EA011554B1 - Стабильные жидкие композиции плазмидной днк - Google Patents

Abstract

Данное изобретение относится к стабильным жидким препаратам плазмидной ДНК, которая остается не деградированной от 4°C до комнатной температуры в течение длительных периодов времени, и, таким образом, они приемлемы для хранения плазмидной ДНК, применяемой для исследований, основанной на плазмидах терапии, как, например, ДНК-вакцина и средства генной терапии. Настоящее изобретение также относится к способу хранения плазмидной ДНК в стабильной форме во времени от 4°C до комнатной температуры. Настоящее изобретение также относится к жидким композициям стабильной плазмидной ДНК для применения в способе лечения человеческого организма или организма животного посредством основанной на плазмидах терапии, как, например, ДНК-вакцинация или генная терапия.

Description

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к стабильным жидким композициям плазмидной ДНК, где плазмида остается не деградировавшей при температуре от 4°С до комнатной температуры в течение длительных периодов времени. Таким образом, подобные композиции пригодны для хранения плазмидной ДНК, применяемой в исследованиях или основанной на плазмидах терапии, как, например, ДНК-вакцины или средства генной терапии.

Предпосылки изобретения

Открытия в молекулярной биологии отчетливо показывают, что основанная на плазмидах терапия, конкретно области ДНК-вакцин и генной терапии, может обеспечить эффективные пути лечения заболеваний. Одним перспективным способом безопасной и эффективной доставки нормального гена в человеческие клетки является доставка посредством плазмидной ДНК. Плазмидная ДНК представляет собой ковалентно замкнутое кольцо (ссс) или сверхспирализованную форму бактериальной ДНК, в которую можно вставлять представляющую интерес последовательность ДНК. Примеры представляющих интерес последовательностей ДНК, которые можно вводить в клетки млекопитающих, включают в себя экзогенные гены, функциональные гены или мутантные гены, антисмысловые последовательности, последовательности иРНК или дцРНК, рибозимы и последовательности для применений, например, в ДНКвакцинах против вирусной инфекции или при лечении сердечно-сосудистых заболеваний, связанных с ангиогенезом заболеваний или злокачественной опухоли. Однажды доставленная в человеческую клетку плазмидная ДНК начинает реплицироваться и синтезировать копии представляющей интерес последовательности ДНК. Таким образом, перспектива применения плазмидных ДНК в качестве активных фармацевтических ингредиентов (ΑΡΙ) достаточна для лечения ряда болезненных состояний, но хранение представляет собой существенное препятствие для данного способа. В действительности, если плазмидную ДНК хранят в неблагоприятных условиях, ее структура деградирует, и суперскрученная (ссс) топология/структура молекулы может превращаться в неактивные формы (открытую кольцевую и линейную) из-за окислительных повреждений. Образованные в результате реакций типа реакции Фентона окислители, например перекись водорода, супероксид и гидроксильные радикалы, отвечают за окислительную деградацию ДНК. Конкретно, свободно-радикальные окислительные пути и β-отщепление представляют собой основные источники деградации ДНК для высокоочищенной плазмидной ДНК в водных препаратах, вызывающие одноцепочечные разрывы или ник-разрывы ДНК и последующие превращения ковалентно-замкнутого кольца (ссс) двухцепочечной суперскрученной ДНК в релаксированную кольцевую или открытую кольцевую и линейную формы.

Плазмидную ДНК обычно формулируют в фосфатном или Тп8-буферном водных растворах, где фосфат или Тгщ-буферный раствор представлен в концентрации приблизительно от 10 мМ. Однако такие композиции, как правило, подвержены происходящим при хранении в водном растворе процессам деградации. Данные растворы плазмидной ДНК имеют очень низкую стабильность приблизительно при 4 и 25°С. Конкретно, их отношения депуринизации очень высоки от 4°С до комнатной температуры (КТ). Процессы депуринизации обычно контролируют посредством измерений содержания суперскрученной, открытой кольцевой и линейной ДНК, а также отношения депуринизации, т.е. накопления апуринизированных сайтов, и окисления, т.е. образования 8-гидроксигуанина с течением времени.

Таким образом, длительное хранение фармацевтического продукта плазмидной ДНК приводит ко многим влияющим на стабильность ДНК реакциям деградации. Для преодоления данных проблем плазмидные ДНК обычно лиофилизируют для хранения при температурах, вплоть до комнатной температуры, но, следовательно, требующих дополнительных манипуляционных стадий переработки рецептур и, кроме того, создающих дополнительную угрозу загрязнений и/или деградации.

Так как любой происходящий в плазмидной ДНК разрыв цепи влияет на ее качество и функционирование, необходимо рассмотреть происходящие во время длительного хранения и манипуляций с плазмидной ДНК повреждения и предоставить композицию для хранения, обеспечивающую устойчивость плазмидной ДНК при длительном хранении и безопасные манипуляции при температурах, находящихся в интервале от 4°С до комнатной температуры.

Таким образом, авторы обнаружили новые жидкие композиции для плазмидной ДНК, являющиеся стабильными и устойчивыми в течение длительного периода времени к широкому диапазону температур, например вплоть до комнатной температуры, таким образом облегчая хранение, транспортировку, манипуляции и распространение основанного на ДНК лекарственного средства, ДНК-вакцин или средства для генной терапии до безопасных введений субъектам. Конкретно, такие жидкие композиции приемлемы для высокоочищенной плазмидной ДНК, которую можно применять для исследований и для основанной на плазмидах терапии, например в генотерапии и ДНК-вакцинах.

Сущность изобретения

Первый объект настоящего изобретения представляет собой композицию, сохраняющую плазмидную ДНК в жидком препарате в течение длительных периодов времени при температурах до 25°С.

Таким образом, настоящее изобретение относится к жидкой композиции, сохраняющей стабильной плазмидную ДНК, содержащей плазмидную ДНК и буферный раствор в концентрации до 5, 4, или до 3, или даже до 2 мМ, достаточной для поддержания рН композиции плазмидной ДНК между 6 и 9, таким

- 1 011554 образом позволяя хранить плазмидную ДНК с содержанием суперскрученной формы по меньшей мере 80% и содержанием подверженных депуринизации и однонитевым разрывам плазмид менее 20%.

Настоящее изобретение также относится к жидкой композиции, сохраняющей стабильной плазмидную ДНК, содержащей плазмидную ДНК и буферный раствор в концентрации до 2 мМ, достаточной для поддержания рН указанного препарата или композиции между 6,2 и 8,5 и/или приблизительно +/-0,3 от одного или обоих из этих значений, тем самым сохраняя плазмидную ДНК с отношениями депуринизации и однонитевых разрывов менее 5% в год при хранении приблизительно при 4°С и менее 5% в месяц при хранении приблизительно при 25°С.

Настоящее изобретение также относится к жидкой композиции, сохраняющей стабильной плазмидную ДНК, содержащей плазмидную ДНК и буферный раствор в концентрации до 2 мМ, достаточной для поддержания рН указанного препарата или композиции между 6,7 и 8,0 и/или приблизительно +/-0,3 от одного или обоих из этих значений, тем самым сохраняя плазмидную ДНК с отношениями депуринизации и однонитевых разрывов менее 2% в год при хранении приблизительно при 4°С и менее 2% в месяц при хранении приблизительно при 25°С.

Кроме того, настоящее изобретение относится к жидкой композиции, сохраняющей стабильной плазмидную ДНК, содержащей плазмидную ДНК и буферный раствор в концентрации до 2 мМ, достаточной для поддержания рН указанного препарата или композиции между 7,0 и 7,5 приблизительно +/-0,3, тем самым обеспечивая сохранение плазмидной ДНК с отношениями депуринизации и однонитевых разрывов менее 1% в год при хранении приблизительно при 4°С и менее 1% в месяц при хранении приблизительно при 25°С.

Еще одним объектом настоящего изобретения является способ хранения плазмидной ДНК в стабильной форме в жидкой композиции для хранения, включающий в себя:

(ί) получение очищенного образца плазмидной ДНК;

(ίί) смешивание указанного очищенного образца плазмидной ДНК и буферного раствора в концентрации до 2 мМ, необходимой для поддержания рН полученной композиции между 6 и 9; и (ίίί) хранение плазмидной ДНК.

Способ по настоящему изобретению предусматривает способ хранения высококачественной плазмидной ДНК с содержанием по меньшей мере 80% суперскрученной плазмидной ДНК.

Настоящее изобретение относится к способу хранения плазмидной ДНК в стабильной форме в жидкой композиции для хранения при температурах приблизительно от 4 до 25°С с отношениями депуринизации и однонитевых разрывов менее 5% в месяц и менее 5% в год, включающему:

(ί) получение очищенного образца плазмидной ДНК;

(ίί) смешивание указанного очищенного образца плазмидной ДНК и буферного раствора в концентрации до 2 мМ, необходимой для поддержания рН полученной композиции между 6,2 и 8,5 и/или приблизительно +/-0,3 от одного или обоих из этих значений; и (ίίί) хранение плазмидной ДНК при выбранной температуре.

Настоящее изобретение также относится к способу хранения плазмидной ДНК в стабильной форме в жидкой композиции для хранения при температурах приблизительно от 4 до 25°С с отношениями депуринизации и однонитевых разрывов менее 2% в месяц и менее 2% в год, включающему:

(ί) получение очищенного образца плазмидной ДНК;

(ίί) смешивание указанного очищенного образца плазмидной ДНК и буферного раствора в концентрации до 2 мМ, необходимой для поддержания рН полученной композиции между 6,7 и 8 или приблизительно +/-0,3 от одного или обоих из этих значений; и (ίίί) хранение плазмидной ДНК при выбранной температуре.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу хранения плазмидной ДНК в стабильной форме в жидкой композиции при температурах приблизительно от 4 до 25°С с отношениями депуринизации и однонитевых разрывов менее 1% в месяц и менее 1% в год, включающему:

(ί) получение очищенного образца плазмидной ДНК;

(ίί) смешивание указанного очищенного образца плазмидной ДНК и буферного раствора в концентрации до 2 мМ, необходимой для поддержания рН полученной композиции между 7,0 и 7,5 и/или приблизительно +/-0,3 от одного или обоих из этих значений; и (ίίί) хранение плазмидной ДНК при выбранной температуре.

Соответственно, композиция плазмидной ДНК содержит буферный раствор в концентрации менее 5, или менее 4, или менее 3 мМ. Предпочтительно композиция для хранения стабильной плазмидной ДНК содержит буферный раствор в установленном количестве или в очень слабой концентрации до 2 мМ, а более предпочтительно между 1 и 2 мМ. Наиболее предпочтительно буферный раствор присутствует в концентрации менее 1 мМ, между 250 мкМ и 1 мМ или между 400 мкМ и 1 мМ, для поддержания рН указанного препарата или композиции между 6 и 9 или между 6,2 и 8,5, предпочтительно между 6,7 и 8 и наиболее предпочтительно между 7 и 7,5 и/или приблизительно +/-0,3 от любого одного или нескольких из этих значений.

Стабильная композиция по настоящему изобретению особенно пригодна для хранения высокоочищенной плазмидной ДНК с очень низкими количествами загрязняющей хромосомной ДНК, РНК, белка и

- 2 011554 эндотоксинов. Такие высокоочищенные плазмидные ДНК имеют менее приблизительно 0,01% загрязняющей РНК клетки-хозяина и/или менее приблизительно 0,01% загрязняющей геномной ДНК клеткихозяина. Предпочтительные высокоочищенные плазмидные ДНК имеют менее приблизительно 0,001% загрязняющей РНК клетки-хозяина, и/или менее приблизительно 0,001% загрязняющего белка клеткихозяина, и/или менее приблизительно 0,001% загрязняющей геномной ДНК клетки-хозяина. Наиболее предпочтительные высокоочищенные плазмидные ДНК имеют менее приблизительно 0,0001% загрязняющей РНК клетки-хозяина, и/или менее приблизительно 0,0001% загрязняющего белка клеткихозяина, и/или менее приблизительно 0,0001% загрязняющей геномной ДНК клетки-хозяина.

Еще одним объектом настоящего изобретения является способ получения жидкой композиции стабильной плазмидной ДНК для хранения при температуре приблизительно до 25°С, включающий:

(1) стадию лизиса клеток, состоящую из прохождения клеток через (a) турбулентный поток для быстрого перемешивания клеточной суспензии с лизирующим клетки раствором и (b) ламинарный поток для обеспечения инкубации образованной смеси (а) без существенной активации, где образованная смесь (а) проходит из турбулентного потока в ламинарный поток и, кроме того, необязательно включает в себя (c) добавление нейтрализующего лизирующий раствор второго раствора, инкубированной в (Ь) ламинарном потоке во втором растворе смеси для выделения плазмидных ДНК из клеток;

(2) одну стадию хроматографии для очистки выделенной таким образом плазмидной ДНК;

(3) перемешивание указанной плазмидной ДНК и буферного раствора в концентрации до 2 мМ, достаточной для поддержания рН полученной композиции между 6 и 9; и (4) хранение композиции плазмидной ДНК при температуре приблизительно до 25°С.

Настоящее изобретение также относится к способу получения жидкого препарата для хранения стабильной плазмидной ДНК при температуре приблизительно до 25°С, включающему:

(1) стадию лизиса клеток, состоящую из прохождения клеток через (a) устройство для турбулентного потока для быстрого перемешивания клеточной суспензии с лизирующим клетки раствором и (b) ламинарный поток для обеспечения инкубации образованной смеси (а) без существенного перемешивания, где образованная в (а) смесь переходит из турбулентного потока в ламинарный поток и, кроме того, необязательно включает (c) устройство для добавления нейтрализующего лизирующий раствор второго раствора, инкубированная в (Ь) смесь течет из устройства для ламинарного потока в устройство для добавления второго раствора для выделения плазмидных ДНК из клеток;

(2) выполнение стадии хроматографии для очистки выделенной таким образом плазмидной ДНК;

(3) выполнение стадии диафильтрации и/или замены буфера;

(4) перемешивание указанной очищенной плазмидной ДНК и буферного раствора в концентрации до 2 мМ, достаточной для поддержания рН полученной композиции между 6 и 9; и (5) заполнение ампул жидкой композицией плазмидной ДНК и хранение композиции плазмидной ДНК при температуре приблизительно до 25°С.

Способом настоящего изобретения буферный раствор добавляют к композиции плазмидной ДНК в концентрации менее 5, или менее 4, или менее 3 мМ. Предпочтительно способ включает в себя добавление установленных количеств буферного раствора или добавление буферного раствора в очень слабой концентрации до 2 мМ и более предпочтительно между 1 и 2 мМ. Наиболее предпочтительно буферный раствор присутствует в концентрации менее 1 мМ, между 250 мкМ и 1 мМ или между 400 мкМ и 1 мМ, для поддержания рН указанного препарата или композиции между 6 и 9 или между 6,2 и 8,5, предпочтительно между 6,7 и 8 и наиболее предпочтительно между 7 и 7,5 и/или приблизительно +/-0,3 от любого одного или нескольких из этих значений.

Дополнительный объект настоящего изобретения представляют собой флаконы (ампулы), содержащие в качестве активного фармацевтического ингредиента жидкий препарат стабильной плазмидной ДНК, для применения в исследованиях или в основанной на плазмидах терапии, как, например, генная терапия или ДНК-вакцина.

Еще одним объектом настоящего изобретения является ампула, содержащая очищенную плазмидную ДНК, представляющую собой плазмиду, обозначенную как ЫУ1ЕСЕ, представляющую собой плазмиду рСОК, несущую экспрессирующий кластер, кодирующий ген ЕСЕ-1, пригодный для лечения ишемии периферических конечностей, включающей в себя заболевание периферических артерий (ΡΆΟΌ или ΡΆΌ) и критическую ишемию конечности (СЬ1).

Дополнительные объекты и преимущества изобретения указаны в следующем далее разделе описания и частично становятся очевидными из описания или могут быть изучены при применении изобретения. Объекты и преимущества изобретения понимают и реализуют при помощи подробно перечисленных в прилагаемой формуле изобретения элементов и сочетаний.

- 3 011554

Следует понимать, что в рамках заявленного изложенное выше общее описание и следующее далее подробное описание являются лишь иллюстративными и поясняющими и не ограничивают объем изобретения. Дополняющие включенные и составляющие часть данного описания рисунки иллюстрируют некоторые варианты осуществления изобретения и вместе с описанием помогают объяснить принципы изобретения.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 представляет собой схему устройства, которое можно применять для лизиса клеток в непрерывном режиме по изобретению.

Фиг. 2 представляет собой схему смесителя М1 в устройстве для непрерывного клеточного лизиса.

Фиг. 3 представляет собой таблицу, в которой сравнивают выходы очистки в зависимости от загрязняющих гДНК, РНК, белков, эндотоксина с применением одной стадии анионообменной хроматографии (АЕС) или двухшагового способа со стадией анионообменной хроматографии в сочетании с трехспиральной аффинной хроматографией (ТНАС) и трехшагового способа, включающего в себя стадию анионообменной хроматографии, стадию трехспиральной аффинной хроматографии и стадию хроматографии гидрофобного взаимодействия (Н1С); НО - означает «не обнаружено» (низкая чувствительность аналитических способов).

Фиг. 4 представляет собой таблицу, в которой сравнивают различные способы разделения и очистки плазмидной ДНК, как анионообменная хроматография (АЕС), хроматография на гидроксиапатите (НАС), хроматография гидрофобного взаимодействия (Н1С), хроматография с обращенными фазами (ВРС), эксклюзионная хроматография размеров (8ЕС), трехспиральная аффинная хроматография (ТНАС) отдельно или в сочетании, и способ по настоящему изобретению. Здесь представлены результаты в зависимости от качества очищенной плазмидной ДНК; НО - означает не обнаружено (низкая чувствительность аналитических способов).

Фиг. 5А и 5В представляют собой графики, на которых показаны отношения депуринизации и однонитевых разрывов (образование плазмидной формы разорванного кольца) хранящейся при 25 и 5°С в течение до 90 суток плазмидной ДНК.

Фиг. 6А и 6В представляют собой графики, на которых показаны отношения депуринизации и однонитевых разрывов (образование плазмидной формы разорванного кольца) хранящейся при 25 и 5°С в течение до 150 суток плазмидной ДНК.

Определения «Препарат или композиция плазмидной ДНК» обозначает композицию, содержащую необходимое количество плазмидной ДНК или препарат плазмидной ДНК, в котором присутствует необходимое количество для применения в исследованиях или основанной на плазмидах терапии, как, например генная терапия или ДНК-вакцина.

«Препарат для стабильного хранения плазмидной ДНК» обозначает препарат, который можно применять для хранения плазмидной ДНК в стабильной форме в течение длительных интервалов времени до применения, как, например, в исследованиях или основанной на плазмидах терапии. Срок хранения может составлять несколько месяцев, 1 год, 5, 10, 15 или до 20 лет при температурном интервале от 5 до 25°С (ВТ - комнатная температура).

Как правило, «препарат или композиция стабильной плазмидной ДНК» означает препарат плазмидной ДНК с относительным содержанием суперскрученной двухцепочечной ДНК, по меньшей мере 80%, которая находится в форме открытых кольцевых или/и линейных плазмид.

«Препарат стабильной плазмидной ДНК» в дальнейшем означает композицию, содержащую плазмидную ДНК с отношениями депуринизации и однонитевых разрывов (образование плазмидной открытой кольцевой формы) менее 5% в месяц при хранении при 25°С и менее 5% в год при хранении при 5°С. Предпочтительно препарат стабильной плазмидной ДНК в дальнейшем означает композицию, содержащую плазмидную ДНК с отношениями депуринизации и однонитевых разрывов (образование плазмидной открытой кольцевой формы) менее 2% в месяц при хранении при 25°С и менее 2% в год при хранении при 5°С. Более предпочтительно препарат стабильной плазмидной ДНК в дальнейшем означает композицию, содержащую плазмидную ДНК с отношениями депуринизации и однонитевых разрывов (образование плазмидной открытой кольцевой формы) менее 1% в месяц при хранении при 25°С и менее 1% в год при хранении при 5°С.

«Кислотный» означает связанный с кислотой или содержащий кислоту; обладающий рН менее 7.

«Щелочной» означает связанный со щелочью или содержащий щелочной металл или основание; обладающий рН более 7.

«Непрерывный» означает непрерывающийся, не имеет прерываний.

«Геномная ДНК (сокращенно гДНК)» обозначает полученную из хромосомы или встречающуюся в хромосоме ДНК.

«Ламинарный поток» означает тип тока в потоке раствора воды, в котором каждая частица движется в параллельном направлении каждой частице.

«Лизат» означает полученный в процессе клеточного лизиса материал. Термин «лизирование» относится к процессу разрыва клеточной стенки и/или клеточной мембраны клетки, находящейся в буфер

- 4 011554 ном растворе (т.е. клеточной суспензии), посредством химической обработки с применением содержащего лизирующий агент раствора. Лизирующие агенты включают, например, щелочи, детергенты, органические растворители и ферменты. По предпочтительному варианту осуществления лизис клеток выполняют для выделения интактных плазмид из клеток-хозяев.

«Нейтрализует», чтобы сделать (раствор) нейтральным, или является причиной (кислота или основание/щелочь) осуществления нейтрализации. Под этим термином авторы имеют в виду, что что-то, нейтрализующее раствор, доводит рН раствора до рН между 5 и 7 и предпочтительно приблизительно 7 или более предпочтительно ближе к 7, чем ранее.

«Ньютоновская жидкость» представляет собой жидкость, в которой напряжение сдвига пропорционально градиенту скорости и перпендикулярно плоскости сдвига. Константа пропорциональности известна как вязкость. Примеры ньютоновских жидкостей включают в себя жидкости и газы.

«Неньютоновская жидкость» представляет собой жидкость, в которой напряжение сдвига не пропорционально только градиенту скорости и перпендикулярно плоскости сдвига. Неньютоновские жидкости могут не обладать четко выраженной вязкостью. Неньютоновские жидкости включают в себя пластичные твердые тела, степенные жидкости, вязкоупругие жидкости (с вязкими и эластичными свойствами) и нестационарные вязкие жидкости.

«Плазмидная ДНК» означает небольшое клеточное включение, состоящее из не являющегося хромосомой кольца ДНК, которое может обладать способностью получения вставленного в него фрагмента неэндогенной ДНК. Как применяют здесь, плазмидная ДНК также может представлять собой любую форму плазмидной ДНК, как, например, урезанная, преобразованная или другая управляемая форма нехромосомной ДНК, включающая в себя, например, любую из форм, или любое сочетание форм кольцевой плазмидной ДНК с однонитевым разрывом, релаксированной кольцевой плазмидной ДНК, суперскрученной плазмидной ДНК, урезанной плазмидной ДНК, линеаризованной или линейной плазмидной ДНК и одноцепочечной плазмидной ДНК. Способы конструирования плазмид включают в себя способы, описанные у МашаШ с1 а1., Мо1еси1аг С1ошпд, А ЬаЬогаФгу Мапиа1, 26, Со 16 Брппд НатЬот ЬаЬогаФгу Ргс55 (1989). Для начального выделения плазмидной ДНК для более поздней обработки посредством некоторых аспектов изобретения можно применять хорошо известный в данной области протокол выделения плазмидной ДНК с «минипреп» (В1гпЬо1ш ап6 Оо1у, ЫисШс Ас16§ Кскеатсй 7: 1513 (1979)) и можно противопоставлять высокоочищенным образцам, полученным способами по изобретению. Предпочтительно форма плазмидной ДНК является или, по меньшей мере, представляет собой после подготовки способом очистки по изобретению в значительной степени замкнутую кольцевую форму плазмидной ДНК или приблизительно 80, 85, 90, 95 или приблизительно более 99% замкнутую кольцевую форму плазмидной ДНК. Альтернативно, в некоторых терапевтических способах может быть предпочтительна суперскрученная ковалентно замкнутая форма плазмидной ДНК (ссс), где она может являться более эффективной, чем открытая кольцевая, линейная или мультимерная формы. Следовательно, плазмидная ДНК фармацевтического качества может представлять собой выделенную или отделенную от одной или нескольких форм плазмиду и в основном содержать одну или несколько желаемых форм.

В целях настоящего изобретения термин поток относится к прохождению жидкости через смеситель с конкретной скоростью потока (например, литры в минуту), обычно под действием насоса. Следует отметить, что как полагают, скорость потока через смеситель влияет на эффективность лизиса, преципитации и смешивания.

Термины ДНК с «однонитевым разрывом» и «релаксированная» ДНК обозначают не являющуюся суперскрученной ДНК.

«Суперскрученная» ДНК представляет собой термин, хорошо понятый в данной области в описании конкретной, отдельной формы плазмидной ДНК. В данной области также известны другие формы плазмидной ДНК.

«Загрязняющая примесь» представляет собой любое вещество, от которого желательно отделить или выделить ДНК. Загрязняющие примеси в качестве неограничивающих примеров включают в себя белки клетки-хозяина, эндотоксин, ДНК клетки-хозяина, как, например, хромосомная ДНК или геномная ДНК и/или РНК клетки-хозяина. Понятно, что то, что является или может рассматриваться как загрязняющая примесь, может зависеть от контекста, в котором применяют способы по изобретению. «Загрязняющая примесь» может представлять собой или может не являться полученной из клетки-хозяина, т.е. примесь может являться или не являться примесью клетки-хозяина.

«Выделение» или «очистка» исходного компонента (как, например ДНК) обозначает обогащение исходного компонента от других компонентов, с которыми исходно обнаружен первый компонент. Здесь представлены объемы желаемой и/или получаемой очистки.

Термины «практически свободный и высокоочищенный» обозначают приблизительно 95%, а предпочтительно более чем на 98,99% чистый или свободный от загрязняющих веществ или содержащий менее 5%, а предпочтительно менее 1-2% загрязняющих веществ.

Фармацевтическую категорию ДНК обозначают здесь как препарат ДНК, содержащий не более приблизительно 5%, а более предпочтительно не более приблизительно 1-2% клеточных компонентов, как, например, клеточные мембраны.

- 5 011554

Также описан способ получения и выделения высокоочищенной плазмидной ДНК, которая практически свободна от загрязняющих веществ и таким образом представляет собой фармацевтическую категорию ДНК. При помощи способа по изобретению получают и выделяют плазмидную ДНК, содержащую очень низкие количества, т.е. миллионные доли (м.д.) загрязняющих хромосомной ДНК, РНК, белка и эндотоксинов, и содержит главным образом замкнутую кольцевую форму плазмидной ДНК. Полученная по изобретению плазмидная ДНК имеет достаточную чистоту для применения в исследованиях и основанной на плазмидах терапии и необязательно для данных о человеческих клинических исследованиях и экспериментов по человеческой генной терапии и клинических исследований.

«Композиция плазмидной ДНК фармацевтического качества» по изобретению представляет собой полученную способом по изобретению композицию плазмидной ДНК и/или композицию по меньшей мере с одной из степеней чистоты, обозначенных ниже как «плазмидная ДНК фармацевтического качества».

Предпочтительно «композиция плазмидной ДНК фармацевтического качества» по изобретению имеет степень чистоты, обозначенную посредством по меньшей мере двух из степеней чистоты, определенных ниже как «плазмидная ДНК фармацевтического качества», например, менее приблизительно 0,01% хромосомной или геномной ДНК и менее приблизительно 0,01% загрязняющего белка или, например, менее приблизительно 0,01% хромосомной или геномной ДНК и менее приблизительно 0,1 ЭЕ/мг эндотоксинов. Плазмидная ДНК фармацевтического качества предпочтительно содержит менее приблизительно 0,001% хромосомной или геномной ДНК и менее приблизительно 0,001% загрязняющего белка или, например, менее приблизительно 0,001% хромосомной или геномной ДНК и менее приблизительно 0,1 ЭЕ/мг эндотоксинов. Более предпочтительно она содержит менее приблизительно 0,0001% хромосомной или геномной ДНК и менее приблизительно 0,0001% загрязняющего белка или, например, менее приблизительно 0,0001% хромосомной или геномной ДНК и менее приблизительно 0,1 ЭЕ/мг эндотоксинов. Наиболее предпочтительная плазмидная ДНК фармацевтического качества содержит менее приблизительно 0,00008% хромосомной или геномной ДНК и менее приблизительно 0,00005% загрязняющего белка или, например, менее приблизительно 0,00008% хромосомной или геномной ДНК и менее приблизительно 0,1 ЭЕ/мг эндотоксинов. В определение включены другие сочетания степеней чистоты. Само собой, композиция плазмидной ДНК фармацевтического качества, кроме того, может включать в себя или содержать дополнительные компоненты, желаемые для любого конкретного применения, включающего в себя применение при сочетанных обработках, композициях и терапиях. Количества хромосомной или геномной ДНК, РНК, эндотоксинов или белка относятся к загрязняющим веществам, полученным при основанном на клетках получении плазмид, или другим, полученным в процессе очистки загрязняющим веществам.

Наиболее предпочтительно «плазмидная ДНК фармацевтического качества» означает здесь препарат ДНК, содержащий геномную ДНК, РНК и/или загрязняющие белки на уровне одной миллионной доли или м.д. (<0,0001%, т.е. <0,0001 мг на 100 мг плазмидной ДНК) или менее.

Также или более точно «плазмидная ДНК фармацевтического качества» здесь может означать препарат ДНК, содержащий менее приблизительно 0,01% или менее 0,001%, а предпочтительно менее 0,0001% или предпочтительно менее 0,00008% (<0,00008%, т.е. <0,00008 мг на 100 мг плазмидной ДНК) хромосомной ДНК или геномной ДНК.

«Плазмидная ДНК фармацевтического качества» также может означать препарат ДНК, содержащий менее приблизительно 0,01% или менее 0,001%, а предпочтительно менее 0,0001% или предпочтительно менее 0,00002% (<0,00002%, т.е. <0,00002 мг на 100 мг плазмидной ДНК) загрязняющих РНК.

«Плазмидная ДНК фармацевтического качества» также может означать препарат ДНК, содержащий менее приблизительно 0,0001%, а наиболее предпочтительно менее 0,00005% (<0,00005%, т.е. <0,00005 мг на 100 мг плазмидной ДНК) загрязняющих белков.

«Плазмидная ДНК фармацевтического качества» также может означать препарат ДНК, содержащий менее 0,1 ЭЕ/мг эндотоксинов.

Плазмидная ДНК фармацевтического качества означает здесь препарат ДНК, предпочтительно находящийся главным образом в кольцевой форме, а более точно ДНК, содержащая более 80, 85, 90, 95 или более 99% замкнутой кольцевой формы плазмидной ДНК.

Т-трубка относится к Т-образной конфигурации трубки, где форму Т образуют при помощи произведенной в такой конфигурации цельной трубки или нескольких соединенных для образования такой конфигурации трубок. Т-трубка имеет три рукава и центральную область для соединения рукавов. Т-трубку можно применять для смешивания ингредиентов, так как две жидкости могут течь, каждая, из одного из рукавов Т, соединяясь в центральной области, и выходить из третьего рукава. Смешивание происходит в виде объединения жидкостей.

«Турбулентный поток» означает беспорядочное хаотическое движение частиц жидкости в направлениях, поперечных направлению основного потока, в котором скорость в данной точке беспорядочно меняется по величине и направлению.

«Вязкоэластичный» относится к жидкостям с вязкими и эластичными свойствами.

- 6 011554

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к стабильным жидким препаратам плазмидной ДНК, где плазмидная ДНК остается не деградированной при комнатной температуре в течение длительного периода времени. Таким образом, такие препараты или композиции плазмидной ДНК, сохраняющие плазмидную ДНК, приемлемы для исследований, основаны на плазмидах терапии, как, например, генная терапия или ДНК-вакцина.

По настоящему изобретению жидкая композиция, сохраняющая стабильной плазмидную ДНК, содержит плазмидную ДНК и буферный раствор в концентрации до 5, или до 4, или до 3, или до 2 мМ, достаточной для поддержания рН указанной композиции между 6 и 9, и композиция содержит основную суперскрученную форму плазмидной ДНК при температурах приблизительно от 4 до 25°С в течение нескольких месяцев, 1 года, 2, 3, 4, 5 и до 10 лет.

Композиция плазмидной ДНК с преимущественно суперскрученной формой плазмиды содержит по меньшей мере 80% суперскрученной или замкнутой кольцевой плазмидной ДНК или приблизительно 85%, а предпочтительно приблизительно 90% или приблизительно 95%. Наиболее предпочтительно композиция стабильной плазмидной ДНК содержит приблизительно 99% суперскрученной или замкнутой кольцевой формы плазмидной ДНК. Альтернативно, стабильная композиция для хранения плазмидной ДНК дает отношения депуринизации и однонитевых разрывов менее 5% в месяц.

Таким образом, жидкий препарат, сохраняющий стабильной плазмидную ДНК, по настоящему изобретению содержит плазмидную ДНК и сильно разведенный буферный раствор, буферный раствор в концентрации до 2 мМ, достаточной для поддержания рН композиции приблизительно по меньшей мере 6 и не более 9 или между 6,2 и 8,5, а предпочтительно между 6,7 и 8, а более предпочтительно между 7 и 7,5 и/или приблизительно +/-0,3 от одного или обоих из этих значений.

Жидкая композиция стабильной плазмидной ДНК содержит буферный раствор в концентрации до 2 мМ для поддержания рН указанного препарата или композиции между 6,2 и 8,5 и/или приблизительно +/-0,3 от одного или обоих из этих значений, таким образом обеспечивая хранение плазмидной ДНК с отношениями депуринизации и однонитевых разрывов менее 5% в год при хранении приблизительно при 4°С и менее 5% в месяц при хранении приблизительно при 25°С.

Предпочтительно жидкая композиция стабильной плазмидной ДНК содержит буферный раствор в концентрации до 2 мМ для поддержания рН указанного препарата или композиции между 6,7 и 8 и/или приблизительно +/-0,3 от одного или обоих из этих значений, таким образом обеспечивая хранение плазмидной ДНК с отношениями депуринизации и однонитевых разрывов менее 2% в год при хранении приблизительно при 4°С и менее 2% в месяц при хранении приблизительно при 25°С.

Более предпочтительно жидкая композиция стабильной плазмидной ДНК содержит буферный раствор в концентрации до 2 мМ для поддержания рН указанного препарата или композиции между 7 и 7,5 и/или приблизительно +/-0,3 от одного или обоих из этих значений, таким образом обеспечивая хранение плазмидной ДНК с отношениями депуринизации и однонитевых разрывов менее 1% в год при хранении приблизительно при 4°С и менее 1% в месяц при хранении приблизительно при 25°С.

Молярную концентрацию буферного раствора определяют таким образом, чтобы буферное действие проявлялось в интервале значений и в объеме для стабилизации значения рН между 6 и 9 или между 6,2 и 8,5, предпочтительно между 6,7 и 8, а наиболее предпочтительно между 7 и 7,5 и/или приблизительно +/-0,3 от любого из этих значений. Таким образом, буферный раствор можно добавлять в концентрации менее 5 мМ. Предпочтительно композиция, сохраняющая стабильной плазмидную ДНК, содержит следы буферного раствора или буферный раствор в сильно разбавленной концентрации до 2 мМ, а более предпочтительно между 1 и 2 мМ. Наиболее предпочтительно буферный раствор присутствует в концентрации менее 1 мМ, между 250 мкМ и 1 мМ или между 400 мкМ и 1 мМ для поддержания рН указанного препарата или композиции между 6 и 9 или между 6,2 и 8,5, предпочтительно между 6,7 и 8 и наиболее предпочтительно между 7 и 7,5 и/или приблизительно +/-0,3 от любого одного или нескольких из этих значений.

Буферный раствор присутствует в концентрации до 2 мМ или между 1 и 2 мМ. Предпочтительно буферный раствор присутствует в концентрации менее 1 мМ. Наиболее предпочтительно буферный раствор присутствует в виде следовых количеств при такой низкой концентрации, как, например, 250 мкМ и до 1 мМ. Следовые количества буферного раствора могут составлять приблизительно 400 мкМ и точно достаточны для поддержания рН в указанных здесь выше диапазонах.

Приемлемые для применения в композициях по настоящему изобретению буферные растворы состоят либо из кислотно-основной системы, включающей в себя Тпк [трис-(гидроксиметил)аминометан] или лизин и кислоту, выбранную из сильной кислоты (соляная кислота, например) или слабой кислоты (малеиновая, яблочная или уксусная кислота, например) или из кислотно-основной системы, включающей в себя Нерек [2-(4-(2-гидрогидэтилпиперазин)-1-ил)этансульфоновая кислота] и сильное основание (гидроксид натрия, например) или фосфатные буферы, как, например, фосфат натрия или фосфат калия. Буферный раствор также может содержать Тпк/НСТ лизин/НС1, Тпк/малеиновую кислоту, Тпк/яблочную кислоту, Тгщ/уксусную кислоту или Нерек/гидроксид натрия. Предпочтительно в композиции для хранения стабильной плазмидной ДНК по настоящему изобретению применяют буферный раствор Тпк.

- 7 011554

Как показано далее в примерах, препараты плазмидной ДНК по настоящему изобретению демонстрируют исключительную стабильность при 4°С и при комнатной температуре (КТ), например 20 или 25°С.

Композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать солевой эксципиент. Приемлемые для применения в композициях по настоящему изобретению солевые эксципиенты могут содержать анионы и катионы, выбранные из группы, состоящей из ацетата, фосфата, карбоната, 8О^2-4, С1^-, Вг^-, ΝΟ3^-, Мд²⁺, Ь1 ⁺, Να'. К⁺ и ΝΗ⁴⁺ и любой другой соли или формы имеющегося или применяемого ранее фармацевтического соединения.

Предпочтительный солевой эксципиент представляет собой ΝαΟΊ при концентрации между 100 и 200 мМ, а предпочтительно при концентрации приблизительно 150 мМ.

Стабильные композиции по настоящему изобретению особенно приемлемы для хранения высокоочищенной плазмидной ДНК или фармацевтической категории плазмидной ДНК с очень низкими количествами загрязняющих хромосомной ДНК, РНК, белка и эндотоксинов. Такие высокоочищенные плазмидные ДНК имеют менее приблизительно 0,01, или 0,001, или 0,0001% загрязняющей РНК клеткихозяина, или/и менее приблизительно 0,01, или 0,001, или 0,0001% загрязняющего белка клетки-хозяина, и/или менее приблизительно 0,01, или 0,001, или 0,0001% загрязняющей геномной ДНК клетки-хозяина.

Композиции по настоящему изобретению могут дополнительно включать в себя адъювант, такой как, например, полимер, выбранный из полиэтиленгликоля, плюроника или полисорбатного сахара или спирта.

По еще одному из аспектов настоящее изобретение относится к способу хранения плазмидной ДНК в композиции, включающему в себя:

a) получение очищенного образца плазмидной ДНК и

b) соединение указанного очищенного образца плазмидной ДНК и буферного раствора в концентрации до 2 мМ, поддерживающей рН полученной композиции между 6,2 и 9. Предпочтительно рН поддерживают между 6,5 и 8,5, предпочтительно между 6,7 и 8, а наиболее предпочтительно между 7 и 7,5, а более конкретно приблизительно около 7,2.

Настоящее изобретение также относится к способу хранения плазмидной ДНК в композиции, включающему в себя:

a) получение очищенного образца плазмидной ДНК;

b) соединение указанного очищенного образца плазмидной ДНК и буферного раствора в концентрации до 2 мМ, достаточной для поддержания рН полученной композиции между 6 и 9; и

c) хранение плазмидной ДНК.

Способ по настоящему изобретению позволяет хранить плазмидную ДНК с содержанием по меньшей мере 80% суперскрученной плазмидной ДНК.

рН полученной композиции можно поддерживать между 6,2 и 8,5 и приблизительно +/-0,3 от одного или обоих из этих значений, таким образом допуская хранение плазмидной ДНК при температурах приблизительно от 4 до 25°С с отношениями депуринизации и однонитевых разрывов от менее 5% в месяц до менее 5% в год.

Предпочтительно рН полученной композиции можно поддерживать между 6,7 и 8 приблизительно +/-0,3, таким образом допуская хранение плазмидной ДНК при температурах приблизительно от 4 до 25°С с отношениями депуринизации и однонитевых разрывов от менее 2% в месяц до менее 2% в год.

Наиболее предпочтительно рН полученной композиции можно поддерживать между 7 и 7,5 и приблизительно +/-0,3 от одного или обоих из этих значений, таким образом допуская хранение плазмидной ДНК при температурах приблизительно от 4 до 25°С с отношениями депуринизации и однонитевых разрывов от менее 1% в месяц до менее 1% в год.

Способом по настоящему изобретению к композиции плазмидной ДНК буферный раствор добавляют в концентрации до 2 мМ или между 1 и 2 мМ. Предпочтительно буферный раствор добавляют до достижения концентрации менее 1 мМ. Наиболее предпочтительно буферный раствор присутствует в незначительных количествах при такой низкой концентрации как 250 мкМ и до 1 мМ. Незначительные количества буферного раствора могут составлять приблизительно 400 мкМ и точно достаточны для поддержания рН в указанных здесь выше интервалах.

По настоящему способу к плазмидной ДНК и буферному раствору можно дополнительно добавлять солевой эксципиент.

Солевые эксципиенты описаны здесь выше. Предпочтительный солевой эксципиент представляет собой №1С1 в концентрации между 100 и 200 мМ, а предпочтительно приблизительно 150 мМ.

Представленные в композициях по настоящему изобретению плазмидные ДНК могут находиться в выделенной форме. Их можно выделять посредством лизиса бактериальных клеток и очистки, как здесь описано, или синтезировать посредством автоматического устройства для синтеза нуклеиновых кислот.

Они могут содержать кодирующий полипептид полинуклеотид, где полинуклеотид может представлять собой трансген, как, например, терапевтический ген, например, источником которого является млекопитающее, как, например, грызун, или человеческий ген, и функционально связанный с промоторной последовательностью. Вставленный в плазмидную ДНК полинуклеотид может быть геномного про

- 8 011554 исхождения и, следовательно, содержать экзоны и интроны, как отражено в его геномной структуре или может быть получен из комплементарной ДНК. Полинуклеотид может кодировать любой из ряда полипептидов, в качестве неограничивающих примеров, представляющих собой иммуногенный пептид или белок, ангиогенный фактор, эритропоэтин, аденозиндезаминазу, фактор VIII, фактор IX, дистрофин, β-глобин, рецептор ЬОЬ, СЕТИ, инсулин, антиангиогенный фактор, гормон роста, αΐ-антитрипсин, фенилаланингидроксилазу, тирозингидроксилазу, интерлейкин и интерферон. Предпочтительно плазмидная ДНК содержит полинуклеотид, кодирующий ангиогенный фактор, как, например, ген ЕСЕ (от ЕСЕ-1 до ЕСЕ-22), VΕСЕ, НСЕ или ШЕ-1. В качестве альтернативы применению кодирующего полипептид полинуклеотида полинуклеотид может кодировать интерферирующую РНК, которую можно применять для ингибирования экспрессии целевого гена, например, где экспрессия гена нежелательна (например, ген патогена) или где уровень генной экспрессии в клетке нежелательно высок. Приемлемые для применения в различных системах позвоночных промоторы хорошо известны и включают в себя, например, Κ.δν ЬТК, ΜΡδν ЬТК, 8ν40, промотор металлотионеина и можно успешно применять ΟΜν ШР.

Плазмидная ДНК может включать в себя прокариотические и эукариотические векторы и экспрессирующие векторы, как, например, векторы рВК.322 и рИС и их производные. Они могут включать в себя различные ориджины репликации, например прокариотические ориджины репликации, как, например, рМВ1 и Со1Е1, или эукариотические ориджины репликации, как, например, обеспечивающие репликацию ориджины репликации клеток дрожжей, грибов, насекомых и млекопитающих (например, δν40 оп).

Вставка может включать в себя ДНК из любого организма, но предпочтительно источник происхождения представляет собой млекопитающее и, кроме кодирующего терапевтический белок гена, может включать в себя регуляторные последовательности, как, например, промоторы, энхансеры, локус контролирующие область, выбираемые гены, полилинкеры для вставки трансгена, последовательности лидерных пептидов, интроны, сигналы полиаденилирования или их сочетания. Выбор векторов, источников и генетических элементов варьирует в зависимости от потребностей и хорошо известен специалистам в данной области. Выбираемые маркеры могут представлять собой, например, ген устойчивости к антибиотику, например тРНК 8ирРйе, ген устойчивости к тетрациклину, ген устойчивости к канамицину, ген устойчивости к пуромицину, ген устойчивости к неомицину, ген устойчивости к гигромицину и устойчивости к тимидинкиназе. Основа плазмиды преимущественно допускает вставки фрагментов ДНК млекопитающих, других эукариотических, прокариотических или вирусных ДНК, а полученную плазмиду можно очищать и применять ίη νίνο или ех νίνο в основанной на плазмидах терапии.

Предпочтительно применяют плазмидную ДНК с условным репликатором, как, например, описанная в опубликованной заявке США 2003/1618445 плазмида рСОИ. Полученное высокое число копий сильно повышает соотношение плазмидной ДНК к хромосомной ДНК, РНК, клеточным белкам и кофакторам, улучшает выход плазмиды и способствует более легкой последующей очистке. Таким образом, по изобретению можно применять любую плазмидную ДНК. В качестве неограничивающих примеров репрезентативные векторы включают в себя плазмиду ХУ1ЕСЕ. ХУ1ЕСЕ представляет собой кодирующую кислый фактор роста фибробластов или фактор роста фибробластов 1-го типа (ЕСЕ-1) плазмиду, приемлемую для лечения пациентов с терминальной стадией окклюзионной болезни периферических артерий (ΡΆΟΌ) или с болезнью периферических артерий (ΡΆΌ). Сашего1а е1 а1. (I. ν;·ι^. 8игд., 2002, 35, 5: 930936) описали, что 51 пациенту с невосстанавливаемой терминальной стадией ΡΆΌ с болью в состоянии покоя или тканевым некрозом в ишемизированное бедро и голень внутримышечно вводили ХУ1ЕСЕ в возрастающей однократной или повторяющихся дозах. Затем определяли различные параметры, как, например, чрескожное давление кислорода, лодыжечный и пальце-плечевой индексы, анализ болей и заживление язв. После введения ХУ1ЕСЕ наблюдали значительное повышение плечевых индексов, снижение боли, четкость размера язв и улучшение перфузии.

По еще одному из аспектов настоящее изобретение относится, как обозначено здесь выше, к композиции для применения в способе лечения человеческого организма или организма животного посредством терапии. Предпочтительно композиция по настоящему изобретению содержит плазмиду рСОИ, кодирующую ангиогенный ген семейства ЕСЕ или VЕСЕ, для лечения сердечно-сосудистого заболевания, как периферическая ишемия, заболевания периферических артерий, например ΡΆΟΌ или ΡΆΌ, критическая ишемия конечности (СЫ) и перемежающаяся хромота ДС).

В качестве еще одного предпочтительного применения плазмидная ДНК содержит кодирующий иммунизирующий пептид полинуклеотид и может применяться как ДНК-вакцина. Таким образом, настоящее изобретение относится к композиции для вакцинации людей или животных, тем самым вызывая эффективный иммунитет против инфекционных агентов, включающих в себя внутриклеточные вирусы, а также против опухолевых клеток. В действительности стабильную композицию плазмидной ДНК можно применять в качестве ДНК-вакцин для значительного усиления иммуногенности конкретных вирусных белков и опухолеспецифичных антигенов, обычно вызывающих слабый иммунный ответ. Они являются полезными для индукции опосредованного цитотоксическими Т-клетками иммунитета против слабоиммуногенных вирусных белков герпесвируса, ни-А, ни-В гепатита и НШ.

- 9 011554

Плазмидная ДНК может кодировать иммуногенные полипептиды, которые могут действовать в качестве эндогенных иммуногенов, чтобы вызвать гуморальный или клеточный или тот и другой ответ, или, кроме того, антитело. В этом смысле термин «антитело» включает в себя полный иммуноглобулин любого класса, химерные антитела и гибридные антитела с двойной или множественной специфичностью к антигену или эпитопу, и фрагменты, как, например, Е(аЬ)₂, ЕаЬ', ЕаЬ и т.п., включающие в себя гибридные фрагменты. Также в значение «антитело» включены конъюгаты таких фрагментов и так называемые связывающие антиген белки (одноцепочечные антитела), как описано, например, в патенте США № 4704692 (содержание которого включено сюда в виде ссылки). Таким образом, плазмидную ДНК, содержащую кодирующий вариабельные области антитела полинуклеотид, можно применять для получения антитела ίη δίΐιι. По относящемуся к получению кодирующих антитело полинуклеотидов иллюстративному способу см. \Уагй е! а1. Ыа1иге, 341: 544-546 (1989); С1Ше8 е! а1., Вю1есйпо1. 7: 799-804 (1989) и Ыака1ап1 е! а1., 1ос. с11., 805-810 (1989). В свою очередь, антитело может проявить терапевтический эффект, например, посредством связывания ассоциированного с патогеном поверхностного антигена. В качестве альтернативы кодируемые антитела могут представлять собой антиидиотипические антитела (антитела, связывающие другие антитела), как описано, например, в патенте США № 4699880. Такие антиидиотипические антитела могут связывать эндогенные или чужеродные антитела у подвергающегося лечению человека, таким образом улучшая или предотвращая связанные с иммунным ответом патологические состояния, например, в контексте аутоиммунного заболевания.

Таким образом, композицию по настоящему изобретению можно вводить людям или животным ίη νίνο, обеспечивая доставку плазмидной ДНК в различные клетки организма животного, включающие в себя мышечные клетки, клетки кожи, головного мозга, легких, печени, селезенки или в клетки крови. Доставка полинуклеотидов непосредственно ίη νίνο является предпочтительной для клеток мышц или кожи. Для обеспечения эффективной иммунизации субъекта инъекции можно делать, например, в мышцу или кожу с применением медицинского шприца или шприца для вакцин. Фактически ген антигена, вводимого в клетки субъекта, теперь экспрессирующие антиген трансфицированные клетки, будет процессирован и представлен иммунной системе при помощи обычных клеточных механизмов. Для дополнительного усиления иммунизации по возможности можно одновременно вводить адъюванты или лимфокины.

Например, стабильную композицию настоящей плазмидной ДНК можно применять для вакцинации против вирусов или в качестве ДНК-вакцины для лечения латентных вирусных инфекций, таких как, например, гепатит В, ВИЧ и вызываемые группой герпесвирусов, где вирус сохраняется внутри клетки в неактивной или частично активной форме. Кроме того, композицию плазмидной ДНК по настоящему изобретению можно применять для лечения злокачественной опухоли для усиления клеточного иммунного ответа на специфичный для злокачественной опухоли белок, онкоген, эмбриональный антиген или маркер активации.

Приготовленные для длительного хранения по настоящему изобретению плазмидные ДНК (пДНК) обычно получают в бактериальных клетках, которые затем подвергают лизису для выхода содержимого клеток, из которого выделяют пДНК.

Как правило, этот процесс предусматривает три стадии, включающие в себя ресуспендирование клеток: клеточный лизис, нейтрализацию и преципитацию загрязняющих веществ клеток-хозяев. При ресуспендировании клеток обычно применяют ручное перемешивание или магнитное перемешивающее устройство и гомогенизатор или импеллерную мешалку для ресуспендирования клеток в ресуспендирующем буфере.

Клеточный лизис можно выполнять при помощи раскручивания руками или магнитного перемешивания для перемешивания ресуспендированных клеток с лизирующим раствором, состоящим из лизоцима или разбавленной щелочи (основания), такой как, например, щелочной или ацетат калия (КОАс) и детергентов; затем для завершения лизиса выдерживание смеси при комнатной температуре (20-25°С) или на льду в течение интервала времени, как, например, 5 мин. Также обычно добавляют РНКазу для деградации РНК бактериальной суспензии. Третья стадия представляет собой нейтрализацию и преципитацию загрязняющих веществ клеток-хозяев. Лизат из второй стадии обычно перемешивают с холодным раствором для нейтрализации посредством мягкого перемешивания или магнитного перемешивания для подкисления лизата перед помещением на лед на 10-30 мин для облегчения денатурации и преципитации высокомолекулярной хромосомной ДНК, белков хозяина и других молекул хозяина.

При выполнении лизиса с применением обработки лизоцимом бактерии взаимодействуют с лизоцимом, а затем их кипятят приблизительно при 100°С в соответствующем буфере в течение от 20 до 40 с с образованием нерастворимого сгустка из геномной ДНК, белка и дебриса, оставляя плазмиду в растворе с РНК в качестве основного загрязняющего вещества. После этого с целью растворения цитоплазматической мембраны добавляют смешанный раствор ИаОН и додецилсульфата натрия (δΌδ). ИаОН вызывает частичную денатурацию ДНК и частичную деградацию РНК, а δΌδ действует для растворения мембраны и денатурации белков. Далее δΌδ-белковый комплекс и клеточный дебрис преципитируют добавлением 5Ν ацетата калия (рН 4,8). На данном этапе рН важен для нейтрализации использованного в указанной операции №ЮН и для ренатурации плазмиды. После этого выполняют центрифуги

- 10 011554 рование для удаления преципитатов, таким образом получая целевые плазмидные ДНК в надосадочной жидкости.

В качестве альтернативы выполняют щелочной лизис, состоящий из перемешивания бактериальных клеток с щелочным лизирующим раствором. Щелочной лизирующий раствор состоит из детергента, например додецилсульфата натрия (8Ό8) для лизиса бактериальных клеток и выхода внутриклеточного вещества, и щелочи, например, гидроксида натрия для денатурации белков и нуклеиновых кислот клеток (конкретно гДНК и РНК). Так как клетки лизированы и денатурирована ДНК, вязкость раствора резко повышается. После денатурации для нейтрализации гидроксида натрия добавляют кислый раствор, например ацетат калия (раствор 3), стимулируя ренатурацию нуклеиновых кислот. Длинные фрагменты гДНК соединяются случайным образом и образуют оседающие в виде хлопьев сети, захватывая белки, липиды и другие нуклеиновые кислоты. Калиевая соль додецилсульфата также оседает, удаляя белки, с которыми она связана. Две переплетающиеся друг с другом цепи пДНК (плазмидной ДНК) обычно реассоциируют для восстановления остающейся в растворе исходной плазмиды.

Эти химические стадии могут являться пригодными для лизиса клеток в малом количестве или небольших объемов бактериальных культур менее 5л, но увеличение вязкости может затруднять обработку больших количеств.

Технику лизиса можно выполнять в серийном производстве, т. е. где различные растворы перемешивают посредством последовательного добавления растворов к сосудам и емкостям.

В качестве альтернативы периодическим способом, особенно когда предусмотрено получение большого объема плазмиды, можно применять непрерывное перемешивание различных растворов для лизиса клеток с применением ряда статических смесителей. По этим способам раствор клеточной суспензии и раствор для лизиса клеток одновременно добавляют в статический смеситель. Выходящий из первого статического смесителя раствор лизированных клеток и раствор для преципитации затем одновременно добавляют во второй статический смеситель. Выходящий из этого второго смесителя раствор содержит преципитированный лизат и плазмиды. Другие непрерывные способы лизиса клеток включают применение потока, проходящего через теплообменное устройство, где суспендированные клетки нагревают до 70-100°С. После клеточного лизиса в теплообменном устройстве выходящий поток подвергают центрифугированию непрерывной фракцией или по частям, при котором осаждают клеточный дебрис и геномную ДНК, оставляя плазмидную ДНК в надосадочной жидкости.

Предпочтительный способ непрерывного щелочного лизиса суспензии бактериальных клеток, особенно при большом масштабе, описан в международной патентной публикации XVО 05/02 6331, включенной сюда в виде ссылки. Данный предпочтительный способ направлен на вызванные вязкоупругими свойствами жидкостей проблемы и вовлеченные на стадиях перемешивания силы трения, и обеспечивает главное преимущество по ограничивающим силам трения. Поэтому можно получать высокий выход плазмидной ДНК с применением способа с изменением масштаба непрерывного щелочного лизиса клеток-хозяев, описанный здесь далее.

На первой стадии заражают клетки-хозяева, т.е. трансформируют плазмидной ДНК на экспоненциальной фазе роста клеток и сеют в планшеты, содержащие среду ЬВ, включающую в себя антибиотик, как, например, тетрациклин. Затем каждую отдельную колонию из планшета вносят в 20 мл среды ЬВ с содержанием соответствующего антибиотика тетрациклина в отдельные стерильные пластиковые флаконы Эрленмейера и растят в течение 12-16 ч при 37°С в инкубаторе со встряхиванием. Затем одну из этих культур применяют для заражения 200 мл стерильной дополненной среды ЬВ в 2 л флаконах Эрленмейера. Их растят при 37°С и 200 об/мин в инкубаторе со встряхиванием и применяют для заражения двух 5 л флаконов Эрленмейера, а также растят при 30°С и 200 об/мин в инкубаторе со встряхиванием и применяют для заражения сосуда для ферментера в середине экспоненциальной фазы через 5 ч и при ΟΌ600 нм, равной 2 единицам.

Культуры клеток-хозяев и заражение хорошо известны в данной области. Как правило, клеткихозяева растят до достижения ими высокой биомассы, а клетки находятся в экспоненциальной фазе роста затем, чтобы иметь большое количество плазмидной ДНК. Можно применять два различных способа, т.е. культивирование с одноразовой загрузкой и культивирование с периодической подпиткой.

Культивирование с одноразовой загрузкой предусматривает скорость роста, контролируемую посредством управления температурой роста и применяемым источником углерода. Как здесь применяют, термин «культивирование с одноразовой загрузкой» представляет собой способ культивирования клеток, при котором все необходимые для клеточного роста и для синтеза плазмиды питательные вещества содержатся в сосуде для культивирования клеток в большом избытке, как, например, до 10-кратных избыточных концентраций питательных веществ во время заражения, таким образом устраняя необходимость делать добавки в стерильный сосуд после добавок после стерилизации и необходимость в сложных моделях и способах подпитки. В частности, среда для загрузки дополнена избытком дрожжевого экстракта от 5 (как в среде ЬВ) до 20 г/л, таким образом предоставляя огромные количества факторов роста и предшественников нуклеиновых кислот. Среду также дополняют сульфатом аммония (5 г/л), действующим в качестве источника органического азота.

- 11 011554

Еще один тип культивирования представляет собой культивирование с периодической подпиткой, при котором скорость клеточного роста контролируют добавлением в культуру питательных веществ во время клеточного роста. Как применяют здесь «культивирование с периодической подпиткой» относится к способу культивирования клеток, при котором скорость роста контролируют тщательно измеренными добавками метаболитов к культуре при культивировании. Культивирование с периодической подпиткой по изобретению позволяет клеточной культуре достичь более высокой биомассы, чем при культивировании с одноразовой загрузкой. Примеры способа культивирования и иллюстративные величины добавления питания описаны ниже для 50 л композиции. Однако с применением описанных ниже иллюстративных величин добавок также можно обрабатывать другие объемы, например 10, 50 или более 500 л, в зависимости от размера оборудования. Высоко обогащенная среда для одноразовой загрузки и среда для культивирования с периодической подпиткой предназначены для получения культуры с высокой плотностью клеток для максимального повышения выхода конкретной плазмиды и обеспечения получения высокой биомассы клеток, все еще находящихся в экспоненциальной фазе роста. При культивировании с периодической подпиткой в качестве источника углерода используют глюкозу или глицерин. Культивированием управляют в периодическом режиме до тех пор, пока не истощится исходный субстрат углерода (глюкоза). Этот момент отмечают по стремительному повышению ΌΟ и подтверждают анализом глюкозы взятого сразу после этого события образца. После этого включают предварительно заправленный питательной средой насос. Скорость нагнетания определяют при помощи полученной Сиг1е88 е( а1. (Βίοепд. 38: 1082-1090, 1991) модели, полностью включенной сюда в виде ссылки. Модель разработана для облегчения контроля этапа питания в способе с периодической подпиткой. В исходном серийном производстве растущие с максимальной конкретной скоростью роста клетки потребляют не сдерживающую концентрацию субстрата, обеспечивая быстрое увеличение биомассы после заражения. Культура не может расти с такой скоростью бесконечно из-за накопления токсических метаболитов (ИезсЫо е( а1., «Еегтеп(а(юп Тесйпо1оду Изтд КесотЬшап! Мкгоогдашзтз». 1п Вю(есйпо1оду, ебз. Н.1. К1ет и О. Кееб. ШетНепп: УСН Уег1ад8де8е118сйай тЬН 7Ь: 117-140, 1989). Для обеспечения непрерывного логарифмического роста с помощью модели вычисляют контролируемую по времени скорость подачи ограничивающего рост субстрата углерода, без потребности в системе управления с обратной связью, обеспечивая установленную оператором фазу роста с периодической подпиткой. Ее выбирают при концентрации, не приводящей к накоплению ингибирующих катаболитов и достаточной для получения высокой биомассы. Добавки предшественников (органический азот в виде сульфата аммония) во время стадии питания при культивировании с периодической подпиткой предназначены для предотвращения вредных для качества плазмиды воздействий.

Можно применять хорошо известные в данной области способы лизиса, включающие в себя, например, лизиссодержащих плазмиду микробных клеток при нагревании потока. Этот способ среди прочего описан в международной патентной публикации ШО 96/02658. Конкретное теплообменное устройство состоит из 10 фтх0,25 дюймов по внешнему диаметру трубы из нержавеющей стали в форме спирали. Спираль полностью погружена в водяную баню с постоянной высокой температурой. Вмещающий объем спирали составляет приблизительно 50 мл. Для измерения входной и выходной температуры и температуры водяной бани использовали термопары и термометр, соответственно. Поток с продуктом закачивают в нагреваемую спираль с применением перистальтического насоса с силиконовой трубкой Ма8(егДех. После прохождения спирали клеточный лизат центрифугируют в импульсной центрифуге для очистки Весктап 1-21. После центрифугирования можно очищать плазмидную ДНК с применением способа очистки по настоящему изобретению.

В качестве альтернативы клеточный лизис можно выполнять с применением последовательно расположенных статических смесителей. Как описано в ШО 97/23601 (включенной сюда в виде ссылки), первый статический смеситель для лизиса клеток с помощью одного статического смесителя и для преципитации клеточного лизата, тем не менее, в качестве альтернативного способа клеточного лизиса до способа очистки плазмидной ДНК по настоящему изобретению можно применять второй статический смеситель. С применением последовательно расположенного смесителя можно осторожно и непрерывно лизировать большие объемы клеток, а другие статические смесители располагают последовательно для осуществления других задач, как, например, разведение и осаждение. Приемлемые статические смесители, пригодные для способа по настоящему изобретению, включают в себя любое устройство с непрерывным потоком, указанное в данной области как статический или неподвижный смеситель с достаточной для обеспечения способов по настоящему изобретению протяженностью. Например, для лизиса клеток статический смеситель должен иметь до 5 секций, обеспечивая достаточное время взаимодействия между лизирующим раствором и клетками, вызывая лизис подверженных воздействию клеток при прохождении через смеситель. Приемлемые 5 статических смесителей содержат внутреннюю спиральную структуру, заставляющую две жидкости взаимодействовать друг с другом в противоположно вращающемся потоке, обусловливая смешивание жидкостей в турбулентном потоке.

Наиболее предпочтительный способ или устройство для лизиса клеток включает в себя:

(а) устройство для турбулентного потока для быстрого перемешивания клеточной суспензии (см. фиг. 1) с лизирующим клетки раствором (раствор 2 на фиг. 1) и

- 12 011554 (Ь) устройство для ламинарного потока для обеспечения инкубации смеси, образованной в (а) без существенного перемешивания, где образованная в (а) смесь течет из устройства для турбулентного потока в устройство для ламинарного потока.

Кроме того, оно может содержать устройство для добавления третьего раствора, нейтрализующего лизирующий раствор (раствор 3 на фиг. 1), где смесь, инкубированная в (Ь), течет из устройства для ламинарного потока в устройство для добавления второго раствора. Таким образом, например, для выделения плазмидной ДНК из клеток можно применять данный способ, включающий в себя:

(a) перемешивание клеток с щелочным лизирующим раствором в устройстве для турбулентного потока и (b) нейтрализацию щелочного лизирующего раствора добавлением кислого раствора.

В данном способе для непрерывного и очень быстрого перемешивания клеточной суспензии (раствор 1) и щелочного раствора (раствор 2) применяют Т-образные трубки до появления вязкоупругой жидкости, таким образом обеспечивая большое преимущество относительно ограничивающих сила трения. Как правило, Т-образные трубки имеют небольшой диаметр трубки, обычно диаметром менее см, предпочтительно приблизительно 2 и 8 мм и более предпочтительно приблизительно 6 мм, чтобы увеличить время взаимодействия смешиваемых жидкостей, но по данному способу не применяют вызванное прохождением через трубку перемешивание. Далее в табл. 1 показаны варианты параметров В1а, В1Ь, В2 устройства для турбулентного потока, ламинарного потока и турбулентного потока соответственно и их соответствующие скорости потока 81, 82, и 83, как показано на фиг. 1.

Таблица 1

В1а (60 л/ч)	В1Ь (60 л/ч)	В2 (90 л/ч)	Скорости потока
Диаметр	Длина	Диаметр	Длина	Диаметр	Длина	31, 32 и 33	Диапазон
от 5 ДО 7 мм	2-6 м	от 12,5 ДО 19 мм	от 13 до 23 м	от 5 до 8 мм	от 2 до 4 м	60/60/9 0 л/ч	±20%

Способом можно применять смеситель или инжектор с трубками вместо Т-образной трубки, обеспечивающий разрушение клеток в лизирующем растворе. Соответственно, механический стресс проходящих по трубкам жидкостей значительно снижен по сравнению с тем, когда жидкости в резервуарах перемешивают, например, мешалками с лопастями. Исходная эффективность перемешивания приводит к еще большей эффективности в секундах, из чего следует, что эта жидкость еще не имеет вязкоупругих свойств и осуществляемое в трубке с небольшим диаметром перемешивание очень эффективно. Напротив, когда для перемешивания применяют Т-образную трубку, исходное перемешивание только смягчает, при этом жидкость быстро становится вязкоупругой, приводя к значительным затруднениям при протекании по трубке. Это частичное перемешивание приводит к лизису только части клеток и поэтому может высвобождать только часть плазмид до нейтрализации. Лизис можно разделить на две фазы при лизировании: фазу I и фазу II. Эти две фазы соответствуют I) лизису клеток и II) денатурации нуклеиновых кислот, вызывающей существенное изменение в реологических свойствах, приводя к образованию вязкоупругой жидкости. Стандартизация диаметров трубок позволяет удовлетворить потребностям этих двух фаз. Перемешивание улучшается при небольшом диаметре трубки (В1а). Это является применяемым для фазы I условием. При большом диаметре трубки (В1Ь) перемешивание (и, таким образом, сила трения) снижается. Это является применяемым для фазы II условием.

Предпочтительный применяемый смеситель представляет собой смеситель, обозначенный как М1, что изображено на фиг. 2, но для обеспечения разрушения клеточной суспензии по настоящему изобретению также можно применять любое Т-образное устройство. Для получения эффективного разрушения один из способов выполнения лизиса с этим смесителем представляет собой впрыскивание раствора 1 в обратно текущий щелочной лизирующий раствор через одно или несколько отверстий небольшого диаметра. Диаметры таких отверстий могут составлять приблизительно от 0,5 до 2 мм и предпочтительно приблизительно 1 мм с указанной конфигурацией. Затем смесь проходит смеситель М1 для прохождения по трубке с небольшим диаметром (фиг. 1) в течение короткого периода времени (приблизительно 2,5 с). Для получения турбулентного потока можно легко вычислить сочетание диаметра и времени тока. Примеры вариантов этих параметров представлены в табл. 1. Все ссылки на диаметр трубки даны для внутреннего диаметра трубки, не внешнего диаметра, включающего в себя непосредственно толщину стен трубки. Такое короткое время жизни в трубке обеспечивает очень быструю гомогенизацию растворов 1 и 2. При условии, что во время фазы I раствор 1 и раствор 2 являются еще ньютоновскими жидкостями, в фазе гомогенизации режим потока является турбулентным. На выходе из этой трубки растворы 1 и 2 гомогенизированы, и в суспензии начинается лизис клеток.

Затем гомогенизированная смесь проходит по второй трубке (В1Ь) значительно большего диаметра (фиг. 1), в которой происходит лизис клеток и образование вязкоупругой жидкости. Во время этой фазы смешивание можно минимизировать, а раствору следует дать «отдохнуть» для ограничения максимальной турбулентности в целях минимизации любой силы трения, способной фрагментировать гДНК. Время

- 13 011554 взаимодействия приблизительно от 1 до 3 мин, приблизительно 2 мин, а предпочтительно 1 мин 20 с может быть достаточным для завершения клеточного лизиса и денатурации нуклеиновых кислот. Во время фазы денатурации режим потока жидкости может являться ламинарным, вызывая медленную диффузию 8Ό8 и гидроксида натрия к клеточным компонентам.

Таким образом, затем можно перемешать полученный лизат и раствор 3 для нейтрализации в обозначенном как М2 смесителе Υ. По одному из вариантов осуществления настоящего изобретения внутренний диаметр смесителя Υ составляет приблизительно от 4 до 15 мм или приблизительно от 6 до 10 мм, а может составлять приблизительно 6 мм или приблизительно 10 мм. Трубку с небольшим диаметром (например, приблизительно 6 мм трубка) устанавливают у выходного отверстия смесителя Υ для обеспечения быстрого (<1 с) и эффективного перемешивания лизата с раствором 3. После этого собирают нейтрализованный раствор в собирающую емкость.

При нейтрализации быстрое снижение рН вызывает образование хлопьев (т. е. образование комков или скоплений). С другой стороны, частично денатурированная плазмида ренатурирует очень быстро и остается в растворе. Хлопья оседают постепенно в собирающей емкости, захватывая большую часть загрязняющих веществ. На схематическом рисунке на фиг. 1 показан один из вариантов осуществления способа непрерывного лизиса (СЬ). Непрерывный лизис можно применять отдельно или с дополнительными стадиями.

Любой тип клеток, т.е. прокариотические или эукариотические, можно лизировать при помощи данного способа для любых связанных с лизисом целей, как, например, высвобождение из клеток-мишеней желаемой, затем очищаемой плазмидной ДНК.

Данный способ стадии непрерывного щелочного лизиса можно выполнять на клетках, собранных в результате культивирования, которое проводили до получения высокой биомассы клеток, еще не достигших стационарной фазы и, таким образом, находящихся в фазе экспоненциального роста (2-10 г сухого веса/л). Стадию непрерывного щелочного лизиса также можно выполнять на клетках, собранных в результате культивирования, которое проводили до получения высокой биомассы клеток, и клетки уже не находятся в экспоненциальной фазе роста, но достигли стационарной фазы с клеточной концентрацией приблизительно 10-200 г сухого веса/л, предпочтительно 12-60 г сухого веса/л.

Плазмидные ДНК можно очищать с применением различных способов до их формулирования в композиции для стабильного хранения по настоящему изобретению. Фактически препараты плазмидной ДНК, полученные из бактериальных препаратов, часто содержат смесь релаксированной и суперскрученной плазмидной ДНК. Способы очистки плазмидной ДНК хорошо известны в данной области.

Как правило, способы выделения и очистки плазмидной ДНК после культивирования бактерий состоят из разрыва содержащих плазмиду бактериальных клеток-хозяев, как описано выше, и нейтрализации лизата посредством нейтрализации ацетатом, чтобы вызвать преципитацию геномной ДНК и белков клеток-хозяев, которые затем удаляют, например, посредством центрифугирования. Жидкая фаза содержит преципитированную спиртом плазмидную ДНК, подвергаемую затем зонному центрифугированию с применением С§С1 в присутствии бромистого этидия для разделения различных форм плазмидной ДНК, т.е. суперскрученной, кольцевой с однонитевым разрывом и линеаризованной. После преципитации ДНК с применением спирта для удаления остаточного количества бромистого этидия необходима дополнительная экстракция с бутанолом. Далее следуют дополнительные стадии очистки для удаления белков клеток-хозяев. Как правило, эти способы приемлемы для небольшого или лабораторного масштаба плазмидных препаратов.

Альтернативные способы включают в себя, например, эксклюзионную хроматографию размеров, хроматографию на основе гидроксиапатита и различные хроматографические способы на основе обращенной фазы или анионного обмена. Данные альтернативы могут быть адекватными для получения небольших количеств исследуемого вещества в лабораторном масштабе, но не могут быть легко расширены для получения больших количеств плазмидной ДНК. Например, в качестве доступных способов разделения плазмидной ДНК применяют ионообменную хроматографию (ЭиаПе с1 а1., 1оигиа1 о£ СНготаЮдгарНу А, 606 (1998), 31-45) или эксклюзионную хроматографию размеров (Ргахегех. Ό.Μ., Вю1ес11по1оду Тес11пк|ие5. уо1. 1, № 6, Личе 1997, р. 417-420), связанные с применением добавок, как, например, полиэтиленгликоль (РЕС), детергенты и другие компоненты, как, например, гексамин кобальта, спермидин и поливинилпирролидон (РУР). В известных альтернативных способах при обработке для разделения суперскрученной и релаксированной форм плазмидной ДНК применяют смолы и растворители, как, например, ацетонитрил, этанол и другие компоненты, как триэтиламин и тетрабутилфосфат аммония.

В случае, когда нуклеиновые кислоты или плазмидную ДНК вводят людям или животным с терапевтической целью, необходима высокоочищенная плазмидная ДНК фармацевтического качества, как таковая, очищенная нуклеиновая кислота должна соответствовать стандартам качества лекарственных препаратов в отношении безопасности, активности и эффективности. Удаление загрязняющих эндотоксинов может являться необходимым, особенно когда плазмидную ДНК очищают от грамотрицательных бактериальных источников с высокими уровнями эндотоксинов. Как правило, данные эндотоксины представляют собой липополисахариды или их фрагменты, являющиеся компонентами наружной мембраны грамотрицательных бактерий, и присутствуют в препарате ДНК клеток-хозяев и мембран клеток

- 14 011554 хозяев или макромолекул. У получающего плазмидную ДНК хозяина они могут вызывать воспалительные реакции, как, например, повышение температуры или сепсис. Следовательно, для терапевтического или профилактического применения удаление эндотоксинов может представлять собой ключевую и необходимую стадию очистки плазмидной ДНК. При удалении эндотоксина из растворов плазмидной ДНК, главным образом, используют отрицательно заряженную структуру эндотоксинов. Однако плазмидная ДНК также отрицательно заряжена и, следовательно, разделения обычно достигают с помощью связывающих обе эти молекулы анионообменных смол и при определенных условиях, предпочтительно элюируют плазмидную ДНК при связывании эндотоксинов. Кроме того, для получения свободных от загрязняющих эндотоксинов нуклеиновых кислот, которые при введении пациенту могут вызвать токсическую реакцию, может быть желательно получение высокоочищенной нуклеиновой кислоты, не содержащей токсичных химикатов, мутагенов, органических растворителей или других реагентов, способных подвергнуть риску безопасность или эффективность полученной нуклеиновой кислоты.

До приготовления плазмидной ДНК в стабильном водном растворе для длительного хранения по настоящему изобретению, плазмидную ДНК предпочтительно очищают посредством сочетания стадий хроматографии, позволяющих получить препарат плазмидной ДНК, содержащий низкие количества, т.е. миллионные доли (м.д.) загрязняющей хромосомной ДНК, РНК, белка и эндотоксинов, и содержащих преимущественно замкнутую кольцевую форму плазмидной ДНК. Более предпочтительно описанные в международной патентной публикации XVО 95/026331 и в международной патентной публикации РСТ/ЕР2005/005213 способы очистки применяют для получения плазмидной ДНК для применений в исследованиях и основанной на плазмидах терапии, как, например, генная терапия и ДНК-вакцина.

Способы очистки включают в себя применение трехспиральной аффинной хроматографии, которой предшествует или за которой следует по меньшей мере один дополнительный способ хроматографии, необязательно или обычно в качестве заключительных стадий очистки или, по меньшей мере, на завершающей стадии или перед завершающей стадией способа очистки плазмиды. Трехспиральную аффинную хроматографию применяют в сочетании с одной или несколькими стадиями хроматографии, как, например, ионообменной хроматографией, хроматографией гидрофобного взаимодействия, гельпроникающей или эксклюзионной хроматографией размеров, хроматографией на гидроксиапатите (тип I и II), с обращенными фазами и аффинной хроматографией. Для применения можно адаптировать любой доступный протокол аффинной хроматографии, предусматривающий разделение нуклеиновых кислот. Можно применять анионообменную хроматографию или любую одну или несколько других применяемых хроматографических стадий или способов, неподвижные фазы, способы вытеснительной хроматографии, способ псевдожидкого слоя и/или непрерывные колонки или системы. Кроме того, можно применять способы или системы высокоэффективной хроматографии, любую одну или несколько стадий или способов.

Таким образом, способ предпочтительно содержит стадии очистки, включающие в себя трехспиральную аффинную хроматографию с дополнительной стадией ионообменной хроматографии и, кроме того, может включать в себя хроматографию гидрофобного взаимодействия или гель-проникающую хроматографию. Стадия ионообменной хроматографии может представлять собой ионообменную хроматографию с движущимся слоем и осевую и/или радиальную анионообменную хроматографию с высоким разрешением. Наиболее предпочтительный способ включает в себя сочетание осуществляемых в указанном порядке стадий ионообменной хроматографии, трехспиральной аффинной хроматографии и хроматографии гидрофобного взаимодействия. Первой хроматографической стадии могут предшествовать фильтрация лизата или другой способ удаления осадка.

Таким образом, непрерывный лизис можно сочетать с перечисленными выше стадиями очистки и давать в результате содержащий пДНК продукт высокой степени чистоты. Его можно сочетать, например, по меньшей мере с одним из способов удаления осадка (как, например, фильтрацией лизата, отстаиванием или центрифугированием), ионообменной хроматографией (как, например, катионной или анионообменной), трехспиральной аффинной хроматографией и хроматографией гидрофобного взаимодействия. По одному из вариантов осуществления изобретения за непрерывным лизисом в указанном порядке следуют анионообменная хроматография, трехспиральная аффинная хроматография и хроматография гидрофобного взаимодействия. За другим непрерывным лизисом в указанном порядке следуют фильтрация лизата, анионообменная хроматография, трехспиральная аффинная хроматография и хроматография гидрофобного взаимодействия. Эти стадии обеспечивают действительно масштабный способ получения плазмиды, с помощью которого можно синтезировать большие количества пДНК с беспрецедентной чистотой. ДНК и РНК, а также белки хозяина присутствуют в диапазоне менее м.д.

В способе также можно применять дополнительные стадии эксклюзионной хроматографии по размерам (8ЕС), хроматографии с обращенными фазами, хроматографии на гидроксиапатите и/или другие доступные хроматографические технологии, способы или системы в сочетании с описанными здесь стадиями по настоящему изобретению.

Для получения более высокой чистоты получаемого продукта пДНК можно удалять осадок. Эту стадию можно применять для удаления осажденного вещества (осадка). Один способ выполнения удаления осадка представляет собой стадию фильтрации лизата, как, например, через сетчатый фильтр от 1 до

- 15 011554 мм и предпочтительно 3,5 мм, за которой в качестве стадии окончательной фильтрации следует глубокая фильтрация. Другие способы выполнения удаления осадка представляют собой центрифугирование или отстаивание.

Для получения более высокой чистоты получаемого продукта пДНК можно выполнять ионообменную хроматографию. Анионный обмен можно выбирать в зависимости от свойств загрязняющих веществ и рН раствора.

Для получения более высокой чистоты получаемого продукта пДНК можно выполнять анионообменную хроматографию. Принципом функционирования анионообменной хроматографии является связывание отрицательно заряженных (или кислотных) молекул с положительно заряженным носителем. Таким образом, применение ионообменной хроматографии позволяет разделить молекулы по их заряду. Посредством данного способа можно легко разделять семейства молекул (кислотные, основные и нейтральные). Можно применять способы ступенчатого элюирования со многими элюируемыми в ранних фракциях загрязняющими веществами и элюированной в более поздних фракциях пДНК. Анионный обмен очень эффективен для удаления белка и эндотоксина из препарата пДНК.

Специалистам в данной области хорошо известны уплотнитель и способ получения такого вещества, а также способ получения, полимеризации и функционирования анионообменной хроматографии и элюирования и разделения плазмидной ДНК для ионообменной хроматографии.

Соединение, применяемое для синтеза основных веществ, служащих уплотнителем для анионообменной хроматографии, может представлять собой любые соединения, если различные проявляющие гидрофобность функциональные группы или различные ионообменные группы можно вводить последующим взаимодействием после синтеза основных веществ.

Примеры монофункциональных мономеров включают в себя стирол, о-галогенметилстирол, м-галогенметилстирол, п-галогенметилстирол, о-галогеналкилстирол, м-галогеналкилстирол, п-галогеналкилстирол, α-метилстирол, α-метил-о-галогенметилстирол, α-метил-м-галогенметилстирол, α-метил-п-галогенметилстирол, α-метил-о-галогеналкилстирол, α-метил-м-галогеналкилстирол, α-метил-п-галогеналкилстирол, о-гидроксиметилстирол, м-гидроксиметилстирол, п-гидроксиметилстирол, о-гидроксиалкилстирол, м-гидроксиалкилстирол, п-гидроксилалкилстирол, α-метил-о-гидроксиметилстирол, α-метил-м-гидроксиметилстирол, α-метил-п-гидроксиметилстирол, α-метил-о-гидроксиалкилстирол, α-метил-м-гидроксиалкилстирол, α-метил-п-гидроксиалкилстирол, глицидилметакрилат, глицидилакрилат, гидроксиэтилакрилат, гидроксиметакрилат и винилацетат.

Наиболее предпочтительные соединения представляют собой замещенные по ароматическому ядру галогеноалкильные группы, галогены, как, например, С1, Вг, I и Р и насыщенные углеводороды с неразветвленной и/или разветвленной цепью с количеством атомов углерода от 2 до 15. Примеры полифункциональных мономеров включают в себя дивинилбензол, тривинилбензол, дивинилтолуол, тривинилтолуол, дивинилнафтален, тривинилнафтален, диметакрилат этиленгликоля, диакрилат этиленгликоля, диметакрилат диэтиленгликоля, диакрилат диэтиленгликоля, метилен-бис-метакриламид и метилен-бисакриламид.

Различные ионообменные группы можно вводить посредством последующего взаимодействия. Получение основного вещества включает в себя первую стадию, где монофункциональный мономер и полифункциональный мономер отвешивают в соответствующем соотношении и применяемые с целью стандартизации пор в образованных частицах точно отвешенный разбавитель или растворитель и аналогичным образом добавляют точно взвешенный инициатор полимеризации с последующим тщательным перемешиванием. Затем смесь подвергают суспензионной полимеризации типа «масло в воде», где смесь добавляют в водный раствор предварительно точно взвешенного растворенного стабилизатора суспензии и формируют масляные капли с целевым размером посредством перемешивания с мешалкой, и при постепенном нагревании смешанного раствора проводят полимеризацию. Для получения мягких частиц основного вещества отношение монофункционального мономера к полифункциональному мономеру, как правило, составляет приблизительно 1 моль монофункционального мономера и приблизительно от 0,01 до 0,2 моль полифункционального мономера. Инициатор полимеризации также конкретно не ограничен и обычно применяют используемые инициаторы азо-бис типа и/или пероксидного типа.

Для предотвращения агрегации среди самих масляных капель также можно применять суспензионные стабилизаторы, как, например, ионные сурфактанты, неионные сурфактанты и полимеры с амфипатическим свойством или их смеси.

Применяемый для ионообменной хроматографии уплотнитель для очистки плазмидных ДНК предпочтительно имеет относительно большой диаметр пор, конкретно в пределах диапазона от 1500 до 4000 А. Для введения ионообменных групп в основные вещества в данной области хорошо известна модификация поверхности.

Для ионообменной хроматографии можно применять два типа элюентов. Можно применять содержащий низкую концентрацию соли первый элюент и содержащий высокую концентрацию соли второй элюент. Способ элюирования состоит в ступенчатом переключении с первого элюента на второй элюент и способе градиентного элюирования, непрерывно меняющем композицию с первого элюента на второй

- 16 011554 элюент. Можно применять буферные растворы и соли, обычно применяемые в данных элюентах для ионообменной хроматографии. Для содержащего низкую концентрацию соли первого элюента особенно предпочтителен водный раствор с концентрацией буфера от 10 до 50 мМ и значение рН от 6 до 9. Для содержащего высокую концентрацию соли второго элюента особенно предпочтителен водный раствор с добавленной от 0,1 до 2 М солью натрия в элюент С. В отношении солей натрия - можно применять хлорид натрия и сульфат натрия.

Кроме того, для ингибирования деградации плазмид из-за разрушающих ДНК ферментов в лизате ЕксЕепсЫа сой для двухвалентного иона металла можно применять хелатирующий агент, как, например, этилендиаминтетрауксусная кислота. Концентрация хелатирующего агента для двухвалентного иона металла предпочтительно составляет от 0,1 до 100 мМ.

Для применения по настоящему изобретению приемлем широкий диапазон коммерчески доступных анионообменных матриц в качестве неограничивающих примеров, включающих в себя матрицы, доступные из РОК.О8 Άηίοη Ехсйаиде Кс81И8, Οίαβοη. Тою Наак, 8!егодеие, 8рйегобех, Ыискорас и Рйагтааа. Например, колонку (Рою II Р1/М, 4.5 ммх100) исходно уравновешивают 20 мМ В18/ТП8 Ргораие при рН 7,5 и 0,7 М №1С1. Образец наносят на колонку и промывают тем же исходным буферным раствором. Затем наносят градиент элюции от 0,5 до 0,85 М №101 приблизительно в 25 объемах колонки и собирают фракции. Предпочтительная анионообменная хроматография включает в себя Егас!оде1 ТМАЕ Н1Сар.

Трехспиральная аффинная хроматография описана, среди прочего, в патентах США 6319672, 6287762, а также в опубликованной международной патентной заявке \¥О 02/77274 изобретателя.

Трехспиральная аффинная хроматография основана на специфичной гибридизации олигонуклеотидов и целевой последовательности в двухспиральной ДНК. Данные олигонуклеотиды могут содержать следующие основания:

тимидин (Т), способный к образованию триплетов с дуплетами А.Т двухспиральной ДНК (Ка)адора1 е! а1., Вюсйеш 28 (1989), 7859);

аденин (А), способный к образованию триплетов с дуплетами А.Т двухспиральной ДНК; гуанин (О), способный к образованию триплетов с дуплетами О.С двухспиральной ДНК; протонированный цитозин (С⁺), способный к образованию триплетов с дуплетами О.С двухспиральной ДНК (Ка)адора1 е! а1., 1ос. сй.);

урацил (И), способный к образованию триплетов с парами оснований А.и или А.Т.

Предпочтительно применяемый олигонуклеотид содержит богатую цитозином гомопиримидиновую последовательность, а представленная в ДНК специфичная последовательность представляет собой гомопурин-гомопиримидиновую последовательность. Присутствие цитозинов позволяет получить тройную спираль, стабильную при кислом рН, где цитозины протонированы, и дестабилизированную при щелочном рН, где цитозины нейтрализованы.

Олигонуклеотид и представленная в ДНК специфичная последовательность предпочтительно комплементарны для обеспечения образования тройной спирали. Наилучшие выходы и наилучшую селективность можно получать при применении полностью комплементарных олигонуклеотида и специфичной последовательности. Например, олигонуклеотид поли (СТТ) и специфичная последовательность поли (ОАА). Предпочтительные олигонуклеотиды имеют последовательность 5'-ОАООСТТСТТСТТСТТСТТСТТСТТ-3' (6Л60(СТТ) )(8ЕО ГО № 1), в которой основания ОАОО не образуют тройную спираль, но позволяют отделить олигонуклеотид от соединяющей связи; последовательность (СТТ)7. Данные олигонуклеотиды способны к образованию тройной спирали с содержащей комплементарные звенья (ОАА) специфичной последовательностью. Рассматриваемая последовательность может, в частности, представлять собой содержащую 7, 14 или 17 звеньев ОАА область, как описано в примерах.

Еще одна представляющая особый интерес последовательность является последовательностью 5'-ААОООАОООАООАОАООАА-3' (8ЕО Ш № 2).

Эта последовательность образует тройную спираль с олигонуклеотидами 5'-ААООАОАООАОООАОООАА-3' (8ЕО Ш № 3) или 5'-ТТООТОТООТОООТОООТТ-3' (8ЕО Ш № 4). В данном случае олигонуклеотид связывается в антипараллельной ориентации с полипуриновой цепью. Эти тройные спирали устойчивы только в присутствии Мд^ (Уакциех е! а1., Вюсйетзкйу, 1995, 34, 72437251; Веа1 аиб Оегуаи, 8с1еисе, 1991, 251, 1360-1363).

Как указано выше, специфичная последовательность может представлять собой встречающуюся в природе в двухспиральной ДНК последовательность или синтетическую последовательность, искусственно введенную в последнюю. Особенно предпочтительно применять олигонуклеотид, способный к образованию тройной спирали со встречающейся в природе в двухспиральной ДНК последовательностью, например, в точке начала репликации плазмиды или в маркерном гене. В этом отношении, из анализа последовательности известно, что некоторые области этих ДНК, в особенности в точке начала репликации, могут иметь гомопурин-гомопиримидиновые области. Синтез способных к образованию тройных спиралей с этими природными гомопурин-гомопиримидиновыми областями олигонуклеотидов успешно позволяет применять способ по изобретению к не модифицированным плазмидам, в особенности коммерческим плазмидам рИС, рВК.322, р8У и т.п. типа. Среди встречающихся в природе в двухспи

- 17 011554 ральной ДНК гомопурин-гомопиримидиновых последовательностей можно указать последовательность, содержащую всю или часть присутствующей в точке начала репликации Е.со11 плазмиды Со1Е1 последовательности 5'-СТТССССААСССАСАААСС-3' (БЕЦ ГО № 5). В данном случае образующий тройную спираль олигонуклеотид имеет последовательность 5'-СААССССТТСССТСТТТСС-3' (БЕЦ ГО № 6) и альтернативно связывается с двумя цепями двойной спирали, как описано у Веа1 апб Оегуап (I. Ат. Сйет. Бос. 1992, 114, 4976-4982) и Дауакеиа апб 1о11пк1оп (Ыис1е1с Ашбк Кек. 1992, 20, 5279-5288). Также можно указать последовательность гена β-лактамазы 5'-САААААССААСАС-3' (БЕЦ ГО № 7) плазмиды рВК322 (Пиуа1-Уа1епйи е! а1., Ргос. ЫаИ. Аса6. БсЕ ИБА, 1992, 89, 504-508).

В точках начала репликации плазмид Со1Е1, а также плазмид рСОК идентифицированы подходящие целевые последовательности, способные к образованию тройных структур с конкретными олигонуклеотидами. Плазмиды рСОК представляют собой плазмиды с условным ориджином репликации и, среди прочего, описаны в ИБ 2004/142452 и ИБ 2003/161844. Полученные из Со1Е1 плазмиды содержат 12-членную гомопуриновую последовательность (5'-АСАААААААССА-3') (БЕЦ ГО № 8), картированную перед транскриптом РНК-11, вовлеченным в репликацию плазмиды (Еаса1епа е! а1., 1981, Ыа1иге, 294, 623). Эта последовательность образует стабильную тройную структуру с 12-членным комплементарным олигонуклеотидом 5'-ТСТТТТТТТССТ-Б' (БЕЦ ГО № 9). Цепь рСОК содержит гомопуриновый участок из 14 не повторяющихся оснований (5'-АА6АААААААА6АА-3') (БЕЦ ГО № 10), расположенных в богатом А+Т сегменте γ точки начала репликации рСОК (Ееусйепко е! а1., 1996, ЫисШс Ас16к Кек., 24, 1936). Эта последовательность образует стабильную тройную структуру с 14-членным комплементарным олигонуклеотидом 5'-ТТСТТТТТТТТСТТ-3' (БЕЦ ГО № 11). Соответствующие олигонуклеотиды 5'-ТСТТТТТТТССТ-3' (БЕР ГО № 8) и 5'-ТТСТТТТТТТТСТТ-3' (БЕС) ГО № 11) эффективно и специфически метят свои соответствующие расположенные в точке начала репликации Со1Е1 оп или рСОК (оп·/) комплементарные последовательности. Фактически отдельная неканоническая триада (Т*СС или С*АТ) может приводить к полной дестабилизации тройной структуры.

Применение олигонуклеотида, способного к образованию тройной спирали с представленной в точке начала репликации или маркерном гене последовательностью, особенно выгодно, так как позволяет с одним и тем же олигонуклеотидом очищать любую ДНК, содержащую указанную ориджин репликации или указанный маркерный ген. Следовательно, нет необходимости модифицировать плазмиду или двухспиральную ДНК для того, чтобы ввести в нее синтетическую специфичную последовательность.

Хотя предпочтительны полностью комплементарные последовательности, тем не менее, понятно, что между последовательностью олигонуклеотида и представленной в ДНК последовательностью могут быть допустимы некоторые несоответствия, при условии, что они не приводят к слишком сильной потере аффинности. Можно указать представленную в гене β-лактамазы Е.соН последовательность 5'-АААААА666ААТАА666-3' (БЕЦ ГО № 12). В данном случае разрывающий полипуриновую последовательность тимин может узнать гуанин третьей цепи, тем самым образуя триплет С*ТА, стабильный в случаях, когда фланкирован двумя триплетами Т*АТ (К1екк1тд е! а1., ВюсйетШгу, 1992, 31, 28292834).

По конкретному варианту осуществления олигонуклеотиды по изобретению содержат последовательность (ССТ)п, последовательность (СТ)п или последовательность (СТТ)п, где п представляет собой целое число между 1 и 15 включительно.

Особенно выгодно применять последовательности типа (СТ)_п или (СТТ)_п. Фактически изобретатели показали, что выход после очистки зависит от количества С в олигонуклеотиде. Конкретно, как показано в примере 7, выход после очистки повышается, если олигонуклеотид содержит меньше цитозинов. Следует понимать, что олигонуклеотиды по изобретению также могут сочетать звенья (ССТ), (СТ) или (СТТ).

Применяемый олигонуклеотид может являться природным (состоящим из не модифицированных природных оснований) или химически модифицированным. Конкретно, олигонуклеотид может предпочтительно иметь определенные химические модификации, обеспечивающие ему устойчивость или его защиту против нуклеаз или повышающие его аффинность к специфичной последовательности. Также понятно, что олигонуклеотид означает любую сцепленную последовательность нуклеозидов, подверженную модификации структуры с целью сделать ее более устойчивой к нуклеазам. Среди возможных модификаций можно указать олигонуклеотидные фосфоротиоаты, способные к образованию тройных спиралей с ДНК (Хобо е! а1., ЫисШс Ас16к Кек., 1994, 22, 3322-3330), а также олигонуклеотиды, содержащие скелеты с формацеталем или метилфосфонатом (МаИеисс! е! а1., I. Ат. Сйет. Бос, 1991, 113, 7767-7768). Также можно применять синтезированные с α-аномерами нуклеотидов олигонуклеотиды, также образующие тройные спирали с ДНК (Бе Эоап е! а1., ЫисШс Ашбк Кек., 1987, 15, 7749-7760). Еще одна модификация скелета представляет собой фосфорамидатную связь. Например, можно указать описанную у Сгуахпоу апб Сйеп межнуклеотидную фосфорамидатную связь Ν³-Ρ⁵, дающую олигонуклеотиды, образующие особенно стабильные тройные спирали с ДНК (I. Ат. Сйет. Бос., 1994, 116, 3143-3144). Среди других модификаций скелета также можно указать применение рибонуклеотидов 2'-О-метилрибозы, фосфодиэфира и т.д. (Бип апб Не1епе, Сигг. Оршюп Б1гис1. Вю1., 116, 3143-3144). Наконец, скелет на ос

- 18 011554 нове фосфора можно замещать полиамидным остовом, как в ПНК (пептидных нуклеиновых кислотах), также способных к образованию тройных спиралей (Мекеп с1 а1., 8с1епсе, 1991, 254, 1497-1500; К1т е1 а1., 1. Ат. Сйет. Зос., 1993, 115, 6477-6481), или скелетом на основе гуанидина, как в ДНГ (дезоксирибонуклеиновый гуанидин, Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А, 1995, 92, 6097-6101), или также образующими тройные спирали поликатионными аналогами ДНК.

Также можно замещать тимин третьей цепи 5-бромурацилом, повышающим аффинность олигонуклеотида к ДНК (Роч81с апб Эегуап. 1. Ат. Сйет. 8ос., 1989, 111, 3059-3061). Третья цепь также может содержать неприродные основания, среди которых можно указать 7-деаза-2'-дезоксиксантозин (МбИдап е1 а1., №.1с1е1с Ас1бк Кек., 1993, 21, 327-333), 1-(2-дезокси-3-Э-рибофуранозил)-3-метил-5-амино-1Нпиразол[4,3-б]пиримидин-7-он (Кой апб Эегуап, 1. Ат. Сйет. 8ос, 1992, 114, 1470-1478), 8-оксоаденин, 2-аминопурин, 2'-О-метилпсевдоизоцитидин или любую другую известную специалисту в данной области модификацию (для ознакомления см. 8ип апб Не1епе, Сшт. Ор1шоп 81гис1. Вю1., 1993, 3, 345-356).

Еще один тип модификации олигонуклеотида имеет целью более конкретное усиление взаимодействия и/или аффинности между олигонуклеотидом и специфичной последовательностью. Конкретно, наиболее выгодная модификация по изобретению состоит в метилировании цитозинов олигонуклеотида. Таким образом, метилированный олигонуклеотид демонстрирует заслуживающее внимания свойство образования тройной спирали со специфичной последовательностью в близких к нейтральному (>5) диапазонах рН. Следовательно, это позволяет работать при более высоких значениях рН, чем для олигонуклеотидов предшествующей области, т. е. при значениях рН, где риски деградации плазмидной ДНК намного меньше.

Длина применяемого в способе по изобретению олигонуклеотида составляет между 5 и 30. Предпочтительно применять олигонуклеотид с длиной более 10 оснований. Для получения желаемой селективности и стабильности взаимодействия специалист в данной области может адаптировать длину для каждого конкретного случая.

Олигонуклеотиды по изобретению можно синтезировать при помощи любого известного способа. Конкретно их можно получать с использованием синтезатора нуклеиновых кислот. Совершенно очевидно, что можно применять любой другой известный специалисту в данной области способ.

Для обеспечения ковалентного связывания с носителем олигонуклеотид, как правило, функционализуют. Таким образом, его можно модифицировать тиоловой, аминной или карбоксильной концевой группой в положении 5' или 3'. Конкретно, добавление тиоловой, аминной или карбоксильной группы делает возможным, например, связывание олигонуклеотида с носителем, несущим дисульфидную, малеимидную, аминную, карбоксильную, сложноэфирную, эпоксидную, бромциановую или альдегидную функциональные группы. Такие сшивки образуются посредством введения дисульфидных, тиоэфирных, сложноэфирных, амидных или аминных связей между олигонуклеотидом и носителем. Можно применять любой другой известный специалисту в данной области способ, такой как, например, бифункциональные связывающие реагенты.

Кроме того, для улучшения гибридизации со связанным олигонуклеотидом для олигонуклеотида может быть выгодно содержание «плечевой» и «спейсерной» последовательности оснований. Применение плеча фактически позволяет связать олигонуклеотид на выбранном расстоянии от носителя, способствуя улучшению условий его взаимодействия с ДНК. Предпочтительно плечо состоит из неразветвленной углеродной цепи, содержащей от 1 до 18 и предпочтительно 6 или 12 групп (СН₂), и обеспечивает связывание с колонкой амина. Плечо связано с фосфатом олигонуклеотида или «спейсера», состоящего из не препятствующих гибридизации оснований. Таким образом, «спейсер» может содержать пуриновые основания. В качестве примера «спейсер» может содержать последовательность САСС. Плечо предпочтительно состоит из содержащей 6 или 12 атомов углерода неразветвленной углеродной цепи.

Для удаления РНК и геномной ДНК очень эффективна триплексная аффинная хроматография. Они могут представлять собой функционализованные хроматографические носители без упаковки или предварительно заправленные в колонку, функционализованные пластиковые поверхности или функционализованные латексные сферы, магнитные или др. Предпочтительно применяют хроматографические носители. В качестве примера приемлемые для применения хроматографические носители представляют собой агарозу, акриламид или декстран, а также их производные (такие как Зерйабех, Зерйагоке, Зирегоке и др.), полимеры, такие как, например, поли(стиролдивинилбензол) или привитой или непривитой оксид кремния. Хроматографические колонки можно использовать в диффузионном или перфузионном режиме.

Для получения более высоких выходов после очистки особенно выгодно применять плазмидную последовательность, содержащую несколько точек гибридизации с олигонуклеотидом. Фактически присутствие нескольких точек гибридизации активирует взаимодействия между указанной последовательностью и олигонуклеотидом, что приводит к повышению выходов после очистки. Таким образом, для содержащего п повторов фрагментов (ССТ), (СТ) или (СТТ) олигонуклеотида предпочтительно применять последовательность ДНК, содержащую по меньшей мере п комплементарных мотивов, а предпочтительно п+1 комплементарный мотив. Таким образом, несущая п+1 комплементарный мотив последовательность представляет две точки гибридизации с олигонуклеотидом. Предпочтительно последова

- 19 011554 тельность ДНК содержит до 11 точек гибиридизации, т.е. п+10 комплементарных мотивов.

Способ по настоящему изобретению можно применять для очистки любого типа двухспиральной ДНК. Примером последней является кольцевая ДНК, как, например, плазмида, как правило, включающая в себя один или несколько генов терапевтического значения. Эта плазмида также может включать в себя ориджин репликации, маркерный ген и т.п. Способ по изобретению можно выполнять непосредственно в клеточном лизате. По данному варианту осуществления амплифицированную трансформацией с последующим культивированием клеток плазмиду очищают сразу после лизиса клеток. Также способ по изобретению можно выполнять в очищенном лизате, т.е. в полученной после нейтрализации и центрифугирования клеточного лизата надосадочной жидкости. Достаточно очевидно, что также его можно выполнять в предварительно очищенном известными способами растворе. Этот способ также позволяет очищать включающую в себя важную последовательность линейную или кольцевую ДНК от смеси, содержащей ДНК с различными последовательностями. Способ по изобретению также можно применять для очистки двухспиральной ДНК.

Клеточный лизат может представлять собой лизат прокариотических или эукариотических клеток.

Что касается прокариотических клеток, в качестве примеров можно указать бактерии Ε.οοίί. В.киЬ1Ϊ1Ϊ8, 8.1урЫтит1ит или 81геротусе§. Относительно эукариотических клеток можно указать клетки животных, дрожжей, грибов и т.п. , и главным образом дрожжей К1цууеготусе§ или Зассйаготусек, или клетки СО8, СНО, С127, ΝΙΗ3Τ3 и т.п.

Для получения более высокой степени очистки конечного продукта пДНК можно применять способ по настоящему изобретению, включающий в себя, по меньшей мере, стадию триплексной аффинной хроматографии. При триплексной аффинной хроматографии олигонуклеотид связывают с носителем, таким как хроматографическая смола или другая матрица. После этого подвергаемый очистке образец смешивают со связанным олигонуклеотидом, как, например, нанесением образца на хроматографическую колонку, содержащую связанный с хроматографической смолой олигонуклеотид. Желаемая плазмида в образце связывается с олигонуклеотидом с образованием триплекса. Связи между олигонуклеотидом и плазмидой могут представлять собой Хугстэновские взаимодействия. Такой переход может происходить при рН<5, при высокой солевой концентрации, при времени взаимодействия от 20 мин или более. Можно применять стадию отмывки. Наконец, в нейтральном буферном растворе происходит депротонирование цитозина с элюированием плазмиды из олигонуклеотидсвязанной смолы.

В хроматографии гидрофобного взаимодействия для привлечения гидрофобных участков в молекулах образца для очистки используются гидрофобные вещества на субстрате. Следует заметить, что данные носители Н1С работают при помощи эффекта «кластеризации»; в случае связывания этих молекул образуются или распределяются нековалентные или ионные связи.

Хроматография гидрофобного взаимодействия полезна, так как очень эффективно удаляет открытые кольцевые плазмидные формы и другие загрязняющие вещества, как, например, гДНК, РНК и эндотоксин.

Синтез основных веществ для хроматографии гидрофобного взаимодействия, а также способ получения, полимеризации и функционализирования хроматографии гидрофобного взаимодействия и элюирования и разделения плазмидной ДНК посредством него хорошо известны в данной области и, среди прочего, описаны в патенте США № 6441160, включенном сюда в виде ссылки.

Применяемые для синтеза основных веществ соединения, служащие уплотнителем при хроматографии гидрофобного взаимодействия, могут представлять собой любые соединения, если различные проявляющие гидрофобность функциональные группы или различные ионообменные группы можно вводить последующим взаимодействием после синтеза основных веществ.

Примеры монофункциональных мономеров включают в себя стирол, о-галогенметилстирол, м-галогенметилстирол, п-галогенметилстирол, о-галогеналкилстирол, м-галогеналкилстирол, п-галогеналкилстирол, α-метилстирол, α-метил-о-галогенметилстирол, α-метил-м-галогенметилстирол, α-метил-п-галогенметилстирол, α-метил-о-галогеналкилстирол, α-метил-м-галогеналкилстирол, α-метил-п-галогеналкилстирол, о-гидроксиметилстирол, м-гидроксиметилстирол, п-гидроксиметилстирол, о-гидроксиалкилстирол, м-гидроксиалкилстирол, п-гидроксилалкилстирол, α-метил-огидроксиметилстирол, α-метил-м-гидроксиметилстирол, α-метил-п-гидроксиметилстирол, α-метил-огидроксиалкилстирол, α-метил-м-гидроксиалкилстирол, α-метил-п-гидроксиалкилстирол, глицидилметакрилат, глицидилакрилат, гидроксиэтилакрилат, гидроксиметакрилат и винилацетат.

Наиболее предпочтительные соединения представляют собой замещенные по ароматическому ядру галогеноалкильные группы, галогены, как, например, С1, Вг, I и Р, и насыщенные углеводороды с неразветвленной и/или разветвленной цепью с количеством атомов углерода от 2 до 15.

Примеры полифункциональных мономеров включают в себя дивинилбензол, тривинилбензол, дивинилтолуол, тривинилтолуол, дивинилнафтален, тривинилнафтален, диметакрилат этиленгликоля, диакрилат этиленгликоля, диметакрилат диэтиленгликоля, диакрилат диэтиленгликоля, метилен-бисметакриламид и метилен-бис-акриламид.

Различные гидрофобные функциональные группы или различные ионообменные группы можно

- 20 011554 вводить посредством последующего взаимодействия. Для минимизации влияния на желаемые для разделения целевые продукты, обусловленного гидрофобностью, проявляемой самим основным веществом, или увеличения или сокращения основного вещества из-за изменения солевой концентрации и изменения значения рН, основное вещество предпочтительно получают с применением относительно гидрофильных мономеров, таких как глицидилметакрилат, глицидилакрилат, гидроксиэтилакрилат, гидроксиметилакрилат и винилацетат. Получение основного вещества включает в себя первую стадию, где монофункциональный и полифункциональный мономеры отвешивают в соответствующем соотношении и применяемые с целью стандартизации пор в образованных частицах точно отвешенный разбавитель или растворитель и аналогичным образом добавляют точно взвешенный инициатор полимеризации с последующим тщательным перемешиванием. Затем смесь подвергают суспензионной полимеризации типа «масло в воде», где смесь добавляют в водный раствор предварительно точно взвешенного растворенного стабилизатора суспензии и формируют масляные капли с целевым размером посредством перемешивания с мешалкой, и при постепенном нагревании смешанного раствора проводят полимеризацию.

Для получения мягких частиц основного вещества отношение монофункционального мономера к полифункциональному мономеру, как правило, составляет приблизительно 1 моль монофункционального мономера и приблизительно от 0,01 до 0,2 моль полифункционального мономера. Для получения жестких частиц основных веществ отношение полифункционального мономера можно увеличивать приблизительно от 0,2 до 0,5 моль. Для получения еще более жестких частиц можно применять только полифункциональный мономер.

Инициатор полимеризации также конкретно не ограничен и обычно применяют используемые инициаторы азо-бис типа и/или пероксидного типа.

Для предотвращения агрегации среди самих масляных капель также можно применять суспензионные стабилизаторы, как, например, ионные сурфактанты, неионные сурфактанты и полимеры с амфипатическим свойством или их смеси.

Диаметр образованных частиц, как правило, составляет приблизительно от 2 до 500 мкм. Предпочтительный диаметр частиц составляет от 2 до 30 мкм и более предпочтительно приблизительно от 2 до 10 мкм. В случае необходимости очистки большого количества нуклеиновых кислот с высокой степенью чистоты диаметр частиц составляет приблизительно от 10 до 100 мкм, а при отделении целевого продукта от неочищенного маточного раствора он может составлять от 100 до 500 мкм, более предпочтительно приблизительно от 200 до 400 мкм. Для стандартизации диаметра частиц можно подбирать скорость вращения мешалки во время полимеризации. В случае необходимости частиц с небольшим диаметром количество вращений можно увеличивать и если желательны большие частицы, количество вращений можно снижать. В данной работе особенно важен выбор растворителя, так как применяемый растворитель используют для стандартизации пор в образованных частицах. В качестве основной концепции для применяемого для полимеризации растворителя корректировку выполняют различным сочетанием слабого растворителя для мономера с хорошим растворителем для мономера. Размер диаметра пор можно выбирать, соответственно, в зависимости от размера предназначенных для разделения молекул нуклеиновых кислот, но он предпочтительно находится в диапазоне от 500 до 4000 А для уплотнителя для хроматографии гидрофобного взаимодействия и в диапазоне от 1500 до 4000 А для уплотнителя для ионообменной хроматографии.

В хроматографии гидрофобного взаимодействия для отделения нуклеиновых кислот с различной гидрофобностью предпочтительно применение уплотнителей с различной гидрофобностью, соответственно, важна модификация поверхности основного вещества.

Гидрофобные группы можно выбрать из длинноцепочечных или разветвленных групп, включающих в себя насыщенные углеводородные группы или ненасыщенные углеводородные группы с количеством атомов углерода от 2 до 20. Углеводородная группа также может содержать ароматическое ядро.

Гидрофобные группы также могут быть выбраны из соединений со следующей формулой:

Основные вещества

где η равно от 0 до приблизительно 20 и метиленовая группа может представлять собой неразветвленную или разветвленную цепь;

т равно от 0 до приблизительно 3, а углеводородная группа может представлять собой неразветвленную или разветвленную цепь;

А представляет собой С=О-группу или простую эфирную группу, но метиленовая группа может быть связана с основным веществом без А.

Гидрофобные группы, кроме того, могут включать в себя простую эфирную группу алкиленгликоля с количеством атомов углерода от 2 до 20, состоящую из от 0 до 10 повторяющихся звеньев, где взаимодействующий с основным веществом противоположный конец функциональной группы может представлять собой уходящую так ОН-группу или может перекрываться с алкильной группой с количеством атомов углерода от 1 до 4.

- 21 011554

Для модификации поверхности описанные выше гидрофобные группы можно применять отдельно или в смеси.

Цепь алкильных групп с количеством атомов углерода от 6 до 20 углеродных атомов предпочтительна для плазмид с низкой гидрофобностью; длинная цепь алкильных групп с количеством атомов углерода от 2 до 15 - для выделения соединений с высокой гидрофобностью, как, например, полученная из ЕкеНепеЫа со11 РНК и РНК в клетках человека и животных; алкильные группы с количеством атомов углерода от 4 до 18 - для выделения соединений с относительно низкой гидрофобностью, как, например, полученные из ЕксНепсЫа сой ДНК и ДНК в клетках человека и животных.

При отделении этих соединений соединения для модификации поверхности можно выбирать соответствующим образом, не ограничиваясь указанным примером. Фактически, степень гидрофобности уплотнителя варьирует в зависимости от концентрации соли в среде или концентрации соли в элюенте для адсорбции. Кроме того, степень гидрофобности уплотнителя отличается в зависимости от количества введенной в основное вещество групп.

Диаметр пор основного вещества для хроматографии гидрофобного взаимодействия особенно предпочтительно составляет от 500 до 4000 А, но он может быть выбран соответствующим образом из указанного диапазона в зависимости от размера молекул желаемых для отделения нуклеиновых кислот. Обычно, так как удержание нуклеиновых кислот на уплотнителе и адсорбционная способность (выход образца) отличаются в зависимости от диаметра пор, для нуклеиновых кислот с большим размером молекул предпочтительно применять основное вещество с большим диаметром пор и для нуклеиновых кислот с небольшим размером молекул - основное вещество с небольшим диаметром пор.

Например, стирольное основное вещество может взаимодействовать с гидрофобной группой, содержащей длинную цепь алкильных групп, применяя галогенсодержащее соединение и/или карбонилгалогенид и катализатор, как, например, ЕеС1₃, 8иС1₂ или А1С1₃, а применяя реакцию Фриделя-Крафтса, может быть добавлено непосредственно в ароматическое ядро в основное вещество, как, например, дегалогенированное соединение и/или ацилированное соединение. Функциональную группу можно ввести посредством простой эфирной связи в случае основного вещества, представляющего собой содержащую галогенную группу фракцию, например, с применением соединений с содержащейся в вводимой функциональной группе ОН, как, например, бутанол, и с применением реакции Вильямсона с щелочным катализатором, таким как ΝαΟΗ или КОН. В случае желательной для введения функциональной группы, представляющей собой соединение, содержащее аминогруппу, как, например, гексиламин, можно добавлять с применением щелочного катализатора, такого как №1ОН или КОН, и применяя кислую реакцию дегалогенирования. В случае содержащего ОН-группу основного вещества, наоборот, при введении эпоксигруппы, галогенной группы или карбонилгалогенидной группы предварительно в желательную для введения функциональную группу можно вводить функциональную группу посредством простой эфирной или сложноэфирной связи. Можно вводить функциональную группу посредством простой эфирной или аминной связи в случае содержащего эпоксигруппу основного вещества, при взаимодействии с соединением с ОН-группой или аминогруппой, содержащейся в желательной для введения функциональной группе. Кроме того, в случае желательной для введения функциональной группы, содержащей галогенную группу, можно вводить функциональную группу посредством простой эфирной связи с применением кислотного катализатора. Так как часть вводимой в основное вещество функциональной группы находится под влиянием гидрофобности желательного для отделения представленного продукта, ее нельзя сокращать, но обычно является пригодным связующий материал с приблизительно от 0,05 до 4,0 ммоль добавленной функциональной группой на 1 г сухого основного вещества.

В отношении модификации поверхности способ добавления функциональной группы посредством последующего взаимодействия после образования основного вещества или частиц представляет собой описанный способ. Модификацию поверхности проводят по тому же самому способу, где основное вещество формируют после полимеризации с применением мономеров с добавленными до полимеризации указанными функциональными группами.

Основное вещество также может представлять собой пористый силикагель. Способ получения силикагеля включает в себя присоединение силана с применением соединения, как, например, алкилтриметоксисилан непосредственно на частицы, полученные способому, описанному в «Ьа1е81 Н1дй-8реей ί-ίςшй СйготаФдгарйу», р. 289 ίί. (\\тЦ1еп Ьу ТокЫо №ипЬага апй Νοόιιο 1кеда^а, риЬНккей Ьу Токуо Нпока\\'а ВооккФге ίη 1988). До или после присоединения силана с применением связующего вещества содержащего эпоксигруппу силана можно добавлять функциональную группу по указанному выше способу. Приемлемой является часть функциональной группы, введенная приблизительно от 0,05 до 4,0 ммоль функциональной группы, добавленной на 1 г сухого основного вещества.

В разделении хроматографией гидрофобного взаимодействия или на стадии очистки применяют элюенты. Как правило, применяют два типа элюентов. Один элюент содержит высокую концентрацию соли, тогда как второй элюент содержит низкую концентрацию соли. Способ элюирования включает в себя ступенчатое переключение с элюента с высокой концентрацией соли на элюент с низкой концентрацией соли и можно применять способ градиентного элюирования, непрерывно переключающий композицию с одного элюента на другой. Можно применять буферные растворы и соли, обычно применяе

- 22 011554 мые для хроматографии гидрофобного взаимодействия. Относительно содержащего высокую концентрацию соли элюента особенно предпочтителен водный раствор с солевой концентрацией от 1,0 до 4,5 М и значением рН от 6 до 8. Относительно содержащего низкую концентрацию соли элюента особенно предпочтительные соли представляют собой водный раствор с солевой концентрацией от 0,01 до 0,5 М и значением рН от 6 до 8. Как правило, в качестве солей можно применять сульфат аммония и сульфат натрия.

Стадию очистки хроматографии гидрофобного взаимодействия плазмидной ДНК можно проводить, последовательно комбинируя связующий материал с введенной функциональной группой со слабой гидрофобностью со связующим материалом с введенной функциональной группой с сильной гидрофобностью. Фактически, культуральная среда ЕзсйепсЫа сой содержит в большом количестве различные отличающиеся по гидрофобности компоненты, как, например, полисахариды, гДНК ЕзсйепсЫа сой, плазмидные РНК и белки. Также известно, что существуют различия по гидрофобности даже среди самих нуклеиновых кислот. Становящиеся загрязняющими примесями белки имеют более высокую гидрофобность по сравнению с плазмидами.

Многие смолы для хроматографии гидрофобного взаимодействия, такие как 1тас1оре1 ргору1, Тоуореаг1, 8оигсе 1§оргору1 или любые другие смолы с гидрофобными группами, коммерчески доступны. Наиболее предпочтительные смолы представляют собой объемные полимерные вещества Тоуореаг1. Тоуореаг1 представляет собой метакриловый полимер с высокой механической и химической стабильностью. Смолы пригодны в виде не функционализованных смол серии 11\С, а при помощи химии поверхности для ионообменной хроматографии или хроматографии гидрофобных взаимодействий можно получать производные. Можно применять четыре типа смол Тоуореаг1 ШС с различной химией поверхности и уровнями гидрофобности. Гидрофобность смол Тоуореаг1 ШС повышается по сериям: Е1йег, Рйепу1, Ви1у1 и Неху1. Структуры предпочтительных смол Тоуореаг1 ШС, т.е. Тоуореаг1 11\\'-65, с диаметром пор 1000 А показаны ниже:

Описанные выше смолы Тоуореаг1 могут иметь различный класс крупности частиц. Тоуореаг1 650С имеет размер частицы приблизительно от 50 до 150 мкм, предпочтительно приблизительно 100 мкм, тогда как Тоуореаг1 650М имеет размер частицы приблизительно от 40 до 90 мкм, предпочтительно приблизительно 65 мкм, а Тоуореаг1 6508 имеет размер частицы приблизительно от 20 до 50 мкм, предпочтительно приблизительно 35 мкм. Хорошо известно, что размер частиц влияет на выделение, т.е. выделение улучшается от С к М и к 8 классу крупности частиц и таким образом увеличивается при уменьшении размеров частиц. Наиболее предпочтительную смолу Тоуореаг1, применяемую в стадии ШС хроматографии в процессе отделения и очистки плазмидной ДНК по настоящему изобретению, представляет Тоуореаг1 Ьи1уГ6508, запущенный в серийное производство Тозой Вюзс1епсе.

Можно выполнять дополнительную стадию диафильтрации. В данной области известны приемлемые для применения в данном способе по стандартным методикам традиционные, коммерчески доступные вещества для диафильтрации. Предпочтительный способ диафильтрации представляет собой диафильтрацию с применением ультрафильтрующей мембраны с пределом исключения молекулярного веса в диапазоне от 30000 до 50000 в зависимости от размера плазмиды. Эта стадия диафильтрации предусматривает замену буфера, а затем определяют концентрацию. Элюат 3-4-кратно концентрируют посредством тангенциальной фильтрации потока (предел исключения мембраны 30 кДа) до целевой концентрации приблизительно от 2,5 до 3,0 мг/мл, и концентрат представляет собой замененный диафильтрацией буфер при постоянном объеме 10 объемами физиологического раствора и подобран для целевой плазмидной концентрации с физиологическим раствором.

Концентрацию плазмидной ДНК вычисляют, исходя из поглощения при 260 нм образцов концентрата. Раствор плазмидной ДНК фильтруют через 0,2 мкм мембранный фильтр и делят на несколько аликвот, которые хранят в контейнерах в холодной комнате при 2-8°С до последующей обработки. Это дает очищенный концентрат с плазмидной ДНК, концентрация суперскрученной плазмиды составляет приблизительно 70, 75, 80, 85, 90, 95 и предпочтительно 99%. Предельное получение плазмиды при помощи

- 23 011554 этого способа составляет по меньшей мере 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 и 80% со средним выходом 60%.

Подобную стадию диафильтрации проводят в соответствии со следующими условиями: применяют буфер для стадии (а) и для стадии (Ь):

ί) первая диафильтрация (стадия (а)) против 12,5-13,0 объемов 50 мМ Тгй/НО. 150 мМ ЫаС1, рН 7,4 (обозначен буфер Ι) и ίί) выполнение второй диафильтрации концентрата из указанной выше стадии (а) (стадия (Ь)) против 3,0-3,5 объемов солевого носителя (150 мМ ЫаС1).

Это предпочтительная стадия диафильтрации по настоящему изобретению эффективно и тщательно удаляет сульфат аммония и тщательно ЭДТА. Кроме того, после этих стадий диафильтрации получают соответствующую физиологическую концентрацию №1С1 (приблизительно 150 мМ) и конечную концентрацию Тп8 ниже 1 мМ (между 200 мкМ и 1 мМ).

Предпочтительно применяемая композиция плазмидной ДНК содержит очищенную практически свободную от загрязняющих веществ или с содержанием загрязняющих веществ в диапазоне менее м.д. плазмидную ДНК и таким образом, представляет собой фармацевтическую категорию ДНК. Композиция плазмидной ДНК фармацевтического качества может содержать менее м.д. (<0,0001%, т.е. <0,0001 мг на 100 мг плазмидной ДНК) гДНК, РНК и белковых загрязняющих веществ.

Композиция плазмидной ДНК фармацевтического качества может содержать менее приблизительно 0,01% или менее 0,001%, а предпочтительно менее 0,0001% или предпочтительно менее 0,00008% (<0,0008%, т.е. <0,0008 мг на 100 мг плазмидной ДНК) хромосомной ДНК или геномной ДНК.

Композиция плазмидной ДНК фармацевтического качества может содержать менее приблизительно 0,01% или менее 0,001%, а предпочтительно менее 0,0001% или предпочтительно менее 0,00002% (<0,0002%, т.е. <0,0002 мг на 100 мг плазмидной ДНК) загрязняющих РНК.

Композиция плазмидной ДНК фармацевтического качества может содержать препарат плазмидной ДНК, содержащий менее приблизительно 0,0001%, а наиболее предпочтительно менее 0,00005% (<0,00005%, т.е. <0,00005 мг на 100 мг плазмидной ДНК) загрязняющих белков клеток-хозяев.

Композиция также может содержать препарат плазмидной ДНК, содержащий менее 0,1 ЭЕ/мг эндотоксинов.

Таким образом, композиция плазмидной ДНК фармацевтического качества преимущественно содержит кольцевую форму, а более точно содержит более 80, 85, 90, 95 или 99% замкнутой кольцевой формы плазмидной ДНК.

Включенная в изобретение фармацевтическая композиция может иметь определяемый уровень геномной ДНК клеток-хозяев менее приблизительно 0,01% и менее приблизительно 0,001% РНК клетокхозяев. Наиболее предпочтительно композиция плазмидной ДНК фармацевтического качества может иметь менее приблизительно 0,00008% геномной ДНК клеток-хозяев, и менее приблизительно 0,00002% РНК клеток-хозяев, и менее приблизительно 0,00005% белка клеток-хозяев. Фактически любое сочетание указанных выше степеней очистки можно использовать для любой конкретной композиции плазмидной ДНК фармацевтического качества по изобретению. Композиции также могут содержать другие фармацевтически приемлемые компоненты, буферные растворы, стабилизаторы или соединения для улучшения передачи генов и конкретно переноса плазмидной ДНК в клетку или организм.

Полученную таким образом плазмидную ДНК затем можно готовить в виде композиции по настоящему изобретению в ЫаС1 в качестве солевого наполнителя и соответствующей концентрации буферного раствора Тп8 для поддержания или контроля значения рН между 6,2 и 9, предпочтительно между 6,5 и 8, более предпочтительно между 7 и 7,5. Препараты плазмидной ДНК по настоящему изобретению особенно эффективны, так как они могут удивительно сохранять плазмидную ДНК в стабильной не деградировавшей форме при данных условиях в течение длительного интервала времени при 5°С и до 25°С, что представляет собой комнатную температуру.

Как обозначено выше, очищенная плазмидная ДНК присутствует в растворе с количеством эндотоксина менее или приблизительно 0,1 ЭЕ/мг, менее или приблизительно 0,00005% загрязняющего белка клеток-хозяев, менее или приблизительно 0,00002% загрязняющей РНК клеток-хозяев и менее или приблизительно 0,00008% загрязняющей геномной ДНК клеток-хозяев. Композиция плазмидной ДНК фармацевтического качества содержит менее м.д. (<0,00001 %) гДНК клеток-хозяев, РНК и загрязняющих белков. Более точно композиция плазмидной ДНК фармацевтического качества практически свободна от определяемой загрязняющих гДНК, РНК и белка. Кроме того, композиция плазмидной ДНК фармацевтического качества в значительной степени свободна от определяемой хромосомной ДНК бактериального хозяина, и, таким образом, содержит менее приблизительно 0,01%, или менее приблизительно 0,001%, или менее приблизительно 0,0001%, или предпочтительно менее 0,00008% хромосомной ДНК или геномной ДНК. Кроме того, композиция плазмидной ДНК фармацевтического качества в значительной степени свободна от определяемой РНК клеток-хозяев и более точно содержит менее приблизительно 0,01% или менее 0,001% и предпочтительно менее 0,0001% или предпочтительно менее 0,00002% загрязняющих РНК клеток-хозяев. Кроме того, композиция плазмидной ДНК фармацевтического качества в значительной степени свободна от определяемых загрязняющих белков клеток-хозяев и более точно содержит менее приблизительно 0,0001% и наиболее предпочтительно менее 0,00005% загрязняющих

- 24 011554 белков клеток-хозяев. Наконец, композиция плазмидной ДНК фармацевтического качества в значительной степени свободна от измеримых загрязняющих эндотоксинов и более точно содержит менее 0,1 ЭЕ/мг эндотоксинов. Плазмидная ДНК присутствует преимущественно в суперскрученной форме и более точно содержит приблизительно или более 99% замкнутой кольцевой формы плазмидной ДНК.

Можно выполнять стадию стерилизующего фильтрования до заполнения контейнеров очищенной плазмидной ДНК. Также предоставлен получаемый посредством данных способов контейнер с очищенной плазмидной ДНК.

Можно выполнять очистку от любого типа векторов с различными размерами. Диапазон размеров приемлемой для отделения плазмидной ДНК составляет приблизительно от 5 до приблизительно 50 т.п.н., предпочтительно от 15 до 50 т.п.н., эта ДНК включает в себя векторный остов приблизительно от 3 т.п.н., терапевтический ген и связанные регуляторные последовательности. Таким образом, приемлемый по изобретению векторный остов может нести вставки приблизительно от 10-50 или более т.п.н. Вставка может включать в себя ДНК из любого организма, но предпочтительно источником является млекопитающее, и может включать в себя, кроме кодирующего терапевтический белок гена, регуляторные последовательности, такие как промоторы, полиаденилирующие последовательности, энхансеры, локус контролирующие области и т.д. Кодирующий терапевтический белок ген может быть геномного происхождения и, следовательно, содержать экзоны и интроны, как отражено в его геномной структуре, или может быть получен из комплементарной ДНК. Такие векторы могут включать в себя, например, векторную последовательность, реплицирующуюся с высоким числом копий репликации, с полилинкером для вставки терапевтического гена, кодирующим выбранный маркер геном, например тРНК ЗирРЕе, ген устойчивости к тетрациклину и канамицину и физически небольшой и стабильный. Векторная последовательность плазмиды эффективно обеспечивает вставки фрагментов ДНК млекопитающих, других эукариотов, прокариотов или вирусов и полученную плазмиду можно очищать и применять в основанной на плазмидах терапии ίη νίνο или ех νίνο. Посредством способа по настоящему изобретению можно отделять и очищать векторы с относительно высоким числом копий, т.е. в диапазоне от 20-40 до 10002000 копий/клетку. Например, способом по изобретению предпочтителен вектор, включающий в себя ориджин репликации рИС. Ориджин репликации рИС обеспечивает более эффективную репликацию плазмидной ДНК и дает десятикратное увеличение числа копий плазмиды/клетку относительно, например, ориджина рВК322. Посредством способа по настоящему изобретению можно отделять предпочтительно плазмидную ДНК с условной точкой репликации или рСОК, как описано в И8 2003/1618445. Полученное высокое число копий резко повышает отношение плазмидной ДНК к хромосомной ДНК, РНК, клеточным белкам и кофакторам, повышает плазмидный выход и способствует более легкой дальнейшей очистке. Таким образом, можно применять любой вектор (плазмидную ДНК) по изобретению. Репрезентативные векторы в качестве неограничивающих примеров включают в себя плазмиду №У1ЕСЕ.

КУ1ЕСЕ представляет собой кодирующую кислый фактор роста фибробластов или фактор роста фибробластов 1-го типа (ЕСЕ-1) плазмиду, приемлемый для лечения пациентов с терминальной стадией окклюзионной болезни периферических артерий (РАОЭ) или с болезнью периферических артерий (РАО). СатегоЮ е! а1. (Л. Уакс. 8игд., 2002, 35, 5: 930-936) описали, что 51 пациенту с невосстанавливаемой терминальной стадией РАО с болью в состоянии покоя или тканевым некрозом в ишемизированное бедро и голень внутримышечно вводили NУ1ЕСЕ в возрастающей однократной или повторяющихся дозах. Затем определяли различные параметры, как, например, чрескожное давление кислорода, лодыжечный и пальце-плечевой индексы, анализ болей и заживление язв. После введения NУ1ЕСЕ наблюдали значительное повышение плечевых индексов, снижение боли, четкость размера язв и улучшение перфузии.

Композиция плазмидной ДНК может дополнительно содержать по меньшей мере один полимер для улучшения переноса плазмидной ДНК в клетку. Композиция плазмидной ДНК также может содержать фармацевтически приемлемую основу или носитель. Композицию плазмидной ДНК можно формулировать для введения посредством инъекции, внутривенной инъекции, внутримышечной инъекции, внутриопухолевой инъекции, бомбардировки мелкими частицами или местного применения в ткани. В этих композициях плазмидная ДНК в основном находится в форме суперскрученной замкнутой кольцевой ДНК.

Приемлемые по изобретению клетки-хозяева могут представлять собой любой бактериальный штамм, т.е. грамположительные и грамотрицательные штаммы, такие как Е.со11 и За^огеНа ТурЫтигшт или ВасШик, способные к поддержанию высокого числа копий описанных выше плазмид; например 20-200 копий. По изобретению можно применять Е.со11 штаммы-хозяева, которые включают в себя НВ101, ОН1 и ОН5оЕ, ХАС-1 и ХАС-1рп116, ТЕХ2 и ТЕХ2рп42 (№О04/033664). Содержащие плазмиду Е или производные плазмиды Е штаммы (например, ЛМ 109), как правило, не являются предпочтительными, так как плазмида Е может очищаться вместе с терапевтическим продуктом плазмиды.

- 25 011554

Примеры

Общие способы клонирования и молекулярной биологии.

Обычные способы молекулярной биологии, такие как расщепление рестрикционными ферментами, гель-электрофорез, трансформация Е.сой, выделение нуклеиновых кислот, описаны в литературе (Машайк е! а1., Т., Е.Р. Ртйксй, аиб 1. 8атЬгоок, 1989. Мо1еси1аг с1ошид: а 1аЬога!огу тапиа1, кесоиб ебйюи. Со1б 8рпид НагЬог ЬаЬота1огу, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬота1оту Ргекк, Νο\ν Уотк; АикиЬе1 Р.М., К. Вгеи!, К.Е. Кшк1ои, Ό.Ό. Мооге, кА. 8ιηί11τ 1.0. 8е1бтаи аиб К. 8ΐπι1ι1. 1987. Сштеи! рго!осо1к ίη то1еси1аг Ью1оду 1987-1988. 1оНи ^111еу&8оик, Ыете Уотк). Нуклеотидные последовательности определяли способом обрыва цепи в соответствии с уже опубликованным протоколом (АикиЬе1 е! а1., 1987).

Рестрикционные ферменты получали из Νο\ν Еид1аиб Вю1аЬк, Веует1у, МА (Вю1аЬк).

При выполнении лигирования фрагменты ДНК инкубировали в буферном растворе, содержащем 50 мМ Тпк-НС1 рН 7,4, 10 мМ МдС1₂, 10 мМ ΌΤΤ, 2 мМ АТР в присутствии ДНК-лигазы фага Т4 (В1о1аЬк).

Олигонуклеотиды синтезировали на автоматическом синтезаторе ДНК Вюкеатсй 8600 с использованием рекомендаций производителя с применением химии фосфорамидитов при помощи защищающих β-положение цианоэтильной группой фосфорамидитов (801113, Ν.Ό., 1. В1ета!, 1. МсМаиик аиб Н. Кбк!ег, 1984. Ро1утег киррой о11доиис1еоббе куЩНек® XVIII: Ике о! β-суаηοеΐйу1-N,N-б^а1ку1ат^иο-/N-тο^ρйο1^иο рНокрНогапйбйе о! беохуиис1еок1бек Гог (Не куи!йек1к о! ΩΝΛ ГгадтеШк к1тр1йутд берго!есйои аиб 1ко1а1юи о! (Не йиа1 ргобис!. №с1. Ас1бк Кек., 12, 4539-4557: Ойек, !\¥. 1985. Абуаисек 1и аи!ота!еб ^NА кугИНекО. Ат. Вю1есЬио1., №у./Эес.).

Лигированную ДНК или тестируемую по эффективности трансформации ДНК применяли для трансформации следующих соответствующих требованиям штаммов:

Е.сой ЭН5а[Р/еибА1, НкбК17, кирЕ44, 1И-1, гесА1, дугА96, ге1А1, Д(1ас2УА-ащР) И169, беоК, Ф80б1ас (1ас2ДМ15)] (для любой плазмиды Со1 Е1) или

Е.сой ХАС-рп (для любой полученной из рСог плазмиды).

Минипрепараты плазмидной ДНК получали в соответствии с протоколом К1еш е! а1., 1980.

Для роста штаммов Е.сой применяли культуральную среду ЬВ (Машайк е! а1., 1982). Штаммы инкубировали при 37°С. Бактерии высевали на чашки с дополненной приемлемыми антибиотиками средой ЬВ.

Пример 1.

Подбор диаметров к применяемым скоростям потока следует из вычисления коэффициентов Рейнольдса в спиралях системы непрерывного лизиса. Поскольку следующий анализ предполагает, что по свойству жидкости являются ньютоновскими, представленные далее фигуры полностью справедливы только в В1а и до некоторой степени - в В2.

Значение коэффициента Рейнольдса позволяет специалисту в данной области указать тип обнаруженного движения. В данной работе авторы рассматривали только поток жидкости по трубе (гидравлика).

1) Неньютоновская жидкость.

Два типа чаще всего встречающихся в промышленности неньютоновских жидкостей представляют собой жидкости Бингама и Оствальда-де Вейля.

В данном случае коэффициент Рейнольдса (Ке) вычисляли следующим образом:

Кек=(1/ (2‘³)) х (η/3η+1)^ηχ ((ρχϋ^ηχν²^) /т) (1) где Ке_N представляет собой обобщенный коэффициент Рейнольдса;

Ό - внутренний диаметр поперечного сечения (м);

ρ - объемная масса жидкости (кг/м³);

ν - скорость распространения жидкости в пространстве (м/с);

и - показатель текучести (безразмерный);

т - показатель степени густоты жидкости (дин-с^и/см²);

и и т определяли эмпирически (исследование реологичеких свойств).

2) Ньютоновская жидкость.

Как и в первом разделе, в формуле (1) авторы получали:

Ке=!(внутренний диаметр, μ, ρ и и), так как и и т представляют собой функции μ

Ке=(ихРхр)/р (2) ρ - объемная масса жидкости (кг/м³);

μ - вязкость жидкости (Па-с, 1 мПа-с=1 сР);

Ό - внутренний диаметр поперечного сечения (м);

и - средняя скорость распространения жидкости в пространстве (м/с).

Формула (1) при и=1 сводится к формуле (2).

С О=скорость потока (м³/ч) и 8=площадь поверхности поперечного сечения (м²) и если μ дана в сР, следовательно, (4х (2/3600) хр) / ( (μ/ЮОО) хпхС) (3)

- 26 011554

В круглой трубе поток является ламинарным для коэффициента Рейнольдса ниже 2500 и представляет собой гидравлически ровный турбулентный поток при коэффициенте Рейнольдса между 2000 и 500000. Граничное значение специально не определено и находится между 2000 и 2500, где применяют оба типа свойств для определения того, что может затем произойти, и делают выбор эмпирически.

3) Вычисления.

Так как п и т, как правило, не известны, для оценки движений применяли следующие приближения.

Ньютоновская жидкость (во всех поперечных сечениях): ρ=1000 кг/м³ (для всех жидкостей);

μ=5 сР в В1а и 40 сР в В1Ь (данные авторов) и 2,5 сР в В2 (данные авторов).

Для двух стандартных тестируемых конфигураций, обозначенных конфигурация 1 и конфигурация 2 (без трубы В1Ь), с применением формулы (3) выполняли следующие вычисления.

Таблица 2

Спираль	Конфигу В1а	рация 1 В2	Конфигу В1а	рация 2 В2
Вязкость* (сР)	5	2,5	5	2,5
Диаметр (мм)	12,7	9,5	6	6
Скорость потока (л/ч)	60	105	12	21
Коэффициент Рейнольдса Движение	334	1564	141	495
ламинарное	ламинарное	ламинарное	ламинарное

В двух данных конфигурациях потоки являются ламинарными на всех стадиях и растворы не смешиваются в достаточной мере.

Для других конфигураций труб (без трубы В1Ь) авторы получали следующее.

Таблица 3

Спираль	Высокая скорость/стандартный	Высокая скорость/В.Д. 16 мм	Высокая скорость/В.Д. 6 мм
диаметр В1а	В2	В1а	В2	В1а	В2
Вязкость * (сР)	5	2,5	5	2,5	5	2,5
Диаметр (мм)	12	10	16	16	6	6
Скорость потока (л/ч)	120	210	120	210	120	210
Коэфф. Рейнольдса	707	2971	531	1857	1415	4951
Движение	Ламинар.	Турбулен.	Ламинар.	Ламинар.	Ламинар.	Турбулен.

Аналогичные вычисления выполняли с применением формулы (3) для различных конфигураций труб с представленными трубами В1а и В1Ь.:

Таблица 4

Спираль	Высокая скорость	Высокая скорость/максимальное перемешивание
В1а	В1Ь	В2
В1а	В1а	В1а
Вязкость* (сР)	5	5	2, 5	5	5	5
Диаметр	6	16	6	3	2	3
Скорость потока (л/ч)	120	120	210	120	120	160
Коэффициент Рейнольдса	1415	531	4951	2829	4244	3773
Движение	Ламинар.	Ламинар.	Турбулен.	Турбулен.	Турбулен.	Турбулен.

Очевидно, что предварительно определенные коэффициенты Рейнольдса можно получать посредством подбора диаметров труб и скоростей потоков.

Специалист в данной области может представить много сочетаний диаметров и длин для В2 или для двух секций В1 (В1а и В1Ь). Например, чтобы уменьшить длину и усилить перемешивание можно урезать от 6 до 3 мм первую секцию В1. Кроме того, из изучения реологического свойства жидкостей можно определять п и т и использовать для определения правильных характеристик труб.

Кроме эффективности перемешивания, также можно рассматривать продолжительность перемешивания, которое в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения получают подбором дли

- 27 011554 ны спиралей.

Диаметр труб или скорость жидкости оказываются не доминирующими в формуле (1) для неньютоновской жидкости (данные не показаны). Другими словами, изменение диаметра оказывается не более эффективным, чем изменение скорости потока, если формулу (1) применяют для вычислений в В1Ь и В2. Диаметр можно менять вместе со скоростью потока в тех случаях, когда желательны высокие скорости потока.

Эти принципы можно применять в качестве основы для максимально возможного ограничения перемешивания в В1Ь и В2 во избежание фрагментации гДНК.

Во время лизиса перемешивание может быть достаточно интенсивным до тех пор, пока гДНК не денатурирована. Уменьшение диаметра в начале В1 позволяет увеличить перемешивание (повышенный Ве) для достаточного смешивания раствора 2 с клетками. С другой стороны, при лизировании клеток перемешивание и силы трения у стены можно снижать во избежание фрагментации нуклеиновой кислоты. Увеличение диаметра позволяет уменьшить перемешивание (сниженный Ве) и трение (сниженная скорость).

М1: смешивание жидкостей.

В1а: точная настройка смешивания в начале лизиса: конвекционный эффект (макроперемешивание).

В1Ь: происходит осуществление денатурации плюс явление диффузии (микроперемешивание).

Считают, что обобщенный коэффициент Рейнольдса имеет то же самое значение для неньютоновской жидкости, которое классический коэффициент Рейнольдса имеет для ньютоновской жидкости. Конкретно, считают, что граничное значение для ламинарного режима в трубе с круглым поперечным сечением составляет Ве\<2300.

В В2 выполняют нейтрализацию. Высокие скорости потоков имеют тенденцию усиливать фрагментацию геномной ДНК из-за слишком сильного перемешивания и в результате сил трения у стенки (механические напряжения). Применение большого диаметра трубы позволяет снизить перемешивание (Ве) и силы трения (скорость). В данной работе авторы установили трубу с небольшим диаметром (6 мм) во избежание получения недостаточного перемешивания. Наблюдения авторов показывают, что для В2 лучше всего подходит труба с небольшим диаметром, чтобы «резко и быстро» перемешать нейтрализованный лизат.

Пример 2.

Авторы предлагают разбить систему лизиса клеток на 5 стадий. В одном конкретном варианте осуществления конфигурация выглядит следующим образом:

1) Смешивание: клетки (в растворе 1)+раствор 2 (М1+3 м, 6 мм, труба). Начало лизиса клеток посредством 8Ό8, без риска фрагментации ДНК до тех пор, пока не денатурована ДНК.

2) Конец лизиса и денатурация гДНК (13 м, 16 мм, труба).

3) Смешивание: лизат+раствор 3 (М2+3 м, 6 мм, труба).

4) Сбор нейтрализованного лизата при 4°С

5) Осаждение хлопьев и крупных фрагментов гДНК всю ночь при 4°С. Для осуществления непрерывного лизиса можно использовать следующие условия:

Раствор 1: ЭДТА 10 мм, глюкоза (С1с) 9 г/л и Тп5-НС1 25 мМ, рН 7,2.

Раствор 2: 8Ό8 1% и ΝαΟΗ 0,2н.

Раствор 3: уксусная кислота 2 М и ацетат калия 3 М.

Раствор 1 и раствор 2: скорость потока 60 л/ч.

Раствор 3: скорость потока 90 л/ч.

Клетки доводят до 38,5 г/л раствором 1.

Клетки в растворе 1 проходят через 3 отверстия, чтобы распылить их в идущий в обратном направлении раствор 2.

Смеситель М1 имеет такую форму, чтобы обеспечить оптимальное смешивание двух жидкостей (см. фиг. 2, схематический рисунок смесителя).

Первая часть трубы после смесителя М1 представляет собой В1а, а следующей частью является В1Ь.

В1а: труба 3 м длина, диаметр 6 мм, время пребывания 2,5 с.

В1Ь: 13 м длина, диаметр 16 мм, время пребывания 77 с.

Способ по настоящему изобретению в отношении эффективности обеспечивает преимущество, в сумме представляющий собой дисперсию, кратковременное резкое смешивание и мягкое смешивание диффузией. С применением способа по настоящему изобретению количество лизированных клеток возрастает и, следовательно, повышается количество выделенной плазмидной ДНК. Идея диффузии особенно важна из-за трудности смешивания этих жидкостей благодаря их свойствам, в особенности вязкоэластичности.

Способ по настоящему изобретению позволяет ограничить напряжение сдвига и поэтому ограничить фрагментацию гДНК, способствуя ее удалению во время последующей очистки хроматографией.

- 28 011554

Трудность представляет собой последующее смешивание с раствором 3, который можно охлаждать до 4°С. По одному из вариантов осуществления процесс включает в себя смеситель М2 с Υ-образной формой и внутренним диаметром приблизительно 10 мм; часть трубы В2, помещаемой после смесителя М2;

В2: труба 2 м, 6 мм; время пребывания: 1 с.

В табл. 5 далее представлены полученные в сравнительных тестах результаты для демонстрации преимуществ разработанного авторами способа непрерывного лизиса по сравнению с лизисом с одноразовой загрузкой.

Таблица 5

	Соотношение гДНК/пДНК в лизате	Количество выделенной плазмиды на г клеток (мг/г)
Лизис с одноразовой загрузкой	16, 9	1,4
Непрерывный лизис в описанной в примере 1 системе СЬ	1,6	1,9

Пример 3.

Применяемая колонка представляет собой 1 мл Н1Тгар колонку, активированную N118 (Ν-гидроксисукцинимид, Р1агтас1а), соединенную с перистальтическим насосом (скорость <1 мл/мин). Применяемый конкретный олигонуклеотид имел на 5'-конце NН2-группу, его последовательность выглядит следующим образом: 5'-ОАООСТТСТТСТТСТТСТТСТТСТТ-3' (8Ер ГО № 1).

Применяемые в данном примере буферные растворы представляли собой следующие растворы: Связывающий буфер: 0,2 М ΝηΙ 1СО₃, 0,5 М №С1, рН 8,3.

Буфер А: 0,5 М этаноламин, 0,5 М №С1, рН 8,3.

Буфер В: 0,1 М ацетат, 0,5 М №С1, рН 4.

Колонку промывали 6 мл 1 мМ НС1 и растворенный в связывающем буфере олигонуклеотид (50 нмоль в 1 мл) затем наносили на колонку и оставляли на 30 мин при комнатной температуре. Колонку последовательно промывали три раза 6 мл буфера А и после этого 6 мл буфера В. Таким образом, олигонуклеотид ковалентно связывался с колонкой посредством СΟNН связи. Колонку хранили при 4°С в ФСБ, 0,1% ΝηΝ₃ и могли использовать по меньшей мере четыре раза.

Синтезировали следующие два олигонуклеотида:

олигонуклеотид 4817: 5'-ОАТССОААОААОААОААОААОААОААОААОААОААОААОААОААОААОААОААОААОО-3' (8Ер ГО № 13) и олигонуклеотид 4818: 5'-ААТТССТТСТТСТТСТТСТТСТТСТТСТТСТТСТТСТТСТТСТТСТТСТТСТТСТТСО-3' (8Ер ГО № 14)

После гибридизации и клонирования в плазмиду данных олигонуклеотидов в соответствующую плазмиду вводили гомопурин-гомопиримидиновую последовательность (ОАА)_п (8Е() ГО № 15), как описано выше.

Соответствующую этим двум гибридизованным олигонуклеотидам последовательность клонировали в участок множественного клонирования плазмиды рВК8+ (81га1адепе С1оп1пд 8уз1ет, Ба 1о11а СА), содержащей ген устойчивости к ампициллину. Для этого олигонуклеотиды гибридизовали в следующих условиях: 1 мкг этих двух олигонуклеотидов помещали вместе в 40 мл конечного буфера, содержащего 50 мМ ТП8-НС1 рН 7,4, 10 мМ МдС1₂. Эту смесь нагревали до 95°С и затем оставляли при комнатной температуре таким образом, чтобы температура медленно падала. 10 нг смеси гибридизованных олигонуклеотидов лигировали с 200 нг плазмиды рВК8+ (81га1адепе С1ошпд 8уз1ет, Ба 1о11а СА), расщепленной ВатН1 и ЕсоК1 в 30 мкл конечного буфера. После лигирования аликвоту трансформировали в ОН5а. Смеси для трансформации выделяли на среде, дополненной ампициллином Б (50 мг/л) и Х-да1 (20 мг/л). Рекомбинантные клоны должны демонстрировать отсутствие синего цвета на этой среде в отличие от их материнской плазмиды (рВК8+), обеспечивающей α-комплементацию с фрагмента β-галактозидазы Е.соН. После получения плазмидной ДНК из 6 клонов все демонстрировали потерю участка Р§11, расположенного между участками ЕсоК1 и ВатН1 рВК8+, и увеличение молекулярного веса на 448 т.п.н. полосы РуиП, содержащей участок для множественного клонирования. Выбирали один клон и обозначали соответствующую плазмиду рХБ2563. Клонированную последовательность проверяли посредством сиквенса с применением праймера -20 (5'-ТОАССООСАОСААААТО-3' (8ЕР ГО № 16)) (У1ега Б и Б Меззтд. 1982. Т1е риС рБзткБ, ап М13тр7-бепуеб 8У81ет £ог тзегйоп ти1адепе818 апб зедиепстд \νίΐ1ι зупФейс ишуег8а1 рптегз. Оепе, 19, 259-268) для плазмиды рВК8+ (81га1адепе С1отпд 8уз1ет, Ба 1о11а СА). Плазмиду рХБ2563 очищали при помощи \\л/агс.1 Медаргер кй (Рготеда Согр. МаФзоп, Ш1) в соответствии с рекомендациями производителя. Этот препарат плазмидной ДНК применяли в описанных далее примерах.

- 29 011554

Плазмиду рХЬ2563 очищали на связанной с описанным в 1.1 олигонуклеотидом колонке Н1Тгар из раствора, также содержащего плазмиду рВК8+. Применяемые в данной очистке буферы представляли собой буфер Е: 2 Μ ЫаС1, 0,2 Μ ацетат, рН от 4,5 до 5;

буфер Е: 1 Μ ТЙ8-НС1, рН 9, 0,5 мМ ЭДТА.

Колонку промывали 6 мл буфера Е, наносили на колонку плазмиды (20 мкг рХЬ2563 и 20 мкг рВК8+ в 400 мкл буфера Е) и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Колонку промывали 10 мл буфера Е, а затем выполняли элюирование буфером Е. Плазмиды детектировали после электрофореза в 1% агарозном геле и окрашивания бромистым этидием. Часть плазмид в растворе оценивали измерением их трансформирующей активности на Е.со11.

Исходя из содержащей 30% рХЬ2563 и 70% рВК8+ смеси, на выходе колонки собирали содержащий 100% рХЬ2563 раствор. Оценивающаяся по отношению ОИ при 260 к 280 нм чистота возрастала от 1,9 до 2,5, что указывает на удаление загрязняющих белков посредством данного способа.

Пример 4.

Связывание олигонуклеотида (5'-САСССТТСТТСТТСТТСТТСТТСТТ-3' (8ЕО ГО № 1)) с колонкой выполняли, как описано в примере 3. Для связывания олигонуклеотид модифицировали по 5'-концу аминной группой, связанной с фосфатом спейсера посредством плеча, содержащего 6 углеродных атомов (Μοά^Γ1еά о1щогшс1еоббе ЕигодеШес 8А, Ве1дшт). Плазмиду рХЬ2563 очищали с применением νί/агб Μедар^ер ΕίΙ (Тготеда Согр., Μаά^8οη, VI) в соответствии с рекомендациями производителя. Применяемые в данном примере буферы представляли собой буфер Е: 0-2 Μ ЫаС1, 0,2 Μ ацетат, рН от 4,5 до 5;

буфер Е: 1 Μ ТЙ8-НС1, рН 9, 0,5 мМ ЭДТА.

Колонку промывали 6 мл буфера Е и 100 мкг плазмиды рХЬ2563 растворяли в 400 мкл буфера Е, а затем наносили на колонку и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Колонку промывали 10 мл буфера Е, а затем выполняли элюирование буфером Е. Количество плазмиды определяли по измерению оптической плотности при 260 нм.

В данном примере связывание выполняли в буфере, молярность которого в отношении №1С1 варьировала от 0 до 2 М (буфер Е). Выход после очистки снижался, если снижалась молярность ЫаС1. рН связывающего буфера может меняться от 4,5 до 5, выход после очистки получали выше при 4,5. Также можно применять еще один элюирующий буфер основного рН: при этом элюирование выполняют с буфером, содержащим 50 мМ борат, рН 9, 0,5 мМ ЭДТА.

Связывание олигонуклеотида (5'-САСССТТСТТСТТСТТСТТСТТСТТ-3' (8ЕО ГО № 1)) с колонкой выполняли, как описано в примере 3. Плазмиду рХЬ2563 очищали с применением νί/агб Μедар^ер ΕίΙ (Тготеда Согр., Μаά^8οη, VI) в соответствии с рекомендациями производителя. Применяемые в данном примере буферы представляли собой буфер Е: 0,1 Μ ЫаС1, 0,2М ацетат, рН 5;

буфер Е: 1 Μ ТЙ8-НС1, рН 9, 0,5 мМ ЭДТА.

Колонку промывали 6 мл буфера Е и 100 мкг плазмиды рХЬ2563 растворяли в 400 мкл буфера Е, а затем наносили на колонку и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Колонку промывали 10 мл буфера Е, а затем выполняли элюирование буфером Е. Измеряли содержание геномной или хромосомной ДНК Е.со11, присутствующей в образцах плазмиды до и после прохождения через колонку с олигонуклеотидом. Данную геномную ДНК вычисляли посредством Ρί.Έ с применением праймеров к гену да1К Е.со11. Следовали протоколу: последовательность этих праймеров описана у ИеЬоиск е! а1. (ХисЕчс Ас1б8 Ие8. 1985, 13, 1841-1853):

5'-СССААТТСТССССАССАААССАСТТТС-3 '(8Ер ГО № 17); и

5'-ССААССТТСАСТСТТСАССАССССТСТ-3' (8ЕО ГО № 18).

Реакционная среда содержала в 25 мкл ПЦР-буфера (Гготеда Егапсе, СкагЬопп1еге8):

1,5 мМ ΜβΕΕ;

0,2 мМ РХТТ ^Наташа, Ог8ау);

0,5 мкМ праймера;

Ед/мл Тад-полимеразы (Гготеда).

Реакцию проводили в следующей последовательности:

мин при 95°С;

циклов из 10 с при 95°С, 30 с при 60°С, 1 мин при 78°С;

мин при 78°С.

Амплифицированный фрагмент ДНК длиной 124 т.п.н. отделяли посредством электрофореза в 3% агарозном геле в присутствии 8уЬгСгееп I (Μο1еси1а^ Ρ^οЬе8, Еидепе, И8А), а затем определяли количество по набору контрольных геномных ДНК Икгарцг штамма В Е.со11 (81дта, геГ Ό4889).

- 30 011554

Пример 5.

В этом примере описана очистка плазмидной ДНК из очищенного лизата бактериальной культуры, на так называемом «минипреп» масштабе: 1,5 мл ночной культуры содержащих плазмиду рХЬ2563 штаммов ΌΗ5α центрифугировали и ресуспендировали осадок в 100 мкл 50 мМ глюкозы, 25 мМ ТпзНС1, рН 8, 10 мМ ЭДТА. Добавляли 200 мкл 0,2 Μ ΝαΟΗ, 1% 8Ό8, пробирки перемешивали переворачиванием, после чего добавляли 150 мкл 3 Μ ацетата калия, рН 5 и пробирки перемешивали переворачиванием. После центрифугирования супернатант восстанавливали и наносили на колонку с олигонуклеотидом, полученную, как описано в примере 1. Связывание, промывки и элюирование идентичны процедурам, описанным в примере 3. Из 1,5 мл культуры выделяли приблизительно 1 мкг плазмиды. Полученную плазмиду аналиировали посредством агарозного гель-электрофореза и окрашивания бромистым этидием, принимая форму из одной полосы за «суперскрученную» кольцевую ДНК. В очищенной данным способом плазмиде наблюдали отсутствие следов высокомолекулярной (хромосомной) ДНК или РНК.

Пример 6.

В этом примере описан эксперимент по очистке плазмидной ДНК, проводимый в тех же условиях, как в примере 5, исходя из 20 мл содержащих плазмиду рХЬ2563 штаммов бактериальной культуры ΌΗ5α. Клеточный осадок помещают в 1,5 мл 50 мМ глюкозы, 25 мМ ТП8-НС1, рН 8, 10 мМ ЭДТА. Лизис проводили с 2 мл 0,2 Μ ΝαΟΗ, 1% 8Ό8, а нейтрализацию - с 1,5 мл 3 Μ ацетата калия, рН 5. После этого ДНК осаждали 3 мл 2-пропанола и осадок помещали в 0,5 мл 0,2 Μ ацетата натрия, рН 5, 0,1 Μ №101 и наносили на колонку с олигонуклеотидом, полученную, как описано выше в примере. Связывание, промывание колонки и элюирование выполняли, как описано выше в примере, за исключением промывающего буфера, молярность которого в отношении Να01 составляла 0,1 Μ. Полученную плазмиду анализировали посредством агарозного гель-электрофореза и окрашивания бромистым этидием, принимая форму из одной полосы за «суперскрученную» кольцевую ДНК. В очищенной плазмиде наблюдали отсутствие следов высокомолекулярной (хромосомной) ДНК или РНК. Расщепление плазмиды рестрикционными ферментами давало отдельную полосу с ожидаемым молекулярным весом 3 т.п.н. Плазмида содержала плазмиду, включающую в себя промотор цитомегаловируса, кодирующий люциферазу ген и гомопурин-гомопиримидиновую последовательность (ОАА)₁₇ (8ЕД ΙΌ № 15), происходящую из плазмиды рХЬ2563. Содержащий эту плазмиду штамм ΌΗ1 (ΜαηίαΙίδ с1 а1., 1989) культивировали в 7-литровом ферментере. Очищенный лизат получали из 200 г клеток: клеточный осадок помещали в 2 л 25 мМ Тп8, рН 6,8, 50 мМ глюкозу, 10 мм ЭДТА, к которым добавляли 2 л 0,2 Μ ΝαΟΗ, 1% 8Ό8. Лизат нейтрализовали добавлением 1 л 3 Μ ацетата калия. После диафильтрации 4 мл этого лизата наносили на 5 мл колонку Н1Тгар-ЫН8, связанную с олигонуклеотидом с последовательностью 5'-ОА6ОСТТСТТСТТСТТСТТСТТСТТ-3' (8ЕО ΙΌ № 1) в соответствии с описанным в примере 3 способом. Отмывку и элюирование выполняли, как описано выше в примере.

Пример 7.

В этом примере описано применение олигонуклеотида, несущего метилированные цитозины. Последовательность применяемого олигонуклеотида представляла собой

5'-6А66^ΜеСТТ^ΜеСТТ^ΜеСТТ^ΜеСТТ^ΜеССТ^ΜеСТТ^ΜеСТТ-3' (8ЕО ΙΌ № 19).

Данный олигонуклеотид имел ХН₂-группу на 5'-конце; ^МеС = 5-метилцитозин. Этот олигонуклеотид обеспечивает очистку плазмиды рХЬ2563 при условиях примера 1 со связывающим буфером с рН 5 (таким образом снижая риск деградации плазмиды).

Пример 8.

В описанных выше примерах применяемый олигонуклеотид модифицировали по 5'-концу аминной группой, связанной с фосфатом посредством содержащего 6 углеродных атомов плеча: ЫН₂-(СН₂)₆. В данном примере связывали с фосфатом 5' -конца посредством содержащего 12 углеродных атомов плеча: ХН₂-(СН₂)1₂. Связывание олигонуклеотида и прохождение через колонку проводили, как описано в примере 3, с буфером Р: 2 Μ ЫаС1, 0,2 Μ ацетат, рН 4,5. Этот олигонуклеотид позволяет получить лучший выход после очистки: получали выход 53%, тогда как при тех же условиях с содержащим 6 углеродных атомов олигонуклеотидом этот выход составлял приблизительно 45%.

Пример 9.

После описанной в примере 3 методики клонирования конструировали еще две плазмиды, несущие гомопурин-гомопиримидиновые последовательности:

содержащую последовательность (ООА)1₆ плазмиду рХЬ2725 (8ЕД ΙΌ № 20) и содержащую последовательность (ОА)₂₅ плазмиду рХЬ2726 (8ЕД ΙΌ № 21).

Плазмиды рХЬ2725 и рХЬ2726, аналогичные плазмиде рХЬ2563, конструировали по описанной в примере 3 методике клонирования, с применением следующих олигонуклеотидных пар:

5986: 5'-ОАТСС (ОА)₂₅666-3' (8ЕО ΙΌ № 22);

5987: 5'-ААТТССС(ТС)₂₅О-3' (8ЕО ΙΌ № 23);

5981: 5'-ОАТСС(66А)₁₇6О-3' (8ЕО ΙΌ № 24);

5982: 5'-ААТТ (ССТ)₁₇ССО-3' (8ЕО ΙΌ № 25).

- 31 011554

Олигонуклеотидную пару 5986 и 5987 применяли для конструирования плазмиды рХЬ2726 посредством клонирования олигонуклеотидов в участках ВатН1 и ЕсоК1 рВК8+ (81га1адепе С1ошпд 8уз1ет, Ьа бо11а СА), тогда как олигонуклеотиды 5981 и 5982 применяли для конструирования плазмиды рХЬ2725. Применяли те же экспериментальные условия, что и для конструирования плазмиды рХЬ2563, и меняли только олигонуклеотидные пары. Аналогичным образом клонированные последовательности проверяли секвенированием плазмид. Это позволяет показать, что плазмида рХЬ2725 имеет модификацию относительно ожидаемой последовательности: вместо повторяющейся 17 раз последовательности ОСА там присутствует ССАСА(ССА)1₅ (8ЕЦ ΙΌ № 26).

Пример 10.

Образующие тройные спирали с данными гомопуриновыми последовательностями олигонуклеотиды связывали с колонками Н1Тгар по описанному в примере 1.1 способу. Олигонуклеотид с последовательностью 5'-ААТСССТССТССТССТССТССТССТ-3' (8ЕЦ ΙΌ № 27) применяли для очистки плазмиды рХЬ2725, а олигонуклеотид с последовательностью 5'-АСТССТСТСТСТСТСТСТСТСТСТСТ-3' (8Е0 ΙΌ № 28) применяли для очистки плазмиды рХЬ2726.

Таким образом, получали две колонки, обеспечивающие очистку соответствующих плазмид по описанному в примере 2 способу со следующими буферами:

буфер Е: 2 М №С1, 0,2 М ацетат, рН 4,5;

буфер Е: 1 М ТЙ8-НС1, рН 9, 0,5 мМ ЭДТА.

Полученные выходы составляли 23 и 31% для рХЬ2 725 и рХЬ2726 соответственно.

Пример 11.

В данном примере иллюстрируют влияние длины представленной в плазмиде конкретной последовательности на выходы после очистки.

Применяемый в данных экспериментах для демонстрации активности композиций по изобретению репортерный ген представляет собой кодирующий ген люциферазу (Ьис).

Плазмида рХЬ2621 содержит кластер, включающий в себя 661-т.п.н. промотор цитомегаловируса (СМУ), клонируемый до кодирующего люциферазу гена в участки М1и1 и ΗίηάΙΙΙ в вектор рСЬ Ьазю Уес1ог (Рготеда Согр., Маб1зоп, XVI). Эту плазмиду конструировали с применением традиционных способов молекулярной биологии.

Плазмиды рХЬ2727-1 и рХЬ2727-2 конструировали в следующих условиях.

мк плазмиды рХЬ2621 линеаризовали ВатН1; фермент инактивировали посредством обработки в течение 10 мин при 65°С; в то же время олигонуклеотиды 6006 и 6008 гибридизовали, как описано для конструкции плазмиды рХЬ2563:

6006: 5'-САТСТ(САА)₁₇СТССАСАТСТ-3' (8ЕО ΙΌ № 29);

6008: 5'-САТСАСАТСТССАС(ТТС)1₇А-3' (8ЕО ΙΌ № 30).

Эту гибридизационную смесь клонировали по ВатШ концам плазмиды рХЬ2621 и после трансформации в ΌΗ5α посредством РзП рестрикционного ферментного анализа определяли рекомбинантные клоны, так как олигонуклеотиды включали участок для Рзб. Отбирали два клона и с применением праймера (6282: 5'-АСАСТСАТААСТСССССоАсС-3' (8ЕО ΙΌ № 31)) определяли нуклеотидную последовательность клонированного фрагмента, как, например, секвенированием реакционного праймера (У1ега ί. апб ί. Меззтд, 1982) при помощи полученной системы из плазмид рИС М13тр7 для инсерционного мутагенеза и секвенирования с синтетическими универсальными праймерами (Сепе 19:259-268).

Первый клон (рХЬ2727-1) содержал повторяющуюся 10 раз последовательность САА. Второй (рХЬ2727-2) содержал последовательность 5 -СААСААСАС (САА)₇ССААСАСАА-3' (8ЕО ΙΌ № 32).

Применяли колонку, как, например, описанную в примере 3 и связанную с олигонуклеотидом 5'-САСССТТСТТСТТСТТСТТСТТСТТ-3' (8ЕЕ) ΙΌ № 1).

Плазмида рХЬ2727-1 несла 14 повторов последовательности САА. Описанный выше олигонуклеотид, содержащий только 7 повторов соответствующей гибридизуемой последовательности СТТ, таким образом, можно гибридизовать с плазмидой по 8 различным положениям. Напротив, плазмида рХЬ2727-2 имела последовательность гибридизации (САА)₇ (8ЕО ΙΌ № 36) той же длины, как и связанный с колонкой олигонуклеотид. Таким образом, этот олигонуклеотид можно гибридизовать только по одному положению на рХЬ2727-2. Эксперимент аналогичен описанному в примере 4 эксперименту со следующими буферами:

буфер Е: 2 М №С1, 0,2 М ацетат, рН 4,5;

буфер Е: 1 М ТЙ8-НС1, рН 9, 0,5 мМ ЭДТА.

Выход после очистки с плазмидой рХЬ2727-1 составляет 29 и 19% с рХЬ2727-2. Применяемые клетки представляют собой клетки ΝΙΗ 3Т3, за день до эксперимента введенные в 24-луночные культуральные планшеты из расчета 50000 клеток/лунку. Плазмиду растворяли в 150 мм №1С1 и смешивали с липофектантом КРК115335. Применяли соотношение положительно заряженного липофектанта/отрицательно заряженная ДНК, равное 6. Смесь встряхивали, оставляли на 10 мин при комнатной температуре, разводили в среде без эмбриональной телячьей сыворотки, а затем добавляли к клеткам в пропорции 1 мкг ДНК на лунку с культурой. После 2 ч при 37°С добавляли 10% (об./об.) эмбриональной телячьей сыворотки и клетки инкубировали в течение 48 ч при 37°С в присутствии 5% СО₂. Клетки от

- 32 011554 мывали дважды ФСБ и измеряли активность люциферазы по описанному протоколу (Рготеда к11. Рготеда Согр. МаФзоп, XVI) на люминометре Бита! БВ9501 (ЕС апб. С ВеПйоИ, Еугу). Очищенная, как описано в примере 8.2, плазмида рХЬ2727-1 давала выход после трансфекции в два раза больше, чем выход после трансфекции, полученный с той же плазмидой, очищенной с применением ΧνίζηΓά Медаргер к11 (Рготеда Согр. МабЕоп, VI).

Пример 12.

В следующем примере демонстрируют очистку полученных из рСОК плазмид с применением трехспиральной аффинной хроматографии. Показали, что с помощью этого способа можно удалять загрязняющие нуклеиновые кислоты (конкретно геномную ДНК и РНК хозяина) до уровней, не достижимых для обычных способов хроматографии.

В качестве хроматографической матрицы синтезировали с 8ерйасгу1 8-1000 8Б (АтегзйаМРйагтас1а Вю1есй) триплекс-аффинный гель. Сначала 8ерйасгу1 8-1000 активировали натрия м-периодатом (3 мМ, комнатная температура, 1 ч) в 0,2 М ацетате натрия (рН 4,7). Затем связывали олигонуклеотид через его 5'-ΝΗ₂ концевую часть с альдегидными группами активированной матрицы восстановительным аминированием в присутствии аскорбиновой кислоты (5 мМ), как описано выше для связывания белков (Нотзеу е1 а1., 1. Iттиηо1. МеШобз, 1986, 93, 83-88). Применяемый для данных экспериментов гомопиримидиновый олигонуклеотид (из Ецгодеп1ес, НРЬС-рцпЕеб) имел последовательность, комплементарную короткой 14-членной гомопуриновой последовательности 5'-ААСААААААААСАА-3' (8ЕС ГО № 10), присутствующей в точке начала репликации (опу) плазмиды рСОК (8оиЬпег е1 а1., Сепе Тйегару, 1999, 6, 1482-1488). Как обсуждали ранее, последовательность гомопиримидинового олигонуклеотида представляет собой 5'-ТТСТТТТТТТТСТТ-3' (8ЕС ГО № 11).

После этого плазмиды подвергали хроматографии:

рХЬ3296 (рСОК без трансгена, 2,0 т.п.н.), рХЬ3179 (рСОК-ЕСЕ, 2,4 т.п.н.), рХЬ3579 (рСОК-УЕСЕВ, 2,5 т.п.н.), рХЬ3678 (рСОК-АЕР, 3,7 т.п.н.), рХЬ3227 (рСОК-1ас2 5,4 т.п.н.) и рХЬ3397 (рСОК-Вбе1е!еб ЕУШ, 6,6 т.п.н.).

Все эти плазмиды очищали двумя стадиями анионообменной хроматографии из полученных, как описано в примере 4, очищенных лизатов. Также исследовали очищенную ультрацентрифугированием в СзС1 плазмиду рВК8+ (рВ1иезспр1 II К8 + Егот 81га1адепе), полученную из Со1Е1 плазмиду. Все применяемые плазмиды находились в суперскрученном (> 95%) топологическом состоянии или форме.

В каждом эксперименте по очистке плазмидной ДНК на содержащую указанный выше олигонуклеотид 5'-ТТСТТТТТТТТСТТ-3' (8ЕС ГО № 11) аффинную колонку наносили 300 мкг плазмидной ДНК в 6 мл 2 М №С1, 0,2 М ацетата калия (рН 5,0) при скорости потока 30 см/ч. После промывания колонки 5 объемами того же буфера связанную плазмиду элюировали 1 М ТИ8/НС1, 0,5 мМ ЭДТА (рН 9,0), определяли количество в ИУ (260 нм) и проводили ионообменную хроматографию на колонке МПНроге Сеп-Рак (Мащце! е1 а1., ВюРйагт, 1995, 8, 26-37). Полученные плазмиды в собранных фракциях составляли:

207 мкг для рХЬ3296,

196 мкг для рХЬ3179,

192 мкг для рХЬ3579,

139 мкг для рХЬ3678, мкг для рХЬ 3227 и мкг для рХЬ 3397.

Определяли отсутствие связанной плазмиды (<3 мкг) в случае хроматографии на этой колонке рВК8. Это указывает на то, что олигонуклеотид 5'-ТТСТТТТТТТТСТТ-3' (8ЕС ГО № 11) образует стабильные трехспиральные структуры с присутствующей в рСОК (опу) комплементарной 14-членной последовательностью 5'-ААСААААААААСАА-3' (8ЕС ГО № 10), но не с присутствующей в рВК8 прочно связанной последовательностью 5'-АСАААААААССА-3' (8ЕС ГО № 8). Это указывает на то, что введение одной неканонической триады (в данном случае Т*СС) приводит к полной дестабилизации структуры триплекса.

В качестве контроля наблюдали связывание без плазмиды (<1 мкг), если хроматографии рХЬ3179 на пустой колонке, синтезированной при строго аналогичных условиях, но без олигонуклеотида.

При выполнении данной аффинной очистки на колонке в указанных здесь условиях уровень загрязнения геномной ДНК хозяина снижался от 2,6 до 0,07% для препарата рХЬ3296. Аналогично уровень загрязнения ДНК хозяина снижался от 0,5 до 0,008% для препарата рХЬ3179, если для образца применяли хроматографию с такой же аффинной колонкой.

- 33 011554

Пример 13.

В следующем примере продемонстрирована очистка полученных из Со1Е1 плазмид с применением трехспиральной аффинной хроматографии. Показали, что с помощью этого способа можно удалять загрязняющие нуклеиновые кислоты (конкретно геномную ДНК и РНК хозяина) до уровней, не достижимых для обычных способов хроматографии.

Триплекс-аффинный гель синтезировали связыванием олигонуклеотида с последовательностью 5'-ТСТТТТТТТССТ-3' (ЗЕО ΙΌ № 9) на периодат-окисленном Зерйасгу1 3-1000 ЗЕ, как описано выше в примере.

С плазмидами рХЬ3296 (рСОК без трансгена) и полученной из Со1Е1 плазмидой рВКЗ проводили хроматографию на 1-мл колонке, содержащей олигонуклеотид 5'-ТСТТТТТТТССТ-3' (ЗЕО ΙΌ № 9) в описанных в примере 9 условиях. Полученные плазмиды в собранных фракциях составляли 175 мкг для рВКЗ и <1 мкг для рХЬ3296. Это указывает на то, что олигонуклеотид 5'-ТСТТТТТТТССТ-3' (ЗЕО Ш № 9) образует стабильные трехспиральные структуры с присутствующей в рВКЗ комплементарной 12-членной последовательностью 5'-АСАААААААССА-3' (ЗЕО ΙΌ № 8), но не с присутствующей в рСОК очень прочно связанной 12-членной последовательностью 5'-АСААААААААСА-3') (ЗЕО ΙΌ № 34). Это указывает на то, что введение одной неканонической триады (в данном случае С*АТ) приводит к полной дестабилизации структуры триплекса.

Пример 14.

Посев культуры выполняли в не закрытом флаконе Эрленмейера следующим способом. Рабочий банк клеток вводили во флакон Эрленмейера, содержащий среду М9тобС5 с соотношением посева 0,2% (об./об.). Штамм культивировали при 220 об/мин в ротационном шейкере при 37±1°С в течение приблизительно 18±2 ч до истощения глюкозы. В результате получали 200 мл высеянной культуры. Предполагаемая оптическая плотность культуры А600 составляла приблизительно 2-3.

Затем в первом ферментере получали предкультуру. Высеянную культуру стерильно переносили в пре-ферментер со средой М9тобС5 для обеспечения соотношения посева 0,2% (об./об.) и культивировали при аэрации и перемешивании. рО₂ поддерживали выше 40% насыщения. Культуру собирали, когда через 16 ч заканчивалась глюкоза. В результате получали приблизительно 30 л предкультуры. Предполагаемая оптическая плотность культуры А600 составляла приблизительно 2-3.

Затем во втором ферментере получали основную культуру. Для обеспечения отношения посева приблизительно 10% (об./об.) в заполненный 270 л стерильной среды ЕтобС2 ферментер стерильно переносят 30 л предкультуры. Культуру запускают на периодический режим для образования некоторой биомассы. Добавление глюкозы выполняли однократно, исходно добавленный сахар истощался приблизительно через 4 ч. Для поддержания конкретной близкой к 0,09 ч^-1 скорости роста контролировали аэрацию, перемешивание, рО₂ (40 %), рН (6,9±0,1), температуру (37±1°С) и добавление глюкозы. Культивирование останавливали приблизительно через 35 ч фидинга. Это приводит к получению приблизительно 400 л культуры. Предполагаемая оптическая плотность культуры А₆₀₀ составляла приблизительно 100.

После сбора указанных клеток выполняли первую стадию выделения. Биомассу собирали на центрифуге с коническими перегородками в роторе. Для элиминации использованной культуральной среды среду 3-4-кратно концентрировали и непрерывно ресуспендировали в 400 л стерильного буфера З1. Это приводит к получению приблизительно 500 л указанной выше биомассы. ЭС\У=25±5 г/л.

После указанной стадии концентрирования выполняли вторую стадию выделения. После ресуспендирования/гомогенизации в буфере З1 клетки снова обрабатывали в центрифуге до получения концентрированной густой суспензии. Это приводит к получению приблизительно 60-80 л отмытой и концентрированной густой суспензии, ЭС\У=Е50±30 г/л; плазмидной ДНК=300±60 мг/л.

Затем выполняли стадию заморозки. Густую суспензию стерильно переносили в 20-литровые мешки Е1ехЬоу™ (заполняли до 50% их объема), а затем замораживали при -20±5°С до дальнейшей последовательной обработки. Это приводит к получению замороженной биомассы, пДНК=300±60 мг/л; суперскрученная форма >95%.

Затем выполняли стадию размораживания клеток. Замороженные мешки отогревали до 20°С и густую клеточную суспензию разводили в 40 г/л, рН 8,0 с 100 мМ Тпк-гидрохлоридом, 10 мМ ЭДТА, 20 мМ глюкозы и до клеточного лизиса оставляли суспензию при 20±2°С на 1 ч при перемешивании. Это приводит к получению размороженной густой суспензии биомассы, рН 8,0±0,2.

На данной стадии можно применять температуры приблизительно 20°С.

Затем выполняли стадию щелочного лизиса. Стадия клеточного лизиса включала в себя перекачивание разведенной клеточной суспензии через поточный смеситель с раствором 0,2 N ЫаОН-35 мМ ЗЭЗ (раствор З2) с последующей стадией непрерывного взаимодействия в спиральной трубке. Стадия непрерывного взаимодействия обеспечивала полный клеточный лизис и денатурацию геномной ДНК и белков. До сбора в охлажденный перемешиваемый сосуд раствор лизированных клеток смешивали в потоке с раствором 3 (З3) охлажденного 3 М ацетата калия 2н. уксусной кислоты. Добавление раствора З3 приводило к преципитации геномной ДНК, РНК, белков и КОЗ.

После этого выполняли фильтрацию лизата. Затем нейтрализованный лизат инкубировали при 5±3°С в течение от 2 до 24 ч без перемешивания и для удаления массы преципитированного вещества

- 34 011554 (мутная фаза) фильтровали через 3,5 мм сетчатый фильтр с последующей глубокой фильтрацией для улучшения стадии фильтрации. Это приводило к получению очищенного лизата с концентрацией суперскрученной плазмиды более 90%.

Затем выполняли анионообменную хроматографию. Раствор очищенного лизата растворяли в очищенной воде до целевого значения проводимости 50 мСм/см, фильтровали через двухслойный фильтр (3-0,8 мкм) и наносили на анионообменную хроматографическую колонку. Применяли 300-мм колонку, заполненную 11,0 л смолы Ргас1оде1® ТМАЕ Н1Сар (М) (Мегск; #1.10316.5000). Очищенный лизат наносили на колонку и выполняли элюцию с применением ступенчатого градиента №С1. Массу связавшихся с колонкой загрязняющих веществ элюировали раствором ΝηΟΊ приблизительно при 61 мСм/см, а плазмидную ДНК элюировали раствором ΝηΟΊ приблизительно при 12 мСм/см. Это приводило к получению элюата ионообменной хроматографии с высокой концентрацией плазмидной ДНК.

После этого проводили трехспиральную аффинную хроматографию. Элюат с анионообменной хроматографической колонки растворяли приблизительно в 0,5 объемах содержащего 4,8 Μ ΝηΟΊ раствора 500 мМ ацетата натрия (рН 4,2) и перекачивали через трехспиральную аффинную хроматографическую колонку, уравновешенную 50 мМ ацетатом натрия (рН 4,5), содержащим 2 М №С1. Диаметр колонки составлял 300 мм и содержал 10,0 л геля ТНАС 8ерйасгу1™ 8-1000 (Атегкйат Вюкшепсек; Ркса1атау, N1). Колонку промывали раствором содержащего 1 Μ ΝηΟΊ 50 мМ ацетата натрия (рН 4,5) и ΝΥ1ΡΟΡ элюировали 100 мМ Тгк (рН 9,0), содержащим 0,5 мМ ЭДТА. Это приводило к получению элюата трехспиральной аффинной хроматографии с высокой концентрацией плазмиды.

Затем следовала стадия хроматографии гидрофобного взаимодействия. Элюат аффинной хроматографической колонки разводили в 3,6 объемах раствора 3,8 М сульфата аммония в Тгк (рН 8,0). После фильтрации через 0,45 мкм фильтр фильтрат наносили при 60 см/ч на колонку гидрофобного взаимодействия (диаметр 300 мм), заполненную 9,0 л смолы Тоуореаг1® Ви1у1-6508 (ТокоН согр., Сгоуе Сйу, ОН). Колонку промывали раствором сульфата аммония приблизительно при 240 мСм/см и элюировали Νν1ΡΟΡ сульфатом аммония при 220 мСм/см. Это приводило к получению свободного от релаксированной формы элюата Н1С.

По предпочтительному варианту осуществления выполняли дополнительную стадию диафильтрации. В данной области известны приемлемые для применения в данном способе по стандартным методикам традиционные, коммерчески доступные вещества для диафильтрации. Предпочтительный способ диафильтрации представляет собой диафильтрацию с применением ультрафильтрующей мембраны с пределом исключения молекулярного веса в диапазоне от 30000 до 50000 в зависимости от размера плазмиды. Эта стадия диафильтрации предусматривает замену буфера, а затем определение концентрации. Элюат стадии 12 3-4-кратно концентрировали посредством тангенциальной фильтрации потока (предел исключения мембраны 30 кДа) до целевой концентрации приблизительно от 2,5 до 3,0 мг/мл и концентрат представлял собой замененный диафильтрацией буфер при постоянном объеме 10 объемами физиологического раствора и подобран для целевой плазмидной концентрации с физиологическим раствором. Концентрацию Νν1ΡΟΡ вычисляли из поглощения при 260 нм образцов концентрата. Раствор Νν1ΡΟΡ фильтровали через 0,2 мкм мембранный фильтр и хранили в контейнерах в холодной комнате при 2-8°С до последующей обработки. В результате получали очищенный концентрат с плазмидной ДНК, концентрация суперскрученной плазмиды составляет приблизительно 70, 75, 80, 85, 90, 95 и предпочтительно 99%. Предельный выход плазмиды по данному способу составляет по меньшей мере 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 и 80% со средним выходом 60%.

Пример 15.

Способ по указанному выше примеру, включающий в себя стадию ионообменной хроматографии (АЕС), стадию трехспиральной аффинной хроматографии (ТНАС) и стадию гидрофобной хроматографии (Н1С), приводит к получению более очищенного препарата плазмидной ДНК по сравнению с известными ранее способами. Данный новый способ сравнили с известными ранее способами и получили в препаратах плазмидной ДНК более низкие количества геномной ДНК, РНК, белка и эндотоксина. Это отображено на фиг. 3. Данные эксперименты показали, что АЕС, ТНАС и Н1С обеспечивают удивительно более высокий выход очистки по сравнению с некоторыми из 2-ступенчатых сочетаний для эффективного удаления всех загрязняющих веществ. Сочетание данных стадий обеспечивает четкий синергизм в отношении эффективности отделения плазмидной ДНК от других биологических веществ и загрязняющих веществ, как, например, белок и эндотоксин, РНК и геномная ДНК, а также открытой кольцевой плазмиды. Кроме того, сочетание синергичных стадий, т.е. АЕС/ТНАС/Н1С, по настоящему изобретению позволяет не только получать высокоочищенную плазмидную ДНК фармацевтической категории, а также композиции высокой чистоты и полностью суперскрученной, более 80, 85, 90, 95 и более 99% плазмидной ДНК.

Пример 16.

Способ для получения высокоочищенного препарата плазмидной ДНК по указанному выше примеру, включающий в себя стадию ионообменной хроматографии, стадию трехспиральной аффинной хроматографии и стадию гидрофобной хроматографии, сравнивали с известными ранее способами. Как по

- 35 011554 казано на фиг. 4, способ по настоящему изобретению неожиданно привел к получению препаратов пДНК с намного меньшими количествами геномной ДНК, РНК, белка и эндотоксина в диапазоне менее м.д. Кроме того, как показано на фиг. 4, в способе по настоящему изобретению показано полученное количество продукта до 10 г.

Пример 17.

Стадию диафильтрации выполняли, как описано в примере 14, в соответствии со следующими ус ловиями:

буфер для стадии (а) и для стадии (Ь) применяли для определения наилучших условий для:

ίίί) первой диафильтрации (стадия (а)) против 12,5-13,0 объемов 50 мМ Тпз-НС1, 150 мМ №С1, рН 7,4 (обозначенного буфер I), и ίν) выполнения второй диафильтрации концентрата из указанной выше стадии (а) (стадия (Ь)) против от 3,0 до 3,5 объемов солевого носителя (150 мМ Νπ('Ί).

Данная альтернативная стадия диафильтрации по настоящему изобретению эффективно и тщательно удаляет сульфат аммония и тщательно ЭДТА. Кроме того, после этих стадий диафильтрации получают соответствующую целевую концентрацию NаС1 приблизительно 150 мМ и конечную концентрацию Тг18 между 400 мкМ и 1 мМ. Примеры препаратов композиций плазмидной ДНК представлены в табл. 6.

Таблица 6

Образцы	Конечная концентрация
1-я диафильтрация	2-я диафильтрация	Активный фармацевтический ингредиент
Сульфат аммония	10 мкМ	<1 мкМ	<1 мкМ
ЭДТА	4 мкМ	<1 мкМ	<1 мкМ

ТГ15

ИаС1

Пример 18.

Обозначенную Ь806 промышленную партию плазмидной ДНК ХУ1РСР АР1 (активные фармацевтические ингредиенты) производили по примерам 13 и 17 со стадией процесса диафильтрации, описанной в примере 17. Сначала элюат подвергали первой диафильтрации приблизительно при 2 мг АР1/мл против приблизительно 13 объемов буфера I и полученный ренетрат подвергали диафильтрации против приблизительно 3 объемов солевого наполнителя. Затем фильтровали конечный ренетрат через 0,2 мкм фильтр и доводили до 1 мг/мл. Конечные АР1 (рН 7,24) хранили в стеклянном флаконе при 5°С до получения ΌΡ.

Исследование стабильности проводили на образцах Ь806, хранившихся в стеклянных флаконах Оигап (АР1), а также в 8-мл флаконах, применяемых при производстве фармацевтического продукта. После 90 суток при 5°С степень депуринизации и содержание открытых кольцевых форм для всех образцов составляло едва определяемое количество (<0,3%). После 90 суток при 25°С отношение депуринизации и содержание открытых кольцевых форм образцов Ь806 также являлись достаточно низкими. Вычисленные из этого исследования отношения депуринизации и открытых кольцевых форм составляли <1% в месяц (фиг. 5). Данное исследование продемонстрировало, что в препарате по настоящему изобретению, где значения рН поддерживали приблизительно от 7,0 до 7,5, профиль стабильности плазмидной ДНК ИУ1ЕСЕ очень стабилен. Это ясно демонстрирует, что в течение длительного интервала времени при 25°С плазмидная ДНК остается стабильной в не деградировавшей форме с низкими отношениями депу ринизации и разрывов плазмид.

Пример 19.

Обозначенные Ь804, Ь804, Ь806, Ь807 и ЬТ05 партии плазмидной ДНК НУ1РСР АР1 (активные фармацевтические ингредиенты) производили по примеру 13 со стадией процесса диафильтрации, описанной в примере 17. Сначала элюат подвергали первой диафильтрации приблизительно при 2 мг АР1/мл против приблизительно 13 объемов буфера I и полученный ренетрат подвергали диафильтрации против приблизительно 3 объемов солевого наполнителя. Затем фильтровали конечный ренетрат через 0,2 мкм фильтр и доводили до 1 мг/мл для хранения в 8 мл флаконах. Получали плазмидную ДНК с концентрацией NаС1 приблизительно 150 мМ и конечной концентрацией Тпз между 1 и 2 мМ. Исследование стабильности проводили на всех указанных образцах, хранившихся в применяемых при производстве фармацевтического продукта 8 мл флаконах.

Исследование стабильности проводили в течение 150 суток при 25°С, рН композиций плазмидной ДНК заметно не меняли, как показано на фиг. 6А. Через 203 суток рН Ь804 значительно снижался до 6,54 (-0,27 единиц).

Для всех партий, за исключением Ь804, отношения депуринизации и однонитевых разрывов при 25°С составляли приблизительно 1,0% в месяц и оказались линейно-зависимыми от времени после 140 суток. Отношение депуринизации Ь804 было значительно выше (2,7% в месяц) в результате значительно более низкого рН данной партии АР1 (>0,4 единиц при Т₀). Отношение однонитевых разрывов

- 36 011554

Ь804 было значительно ниже, чем его отношение депуринизации (2,4% в месяц).

При 5°С рН всех растворов сохранялся стабильным в течение всего времени и степень депуринизации и однонитевых разрывов являлась очень низкой (менее 0,5% через 200 суток; фиг. 6В).

Данное исследование продемонстрировало, что в препаратах по настоящему изобретению профиль стабильности плазмидной ДНК ЫУ1ЕСЕ очень стабилен в течение всего времени при 5 и 25°С с очень низкими отношениями депуринизации и однонитевых разрывов.

Описание следует понимать в свете идей ссылок, процитированных в описании. Варианты осуществления в описании обеспечивают иллюстрацию вариантов осуществления изобретения и их не следует рассматривать в качестве ограничивающих возможности изобретения. Квалифицированный специалист сразу подтвердит, что изобретение включает в себя многие другие варианты осуществления. Все публикации и патенты, процитированные в данном описании изобретения в полном объеме, включены сюда в качестве ссылок. В тех случаях, когда включенный в виде ссылки материал противоречит или не соответствует данному описанию, описание замещает любой такой материал. Цитирование здесь любых ссылок не признает, что такие ссылки являются предшествующими относительно настоящего изобретения.

Если не обозначено иначе, все числа, выражающие количества ингредиентов, условия реакции и т.д., применяемые в описании, включая формулу изобретения, следует понимать как измененные во всех случаях термином «приблизительно». Соответственно, если не обозначено иначе до наоборот, числовые параметры являются приближенными и могут варьировать в зависимости от желательных свойств при стремлении к полученным параметрам по настоящему изобретению. По крайней мере, каждый числовой параметр следует рассматривать в свете ряда значащих цифр и обычных принципов округления, но не в качестве попытки ограничения в изобретении объемов эквивалентов возможности формулы изобретения.

Если не указано иначе, термин «по меньшей мере» предваряет серии элементов, что следует понимать со ссылкой на каждый элемент в сериях. Квалифицированный специалист найдет или способен определить с применением не более обычного эксперимента многие эквиваленты описанным здесь конкретным вариантам осуществления изобретения. Такие эквиваленты намереваются охватить в следующей далее формуле изобретения.

Специалист в данной области может доверять содержанию любой из ссылок или документов, указанных здесь, и каждой ссылке или документу, включенному в данный документ в виде ссылки в его полном объеме. Однако ничто из указанной здесь ссылки или документа не должно изменять значение любого термина или концепции, специально обозначенных в данном документе. Ссылки и документы, а также имеющиеся доступные любому специалисту в данной области знания позволят допускать изменения и варианты в описанных здесь конкретных вариантах осуществления. Обозначенные здесь примеры и конкретные варианты осуществления не следует понимать как ограничение возможностей или объема изобретения.

Claims (88)

1. Жидкая композиция, сохраняющая стабильной плазмидную ДНК, содержащая плазмидную ДНК и буферный раствор, где буфер представлен в концентрации менее 2 мМ для поддержания рН указанной композиции между 6 и 9, и композиция содержит предварительно очищенную суперскрученную форму плазмидной ДНК.

2. Композиция по п.1, где плазмидная ДНК стабильна при температурах приблизительно от 4 до 25°С.

3. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где плазмидная ДНК стабильна в течение нескольких месяцев, 1 года, 2, 3, 4, 5 лет и до 10 лет.

4. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где плазмидная ДНК стабильна приблизительно при 4°С в течение нескольких месяцев, 1 года, 2, 3, 4, 5, 10, 15 лет и до 20 лет.

5. Композиция по любому из предыдущих пунктов, содержащая по меньшей мере 80% суперскрученной формы или замкнутой кольцевой формы плазмидной ДНК.

6. Композиция по любому из предыдущих пунктов, содержащая приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 95% и приблизительно или более 99% суперскрученной или замкнутой кольцевой формы плазмидной ДНК.

7. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где отношения депуринизации и однонитевых разрывов составляют менее 5% в месяц.

8. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где буфер представлен в концентрации до 2 мМ.

9. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где буфер представлен в концентрации между 1 и 2 мМ.

10. Композиция по п.8, где буфер представлен в концентрации менее 1 мМ.

11. Композиция по п.10, где буфер представлен в концентрации между 250 мкМ и 1 мМ.

12. Композиция по п.11, где буфер представлен в концентрации приблизительно 400 мкМ.

13. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где буферный раствор присутствует в такой

- 37 011554 концентрации, чтобы поддерживать рН указанного препарата или композиции между 6,2 и 8,5 или приблизительно ±0,3 от одного или обоих из этих значений.

14. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где буферный раствор присутствует в такой концентрации, чтобы поддерживать рН указанного препарата или композиции между 6,2 и 8,5 или приблизительно ±0,3 от одного или обоих из этих значений, и плазмидная ДНК имеет отношения депуринизации и однонитевых разрывов менее 5% в год при хранении приблизительно при 4°С и менее 5% в месяц при хранении приблизительно при 25°С.

15. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где буферный раствор присутствует в такой концентрации, чтобы поддерживать рН указанного препарата или композиции между 6,7 и 8,0 или приблизительно ±0,3 от одного или обоих из этих значений.

16. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где буферный раствор присутствует в такой концентрации, чтобы поддерживать рН указанного препарата или композиции между 6,7 и 8,0 или приблизительно ±0,3 от одного или обоих из этих значений, и плазмидная ДНК имеет отношения депуринизации и однонитевых разрывов менее 2% в год при хранении приблизительно при 4°С и менее 2% в месяц при хранении приблизительно при 25°С.

17. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где буферный раствор присутствует в такой концентрации, чтобы поддерживать рН указанного препарата или композиции между 7,0 и 7,5 или приблизительно ±0,3 от одного или обоих из этих значений.

18. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где буферный раствор присутствует в такой концентрации, чтобы поддерживать рН указанного препарата или композиции между 7,0 и 7,5 или приблизительно ±0,3 от одного или обоих из этих значений, и плазмидная ДНК имеет отношения депуринизации и однонитевых разрывов менее 1% в год при хранении приблизительно при 4°С и менее 1% в месяц при хранении приблизительно при 25°С.

19. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где буферный раствор содержит:

(a) Тпк или лизин и кислоту, выбранную из сильной кислоты или слабой кислоты;

(b) Нерек и сильное основание или (c) фосфатный буфер.

20. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где буферный раствор содержит Тпк/НС1, лизин/НС1, Тпк/малеиновую кислоту, Тпк/яблочную кислоту, Тпк/уксусную кислоту или Нерек/гидроксид натрия.

21. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где буферный раствор представляет собой Тпк.

22. Композиция по любому из предыдущих пунктов, кроме того, содержащая солевой эксципиент.

23. Композиция по п.22, где солевой эксципиент представляет собой ЫаС1.

24. Композиция по п.23, где ЫаС1 присутствует в концентрации между 100 и 200 мМ и предпочтительно приблизительно 150 мМ.

25. Композиция по любому из предыдущих пунктов, где плазмидная ДНК является высокоочищенной или представляет собой плазмидную ДНК фармацевтического качества.

26. Композиция стабильной плазмидной ДНК, содержащая плазмидную ДНК и буферный раствор, где буферный раствор присутствует в концентрации, достаточной для сохранения плазмидной ДНК в стабильной форме при температурах приблизительно от 4 до 25°С.

27. Композиция стабильной плазмидной ДНК, содержащая плазмидную ДНК и буферный раствор, где буферный раствор присутствует в концентрации, достаточной для сохранения плазмидной ДНК по меньшей мере с 80% суперскрученной плазмидной ДНК при температуре приблизительно 4°С до по меньшей мере приблизительно 4 лет.

28. Композиция стабильной плазмидной ДНК, содержащая плазмидную ДНК и буферный раствор, где буферный раствор присутствует в концентрации, достаточной для сохранения плазмидной ДНК с отношениями депуринизации и однонитевых разрывов от менее 5% в год до 5% в месяц при хранении приблизительно при 4°С приблизительно до 25°С.

29. Солевая композиция стабильной плазмидной ДНК, содержащая плазмидную ДНК и буферный раствор, где буферный раствор присутствует в концентрации, достаточной для сохранения плазмидной ДНК в стабильной форме с содержанием по меньшей мере 80% суперскрученной плазмидной ДНК от 4 до 25°С в течение длительного периода времени.

30. Композиция стабильной плазмидной ДНК, содержащая плазмидную ДНК и буферный раствор, где буферный раствор присутствует в концентрации, достаточной для сохранения плазмидной ДНК в стабильной форме с содержанием по меньшей мере 80% суперскрученной плазмидной ДНК при от 4 до 25°С в течение до 20 месяцев.

31. Композиция по любому из пп.26-30, дополнительно содержащая солевой эксципиент.

32. Композиция по п.31, где солевой эксципиент представляет собой ЫаС1, присутствующий в концентрации между 100 и 200 мМ и предпочтительно приблизительно 150 мМ.

33. Композиция по любому из пп.26-32, где плазмидная ДНК является высокоочищенной или представляет собой плазмидную ДНК фармацевтического качества.

- 38 011554

34. Способ хранения плазмидной ДНК в стабильной форме в композиции, включающий в себя получение очищенного образца плазмидной ДНК;

смешивание указанного очищенного образца плазмидной ДНК и буферного раствора в концентрации до 2 мМ, достаточной для поддержания рН полученной композиции между 6 и 9; и хранение плазмидной ДНК.

35. Способ по п.34, где плазмидная ДНК содержит по меньшей мере 80% суперскрученной плазмидной ДНК.

36. Способ по пп.34, 35, где буферный раствор присутствует в такой концентрации, чтобы поддерживать рН указанной композиции между 6,2 и 8,5 или приблизительно ±0,3 от одного или обоих из этих значений.

37. Способ по п.36, где плазмидную ДНК хранят при температурах приблизительно от 4 до 25°С с отношениями депуринизации и однонитевых разрывов от менее 5% в месяц до менее 5% в год.

38. Способ по любому из пп.34-37, где буферный раствор присутствует в такой концентрации, чтобы поддерживать рН указанной композиции между 6,7 и 8,0 или приблизительно ±0,3 от одного или обоих из этих значений.

39. Способ по п.38, где плазмидную ДНК хранят при температурах приблизительно от 4 до 25°С с отношениями депуринизации и однонитевых разрывов от менее 2% в месяц до менее 2% в год.

40. Способ по любому из пп.34-39, где буферный раствор присутствует в такой концентрации, чтобы поддерживать рН указанной композиции между 7,0 и 7,5 или приблизительно ±0,3.

41. Способ по п.40, где плазмидную ДНК хранят при температурах приблизительно от 4 до 25°С с отношениями депуринизации и однонитевых разрывов от менее 1% в месяц до менее 1% в год.

42. Способ по любому из пп.34-41, где буфер добавляют в концентрации до 2 мМ.

43. Способ по п.42, где буфер добавляют в концентрации между 1 и 2 мМ.

44. Способ по п.42, где буфер добавляют в концентрации менее 1 мМ.

45. Способ по п.44, где буфер добавляют в концентрации между 250 мкМ и 1 мМ.

46. Способ по п.45, где буфер добавляют в концентрации приблизительно 400 мкМ.

47. Способ по пп.34-46, где к плазмидной ДНК и буферному раствору дополнительно добавляют солевой эксципиент.

48. Способ по п.47, где солевой эксципиент представляет собой №С1.

49. Способ по п.48, где Νηί',Ί добавляют в концентрации между 100 и 200 мМ и предпочтительно приблизительно 150 мМ.

50. Способ по любому из пп.34-49, где высокоочищенную плазмидную ДНК или плазмидную ДНК фармацевтического качества смешивают с буферным раствором.

51. Способ хранения плазмидной ДНК в стабильной форме с содержанием по меньшей мере 80% суперскрученной плазмидной ДНК в жидкой композиции при температуре приблизительно до 25°С в течение нескольких месяцев, включающий в себя получение очищенного образца плазмидной ДНК;

смешивание очищенного образца плазмидной ДНК и буферного раствора, где буфер присутствует в концентрации менее 2 мМ; и хранение композиции плазмидной ДНК при температуре приблизительно до 25°С.

52. Способ хранения плазмидной ДНК в стабильной форме с содержанием по меньшей мере 80% суперскрученной плазмидной ДНК в жидкой композиции при температуре приблизительно до 25°С в течение нескольких месяцев, включающий в себя получение очищенного образца плазмидной ДНК;

смешивание очищенного образца плазмидной ДНК и буферного раствора, где буфер присутствует в концентрации между 1 и 2 мМ; и хранение композиции плазмидной ДНК при температуре приблизительно до 25°С.

53. Способ хранения плазмидной ДНК в стабильной форме с содержанием по меньшей мере 80% суперскрученной плазмидной ДНК в жидкой композиции при температуре приблизительно до 25°С в течение нескольких месяцев, включающий в себя получение очищенного образца плазмидной ДНК;

смешивание очищенного образца плазмидной ДНК и буферного раствора, где буфер присутствует в концентрации до 1 мМ; и хранение композиции плазмидной ДНК при температуре приблизительно до 25°С.

54. Способ хранения плазмидной ДНК в стабильной форме с содержанием по меньшей мере 80% суперскрученной плазмидной ДНК в жидкой композиции при температуре приблизительно до 25°С в течение нескольких месяцев, включающий в себя получение очищенного образца плазмидной ДНК;

смешивание очищенного образца плазмидной ДНК и буферного раствора, где буфер присутствует в концентрации между приблизительно 250 мкМ и 1 мМ; и хранение композиции плазмидной ДНК при температуре приблизительно до 25°С.

- 39 011554

55. Способ по любому из пп.51-54, где плазмидную ДНК хранят при температурах приблизительно от 4 до 25°С с отношениями депуринизации и однонитевых разрывов от менее 5% в месяц до менее 5% в год.

56. Способ по любому из пп.51-55, где к композиции плазмидной ДНК дополнительно добавляют солевой эксципиент.

57. Способ по п.56, где солевой эксципиент представляет собой ΝαΟΊ.

58. Способ по п.57, где №-1С1 присутствует в концентрации между 100 и 200 мМ и предпочтительно приблизительно 150 мМ.

59. Способ получения композиции стабильной плазмидной ДНК при температуре приблизительно до 25°С, включающий в себя стадию лизиса клеток, состоящую из прохождения клеток через (а) устройство для турбулентного потока для быстрого перемешивания клеточной суспензии с лизирующим клетки раствором и (Ь) устройство для ламинарного потока для обеспечения инкубации образованной смеси (а) без существенной активации, где образованная смесь в (а) без значительного перемешивания проходит из устройства для турбулентного потока в устройство для ламинарного потока, и, кроме того, необязательно включает в себя (с) устройство для добавления нейтрализующего лизирующий раствор второго раствора, инкубированная в (Ь) смесь течет из устройства для ламинарного потока в устройство для добавления второго раствора, таким образом высвобождая плазмидные ДНК из клеток;

одну стадию хроматографии для очистки выделенной таким образом плазмидной ДНК;

перемешивание указанной очищенной плазмидной ДНК и буферного раствора в концентрации до 2 мМ, достаточной для поддержания рН полученной композиции между 6 и 9; и хранение композиции плазмидной ДНК при температуре приблизительно до 25°С.

60. Способ получения композиции стабильной плазмидной ДНК при температуре приблизительно до 25°С, включающий в себя стадию лизиса клеток, состоящую из прохождения клеток через (а) устройство для турбулентного потока для быстрого перемешивания клеточной суспензии с лизирующим клетки раствором и (Ь) устройство для ламинарного потока для обеспечения инкубации образованной смеси (а) без существенной активации, где образованная смесь в (а) без значительного перемешивания, где образованная в (а) проходит из устройства для турбулентного потока в устройство для ламинарного потока, и, кроме того, необязательно включает в себя (с) устройство для добавления нейтрализующего лизирующий раствор второго раствора, инкубированная в (Ь) смесь течет из устройства для ламинарного потока в устройство для добавления второго раствора, таким образом высвобождая плазмидные ДНК из клеток;

одну стадию хроматографии для очистки выделенной таким образом плазмидной ДНК;

перемешивание указанной очищенной плазмидной ДНК и буферного раствора в концентрации до 2 мМ, достаточной для поддержания рН полученной композиции между 6,2 и 8,5 или приблизительно ±0,3 от одного или обоих из этих значений; и хранение композиции плазмидной ДНК при температуре приблизительно до 25°С.

61. Способ получения композиции стабильной плазмидной ДНК при температуре приблизительно до 25°С, включающий в себя стадию лизиса клеток, состоящую из прохождения клеток через (а) устройство для турбулентного потока для быстрого перемешивания клеточной суспензии с лизирующим клетки раствором и (Ь) устройство для ламинарного потока для обеспечения инкубации образованной смеси (а) без существенной активации, где образованная смесь в (а) без значительного перемешивания проходит из устройства для турбулентного потока в устройство для ламинарного потока, и, кроме того, необязательно включает в себя (с) устройство для добавления нейтрализующего лизирующий раствор второго раствора, инкубированная в (Ь) смесь течет из устройства для ламинарного потока в устройство для добавления второго раствора, таким образом высвобождая плазмидные ДНК из клеток;

одну стадию хроматографии для очистки выделенной таким образом плазмидной ДНК;

перемешивание указанной очищенной плазмидной ДНК и буферного раствора в концентрации до 2 мМ, достаточной для поддержания рН полученной композиции между 6,7 и 8,0 или приблизительно ±0,3 от одного или обоих из этих значений; и хранение композиции плазмидной ДНК при температуре приблизительно до 25°С.

62. Способ получения композиции стабильной плазмидной ДНК при температуре приблизительно до 25°С, включающий в себя стадию лизиса клеток, состоящую из прохождения клеток через (а) устройство для турбулентного потока для быстрого перемешивания клеточной суспензии с лизирующим клетки раствором и (Ь) устройство для ламинарного потока для обеспечения инкубации образованной смеси (а) без существенной активации, где образованная смесь в (а) без значительного перемешивания проходит из устройства для турбулентного потока в устройство для ламинарного потока, и, кроме того, необязательно включает в себя (с) устройство для добавления нейтрализующего лизирующий раствор второго раствора, инкубированная в (Ь) смесь течет из устройства для ламинарного потока в устройство для добавления второго рас

- 40 011554 твора, таким образом высвобождая плазмидные ДНК из клеток;

одну стадию хроматографии для очистки выделенной таким образом плазмидной ДНК;

перемешивание указанной очищенной плазмидной ДНК и буферного раствора в концентрации до 2 мМ, достаточной для поддержания рН полученной композиции между 7,0 и 7,5 или приблизительно ±0,3 от одного или обоих из этих значений; и хранение композиции плазмидной ДНК при температуре приблизительно до 25°С.

63. Способ по любому из пп.59-62, где буферный раствор присутствует в концентрации менее 2 мМ.

64. Способ по любому из пп.59-63, где буферный раствор присутствует в концентрации приблизительно от 1 до 2 мМ.

65. Способ по любому из пп.59-64, где буферный раствор добавляют до достижения в композиции плазмидной ДНК концентрации приблизительно от 250 мкМ до менее 1 мМ.

66. Способ получения композиции стабильной плазмидной ДНК при температуре приблизительно до 25°С, включающий в себя стадию лизиса клеток, состоящую из прохождения клеток через (а) устройство для турбулентного потока для быстрого перемешивания клеточной суспензии с лизирующим клетки раствором и (Ь) устройство для ламинарного потока для обеспечения инкубации образованной смеси (а) без существенной активации, где образованная смесь в (а) без значительного перемешивания проходит из устройства для турбулентного потока в устройство для ламинарного потока, и, кроме того, необязательно включает в себя (с) устройство для добавления нейтрализующего лизирующий раствор второго раствора, инкубированная в (Ь) смесь течет из устройства для ламинарного потока в устройство для добавления второго раствора, таким образом высвобождая плазмидные ДНК из клеток;

одну стадию хроматографии для очистки выделенной таким образом плазмидной ДНК;

перемешивание указанной очищенной плазмидной ДНК и буферного раствора, где буферный раствор представлен в концентрации менее 2 мМ или менее 1 мМ или между 250 мкМ и 1 мМ и предпочтительно 400 мкМ; и хранение композиции плазмидной ДНК при температуре приблизительно до 25°С.

67. Способ по любому из пп.59-66, где к композиции плазмидной ДНК дополнительно добавляют солевой эксципиент.

68. Способ по п.67, где солевой эксципиент представляет собой №С1.

69. Способ по п.68, где Ν;·ιί.Ί добавляют в концентрации между 100 и 200 мМ и предпочтительно приблизительно 150 мМ.

70. Способ по любому из пп.59-69, где лизирующий раствор представляет собой раствор, содержащий лизирующее вещество, выбранное из группы, состоящей из щелочи, детергента, органического растворителя и фермента или их смеси.

71. Способ по любому из пп.59-70, где плазмидную ДНК очищают по меньшей мере одной хроматографической стадией, включающей в себя стадию анионообменной хроматографии, трехспиральную аффинную хроматографию или хроматографию гидрофобного взаимодействия.

72. Способ по п.71, где для очистки плазмидной ДНК стадию анионообменной хроматографии комбинируют со стадией трехспиральной хроматографии.

73. Способ по п.72, дополнительно включающий в себя стадию хроматографии гидрофобного взаимодействия.

74. Способ по любому из пп.59-73, где плазмидную ДНК очищают посредством 3-шагового способа хроматографии, включающего в себя анионообменную хроматографию, трехспиральную аффинную хроматографию и хроматографию гидрофобного взаимодействия, осуществляемые в указанном порядке.

75. Способ по любому из пп.59-74, где выполнение первой хроматографии предшествует фильтрации лизата.

76. Способ по любому из пп.59-75, где выполнение первой хроматографии предшествует удалению осадка.

77. Способ по любому из пп.59-76, где последние стадии хроматографии следуют за стадией диафильтрации и/или замены буфера.

78. Способ по любому из пп.59-77, где удалению осадка предшествует выполнение прохождения раствора через сетчатый фильтр и через глубокую фильтрацию.

79. Способ по любому из пп.59-78, включающий стадию диафильтрации для достижения соответствующих солевых, буферных и рН целевых значений.

80. Способ по любому из пп.59-79, включающий в себя следующие стадии:

сбор раствора после последней стадии хроматографии;

проведение первой стадии диафильтрации против буфера Тп8/№1С1;

проведение второй стадии диафильтрации против физиологического раствора в условиях, приемлемых для контроля конечной буферной концентрации и для стабилизации рН конечного препарата плазмидной ДНК.

- 41 011554

81. Способ по любому из пп.59-80, дополнительно включающий в себя стадию стерилизации фильтрацией, приготовления композиции и заполнения флаконов очищенной плазмидной ДНК.

82. Способ по любому из пп.59-81, где стадии хроматографии обеспечивают удаление примесей, таких как белки, денатурированная геномная ДНК, РНК, белки, олигорибонуклеотиды, олигодезоксирибонуклеотиды, денатурированная плазмидная ДНК и липополисахариды.

83. Способ по любому из пп.59-81, где стадии хроматографии проводят на твердом носителе, представляющем собой любое органическое, неорганическое или комбинированное вещество, пористое, непористое, суперпористое или непористое, приемлемое для хроматографических выделений, являющееся производным полиалкенгликолей, алканов, алкенов, алкинов, аренов или других придающих носителю гидрофобные свойства молекул.

84. Композиция по любому из пп.1-33, где плазмидная ДНК содержит кодирующую терапевтическую и/или иммуногенную последовательность.

85. Композиция по п.84, где терапевтический ген представляет собой ген млекопитающего.

86. Применение композиции по п.84 в качестве ДНК-вакцины.

87. Применение композиции по п.84 или 85 в качестве средства для основанной на плазмиде терапии, как, например, генной терапии.

88. Применение композиции по любому из пп.1-33 в способе лечения посредством терапии человеческого организма или организма животного.