및 내독소, RNA 및 게놈 DNA와 개환형 플라스미드로부터의 플라스미드 DNA의 분리 효능 면에서 명백한 상승효과를 제공한다. 또한, 상승적 단계 조합, 즉, 본 발명에 따른 AEC/THAC/HIC는 고도로 정제된 제약 등급 플라스미드 DNA를 얻을 수 있을 뿐만 아니라, 또한 80％, 85％, 90％, 95％ 이상 및 99％ 이상의 플라스미드 DNA의 고도로 순수한 완전 수퍼코일형의 조성물을 얻을 수 있다.

실시예 16

고도로 정제된 플라스미드 DNA 제제의 제조를 위한 이온 교환 크로마토그래피 단계, 삼중 나선 친화도 크로마토그래피 단계, 및 소수성 크로마토그래피 단계를 포함하는 상기 실시예의 방법을 이전에 공지된 방법에 비교한다. 도 4에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 방법은 놀랍게도 ppm 미만 범위로 훨씬 더 적은 양의 게놈 DNA, RNA, 단백질 및 내독소를 갖는 pDNA 제제를 생성시킨다. 또한, 도 4에 도시된 바와 같이, 본 발명의 방법은 10 g 이하에서 얻어진 생성물 품질을 보여준다.

실시예 17

실시예 14에 기재된 바와 같은 투석여과 단계를 다음 조건에 따라 수행한다: 다음을 위한 최선의 조건을 측정하기 위해 단계 a 및 단계 b를 위한 버퍼를 사용하였다:

iii) 12.5 내지 13.0 부피의 50 mM 트리스/HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4 (버퍼 I로 명명)에 대한 제1 투석여과 (단계 a), 및

iv) 3.0 내지 3.5 부피의 염수 부형제 (150 mM NaCl)에 대해 상기 단계 a)로부터의 보유액의 제2 투석여과를 수행함 (단계 b).

본 발명에 따른 상기 대안적인 투석여과 단계는 황산암모늄 및 EDTA를 효율적으로 광범하게 제거한다. 또한, 상기 투석여과 단계에 이어, 약 150 mM의 적절한 표적 NaCl 농도 및 400 μM 내지 1 mM의 최종 트리스 농도가 얻어진다. 플라스미드 DNA 제제 조성물의 예를 하기 표 6에 제공한다.

종	최종 농도
	제1 투석여과	제1 투석여과	활성 제약 성분
황산암모늄	10 μM	< 1 μM	< 1 μM
EDTA	4 μM	< 1 μM	< 1 μM
트리스	50 mM	1.48 mM	740 μM
NaCl	154 mM	154 mM	154 mM

실시예 18

LS06으로 명명한 플라스미드 DNA NV1FGF API (활성 제약 성분)의 기술적 배치는 실시예 17에 설명된 투석여과 공정 단계를 이용하여 실시예 13 및 17에 따라 제조한다. 용출물을 먼저 약 2 mg API/mL에서 약 13 부피의 버퍼 I에 대해 투석여과하고, 생성되는 보유액을 약 3 부피의 염수 부형제에 대해 투석여과하였다. 이어서, 최종 보유액을 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과하고 1 mg/mL로 조정하였다. 최종 API (pH 7.24)를 DP 제조까지 +5℃에서 유리병 내에 보관하였다.

안정성 연구는 Duran 유리병에 보관된 LS06의 샘플 (API)과 약품 제조를 위해 사용된 8-mL 바이알 내의 것에 대해 수행하였다. +5℃에서 90일 후, 모든 샘플에 대한 탈퓨린화 및 개환 정도가 거의 검출가능하지 않았다 (≤0.3％). +25℃에서 90일 후, LS06 샘플의 탈퓨린화 및 개환 비율은 또한 매우 낮았다. 본 연구로부터 계산된 탈퓨린화 및 개환 비율은 ≤1％/개월이었다 (도 8).

본 연구는 pH값이 약 7.0 내지 7.5로 유지되는 플라스미드 DNA NV1FGF의 안정성 프로필이 본 발명의 제제 내에서 매우 안정함을 증명하였다. 이는 플라스미드 DNA가 +25℃에서 장기간 동안 낮은 탈퓨린화 및 플라스미드 닉 형성 비율을 가지면서 비-분해된 형태로 안정하게 유지됨을 명백하게 증명한다.

실시예 19

플라스미드 DNA NV1FGF API (활성 제약 성분)의 배치 (LS04, LS04, LS06, LS07 및 LT05로 명명)를 실시예 17에 설명된 투석여과 공정 단계를 이용하여 실시예 13에 따라 제조하였다. 용출물을 먼저 약 13 부피의 버퍼 I에 대해 약 2 mg API/ml에서 투석여과시키고, 생성되는 보유액을 약 3 부피의 염수 부형제에 대해 투석여과시켰다. 이어서, 최종 보유액을 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과하고, 8 ml 바이알 내에 보관을 위해 1 mg/ml로 조정하였다. NaCl 농도가 약 150 mM이고 최종 트리스 농도가 1 mM 내지 2 mM인 플라스미드 DNA를 얻었다. 안정성 연구는 약품 제조를 위해 사용된 8-mL 바이알 내에 보관된 상기 열거된 모든 샘플에 대해 수행하였다.

+25℃에서 150일에 걸쳐, 플라스미드 DNA 조성물의 pH는 도 6A에 도시된 바와 같이 검출가능하게 변하지 않았다. LS04의 pH는 203일 후 6.54 (-0.27 단위)로 유의하게 강하하였다.

LS04를 제외한 모든 배치에 대해, +25℃에서 탈퓨린화 및 닉 형성 비율은 약 1.0％/개월이었고, 140일에 걸쳐 직선적으로 시간 의존성인 것으로 나타났다. 상기 API 배치의 유의하게 더 낮은 pH (T₀에서 >0.4 단위) 때문에 LS04의 탈퓨린화 속도는 유의하게 더 높았다 (2.7％/개월). LS04의 닉 형성 비율은 그의 탈퓨린화 속도보다 약간 더 낮았다 (2.4％/개월).

+5℃에서, 모든 용액의 pH는 시간이 지남에 따라 안정하게 유지되었고, 탈퓨린화 및 닉 형성 정도는 매우 낮았다 (200일 후 0.5％ 미만; 도 6B).

본 연구는 플라스미드 DNA NV1FGF의 안정성 프로필은 매우 낮은 탈퓨린화 및 닉 형성 비율을 가지면서 본 발명의 제제 내에서 +5℃ 및 +25℃에서 시간이 지남에 따라 매우 안정함을 증명하였다.

본원 명세서는 본원 명세서에서 언급된 참고 문헌의 개시 내용에 비추어 이해되어야 한다. 본원 명세서 내의 실시태양은 본 발명의 실시태양의 예를 제공하는 것으로서, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 생각되지 않아야 한다. 당업자는 많은 다른 실시태양이 본 발명에 포함됨을 쉽게 이해할 것이다. 본원에 언급된 모든 간행물 및 특허는 그 전부가 참고로 포함된다. 참고로 포함되는 물질이본원 명세서와 모순되거나 일치하지 않는 정도까지, 본원 명세서는 상기 임의의 물질을 대체할 것이다. 본원에서 임의의 참고 문헌의 인용은 상기 참고 문헌이 본 발명에 대한 선행 기술임을 인정하는 것은 아니다.

달리 나타내지 않으면, 청구의 범위를 포함하여 본원 명세서에 사용된 성분의 양, 반응 조건 등을 표현하는 모든 숫자는 모든 경우에 용어 "약"에 의해 변경되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 그와 반대되는 의미로 나타내지 않는 한, 숫자 파라미터는 근사치이고, 본 발명에 의해 달성하고자 하는 요구되는 특성에 따라 상이할 수 있다. 적어도, 청구 범위에 대한 균등론 적용을 제한하고자 하는 것이 아니라, 각각의 숫자 파라미터는 유의한 숫자 및 통상적인 반올림 방식에 비추어 파악되어야 한다.

달리 나타내지 않으면, 일련의 성분 앞에 사용되는 용어 "적어도"는 관련되는 모든 성분을 의미하는 것임을 이해해야 한다. 당업자는 단지 통상적인 실험을 통해 본원에 기재된 본 발명의 구체적인 실시태양에 대한 많은 동등물을 인식하고 확인할 수 있을 것이다. 상기 동등물은 하기 청구의 범위에 포함되는 것이다.

당업자는 본원에서 언급되는 임의의 참고문헌 또는 문헌의 내용을 참고로 할 수 있고, 각각의 참고문헌 또는 문헌은 그 전부가 본원에 참고로 포함된다. 그러나, 본원에서 언급되는 참고문헌 또는 문헌의 어떠한 내용도 본원에 구체적으로 규정된 임의의 용어의 의미 또는 개념을 변경하지 않을 것이다. 참고문헌 및 문헌 및 당업자가 알 수 있는 지식을 통해 본원에 기재된 구체적인 실시태양을 변경 및 변형할 수 있을 것이다. 본원에 제시된 실시예 및 구체적인 실시태양은 본 발명의 범위 또는 정도를 제한하는 것으로서 간주되지 않아야 한다.

SEQUENCE LISTING <110> CENTELION <120> STABLE LIQUID FORMULATIONS OF PLASMID DNA <130> GC03001B-PCT <150> PCT/EP2004/011437 <151> 2004-09-17 <150> PCT/EP2005/005213 <151> 2005-04-19 <160> 34 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 1 gaggcttctt cttcttcttc ttctt 25 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 2 aagggaggga ggagaggaa 19 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 3 aaggagagga gggagggaa 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 4 ttggtgtggt gggtgggtt 19 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 5 cttcccgaag ggagaaagg 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 6 gaagggcttc cctctttcc 19 <210> 7 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 7 gaaaaaggaa gag 13 <210> 8 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 8 agaaaaaaag ga 12 <210> 9 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 9 tctttttttc ct 12 <210> 10 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 10 aagaaaaaaa agaa 14 <210> 11 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 11 ttcttttttt tctt 14 <210> 12 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 12 aaaaaaggga ataaggg 17 <210> 13 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 13 gatccgaaga agaagaagaa gaagaagaag aagaagaaga agaagaagaa gaagaagg 58 <210> 14 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 14 aattccttct tcttcttctt cttcttcttc ttcttcttct tcttcttctt cttcttcg 58 <210> 15 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 15 gaagaagaag aagaagaaga agaagaagaa gaagaagaag aagaagaaga a 51 <210> 16 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 16 tgaccggcag caaaatg 17 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 17 ccgaattctg gggaccaaag cagtttc 27 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 18 ccaagcttca ctgttcacga cgggtgt 27 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 5-methylcytosine <400> 19 gaggcttctt cttcttcttc ttctt 25 <210> 20 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 20 ggaggaggag gaggaggagg aggaggagga ggaggaggag gaggagga 48 <210> 21 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 21 gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga 50 <210> 22 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 22 gatccgagag agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag agagaggg 58 <210> 23 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 23 aattccctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctcg 58 <210> 24 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 24 gatccggagg aggaggagga ggaggaggag gaggaggagg aggaggagga ggaggagg 58 <210> 25 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 25 aattcctcct cctcctcctc ctcctcctcc tcctcctcct cctcctcctc ctcctccg 58 <210> 26 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 26 ggagaggagg aggaggagga ggaggaggag gaggaggagg aggaggagga 50 <210> 27 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 27 aatgcctcct cctcctcctc ctcct 25 <210> 28 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 28 agtgctctct ctctctctct ctctct 26 <210> 29 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 29 gatctgaaga agaagaagaa gaagaagaag aagaagaaga agaagaagaa gaagaactgc 60 agatct 66 <210> 30 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 30 gatcagatct gcagttcttc ttcttcttct tcttcttctt cttcttcttc ttcttcttct 60 tcttca 66 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 31 acagtcataa gtgcggcgac g 21 <210> 32 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 32 gaagaagagg aagaagaaga agaagaagaa ggaagagaa 39 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 33 gaagaagaag aagaagaaga a 21 <210> 34 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synethtic oligonucleotide <400> 34 agaaaaaaaa ga 12

Claims (93)

1. 플라스미드 DNA 및 버퍼 용액을 포함하고, 상기 버퍼가 조성물의 pH를 6 내지 9로 유지하기 위해 2 mM 미만의 농도로 존재하며, 수퍼코일형 형태의 플라스미드 DNA를 우세하게 포함하는 안정한 플라스미드 DNA 액체 보관 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 플라스미드 DNA가 약 4℃ 내지 25℃의 온도에서 안정한 것인 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 플라스미드 DNA가 수개월, 1년, 2년, 3년, 4년, 5년 또는 10년 이하 동안 안정한 것인 조성물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라스미드 DNA가 약 4℃에서 수개월, 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 10년, 15년 또는 20년 이하 동안 안정한 것인 조성물.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 수퍼코일형 또는 폐환형 플라스미드 DNA를 80％ 이상 포함하는 조성물.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 수퍼코일형 또는 폐환형 형태의 플라스미드 DNA를 약 80％, 약 85％, 약 90％, 약 95％, 또는 약 99％ 초과로 포함하는 조성물.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 탈퓨린화 및 닉 형성 (nicking) 비율이 1개월당 5％ 미만인 조성물.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 버퍼가 2 mM 이하의 농도로 존재하는 것인 조성물.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 버퍼가 2 mM 내지 1 mM의 농도로 존재하는 것인 조성물.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 버퍼가 1 mM 미만의 농도로 존재하는 것인 조성물.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 버퍼가 250 μM 내지 1 mM의 농도로 존재하는 것인 조성물.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 버퍼가 약 400 μM의 농도로 존재하는 것인 조성물.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 버퍼 용액이 상기 제제 또는 조성물의 pH를 6.2 내지 8.5 또는 상기 값 중 하나 또는 둘 모두의 약 +/- 0.3으로 유지하기 위한 농도로 존재하는 것인 조성물.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 버퍼 용액이 상기 제제 또는 조성물의 pH를 6.2 내지 8.5 또는 상기 값 중 하나 또는 둘 모두의 약 +/- 0.3으로 유지하기 위한 농도로 존재하고, 상기 플라스미드 DNA의 탈퓨린화 및 닉 형성 비율이 약 +4℃에서 보관시에 1년당 5％ 미만, 약 +25℃에서 보관시에 1개월당 5％ 미만인 조성물.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 버퍼 용액이 상기 제제 또는 조성물의 pH를 6.7 내지 8.0 또는 상기 값 중 하나 또는 둘 모두의 약 +/- 0.3으로 유지하기 위한 농도로 존재하는 것인 조성물.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 버퍼 용액이 상기 제제 또는 조성물의 pH를 6.7 내지 8.0 또는 상기 값 중 하나 또는 둘 모두의 약 +/- 0.3으로 유지하기 위한 농도로 존재하고, 상기 플라스미드 DNA의 탈퓨린화 및 닉 형성 비율이 약 +4℃에서 보관시에 1년당 2％ 미만, 약 +25℃에서 보관시에 1개월당 2％ 미만인 조성물.
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 버퍼 용액이 상기 제제 또는 조성물의 pH를 7.0 내지 7.5 또는 상기 값 중 하나 또는 둘 모두의 약 +/- 0.3으로 유지하기 위한 농도로 존재하는 것인 조성물.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 버퍼 용액이 상기 제제 또는 조성물의 pH를 7.0 내지 7.5 또는 상기 값 중 하나 또는 둘 모두의 약 +/- 0.3으로 유지하기 위한 농도로 존재하고, 상기 플라스미드 DNA의 탈퓨린화 및 닉 형성 비율이 약 +4℃에서 보관시에 1년당 1％ 미만, 약 +25℃에서 보관시에 1개월당 1％ 미만인 조성물.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 버퍼 용액이 (a) 트리스(Tris) 또는 리신, 및 강산 또는 약산 중에서 선택된 산; (b) 헤페스(Hepes) 및 강염기; 또는 (c) 포스페이트 버퍼를 포함하는 것인 조성물.
20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 버퍼 용액이 트리스/HCl, 리신/HCl, 트리스/말레산, 트리스/말산, 트리스/아세트산 또는 헤페스/수산화나트륨을 포함하는 것인 조성물.
21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 버퍼가 트리스인 조성물.
22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 염수 부형제를 추가로 포함하는 조성물.
23. 제22항에 있어서, 상기 염수 부형제가 NaCl인 조성물.
24. 제23항에 있어서, NaCl이 100 내지 200 mM, 바람직하게는 약 150 mM의 농도로 존재하는 것인 조성물.
25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라스미드 DNA가 고도로 정제되거나 제약 등급 플라스미드 DNA인 조성물.
26. 플라스미드 DNA 및 버퍼 용액을 포함하며, 상기 버퍼 용액이 플라스미드 DNA를 약 +4℃ 내지 +25℃의 온도에서 안정한 형태로 보존하기에 충분한 농도로 존재하는 것인 안정한 플라스미드 DNA 조성물.
27. 플라스미드 DNA 및 버퍼 용액을 포함하며, 상기 버퍼 용액이 약 +4℃의 온도에서 적어도 약 4년까지 수퍼코일형 플라스미드 DNA를 80％ 이상 갖도록 플라스미드 DNA를 보존하기에 충분한 농도로 존재하는 것인 안정한 플라스미드 DNA 조성물.
28. 플라스미드 DNA 및 버퍼 용액을 포함하며, 상기 버퍼 용액이 플라스미드 DNA를 약 +4℃ 내지 +25℃에서 보관시에 탈퓨린화 및 닉 형성 비율이 1년당 5％ 미만 내지 1개월당 5％ 미만이 되도록 보존하기에 충분한 농도로 존재하는 것인 안정한 플라스미드 DNA 조성물.
29. 플라스미드 DNA 및 버퍼 용액을 포함하며, 상기 버퍼 용액이 플라스미드 DNA를 +4℃ 내지 +25℃에서 연장된 기간 동안 수퍼코일형 플라스미드를 80％ 이상 갖도록 안정한 형태로 보존하기에 충분한 농도로 존재하는 것인 안정한 플라스미드 DNA 조성물.
30. 플라스미드 DNA 및 버퍼 용액을 포함하며, 상기 버퍼 용액이 플라스미드 DNA를 +4℃ 내지 +25℃에서 20개월 이하 동안 수퍼코일형 플라스미드 DNA를 80％ 이상갖도록 안정한 형태로 보존하기에 충분한 농도로 존재하는 것인 안정한 플라스미드 DNA 조성물.
31. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 염수 부형제를 추가로 포함하는 조성물.
32. 제31항에 있어서, 상기 염수 부형제가 100 내지 200 mM, 바람직하게는 약 150 mM의 농도로 존재하는 NaCl인 조성물.
33. 제26항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라스미드 DNA가 고도로 정제되거나 제약 등급 플라스미드 DNA인 것인 조성물.
34. 플라스미드 DNA의 정제된 샘플을 제조하는 단계;

    상기 플라스미드 DNA의 정제된 샘플을 생성되는 조성물의 pH를 6 내지 9로 유지하기에 충분한 2 mM 이하의 농도의 버퍼 용액과 합하는 단계; 및

    플라스미드 DNA를 보관하는 단계를 포함하는, 조성물 중에서 플라스미드 DNA를 안정한 형태로 보존하는 방법.
35. 제34항에 있어서, 상기 플라스미드 DNA가 수퍼코일형 플라스미드 DNA를 80％ 이상 함유하는 것인 방법.
36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 버퍼 용액이 상기 조성물의 pH를 6.2 내지 8.5 또는 상기 값 중 하나 또는 둘 모두의 약 +/- 0.3으로 유지하기 위한 농도로 존재하는 것인 방법.
37. 제36항에 있어서, 상기 플라스미드 DNA가 약 +4℃ 내지 +25℃의 온도에서 탈퓨린화 및 닉 형성 비율이 1개월당 5％ 미만 내지 1년당 5％ 미만으로 보존되는 것인 방법.
38. 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 버퍼 용액이 상기 조성물의 pH를 6.7 내지 8.0 또는 상기 값 중 하나 또는 둘 모두의 약 +/- 0.3으로 유지하기 위한 농도로 존재하는 것인 방법.
39. 제38항에 있어서, 상기 플라스미드 DNA가 약 +4℃ 내지 +25℃의 온도에서 탈퓨린화 및 닉 형성 비율이 1개월당 2％ 미만 내지 1년당 2％ 미만으로 보존되는 것인 방법.
40. 제34항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 버퍼 용액이 상기 조성물의 pH를 7.0 내지 7.5 또는 상기 값 중 하나 또는 둘 모두의 약 +/- 0.3으로 유지하기 위한 농도로 존재하는 것인 방법.
41. 제40항에 있어서, 상기 플라스미드 DNA가 약 +4℃ 내지 +25℃의 온도에서 탈퓨린화 및 닉 형성 비율이 1개월당 1％ 미만 내지 1년당 1％ 미만으로 보존되는 것인 방법.
42. 제34항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 버퍼를 2 mM 이하의 농도로 첨가하는 것인 방법.
43. 제42항에 있어서, 상기 버퍼를 2 mM 내지 1 mM의 농도로 첨가하는 것인 방법.
44. 제43항에 있어서, 상기 버퍼를 1 mM 미만의 농도로 첨가하는 것인 방법.
45. 제43항에 있어서, 상기 버퍼를 250 μM 내지 1 mM의 농도로 첨가하는 것인 방법.
46. 제45항에 있어서, 상기 버퍼를 약 400 μM의 농도로 첨가하는 것인 방법.
47. 제34항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염수 부형제를 플라스미드 DNA 및 버퍼 용액에 추가로 첨가하는 것인 방법.
48. 제47항에 있어서, 상기 염수 부형제가 NaCl인 방법.
49. 제48항에 있어서, NaCl이 100 내지 200 mM, 바람직하게는 약 150 mM의 농도로 첨가되는 것인 방법.
50. 제34항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 고도로 정제된 플라스미드 DNA 또는 제약 등급 플라스미드 DNA를 버퍼 용액과 합하는 것인 방법.
51. 플라스미드 DNA의 정제된 샘플을 제조하는 단계;

    상기 플라스미드 DNA의 정제된 샘플을 2 mM 미만의 농도로 존재하는 버퍼 용액과 합하는 단계; 및

    플라스미드 DNA 조성물을 약 25℃ 이하의 온도에서 보관하는 단계를 포함하는, 약 25℃ 이하의 온도에서 수개월 동안 액체 조성물 중 수퍼코일형 플라스미드 DNA를 80％ 이상 갖도록 플라스미드 DNA를 안정한 형태로 보존하는 방법.
52. 플라스미드 DNA의 정제된 샘플을 제조하는 단계;

    상기 플라스미드 DNA의 정제된 샘플을 1 내지 2 mM의 농도로 존재하는 버퍼 용액과 합하는 단계; 및

    플라스미드 DNA 조성물을 약 25℃ 이하의 온도에서 보관하는 단계를 포함하는, 약 25℃ 이하의 온도에서 수개월 동안 액체 조성물 중 수퍼코일형 플라스미드 DNA를 80％ 이상 갖도록 플라스미드 DNA를 안정한 형태로 보존하는 방법.
53. 플라스미드 DNA의 정제된 샘플을 제조하는 단계;

    상기 플라스미드 DNA의 정제된 샘플을 1 mM 이하의 농도로 존재하는 버퍼 용액과 합하는 단계; 및

    플라스미드 DNA 조성물을 약 25℃ 이하의 온도에서 보관하는 단계를 포함하는, 약 25℃ 이하의 온도에서 수개월 동안 액체 조성물 중 수퍼코일형 플라스미드 DNA를 80％ 이상 갖도록 플라스미드 DNA를 안정한 형태로 보존하는 방법.
54. 플라스미드 DNA의 정제된 샘플을 제조하는 단계;

    상기 플라스미드 DNA의 정제된 샘플을 약 250 μM 내지 1 mM의 농도로 존재하는 버퍼 용액과 합하는 단계; 및

    플라스미드 DNA 조성물을 약 25℃ 이하의 온도에서 보관하는 단계를 포함하는, 약 25℃ 이하의 온도에서 수개월 동안 액체 조성물 중 수퍼코일형 플라스미드 DNA를 80％ 이상 갖도록 플라스미드 DNA를 안정한 형태로 보존하는 방법.
55. 제51항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라스미드 DNA가 약 +4℃ 내지 +25℃의 온도에서 탈퓨린화 및 닉 형성 비율이 1개월당 5％ 미만 내지 1년당 5％ 미만으로 보존되는 것인 방법.
56. 제51항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 염수 부형제를 플라스미드 DNA 조성물에 추가로 첨가하는 것인 방법.
57. 제56항에 있어서, 상기 염수 부형제가 NaCl인 방법.
58. 제57항에 있어서, NaCl이 100 내지 200 mM, 바람직하게는 약 150 mM의 농도로 존재하는 것인 방법.
59. 제34항 내지 제58항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 얻은 안정한 플라스미드 DNA 조성물.
60. 제59항에 있어서, 상기 플라스미드 DNA가 고도로 정제되거나 제약 등급의 것인 안정한 플라스미드 DNA 조성물.
61. - (a) 세포 현탁액과 세포를 용해시키는 용액을 신속하게 혼합하기 위해 난류 수단을 통해 세포를 유동시키고; (b) 실질적인 진탕 없이 (a)에서 형성된 혼합물의 인큐베이션을 허용하기 위해 층류 수단을 통해 세포를 유동시키고, 여기서 (a)에서 형성된 혼합물은 난류 수단으로부터 층류 수단으로 유동시키고, (c) 임의로, 플라스미드 DNA를 세포로부터 방출시키기 위해 (b)에서 인큐베이션된 혼합물을 층류 수단으로부터 용해 용액을 중화시키는 제2 용액을 첨가하기 위한 수단으로 유동시키는 것을 추가로 포함하는, 세포의 용해 단계;

    - 방출된 플라스미드 DNA를 정제하기 위해 크로마토그래피를 수행하는 한 단계;

    - 상기 정제된 플라스미드 DNA를 생성되는 조성물의 pH를 6 내지 9로 유지하기에 충분한 2 mM 이하의 농도의 버퍼 용액과 합하는 단계, 및

    - 약 25℃ 이하의 온도에서 플라스미드 DNA 조성물을 보관하는 단계

    를 포함하는, 약 25℃ 이하의 온도에서 안정한 플라스미드 DNA 조성물의 제조 방 법.
62. - (a) 세포 현탁액과 세포를 용해시키는 용액을 신속하게 혼합하기 위해 난류 수단을 통해 세포를 유동시키고; (b) 실질적인 진탕 없이 (a)에서 형성된 혼합물의 인큐베이션을 허용하기 위해 층류 수단을 통해 세포를 유동시키고, 여기서 (a)에서 형성된 혼합물은 난류 수단으로부터 층류 수단으로 유동시키고, (c) 임의로, 플라스미드 DNA를 세포로부터 방출시키기 위해 (b)에서 인큐베이션된 혼합물을 층류 수단으로부터 용해 용액을 중화시키는 제2 용액을 첨가하기 위한 수단으로 유동시키는 것을 추가로 포함하는, 세포의 용해 단계;

    - 방출된 플라스미드 DNA를 정제하기 위해 크로마토그래피를 수행하는 한 단계;

    - 상기 정제된 플라스미드 DNA를 생성되는 조성물의 pH를 6.2 내지 8.5 또는 상기 값 중 하나 또는 둘 모두의 약 +/- 0.3으로 유지하기에 충분한 2 mM 이하의 농도의 버퍼 용액과 합하는 단계, 및

    - 약 25℃ 이하의 온도에서 플라스미드 DNA 조성물을 보관하는 단계

    를 포함하는, 약 25℃ 이하의 온도에서 안정한 플라스미드 DNA 조성물의 제조 방법.
63. - (a) 세포 현탁액과 세포를 용해시키는 용액을 신속하게 혼합하기 위해 난류 수단을 통해 세포를 유동시키고; (b) 실질적인 진탕 없이 (a)에서 형성된 혼합 물의 인큐베이션을 허용하기 위해 층류 수단을 통해 세포를 유동시키고, 여기서 (a)에서 형성된 혼합물은 난류 수단으로부터 층류 수단으로 유동시키고, (c) 임의로, 플라스미드 DNA를 세포로부터 방출시키기 위해 (b)에서 인큐베이션된 혼합물을 층류 수단으로부터 용해 용액을 중화시키는 제2 용액을 첨가하기 위한 수단으로 유동시키는 것을 추가로 포함하는, 세포의 용해 단계;

    - 방출된 플라스미드 DNA를 정제하기 위해 크로마토그래피를 수행하는 한 단계;

    - 상기 정제된 플라스미드 DNA를 생성되는 조성물의 pH를 6.7 내지 8.0 또는 상기 값 중 하나 또는 둘 모두의 약 +/- 0.3으로 유지하기에 충분한 2 mM 이하의 농도의 버퍼 용액과 합하는 단계, 및

    - 약 25℃ 이하의 온도에서 플라스미드 DNA 조성물을 보관하는 단계

    를 포함하는, 약 25℃ 이하의 온도에서 안정한 플라스미드 DNA 조성물의 제조 방법.
64. - (a) 세포 현탁액과 세포를 용해시키는 용액을 신속하게 혼합하기 위해 난류 수단을 통해 세포를 유동시키고; (b) 실질적인 진탕 없이 (a)에서 형성된 혼합물의 인큐베이션을 허용하기 위해 층류 수단을 통해 세포를 유동시키고, 여기서 (a)에서 형성된 혼합물은 난류 수단으로부터 층류 수단으로 유동시키고, (c) 임의로, 플라스미드 DNA를 세포로부터 방출시키기 위해 (b)에서 인큐베이션된 혼합물을 층류 수단으로부터 용해 용액을 중화시키는 제2 용액을 첨가하기 위한 수단으로 유 동시키는 것을 추가로 포함하는, 세포의 용해 단계;

    - 방출된 플라스미드 DNA를 정제하기 위해 크로마토그래피를 수행하는 한 단계;

    - 상기 정제된 플라스미드 DNA를 생성되는 조성물의 pH를 7.0 내지 7.5 또는 상기 값 중 하나 또는 둘 모두의 약 +/- 0.3으로 유지하기에 충분한 2 mM 이하의 농도의 버퍼 용액과 합하는 단계, 및

    - 약 25℃ 이하의 온도에서 플라스미드 DNA 조성물을 보관하는 단계

    를 포함하는, 약 25℃ 이하의 온도에서 안정한 플라스미드 DNA 조성물의 제조 방법.
65. 제61항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 버퍼 용액이 2 mM 미만의 농도로 존재하는 것인 방법.
66. 제61항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 버퍼 용액이 약 1 내지 2 mM의 농도로 존재하는 것인 방법.
67. 제61항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 버퍼 용액을 플라스미드 DNA 조성물에 약 250 μM 내지 1 mM 미만의 농도에 도달하도록 첨가하는 것인 방법.
68. - (a) 세포 현탁액과 세포를 용해시키는 용액을 신속하게 혼합하기 위해 난류 수단을 통해 세포를 유동시키고; (b) 실질적인 진탕 없이 (a)에서 형성된 혼합물의 인큐베이션을 허용하기 위해 층류 수단을 통해 세포를 유동시키고, 여기서 (a)에서 형성된 혼합물은 난류 수단으로부터 층류 수단으로 유동시키고, (c) 임의로, 플라스미드 DNA를 세포로부터 방출시키기 위해 (b)에서 인큐베이션된 혼합물을 층류 수단으로부터 용해 용액을 중화시키는 제2 용액을 첨가하기 위한 수단으로 유동시키는 것을 추가로 포함하는, 세포의 용해 단계;

    - 방출된 플라스미드 DNA를 정제하기 위해 크로마토그래피를 수행하는 한 단계;

    - 상기 정제된 플라스미드 DNA를 2 mM 미만, 또는 1 mM 미만, 또는 250 μM 내지 1 mM, 바람직하게는 400 μM의 농도로 존재하는 버퍼 용액과 합하는 단계, 및

    - 약 25℃ 이하의 온도에서 플라스미드 DNA 조성물을 보관하는 단계

    를 포함하는, 약 25℃ 이하의 온도에서 안정한 플라스미드 DNA 조성물의 제조 방법.
69. 제61항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 염수 부형제를 플라스미드 DNA 조성물에 추가로 첨가하는 것인 방법.
70. 제69항에 있어서, 상기 염수 부형제가 NaCl인 방법.
71. 제70항에 있어서, NaCl이 100 내지 200 mM, 바람직하게는 약 150 mM의 농도로 존재하는 것인 방법.
72. 제61항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용해 용액이 알칼리, 세제, 유기 용매 및 효소, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된 용해제를 함유하는 용액인 방법.
73. 제61항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라스미드 DNA가 음이온 교환 크로마토그래피, 삼중 친화도 크로마토그래피 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피를 포함하는 하나 이상의 크로마토그래피 단계를 통해 정제되는 것인 방법.
74. 제73항에 있어서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 단계가 플라스미드 DNA 정제를 위한 삼중 나선 크로마토그래피 단계와 조합되는 것인 방법.
75. 제74항에 있어서, 소수성 상호작용 크로마토그래피 단계를 추가로 포함하는 방법.
76. 제61항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라스미드 DNA가 음이온 교환 크로마토그래피, 삼중 친화도 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 순서로 실시되는 3단계 크로마토그래피 과정을 통해 정제되는 것인 방법.
77. 제61항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 크로마토그래피 수행 전에 용해물 여과를 실시하는 것인 방법.
78. 제61항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 크로마토그래피 수행 전에 응집체 제거를 실시하는 것인 방법.
79. 제61항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 마지막 크로마토그래피 단계 후에 투석여과 및/또는 버퍼 교환 단계를 실시하는 것인 방법.
80. 제61항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 선행하는 응집체 제거 단계를 용액을 그리드 필터 및 다층 (depth) 여과를 통해 통과시켜 수행하는 것인 방법.
81. 제61항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투석여과 단계가 적절한 염, 버퍼 및 pH 표적 값에 도달하기 위한 것인 방법.
82. 제61항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투석여과 단계가

    마지막 크로마토그래피 단계로부터 용액을 수거하고;

    트리스/NaCl 버퍼에 대해 제1 투석여과 단계를 수행하고;

    최종 버퍼 농도를 조절하고 최종 플라스미드 DNA 제제의 pH를 안정화시키기 에 적합한 조건 하에서 염수에 대해 제2 투석여과 단계를 수행하는 것을 포함하는 것인 방법.
83. 제61항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 플라스미드 DNA를 멸균 여과하고, 제제화하여 바이알에 충전하는 것을 추가로 포함하는 방법.
84. 제83항에 따른 방법에 의해 얻은 고도로 정제된 플라스미드 DNA의 바이알.
85. 제84항에 있어서, 정제된 플라스미드 DNA가 FGF-1 유전자를 코딩하는 발현 카세트를 갖는 pCOR 플라스미드인 NV1FGF로 명명된 플라스미드인 바이알.
86. 제85항에 있어서, 말초 동맥 질환 (PAOD 또는 PAD) 및 중증 사지 허혈 (CLI)을 포함하는 말초 사지 허혈의 치료에 사용하기 위한 바이알.
87. 제61항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 크로마토그래피 단계가 단백질, 변성된 게놈 DNA, RNA, 단백질, 올리고리보뉴클레오티드, 올리고-데옥시리보뉴클레오티드, 변성 플라스미드 DNA 및 지질다당류와 같은 불순물의 제거를 가능하게 하는 것인 방법.
88. 제61항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 크로마토그래피 단계를 폴리(알켄 글리콜), 알칸, 알켄, 알킨, 아렌, 또는 지지체에 소수성 특성을 부여하는 다른 분자로 유도체화된, 크로마토그래피 분리에 적합한 다공성, 초다공성 또는 비-다공성의 임의의 유기, 무기 또는 복합 물질인 고체 지지체 상에서 수행하는 것인 방법.
89. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라스미드 DNA가 치료적 및/또는 면역원 코딩 서열을 포함하는 것인 조성물.
90. 제89항에 있어서, 상기 치료적 유전자가 포유동물 유전자인 조성물.
91. 제89항에 있어서, DNA 백신으로서의 조성물.
92. 제89항 또는 제90항에 있어서, 플라스미드 기재 요법제, 예를 들어 유전자 요법제로서의 조성물.
93. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 요법제에 의한 인간 또는 동물 신체의 치료 방법에 사용하기 위한 조성물.

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